CN101875693B - 具备抗血管生成活性的白蛋白变异体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体属于蛋白质药物技术领域。本发明要解决的技术问题是现有的ATWLPPR肽在体内半衰期短，用量大。解决该问题的技术方案是提供一种白蛋白变异体。该白蛋白变异体将白蛋白C末端的KEQLK肽段突变为WLPPR肽段后得到的变异体。该人白蛋白变异体完全保留有人白蛋白的功能，同时具有了新的ATWLPPR序列功能。体外实验证明，该白蛋白变异体在体外可明显抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖和移动，其效率同小肽相当。然而注射到动物体内其抑制家兔角膜血管生成作用的效率与相同浓度的小肽相比，前者是后者的40-60倍。该人白蛋白变异体可作为一种高效新型的抗血管生成药物。

Description

具备抗血管生成活性的白蛋白变异体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种蛋白变异体及其制备方法。

背景技术

“血管生成”(angiogenesis)一词于1787年由英国外科医生John Hunter首次提出。由此，人们发现“血管生成”与胚胎发育、组织再生以及慢性炎症有关[1]。直到1971年Folkmani证明“血管生成”与肿瘤生长有关[2]。从此，“抗血管生成”(anti-angiogenesis)成为一种新的抗肿瘤治疗战略。

血管内皮细胞的生长和分化调控是血管生成的关键步骤。已证明前者受酪氨酸蛋白激酶调节。血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体-2(KDR)与VEGF结合，导致其受体酪氨酸蛋白激酶活性被活化，从而启动一系列后续细胞信号传导通路。这一过程对于调控内皮细胞前体分化以及原始血管网络的形成至关重要。因此，抑制KDR的活性是抑制血管生成的关键点之一。[3]

临床实验中，许多小分子化学物质可特异性抑制KDR酪氨酸蛋白激酶活性，从而有显著的抗血管生成效应。然而，临床实验结果证明这些小分子化学物质毒性副作用较大。最近，有人用中和抗体技术阻断KDR的生物学活性，实验证明这些抗体有有效的抗血管生成作用。进一步这些抗体已成功用于临床肿瘤抗血管生成治疗[4]。

由于噬菌体显示技术(phage-display technology)的广泛应用，人们筛选到许多具有生物学活性的多肽[5]，其中一些具有十分有效的药物学效应。然而，由于小肽分子在体内应用的局限性，到目前为止很少有小肽药物的成功上市。但具有药物效应小肽分子的发现，也为进一步药物的设计和改造提供了非常有用的基本信息。现已发现ATWLPPR肽可以抵抗VEGF在体外刺激血管内皮细胞的增殖，并且可在动物体内完全阻断VEGF诱导的血管生成[6]。然而，这一小分子肽在体内半衰期短，用于治疗肿瘤效果有限。

人白蛋白(人血清白蛋白)是血液中最丰富的蛋白质之一，大约浓度为50mg/ml(600μM)，其半衰期约为19天[11，12]。白蛋白对于维持血液的PH，胶体渗透压有着非常重要的作用，同时它也作为体内许多代谢物和脂肪酸的载体。许多药物进入体内也利用白蛋白作为运送载体。最近，有人成功地利用白蛋白结合多肽将小肽药物附着在白蛋白分子上，从而大大提高了小肽药物在体内的半衰期和药物疗效作用[13]。也有人将多肽药物分子直接与白蛋白一起表达成融合蛋白，从而利用白蛋白在体内的特性提高其多肽药物在体内的半衰期以及生物学疗效[14]。但是，直接将白蛋白进行定向化改造使之具有其他的活性还未见报道。

发明内容

本发明要解决的是现有的ATWLPPR肽体内半衰期短，用量大的问题。

解决该问题的技术方案是提供一种白蛋白变异体。该白蛋白变异体为白蛋白C末端的KEQLK肽段突变为WLPPR肽段而得。

其中，所述的白蛋白为人白蛋白。

进一步的，上述白蛋白变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了编码上述的白蛋白变异体的基因。

进一步的，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

同时，本发明提供了含有上述基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

为了制备上述的白蛋白变异体，本发明还提供了一种制备所述白蛋白变异体的方法。该方法包括以下步骤：

a、将白蛋白编码基因序列中编码肽段KEQLK序列的核苷酸序列诱变成编码氨基酸肽段WLPPR序列的核苷酸序列，得到白蛋白变异体编码基因序列；

b、将白蛋白变异体编码基因序列到连接到表达载体中；

c、将表达载体转入宿主中进行表达得到白蛋白变异体。

其中，上述的表达载体优选为真核表达载体，宿主细胞优选为真核宿主细胞。

其中，上述的将白蛋白编码基因序列中编码肽段KEQLK序列的核苷酸序列诱变成编码氨基酸肽段WLPPR序列的核苷酸序列的诱变方式可以使用定点诱变引物进行PCR完成定点诱变。

本发明要解决的另一个技术问题是提供上述的白蛋白变异体或表达载体在制备抗血管生成药物中的用途。同时本发明提供了一种抗血管生成药物，该抗血管生成药物由上述的白蛋白变异体或表达载体添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。

具体说来，本发明直接将人白蛋白分子进行突变改造，从而附与产生的白蛋白变异体具有新的生物学功能。这不同于通过白蛋白结合分子将外源药物分子与白蛋白结合从而形成一个“白蛋白药物”复合物；或药物分子与白蛋白融合在一起形成一种化学融合蛋白的现有途径。本发明主要通过改变白蛋白本身的分子结构，在白蛋白分子中通过氨基酸残基置换突变，从而产生一种新自然界不存在的白蛋白分子。即将白蛋白C末端的氨基酸残基KEQLK(人白蛋白在第565位至569位)采用分子突变方法变成WLPPR，从而在白蛋白分子中产生了一个新的ATWLPPR功能结构(人白蛋白C末端的KEQLK残基的两端分别相邻的残基分别为T和A)。该白蛋白分子保留有白蛋白分子的基本生物学活性，同时也具有突变引入的新的功能结构所带来的新活性。

本发明的有益效果在于：创造性地将人白蛋白进行定位突变，从而在其分子中产生出一段ATWLPPR序列。这一白蛋白变异体具有ATWLPPR多肽的功能，并且保留了白蛋白的分子结构。这导致本发明白蛋白变异体在体内有与野生型白蛋白一样较长半衰期，同时可大剂量在体内应用。这有利于提高ATWLPPR的功能作用。实验结果证明本发明ATWLPPR-白蛋白变异体具有与ATWLPPR在体外相同的抑制血管内皮细胞的增殖作用，且前者具有显著更强的体内抗血管生成作用。这一ATWLPPR-白蛋白变异体为抗血管生成药物的制备提供了一种新的有效选择

附图说明

图1为PHIL-D2质粒的结构简图

图2为人白蛋白变异体分离纯化电泳图谱。Lane 1：DEAE离子交换层析纯化样品；Lane2：抗白蛋白抗体亲和层析纯化样品

图3为ATWLPPR肽及白蛋白变异体对VEGF与Huvec细胞结合的抑制作用。VEGF可与Huvec细胞表面VEGF受体结合。结合在细胞表面的VEGF可用细胞放射结合测定方法(见材料和方法)用特异性¹²⁵I-标记的VEGF抗体检测之。其抗体结合的量(O.D.)可直接反映出VEGF结合在细胞表面的量。将ATWLPPR肽和白蛋白变异体与Huvec细胞温育，可明显抑制后续的VEGF与Huvec细胞的结合作用。

图4为ATWLPPR肽及白蛋白变异体对VEGF诱导Huvec细胞增殖效应的抑制作用结果。VEGF在体外明显诱导Huvec细胞进行细胞增殖作用。其细胞增殖作用可用掺入的3H TdR量计量之。ATWLPPR肽和白蛋白变异体可明显抑制VEGF诱导Huvec细胞中3H-TdR的掺入量。

图5为用western-blot结果表明ATWLPPR-白蛋白变异体对VEGF细胞信号传导的抑制作用。其中+表示这一道用了这种处理，-表示这一道没有用这种处理，1道为ATWLPPR多肽预先处理Huvec细胞，然后用VEGF刺激后的样品；2道为ATWLPPR-HAS(ATWLPPR-白蛋白变异体)预先处理Huvec细胞，然后用VEGF刺激后的样品；3道为ATWLPPR-HAS(ATWLPPR-白蛋白变异体)预先处理Huvec细胞，然后用VEGF刺激的样品；4道为没有加活性物质处理，也没有用VEGF刺激的对照样品。

A1为用磷酸化的KDR(Try1054/1059)单克隆抗体与样品反应的结果，1、2、4道中反应信号弱，表明磷酸化的KDR少，而第3道信号强，表明KDR被磷酸化。

A2为用KDR抗体与各样品反应的结果，表明各道中均有KDR。

A的结果表示ATWLPPR白蛋白变异体明显抑制KDR(血管内皮生长因子受体2，VEGF受体2)的酪氨酸磷酸化作用。

第B1行为用磷酸化的-Akt(Ser473)单克隆抗体与样品反应的结果，1、2、4道中反应信号基本没有，表明KDR未被磷酸化，而第3道信号强，表明Akt被磷酸化。

第B2行为用Akt的抗体与各样品反应的结果，表明各道中均有Akt。

B的结果表明ATWLPPR白蛋白变异体完全抑制了活化AKT(蛋白激酶B)的形成；

第C1行为用磷酸化的-MAPK(Thr202/Tyr204)单克隆抗体与样品反应的结果，1、2、4道中反应信号基本没有，表明KDR被磷酸化少，而第3道信号强，表明Akt被磷酸化。

第C2行为用MAPK的抗体与各样品反应的结果，结果表明各道中均有MAPK。

C的结果表示ATWLPPR白蛋白变异体有效地抑制了MAPK蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases促分裂素原活化蛋白激酶)的活化。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图，进一步说明而不限定本发明。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中，所用质粒PCRScript、载体PHIL D2购自于Invitrogen公司，菌株Pichia Pastoris购自于Invitrogen公司。其余化学试剂均为市售分析纯。

下述实施例中，“SEQ ID NO：1”单独出现时，本领域技术人员可理解1其为“SEQ IDNO：1所示序列”的简称。

实施例一本发明ATWLPPR-白蛋白变异体表达载体的构建和蛋白质合成与纯化

从人肝细胞中分离出mRNA，然后逆转录合成cDNA，再用PCR方法在人白蛋白特异性引物介导下合成人白蛋白cDNA。将PCR产物克隆到PCRScript质粒中。

测定插入的人白蛋白cDNA的全长序列，序列为SEQ ID NO.1所示。进一步进行体外诱变。先合成寡聚核苷酸引物

5’GAGCTTGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAtggctgccaccgcgaGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAG 3’(SEQ ID NO：5)。

同时合成与之配对的一互补序列引物作为引物对。用前述克隆了人白蛋白cDNA的PCRScript质粒作为模板，在这两个引物介导下进行定点诱变。如上述SEQ ID NO.3中小写字母所示，将白蛋白中的原来的编码序列AAAGAGGCAACTGAA(编码KEQLK)被突变成了tggctgccaccgcga(编码WLPPR)。定点诱变用Stratagene公司的Quick ChangeMutagenesis试剂盒按照说明书进行。将筛选到含变异体分子的质粒进行序列分析，证明原白蛋白相应序列已突变成为WLPPR的序列，测序确认ATWLPPR白蛋白变异体全长cDNA编码序列如SEQ ID NO：2所示。

在完成上述突变实验后，进一步将编码该白蛋白变异体的cDNA克隆到酵母表达载体中去。首先，合成2个寡聚脱氧核苷酸其序列作为引物，其序列分别为：

上游引物：5’ATCGTTCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC 3’(SEQ ID NO：6)；

下游引物：5’CGATGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG 3’(SEQ ID NO：7)。

然后用上述ATWLPPR白蛋白变异体cDNA作为模板进行PCR反应。在该合引物对中分别引进了上游CSP451酶切点和下游EcoRI酶切点，将PCR产物进行CSP451和EcoRI双酶切，然后将酶切产物克隆到PHIL-D2质粒(结构简图见图1)中。

将含有插入序列的PHIL-D2质粒进行序列分析证明PCR方法没有在ATWLPPR-白蛋白变异体序列中引入新的突变，确认插入的序列为目标序列(SEQ ID NO：3)。然后按InVitrogen公司的pichia酵母表达系统试剂盒操作手册，在酵母中表达ATWLPPR-白蛋白变异体蛋白。

将含有ATWLPPR-白蛋白变异体的酵母裂解物配制于0.1M磷酸盐缓冲液(PH6.8)，置4℃离心(10000g×30分钟)除去沉淀物，取上清上样于DEAE-Sephadex A-50柱。用8倍柱体积的0.1M磷酸盐缓冲液洗涤DEAE-Sephadex A-50柱。然后用0.1M磷酸盐缓冲液含100mM至0.5MNacl盐梯度洗脱之，收集洗脱样品。将收集峰样品上样于10％SDS-PAGE gel电泳，然后用Western blot方法用白蛋白抗体检测含白蛋白的蛋白收集峰。将收集的含白蛋白样品的洗脱峰样品汇集在一起，针对TBS缓冲液透析。然后上样于抗白蛋白抗体-Sepharose 4B柱进行亲和层析。用8倍柱体积的0.1％Tween-TBS缓冲液洗涤该柱，然后用TBS(含0.2M甘氨酸-HCL(PH2.5))洗脱蛋白，收集蛋白洗脱峰。将亲和层析分离纯化的ATWLPPR白蛋白变异体进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果如图2所示，该白蛋白变异体的纯度＞95％。

实施例二、本发明的ATWLPPR-白蛋白变异体的功效验证实验

一、实验设计

(一)ATWLPPR多肽由Syma-Genosys(Woodland_TX)公司合成。ATWLPPR-白蛋白变异体由实施例一制备。

(二)HUVEC细胞增殖试验：Huvec细胞购自Cell Applications Inc.(San Diego，CA)。将Huvec细胞以1500细胞/孔接种于96孔培养板中，将细胞置37℃CO₂培养箱中培养16小时后，加入不同浓度的合成ATWLPPR多肽或ATWLPPR白蛋白变异体，然后加入2ng/ml VEGF。继续培养48小时后，加入3H-TdR。6小时后，收获细胞，用液闪计数计测定掺入的3H-TdR量。N1H-3T3细胞作为对照。

(三)多肽竞争抑制结合实验：将VEGF受体2(KDR)转染HEK293细胞，将转染后的KDR-293细胞接种于96孔板中(1×10⁴细胞/孔)，置37℃培养过夜。用10％甲醇固定细胞(20℃15分钟)。用0.2％甘氨酸PBS处理细胞(室温15分钟)一次。再用PBS洗二次。然后加入不同浓度的ATWLPPR肽或ATWLPPR白蛋白变异体，同时加入0.1ng/孔VEGF。置37℃温育2小时(Hr)，用PBS洗涤之。用125I-标记的抗VEGF抗体测定结合于细胞上的VEGF量。

(四)VEGF细胞信号传导的抑制作用：将Huvec细胞置100mm直径培养板中培养，当细胞密度达到75％时，改用无血清RPMI1640培养基培养16小时，然后加入2×10^-4M的合成ATWLPPR肽或ATWLPPR白蛋白变异体，30分钟后加入100ng/ml VEGF刺激5分钟。将细胞用冷PBS洗2次，加入1ml Lamilli电泳上样液裂解细胞，收集细胞裂解物，超声处理后，再煎沸5分钟。将细胞裂解物上样于12％SDS PAGE胶中电泳，然后进行Western Blot分析试验。用抗磷酸化AKT(Thr 473)抗体(购自Upstate)和抗磷酸化MAPK(Thr218/Tyr220)抗体(购自SantCruz公司)检测VEGF刺激AKT和MAKP活化情况。用抗磷酸化KDR(Tyr1054/1059)抗体检测KDR的酪氨酸磷酸化作用。

(五)家兔“角膜口袋”血管生成试验(Corneal pocket assay)：将Hydrogel水凝胶(1x2mm)置于载玻片上，加入2μl PBS(其中含有25μg BSA)，2pmol VEGF和30nmolATWLPPR多肽或ATWLPPR白蛋白变异体。将其置入新西兰家兔角膜中。12天后直接用裂隙灯检测新生血管的形成作用。“+”表示新生血管小于1mm长，“++”表示新生血管1mm长，“+++”表示新生血管1-2mm长，“++++”表示新生血管＞2mm长。

二、实验结果

(一)ATWLPPR-白蛋白变异体对VEGF与KDR结合的竞争性抑制作用。

在KDR转染的HEK293细胞表面表达有大量的KDR蛋白。作为VEGF的受体，KDR可特异性与VEGF进行高亲和力结合。在加入VEGF之前，如果先用ATWLPPR白蛋白变异体处理KDR转染的HEK293细胞，则可显著抑制后续加入的VEGF与KDR的结合。结果如图3所示，随着加入ATWLPPR-白蛋白变异体浓度的增加，其抑制作用相应增强。ATWLPPR多肽在抑制VEGF与其受体KDR结合过程中的作用相似。

(二)ATWLPPR-白蛋白变异体对VEGF刺激体外Huvec细胞增殖的抑制作用。

Huvec细胞表面表达有特异性KDR分子，VEGF通过与KDR结合从而刺激Huvec细胞DNA合成和增殖。用3H-TdR掺入方法可定量测定DNA合成及细胞增殖的程度。将ATWLPPR肽或ATWLPPR-白蛋白变异体预先处理Huvec细胞，结果VEGF刺激Huvec细胞增殖的程度明显被抑制。如图4所示，其抑制效应与ATWLPPR肽和白蛋白变异体浓度成正比，并且ATWLPPR肽与白蛋白变异体对VEGF刺激的Huvec细胞增殖作用的抑制效应非常相似。

(三)ATWLPPR白蛋白变异体对VEGF刺激的细胞信号传导的抑制作用。

VEGF与KDR结合后，首先诱导KDR二聚体化(dimerization)，从而激活其酶氨酸蛋白激酶活性，催化KDR的酪氨酸自身磷酸化(autophosphorylation)以及下游底物分子的酪氨酸磷酸化。已证明有二条主要细胞信号传导通路对VEGF诱导内皮细胞促进血管生成作用至关重要：一是AKT蛋白激酶的活化；另一是MAPK蛋白激酶的活化。二者对于内皮细胞的移动、分化、抗凋亡(anti-apoptosis)以及细胞增殖调控有着关键作用。[7-10]

将ATWLPPR肽或白蛋白变异体预先处理Huvec细胞，然后用VEGF刺激之，其不同分子的磷酸化程度可用不同的特异性磷酸化抗体分子测定之，结果如图5所示，VEGF刺激的KDR酶氨基酸1054和1059(Tyr1054和Tyr1059)的磷酸化作用被明显抑制。Tyr1054和Tyr1059位于KDR的蛋白激酶调控区域，其磷酸化对KDR的活化和蛋白激酶活性至关重要。其Tyr1054和Tyr1059的磷酸化程度可反映出KDR的酶活性。与此相对应，KDR下游的AKT和MAPK蛋白激酶活化也都受到了ATWLPPR肽和其白蛋白变异体处理的抑制。AKT蛋白Thr473的磷酸化是AKT激酶活化必需的一步。AKT的Thr473磷酸化程度是其酶活性的一个指标。MAPK激酶的活化需要其Thr218和Tyr220磷酸化，这二个氨基酸残基的磷酸化程度也直接反映了MAPK蛋白激酶活性。如图5所示，在ATWLPPR肽和白蛋白变异体处理的细胞中AKT Thr473和MAPK Thr218/Tyr220磷酸化程度明显低于未处理的对照组。这表明这二条信号传导通路都被肽或白蛋白变异体处理抑制。

(四)ATWLPPR白蛋白变异体在体内的血管生成抑制作用

用家兔角膜“口袋”试验(corneal pocket assay)来检测ATWLPPR白蛋白变异体在体内的血管生成抑制作用。由于置入家兔角膜的胶中含有VEGF，在VEGF的作用下可诱导角膜形成新生血管。如果胶中同时加入有同剂量的ATWLPPR肽或其白蛋白变异体，则VEGF诱导的血管生成作用被明显地抑制。

这证明了该白蛋白变异体在体内能有效地抑制血管的生成。同时表1显示，白蛋白变异体的抑制作用比ATWLPPR肽更有效

表1：ATWLPPR肽及白蛋白变异体对家兔角膜血管生成的抑制作用

ATWLPPR肽浓度(μM)(抑制效应)	白蛋白变异体浓度(μM)(抑制效应)
		5(-)20(±)50(+)100(++)	5(+)20(++)50(+++)100(++++)

实验表明本发明新合成的白蛋白变异体具有ATWLPPR肽分子相同的血管生成抑制作用。它可以在体外抑制VEGF与其特异性受体分子KDR的结合。阻断VEGF-KDR介导的细胞信号传导作用，抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖作用。同时，它在体内家兔角膜血管生成实验中可明显抑制血管的生成。

参考文献：

1、Garmeliet，P：Nature Med.6：389-395，2000

2、Folkman，J：N.Engl.J.Med.285：1182-1186，1971

3、Bold，G.et al：J.Med.Chem.43：2310-2323，2000

3、Davis，D.W et al：Biotech.34：1048-1063，2003

4、Lei，H et al：J.Biol Chem.277：43137-43142，2002

5、Binetruy-Tournaire，R，et al：EMBOJ.19：1525-1533，2000

6、Meyer，M et al：EMBD.J.18：363-374，1999

7、Karkkainem，M.J.&Retrova，T.Oncogene 19：5598-5605，2000

8、Kroll，J&Waltenberger，J.：J.Biol.Chem.272：32501-32527，1997

9、Dougher-Vermazen，M.et al：Biochem.Biophys.Res.Comm.205：728-738，1999

10、Peters，T.Jr：Adv.Protein Chem.37：161-245，1985

11、Peters，T.Jr：All About Albumin，Academic Press，Inc.San Diego，CA

12、Dennis，M.S.et al：J.Biol.Chem.277：35035-35043，2002

13、Syed，S.et al：Blood 89：3243-3252，1997.

SEQUENCE LISTING

<110>成都正能生物技术有限责任公司

<120>具备抗血管生成活性的白蛋白变异体及其制备方法

<130>A100010k

<160>7

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1830

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt     60

gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa    120

gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt    180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat    240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca    300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct    360

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg    420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa    480

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc    540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc    600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag    660

agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta    720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca    780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac    840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag    900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat    960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc   1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga   1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact    1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa    1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag    1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc    1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa    1380

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc    1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc    1500

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgtcca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca    1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt    1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag    1680

cccaaggcaa caaaagaggc aactgaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag    1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt    1800

gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa                                     1830

<210>2

<211>609

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1               5                   10                  15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

            20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

        35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

    50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu

<210>3

<211>1830

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>3

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt     60

gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa    120

gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt    180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat    240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca    300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct    360

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg    420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa    480

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc    540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc    600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag    660

agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta    720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca    780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac    840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag    900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat    960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc    1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga    1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact    1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa    1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag    1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc    1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa    1380

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc    1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc    1500

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgtcca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca    1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt    1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag    1680

cccaaggcaa catggctgcc accgcgagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag    1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt    1800

gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa                                     1830

<210>4

<211>609

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>4

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1               5                   10                  15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

            20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

        35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

    50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Trp Leu Pro Pro Arg Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu

<210>5

<211>78

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>5

gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca tggctgccac cgcgagctgt tatggatgat    60

ttcgcagctt ttgtagag                                                  78

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>6

atcgttcgaa atgaagtggg taacctttat ttccc                                35

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>7

cgatgaattc ttataagcct aaggcagctt g                31

Claims (9)

1.白蛋白变异体，其特征在于由白蛋白C末端的KEQLK肽段突变为WLPPR肽段而成；所述的白蛋白为人白蛋白。

2.根据权利要求1所述的白蛋白变异体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

3.编码权利要求1或2任一项所述的白蛋白变异体的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。

6.含有权利要求5所述表达载体的宿主细胞。

7.制备权利要求1或2任一项所述的白蛋白变异体的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、使用定点诱变引物将白蛋白编码基因序列中编码肽段KEQLK序列的核苷酸序列诱变成编码氨基酸肽段WLPPR序列的核苷酸序列，得到白蛋白变异体编码基因序列；

b、将白蛋白变异体编码基因序列到连接到表达载体中；

c、将表达载体转入宿主中进行表达得到白蛋白变异体。

8.权利要求1或2任一项所述的白蛋白变异体或权利要求5所述的表达载体在制备抗血管生成药物中的用途。

9.抗血管生成药物，由权利要求1所述的白蛋白变异体添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。 

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