JP2005534718A - カチオンキャリヤー系において診断化合物および治療化合物を安定化させる新規方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、低分子量化合物をリポソーム中で安定化する方法に関し、その際、前記化合物は脂質膜中で低い溶解度を有する、かつ／または脂質膜を介して低い透過性を有する。有利には、脂質膜溶解度および／または脂質膜透過性を増大させるために、前記化合物は変性される。カチオンリポソームを標的部位、特に生物での標的部位に運ばれた後に、変性を反転させ、低分子量化合物が所望の作用を生じることもできる。

Description

本発明は、脂質膜中で低い溶解度を有する、かつ／または脂質膜を介して低い透過性を有する低分子量化合物をカチオンリポソーム中で安定化させる方法に関する。有利には、膜溶解性を増大させるためおよび／または脂質膜透過性を増大させるために、前記化合物を変性する。カチオンリポソームは標的部位、特に生物での標的部位に運ばれた後に、変性を反転させ、低分子量化合物が所望の作用を生じることもできる。

一般的には、リポソームの水性コンパートメント中にカプセル封入することにより、低分子量の水溶性分子をリポソームと一緒に調製することができる。この目的のために、例えば、フラスコの内壁で薄い脂質フィルムを化合物の水溶液で戻すこと（reconstitution）により、または周知のエタノール注入法により、リポソーム懸濁液は前記化合物の水溶液中で製造される。カプセル封入される薬物の量は、カプセル封入された体積と空隙体積の割合を掛けた水溶液中の成分の初期濃度に相応する。リポソームの内部の水性体積と懸濁液の全水性体積との割合が好ましくないので、カプセル封入された薬物の量は、むしろ通常は少ない。カプセル封入されていない化合物のフラクションを分離するために、透析、ダイアフィルトレーションまたは類似の方法が行われる。残念ながら、この分離工程の際にカプセル封入された化合物の大半が失われてしまう。

強い親油性の分子は、リポソーム膜中にこれらの分子を包埋することにより、リポソームと一緒に調製することができる。残念ながら、これらの分子の幾つかは、むしろ低い程度でしか包埋することができない。疎水性化合物は、二分子膜の炭化水素領域中に“溶解”し、限られた数の分子だけがスラブ中に挿入できると考えられている。これらの分子の極めて顕著な例は、抗癌剤であるパクリタキセルであるが、これは脂質と薬物の最終モル比が３３：１（３mol％）まででしか膜に負荷することができない。

これらの欠点をまとめると、本発明の根底にある課題は、水溶性または脂溶性であってよく、かつそれ自体が脂質膜中に僅かにだけ溶解する、かつ／または前記膜を介して低い膜透過性を有していてよい低分子量化合物の安定な調製物を製造する方法を提供し、前記化合物を標的部位に効率的に輸送することであった。

前記の課題は、脂質膜中に僅かにだけ溶解する、かつ／または該膜を介して低い透過性を有する低分子量化合物をリポソーム中で安定化する方法を提供することりより解決され、前記方法は次の工程：
ａ） 前記化合物を準備する、その際、化合物は負の実効電荷を有するか、任意に変性されて負の実効電荷を有している
ｂ） 工程ａ）の化合物を正の実効電荷を有するカチオン両親媒性物質、任意に負および／または中性の実効電荷を有する少なくとももう１つの両親媒性物質（アニオンおよび／または中性の両親媒性物質）と会合させ、かつ
ｃ） 正のゼータ電位を有するカチオンリポソームを形成する
から成る。

この方法では、負の実効電荷を有する化合物を溶液、例えば水溶液中で準備し、静電力、任意に両親媒性の力により選択的にカチオン脂質へ結合させる。この会合により、該化合物を含む安定なリポソームを形成することができる。この場合に、溶液中に存在する化合物の多くのフラクションがカチオン脂質に結合することができ、よってリポソーム中に組み込まれるので、ごく僅かなフラクションだけが失われるだけである。

低分子量化合物は、負の実効電荷を有する診断薬、負の実効電荷を有する治療薬またはこれらの組合せであることができる。負の実効電荷は、１つまたは幾つかのアニオン基の存在により、例えばカルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、ニトレートまたはこれらの組み合わせであることができる。これらの基は、このまま分子中に存在しているか、または変性、例えば化学的誘導化により挿入してもよい。好ましくは、化合物は有機分子であるか、有機部分を含有している。しかし、ハロゲン化物イオンのような弱いアニオンも負に帯電した低分子量化合物のグループに属すことに留意すべきである。

低分子量化合物は、約５０００Da、有利に約２００〜約５００Daのモル分子量を有していてもよい。化合物が負に帯電した基を含有しない場合には変性が必要である。変性する前に、化合物は、例えば約３より高い、有利に約４より高いオクタノール／水−分布係数（logD）により示されるような極めて高い親油性で特徴付けられるのが有利である。さらに、例えば反応性官能基を有することにより、化合物は変性／誘導化を行える必要がある。

診断薬は、診断薬またはイメージング剤、例えば、染料、近赤外線染料、蛍光染料、金粒子、酸化鉄粒子ならびに常磁性分子、Ｘ線減衰化合物（CTおよびX線用）、超音波用造影剤、X線およびｙ線放出アイソトープ（シンチグラフィー）および陽電子放出アイソトープ（PET） を含むその他の造影剤から選択することができる。特殊な例は、ヨウ化芳香化合物、例えばロパミドール（lopamidol）、^９９ｍTｃ−DIPA（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）または^１１１In−DTPAおよびこれらの誘導体、蛍光化合物、例えばローダミンまたはフルオレセイン、フェライト粒子またはGｄ錯体、例えばGd-DTPAまたはGd-DOTAから選択される。

治療薬は、抗炎症剤、抗癌剤、酵素薬、抗生物質、抗酸化剤、ホルモン剤、血管形成阻害剤、平滑筋細胞増殖／遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、化学伝達物質用放出阻害剤、血管内皮用の増殖／遊走阻害剤のような薬剤から選択することができる。特殊な例は、タキサン、微小管と相互作用する他の薬剤、例えば、エポチロン、ディスコデルモライド、ラウリマライド、イソラウリマライド、エレウテロビン、コルキシンならびにこれらの誘導体、ビンカアルカロイド、例えば、ビノレルビン、白金錯体、例えば、オキサリプラチン、カンプトテシン、アントラサイクリン、例えばドキソルビシンまたはスタチン（例えば、ロバスタチン）から選択される。

本発明では、リポソーム中の低分子量イメージング剤の濃度は、選択されたイメージング剤のクラスに相当に依存する。すなわち、所望の用途による。放射性原子核がnM範囲の極めて低い濃度で負荷されるのに対して、MRIとX線造影剤は、約１mM〜約１０００mMの濃度で負荷することができる。リポソーム染料は、約０．１mM〜約１００mMの濃度範囲で負荷することができるのに対して、金ナノ粒子は、数μMの範囲内である。ヒトのPET造影実験には、約１０mCi線量のフルオリン−１８が必要である。

治療化合物は、治療的に有効な濃度、例えば、リポソーム成分に対して、約０．１mol％〜約５０mol％、有利に約１mol％〜約２０mol％、さらに有利に約３mol%〜約１５mol%、有利に約５mol％〜約１０mol％の濃度範囲でリポソーム膜に負荷することができる。

本発明で使用されるカチオン両親媒性物質は、正の実効電荷を有する両親媒性物質である。一価または多価であることができる。正の実効電荷を有する脂質、リゾ脂質またはペグ化脂質から選択してもよい。したがって、有効なカチオン脂質には次のものが含まれる：
DDAB、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；N−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（DOTAP）；１，２−ジアシルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン、（次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイルおよびジステアロイルが含まれる；２個の異なるアシル鎖はグリセロール主鎖に結合することができる）；N−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N,N−ジメチルアミン（DODAP）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、（次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイルおよびジステアロイルが含まれる；２個の異なるアシル鎖はグリセロール主鎖に結合することができる）；N−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、（次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル、ジミリスチル、ジラウリル、ジパルミチルおよびジステアリルが含まれる；２個の異なるアルキル鎖はグリセロール主鎖に結合することができる）；
ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）；３β−［N−（N', N'−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）；２，３−ジオレオイルオキシ−N−（２−（スペルミンカルボキサミド）−エチル）−N,N−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）；β−アラニルコレステロール；セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）；diC14−アミジン；N−tert−ブチル−N'−テトラデシル−３−テトラデシルアミノプロパンアミジン；１４Dea２；N−（アルファ−トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル−D−グルタメートクロリド（TMAG）；O,O'−ジテトラデカノイル−N−（トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロパンアミド（DOSPER）；N,N,N',N'−テトラメチル−N,N'−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨージド；Solodin et al. (1995) Biochem. 43:13537-13544に記載されているような１−［２−（アシルオキシ）エチル］２−アルキル（アルケニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロリド誘導体、例えば、１−［２−（９（Z）−オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−（８（Z）−ヘプタデセニル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド）（DOTIM）、１−［２−（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］−２−ペンタデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（DPTIM）、例えば、Felgner et al.[Felgner et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 2550−2561]に記載されているような２，３−ジアルキルオキシプロピル第四アンモニウム化合物誘導体、第四アミンにヒドロキシアルキル部分を含有するもの、例えば１，２−ジオレイル−３−ジメチルーヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORI）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORIE）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシプロピルアンモニウムブロミド（DORIE-HP）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシブチルアンモニウムブロミド（DORIE-HB）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシペンチルアンモニウムブロミド（DORIE-Hpe）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、１，２−ジパルミトイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DPRIE）、１，２−ジステリルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DSRIE）；Santaniello et al..により報告されているアシルカルニチンのカチオンエステル[US5498633]。有利な実施態様では、カチオン両親媒性物質はN−［１−（２，３−ジアシルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムのような第四アンモニウム塩から選択され、その際、第四アミノ化合物の製剤学的に認容性の対イオンは、クロリド、ブロミド、フルオリド、ヨージド、ニトレート、スルフェート、メチルスルフェート、ホスフェート、アセテート、ベンゾエート、シトレート、グルタメートまたはラクテートから成るグループから選択される。

本発明の有利なリポソームは、DOTAP、DODAP、DOTAPまたはDODAPの類似物または他のカチオン脂質を、全体のリポソーム形成脂質の少なくとも２０＋ｘmol％の量で、有利に少なくとも３０＋ｘmol％、より有利には少なくとも４０＋ｘmol％の量で有し、ならびにDOPC、ペグ化脂質または中性の実効電荷を有する他の脂質を８０−２ｘmol％までの量、有利に７０−２ｘmol％までの量、最も有利には６０−２ｘmol％までの量（ここで、ｘmol％は、負荷化合物の量であり、かつ任意に存在する中性もしくは負に帯電した両親媒性物質の量である）で有する。

本発明のカチオンリポソームは、カチオン脂質を少なくとも約３０mol％、有利に約４０mol％、より有利に約５０mol％、さらに有利に約６０mol％、約７０mol％、約８０mol％、もしくは９９．９mol％の量まで含み、約pＨ７．５、室温で約０．０５M ＫＣl溶液中、正のゼータ電位を有することにより特徴づけられる。

アニオンおよび／または中性両親媒性物質は、中性または負の実効電荷により特徴づけられ、負または中性の実効電荷を有するステロールまたは脂質、例えば、コレステロール、リン脂質、リゾ脂質、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質またはペグ化脂質から選択することができる。それに関して、有効なアニオンおよび中性脂質には、次のものが含まれる：ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（特定の糖に限定されるわけではない）、脂肪酸、カルボン酸基を含有するステロール、コレステロール、１，２−ジアシル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル（DOPE）、１，２−ジアシル−グリセロ−３−ホスホコリンおよびスフィンゴミエリンが含まれる。グリセロール主鎖に結合する脂肪酸は、特定の長さまたは二重結合の数に限定されない。リン脂質は、２個の異なる脂肪酸を有することもできる。有利な実施態様では、中性の両親媒性物質はジアシルホスファチジルコリンである。

本発明の方法の工程ｃ）では、リポソームを脂質フィルム法によるか、または注入法により形成することができる。脂質フィルム法は、次の工程を含む：
ａ）ｉ．カチオン両親媒性物質、任意に少なくとも１つのアニオンおよび／または中性の両親媒性物質および前記化合物を有する脂質フィルムと
ｉｉ．水溶液
を準備する、または
ｂ）ｉ．カチオン両親媒性物質、任意に少なくとも１つのアニオンおよび／または中性の両親媒性物質を有する脂質フィルムと
ｉｉ．前記化合物を有する水溶液
を準備し、かつ
ｃ）前記脂質フィルムを前記水溶液中に懸濁させる。

注入法は、次の工程を含む：
ａ）カチオン両親媒性物質、任意に少なくとも１つのアニオンおよび／または中性の両親媒性物質を有する有機溶液を、前記化合物の水溶液に添加する、または
ｂ）カチオン両親媒性物質、任意に少なくとも１つのアニオンおよび／または中性の両親媒性物質および前記化合物を有する有機溶液を水溶液に添加する。

製造法のうち１つで使用される有機溶液は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、テトラヒドロフラン、クロロホルム、tert−ブタノール、ジエチルエーテルまたはこれらの溶剤の混合物から選択される有機溶剤を含んでいる。水溶液は有利には、糖またはアルコールまたはこれらの組合せから選択される凍結保護物質のような安定剤、例えば、トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトース、デキストラン、マンニトールまたはソルビトールを含んでおり、約２０％（m/v）までの範囲内で使用される。好ましくは、安定剤はリポソームの分散液の全体積に対して、約１％（m/v）〜約２０％（m/v）の範囲内、最も有利には約５％（m/v）〜約１０％（m/v）の範囲内で使用される。

リポソームが形成される次第、続いて少なくとも１種の透析および／または少なくとも１種のホモジナイゼーションおよび／または任意に少なくとも１種の滅菌ろ過および／または任意に凍結乾燥および／または戻し工程を行ってもよい。

上記のような方法により得られるカチオンリポソームは、全体的に正の電荷を有することにより特徴づけられ、これは外側の分子層中で正に帯電した過剰の分子を意味する。リポソームは、少なくとも２０mol％、有利に少なくとも３０mol％、最も有利に少なくとも４０mol％の過剰なカチオン脂質を含むことができる。例として、リポソームが負に帯電した脂質もしくは負に帯電した変性化合物を１０mol％含有している場合には、電荷の要求性を満たすために、正に帯電した脂質の量は、少なくとも３０mol％、有利に少なくとも４０mol％、最も有利には少なくとも５０mol％でなくてはならない。

カチオンリポソームは、静電力、任意に両親媒性相互作用により安定化され、有利には少なくとも１つの以下の特徴により特徴づけられる：
− ゼータ電位が約pＨ７．５、室温で約０．０５mM KCl溶液中、約２５mV〜１００mVの範囲内であり、有利には約pＨ７．５、室温で約０．０５mM KCl溶液中、約３５mV〜７０mVの範囲内である。
− 実質的に非変性化合物を含まない（負の実効電荷を提供するために化合物の変性が必要な場合）
− 化合物を約１〜５０mol％、有利に化合物を約５〜約２０mol％を有する、
− カチオン両親媒性物質を約３０〜１００mol％未満、有利にカチオン両親媒性物質を約５０mol％〜約９０mol％有する。
− 約５nm〜約５μｍ、有利に約２５nm〜約５００nm、より有利には約１００nm〜約３００nmの粒子直径を有する粒子から成る。

定義
本明細書中で使用されるすべての工業的および科学的用語は、本発明が関係する通常の当業者によって一般に理解されるような同じ意味を有するべきものとする。

量の値に関する“約”とは、表示された値に対して、最大＋／−２０％、有利に＋／−１０％の平均偏差を意味する。例えば、約３０mol％のカチオン脂質量とは、全体の脂質／両親媒性物質のモル濃度に関して、３０mol％＋／−６mol％、有利には３０mol％＋／−３mol％のカチオン脂質を意味する。

“活性成分”とは、診断的または治療的に有効な薬剤を意味する。

“両親媒性物質”とは、水溶性（親水性）と油溶性（疎水性）部分から成る分子を意味する。脂質部分は、有利には少なくとも１０、特に少なくとも１２個の炭素原子を有する少なくとも１つのアルキル基を含有する。

負に帯電した化合物がカチオン両親媒性物質に“会合”することは、静電力および／または両親媒性の力により前記化合物がカチオン有機分子に結合することを意味する。前記化合物とカチオン両親媒性物質の分子会合の実効電荷は、０に近いと考えられている。会合は、１：１に近いカチオン／アニオン電荷比により特徴づけられるのが有利であるが、１．５：１または＞２：１の電荷比も分子の性質に応じて使用してもよい。

“カンプトテシン薬”は、カンプトテシンまたはそれらの誘導体を意味する。カンプトテシン誘導体は、カンプトテシンの化学的誘導化によっても得られる。分子図のうち、最も頻繁な誘導化部位はＲ_１〜Ｒ_５として記載されている。表には、種々の部位での誘導化の一般的な例が記載されている。これらの例のいずれかの組合せおよび他の誘導化を行うことができる。化合物は塩酸塩として存在することもできる。ラクトン環は、６員環の代わりに７員環であってもよい。

“癌”とは、癌のより一般的な形、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭部癌、頚部癌、白血球、肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌および小児癌、例えば、脳幹グリオーム、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、上衣細胞腫、ユーイング肉腫／腫瘍ファミリー、胚細胞腫瘍、頭蓋外疾患、ホジキン疾患、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性癌、肝臓癌、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨の骨肉腫／悪性繊維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、テント上原始神経外胚芽腫瘍および松果体部腫瘍、異常小児癌、視覚路および視床下部グリオーム、ウィルムス腫瘍および急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、脳腫瘍、子宮頚癌、小児癌、小児肉腫、慢性リンパ球性リンパ腫、慢性骨髄性白血球、食道癌、ヘアリー・セル白血病、腎癌、肝臓癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、すい臓癌、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚癌、小細胞肺癌を含む一般的ではない癌を意味する。

“キャリヤー”とは、診断薬または治療薬と一緒に投与される希釈剤、補助剤、付形剤またはベヒクルを意味する。この用語は、複合体を含む製剤学的に認容性の成分も意味し、さらには活性成分と会合して意図する標的部位に薬剤の輸送を促進する。キャリヤーには、当業者に周知のようなリポソーム、ポリマー、脂質錯体、血清アルブミン、抗体、シクロデキストリンおよびデキストラン、キレートならびに他の超分子集成体が含まれる。

“カチオン”とは、生理学的ｐHで正の実効電荷または正のゼータ電位を有する薬剤を意味する。

ここで使用される“カチオン脂質”とは、カチオンである本発明（上記に列挙したような）の脂質を包含する。脂質は、これが生理学的pＨで正の電荷を有する場合にカチオンであるとみなされる。カチオン脂質上に脂肪酸が存在する場合には、１２〜２４の炭素の長さを有し、不飽和（二重結合）を６個まで含有し、アシルもしくはエーテル結合により主鎖に結合し、１個だけの脂肪酸鎖が主鎖に結合していてもよい。１個以上の脂肪酸が主鎖に結合する場合には、脂肪酸は異なっていてもよい（非対称）。混合調製物も可能である。

カチオンリポソームは、カチオン脂質自体から製造されるか、または他の脂質、特に、例えばコレステロール；１，２−ジアシル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル（DOPE）、１，２−ジアシル−sn−グリセロ−３−ホスホコリン；天然卵黄のホスファチジルコリン（PC）およびこのようなものを含む）、ならびに合成モノ−およびジアシル−ホスホエタノールアミンのような中性脂質との混合物の形で製造される。非対称脂肪酸は、上記のジアシル誘導体に関して、合成および中性のもの、ならびに混合調製物のものも含まれる。

“コロイド”または“コロイド粒子”は、媒体中に分散した粒子を意味するが、この媒体中では該粒子は溶解せず、かつ約１０nm〜５０００nmのサイズを有する。

“凍結防止剤”とは、凍結の影響からの化学種の保護を補助する物質を意味する。

“誘導体”とは、その一般的な構造特性を保持しながら、ある他の化合物から由来した化合物を意味する。

“診断薬”とは、種々の検出法により、標的部位を局在化または視覚化するために使用できる製剤学的に認容性の薬剤を意味する。診断薬またはイメージング剤には、当業者に公知のもの、例えば、染料、蛍光染料、金粒子、酸化鉄粒子ならびに常磁性分子、Ｘ線減衰化合物（CTおよびX線用）、超音波用造影剤、X線放出アイソトープ（シンチグラフィー）および陽電子放出アイソトープ（PET） を含む他の造影剤が含まれる。

“診断学的に有効”とは、モニターまたはイメージング目的のために標的部位を局在化または同定するために有効な薬剤を意味する。

“増強した血管新生活性により特徴付けられる疾患”とは、創傷治癒、組織炎症、関節炎、喘息、腫瘍成長および糖尿病性網膜症のようなプロセスを意味する。

ここで使用される“薬物”とは、製剤学的に認容性の薬理学的活性物質、生理学的活性物質および／または診断用途のための物質を意味する。

“ホモジナイゼーション”とは、幾つかの成分の間で均一な分布を達成する生理学的プロセスを意味する。１例は、高圧ホモジナイゼーションである。

“脂質”という用語は、その通常の意味で、脂肪、脂質、水中に不溶性である原形質のアルコール−エーテル溶解性成分を包含する一般用語として使用される。脂質は、脂肪、脂肪油、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、スルホリピド、アミノリピド、色素類脂肪および脂肪酸であってもよい。この用語は、天然に存在する脂質と合成脂質の両方を含む。本発明と関連する有利な脂質は、ステロイドおよびステロール、特にコレステロール、ホスファチジルおよびホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンを含むリン脂質である。脂肪酸がある場合には、これらは約１２〜２４個の炭素鎖の長さであり、６個までの二重結合を含有し、主鎖に結合していることができ、脂肪酸は異なっている（非対称）か、または１個だけの脂肪酸鎖、例えば、リゾレシチンが存在していてもよい。非カチオン脂質が天然源例えば、卵黄、ウシの心臓、脳もしくは肝臓または大豆から精製されるレシチン（ホスファチジルコリン）から由来する場合には、混合調製物も可能である。

“リポソーム”は、顕微的球状の膜に封入された小胞（約５０〜２０００nmの直径）を意味する。“リポソーム”という用語には、脂質二分子層により封入されたコンパートメントも含まれる。リポソームは、脂質小胞ともいわれる。リポソームを形成するために、脂質分子は、延びた非極性（疎水性）部分と極性（親水性部分）を有する。分子の疎水性と親水性部分は、有利には延びた分子構造の２個の末端に位置する。このような脂質が水中に分散する際に、これらは自然にラメラと称される二分子膜を形成する。ラメラは、非極性（疎水性）表面が相互に向かい合い、極性（親水性）表面が水性媒体に向いている２枚の脂質分子の単一層シートから成る。脂質により形成された膜は、細胞内容物を囲でいる細胞膜と同じような方法で水相部分を囲む。このように、リポソームの二分子層は、タンパク質成分が細胞膜中に存在すること以外は細胞膜と類似性を有する。本発明に関して使用されているように、リポソームという用語には多重ラメラリポソームが含まれ、これは一般的に約１〜１０ミクロンの範囲内の直径を有し、２〜数百の同軸の脂質二分子層と水性相とから交互に成っており、また一般的に約２０〜約４００ナノメーター（nm）、約５０〜約３００nm、約３００〜約４００nm、約１００〜約２００nmの範囲内の直径を有する１枚の脂質層から成る。これらの小胞は、多重ラメラリポソームを超音波に曝すことにより、または加圧下に定義付けられたサイズの細孔を有する膜を通して押出すことにより、または高圧ホモジナイゼーションにより製造することができる。

有利なリポソームは単ラメラ小胞であり、これは単層脂質の二分子膜を有し、かつ約２５〜４００nmの範囲内の直径を有する。

“低分子量化合物”とは、５０００ダルトン未満の分子量を有する分子を意味する。

“リゾ脂質”とは、１個の脂肪酸エステルを切断して１個の遊離ヒドロキシ基を有するグリセロー主鎖を生じる脂質を意味する。

“リゾリン脂質”とは、１個の脂肪酸エステルを切断して１個の遊離ヒドロキシ基を有するグリセロール主鎖を生じるリン脂質を意味する。

モルパーセント（またはmol％）は、濃度の割合を定義づける。モルパーセントは、例えば、脂質のモル割合（％で表示）または１リットル中の全体の脂質含量（モルで表示）に対する脂溶性の化学種の割合を意味する。DOTAP５mmol、DOPC４．７mmolおよびパクリタキセル０．３mmolから成る１リットルのリポソーム調製物は、全体の脂質含量に対して１０mMである。この場合に、DOTAPはリポソーム調製物に対して５０molパーセントを占め、DOPCが４７molパーセント、パクリタキセルが３molパーセントを占める。この調製物は、１０mM DOTAP／DOPC／パクリタキセル５０／４７／３のように記載することができる。

“ミセル”とは、コロイドの形の分子の凝集を意味する。

“変性”とは、化合物の化学構造を部分的に変化させることを意味する。

“負に帯電した脂質”とは、負の実効電荷を有する脂質、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（特定の糖に限定されることはない）、脂肪酸、カルボン酸基を有するステロールを意味する。グリセロール主鎖に結合した脂肪酸は、特定の長さまたは二重結合の数に限定されることはない。

“中性脂質”とは、中性の実効電荷を有する脂質、例えば、コレステロール、１，２−ジアシル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル（DOPE、多数の誘導体ファミリーがAvanti Polar Lipidsから入手可能）、１，２−ジアシル−グリセロー３−ホスホコリン（多数の誘導体ファミリーがAvanti Polar Lipidsから入手可能）、スフィンゴミエリンを意味する。

“粒子直径”とは、Malvern Zetasizer 3000を用いる動的光散乱法（DLS）により測定される粒子のサイズを意味する。

“ペグ化脂質”とは、１個以上のポリエチレングリコール残基を有する脂質を意味する。

“製剤学的組成物”とは、どちらか一方の成分が有するよりも優れた製剤学的特性を有する２種以上の異なる材料の組合せを意味する。

“リン脂質”とは、ホスフェート基と１個以上の脂肪酸を有する脂質を意味する。

“可逆性”とは、プロセスを反転させるように変化させることができる化学プロセスを意味する。

“ステロール”とは、ステロイドアルコールを意味する。ステロイドは、シプロペンタノペルヒドロフェナントレンと呼ばれる化合物から誘導される。ステロールの周知の例には、コレステロール、ラノステロールおよびフィトステロールが含まれる。

本明細書で使用されるような“タキサン薬”とは、微小管作用のメカニズムを有し、かつ珍しいキサンタン環構造を含む構造と細胞分裂阻止活性に必要な立体特異的側鎖を有する抗腫瘍薬のクラスを意味する。

“タキサン”とは抗血管新生剤を意味する。“タキサン”という用語には、親水性誘導体と疎水性誘導体の両方を含む多様な公知の誘導体が含まれる。タキサン誘導体は、次のものに限定されるわけではないが、国際特許出願No.WO99/18113に記載されているようなガラクトース、マンノース誘導体、WO99/14209に記載されているピペラジノおよび他の誘導体；WO99/09021、WO98/22451およびU.S.特許No. 5869680に記載されているタキサン誘導体；WO98/28288に記載されている６−チオ誘導体；U.S.特許No.5821263に記載されているスルフェンアミド誘導体；ならびにU.S.特許No.5415869に記載されているタキソール誘導体が含まれる。

“パクリタキセル”（ここでは、ドセタキセル、タキソテレ（ドセタキセルの調製物）、パクリタキセルの１０−デサセチル類似物およびパクリタキセルの３'N−デスベンゾイル−3'N−ｔ−ブトキシカルボニル類似物のような類似物、調製物、誘導体が含まれると解釈される）は、当業者に公知の技術を利用することにより容易に製造できる（WO94/07882、WO94/07881、WO94/07880、WO94/07876、WO93/23555、WO93/10076; U.S. Pat. Nos. 5294637; 5283253; 5279949; 5274137; 5202448; 5200534; 5229529;EP590267参照）、またはSigma Chemical Co., St. Louis, Mo.（Taxus brevifolia社製のT7402；またはTaxus yannanensis社製のT-1912）を含む種々の市販物から得られる。パクリタキセルは、一般に化学的に入手可能なパクリタキセルの形を意味するだけではなく、類似物（例えば、上記のようなタキトテレ）およびパクリタキセル共役物（例えば、パクリタキセル−PEG、パクリタキセル−デキストラン、またはパクリタキセル−キシロース）も意味すると解釈すべきである。

“治療薬”とは、癌のような疾患の病理の程度を減少させる化学種を意味する。このような化合物は、例えば、原発腫瘍成長、有利には癌の転移の可能性を減少させることができる。二者択一的に、このような化合物は、微細血管のサイズまたは数を減らすことによるか、または血管密度の割合を減少させることにより腫瘍の血管分布を減少させることができる。

化学種を“事実上不含”または“実質的に不含”とは、HPTLCにより検出不可能であるものと定義される。

“ゼータ電位”とは、レーザー・ドップラー微量電気泳動法を規定条件下で使用してZetasizer 3000のような装置で測定した、コロイド粒子のような粒子の表面電位を意味する。ゼータ電位は、溶液と流体力学的せん断層もしくは拡散層領域との間の境界での電位を説明する。

本発明の利点は、以下のとおりである：
負荷化合物は、本発明のリポソーム中で化学的に安定化される。安定な効果は、正に帯電した両親媒性物質と複合することによるものであり、場合により化合物の変性（負に帯電し、かつ両親媒性の誘導体）によるものである。本発明の調製物が実質的に分解産物不含であり、かつ電荷と両親媒性特性の要求性を有さない非変性化合物も不含であることを観察するために、両方の工程は重要である。

両親媒性物質の性質は、最も効果的なドラックデリバリー用の化合物の高い負荷を可能にする。これは、開示した組成物と他の両親媒性物質との間の改善された安定化相互作用（両親媒性相互作用）による。しかし、一本鎖の両親媒性物質、例えば、ステアリルアミンは、１０mol%以上の高い濃度では不適切である。それというのも、これらはリポソーム調製物の物理的安定性を著しく下げてしまうからである。したがって、一本鎖ではないカチオン性両親媒性物質（脂肪）が本発明の方法で使用される。

総体的に有利な調製物の生理化学的特性として、in vivoで標的部位へ負荷化合物をより効率的に輸送する役割がある。この利点は、結果として全身投与後に最小限の副作用しかないような改善された治療につながる。さらに、治療後の薬物耐性も検出されない。これは、他の薬物調製物での治療とは著しく異なる標的細胞による薬物の吸収による。

以下に概要されるように、カチオン脂質との相互作用を強化するように化合物の分子特性を変性することが提唱されている。これは、マイナスの電荷を分子に付けることにより、および／または更に両親媒性にすることにより達成できる。次に化合物は脂質に堅く結合し、脂質二分子層／膜の内部で不可欠な成分として可溶化する。

従って、化合物を負の実効帯電を有する部分（負に帯電した部分）で変性することが本発明の有利な実施態様である。変性は以下のものを含む：
ａ）負に帯電した部分を、例えば、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、アミド、アミン、炭素−炭素結合またはシッフ塩基により前記化合物に共有結合させる、
ｂ）前記化合物を負に帯電したリガンドでキレート化する、または
ｃ）前記化合物を、カルセランド、カリックスアレーン、フラーレン、クラウンまたはアンチ−クラウンエーテルのような負に帯電した部分内に取り込む。

好ましくは、変性は可逆的変性である。すなわち、変性は所望の標的部位、すなわち生物中の標的部位で反転し、それにより低分子量化合物が活性な形で放出される。

負に帯電した部分は、少なくとも１つ、有利には１個以上のカルボン酸のような酸基を有する分子、例えば、乳酸、クエン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、アジピン酸またはグルタミン酸から選択されるものから選ぶことができる。負に帯電した部分は、カルボン酸に限定されるわけではなく、硫黄またはリンまたはその他のヘテロ原子を含有する他の酸も使用できる。負に帯電した部分には、後者のポリマーも含まれる。負に帯電した部分が化合物と共有結合した後、必要に応じて少なくとも１個の遊離酸基が電荷の要求性を満たすために必要である。一方で、本来の分子を標的部位に近づけるため、または標的部位に放出させて望ましい治療効果を示すために新たな化学結合の切断も必要である。他方で、調製およびin vivoでの投与の間に変性が化学的に安定であることが重要である。また、化学安定性は化合物をその標的部位に効率的に輸送するために付与されるべきである。化学的に変性された治療化合物は、通常プロドラッグと呼ばれる。

酵素または簡単な加水分解による、分子と負に帯電した部分との間の化学結合の切断は、負荷リポソームが標的部位に到達したときに行われるべきである。結合および／またはエンドサートーシスの際に、化学的に変性された分子は標的細胞に入り、続いて負に帯電した部分の切断が治療／診断学的活性化合物を放出する。

化学的誘導化は、低分子量化合物上の反応性官能基へ誘導化部分をカップリングすることを含む。有利な反応性官能基の例は、例えば、ヒドロキシ基とアミノ基である。

誘導化部分の有利な例は、多価有機酸の無水物またはハロゲン化物であり、特にジカルボン酸の無水物、例えば、無水コハク酸である。誘導化部分と化合物との間の共役結合は、有利には、所望の標的部位で、例えば加水分解により切断できる結合である。有利な結合はエステルまたはアミド結合である。

二者択一的に、誘導化は、分子内反応、例えば、開環反応を含み、その際、有利には負に帯電した遊離基が生じる。例えば、ラクトン環が開かれる。

本発明の他の対象は、本発明の方法により得られるカチオンリポソームならびに製剤学的に有効量の前記リポソームと一緒に製剤学的に認容性のキャリヤー、希釈剤および／または補助剤を有する製剤学的組成物を提供することである。

さらに本発明の対象は、負の実効電荷を有する部分（負に帯電した部分）で変性された化合物と、少なくとも約３０mol％を有するカチオン両親媒性物質ならびに場合により更なるアニオンおよび／または中性両親媒性物質から成る正のゼータ電位を有するカチオンリポソームを提供することである。本発明のリポソームは、糖またはアルコールまたはこれらの組合せ、例えば、トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトース、デキストラン、マンニトールまたはソルビトールから選択される凍結防止剤のような安定剤を含むことができる。液体調製物中の凍結防止剤は、約１％（w/v）〜約２０％（w/v）、有利に約５％（w/v）〜約１０％（w/v）の量で存在することができる。他の保護剤は、トコフェロール、ビタミンCならびに例えば、好ましくない光、温度または他の環境条件による化学分解から調製物を保護するその他の物質である。例として、脂肪親和性のトコフェロールは約０．０５mol%〜約０．５mol%の量で存在でき、水溶性ビタミンCは、約０．０５mM〜約１．０mMの量で存在できる。

その他の解釈では、製剤学的有効量の前記リポソームと一緒に製剤学的に認容性のキャリヤー、希釈剤および／または補助剤を含む製剤学的組成物が提供される。

製剤学的組成物は、増大した血管新生活性、有利には癌、例えば、充実性腫瘍ならびに膀胱、頭部、胸部、頚部、結腸直腸、子宮内膜、頭部および首または腎臓癌、白血病、肝臓または肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞、肺、子宮、すい臓または前立腺癌のようなそれらの転移に特徴づけられる症状の診断、予防および／または治療のために使用することができる。さらに症状は、慢性炎症疾患、リウマチ様動脈炎、皮膚炎、乾癬または創傷治癒であってもよい。

本発明の他の対象は、低分子量化合物を血管新生の血管標的部位に輸送する方法を提供することであり、以下の工程から成る：
ａ．低分子量化合物を活性成分として有するカチオンリポソームを含む製剤学的組成物を準備し、
ｂ．製剤学的組成物を、これを必要とする対象に投与し、
ｃ．製剤学的組成物を標的部位と会合させ、
ｄ．低分子量化合物を放出させ、かつ場合により活性化させる。

低分子量化合物がイメージング剤である場合には、組成物はその標的部位に到達し次第、細胞内に入るか、または標的細胞により吸収されることなく周囲に蓄積される。さらに、ターゲッティングの際に、イメージング剤は造影のためにリポソーム構成物を出るか、またはリポソーム構成物内で診断特性を有していてもよい。ターゲッティングの際にリポソーム膜の分解が望ましい薬剤の例は、MRI造影剤であるが、リポソーム膜の遅い水交換によってその効果が減少する可能性がある。ここでは造影剤の放出が好ましい。この放出は、標的部位との相互作用の際またはエンドサイトーシスの際に生じてもよい。同様に、リポソーム膜の成分により消失される蛍光染料は、脂質小胞の分解の際に大きな蛍光シグナルを誘発する。他方で、放射線イメージング剤は、それらのリポソーム小胞の運命とは独立して、イメージとなる。それというのも、放射性崩壊はリポソーム成分に影響されないからである。一般的には、診断目的のために標的細胞によるイメージング剤の吸収は必要でない。

化学的に変性された治療化合物は、一般的にプロドラッグと称される。プロドラッグからの放出は、例えば、酵素または簡単な加水分解による、分子と負に帯電した部分との間の化学結合の切断によって、変性部分の分解により影響される。有利には、負荷リポソームが標的部位にある時に放出が生じるべきであり、結合および／またはエンドサイトーシスの際に、化学変性された分子は標的細胞中に入り、続いて、負に帯電した部分の切断が治療／診断学的活性化合物を放出する。

低分子量化合物の放出ならびに場合による活性化は、次のものから成る：
ａ）化合物を会合したカチオン両親媒性物質から遊離するおよび／または
ｂ）共有結合を加水分解するか、または閉環反応を行うことにより、負に帯電した部分を除去する。

後者ｂ）は、標的細胞と一緒にエンドサイトーシスすることにより、かつ／または標的細胞膜と一緒に融解することにより、かつ／または標的細胞膜を介して拡散することにより生じ得る。

プロドラッグの活性化は、加水分解、閉環または化合物の変性を反転させる他の方法から成ることができる。活性化とは、変性化合物が治療／診断学的に活性な元の構造／形へ変換することを意味する。

さらに、本発明を下記の図と実施例により詳説する。

図
図１：リポソームと会合する前と後のフルオレセイン誘導体（AF, F, CF）のUV-visスペクトル。グラフ中、DOTAPはDOTAP/DOPC 50/50を示し、PGはDOPG/DOPC 5/95を示す。遊離CFの曲線は、AFとFのうち一方と同じである（AFとFの両スペクトルは、明確に示されていない）。表から見て取れるように、DOPG/DOPCリポソームでは何のスペクトルシフトも観察されない。それに対して、DOTAP/DOPCリポソームでは、スペクトルシフトが明らかであり、AF＜F＜CFの順に増大している。
図２：１：１で２５mM DOTAP/DOPCリポソームの懸濁液と混合したAFの５mM溶液のUV-visスペクトル。ａ）混合後。ｂ）遊離染料を除去するためのダイアフィルトレーション後。ｃ）リポソームを分解し、染料を脂質から放出するためのトリトン添加後。
図３および４：種々のｐHと温度条件でのパクリタキセル（TXL）放出として示されるスクシニルパクリタキセル（SuccTXL）の化学安定性。
図５と６：リポソームSuccTXL含量とTXL放出として示されるリポソームSuccTXLの物理および化学安定性。
図７と８：４℃および室温（RT）でのTXL放出として示されるリポソームSuccTXLの安定性。
図９：Taxol^（Ｒ）とSuccTXL−カチオンリポソームを用いたNMRIヌードマウスにおけるA-375黒色腫の治療。
図１０：種々のカンプトテシン調製物を用いたEa.hy926細胞の治療。
図１１：種々のカンプトテシン調製物を用いたNMRIマウスにおけるA-375黒色腫の治療。
図１２：クロロホルム／メタノール中に溶解させたリポソームの形のカンプトテシンの励起スペクトルと蛍光スペクトル。
図１３：種々の条件下でのCPTのUV-visスペクトル。

実施例
以下の例は本発明を説明するものであるが、これらに限定されるものではない。

水溶性分子のリポソームへの会合
１．フルオレセイン染料誘導体
例として、種々のフルオレセイン染料誘導体を用いた調製物試験が概略されている。アミノフルオロセイン（AF）、フルオロセイン（F）およびカルボキシ−フルオロセイン（CF）を有する調製物が示されている。これら３種の成分は、カルボキシ基を有し、その際、プロトンの酸度はAF＜F＜CFの順に増大するため、その意味でカチオン脂質への結合も増大する。

調製方法は、以下の工程から成る。

１．１ 直接的負荷（Direct Loading）
リポソーム懸濁液の製造
ａ．フィルム法
リポソームは、文献［１］に記載されているような周知のフィルム法により製造できる。簡潔に述べると、脂質または脂質と薬物の有機溶液から溶剤を蒸発させて、脂質（または脂質と薬物）の薄いフィルムをフラスコの内壁で形成させる。薄い分子フィルムを染料を含有している水相中で再懸濁させ、緩衝液、イオン、凍結防止剤などのような更なる成分を含有していてもよい。一般的な調製物は２５mM DOTAP/DOPC1:1の懸濁液から成っており、これを染料の５mM溶液により再懸濁させる。

戻しの後に所望のｐＨを達成するために、水溶液はグルコース、トレハロース、緩衝液（Tris）を含有していてもよい。一般的なpＨは７〜８の間である。しかし、脂質に応じて、より高い値（pＨ９まで）または低い値（pＨ６まで）を選択してもよい。さらに処置するために、リポソーム調製物のpＨを調製後に変化させてもよい。

１例として、表１中には幾つかの実験からの結果が記載されている。さらに比較のためにアニオン脂質を用いる調製を行った。アニオンリポソームに関しては、殆どの染料がダイアフィルトレーションの間に損失されているのに対して、カチオンリポソームでは染料の大部分のモルフラクションがリポソーム懸濁液中に固定されたまま残っている。このことは、染料分子が脂質リポソームに効率的に結合していることを示す。CＦ試験に関しては、低い容積濃度の染料を選択した。それというのも、この場合に高い濃度にすると、CF分子による立体障害によりリポソームが不安定になってしまうほど結合が極めて強いからである。カチオンリポソームからの懸濁液中に固定されることが判明した染料のフラクションは、（アニオン性）DOPG含有リポソームのものよりもかなり高かった。吸収スペクトル中のバンドシフト（λmax）が観察され、これはAF＜F＜CFの順で増大し、結合の強さを示している。一方、DOPGリポソームに関しては、吸収極大のシフトが何も生じなかった。このことは、図１で最も明確にわかる。ここで、遊離染料とリポソーム染料に関する完全なスペクトルが描かれている。

ｂ．有機溶液の注入
フィルム法の代わりに、染料水溶液中へ脂質溶液を注入させることによりリポソーム懸濁液を得てもよい（cit.）。染料濃度は、所望する最終的な染料／脂質比に応じて広範囲で変化させることができる。標準値は、実験では５mMであり、最終的な脂質濃度は１５mMである。脂質用の通常の溶剤は、エタノール（“エタノール注入”）である。エタノール中の脂質の濃度は、通常４００mMであるが、これとは異なる値（２００mM、およびこれ以下）も同様に適用できる。一般的には、得られたリポソームの培地サイズを脂質濃度によりある程度調節することができる。エタノール中の脂質溶液の適量を強力に撹拌しながら注入するが、注入する量は最終的に所望の脂質濃度により与えられる。一般的には、１０〜２５mMの脂質濃度を有する脂質調製物が製造されるが、これよりも高いまたは低い濃度も可能である、１．１ａに記載されているようなすべての組成物と濃度は、この手法により得ることができる。エタノールの代わりに、他の適切な溶剤または混合物を使用することもできる。通常は、これらはアルコール、エーテル、クロロホルム、炭化水素などである。さらに、超臨界状態の溶剤、例えば、炭化水素、二酸化炭素、過フルオロ化化合物などを使用することもできる。上記の調製方法に続いて、押出し（２）、透析（３）、濃縮工程（４）または凍結乾燥を行うこともできる。

押出し
上記の方法のように得られたリポソーム懸濁液は、必ずしも所望の粒度分布を有するとは限らない。よって、続いて所定の孔径の膜を通す押出しを行ってもよい。この試験では、孔径２００nmの膜（会社規格）を通して押出しを行った。他の通常の押出し膜は１００nmまたは４００nmの孔径を有していた。粒度分布は、準弾性光散乱により測定した。

透析
リポソーム懸濁液からの低分子量化合物の分離
透析法を使用して、リポソーム懸濁液から低分子量成分を分離した。上記の水相中５ｍＭ染料を有する１５mM DOTAP/DOPC1:1調製物に対しては、約５０％の染料がＡＦのリポソーム懸濁液中に保持されたが、Ｆでは約６０％が保持されていた。ＣＦ０．５mMでは、事実上染料の１００％が溶液中に保持された（放出された染料の量はUV-vis分光分析によりモニターした）。

凍結乾燥
リポソーム調製物の凍結乾燥を標準的なプロトコールを用いて行った。懸濁液の組成と物理的状態は下記のように戻した後に特徴づけた。リポソームの凝集状態に著しく影響を及ぼすことなく、上記のように懸濁液を凍結し、室温まで戻すことができた。

１．２．遠隔負荷（Remote Loading）
染料のリポソームへの会合は、既に製造した調製物のように、染料溶液とリポソーム懸濁液を混合することにより簡単に行うことができる。染料／脂質の割合が最大負荷を超えない場合で、かつ結合定数が十分に高い場合には、事実上すべての染料がリポソームに結合することができる。負荷の有効性は、懸濁液のダイアフィルトレーションとUV-visと蛍光分光分析により測定することができる。１例として、AF（最も弱く結合するフルオロセインの変種）でDOTAP/DOPCリポソームを遠隔負荷した結果が得られている。純粋な脂質リポソームの２５mM懸濁液を標準的手法により製造した。次にAFの５mM溶液をこの懸濁液に添加した（同体積）。続いて、懸濁液を透析して遊離染料を除去した。溶液中の染料の含量をUV-vis分光分析により調節した。図２には、混合後、透析後ならびにトリトンを添加後のスペクトルが示されている。トリトンは、リポソームを分解し、脂質結合染料を放出するために添加した。

染料の約５０％がリポソームに結合したままであることから、スペクトルのレッドシフトが染料の脂質−結合状態を示していることが分かる。トリトンを添加した後に、吸収極大が遊離染料の元の値までシフトバックし、このことはリポソームが分解され、染料が放出されていることを示している。

リポソームの物理化学的特徴
調製物のすべての工程は、HPLC分析（脂質と薬物）とUV-vis分光分析によりモニターする。HPLC分析では、押出し後に僅かな材料の損失が観察され得る。UV-vis分光分析は、調製物の有効性を調節するための定性的手段として役立つ。染料のUV-visスペクトルは、脂質への結合においてシフトする。バンドシフトは、結合定数のファンクションであり、脂質が結合した染料と遊離染料のフラクションはUV-vis分光分析により評価することができる。

準弾性光散乱（Zetasizer 1000とZetasizer 3000, Malvern Instrument）を測定してリポソームの粒度分布を測定した。ゼータ電位はZetasizer 3000（Malvern Instruments）を用いて測定した。

２．パテントブルーとカチオンリポソームの会合
この例は、負に帯電した染料であるパテントブルーがカチオンリポソームと密接に会合することを説明する。

２．１リポソームの製造
パテントブルー（アルファズリンA）は、リンパ系の診断的視覚化に認可されている水溶性染料である。

染料の２．５％と０．２％（w/w）水溶液を製造した。適量の脂質をクロロホルム中に溶解させ、薄い脂質フィルムが形成されるまで溶剤を真空下に蒸発させることによりリポソームを製造した。脂質フィルムを４０℃で、３〜５mbarの真空下に約６０分間乾燥させた。引き続き、脂質を適量のパテントブルー（PB）溶液中に分散させ、多層ラメラの脂質小胞（１０mM脂質濃度）の懸濁液が得られた。一日後に、小胞を４００nm膜を通して押出し（加圧下に濾過）した（５回の試行）。表２には製造した調製物がまとめられている。

２．２．中性リポソームからの会合していない染料の分離
ゲルろ過を使用して染料（MW＜１０００Da）をコロイドリポソームから分離した。遊離染料はカラムの細孔中に保持されるが、リポソームは極めて大きいため空隙体積に保持されることなく溶出された。１０mMの脂質濃度を有するリポソーム調製物中には、水相の約２％がリポソーム中に閉じ込められているが、９８％は閉じ込められないと考えられている（Liposomes a practical approach, Ed. R. R. C. New, IRL Press, Oxford 1990）。この染料の量は、ゲルろ過によりリポソームから分離されることになる。

Microspin^ＴＭ S-300 HRカラム（Amersham）は、製造明細書で必要とされているように前平衡させ、中性リポソーム調製物Ｃを５０μｌ負荷した。この目的は、リポソームと会合しなかったパテントブルーが文献に記載されているようにリポソームフラクションから分離できるかどうかを調査することであった（Reynolds, J.A.; Nozaki, Y.; Tanford, C. Gelexclusion chromatography on S1000 Sephacryl: application to phospholipids vesicles. Anal Biochem 1983, 130(2), 471-474）。染料の大半は、カラムに保持されたが、僅かに青い溶液が溶出された（会合した染料を有するリポソーム；UV分光分析による予測で約２％）。このことは、中性リポソームに関しては、会合していない材料を分離するために確立された分離プロトコールを適用できることを示している。

２．３．会合していない染料のカチオンリポソームからの分離
Microspin^ＴＭ S-300 HRカラムを使用して会合していない染料をリポソーム調製物AとBから分離した。３つのカラムを製造文献で必要とされているように前平衡し、５０μｌのＰＢ０．２％溶液（カラム１）、リポソーム調製物Ａ（カラム２）または０．２％ＰＢ溶液を添加したリポソーム調製物Ｂ（カラム３）を負荷した。

遊離染料ＰＢは予想通りにカラム材料の細孔中に閉じ込められた。しかし、カラム２ではＰＢをカチオンリポソームから分離することができず、材料の大半は空隙体積中のカチオンリポソームと一緒にカラムから溶出された。カチオンリポソームとＰＢの混合物の場合（カラム３）には、意外にもカチオンリポソームと染料との相互作用が極めて強いため、２成分である染料とリポソームを簡単に混合することにより、染料がカラムを通してリポソームと一緒に運び出されるほど極めて強い相互作用を生じた。

２．４．リポソームと会合したＰＢの透析
２．２と２．３からの研究成果を透析によって更に確認した。リポソーム調製物Ａ，ＣおよびＤを、グルコースに対して、８〜１００００の分子量カットオフ（MWCO）を備えた透析管中で８時間透析した。実験の目的は、遊離ＰＢをその小さな分子量により膜の細孔を通すことにより、会合していない染料をリポソームにより会合した染料から分離することであった。

調製物Aに関しては、測定可能な染料は管から何も透析されなかった（UV分光分析により測定したところ１％未満）。調製物ＣとＤに関しては、著しい量の染料が透析された（約６０〜７０％）。ここでは、透析物が変化した後にさらに多くの染料が除去された。この例は、カチオンリポソームとアニオン染料との間の強い分子相互作用を示している。

３．金属とハロゲン化物含有誘導体
以下の例は、負に帯電した化合物、例えば、ガドリニウム錯体、テクネチウム錯体、フッ化物アニオンがカチオンリポソームと密接に会合することを示す。他のアニオン、例えば、ハロゲン化物イオン、ホウ素クラスター、または他の金属イオンの金属錯体、例えば、常磁性および発光ランタニド、放射性トレーサー、例えば、インジウム、タリウムまたはガリウムも類似した方法でカチオン脂質と会合してもよい。

３．１．ガドリニウム含有造影剤とカチオン脂質
脂質（１０mM DOTAP/DOPC 50/50）をクロロホルム中に溶解させ、脂質溶液を丸底フラスコに移した。有機溶剤を真空下に蒸発させ、透明な脂質フィルムがフラスコ表面に形成された。このフィルムを真空下（３〜５mbar）に４０℃で約６０分間乾燥させた。次に、フィルムを適量の造影剤の水溶液で再水和してリポソーム溶液が生じた。翌日に、４００nm膜を通してリポソーム溶液を５回押出しした。リポソーム性ではない造影剤を除去するために、ｐH７のグルコースに対してリポソームを８時間３回透析した（Pierce, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette, 10000 molecular weight cut off）。リポソームのサイズをZetasizer 1000と3000（Malvern Instruments）を用いて光子相関分光分析（PCS）により９０°の角度（２５℃）で測定した。４００nmの膜を通す押出しにより得られた平均直径は２５０nmであり、Gｄ濃度をX線蛍光により測定した。

３．２．フッ化物とカチオン脂質から成るリポソーム
脂質（１０mM DOTAPまたは１０mM DOPC）をクロロホルム中に溶解させ、溶液を丸底フラスコに移した。有機溶剤を減圧下に蒸発させ、透明な脂質フィルムをフラスコ表面に形成した。このフィルムを真空下（３〜５mbar）に４０℃で約６０分間乾燥させた。次に、フィルムを適量の１５０mMフッ化ナトリウム水溶液で再水和し、リポソーム溶液が生じた。翌日に、リポソーム溶液を２００nm膜を通して５回押出しした。リポソームのサイズをPCS（Zetasizer 1000と3000, Malvern Instruments）により測定した。リポソームと会合していないフッ化物を３回連続して透析工程により除去し（８時間、Pierce, Slide-A-Lyzer dialysis cassette; 10000分子量カットオフ）、リポソームフッ化物濃度はイオンクロマトグラフィーにより確立した。カチオン性１０mM DOTAPリポソームに関しては、フッ化物濃度が１．３mMであったのに対して、フッ化物イオン濃度は中性の１０mM DOPCリポソーム（０．３mMフッ化物）の約４倍低かった。はるかに低い中性リポソームのフッ化物イオン濃度は、負に帯電したハロゲン化物アニオンと相互作用するカチオン脂質の誘引力により説明される。

Ｂ水不溶性分子のリポソームへの会合
１．パクリタキセル誘導体の合成
Horowitz［US4942184］または［２］による方法に基づき、スクシニルパクリタキセル（SuccTXL）を合成した。

以下のスクシニルパクリタキセルを用いる例は、種々の誘導体の特異的例として役立つ。よって、負に帯電したその他の誘導体を合成し、乳酸、クエン酸、グルタル酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、アジピン酸またはグルタミン酸の活性化形（カルボン酸塩化物またはカルボン酸無水物）を使用して調製した。

パクリタキセル（Taxol）（３３mg, 0.0386mmol）を無水ピリジン０．５ｍｌ中に溶解させ、これに無水コハク酸７．７mg（0.0772mmol）と４−ジメチルアミノピリジン０．５mg（0.00386mmol）を添加した。得られた溶液を室温で３時間撹拌した。生成物をシリカゲル６０カラムにおいてでクロマトグラフィーにより精製し、スクシニルパクリタキセル３４．６mgが得られた。Rｆはクロロホルム−メタノール（９０：１０）中で０．４２であった。収率：８４％。

構造上のキャラクタリゼーション：
NMR、TLCおよびMS分析によりスクシニルパクリタキセルの化学構造を立証する。分析データは文献で報告されていた結果と一致した。

HPLC分析によれば純度は９９％よりも高かった。使用したHPLC法の幾つかのパラメーターは以下に概略されている：

スクシニルパクリタキセル−DOTAP（SuccTXL-DOTAP）の合成
以下のように、スクシニルパクリタキセルとDOTAPの有機溶液からSuccTXL-DOTAPを製造した：
スクシニルパクリタキセルとDOTAP（Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ−プロパン）-Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）のメタノール溶液を等モル比で水に添加した。溶剤を除去させた後に残った固体を水に溶解させ、凍結乾燥させてSuccTXL−DOTAPの細かい白色粉末が得られた。

更なるスクシニルパクリタキセル−カチオン両親媒性物質（SuccTXL-CA）の合成
スクシニルパクリタキセルと他のカチオン両親媒性物質を含有する組成物は、SuccTXL-DOTAPで使用したような方法に基づき製造した。SuccTXL−カチオン両親媒性物質を次のリストから選択されるカチオン両親媒性物質を用いて製造した：
DSTAP N−（２，３−ジステアリルオキシ−プロパン）−N,N,N−トリメチル塩化アンモニウム
DMTAP N−（２，３−ジミリストイルオキシ−プロパン）−N,N,N−トリメチル塩化アンモニウム
DODAP N−（２，３−ジオレオイルオキシ−プロパン）−N,N−ジメチルアミン
DMDAP N−（２，３−ジミリストイルオキシ−プロパン）−N,N−ジメチルアミン
^１NMR−分光分析と元素分析データは化学構造と一致した。

スクシニルパクリタキセルの化学安定性
種々の温度（４℃と４０℃）と種々のｐH（ｐH５，７，９）での水溶液中のスクシニルパクリタキセルの化学安定性をHPLCにより測定し、図３と４に示した。

４℃での安定性は、パクリタキセルの２'−OH基と負に帯電した部分（コハク酸）との間で形成されたエステル結合の切断によりスクシニルパクリタキセルから放出された遊離パクリタキセルの量とよく相関した。ｐH５と７では、スクシニルパクリタキセルは９日後に４％だけのパクリタキセル放出という高い安定性を示したのに対して、pＨ９では、９日後に７０％まで著しく増大した。

４０℃の温度では、パクリタキセルの強力な放出が全てのpＨ値で５６時間以内に観察され、このことは、化学的に結合したパクリタキセルの全体量をin vivoで利用できる可能性を示している。

Succ TXL-DOTAPのリポソーム調製物
脂質フィルム法またはエタノール注入に限定されることなくリポソームを製造した。

SuccTXL-DOTAPを有するリポソーム調製物を脂質フィルム法を用いて次のように製造した：脂質とスクシニルパクリタキセルを丸底フラスコ中でクロロホルム中に溶解させた。次に薄いフィルムが形成されるまでフラスコを真空下（１００〜２００mbar）で回転させた。脂質フィルムを約３〜５mbarの真空下に４０℃で約６０分間完全に乾燥させた。乾燥した脂質フィルムを氷浴で冷却させ、冷たい（４℃）グルコース溶液で再水和した結果、約１０〜２０mMの全体濃度で多重ラメラ脂質小胞の懸濁液が生じた。均一な分散液が形成され次第（１５〜２０分後）、リポソーム分散液を４℃〜４０℃の温度で、１〜５回、通常１００〜４００nmの適切な大きさのポリカーボネート膜を通して押出し（加圧下でろ過）した。各成分の実の濃度（HPLC）を測定し、かつゼータ電位とリポソームのサイズを標準の方法を使用して測定することにより、形成されたリポソーム分散液をキャラクタリゼーションした。DOTAPと、DOPC含有または不含から成るリポソームと、SuccTXL-DOTAPから成るリポソームを以下の表に示されているようなモル比で形成した。

脂質フィルム法とDOTAP/DOPC系を用いることにより、１４mol%まで（SuccTXLに応じて）を有するリポソームをHPLCによって測定したように調製した。ゼータ電位値は、SuccTXL−DOTAP含量が３〜１７mol%まで増大するにしたがって減少した（SuccTXLに応じて）。しかし、この傾向はDOPC不含の調製物では観察されなかった。リポソームのサイズは、リポソーム組成物によって著しく影響されることはなかった。
また、エタノール注入法を使用してリポソームを製造した：
エタノール中のDOTAP、 DOPCおよびSuccTXL-DOTAPの溶液を１００mM、２００mMまたは４００mMの種々の全体濃度で製造した。

各調製物は、以下の表に示されるリポソームのサイズ測定値によりキャラクタリゼーションした。

リポソームSuccTXL-DOTAP調製物の物理および化学安定性
安定性を調査するために、SuccTXL-DOTAP含有リポソームを４℃で３０日間まで貯蔵した。種々の時点で、各成分の濃度を測定（HPLC）し、調製物をリポソームのサイズ、ゼータ電位測定値により、かつ可能性のあり得る沈殿の測定により（顕微鏡的測定）キャラクタリゼーションした。さらに、スクシニルパクリタキセルの化学安定性を、HPLC分析に基づき放出されたパクリタキセルの測定により試験した。

SuccTXL含量（mol%）とSuccTXLから放出されるパクリタキセルによりモニターした種々のリポソーム調製物の長期安定性は、図５と６に示されている。

リポソームSuccTXL-DOTAP含量は、脂質の全体量を意味し、SuccTXL含量のmol%として示した。SuccTXL-DOTAPのSuccTXL成分から放出されるパクリタキセルは、リポソーム中のSuccTXL成分の初期量に基づき計算し、mol%として示した。結果は、DOPC含有または不含の極めて安定なリポソームSuccTXL-DOTAP調製物を示している。３０〜４０日間の貯蔵後に、３０mol%放出を伴って遊離パクリタキセルの時間依存性の直線状の増大があった。放出されたパクリタキセル含量が０．３mMの濃度（全体の脂質１０mM）に到達するたびに沈殿が見られた。このことは、リポソーム性パクリタキセルの量の増大が、薬物：脂質の割合が３mol%（０．３mM、全体の脂質１０mM）を上回る場合に沈殿を生じるパクリタキセルリポソームでの観察と一致した。

SuccTXL-DOTAP含有リポソームの凍結乾燥
SuccTXL-DOTAPリポソーム含有調製物を凍結乾燥するために、脂質フィルム法またはエタノール注入により（上記のように）または他の適切な方法により製造した。トレハロースまたは他の糖もしくはアルコールを調製の凍結防止剤として使用した。一般的な凍結乾燥のプロトコールは以下の図表に示されている。

凍結乾燥し、続いて必要量の水で戻したリポソーム調製物の例は、次の表に記載されている。

DOPC含有または不含の両方のリポソーム調製物は、PCSとゼータ電位の測定値により示されるように凍結乾燥物を戻すことにより簡単に形成される。さらに、HPLCデータにより示されるように、著しいパクリタキセル放出は凍結乾燥法の際に観察されなかった。

凍結乾燥したSuccTXL-DOTAP含有リポソームの安定性
新たに戻し、凍結乾燥したリポソームの安定性を４℃と室温で２４時間にわたり試験した。試験調製物の組成は、以下の表に示されている。

各凍結乾燥物に適量の水を添加した後、静かに振とうし、続いて戻した試料を４℃で更に３０分間貯蔵し、全体を脱気させた。戻したリポソームを４℃または室温でそれぞれ保持した。種々の時点（０時、４時、８時および２４時）で、サイズ、ゼータ電位およびHPLCによる各成分の濃度の測定によりリポソームをキャラクタリゼーションした。

４℃または室温で２４時間貯蔵した後に、各リポソーム調製物は凍結乾燥する前のリポソームのサイズと殆ど同じリポソーム直径を有した。さらに、同じ処置後でも各調製物のゼータ電位に著しい変化は観察されなかった。

HPLC分析は、優れた安定性を保証した。脂質成分の濃度が全く変化しない間は、パクリタキセルの放出は２４時間の貯蔵後でも全く無いか、殆ど見られなかった。４℃で貯蔵した場合には、図７に示されている通り、SuccTXL（SuccTXL-DOTAP）から放出されたパクリタキセルの量を測定することによりモニターしたところ、どの調製物もリポソームSuccTXL-DOTAPの著しい不安定性を表さなかった。

室温での貯蔵の結果、図８に示されているようにSuccTXLの初期濃度に応じて１０〜１３mol％のパクリタキセルの形成を生じた。

In vitroでの試験
リポソームスクシニルパクリタキセルの調製物の有効性は、薬物濃度と相関する細胞生存能の減少を分析することによりin vitroで測定した。細胞生存能が５０％まで阻害される薬物濃度（ＩＣ_５０）を阻害能力の指標として使用した。

A-375（形質転換した内皮細胞系）とEa.HY細胞（ヒト黒色腫細胞系）を一定の濃度（２×１０^４／ｃｍ^２）で２４ウェルプレート中に播種し、一晩５〜５．５％ＣＯ_２、３７℃、９０％までの湿度条件で培養した。一日目に、細胞培地を新たな培地の混合物と交換し、１１種の連続した薬物希釈剤を各ウェルに添加し（２重反復）、０．１〜１０００nMの最終薬物濃度の範囲内をカバーした。７２時間後に、各ウェル中の細胞生存能をミトコンドリアの脱水素活性（MTTアッセイ）を測定することにより測定した。生菌中、MTT基質を青い細胞不透過性染料（ホルマザン）と交換した。１時間後に培地を除去し、細胞をイソプロパノール／０．０４％ＨＣlで溶解し、ELISAリーダーで計測した５５０nm（ＯＤ_{５５０ｎｍ}）の波長での光学密度としてブルーホルマザンの量を示した。各薬物濃度に対する平均ＯＤ_{５５０ｎｍ}値をプロットすることにより、シグマプロット分析ソフトを用いて試験の数値を評価した。最も良くフィットした曲線をダブルシグモイド仮定演算規則に基づき計算し、ＩＣ_５０値を以下の結果を有する最も良くフィットした曲線に従って測定した。

In vivoでの実験
Elevage JanvierのNMRIヌードマウスを隔離された換気ケージ中で環境条件を保ちながら（SPF設備、２２℃、湿度３０〜７０％、１２時間の明暗サイクル）食糧と水を任意に与えて飼育した。実験計画は審査され、地方自治体から認可された。

ATCCから提供されているデータシートに記載されているように腫瘍細胞（A-375ヒト黒色腫細胞系, ATCCNr.：CRL-1619）を成長させた。腫瘍細胞（PBS中５×１０^６）を０日目に５０μｌの量でマウスの右の背側側腹部に皮下接種した。

マウスを実験グループ（１ケージあたり８匹）に分け、腫瘍接種前に少なくとも５日間飼育し、処理（体重の増加のモニターを含める）した（＝−６日から０日）。薬物治療は、腫瘍が約１００ｍｍ^３の量に達した後に開始した。薬物を等毒性用量で週に３回（月曜、水曜、金曜）次の３週間の間、静脈内に注射した。薬物を記載したように製造した。等毒性用量の化合物を別々の実験で測定し、ここで血液学的パラメーター、体重および動物の臨床観察に基づき毒性を評価した。溶液を〜１０μｌ／ｇ体重の量でゆっくり投与した。

動物を全体の実験の間と、治療終了後に少なくとも１週間、臨床的にモニターした。腫瘍サイズのモニターは、病期の後、投与前、治療期間の間および回復期間の間、週に３回行った（少なくとも１週間）。腫瘍の寸法をカリパスにより測定し、腫瘍のサイズを次の式：V＝πLW^２／６（L＝最長の長さ、W＝垂直軸の幅）に従って計算した。各動物の体重を全ての動物に対して、治療期間の間（例えば、−６日目〜０日目）、腫瘍接種後、治療開始後および回復期間の間（少なくとも１週間）に少なくとも２回モニターした。EDTA血液を４つの時点で延髄後の集網から収集した：治療の間（−３日目）、腫瘍病期（７日目）、治療の真ん中（〜２１日目）および回復期間の終わり（２８日目）に、血液学用の治療グループの４匹の動物から。赤血球と白血球細胞と血小板の数を自動細胞カウンター（Abbott Cell Dyn 3500）を用いて測定した。

動物実験の結果は、以下の図式と表に示されている。コントロールグループの腫瘍が急速な進行性の腫瘍成長を示したのに対して、全ての薬物調製物は腫瘍成長速度を減少させた。それに対して、SuccTXL-DOTAP調製物は、腫瘍成長速度において強い減少を示し、Ｔａｘｏｌ^（Ｒ）は、限られた範囲でのみ腫瘍成長を減少させた（図９）。

２．カンプトテシン誘導体の合成
スクシニルカンプトテシン（SuccCam）をスクシニルパクリタキセルの合成に使用した方法に基づき合成した。カンプトテシン（13mg、0.0386mmol）を無水ピリジン０．５ｍｌ中に溶解させ、これに無水コハク酸７．７ｍｇ（0.0772mmol）と４−ジメチルアミノピリジン０．５ｍｇ（0.00386mmol）を添加した。得られた溶液を室温で３時間撹拌した。生成物をSilica-gel60カラムにおいてクロマトグラフィーによって精製した。

構造上のキャラクタリゼーション：
NMR、ＴＬＣおよびＭＳ分析を使用してスクシニルカンプトテシンの化学構造を確認した。

スクシニルカンプトテシン−DOTAP（SuccCam-DOTAP）の合成
SuccCam-DOTAPをSuccCamとDOTAPの有機溶液から沈殿／結晶化により以下のように形成した：
SuccCamとDOTAP（N−（２，３−ジオレオイルオキシ−プロパン）−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド）のメタノール溶液を等モル濃度比で水に添加した。溶剤を蒸発させた後、残りの固体を水中に溶解させ、凍結乾燥してSuccCam-DOTAPの細かい白色粉末が得られた。化学分析（NMR、元素分析）を使用してSuccCam-DOTAPモル比を立証した。

その他のスクシニルカンプトテシン−カチオン両親媒性物質（SuccCam-ＣA）の合成
SuccCamと他のカチオン両親媒性物質含有のカンプトテシンをSuccCam-DOTAPに使用された方法に基づき製造した。SuccCam-カチオン両親媒性物質の組成物を以下のリストから選択されたカチオン両親媒性物質を用いて製造した。
DSTAP N−（２，３−ジステアリルオキシ−プロパン）−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド
DMTAP N−（２，３−ジミリストイルオキシ−プロパン）−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド
DODAP N−（２，３−ジオレオイルオキシ−プロパン）−N,N−ジメチルアミン
DODAP N−（２，３−ジミリストイルオキシ−プロパン）−N,N−ジメチルアミン
SuccCam-DOTAPのリポソーム調製物
脂質フィルム法またはエタノール注入法に限定することなく、リポソームを製造した。

SuccCam-DOTAPを含むリポソーム調製物を脂質フィルム法を用いて以下のように製造した：脂質とSuccCamを丸底フラスコ中でクロロホルムに溶解させた。次に脂質フィルムが形成されるまでフラスコを真空下（１００〜２００mbar）に回転させた。脂質フィルムを約３〜５mbarの真空下に４０℃で約６０分間完全に乾燥させた。乾燥した脂質フィルムを氷浴で冷却させ、冷たい（４℃）グルコース溶液で再水和し、約１０〜２０mMの全体濃度で多重ラメラ脂質小胞が生じた。均一分散液が形成され次第（１５〜２０分後）、リポソーム分散液を４℃〜４０℃の温度で、１〜５回、通常１００〜４００nmの適切な大きさのポリカーボネート膜を通して押出し（加圧下でろ過）した。形成されたリポソーム分散液を標準方法を用い、ゼータ電位とリポソームのサイズを測定することによりキャラクタリゼーションした。DOTAPおよびSuccCamまたはDOTAP/DOPCおよびSucCamから成るリポソームを同じ方法で調製した。後者の場合には、DOTAP/DOPCが50/50または50/（50-x）の標準的な割合であり、ここでxはmol%でのSuccCamの量である。

脂質フィルム法とDOTAP/DOPC系を用いて、１５mol%（SuccCamに応じて）までのリポソームをHPLCにより測定されたように調製することができる。２０mol%を有するリポソームは、好ましくないリポソームのサイズと粒度分布（Pl）を有し得る。ゼータ電位値は、SuccCam-DOTAP含量が３〜２０mol％まで増大するに伴って減少した（SuccCamに応じて）。リポソームのサイズは記載はリポソーム組成物によっては著しく影響されなかった。

エタノール注入法を使用してリポソームを製造した：エタノール中のDOTAP、DOPCおよびSuccCam-DOTAPの溶液を全体濃度が４００mMになるように製造した。一例として、１０mol%SuccCam、DOTAP２８０．８ｍｇ、DOPC２５３．２mg、SuccCam３５．６mgを有する調製物をエタノール１ｍｌ中に溶解させた（最終濃度：４００mM）。エタノール性溶液を水相に強力に撹拌しながら注入し、所望の脂質濃度が得られた。最も頻繁には、１０mM〜２５mMの脂質濃度が達成された。

SuccCam−DOTAP含有リポソームの凍結乾燥
SuccCam−DOTAPリポソーム含有調製物を凍結乾燥するために、脂質フィルム法またはエタノール注入により（上記のように）または他の適切な方法により製造した。トレハロースまたは他の糖もしくはアルコールを凍結防止剤として使用した。

カンプトテシン−カルボキシレート含有リポソーム
リポソーム懸濁液の製造
ａ．フィルム法
カンプトテシンを有するリポソームは、文献［３］に記載されているような周知のフィルム法により製造できる。簡潔に述べると、脂質または脂質と薬物の有機溶液から溶剤を蒸発させて、脂質（または脂質と薬物）の薄いフィルムをフラスコの内壁で形成させる。薄い分子フィルムを水相中で再懸濁させるが、これは緩衝液、イオン、凍結防止剤などのような更なる成分を含有していてもよい。この方法により、リポソーム懸濁液は自己集合プロセスで形成される。一般的な調製物は９０μM DOTAPと１０μM カンプトテシンのフィルムをクロロホルム／メタノール１０／１の溶液から形成することにより得られる。次に全体のリポソーム濃度（脂質＋薬物）が１０mMである懸濁液を得るためにフィルムを水相１０ｍｌで戻す。戻した後に、所望のpＨを達成するために、水溶液はグルコースまたはトレハロースおよび緩衝液（Tris）を含有していてもよい。一般的なpＨは７〜８の間である。しかし、脂質に応じて、より高い値（pＨ9まで）または低い値（pＨ６まで）を選択できる。さらに処置するために、リポソーム調製物のpＨを調製後に変化させてもよい。このように、薬物／脂質比が１：９であり、全体（脂質＋薬物）の濃度が１０mMであるリポソーム調製物が得られる。その他の一般的なモル濃度は１５mM、２０mMまたは２５mMである。必要な場合は、５０mMまでのモル濃度を調製してもよい。薬物：脂質比は、通常は５：９５〜１５：８５の範囲内から選択される。脂質相はDOTAPのようなカチオン脂質だけで成り立っていてもよく、また５０％までが帯電脂質と非帯電脂質から成っていてもよい。頻繁に使用した標準的な調製物は、CPT／DOTAP／DPOC＝５：４７．５：４７．５、または５：５５：４５または１０：４５：４５または１０：６０：３０から成る。

方法１ａ．の代わりに、調製用にカンプトテシンをカルボキシレート、またはカルボキシレート塩に変換してもよい。従って、薬物のカチオン脂質への会合を容易にするためにCPTは“活性化”される。実際に、カルボキシレートは分子の形であるが、これはカチオン脂質と会合する。CPTを薬物の必要量（すなわち、１ａで記載されている例では１０μＭ）を含有しているＮＨ_３中に溶解し、フラスコに添加する。溶剤を蒸発させた後に、CPTカルボキシレートのアンモニウム塩のフィルムが形成される。次に、脂質の有機溶液を添加し、溶剤を蒸発させる。このように、カンプトテシンと脂質フィルムが得られ、その際、カンプトテシンはカチオン脂質により容易に結合する。特に低いｐH値では、薬物／脂質の高い値を有するリポソームを得ることができる。

さらに、CPTカルボキシレートは、純粋な脂質フィルムを戻すための水溶液の一部であってもよい。この場合に、分離工程または濃縮工程を調製の後に行ってもよい。
ｂ．有機溶液注入
二者択一的に、脂質溶液、または脂質と薬物の溶液を水溶液に注入することによりリポソーム懸濁液を得てもよい。脂質、または脂質／薬物相の一般的な溶剤はエタノール（“エタノール注入”）である。

薬物水溶液への脂質のエタノール注入
エタノール注入はリポソーム懸濁液を形成するための周知の方法である。本発明の例では、カンプトテシン−カルボキシレート水溶液へエタノール注入が行われる。薬物とカチオン脂質との間の誘引相互作用により、カンプトテシン含有リポソームが自己集合プロセスにより形成される。１０mM CPT／DOTAP1:9懸濁液１０ｍｌを得るために、CPTカルボキシレートの１０μM溶液（任意にa.に記載されているような添加剤を更に含有している）が製造される。有利には、ａ．に記載されているようなCPT カルボキシレートのアンモニウム塩も取り入れられる。二者択一的に、CPT カルボキシレートを他の塩基中で高いpHでCPT を溶解させ、引き続き、緩衝液によりpHを所望の値にすることにより製造することができる。水相は実験の必要性に応じて５〜８の間のpHを有していてもよい。エタノール中の脂質溶液の適量が強力に撹拌しながら注入される。ａ．に記載されているような全ての組成物と濃縮物をこの方法により得ることができる。エタノールの代わりに、他の適切な溶剤またはこれらの混合物を取り入れることができる。一般的には、これらはアルコール、エーテル、クロロホルム、炭化水素などである。同様に超臨界状態の溶剤、例えば、炭化水素、二酸化炭素、過フルオロ化化合物などを使用することもできる。上記の調製方法に続いて、押出し（２）、透析（３）、濃縮工程（４）または凍結乾燥を行うこともできる。

二者択一的に、脂質と薬物の両方を注入溶液中に溶解させることもできる。その他の工程も同様である。

押出し
上記の方法により得られたリポソーム懸濁液は、必ずしも所望の粒度分布を有するとは限らない。よって、続いて所定の孔径の膜を通す押出しを行ってもよい。この試験では、２００nmの孔径の膜（企業規格）を通して押出しを行った。他の通常の押出し膜は１００nmまたは４００nmの孔径を有していた。粒度分布は、準弾性光散乱により調節した。
リポソーム懸濁液からの低分子量化合物の分離
透析を使用して、リポソーム懸濁液から低分子量成分を分離した。これは、特にエタノール注入を用いる実験の場合であり、この場合に非リポソームカンプトテシンのフラクションとエタノールの特定量が懸濁液中に存在する。この場合に、遊離CPTの放出をUV-vis分光分析によりモニターした。上記のエタノール注入によるDOTAP/CPT90:10調製物（２ｂ）に対しては、CPTの８０％がリポソーム相に結合することが見出された。すなわち、２０％が透析において放出された。平衡は４時間後に達成された。

リポソーム調製物の凍結乾燥を標準的なプロトコールを用いて行った。懸濁液の組成と物理状態を下記のような戻しの後にキャラクタリゼーションした。上記のような懸濁液は、リポソームの凝集に著しく影響することなく凍結し、室温まで戻すことができた。

リポソームの物理化学的特徴
調製物のすべての工程は、HPLC分析（脂質と薬物）とUV-vis分光分析によりモニターした。HPLC分析では、押出し後に僅かな材料の損失が観察され得る。UV-vis分光分析は、調製物の有効性を調節するための定性的手段として役立つ：
CPTのスペクトルが分子状態と局所環境に強く依存することは周知である。よって、ラクトン型、カルボキシレートおよびリポソームCPTのスペクトルを、スペクトルの形から定量的に区別することができる。

準弾性光散乱（Zetasizer 1000とZetasizer 3000, Malvern Instrument）を測定してリポソームの粒度分布を測定した。

ゼータ電位はZetasizer 3000（Malvern Instruments）を用いて測定した。

細胞培養実験の結果
In vitroでのLipoCamの細胞増殖抑制能の測定
細胞増殖抑制薬の効果を、薬物濃度に相関する細胞生存能の減少を分析することによりin vitroで測定した。細胞生存能が５０％まで阻害される薬物濃度（ＩＣ_５０）を各薬物の阻害能力の指標として使用した。細胞増殖抑制能力が高いほど、ＩＣ_５０値が低い。高い阻害能力を有する薬物は、nM範囲内のＩＣ_５０値を有した。ここでは、リポソームにより封入されたカンプトテシンカルボキシレート（RM544=Lipocam I、RM541=Lipocam II、RM542=Lipocam III）の３種の調製物を遊離カルボキシレート（RM543）と比較した。

原理
適切な細胞系（すなわち、内皮細胞系または腫瘍細胞系）を４つの２４ウェルプレート中に一定の密度で接種した。１日または２日後に、１１種の連続した薬物希釈液を添加して０〜５０００nMの範囲内の最終薬物濃度をカバーした。それぞれの濃度を独立して２つのウェルで測定し、アッセイの精度を上げた。薬物の無い２つのウェルをコントロールとして使った。細胞を最適な成長条件でインキュベートした（５〜５．５％ＣＯ_２、３７℃、〜９０％湿度）。７２時間後に、各ウェル中の細胞生存能をミトコンドリアの脱水素活性（MTTアッセイ）を測定することにより測定した。生菌中、MTT基質を細胞不透過性の青色染料（ホルマザン）と交換した。１時間後に培地を除去し、細胞をイソプロパノール／０．０４％ＨＣlで溶解し、ブルーホルマザンの量を５５０nm にてELISAリーダーで計測した（溶菌緩衝液に対して測定）。各薬物濃度に対する平均ＯＤ_{５５０ｎｍ}値（同一の薬物濃度を有する２つウェルのもの）をプロットすることにより、シグマプロット分析ソフトを用いて実験値を評価した。ＩＣ_５０濃度を最大の半分のＯＤ_{５５０ｎｍ}値で測定した。高い阻害能は低いＩＣ_５０値を生じた。

実験
２×１０^４／ｃｍ^２Ea. Hy926細胞（形質転換したヒト内皮系）を４つの２４ウェルプレートに播種し、一晩培養した。１日目に、細胞培地中で各カンプトテシン調製物の５倍濃縮した１１個の原希釈液を製造した（25000、10000、5000、2500、1250、500、250、50、25、12.5、5ｎM）。全ての希釈液を製造してから培地を細胞から取り除き、新たな培地４００μｌ＋各々の原薬物濃縮物１００μｌを添加した（各濃縮物を２個のウェルに）。この結果、原シリーズの１：５希釈液が生じた（１nM〜５０００nMの最終薬物濃度）。この２つのウェルには薬物を添加しなかった（コントロール）。このプレートを更に７２時間培養した。このインキュベーション期間の後に、MTT気質を含有している新たな培地と前記培地を交換し、１時間インキュベートした。培地を取り除き、細胞をイソプロパノール／０．０４％ＨＣｌ中で溶解し、ＯＤを５５０ｎｍで測定した。

結果
図１０に示されている通り、３種すべてのLipoCam調製物（RM541、RM542、RM544）は、遊離カンプトテシンカルボキシレートと同等もしくは良好な成長阻害曲線を示した。ＩＣ_５０値は２５〜３０nMの間であった。よって、リポソームにより封入されたカンプトテシンカルボキシレートはin vitroで高い細胞阻害能を有した。
動物実験の結果：
ヌードマウスのA-375黒色腫におけるLipoCamの治療的有効性
材料と方法：
NMRI−ヌードマウスをElevage Janvierから購入し、隔離された換気ケージ中で環境条件を保ちながら（SPF設備、２２℃、湿度３０〜７０％、１２時間の明暗サイクル）食糧と水を任意に与えて飼育した。実験計画は審査され、地方自治体から認可された。

ATCCから提供されているデータシートに記載されているように腫瘍細胞（A-375ヒト黒色腫細胞系：CRL-1619）を成長させた。腫瘍細胞（PBS中５×１０^６）を０日目に５０μｌの量でマウスの右の背側側腹部に皮下接種した。

マウスを実験グループ（１ケージあたり８匹）に割り当て、腫瘍接種前に少なくとも５日間飼育し、処理（体重の増加のモニターを含める）した（＝−６日から０日）。薬物治療は、腫瘍が約１００ｍｍ^３の量に達した後に開始した。薬物を等毒性用量で週に３回（月曜、水曜、金曜）３週間の間、静脈内に注射した。薬物を実施例で記載したように製造した。等毒性用量の化合物を別々の実験で測定し、ここで血液学的パラメーター、体重および動物の臨床観察に基づき毒性を評価した。溶液を〜１０μｌ／ｇ体重の量でゆっくり投与した。

動物を全体の実験の間と、治療終了後に少なくとも１週間、臨床的にモニターした。腫瘍サイズのモニターは、病期の後、投与前、治療期間の間および回復期間の間、週に３回行った（少なくとも１週間）。腫瘍の寸法をカリパスにより測定し、腫瘍のサイズを次の式：V＝πLW^２／６（L＝最長の長さ、W＝垂直軸の幅）に従って計算した。各動物の体重を全てのグループに対して、治療期間の間（例えば、−６日〜０日）、腫瘍接種後、治療開始後および回復期間の間（少なくとも１週間）に少なくとも２回モニターした。EDTA血液を４つの時点で眼球後脈叢から収集した：治療の間（−３日）、腫瘍病期（７日目）、治療の真ん中（〜２１日目）および回復期間の終わり（２８日目）に、血液分析用の全ての治療グループの４匹の動物から。赤血球と白血球細胞と血小板の数を自動細胞カウンター（Abbott Cell Dyn 3500）を用いて測定した。

結果は、図１１に示されている。コントロールグループの腫瘍が急速な進行性の腫瘍成長を示したのに対して、等毒性用量で適用された全ての薬物調製物は抗腫瘍効果を示した。最も効果的な調製物はLipoCamIIIであり、殆どの動物で全体の腫瘍が退行した。LipoCamIとLipoCamIIは、一時的な腫瘍退行を示し、ゆっくりした腫瘍の再成長は治療期間の下半期で開始された。CPT-Na-カルボキシレートは、コントロールグループと比較して遅延だけを示した。

クロロホルム／メタノールに溶解させたCPT（“遊離CPT”）とリポソームCPTの分光分析によるキャラクタリゼーション、励起スペクトルおよび蛍光スペクトルは、図１２に示されている。

図１３は、種々の条件下でのCPTのUV-visスペクトルを示している。

リポソームCPT（一番上の曲線）のスペクトルは、その他の条件下のものとは明らかに異なっている。特徴的な形状は、リポソームCPT、CPT−カルボキシレート（上から２番目と３番目の曲線）とCPTからのラクトン（上から４番目と５番目の曲線）を作成することができる。さらに、ラクトンスペクトルは溶剤環境に強い依存性を示した。分かりやすくするために、スペクトルを垂直にシフトさせている。

Ｃ．ヒトの治療プロトコール
この例は、開示された調製物を使用するヒトの治療プロトコールに関する。治療は、増強した血管新生活性と関連するヒトの様々な疾患と障害の診断、予防および／または治療に使用される。特に抗腫瘍治療、例えば、充実性腫瘍および血管学的悪性疾患を患った患者を含む抗腫瘍治療に有効であり、乾癬のような様々な慢性炎症疾患に対する治療にも有効であると考えられている。

本発明の特徴は、幾つかのクラスの疾患および／または異常を、その異常と関連する組織を直接に治療することなく治療することである。例えば、血管新生を阻害することにより、腫瘍への血液供給を遮断し、その腫瘍は腫瘍細胞を直接に治療することなく、いずれかの方法で死滅する。

このような脂質・薬物複合体を使用する患者の治療法は、すでに開発されており、本明細書に参照して引用されている文献を参考にされたい。このような方法は、本明細書中に記載されている方法を用いて簡単に適用できると予想されている。すでに述べたように、他の治療薬も同時にまたは別の時点で投与できると考えられる。よって、プレミックスされた薬理学的組成物または治療薬の“カクテル”を使用することができ、二者択一的に、別々の容器からの薬物の一定量を使用することもできる。

患者の治療とモニタリングを含む臨床的試みを行う種々の要素は、本発明の開示に照らし合わせながら当業者にとって明らかであろう。

規制上の承認を目的に、実験用に選択された患者が、通常の治療の少なくとも１過程に反応することに失敗し、身体検査、実験手法または放射線法により測定されるような客観的に測定可能な疾患を患うことが考えられる。心疾患や腎疾患の経歴も無いと思われるこのような患者は、実験に入る前の少なくとも２週間には化学療法を中止すべきである。

適用前には、幾つかの調製物を５％グルコース滅菌溶液で１：３．３３の割合に希釈すべきである。必要な適用量は、患者の体重と薬用量計画から計算される。

適用前に、調製物が凍結乾燥している場合には、調製物を水溶液中で戻すことができる。また、必要な適用量は患者の体重と薬用量計画から計算される。

開示された調製物は短い注射時間で投与される。いずれかの用量レベルで投与される注射は、それぞれの後に到達する毒性に応じるべきである。よって、グレードIIの毒性が１回注射の後、または一定量注射について特定の期間で達成された場合には、毒性が改善されないのであれば、さらなる投薬を留めておくか、または一定量注射を中止するのがよい。約６０％の患者が、いずれかのカテゴリーで容認できないグレードIIIまたはIVの毒性を示すまで、用量を増加させて患者グループに投与すべきである。この値の２／３の用量は、安全な用量として定義される。

物理実験、腫瘍測定値および実験室試験は、当然ながら治療前と、約３〜４週間の間隔をあけた後に行うべきである。実験室試験は完全血球計算、血清クレアチン、クレアチンキナーゼ、電解質、尿素、窒素、SGOT、ビリルビン、アルブミンおよび全血清タン白質を含むべきである。

臨床反応は、実験室の数値で認容できる尺度または変化、例えば、腫瘍マーカーにより定義してもよい。例えば、完全な反応は、測定可能な全ての疾患が少なくとも１ヶ月間消失することにより定義される。それに対して、局所反応は５０％またはそれ以上の減少により定義してもよい。

本明細書中に開示され、請求されている全ての組成物と方法は、本発明の開示を鑑みて、必要以上の実験を行うことなく製造かつ実施することができる。本発明の組成物と方法を有利な実施態様の点から記載してきたが、本発明のコンセプト、意図および範囲から離れることなく、本発明に記載されている組成物、方法および工程または方法の工程の順序に対して、バリエーションが適用できることが当業者には明らかである。さらには、化学および生理学的に関連する特定の薬物を、同様または類似した結果が得られる限りにおいて本明細書中に記載されている薬物の代わりに用いることができることも明らかとなるであろう。当業者に明らかなこのような全ての類似した置き換えと変性は従属請求項に定義されているような本発明の意図、範囲およびコンセプトの範囲内であると考えられる。

用量におけるバリエーションは、治療される対象の状況に応じて必然的に生じるであろう。投与の責任を負う人物は、少なくとも各対象に対して適切な用量を測定するであろう。さらに、ヒトの投与については、調製物がFDA から要求されているような生物学的基準の無菌状態、発熱性、一般的な安全性および純度標準を満たしているべきである。

投与と用量
本発明は、製剤学的に有効量の本発明の低分子量化合物の調製物を、これを必要とする対象の血管新生の血管標的部位に輸送する方法を包含する。“これを必要とする対象”とは、この場合にホ乳類、例えば、ヒトを意味する。

投与の経路は、腹膜、非経口または局所適用を含み、調製物は溶液注入剤、薬物放出カプセルなどのような種々の剤形で容易に投与される。

本発明で使用されている、これを必要とする対象（血管新生を受けている内皮細胞のある循環器系を有するいずれかの動物）に投与される化合物の“薬理学的に有効量”という用語は、広い範囲のファクターに依存して変化する。例えば、小動物よりもヒトには実質的に多い用量を提供する必要があるであろう。化合物の量は、患者の大きさ、年齢、性別、体重および症状ならびに投与された物質の効力に依存する。用量に関して相当の多様性があることを記載してきたが、当業者は本発明の開示を使用して、はじめに極めて少量の用量を投与し、所望の結果が得られるまで徐々に増大させることによって適切な用量を容易に測定することができると考えられる。用量が上記のファクターに基づいて大きく変化するにもかかわらず、周囲の組織を標的とする、例えば、腫瘍細胞自体を標的とするデリバリーシステムと比較して、本発明は事実上少量の物質の投与を可能にする。

本明細書中に開示されている治療薬の製剤学的に有効量とは、薬物作用の種類とタイプに左右される。ここで述べる例として、ヒトでは約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。パクリタキセル誘導体ならびにカンプトテシンに関しては、通常５ｍｇ／ｋｇのオーダーの用量が適用される。

本明細書中で開示されているような診断薬の製剤学的に有効量とは、診断薬のタイプに左右される。正確な用量は化合物の分子量、検出されるシグナルのタイプと強度に応じる。例えば、ここで挙げられる例として、（蛍光染料としてのフルオロセイン、MRIマーカーとしてのガドリニウム錯体）、適用される用量は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってよい。最も頻度の高い用量は、約５ｍｇ／ｋｇのオーダーである。
参考文献
１．Gregoriadis, G., Liposome Preperation and Related Techniques.
Liposome Technology, 1993.2: P.123-139.
２．Ceruti, M., et al., Preparation, characterization, cytotoxicity and
pharmacokinetics of liposomes containing water-soluble prodrugs of
paclitaxel. J Control Release, 2000. 63(1-2): p.141-53.
３．Burke, t.g., et al., Lipid bilayer partitioning and stability of
camptotecin drugs. Biochemistry, 1993. 32(20): p. 5352-64.

図１は、リポソームと会合する前と後のフルオロセイン誘導体（AF, F, CF）のUV-visスペクトルを表す図である。 図２は、１：１で２５mM DOTAP/DOPCリポソームの懸濁液と混合したAFの５mM溶液のUV-visスペクトルを表す図である。 図３は、種々のｐH（４℃）におけるTXL放出により示されるSuccTXLの化学安定性を示す図である。 図４は、種々のｐH（４０℃）におけるTXL放出により示されるSuccTXLの化学安定性を示す図である。 図５は、リポソームSuccTXL含量により示されるリポソームSuccTXLの物理および化学安定性を示す図である。 図６は、TXL放出として示されるリポソームSuccTXLの物理および化学安定性を示す図である。 図７は、種々のｐH（４℃）におけるTXL放出により示されるリポソームSuccTXLの化学安定性を示す図である。 図８は、種々のｐH（室温）におけるTXL放出により示されるリポソームSuccTXLの化学安定性を示す図である。 図９は、NMRIヌードマウスにおけるA-375黒色腫のTaxol^（Ｒ）とSuccTXL−カチオンリポソームでの治療結果を表す図である。 図１０は、種々のカンプトテシン調製物でのEa.hy926細胞の治療結果を表す図である。 図１１は、NMRIマウスにおけるA-375黒色腫の種々のカンプトテシン調製物での治療結果を表す図である。 図１２は、クロロホルム／メタノール中に溶解させたリポソームの形のカンプトテシンの励起と蛍光スペクトルを表す図である。 図１３は、種々の条件下でのCPTのUV-visスペクトルを表す図である。

Claims (17)

1. 脂質膜中に僅かにだけ溶解する、かつ／または脂質膜を介して低い透過性を有する低分子量化合物をリポソーム中で安定化する方法において、前記方法は次の工程：
   ａ） 化合物を準備する、その際、化合物は負の実効電荷を有するか、任意に変性されて負の実効電荷を有している
   ｂ） 工程ａ）の化合物を正の実効電荷を有するカチオン両親媒性物質、任意に負および／または中性の実効電荷を有する少なくとももう１つのアニオンおよび／または中性の両親媒性物質と会合させ、かつ
   ｃ） 正のゼータ電位を有するカチオンリポソームを形成する
   から成ることを特徴とする、低分子量化合物をリポソーム中で安定化する方法。
2. 工程ａ）は、負の実効電荷を有する部分で化合物を変性することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 変性は、
   ａ．負に帯電した部分を、例えば、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、アミド、アミン、炭素−炭素結合またはシッフ塩基により化合物に共有結合させる、
   ｂ．化合物を負に帯電したリガンドでキレート化する、または
   ｃ．化合物を、カルセランド、カリックスアレーン、フラーレン、クラウンまたはアンチ−クラウンエーテルのような負に帯電した部分内に取り込むこと
   を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 変性は可逆性である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
5. 化合物は診断薬、治療薬またはこれらの組合せである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
6. 化合物は、診断薬またはイメージング剤、例えば、染料、近赤外線染料、蛍光染料、金粒子、酸化鉄粒子ならびに常磁性分子、Ｘ線減衰化合物（CTおよびX線用）、超音波用造影剤、X線放出アイソトープ（シンチグラフィー）および陽電子放出アイソトープ（PET） を含むその他の造影剤から選択される、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
7. 化合物は、抗炎症剤、抗癌剤、酵素薬、抗生物質、抗酸化剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤、平滑筋細胞増殖／遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、化学伝達物質用の放出阻害剤、および血管内皮用の増殖／遊走阻害剤のような薬剤から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
8. カチオン両親媒性物質は、正の実効電荷を有する脂質、リゾ脂質またはペグ化脂質から選択される、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
9. カチオン両親媒性物質は、N−（２，３−ジアシルオキシプロピル）− N,N,N,−トリメチルアンモニウムのような第４アンモニウム化合物から選択される、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
10. アニオンおよび／または中性両親媒性物質は、負または中性の実効電荷を有するコレステロール、リン脂質、リゾ脂質、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質またはペグ化脂質のようなステロールおよび脂質から選択される、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
11. 中性両親媒性物質は、ジアシルホスファチジルコリンである、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
12. 工程（ｃ）で製造されるリポソームは、実質的に非変性化合物を有していない、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
13. 請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法により得られるカチオンリポソーム。
14. 請求項１３に記載の製剤学的に有効量のカチオンリポソームと一緒に製剤学的に認容性のキャリヤー、希釈剤および／または補助剤を有する製剤学的組成物。
15. 増強した血管新生活性に特徴づけられる症状を診断、予防および／または治療するための医薬品を製造するための、請求項１３に記載のカチオンリポソームまたは請求項１４に記載の製剤学的組成物の使用。
16. 医薬品の活性成分は、負に帯電したプロドラッグの形で存在する、請求項１５に記載の使用。
17. プロドラッグの形は所望の標的部位で活性な薬物に変換される、請求項１６に記載の使用。

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