JP2005528102A - 多用途の生存マイクロアレイを用いる、細胞に基づく高処理量アッセイのための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞性成分の細胞応答をスクリーニングするための方法であって：
（ａ）表面に固定された検出分子のアレイを有する基板表面に、細胞性成分を提供する段階；
（ｂ）固形基板表面のアレイ状検出分子に対応する基板上の位置に試験化合物を配送する段階；
（ｃ）細胞応答の誘発を許容する条件下で、試験化合物を、固形支持体表面の細胞性成分とインキュベートする段階；
（ｄ）細胞応答をアッセイする段階；および、
試験化合物によって誘発された細胞応答を同定および特徴付けする段階を含む方法に関する。本発明はさらに、当該方法の使用ならびに当該方法を実施するためのマイクロアレイおよびキットに関する。

Description

本発明は、細胞に基づくアッセイに関する。本発明は、細胞応答をチップ上で機能性スクリーニングアッセイするための方法に関する。本発明は、細胞の生理反応を調節する化合物をスクリーニングし、ならびに薬理学的プロファイリングするための方法に関する。

製薬業界では、コンビナトリアル・ケミストリーの使用により、化合物レポジトリ内で利用可能な相当数の化合物が存在する。これらの化合物ライブラリ由来のヒット化合物は、高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）を使用して同定される。ＨＴＳの主な機能は、化合物レポジトリ由来の多様な化学的化合物を、多数の疾患標的に対し、多種の生物学的アッセイにおいて試験することである。従来のＨＴＳでは通常、９６ウェルのマイクロタイタープレートを利用する。製薬業界には、これらのマイクロプレートアッセイを縮小して、コストを削減し、廃棄物を減少させ、そしてタイムスケジュールを高速化することを促す重大な動機がある。９６ウェル形式からさらに高密度のウェル、例えば３８４および１５３６ウェル形式に変化してきた。しかしながら、液状物の処理、シグナル検出器具類、およびアッセイ技術に関して、これらは課題を示す可能性がある。さらに、マイクロタイタープレートに基づくスクリーニングアッセイを使用する際に遭遇する典型的な問題には、例えば、（ｉ）マイクロタイタープレートの個々のウェル中で同一クローンの増殖および／または遺伝子発現が相違すること、および（ｉｉ）プレート全体で応力（ストレス）曝露（例えば加熱処理、湿度）が相違すること、が含まれる。

上記問題を解決するための努力が行われてきた。例えば、特許文献１は生理活性分子に関して高密度形式でスクリーニングするための方法および装置を提供する。これは試験化合物を細胞層に配送するための技術を非常に単純化し、すなわち、複雑な液体処理を必要としない。この方法では、６１４４種までの試験化合物を同時に、生理活性に関してスクリーニング可能である。

それにもかかわらず、さらに高密度の細胞に基づく機能性生物学的アッセイが必要である。このアッセイは、依然として縮小することが最も困難なタイプのアッセイの１つであり、その原因は、細胞を剪断し、あるいは細胞自身のストレス応答を活性化して、生物学的アッセイを妨害してしまうことなく、マイクロリットル量の細胞を一貫して配送することが制限されていることである。

薬理学的に有用な化合物を同定するコンビナトリアル・ケミストリーのアプローチが開発されており、マイクロアレイレベルで、組み合わせ合成ライブラリ中の化合物に関する薬理学的プロファイルおよび対応する効力について高処理量での特徴付けが実施可能な方法および装置の必要性の存在がますます明らかになっている。

生存細胞のマイクロアレイは、より安全かつ、より個人の注文に応じた薬物を開発する近道を提供し、ならびに細胞性生物が機能する際に辿る分子経路についてさらに進んだ理解を提供することができよう。例として、ケンブリッジのホワイトヘッド生物医学研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）は、哺乳類細胞の遺伝子機能を高処理量分析するための生存細胞のマイクロアレイを開発した（非特許文献１）。この技術は非常に有効であるが、しかしながら、その使用には多数の制限が存在する。この制限には、比較的多量の試薬が必要とされ、そのうちの相当量はアレイと決して接触せず、ゆえに浪費されること、および厄介で時間がかかる処理が必要とされることが含まれる。

特許文献２は、生存細胞のマイクロアレイのさらに別の例を開示している。開示されている縮小型細胞アレイは減少したウェルおよびアレイサイズを特徴とし、これは高含量のスクリーニングを許容する。しかしながら、これは非多孔性であるため、アレイ上のウェル内／表面または細胞結合部位での細胞増殖が、標準培養条件下での伸展性問題を克服し得ない。これは正しい細胞サンプルの識別を妨げることが明らかである。

当分野で認識されるように、上記欠点を克服する改善された方法が依然として必要である。
ＷＯ ９９／３５４９６号公報 米国特許第６，１０３，４７９号公報 Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ． ４１１， ３ Ｍａｙ ２００１

したがって、本発明の目的は、マイクロアレイを用いる組み込み細胞に基づくアッセイのための高性能かつ対費用効果の高い方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、高処理量の細胞に基づくアッセイのための方法であって、最少量のサンプルおよび試薬しか必要としない方法を提供することである。

本発明はまた、上記方法を実施するマイクロアレイまたはキットを提供することを目的とする。

本発明は、細胞性成分の細胞応答をスクリーニングするための方法であって：
（ａ）その表面に固定された検出分子のアレイを有する基板（SUBSTRATE)表面に、細胞性成分を提供する工程；
（ｂ）固形基板の表面のアレイ状検出分子に対応する基板上の位置に、試験化合物を配送する工程；
（ｃ）細胞応答の誘発を許容する条件下で、試験化合物を、固形支持体表面の細胞性成分とインキュベートする工程；
（ｄ）細胞応答をアッセイする工程；および、
（ｅ）試験化合物によって誘発された細胞応答を同定および特徴付けする工程
を含む方法に関する。

本発明はさらに、本発明による上記方法の使用を開示する。

本発明は、細胞に基づくアッセイをマイクロアレイ形式に縮小化することを提供し、これにより、処理量を増加させ、一方、試薬量および試験化合物量を減少させる。

当該方法で使用する装置のフロースルー特性により、本方法はさらに、高速かつ効率的な分析を提供する。

本発明による方法は、非侵襲的チップ上細胞培養または細胞性成分培養を提供し、ここに培養層は固形基板表面全体にわたって等しい条件下で増殖し、そして当該細胞または細胞成分を、所望の密度を得るために必要な時間だけ培地と接触させる。

本発明の更なる特徴および利点は、以下の詳細な説明中に記載され、そして部分的には、その説明から明らかであり、あるいは本発明の実施により習得されるものであってもよい。本発明の目的および他の利点は、記述されている説明及び添付の特許請求の範囲において特に指摘されている工程で認識でき、達成できるであろう。

本方法および本方法で使用する解決策を説明する前に、理解しておくべきことは、本発明は、記載する特定の方法、成分、または解決策に限定されず、それゆえ、方法、成分、および解決策は当然様々であってよいことである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限され、本明細書中で使用する術語は限定を意図しないことが理解されるべきである。

特に規定しない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料と類似のまたは等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用してよいが、好ましい方法および材料は以後記載するものである。

本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形の"a"、"an"および"the"は、前後関係により明らかに別指定されない限り、複数形への参照を含む。

何千もの化合物に対してスクリーニングを実施するには、多数の化合物およびアッセイ成分試薬を並行して処理し、プロセシングする必要がある。標準的な高処理量スクリーニングでは、化合物および生物学的試薬の混合物をいくらかの指標化合物とともに使用し、この指標化合物は標準マイクロタイタープレート中のウェルのアレイ内へ充填されている。

本発明は、固形基板の使用を含む大規模な小型化に関し、この固形基板のあらかじめ定められた領域には、多数の分子が結合してマイクロアレイを形成している。

本発明による細胞アレイには、主に３つの異なる成分が関与する：細胞性成分、試験化合物および検出分子。さらに、細胞捕獲用分子を第四の成分として含んでよい；これらは、例えばそれぞれ特定の細菌を捕獲する抗体であってよい。この捕獲分子の性質に応じて、特定細胞（細菌、菌類、ウイルス、マイコプラズマ）を捕獲し得る。アレイ上の多様な独自の捕獲分子は、多様な独自の細胞性成分を含む細胞アレイを提供し得る。本発明は、多用途の集積化細胞に基づくアッセイを提供し、ここでは多数の試験形式が考慮される。

細胞性成分のアレイでは、基板上にアレイ形式で、異なる細胞の島を培養または堆積させる。次いで、アレイ全体を１つ（または限定数）の試験化合物に曝露し、そして最後に、必要であれば溶解後に、１つ（または限定数）の（この基板中に存在する可能性がある）受容分子に曝露する。このように、この試験形式は、異なる細胞性成分のアレイを特定試験化合物によって誘発される応答に関してスクリーニングすることを可能にする。この応答は特定の検出分子を用いて検出される。この検出分子は、試験化合物を細胞性化合物とインキュベートした後に提供してもよいし、あるいは基板を細胞性成分と接触させる前に基板内へ導入しておいてもよい。さらに検出分子は、試験化合物に曝露する前に細胞性成分内へ導入しておいてもよい；細胞応答として、例えばＧＦＰを発現させてよい。

細胞性成分は、捕獲分子によって固形基板上に捕獲してよい。この捕獲分子は固形基板上にあらかじめ設置される。

用語「検出分子」、「受容分子」および「識別分子」は交換可能に使用してよく、本発明の関連では、細胞応答の検出を可能にする分子を表す。検出分子はまた、試験化合物の変換によって生成させてもよい。

試験物質のアレイでは、均一層の細胞性成分を、あらかじめ定められた領域で局所的に、スポッティングによって、種々の試験物質で処理する。また、試験物質または試験化合物は、細胞性成分を適用する前に基板中に存在させてよく、あるいは試験物質または試験化合物は細胞中に存在させてもよい。処理後、細胞応答は特定の検出分子を用いて検出してよい。この検出分子は、試験化合物を細胞性化合物とインキュベートした後に提供してよいし、あるいは基板を細胞性成分と接触させる前に基板内に導入しておいてもよい。また、検出分子は細胞に導入しておいて、例えばＧＦＰ−発現細胞を得てもよい。

検出アレイでは、異なる受容体または検出分子のアレイを均一層の細胞性成分と接触させ、この細胞性成分は特定の試験化合物で処理する(あるいは互いに少し間をおいて行う)。細胞応答のモニタリングは、受容分子で排出生成物を検出することによって、あるいは細胞性成分の溶解後に受容分子への結合を介して細胞内生成物を検出することによって行う。また、細胞死および形態学的変化を検出してもよい。

固形基板の性質および形状は、種々の要因、例えば特に、アレイのタイプおよび結合様式に依存する。一般に、基板は、細胞培養および所望の分子の固定を許容し、ならびに細胞に基づくアッセイの実施に使用する条件下で融解せず、あるいは別の様式で実質的に劣化することがない、任意の材料から構成されていてよい。さらに、共有結合による固定を意図する場合、基板は反応基を用いて活性化可能でなければならない。この反応基は、固定される分子と結合を形成可能であり、この結合は共有結合であってよい。

本発明で使用する基板において使用するのに適した多数の材料が当分野で記載されている。本発明に適した基板の典型例は、以下の物質を含む材料を含む：アクリル、アクリルアミド、メチレン−ビス−アクリルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、スチレンメチルメタクリレート共重合体、エチレン／アクリル酸、アクリロニトリル−ブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ＡＢＳ／ポリカーボネート、ＡＢＳ／ポリスルホン、ＡＢＳ／ポリ塩化ビニル、エチレンプロピレン、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、ニトロセルロース、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアクリレート、ポリカーボネート、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（低密度、鎖状低密度、高密度、架橋型および超高分子量等級を含む）、ポリプロピレン同種重合体、ポリプロピレン共重合体、ポリスチレン（汎用および高衝撃等級を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フッ素化エチレン−プロピレン（ＦＥＰ）、エチレン−テトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、過フルオロアルコキシエチレン（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、ポリエチレン−クロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、シリコンスチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、スチレン無水マレイン酸（ＳＭＡ）、およびガラス。基板に適したさらに別の例は、２つまたはそれ以上の上記材料の混合物を含む。

本発明の基板を製造するのに適した他の例示材料には金属酸化物が含まれる。金属酸化物は高いチャネル密度および高い多孔率の両者を有する支持体を提供し、この支持体は、サンプルアプライ用の単位表面当たり、異なる第一結合物質を含む高密度アレイの作成を可能にする。さらに、金属酸化物は可視光に関して非常に透過性である。金属酸化物は比較的安価な基板であり、いかなる典型的な微細加工技術の使用をも必要とせず、そして基板表面全体の液状物分配に対して改善された制御を提供する。このような基板は、例えば電気化学的に製造された金属酸化物膜である。通り抜け配向チャネルを有する金属酸化物膜は、金属シートを電気化学的にエッチングすることによって製造できる。考慮される金属酸化物は、とりわけ、タンタル、チタン、およびアルミニウムの酸化物、ならびに2つまたはそれ以上の金属酸化物の合金およびドープ金属酸化物および金属酸化物含有合金がある。金属酸化物膜は、特に濡れている場合は、透明であり、これにより種々の光学的技術を用いるアッセイが可能となる。このような膜は配向性通り抜けチャネルを有し、このチャネルは十分に制御された直径および有用な化学的表面特性を有する。Ａｎｏｐｏｒｅ（商標）の使用を記載するＷＯ ９９／０２２６６はこの側面の典型例であり、これは本発明に明確に組み込まれる。

したがって本発明の一態様では、固形基板は多孔性固形支持体である。

さらに別の態様では、本発明の方法の段階に含まれる固形基板はフロースルー固形支持体である。

さらに別の態様では、本発明の方法の段階に含まれる固形基板は金属−酸化物基板である。

さらに別の態様では、本発明の方法の段階に含まれる固形基板はアルミニウム−酸化物基板である。

本明細書中を通して使用する用語「細胞性成分」とは、無傷の生存可能完全細胞、これには、例えば原核生物細胞が含まれる；ならびに細胞成分、例えば小胞、細胞小器官、およびベクター；ならびに切片材料、例えば組織切片；ならびに固定細胞；ならびに微小多細胞生物、例えば、線虫、ゼブラフィッシュ；等を表す。細胞性成分はまた、ウイルス、細菌およびマイコプラズマであってよい。

本発明によれば、固形基板表面は、その上に細胞性成分の接種材料を直接載せることによってこの接種材料と接触させてよい。接種材料は、この成分および適切な培地を含む液状製剤であってよい。

しかしながら、最終の接種材料はまた、培地を全く含まなくて、代わりに保存剤、例えばグリセリンを含んでもよい(例えば細菌培養物)。したがって、細胞性成分は、後の分析用に基板上で保存してもよい；すなわち細胞性成分は、保存条件下、例えばグリセリン、または他の適した媒体中で基板上に存在させてよく、あるいは凍結乾燥してもよい。用語「保存条件」とは、細胞性成分を生存および／または無傷で、衰退を伴わずに維持する条件を指す。

別法では、細胞性成分の培養物をインキュベートして、その増殖曲線が対数期に達するまで増殖させ、その後、培養物の分割物を直接基板上に載せてよい。

したがって本発明の一態様では、接種材料または培養物を基板上に直接載せることによって細胞性成分を基板表面に提供する方法を提供する。

当業者が認識するように、さまざまな細胞型の培養に関して、確立したプロトコルが利用可能である。このようなプロトコルは特殊なコーティングおよび選択培地の使用を必要とすることがあり、これにより細胞増殖および特殊な細胞機能の発現を可能にする。このようなプロトコルはいずれも、本発明の方法とともに使用することを妨げない。

本発明では、栄養物は固形基板の下側または上側から固形基板の孔を通過して固形基板表面に提供してよい。

栄養物および／またはエフェクターは、固形基板の下側または上側から固形基板の孔を通過し固形基板表面へ拡散させることによって提供してよい。

栄養物は、培地とともに提供して細胞を培養してよい。培地は、宿主細胞の培養に適した任意の慣用的培地、例えば、適切な補充物質を含有する最小または複合培地であってよい。適した培地は市販用の供給元から入手可能であり、あるいは刊行されている方法(例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中で）にしたがって調製してもよい。培地は当分野で既知の手順を用いて調製する。

細胞性成分の培養用の栄養物は、当分野で周知の無菌条件下で基板に提供する。この無菌条件は、層流ベンチ内で作業し、あるいは基板上にカバーを設置して達成してよい；すなわち、細胞性成分の堆積または培養の側である。

本発明による方法はまた、切片材料に適用してよく、この切片材料は直接、基板と接触させて置いてよい。

下流のアッセイ、例えば免疫蛍光検出に必要であれば、例えば化学的固定によって、細胞を固形基板表面へ固定してよい。典型的には、好ましい固定液は、細胞応答が発現性であるかどうか、あるいは目的の分子が細胞表面に存在するか、あるいは細胞内に存在するかに依存する。例えば、いくつかの固定法（例えばメタノール固定またはアセトン固定）は、透過性化を要する細胞（例えば細胞内抗原の検査）に対しては通常使用されない。

多様なアッセイに関して多様な細胞型用の多様な固定プロトコルが当分野で周知である；例えば哺乳類細胞は、固定液、例えば３．７％パラホルムアルデヒドおよび４．０％ショ糖を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と接触させてよい。

本発明で使用する用語「細胞性成分」は、標準組織培養容器上で培養可能な任意の細胞型を包含する。接着性および非接着性細胞型の両者を使用してよい。本発明で使用する「細胞性成分」とは、試験化合物への曝露または試験化合物での処理に対する応答の検出が可能な任意の細胞を意味する。本明細書中による細胞性成分は、野生型、変異体または形質転換またはトランスフェクト細胞（細菌細胞、ウイルス細胞、等）であってよく、それ故非宿主性物質の存続または保持を提供し得る；この非宿主性物質は生存性、例えば寄生生物であってよく、あるいは非自立生存性、例えばベクターであってもよい。そして安定にあるいは一時的に宿主細胞内に存在してよい。細胞が外来性または異種の遺伝物質によってトランスフェクトされている、とは、このような物質が細胞の内部に導入されている場合である。細胞が外来性または異種の遺伝物質によって形質転換されている、とは、トランスフェクトされた物質が細胞の変化、例えば表現型変化を生じさせる場合である。通常、形質転換用遺伝物質は細胞の染色体ＤＮＡ内へ組み込まれ、そのゲノムを構成するであろう。形質転換用遺伝物質、例えばベクターＤＮＡは相同または非相同組換えによって宿主染色体内へ組み込まれ得る。さらに、本明細書中で使用する「細胞性成分」は、親細胞の任意の子孫であって、複製中に生じる変異のせいで親細胞と同一でない子孫の細胞を包含する。

有用な細胞には、ハイブリドーマ細胞を含む哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞のような原核生物および真核生物、およびプロトゾア、藻類および真菌細胞を含む原生生物細胞が含まれる。哺乳類細胞は、種（例えばヒト、げっ歯類、サル）、組織ソース（脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉）および細胞型（例えば上皮細胞、内皮細胞）に関して任意の認知されているソース由来であってよい。さらに、本発明を使用して、組換え遺伝子によってトランスフェクトされた細胞を培養することもできる。

適切な細胞株は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎおよびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ内に含まれているものであってよい。

本発明の一態様では、細胞性成分は、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、および細菌および真菌細胞を含む微生物細胞、細胞小胞、細胞小器官、組織切片、および線虫を含む完全体微小生物を含む群から選択される。

有用な哺乳類細胞株の非限定的な例には、動物およびヒト細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、チャイニーズハムスター肺（ＣＨＬ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ細胞株、ＴＡｇ Ｊｕｒｋａｔ細胞、ハイブリドーマ細胞、癌細胞株、肝細胞等が含まれる。

適切な昆虫細胞株には、鱗翅目細胞株、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えばＳｆ９、Ｓｆ２１）およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞（例えばＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ （商品名）、ＢＴＩ−Ｔｎ−５Ｂ１−４）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明で有用な真菌細胞の非限定的な例には、子嚢菌門(Ascomycota)、担子菌門(Basidiomycota)、ツボカビ門(Chytridiomycota)、および接合菌門(Zygomycota)ならびに卵菌門(Oomycota)およびすべての不完全菌類(mitosporic fungi)が含まれる。子嚢菌門の代表的な群には、例えばパンカビ属(Neurospora)、ユーペニシリウム属(Eupenicilliumまたはペニシリウム属 (Penicillium))、エメリセラ属(Emericellaまたはアスペルギルス属(Aspergillus))、ユーロチウム属(Eurotiumまたはアスペルギルス属(Aspergillus))、および上に掲載する真正酵母が含まれる。担子菌門の例には、マッシュルーム、さび菌類、および黒穂病菌が含まれる。ツボカビ門の代表的な群には、例えばカワリミズカビ属(Allomyces)、Blastocladiella、Coelomomyces、および水生菌類が含まれる。卵菌門の代表的な群には、例えば、saprolegniomycetous水生菌類(ミズカビ)、例えばアクリア属(Achlya)が含まれる。不完全菌類(mitosporic fungi)の例には、アスペルギルス属(Aspergillus)、ペニシリウム属(Penicillium)、カンジダ属(Candiaa)、およびアルテルナリア属(Alternaria)が含まれる。接合菌門の代表的な群には、例えばクモノスカビ属(Rhizopus)およびケカビ属(Mucor)が含まれる。

真菌細胞は酵母細胞であってよい。有用な酵母細胞の非限定的な例には、子嚢胞子形成(ascosporogenous)酵母(Endomycetales)、担子胞子形成(basidiosporogenous)酵母、および不完全菌類(Fungi ImperfectiまたはDeuteromycota)に属する酵母(Blastomycetes)が含まれる。子嚢胞子形成酵母はSpermophthoraceaeおよびSaccharomycetaceae (サッカロミセス)科に細分される。後者は、4つの亜科、Schizosaccharomycoideae (例えば、Schizosaccharomyces (シゾサッカロミセス)属、これはS. pombe (S. ポンベ)を含む)、Nadsonioideae、Lipomycoideae、およびSaccharomycoideae (例えば、Pichia (ピキア)属、例えばP. pastoris、P. guillermondiiおよびP. methanolio)、Kluyveromyces (クルイベロミセス)属、例えばK. lactis、K. fragilis、およびSaccharomyces (サッカロミセス)属、例えばS. carlsbergensis、S. cerevisiae (S. セレビシエ)、S. diastaticus、S. douglasii、S. kluyveri、S. norbensisまたはS. oviformis)から構成される。担子胞子形成酵母には、Leucosporidim、Rhodosporidium、Sporidiobolus、Filobasidium、およびFilobasidiella属が含まれる。不完全菌類に属する酵母は2つの科：Sporobolomycetaceae (スポロボロミセス科、例えばSporobolomyces (スポロボロミセス)およびBullera属)およびCryptococcaceae (クリプトコッカス科、例えばCandida (カンジダ) 属、これはC. maltoseを含む)に細分される。他の有用な酵母宿主細胞はHansehula polymorpha、Yarrowia lipolytica、Ustilgo maylisである。

真菌細胞は糸状真菌細胞であってよく、これにはすべての糸状型の下位区分、真菌門(Eumycota)および卵菌門(Oomycota)が含まれる。糸状菌類は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類から構成される栄養菌糸を特徴とする。栄養生長は菌糸伸長によって生じ、炭素異化作用は絶対好気性である。対照的に、酵母、例えばSaccharomyces cerevisiae (サッカロミセス・セレビシエ)による栄養生長は、単細胞性葉状体の出芽によって生じ、炭素異化作用は発酵性であってよい。さらに好ましい態様では、糸状真菌宿主細胞は以下の種の細胞であるが、これらに限定されない：Acremonium (アクレモニウム属)、Aspergillus (アスペルギルス属)、Fusarium (フザリウム属)、Humicola、Mucor (ケカビ属)、Myceliophthora（ミセリオプソラ）、Neurospora (パンカビ属)、Penicillium (ペニシリウム属)、Thielavia（チエラビア）、Tolypocladium（トリポクラディウム）、およびTrichoderma (トリコデルマ属)またはこれらの有性世代(teleomorph)もしくはシノニム。

有用な微生物細胞は、単細胞性、例えば原核生物、または非単細胞性、例えば真核生物であってよい。有用な単細胞性細胞は始原細菌である。さらに有用な単細胞性細胞は、好気性細菌細胞、例えばグラム陽性菌、これは属Bacillus (バチルス)、Sporolactobacillus（スポロラクトバチルス）、Sporocarcina（スポロカルシナ）、Filibacter（フィリバクター）、Caryophanum（カリオファヌム）、Arthrobacter (アルスロバクター)、Staphylococcus (ブドウ球菌)、Planococcus (プラノコッカス)、Micrococcus (ミクロコッカス)、Mycobacterium (マイコバクテリウム)、Nocardia (ノカルジア)、Rhodococcus (ロドコッカス)を含むがこれらに限定されない；またはグラム陰性菌、これは属Acetobacter (酢酸菌)、Gluconobacter (グルコン酸菌)、Frateuria、Alcaligenes (アルカリゲネス)、Achromobacter (アクロモバクター)、Deleya (デレヤ)、Amoebobacter（アモエボバクター）、Chromatium (クロマチウム)、Lamprobacter（ランプロバクター）、Lamprocystis（ランプロシスティス）、Thiocapsa（チオカプサ）、Thiocystis（チオシスティス）、Thiodictyon（チオヂクチオン）、Thiopedia（チペディア）、Thiospirillum（チオスピリルム）、Escherichia (エシェリキア)、Salmonella (サルモネラ)、Shigella (赤痢菌)、Erwinia (エルビニア)、Enterobacter (エンテロバクター)、Serratia (セラチア)、Legionella (レジオネラ)、Neisseria (ナイセリア)、Kingella (キンゲラ)、Eikenella (エイケネラ)、Simonsiella (シモンシエラ)、Alysiella、Nitrobacter (ニトロバクター)、Nitrospina (ニトロスピナ)、Nitrococcus (ニトロコッカス)、Nitrospira (ニトロスピラ)、Pseudomonas (シュードモナス)、Xanthomonas (ザントモナス)、Zoogloea (ズーグレア)、Fraturia、Rhizobium (リゾビウム)、Bradyrhizobium(ブラディリゾビウム)、Azorhizobium (アゾリゾビウム)、Sinorhizobium (シノリゾビウム)、Rickettsia (リケッチア)、Rochalimaea (ロシャリメア)、Ehrlichia (エールリヒア)、Cowdria (コウドリア)、Neorickettsia (ネオリケッチア)、Treponema (トレポネーマ)、Borrelia (ボレリア)、Vibrio (ビブリオ)、Aeromonas (アエロモナス)、Plesiomonas (プレシオモナス)、Photobacterium (フォトバクテリウム)、Brucella (ブルセラ)、Bordetella (ボルデテラ)、Flavobacterium (フラボバクテリウム)、Francisella (フランシセラ)、Chromobacterium (クロモバクテリウム)、Janthinobacterium (ジャンシノバクテリウム)、およびIodobacter（イオドバクター）を含むが、これらに限定されない。

本発明での使用に適した植物細胞には、双子葉植物細胞、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis Thaliana)、タバコ、ジャガイモ、トマト、およびマメ科植物(例えばマメ、エンドウマメ、ダイズ、アルファルファ)細胞が含まれる。しかしながら、単子葉植物細胞、例えば単子葉穀類植物細胞、例えばコメ、ライムギ、オオムギおよびコムギもまた同等に適していることがあると考えられる。

試験化合物、細胞性成分または検出分子は、液体処理装置を用いて基板上のあらかじめ定められた領域へ配送可能だが、この配送は手動操作により同等に達成可能である。

したがって、液体処理装置を基板上に設置してよく、ここに液体処理装置は高精度のｘ−ｙ−ｚ分注器またはインクジェットプリンターであってよく、これは１つまたはそれ以上のチャネルを有し、このチャネルを通して液体を、連続または並行して、固形基板表面のアレイ状分子と対応する位置へ分配可能である。別法では、横断孔を含む重ね合わせ用のマスクを基板上に重ねてよく、この場合、マスク中の各横断孔が固形基板表面のアレイ状分子と対応するように重ね合わせる。

重ね合わせ用のマスクは細胞アレイの作成に有用であり得る；すなわち、細胞の集密層を培養後、次いで、これらの細胞を一組のベクターまたは遺伝子コンストラクトによって形質転換し、異なる形質転換細胞のアレイを獲得してよい。この形質転換段階中にマスクを使用すれば、形質転換対象であるアレイ上、あらかじめ定められた領域で生育した細胞を、既知のベクターまたは遺伝子コンストラクトで形質転換することができる。このように、マスクを使用して、ＸＹ−パターンの形質転換細胞が作成され、アレイ上のそのＸＹ−位置により形質転換細胞を同定する。

試験化合物、細胞性成分または検出分子は、接触または非接触スポッティングによって配送してよい。本明細書中で使用する用語「接触スポッティング」または「接触力」とは、プリント用基板および配送機構間での直接の表面接触を意味し、この配送機構は、配送機構内の任意の内容物を表面へ移動させ、あるいは配送するための、１つまたは多数またはアレイ状のピンセット、ピンまたはキャピラリーを含んでよく、この移動または配送はピンセット(群)、ピン(群)またはキャピラリー(群)を表面に対して物理的に軽く付けることによって行う。さらに、重ね合わせ用のマスクは、(細胞含有)固形支持体上に設置してよく、これにより、マスク中の充填された孔によって形成されるウェルの内容物は、マスクをチップ上に押すと、毛管作用によって受動的に細胞上に配送される。本明細書中で使用されるとき、マスクは試薬の通過に対する障壁として働く。典型的には、マスク中の孔のパターンにより、試薬が選択的に通過し、結果的に試薬は、マスクの背後／下側に設置された表面上に、対応するパターンで堆積される。

別法では、試験化合物はインクジェットプリント技術によって配送またはスポットしてもよい。この技術は非接触技術であり、ここに反応物は、コンピュータインクジェットプリンターに基づく技術を用いて表面にスプレーされる。インクジェット法は間接的であると呼ばれることがある。その理由は、反応物が直接配置されるのではなく、表面にスプレーされるためである。インクジェット法は比較的小さいスポットを作成可能であり得る。そして、この方法は表面との物理的接触を回避するので、より信頼性が高くなり得る。

有用なインクジェットプリント方法論は、連続的および滴下−応需型インクジェット法を含み得る。最適なインクジェットプリント法は滴下−応需型インクジェット法であり、その例には、圧電性および静電性インクジェットシステムが含まれる。

本発明においてさらに有用であるのは、スポット用ロボットまたは液体処理装置である。ほとんどのスポット用ロボットまたは液体処理装置では、耐振テーブル上にマウントされたＸ−Ｙ−Ｚロボットアーム（３次元で移動可能なもの）を使用する。このアームは、非接触スポッティングの場合、ノズルを保持してよい。接触スポッティングでは、アームはピンを保持してよい。ノズルまたはピンは第一のマイクロタイタープレート内へ浸され、配送すべき液体（例えば試験化合物溶液）を採取する。次いで、ピンの場合、その先端を固形支持体表面へ移動させ、表面へ最小限にのみ接触させる；その結果、試験化合物溶液が移動する。次いでピンを洗浄し、次の組のウェルおよび試験化合物に移動させる。この過程を繰り返し、何百または何千の試験化合物を配置する。固形ピン、針、およびピン−および−リング構成のピンは有用であり得る。

したがって、本発明の一態様では、試験化合物は、配送用マスク、高精度ｘ−ｙ−ｚ分注器、インクジェットプリンター、および手動操作を含む群から選択される手段によって配送される。

本発明のさらに別の態様では、試験化合物は、高精度ｘ−ｙ−ｚ分注器またはインクジェットプリンターによって配送される。

本発明の一態様では、接触力によって試験化合物を細胞含有支持体に配送する。

本発明のさらに別の態様では、接触力によって試験化合物を細胞含有支持体に配送し、この接触力は毛管力または圧電力であってよい

本発明は、細胞応答、例えば生理反応および／または細胞の活性を調節する試験化合物のスクリーニングおよび薬理学的プロファイリングのための方法を提供する。本発明にしたがって、スクリーニング対象の化合物によって生じる種々の作用を検出および定量的に特徴付けしてよい。これらの作用には、以下の変化が含まれるが、これらに限定されない：イオン化カルシウムの細胞内濃度、ｃＡＭＰの差異（例えば代謝活性化または不活性化を原因とする）、ｐＨ、温度、ＮＯ、および膜を横切る電位、細胞内または細胞から外への細胞内Ｃａ−、Ｋ−またはＮａ−流量、および種々の慣用的方法により、例えば特定の蛍光、発光または色発生色素を用いて測定可能な、生存細胞の他の生理学的および生化学的特徴。

本発明はまた、薬物のアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングする方法、その効能プロファイルを特徴付けする方法、細胞膜の受容体発現パターンを同定する方法（「受容体フィンガープリント法」）、化合物に関する毒性プロファイル（例えば中毒学的応答、ＣＹＰ−４５０、ＨＥＲＣ）を決定する方法、細菌の溶解、アポトーシス、細胞壊死、細胞変異過程、例えば発癌、薬物誘発性タンパク質タンパク質相互作用、これは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を用いて検出可能である、ＡＤＭＥ（吸着、分配、代謝および排出）または任意の他の細胞応答を含む。多数の細胞応答には、以下からなる群から選択される細胞応答が含まれる：シグナル伝達、一般タンパク質−タンパク質相互作用、酵素活性の変化、小胞輸送、タンパク質移動、小胞移動、受容体媒介性応答の活性化または阻害、イオンチャネルの活性化または阻害、非選択的細孔の活性化または阻害、受容体またはチャネルの下流ポイントでの二次メッセンジャー経路の活性化または阻害、アポトーシスの活性化または阻害、および細胞壊死、細胞毒性、細胞分化および細胞増殖の活性化または阻害。いくつかの細胞応答、例えば細菌溶解、アポトーシス、壊死、増殖は、これらに関して検出されるべき検出分子を必ずしも必要とせず、それに代わって、これらは視覚的検査によって検出してよい。

また本発明の方法を使用して、生化学的分析、例えばウェスタン分析、ノザン分析、一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出、酵素活性の検出、または分子会合アッセイを実施してもよい。

本発明の方法にしたがって、細胞表面膜上に位置する受容体、イオンチャネル、イオンポンプ、およびイオン輸送体に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する物質の能力および効能を検出し、評価し、ならびに特徴付けしてよい。これらの分子会合体は共同して働き、細胞内イオンの恒常性を維持する。これらの系の活性がどのように変化してもイオンの細胞内濃度の変位が生じ、結果的に細胞代謝応答が生じる。

イオンポンプは、ＡＴＰをエネルギー源として利用して膜を横切るイオン勾配を維持するように作用する。イオンポンプの例としては、膜を横切るナトリウムおよびカリウムイオンの勾配を維持するＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰアーゼ、膜を横切るカルシウムイオン勾配を維持するＣａ^２＋−ＡＴＰアーゼ、および膜を横切るプロトン勾配を維持するＨ^＋−ＡＴＰアーゼがある。

イオン輸送体は、膜を横切る１イオン種の勾配の電気化学エネルギーを利用して、他の対イオンの勾配を維持する。例えばＮａ^＋／Ｃａ^２＋−交換体は、ナトリウムの内向き勾配の化学ポテンシャルを利用して、カルシウムイオンをその化学ポテンシャルに反してくみ出す。

イオンチャネルは、活性化すると、細胞膜を通してイオンを移動させる。この移動はイオンの電気化学ポテンシャルに従う。

したがって本発明の一態様では、細胞応答が、溶解、アポトーシス、発育阻止、および発育促進を含む細胞内の化学的に誘発された現象または生理学的現象；細胞による目的のタンパク質または他の分子の生産、分泌、および表面露出；受容体活性化を含む膜表面分子の活性化；膜を横切るイオン輸送；および転写調節、を含む群から選択される、本明細書中に記載の方法を提供する。

モニター対象であってよい目的分子は、生物起源の任意の分子であってよい。その非限定的な例は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、リポペプチドまたはグリコシル化ペプチドのような翻訳後修飾ポリペプチド、抗菌性ペプチドまたは分子、アルギン酸塩のような一次または二次代謝産物、有機小分子、医薬特性を有する分子、等である。

本発明のさらに別の態様では、目的分子が、リポペプチド、グリコシル化ペプチドおよび抗菌性ペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、抗菌性分子、一次および二次代謝産物、および医薬分子を含む有機小分子を含む群から選択される方法を提供する。

本発明の一態様では、試験化合物が薬物または薬物となり得る任意の化合物である方法を提供する。この試験化合物は薬物候補を選択／検証する過程で有用であり得る。

したがって、さらに別の態様では、試験化合物が薬物または、薬物候補の選択過程で有用な任意の化合物である方法を提供する。

有望な試験化合物数は数１００万に達する。ペプチド、タンパク質、糖、等を含む市販の化合物ライブラリは、例えばＡｒＱｕｌｅ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ｇｒａｆｆｉｎｉｔｙ、Ｐａｎｖｅｒａ、およびＯｘｆｏｒｄから入手することができる。

本発明の特定態様では、試験化合物は化学的なまたは天然の薬物候補ライブラリから選択される薬物である。

細胞応答のアッセイは多数の方法で行ってよい。検出は、例えば細胞増殖または増殖なし、細胞形態等、単に視覚的検査によって行ってよく、あるいは検出分子を用いて行ってもよい。検出分子は、アレイ系にあらかじめ存在していてよい。これは例えば遺伝子の発現をＧＦＰレポーターで検査する場合である。また、検出分子は基板の下の寒天から拡散させてもよい。これは実施例２で例証する通りである。

検出分子が細胞アレイ中にあらかじめ存在しない場合、細胞応答は、試験化合物を細胞性成分とインキュベートした後に、検出分子を細胞アレイに添加してアッセイしてよい。

本発明の一態様では、細胞応答を：
（ａ）細胞性成分に対して検出物質を提供する工程；
（ｂ）過剰の未取り込み検出物質を洗浄して除く工程；および、
（ｃ）検出可能シグナルの変化の存在または不存在を検出する工程、ここで検出可能シグナルの変化が存在すれば細胞応答の存在を示す
によってアッセイする、記載の方法を提供する。

別法では、標識を用いずに細胞応答を検出する場合は、例えば熱量測定によって予見してよい。これにより、例えば細胞中の代謝活性を測定することが可能であり、この測定は例えば高感度ＩＲカメラで検出して行う。

本発明の一態様では、細胞応答は、全ブロスまたは細胞培地中、ペレット化細胞のような単離した細胞中、細胞性成分の上清中、または細胞性成分の溶解液中でアッセイする。

本発明の一態様では、検出分子は、核酸、これはその修飾アナログを含む、ペプチド、タンパク質、および抗体、これは抗体断片を含む、酵素基質および特定色素を含む群から選択される。適切な特定色素の非限定的な例は当分野で周知であり、これにはＦｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、およびＣａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ−１を含むＣａ−色素が含まれる（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓのカタログを参照のこと）。

本発明は、例えば、ＣＹ３およびＣＹ５色素を用いて異なる波長における蛍光を見ることによる、あるいは、異なる検出方法を同時に採用することによる、２以上の細胞応答のモニターリングを意図する。

細胞または細胞性成分は、化学的または分子的細胞特性に関する発光標示薬を用いて修飾してよく、そして生存状態で分析してよい。この標示薬は、試験化合物と接触させる前または後に細胞内へ導入してよい。そしてこの導入は、種々の物理的方法、例えば非限定的には、細胞膜を通過する拡散、細胞膜の機械的不安定化、または所定条件下で標示薬の細胞内発現を導く遺伝子操作、のいずれか１つまたは組み合わせによって行う。生存下の研究は、細胞のライフサイクル中の、または細胞を試験化合物、例えば薬物または他の反応性物質、と接触させた場合の、細胞の生理学的状態の分析を許容し、この状態はインジケーターによって報告される。

したがって本発明の一態様では、試験化合物を配送する前に細胞性成分に対して検出物質を提供し、これによりあらかじめ標識された細胞性成分を提供する。

本発明の一態様では、細胞応答は発光によって同定する。

本発明のさらに別の態様では、前記発光は蛍光である。

特に有用な蛍光分子を例示すると、フルオレセンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、マラカイトグリーン、オレゴングリーン、テキサスレッド、コンゴレッド、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２'，７'−ジメトキシ−４'，５'−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシＸ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２'，４'，７'，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、シアニン色素（例えばＣｙ５、Ｃｙ３）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えばＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、Ａｌｅｘａ５４２、等）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、等（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡを参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。

一般にシグナルを検出するための手段は当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識は写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出してよく、蛍光マーカーは光検出器を用いて発光を検出することにより検出してよい。酵素標識は、典型的には、酵素に酵素基質を供給し、この酵素が基質に作用して生成する反応生成物を検出することによって検出し、比色標識は単に着色標識の視覚化によって検出する。さらに別の検出手段は、例えば(微量)熱量測定および(光学)顕微鏡検査である。

細胞応答の検出はまた、多工程検出を実施して達成してよい。この実施は、例示的かつ非限定的には、当分野で周知のサンドイッチアッセイ、及び酵素による検出可能な生成物への変換であってよい。

本発明の一態様では、アッセイはリアルタイムで実施する。

本発明の別の態様では、アッセイは終点アッセイである。

本発明に基づく方法を使用して、特に、宿主細胞の誘発性細胞応答をモニターできる。誘発性細胞応答には、組換え、形質転換、および例えば温度変位によって行うウイルスによる誘導が含まれるが、これらに限定されない。

したがって本発明による方法は、特に、細胞性成分をチップ上で組換え、形質転換し、またはウイルスによって誘導するために使用可能である。

さらに、本発明による方法を使用して、特に、試験化合物を用いる細胞性成分のアッセイの際の、細胞応答の機能性スクリーニングが可能である。

本発明による方法およびマイクロアレイは、さらに、例えばマイコプラズマを用いて抗生物質のアレイをスクリーニングするのに特に適していることがある。

本発明による方法およびマイクロアレイはまた、組み合わせスクリーニングに特に適していることが、当分野で十分に理解されよう。

試験化合物のアレイは、固形基板表面に固定された試験化合物を有してよい。

後の時点でのスクリーニングのために、基板内のあらかじめ定められた領域に溶液中の試験化合物を提供することが望ましいことがある。本発明の方法で用いるマイクロアレイは試験化合物の保存に特に適している。溶液中で提供すれば、スクリーニング手順中にこの試験化合物は自由に移動し得る。これは、立体障害作用を招くことがある固定された化合物と比較して有益であり得る。

したがって本発明の別の目的は、本発明に基づく方法を実施するためのマイクロアレイであって、試験化合物のアレイをあらかじめ定められた領域内で提供し、ここに試験化合物は液状溶液中にあり、基板に固定されていないマイクロアレイを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、本発明による方法を実施するためのマイクロアレイであって、細胞性成分のアレイを基板上のあらかじめ定められた領域中で提供し、ここに細胞性成分は基板上での保存に適切な状態であるマイクロアレイを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、本発明に基づく方法を実施するためのマイクロアレイであって、細胞性成分を基板上で提供し、ここに細胞性成分は基板上での保存に適切な状態であるマイクロアレイを提供することである。

本発明のさらに別の態様では、当該状態が凍結乾燥およびグリセリン溶解を含む群から選択される、本発明によるマイクロアレイを提供する。

上記の保存性細胞アレイは長期保存によく適している。このような状態の細胞アレイは鋳型として使用してよいことがよく理解されよう。すなわち、これは後に、例えば親アレイから二次アレイ上へ細胞性成分を背中合わせにプリントすることによる、二次的な同一アレイを作成するための親アレイとして使用してよい。同一の親を用いてこの処理を何度も繰り返し、二次アレイのセットを作成してよい。

本発明の一態様では、検出分子のアレイが基板内に固定されている、本明細書中に記載のマイクロアレイを提供する。

本発明のさらに別の態様では、検出分子のアレイが多数の同一検出分子、または多数の異なる検出分子を含む、本発明によるマイクロアレイを提供する。

本発明はまた、基板表面で低い伸展性の細胞性成分の増殖を得るための、本明細書中に記載のマイクロアレイまたは固形多孔性基板の使用を包含する。驚くべきことであるが、本発明による方法において、細胞性成分を固形基板表面に接種すると、近接して充填された基板上のコロニー間の伸展性が制限されることが見出された。

本発明のさらに別の目的は、本明細書中に記載のマイクロアレイを含む、本発明による方法を実施するためのキットを提供することである。

実施例
以下に本発明の実施例を挙げるが、これは例示的であり、いかなる意味においても限定的であると解釈すべきでない。

以下の実験は、本発明による生存アレイ分析法におけるフロースルー基板の使用を説明する。ここでは基板上にプリントされているか、あるいは基板を通して拡散している低分子化合物を細胞応答によって検出可能である。以下の実施例中、使用する細胞応答は微生物の細胞応答であり、これには増殖（または増殖阻害）、酵素活性または蛍光タンパク質の発現を導くＤＮＡの摂取であった。しかしながら、適用はこれらの領域のみに限定されるわけではない。この実施例は、生存細胞アレイに適用可能な種々のエフェクターを単に説明するためのものである。エフェクターに対する細胞応答を基板上でアッセイした。この基板は複数の並行かつ縮小化された分析のために高密度で化合物をプリントするのに適している。

多孔性固形基板表面上への形質転換大腸菌細胞の提供
本発明では、固形基板表面は、細胞性成分の接種材料をその表面へ直接積載して、これと接触させてよい。

エタノール滅菌したフロースルー固形基板（アルミニウム−酸化物基板；Ａｎｏｐｏｒｅ、Ｗｈａｔｍａｎ）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＬ−寒天プレート上に設置した。１０ｐｇのｐＵＣ１８プラスミド（Ｓｉｇｍａ）をＸＬ２ＭＲＦ'形質転換受容性細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、製造元のプロトコルを使用。ただし、形質転換につき形質転換受容性細胞を１００μｌではなく２０μｌしか使用しなかった）内へ形質転換し、次いでこの細胞を異なる希釈率で基板上にプレートし、そして３７℃で８時間培養し、アンピシリン耐性コロニーの出現を評価した。栄養物およびアンピシリンはともに基板の下から基板の孔を通過して細菌に達する。

図１Ｂに示すように、８時間後のコロニーはＬ−寒天と比べて基板上で僅かに小さく、直接Ｌ−寒天上で培養したコロニー（図１Ａ）と比べて、伸展が減少する傾向であった。１６時間後、多孔性基板上のコロニーの直径は寒天プレート上のコロニーの直径のおよそ半分であった。検出は光学顕微鏡検査および視覚的検査によって行った。形質転換効率は２．７ｘ１０^８ｃｆｕ／プラスミドμｇ（寒天）および１．８ｘ１０^８ｃｆｕ／μｇ（基板）であった。

これらの実験は、基板が容易に滅菌でき、そしてプラスミドによって形質転換された細胞の培養および選択は多孔性基板表面で迅速に実施でき、この場合培養効率はわずかに低い、ことを示す。最初の８時間以内では、コロニーの増殖は寒天上の直接増殖と比べてわずかにしか制限されないようである。しかしながら、その後の増殖は寒天上より急速に抑制されるようであり、これは基板上に近接して充填されたコロニー間の伸展性を制限するのに有益である。したがってサンプル間のコンタミネーションが生じる可能性が減少し、これはアレイへの適用に好都合である。

多孔性基板上の培養大腸菌細胞由来のβ−ガラクトシダーゼ活性の検出（この酵素用の蛍光発生基質であるＭＵＧを使用）
滅菌フロースルー基板を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）および５０μｇ／ｍｌのＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ：Ｍ−１６３３）を含有する２ＴＹプレート上に設置した。プラスミドｐＵＣ１８ （β−ガラクトシダーゼ発現性）を伴う、１０^３ ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌ＸＬ２ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'を含有するＬ−ブロス５０μｌ分注量を基板上にプレートし、同様の容量を直接アガロース上にプレートした。コントロールはｐＵＣ１８を欠いた宿主株を同一プレート（アンピシリンなし）上にプレートして実施した。ＭＵＧがその蛍光生成物（４−メチルウンベリフェロン）へ変換されたことは、８時間培養後に評価した。この評価は、寒天プレートをＵＶトランスイルミネータに設置し、ＵＶＰ Ｅｐｉ Ｃｈｅｍｉ ＩＩ ＣＣＤカメラを用いて蛍光コロニーの画像を捕捉することによって行った。図２Ａは実験の設定を示し、図２Ｂおよび２Ｃは基板上（２Ｃ）または直接寒天上（２Ｂ）で得られた結果を示す。

β−ガラクトシダーゼを発現しないコロニーは蛍光性ではなかった。蛍光は、両方の寒天プレート上または、同一寒天プレートの上に積載された基板上で、ｐＵＣ１８を含有する（したがって酵素を発現する）大腸菌コロニーから検出できた。多孔性基板上の方が、蛍光の検出率が高く、拡散性は低かった（図２Ｂ）。

結論として、本発明による方法は、基板の下側から栄養寒天または他のマトリクス由来の拡散を許容する。例えば酵素基質は上方へ拡散できる。さらに、微生物を表面に伴う適切な支持基板は、種々の培地間で移動でき、連続アッセイができた。この実験では、酵素発現性の細菌および下側の寒天中のこの酵素に関する低分子量基質を多孔性材料上にプレートすることにより、特定酵素の発現に基づいて細菌を検出できること、換言すれば、酵素活性に基づく表現型の検出を実証した。この方法は、例えば、種々の比色および蛍光定量アッセイに基づいて細菌を分類するのが一般的である診断学において、多数の用途を有する。さらに、この基板は蛍光物質の検出に関してバックグラウンドが低く、フロースルー多孔性材料上では検出率が少し向上した。これは、部分的には、細菌の低い伸展性および／または酵素の低い側方拡散性を反映しており、これは密に近接した多数のマイクロコロニーの培養に適用可能な微生物マトリクスに関して有用な性質である。

フロースルー固形基板表面での細菌細胞増殖−基板の下側から提供される抗生物質に対する感受性
融解した０．５％寒天および０、５００μｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌカナマイシン（カナマイシン０、１００および１０００ｎｇ）の２００ｎｌスポットを、エタノール滅菌したフロースルー基板上にスポットし、基板を通過する直径１ｍｍの寒天栓を形成させた。基板が多孔性なので、毛管作用により融解寒天が孔内へ引き込まれる。次いで、これらの処理を施した基板の上に、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを伴う２ＴＹブロス中で培養したプラスミドｐＵＣ１８を含有する、１０^６ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌ＸＬ２ ＭＲＦ'細胞を付加した。そしてこの基板を同濃度のアンピシリンを伴う２ＴＹプレート上に置いた。次いでプレートを３７℃で１２時間インキュベートした。この結果を表１に示す。

結論として、この実験は、抗生物質を含有する寒天栓を多孔性基板上にプリントすることによって、抗生物質感受性を微小規模で試験可能であることを示す。本発明による生存アレイにより、エフェクターを、制御されたスポット中に局在化させることができる。このスポットは直接プリントするか、あるいは多孔性基板の孔内でマトリクス、例えば低融点アガロース中に包埋する。抗生物質を直接、あるいは寒天中、または他のマトリクス中でプリントする場合、このアッセイの多重化が許容されることがあり、すなわち平方センチメートルのアレイ表面当たり何千ものアッセイの実施が可能である。この多重化アッセイは、一定精度で、相互コンタミネーションを生じずに実施することができ、これはガラスまたは他の平面アレイ上では不可能である。

ろ過によるフロースルー固形基板表面での細菌のトラップ−コロニー検出および形態学
プラスミドｐＧＦＰｕｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ＢＤ）を含有し、ＧＦＰを活発に発現する大腸菌ＸＬ２ ｂｌｕｅ ＭＲＦ'細胞を１０^３細菌／ｍｌに希釈した。滅菌フロースルー基板を０．２２μＭ孔、直径１０ｃｍのＮａｌｇｅｎｅフィルタ中に置き、基板全体にわたりこの基板を通して培地を吸引した。コントロールとして、細菌の密度が同じの、同じ容量の培地中で基板を振とうしながらインキュベートした。次いで、基板をＬ−寒天プレート上で一晩インキュベートし、ＧＦＰを用いてコロニーを可視化した。

図５Ａおよび５Ｂに示すように、細菌の蓄積が示された。さらに、直径１００μｍより小さいマイクロコロニーが基板上で検出できた（図５Ｃおよび５Ｄ）。細菌コロニー（図５Ｃ）はプリントされたオリゴヌクレオチドスポット（図５Ｄ）と同一サイズで検出できた。

結論として、適切に支持されたフロースルー基板を用いてろ過し、これにより細菌をトラップすることによって細菌を濃縮できることが示された。一般に、微生物は基板の下側の寒天または他のマトリクスに浸透し得ない。この方法は、水質検査のような用途に適用可能である。この用途では、例えばフィルタ濃縮と、選択培地またはさらに別の捕獲物質もしくは分類物質（例えば抗体）でスポットしたアレイ基板上操作を組み合わせる。さらに、他の実験で見られたように、細菌コロニーは、寒天と比べてフロースルー基板上で伸展性が低く、これはプリントされたオリゴヌクレオチドスポットと同一サイズで検出可能である。この最後の２つの特性は、高密度生存アレイの用途にフロースルー基板を使用することを支持するものである。

フロースルー固形基板上での重ね合わせマスクの使用−区画化および自己蛍光試験
上記実験で示されるように、本発明で使用するフロースルー固形基板は、その表面上で相対的に低い微生物の伸展性を示す。しかしながら、酵素反応または微生物学または他の生存細胞アレイの用途に関しては、基板をさらに区画化することがより望ましいことがある。

エタノール滅菌したフロースルー固形基板に種々の化合物を塗り、基板の領域を区画化するのに適したマスク用物質を探した。適したマスク用物質に関する判定基準は（１）容易に適用できること、（２）Ｃｙ３、Ｃｙ５およびフルオレセインチャネル中で低蛍光性であること、（３）溶媒滅菌法に耐性であること、（４）水溶性でないこと、および（５）基板中の全孔をブロック可能であり、ならびに分散した領域内で微生物の伸展を抑えること、であった（図３Ａ参照）。有望な候補である、ラテックスマスク用フィルムについて、滅菌性、溶媒耐性、自己蛍光および適用容易性に関する適合性を十分に試験した。

適切な物質は、当分野の供給元から販売されている、低い蛍光性を有する液体ラテックスマスク用フィルムであることがわかった。Ｔａｌｅｎｓ Ｌｉｑｕｉｄ Ｍａｓｋｉｎｇ Ｆｉｌｍ （０５２，Ｒｏｙａｌ Ｔａｌｅｎｓ，Ａｐｅｌｄｏｏｒｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ）が適していたが、他のマスク用物質も等しく適用可能であり得る。このマスク用物質をエタノール滅菌ナンバー１クロテンブラシを用いて適用した。２時間放置して乾燥した後、サンプルを９５％エタノール、１００％メタノール、１００％イソプロパノール、滅菌１％ＳＤＳ、滅菌水または１００％ＤＭＳＯに１０分間浸し、次いで滅菌水ですすぎ、乾燥した。次いで、処理基板をマスク用液の溶媒耐性、蛍光、および滅菌性に関して評価した（表２参照）。マスクの一例を図３Ｂに示す。

結論として、フロースルー基板の表面は、プリントしたマスク用物質を用いて微生物用に区画化可能である。この物質はまた、基板をより頑強な複合性材料に変える。寒天上であれば過増殖を導くであろう条件にしたがってさえ、フロースルー基板上では区画化が有効である。洗浄工程は、マスク用物質の蛍光に対して穏やかな効果を有したが、滅菌性には影響しなかった。メタノールおよびＤＭＳＯが最良の洗浄用物質であると思われた。その理由は、これらが基板およびマスク用物質を無損傷のままにしたこと、ならびに自己蛍光が低いことである。一旦乾燥すると、マスク用物質は試験した溶媒に対して非常に耐性であった。このマスクは、各区画に適用される異なる検体または細胞型を伴う、生存アレイの区画化を意図するものであり、細菌および真菌用途に好都合な固形基板上の培養に最も有用であるが、またこのマスクを使用して、哺乳類または他の表面増殖組織培養細胞の側方伸展を減少させてもよい。

フロースルー基板のマスク領域−細菌増殖のための区画化
フロースルー基板を滅菌し、上記のようにマスクし、１００％メタノール中で洗浄した後に使用した。この基板を次いで、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＬ−寒天プレート上に置いた。そして、細菌に適した変異体ＧＦＰを発現性プラスミドｐＧＦＰｕｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する、大腸菌ＸＬ２ ｂｌｕｅ ＭＲＦ'を上に付加するか、あるいはスポットした。３７℃で一晩インキュベートした後、増殖および蛍光を評価した。

図４Ａに示すように、区画内へ特定のスポットをした場合には良好な増殖が観察され、細菌は良好に封じ込められていて、隣接する区画へ伸展していないことが示された（図４Ｂおよび４Ｃ）。

結論として、細菌の増殖はマスク用物質を用いて、区画間の伸展を伴わない有効な区画化ができる。プリントおよびマスク化を自動化すれば、この過程はさらに縮小化し得る。

区画化フロースルー基板上で抗生物質感受性をモニターするためのＧＦＰ発現の使用
フロースルー基板の区画を、諸濃度のカナマイシンを含有する１％メタファーアガロース中でプリントした。６０℃未満の温度でプリントするよう注意して、すべてのサンプルを３回プリントした。これらの基板を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ−寒天プレート上に置き、ＧＦＰ発現性大腸菌ＸＬ２ Ｂｌｕｅを上から付加した。カッパカメラを装備した顕微鏡を使用して、画像を捕捉し、これをデジタル化して定量し、細菌増殖および生存度に対するカナマイシンの影響を評価した。

生存度に対するカナマイシンの影響は、ＧＦＰレポーターを用いて明らかに検出できた。これは図６に示す通りである。

結論として、この実験は、フロースルー基板上の生存アレイにおいて使用されている蛍光レポーターまたは読み出しシステムの使用を実証している。

区画化フロースルー基板上での、大腸菌内へのプラスミド形質転換
２つの方法を使用した。第一の方法、（ａ）プラスミドおよび大腸菌をアレイへ適用する直前に混合する、および第二の方法、（ｂ）２つの成分をじかにアレイ上で混合する。
（Ａ）１０ｎｇのｐＧＦＰｕｖまたはｐＵＣ１８を別々に、１０μｌ分取量の形質転換受容性細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＸＬ２ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'）内へ形質転換した。この形質転換は単に２つの成分を混合して行った。これらの混合物の（約）０．２μｌ分取量を区画化フロースルーチップ中にスポットし、これを次いでＬ−寒天／アンピシリンプレート上で一晩培養した。
（Ｂ）ｐＧＦＰｕｖ ＤＮＡ（約０．２μｌ）を基板上にスポットし、次いで数秒後に０．５μｌの形質転換受容性細胞をスポットした。基板を、次いで、Ｌ−寒天／アンピシリンプレート上に置き、一晩インキュベートした。

図７Ａおよび７Ｂに示すように、ｐＵＣおよびｐＧＦＰｕｖは、上記方法Ａにしたがって短時間予備混合すると、区画化基板上で有効に形質転換可能であった。隣接区画への伸展は観察されなかった。

図７Ｃに示すように、ｐＧＦＰｕｖはまた、上記方法Ｂにしたがい、基板上で２つの成分を混合することによって大腸菌内へ形質転換可能であった。

結論として、区画化は、接種領域の増殖の封じ込め、および相互コンタミネーションの防止に関して、４８時間後でさえ有効である（図７Ｄ）。これらの形質転換に関するデータを受けて、精製ＤＮＡをスポットする工程、次いで細胞を基板上へ直接導入する工程を含む形質転換法への道が開かれる。これらの工程は互いに間断なく、あるいは一緒に生存アレイへ適用される。細菌は、プリント直前に形質転換可能であり、あるいはチップ上でさえ高い効率で形質転換可能である。

多数の形質転換プロトコルで共通である、細菌をＤＮＡと冷却インキュベートし、そして熱ショックを与える工程を、チップ上で実施してもよい。可能性としては、本方法論を用いて、例えば１セットの９６ウェルプレート由来の９６細胞型（例えば９６の異なるトランスポゾン挿入を伴う大腸菌）を９６補足用プラスミド（またはこの基板から拾い上げた他のエフェクター）とともにプリントすることができる。これは何千もの組み合わせの株およびエフェクターに関して実施可能である。

フロースルー基板上での抗体による細菌の捕獲
未処理のフロースルー基板をエタノール滅菌した後、分取したウサギ抗大腸菌のＩｇ画分またはコントロール抗体（Ｍ１３抗体、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから入手）のaliquotsで処理した。このウサギ抗大腸菌は、大腸菌Ｋ１２派生株Ｃ６００（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ Ｄｅｎｍａｒｋから入手、ＣＡＴＢ０３５７，ｌｏｔ ０９０−１０１）の超音波処理抽出物をウサギに接種して作成した。これらのスライドを加湿チャンバー中で２時間インキュベートした後、しばらく乾燥してこの抗体を固定し、洗浄し、そしてＧＦＰ発現性の１０６大腸菌を伴うＬ−ブロス１０ｍｌ（または大腸菌を含まない無菌コントロール）と穏やかに振とうしながらインキュベートした。Ｌ−ブロス中で洗浄後、基板をＬ−寒天プレート上に置き、翌日、蛍光コロニーを計数した。

結果として、大腸菌特異的抗体に特異的な細菌の蓄積が観察された。これは図８に示す通りである。大腸菌抗体を用いた場合には、基板当たり平均２１４コロニー（ｎ＝２）が観察され、Ｍ１３コントロール抗体を用いた場合には７１コロニー（ｎ＝２）が観察された。

結論として、フロースルー基板上で細胞を特異的抗体により捕獲できることが示された。

抗体アレイ
熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０アルファ、ＨＳＰ９０ベータ、ＰｏｌｙＵＢＱおよびベータ−アクチンに対する抗体を、標準的プロトコルを用いて、アレイ形式でアルミニウム−酸化物基板（Ａｎｏｐｏｒｅ，Ｗｈａｔｍａｎ）上にスポットする。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＣＯ_２インキュベーター中、標準条件下で培養し、密度１０^６細胞／ｍｌにする。２５μｌの細胞懸濁液をこのアレイに加える。標準設備を使用し、アレイ経由で吸引して培地を除去し、新鮮な培地５０μｌを加える。細胞を基板上、滅菌条件下３７℃でインキュベートする。このインキュベーションは２４時間、または密度が１０^７細胞／ｍｌに達するまで行う。１５分間、温度を４３℃に上げる。コントロールは３７℃で維持する。アレイ経由で吸引して培地を除去する。細胞を洗浄液５０μｌで洗浄する。アレイ経由で吸引してこの液体を除去した後、溶解バッファー２５μｌを加える。１５分溶解した後、液状物をアレイ経由で前後にポンプし、毎分２サイクルの上下流動を１５分間行う。液状物を吸引除去し、洗浄バッファー２５μｌでアレイを洗浄し、このバッファーを吸引除去する。抗−熱ショック抗体（抗−ＨＳＰ９０アルファ、抗−ＨＳＰ９０ベータ、抗−ＰｏｌｙＵＢＱおよび抗−ベータ−アクチン、これらはすべてフルオレセインで標識されている）の混合物２０μｌを加え、毎分２サイクルで１５分間アレイ経由でポンプする。画像を２分毎に捕捉する。バックグラウンドが高すぎる場合は、抗体溶液をアレイから除去し、アレイを洗浄バッファーで洗浄する。画像を撮影する。データは標準的ソフトウェアを用いて分析する。

抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、単鎖抗体、アプタマーであってよく、ここに基板上にスポットされた抗体は、結合した抗体の検出用に添加される抗体とは別のエピトープを認識する。

シトクロムＰ４５０イソ酵素１Ａ（ＣＹＰ１Ａ）の誘導
エトキシレソルフィンを架橋剤で化学的に修飾し、当分野で周知のスポッティング技術を用いてアルミニウム−酸化物基板上にスポットする。

ｖａｎ'ｔ Ｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）に記載されたように肝細胞を調製する。Ｐ．Ａ．Ｃｈｒ'ｔ Ｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ．「培養ラット肝細胞におけるデキサメサゾンによるシトクロムＰ４５０ ３Ａ１の選択的誘導。新規逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを用いる分析。（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ３Ａ１ ｂｙ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６０ ｐｐ１５０９−１５１８（２０００）。生存度はトリプタンブルー排除によって判定する。細胞密度８００００細胞／ｍｌの細胞懸濁液５０μｌを基板に加える。標準設備を用いて、培地を基板経由で吸引除去する。細胞を接着させるため、加湿ＣＯ_２雰囲気中３７℃で、１０％（ｖ／Ｖ）胎児ウシ血清、１４０ｍＵ ｍｌ^-1インシュリン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ ｍｌ^-1ペニシリン、および１００マイクログラム ｍｌ^-1ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で、３．５時間初期培養する。その後、培地をピペットで除去して非接着細胞を洗浄除去する。インキュベーション培地を、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１４０ｍＵ ｍｌ^-1インシュリン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２００Ｕ ｍｌ^-1ペニシリン、および２００マイクログラム ｍｌ^-1ストレプトマイシンを含有する無血清ＤＭＥＭに変える。この肝細胞は１日以内に集密層を形成するであろう。細胞をアレイに適用した２４時間後、培地のほとんどを吸引除去するが、細胞が乾燥しないように注意を払う。

ベンゾ［ａ］ピレン、デキサメサゾン、フェノバルビタール、ヘキソバルビタール、デブリスキン、アニリン、ミダゾラム（ＤＭＳＯ中１〜１００μＭの範囲の濃度）を、圧電性インクジェットスポッティング技術を用いて、（アレイの）特定位置で細胞層上に適用する。誘導物質の適用３０分後、培地２５マイクロリットルを加える。

異なる時点で、培地を吸引除去し、溶解バッファー５μｌを加える。反応溶液２μｌを加え、可溶化液をアレイ内へ引き込む。孔内でレソルフィンが遊離すると蛍光が発生するので、標準設備を用いてこれをモニターし、１０秒毎に画像を捕捉する。

これらの化合物は異なるシトクロムｃイソ酵素を誘導する。いくつかのイソ酵素はエトキシレソルフィンの変換に関して非常に活性が高く、他のものは、ほとんど、あるいは全く活性を有さない。溶解によって、ｃｙｔ Ｐ４５０は細胞から拡散するはずであるが、これは困難であることがある。その理由はｃｙｔ Ｐ４５０が補酵素および補因子を必要とし得る膜結合型酵素だからである。

別法では、エトキシレソルフィンを基板に結び付けることを必要としない。エトキシレソルフィンを添加し、細胞がこれを摂取すれば、離散してしまう前に、そのままで活性をモニターし得る。

この酵素反応中にはポンプを行わず、生成物がその反応部位から離散するのを防ぐ。

フロースルー基板上での糸状菌類の培養
新鮮でないパンから単離されたペニシリウム属種の菌類を、Ｌ−寒天上のフロースルー基板（アルミニウム酸化物；Ａｎｏｐｏｒｅ；Ｗｈａｔｍａｎ）上にプレートし、加湿チャンバー中、室温で３日間インキュベートした。

図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示す通り、良好かつ急速な増殖が得られた。

この実験は、フロースルー基板上で真菌の培養が可能であることを示し、原核微生物に関して、同様の範囲内の適用を生存チップ中で可能である。

細菌性病原体に関する株分類、診断設定における、抗体による捕獲および、洗浄剤感受性、酵素活性およびトランスポゾン挿入に基づくチップ上検出の原理
細菌性病原体に関する株分類、診断設定における、抗体による捕獲および、洗浄剤感受性、酵素活性およびトランスポゾン挿入に基づくチップ上検出の原理を説明する。この分析では、たった５スポットのアレイから多数の情報を得る。この実験は、患者由来の９細菌株の混合物（表３）、および抗原Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅそれぞれに対する抗体である、５スポットの抗体アレイ形式を想定する（図１０）。スポットＥはネガティブコントロールスポットである。

患者由来の病原性細菌の複合サンプルを２つの同じアレイ、図１０に記載したアレイ１Ａに通す。特異的抗体によって捕獲される表面抗原Ａ〜Ｄに基づく、各株型の、アレイへの予想される動員を、図１０に示す−アレイ１Ｂ。各スポット中の数字はアレイ上の各位置に動員される株を示す。

次いで第一のアレイを、すべての株が増殖するはずの、非選択性寒天培地上に置く。第二のアレイは、洗浄剤感受性株の増殖を阻害する洗浄剤を含有する選択性培地上に置く。予想される増殖パターン（多孔性Ｐａｍ基板経由で上方へ栄養物が拡散すると、どのスポットがコロニーに変化するか）を図１０に示す−アレイ１Ｃおよび１Ｄ。

アレイ１Ｃおよび１Ｄを今度は、目的の酵素に関する蛍光発生基質を含有する別の培地上に置く。酵素活性のせいで蛍光性になると予測されるコロニーを図１０に示す−アレイ１Ｅおよび１Ｆ。これは適切な株の捕獲、選択性培地上での増殖および問題の酵素の生産を必要とする。

このアレイを次いで、選択性寒天から取り出し、アレイ上の細胞をその場で溶解し、そのＤＮＡを基板に架橋する。次いで、特異的ハイブリッド形成によってトランスポゾンＸを検出する標識オリゴヌクレオチドと、高速ハイブリッド形成アレイであるフロースルーアレイの機能性を用いて、標準核酸ハイブリッド形成を実施する。予想される結果を図１０に示す−アレイ１Ｇおよび１Ｈ。この時点で、特異的抗体によって捕獲され、使用する培地上で増殖可能であり、そしてトランスポゾン配列を含有する株のみが検出される。

このアレイ系は大きな柔軟性および多数の異なるアッセイを組み合わせて複数のパラメータを同時に複合分析する可能性を提供する。

Ｐａｍ基板上で培養した場合の大腸菌ＸＬ２ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’の、抗生物質カナマイシンに対する感受性

Pam基板に適用されたマスク用物質に対する洗浄処理の影響
蛍光：Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１ ＵＶ顕微鏡を用いて評価。＋＋は、許容範囲を超える高い自己蛍光を有し（９８ｍｓ未満の露出で飽和）、＋は、１２ビットカッパＣＣＤカメラが９８〜２００ｍｓの範囲の露出で飽和、＋／−は、ＣＣＤカメラが２００ｍｓ〜１秒の範囲で飽和。−は、ＣＣＤカメラが１秒を超える露出で飽和。
溶媒耐性：光学顕微鏡法を用いて評価。ＢＸ４１カメラ使用。評価はマスク用物質の洗浄処理耐性に基づく。
滅菌性：基板をＬ−寒天プレート上に重ねて３７℃で一晩置くことにより評価。滅菌とは基板表面にコロニーが存在しないことを示す。

実施例１３で使用する患者のサンプル中の９細胞株。株４および５のみがそのゲノムに挿入されたトランスポゾンＸを有する。

フロースルー固形基板上の形質転換コロニーの存在を示す。このコロニーは基板の縁に集中している。下部パネル（Ｂ）は基板上で培養した大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＸＬ２ ＭＲＦ'のコロニーを示す。この場合、基板の下の寒天から基板を通って栄養物が拡散している。上部パネル（Ａ）は直接寒天上で培養したコロニーを示す。 蛍光発生基質ＭＵＧを用いた、大腸菌によって発現されたβ−ガラクトシダーゼ活性の検出を示す。画像は４ ｍｍ×３ ｍｍ領域を示し、すべて同一の尺度にした。（Ａ）アッセイ原理。フロースルー固形基板の表面にトラップされた細菌は、蛍光生成物を形成する酵素を発現する。蛍光生成物は、この酵素の基質（この場合はＭＵＧ）が上方へ拡散し、細菌にまで達すること、および／または酵素（β−ガラクトシダーゼ）が細胞から放出されて下方へ拡散し、寒天にまで達することによって形成される。ａは寒天；ｂはフロースルー基板；ｃはコロニー（β−ガラクトシダーゼ）（Ｂ）栄養寒天上に直接プレートされた細菌、または（Ｃ）寒天の上に積載されたフロースルー固形基板上にプレートされた細菌。 マスクされた固形基板を示す。このマスクは微生物の増殖または酵素反応を区画化する。下側の培地からの拡散は可能であるが、微生物または他の物質の側方への伸展移動は妨げられる。（Ａ）模式図（上面図）；（Ｂ）メタノール洗浄したマスク化基板の蛍光チャネル中の上面写真。区画は幅０．５ｍｍ〜１ｍｍ、面積０．２５〜１ｍｍ２で変わる。しかしながら、適切なプリント技術を用いれば、これよりずっと小さい区画も可能である。ｃは区画；ｄｍは表面または貫通チップ上の分割用マスク （図３と同様の）マスクされた基板を示す：（Ａ）細菌培養を表面全体にわたって伸展することにより、ＧＦＰ発現性大腸菌で接種された基板。画像のキャプチャーは、ＢＸ４１顕微鏡により、３０ｍｓ露出で、フルオレセインフィルタを用いて行った。この場合の区画は幅約０．５〜１ｍｍである。明るい領域は細菌で満たされた区画である；（Ｂ）ピペットの先端を０．５ｍｍ×０．５ｍｍの１区画内へ接触させてＧＦＰ発現性大腸菌を接種した基板の可視照射；（Ｃ）ピペットの先端を０．５ｍｍ×０．５ｍｍの１区画内へ接触させてＧＦＰ発現性大腸菌を接種した基板にＵＶ照射して行った、ＧＦＰの可視化。 フロースルー基板上でのろ過による細菌の蓄積を示す：（Ａ） 基板を、１０３ＧＦＰ発現性細菌／ｍｌを含有するＬ−ブロス中室温でインキュベートした、および；（Ｂ） 基板を介する培地のろ過、この基板の表面に細菌をトラップする；（Ｃ） フロースルー基板上で６時間培養したＧＦＰ発現性大腸菌コロニーの検出（３０ｍｓ露出）；（Ｄ） Ｆｌｕで標識したＲＮＡ転写物を、同じくＰａｍＣｈｉｐアレイ上のオリゴプローブとハイブリッド形成させて得られるスポット（９８ｍｓ露出）。この画像は（Ｃ）と同一の寸法であり、（Ｃ）および（Ｄ）のスポットは同様のサイズである；（Ｅ）、（Ｆ） ＧＦＰ発現性大腸菌をＬ−寒天上にプレートして得られる典型的コロニー（Ｅ）；および寒天基礎上に設置したフロースルー基板上、同一プレート上で同一期間培養したコロニー（Ｆ）の比較。両写真の拡大率は同一であった。コロニーの境界を規定するエッジは、この基板上で培養した細菌に関しては、常に非常に鮮明である。 区画化フロースルーチップにおける、カナマイシン活性の指標であるＧＦＰ発現を示す。エラーバーは３回の測定に関する標準偏差を示す。 （Ａ）ｐＵＣ１８（アンピシリン耐性を発現するがＧＦＰを発現しない）；および（Ｂ）ｐＧＦＰｕｖ（ＧＦＰタンパク質ならびにアンピシリン耐性を発現する）の、Ｌ−寒天プレート上の区画化フロースルー固形基板上への形質転換。ｎｔは形質転換なし；（Ｃ）細胞およびＤＮＡをチップ上で混合することによる、ｐＧＦＰｕｖの大腸菌内への形質転換。Ｐａｍ基板区画中のマイクロコロニーをＧＦＰ蛍光によって可視化する；（Ｄ）（Ａ）および（Ｂ）と同様であるが、基板と４８時間インキュベートした後に可視照射。区画化により、接種された区画が集密的ではあっても、コロニーの伸展は封じ込められたままであることに留意。四隅は細菌の集密増殖を有し、この細菌増殖は中心区画へ、あるいは部分的にさえ、マスク用物質を超えて、伸展してはいない。 ＧＦＰ発現によって可視化した、抗体による大腸菌の捕獲を示す：（Ａ）Ｍ１３抗体（ネガティブコントロール）；（Ｂ）大腸菌抗体（全細胞抽出物に対して作成）。 フロースルー固形基板上でのペニシリウム属単離体の増殖を示す：（Ａ）パン上での親株増殖；（Ｂ）基板表面でじかに生長している菌糸；（Ｃ）基板表面より3 mm上空の菌糸生長。これは(Ｂ)と同一の実験から得られる。写真は、基板上に始まっているがその上に顕著に突出している菌糸に焦点を合わせている。 細菌性病原体に関する株分類、診断設定における、抗体による捕獲および、洗浄剤感受性、酵素活性およびトランスポゾン挿入に基づくチップ上検出の原理を示す。

Claims (35)

1. 細胞性成分の細胞応答をスクリーニングするための方法であって：
   （ａ）表面に固定された検出分子のアレイを有する基板（SUBSTRATE)表面に、細胞性成分を提供する段階；
   （ｂ）固形基板表面のアレイ状検出分子に対応する基板上の位置に試験化合物を配送する段階；
   （ｃ）細胞応答の誘発を許容する条件下で、試験化合物を、固形支持体表面の細胞性成分とインキュベートする段階；
   （ｄ）細胞応答をアッセイする段階；および、
   （ｅ）試験化合物によって誘発された細胞応答を同定および特徴付けする段階；
   を含む方法。
2. 前記固形基板が多孔性固形基板である、請求項１に記載の方法。
3. 前記固形基板がフロースルー固形基板である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
4. 前記基板表面への細胞成分の提供が、接種材料または培養物を前記基板上に直接載せることによる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記試験化合物の配送が、接触力による、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 前記接触力が毛管力または圧電力である、請求項５に記載の方法。
7. 栄養物(群)を固形表面の孔群の下側から提供する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 細胞応答のアッセイが：
   （ａ）細胞性成分に対して検出物質を提供する段階；
   （ｂ）過剰の未取り込み検出物質を洗浄して除く段階；
   （ｃ）検出可能シグナルの変化の存在または不存在を検出する段階、ここに検出可能シグナルの変化が存在すれば細胞応答の存在を示す；
   による、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記細胞応答を、全ブロスまたは細胞培地中、ペレット化細胞のような単離細胞中、細胞性成分の上清中、または細胞性成分の可溶化液中でアッセイする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記試験化合物の配送が、配送用マスク、高精度ｘ−ｙ−ｚ分注器、インクジェットプリンター、および手動操作を含む群から選択される手段による、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 前記試験化合物の配送が高精度ｘ−ｙ−ｚ分注器またはインクジェットプリンターによる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記細胞応答の同定が発光による、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記発光が蛍光である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記細胞性成分が、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、および細菌を含む微生物細胞、さらに、細胞小胞、細胞小器官、組織切片、および線虫を含む完全体生物、を含む群から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記検出分子が、その修飾アナログを含む核酸、ペプチド、タンパク質、および抗体断片を含む抗体、酵素基質および特定色素を含む群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記細胞応答が、溶解、アポトーシス、増殖阻害、および増殖促進を含む、細胞内の化学的に誘発された現象または生理学的現象；細胞による目的のタンパク質または他の分子の生産、分泌、および表面露出；受容体の活性化を含む膜表面分子の活性化；膜を横切るイオン輸送；および転写調節を含む群から選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記目的分子が、リポペプチド、グリコシル化ペプチドおよび抗菌性ペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、抗菌性分子、一次および二次代謝産物、および医薬分子を含む有機小分子を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記試験化合物が、薬物、または薬物候補を選択する過程で有用な任意の化合物である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
19. 前記試験化合物が、化学的なまたは天然の薬物候補ライブラリから選択される薬物である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記固形基板が金属−酸化物基板である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記固形基板がアルミニウム−酸化物基板である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記アッセイをリアルタイムで実施する、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記アッセイが終点アッセイである、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記細胞性成分に対する検出物質の提供が試験化合物の配送前に生じ、これによりあらかじめ標識された細胞性成分を提供する、請求項８に記載の方法。
25. 宿主細胞の誘発性細胞応答をモニターするための、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法の使用。
26. 細胞性成分をチップ上で組換え、形質転換し、またはウイルスによって導入するための、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法の使用。
27. 試験化合物を伴う宿主細胞のアッセイに際し、細胞応答を機能性スクリーニングするための、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法の使用。
28. 試験化合物のアレイをあらかじめ定められた領域内で提供し、前記試験化合物は液状溶液中であり、かつ基板に固定されていない、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法を実施するためのマイクロアレイ。
29. 細胞性成分のアレイを基板上のあらかじめ定められた領域中で提供し、前記細胞性成分は前記基板上での保存に適切な状態である、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法を実施するためのマイクロアレイ。
30. 細胞性成分を基板上に提供し、前記細胞性成分は前記基板上での保存に適切な状態である、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法を実施するためのマイクロアレイ。
31. 検出分子のアレイが基板内に固定されている、請求項２８〜３０のいずれかに記載のマイクロアレイ。
32. 前記検出分子のアレイが、多数の同一検出分子または多数の異なる検出分子を含む、請求項３１に記載のマイクロアレイ。
33. 前記状態が凍結乾燥およびグリセリン溶解を含む群から選択される、請求項２９または３０に記載のマイクロアレイ。
34. 請求項１〜２４のいずれかに記載の方法で使用する基板表面に細胞性成分を提供するための使用であり、これにより低い伸展性を有する前記細胞性成分を提供する、請求項２８〜３３のいずれかに記載のマイクロアレイの使用。
35. 請求項２８〜３３のいずれかに記載のマイクロアレイを含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。