JP2007289062A - 生体触媒を用いたα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、高い生産性でα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する方法の提供。
【解決手段】ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換するに際し、原料α−ヒドロキシニトリル水溶液に含まれる不純物アルデヒドの濃度を０〜３０００重量ｐｐｍにコントロールすることを特徴とするα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、α−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する方法に関する。

酵素活性を有する生体触媒を利用して目的の化合物を合成する方法は、反応条件が穏和であるため反応プロセスが簡略化できること、あるいは副生成物が少なく高純度の反応生成物を取得できる等の利点があるため、近年、様々な化合物の製造に用いられている。中でもニトリル化合物をカルボン酸或いはカルボン酸アンモニウムに変換する活性を持つニトリラーゼやニトリル化合物をカルボン酸アミドに変換する活性を持つニトリルヒドラターゼ等の加水分解酵素は、その特異的な反応挙動から、様々なカルボン酸或いはカルボン酸アンモニウム及びカルボン酸アミドの製造に用いる検討がなされている。

それらの中で、ニトリラーゼ活性を有する生体触媒を用いて、α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換するα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法も数多く検討されている。例えばCorynebacterium属を用いてグリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献1)、或いはRhodococcus属またはGordona属を用いてグリコール酸を製造する方法(特許文献２)、或いはAcidovorax属を用いてグリコール酸、２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３)、或いはBrevibacterium属を用いて乳酸を製造する方法(特許文献４)、或いはPseudomonas属またはArthrobacter属またはAspergillus属またはPenicillium属またはCochliobolus属またはFusarium属を用いて乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−フェニルプロピオン酸、マンデル酸、を製造する方法(特許文献５)、或いはEnterobacter属またはArthrobacter属またはCaseobacter属またはBrevibacterium属またはAureobacterium属またはEscherichia属またはMicrococcus属またはStreptomyces属またはFlavobacterium属またはAeromonas属またはNocardia属またはMycoplana属またはCellulomonas属またはErwinia属またはCandida属またはPseudomonas属またはRhodococcus属またはBacillus属またはAlcaligenes属またはCorynebacterium属またはMyclobacterium属またはObsumbacterium属を用いてD-乳酸を製造する方法(特許文献６)、或いはGordona属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｌ−４−フェニル−２−ヒドロキシ酪酸、Ｄ−マンデル酸及びその誘導体を製造する方法(特許文献７)、Rhodococcus属またはAlcaligenes属またはBrevibacterium属またはPseudomonas属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｌ−４−フェニル−２−ヒドロキシ酪酸を製造する方法(特許文献８)、或いはRhodococcus属またはAlcaligenes属またはBrevibacterium属またはPseudomonas属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｌ−４−フェニル−２−ヒドロキシ酪酸を製造する方法(特許文献９)、或いはGordona属を用いてＬ−３−フェニル乳酸、Ｄ−マンデル酸及びその誘導体を製造する方法(特許文献１０)、或いはPantoea属またはMicrococcus属またはBacteridium属またはBacillus属またはActinomadura属またはKitasatospora属またはPilimelia属またはAchromobacter属またはBeijerinckia属またはCelluslomonas属またはKlebsiella属またはActinopolispora属またはActinosynnema属またはActinopulanes属またはAmycolata属またはSaccharopolyspora属またはStreptomyces属またはNocardioides属またはProvindencia属またはMirobacterium属またはRhodobacter属またはRhodospirillum属またはCaceobcter属またはPseudomonas属またはAlcaligenes属またはCorynebaterium属またはBrevibacterium属またはNocardia属またはRhodococcus属またはArthrobacter属またはTorulopsis属またはRhodopseudomonas属またはAcinetobacter属またはMycobacterium属またはCandida属またはAgrobacterium属またはAspergillus属またはPenicillium属またはCochliobolus属またはFusarium属またはEnterobacter属またはXanthobacter属またはErwinia属またはCitrobacter属またはAeromonas属またはGordona属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１１)、或いはAlcaligenes属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１２)、或いはVarioovorax属またはArthrobacter属を用いて乳酸、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１３)、或いは或いはEscherichia属またはPseudomonas属またはAlcaligenes属を用いてR-マンデル酸、の製造方法(特許文献１４)、或いはArthrobacter属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１５〜１７)、或いはRhodococcus属を用いて２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸を製造する方法(特許文献１８)、或いはCorynebacterium属を用いてマンデル酸を製造する方法(特許文献１９)、或いはEnterobacter属またはArthrobacter属またはCaseobacter属またはBrevibacterium属またはAureobacterium属またはEschrichia属またはMicrococcus属またはStreptomyces属またはFlavobacterium属またはAeromonas属またはNocardia属またはMycoplana属またはCellulomonas属またはErwinia属またはCandida属またはPseudomonas属またはRhodococcus属またはBacillus属を用いてＬ−乳酸を製造する方法(特許文献２０)、或いはAureobacterium属またはPseudomonas属またはCaseobacter属またはAlcaligenes属またはAcinetobacter属またはBrevibacterium属またはNocardia属を用いてR−マンデル酸及びその誘導体を製造する方法(特許文献２１〜２３)、Rhodococcus属を用いてR−マンデル酸を製造する方法(特許文献２５、２７)、或いはAlcaligenes属を用いてＲ−マンデル酸を製造する方法(特許文献２６)、Alcaligenes属の由来のニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子DNAをベクターに組み込んだ組み替え体DNAで形質転換された形質転換体を用いてＲ−マンデル酸を製造する方法(特許文献２８)、或いはAlcaligenes属またはCorynebacterium属を用いてＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を製造する方法(特許文献２９)、或いはAcinetobacter属またはAlcaligenes属またはPseudomonas属またはRhodopseudomonas属またはCorynebacterium属またはBacillus属またはMycobacterium属またはRhodococcus属またはNocardia属またはArthrobacter属またはKlebsiella属またはCandida属を用いて3-(S)-tert.-ブトキシカルボニルアミノ-4-シクロヘキシル-2-(R)-ヒドロキシ酪酸を製造する方法(特許文献３０)、或いはRhodococcus属またはPseudomonas属またはArthrobacter属またはBrevibacterium属を用いて２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３１)、或いはRhodococcus属を用いて２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３２)、或いはAchromobacter属を用いて２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法(特許文献３３)等が開示されている。

これら先行文献に開示されたα−ヒドロキシ酸の製造方法においては、α−ヒドロキシニトリルを微生物触媒(ニトリラーゼ)で加水分解し、まずα−ヒドロキシ酸アンモニウムを得て、これを当業者によく知られている通常の方法、例えば酸による中和、イオン交換樹脂カラム、電気透析、熱分解等の方法により、遊離のα−ヒドロキシ酸を製造している。

しかしながら、前述の従来の技術では、用いている各種生体触媒の持つ加水分解酵素、つまりニトリラーゼがα−ヒドロキシニトリルに対して必ずしも工業的に満足できる初期比活性を有しておらず、自ずと平均生産速度も低くなり、リアクターサイズが非常に大きくなる等の問題を抱えており、更なるニトリラーゼ初期比活性の向上が求められていた。

例えば、前記特許文献１では、Corynebacterium属を用いて、乳酸アンモニウム平均生産速度が１５．４mmol/g-乾燥菌体/Hrであることが記載されている。また、前記特許文献３では、Acidovorax属を用いて、グリコール酸アンモニウム平均生産速度が１．７mmol/g-乾燥菌体/Hrであることが記載されている。また、前記特許文献３３では、Achromobacter属を用いて、２−ヒドロキシイソ酪酸アンモニウム平均生産速度が１．８mmol/g-乾燥菌体/Hrであることが記載されている。また、前記特許文献１７では、Arthrobacter属を用いて、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸平均生産速度が２３．３mmol/g-乾燥菌体/Hr(35℃×18Hr)と低い値であることが記載されている。また、前記特許文献２では、Rhodococcus属またはGordona属を用いて、グリコール酸アンモニウム平均生産速度が１８．５mmol/g-乾燥菌体/Hr(20℃×24Hr)と低い値であることが記載されている。これらの例は、いずれも工業的に満足できるレベルの平均生産速度を有しているとは言えない。

このように初期生産速度及びまたは平均生産速度が低い理由として、一般的にα―ヒドロキシニトリルが水溶液中で対応するアルデヒドもしくはケトンと青酸に部分的に分解・解離(非特許文献１)し、青酸によって酵素活性が阻害されることが挙げられる。(非特許文献２)また、解離したアルデヒドの作用で酵素が短時間で失活する可能性も指摘されている。また、原料であるα−ヒドロキシニトリルは、一般的に対応するアルデヒド水溶液と青酸からアルカリ触媒によるシアンヒドリン化反応を経て合成されており、反応完結度を上げる観点から、どちらか一方を過剰にすることが好ましいため、アルデヒドか青酸のどちらかを微量な不純物として含む。よって、前述のα−ヒドロキシニトリルの部分的な分解・解離と同様の理由でニトリラーゼの初期活性を下げる要因となるため、該微量青酸或いはアルデヒドを低減することで初期活性の大幅な増加が期待される。このように、従来、前述のような青酸或いはアルデヒドによる阻害・失活の指摘はあったが、不純物として含まれる青酸或いはアルデヒドの低減がどこまで初期比活性を上げることができるのかについては、従来のα−ヒドロキシ酸の製造法に関する先行特許・文献には一切記述がなかった。

また、グリコロニトリルに変換されるアルデヒド或いは青酸以外にも、原料中に含まれるアルデヒド或いはシアン化合物も、同様の阻害或いは失活を引き起こすことは十分に考えられるため、本発明の通り、該アルデヒド或いはシアン化合物の濃度を低減することで初期活性を挙げる効果が期待できる。

つまり、工業的に充分な生産性を有するために必要な、実用的な反応時間と実用的なリアクターサイズで大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造できる、実質的に高いニトリラーゼ比活性を有する生体触媒を用いた工業的なα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法を達成するために、原料中の不純物として存在するシアン化合物或いはアルデヒドの定量的なコントロール技術がないのが実状である。

特公平３−３８８３６号公報 特開平９−０２８３９０号公報 特表２００５−５０４５０６号公報 米国特許第３９４０３１６号明細書 特公平４−６３６７５号公報 米国特許第５２３４８２６号明細書 特開平６−２３７７８９号公報 特開平６−２８４８９９号公報 欧州特許出願公開第６１００４９号明細書 欧州特許出願公開第６１００４８号明細書 特開平１０−１７９１８３号公報 特表２００１−５０２９０８号公報 米国特許第６０３７１５５号明細書 特表２００２−５２７１０６号公報 特開２００２−３４５８４号公報 国際公開第２００２／０５２０２７号パンフレット 国際公開第２００３／０６２４３７号パンフレット 特開２００４−８１１６９号公報 特開昭６２−２９６８８３号公報 特開平４−９９４９７号公報 特開平４−９９４９６号公報 特開平４−９９４９５号公報 特開平４−２１８３８５号公報 特開平５−９５７９５号公報 特開平５−１９２１８９号公報 特開平４−３４１１８５号公報 米国特許第５２９６３７３号明細書 特開平６−１５３９６８号公報 特開平５−１９２１９０号公報 特開平６−３１９５９１号公報 特開平４−４０８９７号公報 特開平５−２１９９６９号公報 特開平６−２３７７７６号公報 特開平５−１９２１８９号公報 米国特許第５３２６７０２号明細書 特開平７−２１３２９６号公報 特開平８−１３１１８８号公報 Chemical Reviews,42,189- ,(1948) Agricultural Biological Chemistry,46,1165- ,(1982)

本発明の課題は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体由来の生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリル化合物からα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造するに当たり、実用的な反応時間と実用的なリアクターサイズで大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造を達成できる工業的なα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造法を提供することに有る。

本発明者らはニトリラーゼ活性を有する微生物菌体由来の生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリ化合物からα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造するに当たり、実用的な反応時間と実用的なリアクターサイズで大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造を達成できる、工業的α−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造法について鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに原料に用いるα−ヒドロキシニトリルに含まれる不純物の中でも、アルデヒドとシアンイオンの濃度をコントロールすることで、従来にない高ニトリラーゼ初期比活性を発現させることができることを見つけ出し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、以下に記載する通りの構成を有する。
［１］ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換するに際し、原料α−ヒドロキシニトリル水溶液に含まれる不純物アルデヒドの濃度を０〜３０００重量ｐｐｍにコントロールすることを特徴とするα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［２］ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換するに際し、原料α−ヒドロキシニトリル水溶液に含まれる不純物シアンイオン濃度を０〜５０００重量ｐｐｍにコントロールすることを特徴とするα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［３］α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の反応系中のｐＨを６以上８以下、且つ反応温度を３０〜６０℃にコントロールすることを特徴とする［１］、［２］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα―ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［４］生体触媒が、アシネトバクター属に属する微生物菌体に由来する生体触媒であることを特徴とする［１］〜［３］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［５］アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226或いはアシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK227又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする［４］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［６］アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする［５］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［７］不純物アルデヒドが存在するα−ヒドロキシニトリル水溶液に一般式Ｍ_ｍ（ＣＮ）_ｎ（ＭはＨ、ＮＨ_４或いは金属元素を表し、ｍ，ｎは整数を表す）で表されるシアン化合物を作用させて、該不純物アルデヒド濃度を低減させたα−ヒドロキシニトリル水溶液を原料に用いることを特徴とする［１］〜［６］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［８］不純物シアン化合物が存在するα−ヒドロキシニトリル水溶液に該シアン化合物と等モル以上の対応するアルデヒドまたはケトンを作用させて、該不純物シアンイオン濃度を低減させたα−ヒドロキシニトリル水溶液を原料に用いることを特徴とする［１］〜［７］記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
［９］原料として用いるα−ヒドロキシニトリルがグリコロニトリルである［１］〜［８］記載のグリコール酸或いはグリコール酸アンモニウムの製造方法。

本発明の方法によれば、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体由来の生体触媒を用いて、実用的な反応時間と実用的なリアクターサイズでα−ヒドロキシニトリル化合物から大量のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造することができる。

以下本発明について具体的に説明する。
本発明で言うニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒とは、ニトリル基をカルボン酸或いはカルボン酸アンモニウム基へ直接変換する能力を有する微生物菌体由来のニトリラーゼ酵素を保有する触媒であれば如何なる形態のものでもよい。

微生物種としては多くのものが知られているが、例えばニトリラーゼ高活性を有するものとして、Rhodococcus属、Acinetobacter属、Alcaligenes属、Pseudomonas属、Corynebacterium属等が挙げられる。本発明においてはこれらの中でも、特にグラム陰性菌であるAcinetobacter属、Alcaligenes属が好ましく、更に好ましくはAcinetobacte属がよい。具体的にはAcinetobacter sp.AK226(FERM BP-08590)、Acinetobacter sp.AK227(FERM- BP-08591)である。これらの菌株は、特開２００５−１７６６３９、特開２００４−３０５０６６、特開２００４−３０５０５８、特開２００４−３０５０６２、特開２００１−２９９３７８、特開平１１−１８０９７１、特開平０６−３０３９９１、特開昭６３−２０９５９２、特公昭６３−２５９６号公報等に記載されている。

また例えば、天然の或いは人為的に改良したニトリラーゼ遺伝子を遺伝子工学的手法によって組み込んだ微生物、或いはそこから取り出したニトリラーゼ酵素であっても構わないが、ニトリラーゼの発現量が少ない微生物或いはα−ヒドロキシニトリルからα−ヒドロキシ酸アンモニウムへの変換活性の低いニトリラーゼを発現した微生物を少量用いてα−ヒドロキシ酸(アンモニウム)を製造するには、より多くの反応時間を要するため、可能な限りニトリラーゼを高発現した微生物、及びまたは変換活性の高いニトリラーゼを発現した微生物、或いはそこから取り出したニトリラーゼ酵素を用いることが望ましい。

生体触媒の形態としては微生物細胞を休眠状態でそのまま使用しても構わないし、或いは破砕処理したもの、または該微生物細胞から必要なニトリラーゼ酵素を取り出したものをそのまま使用しても構わないし、一般的な包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものを使用してもよい。尚、固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、光架橋樹脂等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

微生物をそのまま用いる場合、水（蒸留水及びまたはイオン交換水）のみに懸濁させても構わないが、通常、ニトリラーゼ活性の長期保持の観点から無機塩のバッファー液に懸濁させて使用する。また、固定化したものを用いる場合にも同じく、通常、バッファー液に懸濁させて使用する。この時のバッファー液濃度は、反応液中の不純物低減の観点から低ければ低いほどよいが、生体触媒の安定性、ニトリラーゼ活性の保持の観点からは通常０．１Ｍ未満であり、好ましくは０．０１〜０．０８Ｍ、より好ましくは０．０２〜０．０６Ｍである。

本発明で言うα−ヒドロキシニトリルとは、一般式［Ｉ］：ＲＣＨ（ＯＨ）ＣＮ（式中Ｒは水素原子、置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいＣ２〜Ｃ６のアルケニル基、置換基を有してよいＣ１〜Ｃ６アルコキシル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアリールオキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。）で表されるα−ヒドロキシニトリルを言い、例えば、マンデロニトリル、アセトンシアンヒドリン、グリコロニトリル、ラクトニトリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオンブチロニトリル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明で言う不純物アルデヒドとは、原料α−ヒドロキシニトリル中に含まれる全てのアルデヒドのことである。最も多く存在することが予想されるアルデヒドは、該α−ヒドロキシニトリルに変換される時に残存した該α−ヒドロキシニトリルに対応するアルデヒドであり、具体的にはホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド、或いはベンズアルデヒド等の芳香族アルデヒド等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、該α−ヒドロキシニトリルに変換されないが、存在することが予想されるものとしては、酵素固定化用の架橋剤に使われるグルタルアルデヒド等が挙げられる。

本発明においては、α−ヒドロキシニトリルに含まれる不純物アルデヒドの濃度が非常に重要なファクターである。アルデヒド濃度が高すぎると該アルデヒドが引き起こすニトリラーゼ酵素の阻害或いは失活による初期比活性の低下が顕著となるため、結果として初期生産速度及びまたは平均生産速度の低下を引き起こす。よって、本発明における原料α−ヒドロキシニトリル水溶液中の不純物アルデヒドの濃度は０〜３０００重量ｐｐｍが必須であり、好ましくは０〜２０００重量ｐｐｍ、より好ましくは０〜１０００重量ｐｐｍ、更に好ましくは０〜５００重量ｐｐｍ、最も好ましくは全く含まれないのがよい。

本発明においては、不純物アルデヒドが多く存在するα−ヒドロキシニトリル水溶液については、一般式Ｍ_ｍ(ＣＮ)_ｎ（ＭはＨ或いはＮＨ_４或いはＮａ，Ｋ等のアルカリ金属或いはＣａ，Ｍｇ等のアルカリ度類金属或いはＦｅ等のその他金属を表し、ｍ，ｎは整数を表す）で表されるシアン化合物を作用させて、該不純物アルデヒド濃度を低減させることができる。通常、この操作はアルデヒドまたはケトンと青酸を原料に行われるシアンヒドリン化反応と同一条件で実施することができる。具体的には、反応液のｐＨと温度を適度な範囲にコントロールしながら、α−ヒドロキシニトリル水溶液中の不純物アルデヒドと等モル以下のシアン化合物を該不純物アルデヒドと反応せしめ、α−ヒドロキシニトリルに転化させることで、不純物アルデヒドの低減を図るものである。その場合、ｐＨ及びまたは温度が高すぎると、原料α−ヒドロキシニトリルの分解反応を促進することとなり、遊離青酸の気相部へ拡散や、青酸の重合に起因する着色が激しくなり好ましくない。よって、必ずしも限定されるものではないが、ｐＨは２〜５で実施するのが好ましく、より好ましくは３〜４で実施するのがよい。また、反応温度についても、必ずしも限定されるものではないが、１０〜５０℃で実施するのが好ましく、より好ましくは２０〜４０℃で実施するのがよい。

本発明で言う不純物シアン化合物とは、原料α−ヒドロキシニトリル中に含まれる全てのシアン化合物のことである。最も多く存在することが予想されるシアン化合物は、該α−ヒドロキシニトリルに変換される時に残存した青酸である。また、反応液中にアルカリ金属イオン等が存在すると、シアンイオン或いはシアン化ナトリウム、シアン化カリウム等の形で存在する場合もある。

本発明においては、α−ヒドロキシニトリルに含まれる不純物シアンイオン濃度が非常に重要なファクターである。シアンイオン濃度が高すぎると該シアンイオン及びまたはその重合物が引き起こすニトリラーゼ酵素の阻害或いは失活による初期比活性の低下が顕著となるため、結果として初期生産速度及びまたは平均生産速度の低下を引き起こす。よって、本発明における原料α−ヒドロキシニトリル水溶液中の不純物シアンイオン濃度は、０〜５０００重量ｐｐｍが必須であり、好ましくは０〜１０００重量ｐｐｍ、より好ましくは０〜１００重量ｐｐｍ、更に好ましくは０〜５０重量ｐｐｍ、もっと好ましくは０〜１０重量ｐｐｍ、最も好ましくは全く含まれないのがよい。

本発明においては、不純物シアンイオン濃度が５０００重量ｐｐｍより多く存在するα−ヒドロキシニトリル水溶液については、対応するアルデヒドまたはケトンを作用させて、該不純物シアンイオン濃度を低減させることができる。ここで言う対応するアルデヒドまたはケトンとは、青酸とのシアンヒドリン化反応で、該α−ヒドロキシニトリルを合成しうるアルデヒドまたはケトンのことを指す。通常、この操作はアルデヒドまたはケトンと青酸を原料に行われるシアンヒドリン化反応と同一条件で実施することができる。具体的には、反応液のｐＨと温度を適度な範囲にコントロールしながら、α−ヒドロキシニトリル水溶液中の不純物シアンイオンと等モル以上のアルデヒドまたはケトンを該不純物シアンイオンと反応せしめ、α−ヒドロキシニトリルに転化させることで、不純物シアンイオンの低減を図るものである。その場合、ｐＨ及びまたは温度が高すぎると、原料α−ヒドロキシニトリルの分解反応を促進することとなり、遊離青酸の気相部へ拡散や、青酸の重合に起因する着色が激しくなり好ましくない。よって、必ずしも限定されるものではないが、ｐＨは２〜５で実施するのが好ましく、より好ましくは３〜４で実施するのがよい。また、反応温度についても、必ずしも限定されるものではないが、１０〜５０℃で実施するのが好ましく、より好ましくは２０〜４０℃で実施するのがよい。

本発明で言う初期比活性とは、反応温度３０℃、ｐＨ＝６．５〜７．０、反応基質濃度：１ｗｔ％の反応条件で、生体触媒リン酸バッファー懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を添加することで反応を開始し、反応開始から５分におけるα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産モル量を使用乾燥生体触媒重量で除し、更に反応時間（５分＝１／１２時間）で除することにより得られる、乾燥生体触媒重量当たり、１時間当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産量と定義する。但し、菌体使用量はα−ヒドロキシニトリル転化率が１５〜３０％になるように調整するものとする。

本発明における初期生産速度は、任意の反応条件で、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加する事で反応を開始し、反応開始から1時間におけるα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産モル量を使用乾燥生体触媒重量で除することにより得られる、乾燥生体触媒重量当たり、1時間当たりのα−ヒドロキシ酸アンモニウム生産量と定義する。本発明においては、該初期生産速度が３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、好ましくは５０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、より好ましくは１００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、更に好ましくは２００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、最も好ましくは３００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上がよい。

本発明における平均生産速度は、任意の反応条件で、生体触媒懸濁液にα−ヒドロキシニトリル水溶液を連続的或いは間欠的に添加する事で反応を開始し、生成物であるα−ヒドロキシ酸アンモニウム蓄積濃度が高くなるにつれて引き起こされる活性低下の結果、生産速度が初期生産速度の１／２に低下した時点までの時間平均の生産速度のことであり、その時点までのα−ヒドロキシ酸アンモニウムの生産モル量を反応時間で除することにより得られる。本発明における平均生産速度は、１６[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上が必須であり、好ましくは３２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、より好ましくは５０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、更に好ましくは１００[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上、最も好ましくは１５０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]以上がよい。

反応液のｐＨは、１）使用する生体触媒のニトリラーゼ比活性の至適ｐＨと２）基質α−ヒドロキシニトリルのＨＣＮとアルデヒド或いはケトンへの分解抑制の観点から決定される。１）については、α−ヒドロキシニトリル以外のニトリルの加水分解活性挙動よりｐＨ＝７〜１１のアルカリ性領域がよいと推定されるが、２）の観点からは、ｐＨ＝２程度の酸性領域がよいことが判っている。本発明においては反応液のｐＨは６〜８がよく、好ましくは６．５〜７がよい。

原料であるα−ヒドロキシニトリルは非常に不安定な物質であるため、通常、安定剤として硫酸やリン酸或いは酢酸といった酸成分を含む。よって、反応系中のｐＨを調整するには反応系へのアルカリの添加が必須となる。その場合使用するアルカリは反応に影響を及ぼさなければ特に限定されないが、生成物の一つであるアンモニアを使用するのが望ましい。アンモニアの形態はガスであっても、アンモニア水であっても構わないが、通常、扱いの容易さからアンモニア水が望ましい。

反応温度については、反応温度が低すぎると反応活性が低くなり、高濃度のα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する場合、より多くの反応時間を要する。一方、反応温度が高すぎると生体触媒の熱劣化で、目的とするα−ヒドロキシ酸アンモニウムの濃度が高い場合、該濃度まで到達させることが困難となり、結果として新たな生体触媒の追添等の処置が必要となり触媒コストが高くなる。また、温度が高すぎると、基質α−ヒドロキシニトリルの青酸とアルデヒド或いはケトンへの分解促進にも繋がり、それらによる反応阻害や失活等、ますますの反応活性低下を引き起こす。よって、通常、反応温度は３０〜６０℃がよく、好ましくは４０〜５０℃がよい。

α−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造する反応方法は、固定床、移動層、流動層、撹拌槽等、いずれでもよく、また連続反応でも半回分反応でもよいが、特に固定化されていない微生物菌体を用いる場合、反応の容易性から攪拌槽を用いた半回分反応がよい。その場合、反応効率の観点から、適切な攪拌を行うのがよい。

また、半回分反応を行う場合、生体触媒は1バッチ使い捨てでもよいし、繰り返し反応を行ってもよい。但し、繰り返し反応を行う場合、該生体触媒をα−ヒドロキシ酸アンモニウム高濃度から低濃度へ急激に変化させるため、浸透圧の影響等で比活性が低下する場合があるので注意を要する。

反応基質であるα−ヒドロキシニトリル化合物の定常濃度については、２重量％以下が好ましく、より好ましくは０．１〜１．５重量％、更に好ましくは０．１〜１．０重量％、最も好ましくは０．２〜０．５重量％にコントロールするのがよい。α−ヒドロキシニトリル化合物の濃度が高すぎると、生成物阻害及びまたは失活、或いは高生成物蓄積濃度で初めて顕著となる基質阻害及びまたは失活の影響が急激に大きくなり、それまで進行していた反応が停止してしまう場合がある。また、α−ヒドロキシニトリル化合物の濃度が低すぎると反応速度を低下させることとなり、効率的にα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを製造できないので不利である。以上の理由から、反応中のα−ヒドロキシニトリル化合物定常濃度を管理することは非常に重要である。

製造されるα−ヒドロキシ酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量は１／１００以下がよく、好ましくは１／１００〜１／２００、より好ましくは１／２００〜１／３００、更に好ましくは１／３００〜１／５００、最も好ましくは１／５００以下である。製造されるα−ヒドロキシ酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が多すぎると該生体触媒懸濁液由来の不純物が反応液中に多く同伴されるため精製コストが上がり、製品品質が低下するので好ましくない。逆に、製造されるα−ヒドロキシ酸アンモニウムに対する使用乾燥生体触媒重量が少なすぎるとリアクターボリューム当たりの生産性が低下し、大きなリアクターサイズが必要となり経済的に不利となる。

以下実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。尚、本発明はこれらの実施例により限定されるものではなく、その要旨を超えない限り、様々な変更、修飾が可能である。特に実施例においては、グリコロニトリルを用いた実験のみを示すが、本発明の主旨を考慮すると、原料中に存在するアルデヒド或いはシアン化合物の濃度をコントロールすることが重要なので、グリコロニトリル以外のα−ヒドロキシニトリルについても同様の現象と結果が得られることは容易に類推できるものである。

本発明に使用する生体触媒であるAcinetobacter sp.AK226は本発明者らが既に特許生物寄託センター(産総研)に国際寄託したものであり、FERM BP-08590の国際寄託番号を有するものである。

生体触媒懸濁液中の乾燥生体触媒重量の測定法は、以下のごとく実施した。まず、適当な濃度の生体触媒懸濁液を適量取り、−８０℃まで冷却した後、凍結乾燥機を用いて完全に乾燥し、その重量値から前記生体触媒懸濁液の濃度を算出した。既知濃度となった生体触媒懸濁液を適当な複数の濃度に希釈し、ＵＶ計（６００ｎｍ）を用いて室温において透過度を測定し、該ＵＶ計での該生体触媒の検量線を作成した。以後、該ＵＶ計の指示値から任意の該生体触媒懸濁液の乾燥生体触媒濃度を算出した。

反応液の分析は、以下のごとく実施した。基質であるα−ヒドロキシニトリル及び生成物であるα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムは、高速液体クロマトグラフィーでα−ヒドロキシ酸として測定した。カラムはイオン排除カラム（島津Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０１Ｈ）、カラム温度は４０℃、移動相はリン酸水溶液（ｐＨ＝２．３）、検出器はＵＶ（島津ＳＰＤ−１０ＡＶ ｖｐ、２１０ｎｍ）及びＲＩ（島津ＲＩＤ−６Ａ）で実施した。

［実施例１］
[生体触媒の調製]
塩化ナトリウム０．１重量％、リン酸二水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．０５重量％、硫酸第一鉄七水和物０．００５重量％、硫酸アンモニウム０．１重量％、硝酸カリウム０．１重量％硫酸マンガン五水和物０．００５重量％を含む培養液２５０ｍｌを三角フラスコに仕込み、ｐＨが７になるように水酸化ナトリウムで調整し、１２１℃で２０分間滅菌した後、アセトニトリル０．５重量％を添加した。これにAcinetobacter sp.AK226を接種して３０℃で振とう培養した（前培養）。ミーストパウダー０．３重量％、グルタミン酸ナトリウム０．５重量％、硫酸アンモニウム０．５重量％、リン酸水素二カリウム０．２重量％、リン酸ニ水素カリウム０．１５重量％、塩化ナトリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム七水和物０．１８重量％、塩化マンガン４水和物０．０２重量％、塩化カルシウム二水和物０．０１重量％、硫酸鉄７水和物０．００３重量％、硫酸亜鉛７水和物０．００２重量％、硫酸銅５水和物０．００２重量％、大豆油２重量％を含む培養液３Ｌを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で２０分間滅菌した後、前記の前培養液を接種して３０℃で通気攪拌を行った。培養開始１０時間後から大豆油のフィードを開始した。ＰＨは７になるようにリン酸及びアンモニア水でコントロールし、最終的に約５重量%のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を得た。更に０．０６Ｍリン酸バッファーを用いて２回洗浄を行い、最終的にリン酸バッファーに懸濁されたAcinetobacter sp.AK226懸濁液(乾燥菌体濃度５〜１０重量%)を得た。

[原料グリコロニトリルの分析]
原料として用いるアルドリッチ製の５５重量％グリコロニトリルについて、高速液体クロマトグラフィーを用いて組成分析を実施した。カラムはイオン排除カラム（島津Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０１Ｈ）、カラム温度は４０℃、移動相はリン酸水溶液（ｐＨ＝２．３）、検出器はＵＶ（島津ＳＰＤ−１０ＡＶ ｖｐ、２１０ｎｍ）及びＲＩ（島津ＲＩＤ−６Ａ）で実施した。グリコロニトリル：５３．８重量％、グリコール酸：１．５７重量％、ホルムアルデヒド：検出限界（５重量ｐｐｍ）以下であった。

［初期比活性の測定］
上記の分析したアルドリッチ製の５５重量％グリコロニトリルを原料に、前記の生体触媒懸濁液を用いて加水分解反応を行った。まず、０．０６Ｍリン酸バッファーに懸濁した状態で冷蔵保存された既知菌体濃度のAcinetobacter sp.AK226懸濁液を濃度が３２０重量ｐｐｍとなるように５０ｍＬナスフラスコに予め仕込まれた０．０６Ｍリン酸水溶液（グリコロニトリル水溶液添加時にｐＨ＝６．８になるように予めｐＨ調整したもの）２０ｍｌに懸濁させた。該フラスコを３０℃恒温水槽に入れてスターラー攪拌を実施し、内温が３０℃になるまでしばらく保持した。次に原料の５５％グリコロニトリル水溶液を、マイクロピペッターを用いて０．３６ｍｌ添加し反応を開始した。５分後にサンプリングを実施し、２Ｍ塩酸水溶液で希釈することで反応を停止し、フィルター処理で菌体を除いた後、高速液体クロマトグラフィー分析を実施した。得られた初期比活性は３４０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]であった。結果を図１に示す。

[実施例２、３]
原料のアルドリッチ製の５５重量％グリコロニトリルに適宜量のホルムアルデヒドを添加する以外は実施例１と同様の操作で加水分解反応を実施し、初期比活性を評価した。ホルムアルデヒド濃度が５５０重量ｐｐｍの時、２７５[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]、ホルムアルデヒド濃度が１１２９重量ｐｐｍの時、２４２[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]であった。結果を図１に示す。

[比較例１，２]
原料のアルドリッチ製の５５重量％グリコロニトリルに、本発明で規定する範囲を超える量のホルムアルデヒドを添加した以外は実施例３と同様の操作で加水分解反応を実施し、初期比活性を評価した。ホルムアルデヒド濃度が３９６６重量ｐｐｍの時、１１０[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]、ホルムアルデヒド濃度が９９００重量ｐｐｍの時、８１[mmol/g-乾燥生体触媒/Hr]であった。結果を図１に示す。

本発明法によれば、原料グリコロニトリル中の不純物アルデヒドまたはシアンイオン濃度をコントロールすることにより、ニトリラーゼの持つ初期比活性を十分高くすることができるので、結果として、初期生産速度及び平均生産速度を高く保つことができ、任意のニトリル化合物から工業的に有用なα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムを実用的なリアクターサイズ、反応時間、触媒コストで生産することができる。

実施例及び比較例における原料グリコロニトリル水溶液中のホルムアルデヒド濃度と生体触媒の初期比活性との関係を示す図である。

Claims (9)

1. ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換するに際し、原料α−ヒドロキシニトリル水溶液に含まれる不純物アルデヒドの濃度を０〜３０００重量ｐｐｍにコントロールすることを特徴とするα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
2. ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体に由来する生体触媒を用いてα−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換するに際し、原料α−ヒドロキシニトリル水溶液に含まれる不純物シアンイオン濃度を０〜５０００重量ｐｐｍにコントロールすることを特徴とするα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
3. α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムに変換する反応の反応系中のｐＨを６以上８以下、且つ反応温度を３０〜６０℃にコントロールすることを特徴とする請求項１又は２記載のα−ヒドロキシ酸或いはα―ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
4. 生体触媒が、アシネトバクター属に属する微生物菌体に由来する生体触媒であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
5. アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226或いはアシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK227又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする請求項４記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
6. アシネトバクター属に属する微生物菌体が、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)AK226又はそれら菌体より誘導された微生物菌体であることを特徴とする請求項５記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
7. 不純物アルデヒドが存在するα−ヒドロキシニトリル水溶液に一般式Ｍ_ｍ（ＣＮ）_ｎ（ＭはＨ、ＮＨ_４或いは金属元素を表し、ｍ，ｎは整数を表す）で表されるシアン化合物を作用させて、該不純物アルデヒド濃度を低減させたα−ヒドロキシニトリル水溶液を原料に用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
8. 不純物シアン化合物が存在するα−ヒドロキシニトリル水溶液に該シアン化合物と等モル以上の対応するアルデヒドまたはケトンを作用させて、該不純物シアンイオン濃度を低減させたα−ヒドロキシニトリル水溶液を原料に用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法。
9. 原料として用いるα−ヒドロキシニトリルがグリコロニトリルである請求項１〜８のいずれかに記載のグリコール酸或いはグリコール酸アンモニウムの製造方法。

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