JPWO2020166727A1 - ヒト３５型アデノウイルスを基盤とした腫瘍溶解性ウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は、ｈＴＥＲＴプロモーター又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、及びＥ１遺伝子が３５型アデノウイルスゲノムに組み込まれた、組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス等を提供する。

Description

本発明は、ヒト３５型アデノウイルスを基盤とした腫瘍溶解性ウイルス、及び当該ウイルスを含む医薬組成物に関する。

腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞特異的に感染増殖し、がん細胞を死滅させることから、新規抗癌剤として期待されている。これまで１０種以上の様々なウイルスからなる腫瘍溶解性ウイルスが開発されているが、腫瘍溶解性アデノウイルス（Ａｄ）は最も臨床開発が進んでいる腫瘍溶解性ウイルスの一つである。一方で、Ａｄはヒト由来のものだけでも６７種類の血清型が存在し、ヒト以外の様々な動物種由来のＡｄも同定されているが、腫瘍溶解性Ａｄとして開発が進んでいるのはほとんどがヒト５型Ａｄ由来のものである。増殖能を欠損させたＡｄベクター（主に感染症に対するワクチンベクターと使用されている）の場合には、ヒト５型Ａｄ以外のベクター化も進んでいるが、腫瘍溶解性ウイルスとしての利用はほぼヒト５型Ａｄに限られている。

遺伝子治療の進展につれて、各種遺伝子治療用ベクターの改良と共に、その特性・機能がより明確になってきた。そして最近では、疾病や投与法、投与部位（標的細胞）に応じて各ベクターの使い分けが進んできた。Ａｄは、現在では免疫反応を伴うことを逆に利用して、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）やエボラ出血熱、高病原性インフルエンザなどの新興・再興感染症に対するワクチンベクターとして、あるいは癌細胞特異的にウイルス増幅することで癌細胞を死滅させる腫瘍溶解性ウイルスとして盛んに非臨床・臨床試験が進んでいる。

腫瘍溶解性ウイルスについては、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を搭載したヘルペスウイルスＩＭＬＹＧＩＣＴＭ（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）が２０１５年にメラノーマに対する治療薬として米国ＦＤＡに承認されたが、Ａｄを基盤とした腫瘍溶解性ウイルスも、活発な開発が進められてきた。当初は、ｐ５３を欠損した細胞（多くの癌細胞）で特異的に複製し細胞を殺傷するように、Ｅ１Ｂによってコードされる５５ｋＤａのタンパク質を欠損させたウイルスＯＮＹＸ−０１５（ｄｌ１５２０）が注目されたが、米国において承認には至らなかった。ちなみに、中国では２００６年にＯＮＹＸ−０１５とほぼ同等のウイルス製剤であるＯｎｃｏｒｉｎｅ Ｈ１０１が医薬品として承認された。現在は、腫瘍特異的なプロモーターでＡｄの複製に必須のＥ１Ａ（とＥ１Ｂ）遺伝子を発現させることで、腫瘍特異的にウイルス複製を生じさせ、細胞を死滅させるアプローチが多く用いられている。腫瘍溶解性Ａｄによる抗腫瘍効果は、ウイルス複製に伴う直接的な殺細胞効果だけでなく、癌細胞死滅に伴うＤＡＭＰｓ（ｄａｍａｇｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ）による刺激や抗ウイルス免疫等の免疫系の惹起による寄与も大きいと考えられており、効率良く抗腫瘍免疫を活性化させるという観点から、免疫系を活性化する様々なサイトカインや免疫関連遺伝子などを腫瘍溶解性Ａｄに搭載させることも試みられている。

しかしながら、これまで開発された腫瘍溶解性Ａｄは、ヒト５型Ａｄを基本骨格としたものがほとんどである。感染域を変更し、より癌細胞への感染能を向上させるために、細胞への感染に重要な役割を果たすファイバー領域に外来ペプチドを挿入した腫瘍溶解性Ａｄや、他の血清型のＡｄ由来ファイバーに置換した腫瘍溶解性Ａｄも開発されているが、基本骨格はヒト５型Ａｄ由来である。基本構造をヒト５型Ａｄ以外のもので腫瘍溶解性Ａｄを作製した例は極めて限られており、例えばＰｓｉＯｘｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社は、ヒト３型と１１型Ａｄからなるキメラウイルス（Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ；ＣｏｌｏＡｄ１）の臨床試験を進めている。

一方で、特に感染症に対するＡｄワクチンベクター（増殖不能Ａｄベクター）の場合には、ヒト５型Ａｄ以外の他の種や血清型由来のＡｄベクターを用いた研究も活発に行われている。その中でも、サブグループＣ群に属するヒト５型Ａｄとは異なったサブグループＢ群に属するヒト３５型Ａｄは、ヒトにおける既存抗体保持率が極めて低く、感染受容体としてヒトにおいては赤血球を除く全ての細胞で発現し、特に癌細胞で高発現しているＣＤ４６を受容体とするといった特徴を有しており、感染症に対するワクチンベクターとしても有望と考えられた。しかしながら、ヒト３５型Ａｄベクターは、従来のヒト５型Ａｄベクターに比べ自然免疫誘導能が高いことが明らかになり（非特許文献１：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８８，１０３５４，２０１４）、このために抗原遺伝子の発現期間が短期化し、ワクチン効果が減弱することが明らかとなった。
先行技術文献
非特許文献１：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８８，１０３５４，２０１４

本発明においては、ヒト３５型Ａｄによる、癌治療を目的とした腫瘍溶解性ウイルスが望まれていた。

そこで本発明者らは、ヒト３５型Ａｄを基本骨格とした腫瘍溶解性ウイルス製剤の開発に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ｈＴＥＲＴプロモーター又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、及びＥ１遺伝子が３５型アデノウイルスゲノムに組み込まれた、組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
（２）ｈＴＥＲＴプロモーター又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、及びＥ１Ａ遺伝子が３５型アデノウイルスゲノムに組み込まれた、組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
（３）ｈＴＥＲＴプロモーター又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂプロモーター及びＥ１Ｂ遺伝子が３５型アデノウイルスゲノムに組み込まれた、組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
（４）Ｅ１Ａ遺伝子が変異型のものである（２）又は（３）に記載の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
（５）細胞死誘導関連タンパク質又は免疫賦活関連タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
（６）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルスを含む医薬組成物。ここで、当該医薬組成物としては、例えば癌治療用のものが挙げられ、癌としては、例えば乳癌が挙げられる。
（７）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス、又は（６）６に記載の医薬組成物を癌患者に投与することを特徴とする癌の治療方法。
（８）癌患者が乳癌患者である（７）に記載の治療方法。
発明の効果

ヒト３５型Ａｄによる高い自然免疫誘導能は、癌治療を目的とした腫瘍溶解性ウイルスの場合には逆に抗腫瘍免疫の増強につながり、極めて大きな長所になると期待される。

本発明者らは、ヒト３５型Ａｄを基本骨格とした腫瘍溶解性ウイルス製剤の開発に着手し、その開発に成功した（図１）。本発明では、これまでの研究で明らかとなった腫瘍溶解性ウイルスに適した各ウイルス遺伝子の改変を加え、癌治療のために最適な腫瘍溶解性Ａｄの基本ウイルスの作製を行った。なお、図１において、▲３▼ｓｈＤｉｃｅｒカセットの付与、及び▲４▼ｍｕｔａｎｔ Ｅ１ａの利用は、必要に応じて選択することができるものであり、必ずしも必須の構成ではない。本発明では、例えば抗腫瘍効果を増強するｓｈＤｉｃｅｒカセットを挿入することもできる（図２）。但し、挿入する遺伝子はｓｈＤｉｃｅｒカセットに限定されるものではなく、細胞死誘導関連タンパク質や免疫賦活関連タンパク質をコードする遺伝子を挿入することもできる。ｓｈＤｉｃｅｒカセット、細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子、及び免疫賦活関連タンパク質をコードする遺伝子は、それぞれ単独で挿入してもよく、適宜組み合わせて挿入してもよい。
ここで細胞死誘導関連タンパク質をコードする遺伝子としては、例えばｐ５３をコードする遺伝子、ｐ３８をコードする遺伝子、ＳＡＰＫをコードする遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、免疫賦活関連タンパク質をコードする遺伝子としては、例えばＰＤ−１をコードする遺伝子、ＬＡＧ−３をコードする遺伝子などが挙げられる。

さらに、本発明の一態様において、免疫チェックポイント阻害剤や放射線治療を併用することができる。これまでに、Ａｄ由来のＥ１Ｂ ５５ｋＤａタンパク質が、放射線によるがん細胞の二重鎖ＤＮＡ障害により誘導されるＭｒｅ１１／Ｒａｄ５０／ＮＢＳ１（ＭＲＮ）タンパク質複合体を分解することでＤＮＡ修復を阻害し、放射線感受性を飛躍的に増強することが証明されている（図３）。また、本発明者らは世界に先駆けて３５型Ａｄベクターを開発した実績を持ち（特許第４２３７４４９号；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０，１０４１，２００３）、国内外随一のＡｄ改変に関する技術と知識を有している。

本発明では、ヒト３５型Ａｄを基本骨格とした腫瘍溶解性ウイルスを作製し、さらにウイルス複製や抗腫瘍効果に影響を与えるウイルス遺伝子（プロモーター、変異Ｅ１ａ遺伝子の利用等）を改変し、外来遺伝子を挿入することで、最適化する。種々の改変ヒト３５型Ａｄについて、ウイルス複製能や抗腫瘍効果、自然免疫および抗腫瘍免疫活性化能についてｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏの両条件化で検討し、ヒト５型Ａｄに代わる新しい腫瘍溶解性Ａｄの有用性を明らかにする。

本発明の腫瘍溶解性３５型アデノウイルス（Ａｄ）の一例の概要図である。 Ｄｉｃｅｒ発現のノックダウンによるＡｄ複製能向上のメカニズムを示す図である。 腫瘍溶解性Ａｄと放射線との相乗効果のメカニズムを示す図である。Ａ：腫瘍溶解性Ａｄが感染していない通常のがん細胞に放射線を照射した場合、ＤＮＡ損傷の修復機構が働く。Ｂ：腫瘍溶解性Ａｄが感染している通常のがん細胞に放射線を照射した場合は、Ａｄ由来のＥ１Ｂ ５５ｋＤａタンパク質が、放射線によるがん細胞の二重鎖ＤＮＡ障害により誘導されるＭｒｅ１１／Ｒａｄ５０／ＮＢＳ１（ＭＲＮ）タンパク質複合体を分解することでＤＮＡ修復を阻害し、放射線感受性を飛躍的に増強する。 腫瘍溶解性３５型Ａｄ（ＯＡｄ３５）構築のためのストラテジーを示す図である。 ヒト癌細胞におけるＣＡＲ及びＣＤ４６発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。細胞は抗ＣＡＲ（ＲｍｃＢ）抗体または抗ＣＤ４６（Ｍ１７７）抗体とともにインキュベートした。細胞を洗浄後、細胞をＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇ二次抗体とともにインキュベートした後、ＦＣＭ分析を行った。灰色のヒストグラムはアイソタイプコントロール抗体を、赤いヒストグラムは抗ＣＡＲ（ＲｍｃＢ）抗体または抗ＣＤ４６（Ｍ１７７）抗体を示す。 ＯＡｄ５及びＯＡｄ３５の癌細胞溶解活性を示す図である。ＯＡｄ５及びＯＡｄ３５を図中に示すＶＰ（ｖｅｃｔｏｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ）／細胞でヒト癌細胞株に感染させた。５日間のインキュベーション後、クリスタルバイオレット試薬で細胞を染色した。 腫瘍溶解性５型Ａｄ（ＯＡｄ５）及び腫瘍溶解性３５型Ａｄ（ＯＡｄ３５）を３００ＶＰ／細胞でヒト癌細胞株に感染させた結果を示す図である。図中に示す各時点においてＷＳＴ−８アッセイにより細胞生存率を決定した。データは模擬感染グループのデータにより正規化した。 ＯＡｄ５及びＯＡｄ３５を図中に示すＶＰ／細胞で正常なヒト細胞に感染させた結果を示す図である。５日間インキュベーションした後、クリスタルバイオレット試薬で細胞を染色した。 ＯＡｄ５及びＯＡｄ３５の癌細胞溶解活性を示す図である。 ＯＡｄ５及びＯＡｄ３５の癌細胞溶解活性を示す図である。 癌細胞表面へのＯＡｄの接着の結果を示す図である。ＯＡｄ５及びＯＡｄ３５を１００ＶＰ／細胞でヒト癌細胞株に感染させ、４℃でインキュベートした。１．５時間インキュベーションした後、リアルタイムＰＣＲ分析により、ＯＡｄのウイルスゲノムのコピー数を決定した。 腫瘍溶解性Ａｄ（ＯＡｄ）感染後の癌細胞中のＡｄゲノムコピー数を示す図である。ＯＡｄ５及びＯＡｄ３５を１００ＶＰ／細胞でヒト癌細胞株に感染させた。図中に示す各時点で、リアルタイムＰＣＲ分析によりＯＡｄのウイルスゲノムのコピー数を決定した。 抗Ａｄ５血清存在下におけるＯＡｄの癌細胞溶解活性を示す図である。ＯＡｄをマウス抗Ａｄ５血清存在下でＨｅｐＧ２細胞（Ａ）及びＴ２４細胞（Ｂ）に感染させた。５日間インキュベーションした後、ＷＳＴ−８アッセイにより細胞生存率を決定した。データは模擬感染グループのデータによって正規化した。 ＯＡｄ３５の腫瘍内投与後の腫瘍体積の測定結果を示す図である。ＯＡｄを２．４ｘ１０^９ＶＰ／マウスの用量で腫瘍内に注射した。矢印はウイルス注入後の日数（０日目と３日目）を示す。腫瘍体積は、平均腫瘍体積±Ｓ．Ｅ。として表される。^＊ｐ＜０．０５（ｖｓ．ＰＢＳ）。（ｎ＝５）

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願第６２／８０４，３３４号明細書（２０１９年２月１２日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

本発明では、従来の腫瘍溶解性ヒト５型Ａｄに代わる新しい腫瘍溶解性ウイルスとして、腫瘍溶解性ヒト３５型Ａｄを開発し、およびその有用性評価を行った。腫瘍溶解性ヒト３５型Ａｄは、従来の腫瘍溶解性ヒト５型Ａｄと比べ、ヒトにおける抗体保持率が極めて低いことから既存抗体による影響の排除、感染受容体として広範なヒト細胞で発現し特にがん細胞で発現亢進しているＣＤ４６を利用することによる感染増強等が示された。また、ヒト３５型Ａｄによる高い自然免疫誘導能は、癌治療を目的とした腫瘍溶解性ウイルスの場合には逆に抗腫瘍免疫の増強につながり、極めて大きな長所になると期待される（表１）。

本発明においては、まずヒト３５型Ａｄの全ゲノムを有したプラスミドを作製し、プラスミドの簡便な組換えで種々の改変腫瘍溶解性ヒト３５型Ａｄゲノムが作製できるシステムを開発した。このプラスミドは、ウイルスゲノム両末端に存在するユニークな制限酵素部位で切断することで線状化し、任意の細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）にトランスフェクションすると目的のウイルスを作製できる。

さらに、本発明者らは、これまでにＤｉｃｅｒをノックダウンすることでＡｄ複製が亢進されることを明らかにしている（ＷＯ２０１５／２５９４０号；Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，１６，２５１，２０１７等）。そこで、本発明においてはｓｈＤｉｃｅｒカセットを付与することができ、これにより殺細胞効果の増強を図ることが可能となる（図２）。また本発明においては、ウイルス増殖に必須のＥ１ａ遺伝子の自然免疫の活性化を回避する配列に変異を付与することもでき、これにより、腫瘍特異的プロモーターの最適化（ＳｕｒｖｉｖｉｎやｈＴＥＲＴプロモーターの利用）、ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の保持等の機能を付与し、より優れた腫瘍溶解性ヒト３５型Ａｄを得ることができる。

また、本発明においては、各種腫瘍溶解性ヒト３５型Ａｄのウイルス複製能や細胞障害活性等のウイルス特性を解析する。また、本発明のウイルスは、自然免疫活性化効果及び抗腫瘍免疫誘導効果や、免疫チェックポイント阻害剤との併用による腫瘍の増殖抑制効果などが期待される。
一方、Ａｄ由来のＥ１Ｂ ５５ｋＤａタンパク質は、放射線によるがん細胞の二重鎖ＤＮＡ障害により誘導されるＭｒｅ１１／Ｒａｄ５０／ＮＢＳ１（ＭＲＮ）タンパク質複合体を分解することでＤＮＡ修復を阻害し、放射線感受性を飛躍的に増強することが証明されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７０，９３３９，２０１０）。そこで本発明においては、腫瘍溶解性Ａｄと放射線療法とを組み合わせることができ、これにより、相乗的な抗腫瘍効果が期待できる（図３）。

腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞特異的に感染増殖し、癌細胞を死滅させることから、新規抗癌剤として期待されている。これまで１０種以上のウイルスを基盤とした腫瘍溶解性ウイルスが開発されているが、腫瘍溶解性アデノウイルス（Ａｄ）は、最も臨床開発が進んでいる腫瘍溶解性ウイルスの一つである。これまで開発されてきた腫瘍溶解性Ａｄは、サブグループＣ群に属する５型Ａｄ（Ａｄ５）を基盤としたものがほとんどであるが、近年、（ｉ）Ａｄ５は、Ａｄ５感染受容体であるＣｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）陰性細胞に対して感染が困難なことや、（ｉｉ）多くの成人が、Ａｄ５に対する中和抗体を保持していることなどの問題が明らかとなってきた。一方で、サブグループＢ群に属する３５型Ａｄ（Ａｄ３５）は、赤血球を除く全てのヒト細胞に発現するＣＤ４６を感染受容体としていることや、成人における抗体保持率が低いことが特徴として挙げられる。このことから、Ａｄ３５を基盤とした腫瘍溶解性Ａｄは、ＣＡＲ陰性細胞を含む幅広い癌細胞に感染可能であるとともに、抗Ａｄ５抗体の影響を回避できることが期待される。

本発明の一態様では、Ａｄの自己増殖に必須であるＥ１遺伝子（Ｅ１Ａ遺伝子とＥ１Ｂ遺伝子に分かれる）を腫瘍特異的プロモーター下流に搭載することで、癌細胞特異的に増殖するように腫瘍溶解性Ａｄを設計する。腫瘍特異的プロモーターとしては多くのヒト癌細胞において活性が高いｈｕｍａｎ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）プロモーターなどが用いられる。またプロモーターとしては、Ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーターを用いることもできる
プロモーター下流にＥ１Ａ遺伝子を挿入するとともに、ウイルス本来のプロモーターよりＥ１Ｂ遺伝子を発現するように設計したＥ１遺伝子発現カセットを、５型ならびに３５型ＡｄゲノムのＥ１欠損領域に挿入した。腫瘍溶解性Ａｄ５（ＯＡｄ５）においてはＯＡｄ５のＥ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子を、腫瘍溶解性Ａｄ３５（ＯＡｄ３５）においてはＯＡｄ３５のＥ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子をそれぞれ使用している。Ｅ１遺伝子発現カセットを挿入したＡｄゲノムをコードしたプラスミドを制限酵素処理して線状化した後、パッケージング細胞に遺伝子導入することで各ＯＡｄを回収した。パッケージング細胞としては、ＯＡｄ５に関してはＨ１２９９細胞、ＯＡｄ３５に関してはＨＥＫ２９３細胞を用いた。これらのＯＡｄを種々の培養細胞に作用させ、殺細胞効果やＡｄゲノム量の測定を行った。

作製した各ＯＡｄの癌細胞に対する殺細胞効果を検討するため、ＣＡＲ陽性ヒト癌細胞（ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞）、およびＣＡＲ陰性ヒト癌細胞（Ｔ２４細胞、ＭＣＦ−７細胞）に、作製した腫瘍溶解性Ａｄ５（ＯＡｄ５）ならびに腫瘍溶解性Ａｄ３５（ＯＡｄ３５）を作用させ、ウイルス作用５日後の細胞生存率を評価した。その結果、両ＯＡｄともにＣＡＲ陽性細胞に対しては高い殺細胞効果を示した。一方、ＣＡＲ陰性細胞に対しては、ＯＡｄ５が全てのウイルス用量で有意な殺細胞効果を示さなかったのに対し、ＯＡｄ３５は、Ｔ２４細胞では３００ＶＰ／ｃｅｌｌ以上で、ＭＣＦ−７細胞では１０ＶＰ／ｃｅｌｌ以上でほぼ全ての細胞を死滅させた。

また、各ＯＡｄとも、各種ヒト正常細胞に対しては顕著な殺細胞効果を示さなかった。次に、各ＯＡｄを上記の癌細胞株に作用させ、ウイルス粒子の細胞表面への結合量を検討したところ、各ＯＡｄともにＣＡＲ陽性細胞に対しては効率よく結合する一方で、ＣＡＲ陰性細胞に対してはＯＡｄ３５のみが高い結合能を示した。さらに、抗Ａｄ５血清と各ＯＡｄを３０分間インキュベートした後、各種癌細胞に作用させたところ、ＯＡｄ５は、抗Ａｄ５抗体により殺細胞効果が著しく減弱したのに対し、ＯＡｄ３５では抗Ａｄ５血清による阻害は受けず、高い殺細胞効果を示した。

本発明において開発したＯＡｄ３５は、従来型のＯＡｄ５と比べ、ヒト癌細胞に対しＣＡＲの発現に関わらず高い殺細胞効果を示した。また、抗Ａｄ５抗体存在下においても高い殺細胞効果を示した。以上のことから、ＯＡｄ３５は、ＯＡｄ５が持つ問題点を克服可能であることが示された。

＜治療方法及び医薬組成物＞
本発明は、前記組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルスを含む医薬組成物を提供する。また本発明は、前記組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス、又は前記医薬組成物を癌患者に投与することを特徴とする癌の治療方法を提供する。
治療の対象となる腫瘍（癌）の種類は、限定されるものではなく、例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝癌、前立腺癌、膵癌、食道癌、膀胱癌、胆嚢癌、胆管癌、乳癌、子宮癌、甲状腺癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、肉腫、間葉系腫瘍等が挙げられ、乳癌が好ましい。

本発明の医薬組成物は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、腫瘍内、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体（対象となる細胞や臓器）に導入することもできる。

また、本発明の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルスは、そのまま用いてもよく、あるいは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合することができる。

本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、腫瘍内、筋肉、腹腔等への局部注射、静脈への注射等が例示される。

組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルスの投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日投与量としては、１０^６〜１０^１１ＰＦＵ程度、好ましくは１０^９〜１０^１１ＰＦＵ程度とするのがよく、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
なお、本発明の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルスは、公知の抗癌剤や放射線などとの併用を妨げるものではない。

以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．実験材料
細胞
ＨＥＫ２９３細胞はＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＥＡＧＬＥ’Ｓ ＭＥＤＩＵＭ（ＤＭＥＭ）（１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ含有）、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｔ２４細胞、ＮＨＬＦ細胞、ＭＲＣ−５細胞はＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍＬペニシリン含有）、Ｈ１２９９及びＭＣＦ−７細胞はＲＰＭＩ１６４０ ＭＥＤＩＵＭ（１０％ ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍＬペニシリン含有）を用いて、３７℃、飽和蒸気圧、５％ＣＯ_２存在下で培養した。なお、本実施例において使用したＦＢＳは、すべて５６℃、３０分間の非働化処理を行った後に使用した。

プラスミド
Ａｄ５を基盤とした腫瘍溶解性Ａｄ、ＯＡｄ５作製用プラスミドであるｐＡｄＨＭ３−ｈｍＥ１は以下のように作製した。

まず初めに、ＢＧＨ ｐｏｌｙ（Ａ）配列フラグメントとｈＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（配列番号１１）を含む領域を、ｐＨＭＴＥＲＴ−Ｌ（ｈＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたプラスミド）を鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅することで、ＢＧＨ ｐｏｌｙ（Ａ）配列フラグメントとｈＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒフラグメントを得た。次に、ｐＨＭ１５（シャトルプラスミド；Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｓｅｐ１；１４（１３）：１２６５−７７．）をＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩ処理したフラグメントと上記のＢＧＨ ｐｏｌｙ（Ａ）配列フラグメントをライゲーションし、ｐＨＭ１５−ＢＧＨを得た。次に、ｐＨＭ１５−ＢＧＨをＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ処理したフラグメントと、ＰＣＲにより増幅し得たｈＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒフラグメントをライゲーションし、ｈＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流にＢＧＨ ｐｏｌｙ（Ａ）配列を搭載したｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴを得た。

次に、ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ処理したフラグメントと、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ認識配列をコードした合成オリゴＤＮＡをライゲーションし、ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−ＥＥＢを得た。次に、Ａｄゲノムの全長を持つｐＴＧ３６０２を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法によりＥ１遺伝子を増幅してＥ１遺伝子フラグメントを得た。次に、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１０（マルチクローニングサイトを有するクローニング用のプラスミド；参照ＵＲＬ：
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｅ７６５８？ｌａｎｇ＝ｊａ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＪＰ）をＥｃｏＲＶ処理したフラグメントと、Ｅ１遺伝子フラグメントをライゲーションし、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−Ｅ１を得た。次に、ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−ＥＥＢとｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−Ｅ１をそれぞれＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ処理したフラグメントをライゲーションし、ｈＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流にＥ１遺伝子を搭載したプラスミド、ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−Ｅ１を得た。

ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−Ｅ１上のＸｂａＩサイトを欠失させるため、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔとプライマーを用いて、ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−Ｅ１−ΔＸｂａＩを得た。また、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−Ｅ１をＳａｃＩ処理したフラグメントをセルフライゲーションし、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−Ｅ１Δｓｓを得た。そして、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−Ｅ１ΔｓｓをＸｂａＩ処理した後、Ｋｌｅｎｏｗ処理で平滑化、セルフライゲーションすることで、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−Ｅ１ΔｓｓΔＸｂａＩを得た。次に、ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−Ｅ１−ΔＸｂａＩとｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−Ｅ１ΔｓｓΔＸｂａＩをそれぞれＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ処理したフラグメントをライゲーションし、ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−Ｅ１−２ΔＸｂａＩを得た。次に、ＡｄのＥ１遺伝子のＬＴＣＨＥモチーフをＶＴＳＨＤモチーフに置換した配列を人工合成して購入したプラスミドであるｐＥ１−ＢＳ（ＦＡＳＭＡＣ）とｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−Ｅ１−２ΔＸｂａＩをそれぞれＳａｃＩ／ＢｓｐＥＩ処理したフラグメントをライゲーションし、ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−ｍＥ１−２ΔＸｂａＩを得た。

そして、ｐＨＭ１５−ｈＴＥＲＴ−ｍＥ１−２ΔＸｂａＩをＳｐｅＩ処理したフラグメントと、ｐＨＭ３（シャトルプラスミド；Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８Ｎｏｖ ２０；９（１７）：２５７７−８３）をＸｂａＩ処理したフラグメントをライゲーションし、ｐＨＭ３−ｈｍＥ１を得た。次に、ｐＨＭ３−ｈｍＥ１とｐＨＭ５をそれぞれＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩ処理したフラグメントをライゲーションし、ｈＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ制御下でＡｄ５のＥ１遺伝子を発現するカセットを搭載したプラスミドであるｐＨＭ５−ｈｍＥ１を得た。最後に、Ｅ１遺伝子を欠損したＡｄ５のゲノムを搭載したプラスミドであるｐＡｄＨＭ３とｐＨＭ５−ｈｍＥ１をそれぞれＩ−ＣｅｕＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩ処理したフラグメントをライゲーションすることで、ｐＡｄＨＭ３−ｈｍＥ１を得た。

Ａｄ３５を基盤とした腫瘍溶解性ＡｄであるＯＡｄ３５作製用プラスミドであるｐＡｄＭＳ２−ｈＴＥＲＴ−ｍＥ１は以下のように作製した。まず、Ａｄ３５の５’ＩＴＲ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流にＥ１遺伝子中の途中（Ａｄ３５ ２８０４ ＭｆｅＩ）までを搭載したプラスミドであるｐＡｄ３５−ｍＥ１−１と、Ａｄ３５のＥ１遺伝子途中からｐＩＸ遺伝子の途中まで（Ａｄ３５ ２８０４〜４６０３ｂｐ）の配列を搭載したプラスミドであるｐＡｄ３５−ｍＥ１−２を人工合成した（Ｇｅｎｅｗｉｚ社に外注）。

これらのプラスミドをＭｆｅＩ／ＳｐｅＩ処理したフラグメトをライゲーションし、ｐＡｄ３５−ｓｕｒｖ−ｍＥ１を得た。次に、Ｅ１遺伝子を欠損したＡｄ３５のゲノムを搭載したプラスミドであるｐＡｄＭＳ２をＳｗａＩ処理したフラグメントとｐＡｄ３５−ｓｕｒｖ−ｍＥ１をＳａｌＩ処理したフラグメントをＥ．ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３（ｒｅｃＢＣ ａｎｄ ｓｂｃＢＣ）に同時に形質転換し、相同組換えを誘発することにより、ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ制御下においてＡｄ３５のＥ１遺伝子を発現するカセットをＥ１欠損領域に搭載したｐＡｄＭＳ２−ｓｕｒｖ−ｍＥ１を得た。

最後に、ｐＨＭＴＥＲＴ−Ｌを鋳型ＤＮＡとして、以下のプライマーをそれぞれ用いてＰＣＲ法により遺伝子を増幅して得たｈＴＥＲＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒフラグメント２とｐＡｄＭＳ２−ｓｕｒｖ−ｍＥ１をＰｍｅＩ処理したフラグメントをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことで、ｐＡｄＭＳ２−ｈＴＥＲＴ−ｍＥ１を作製した。

腫瘍溶解性Ａｄ（ＯＡｄ）
ｐＡｄＨＭ３−ｈｍＥ１およびｐＡｄＭＳ２−ｈＴＥＲＴ−ｍＥ１を、それぞれＰａｃＩおよびＳｂｆＩ処理し線状にしたプラスミドＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションすることで、それぞれＯＡｄ−ｔＡＮＢ（ＯＡｄ５）とＯＡｄ３５−ｔＡＮＢ（ＯＡｄ３５）を得た。その後、ＯＡｄ−ｔＡＮＢはＨ１２９９細胞に、ＯＡｄ３５はＨＥＫ２９３細胞に３−４次感染させることで大量調製した。得られた各Ａｄを塩化セシウムの密度勾配遠心にて精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌからなる溶液で透析した。ＯＡｄ３５−ｓＡＮＢは、ｐＡｄＭＳ２−ｓｕｒｖ−ｍＥ１をＳｂｆＩで処理したのち、ＨＥＫ２９３細胞にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎすることで得た。ｐＡｄＭＳ２−ｈＴＥＲＴ−ｍＥ１およびｐＡｄＭＳ２−ｓｕｒｖ−ｍＥ１のＥ１Ｂ発現カセットの下流にｓｈＤｉｃｅｒ発現カセットを挿入し、ｐＡｄＭＳ２−ｈＴＥＲＴ−ｍＥ１−ｓｈＤｉｃｅｒ，ｐＡｄＭＳ２−ｓｕｒｖ−ｍＥ１−ｓｈＤｉｃｅｒを得た。これらのプラスミドをＳｂｆＩで処理した後、ＨＥＫ２９３細胞にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎすることで、ＯＡｄ３５−ｔＡＮＢ−ｓｈＤｉｃｅｒ及びＯＡｄ３５−ｓＡＮＢ−ｓｈＤｉｃｅｒを得た。
各Ａｄの物理学的タイター（Ｖｉｒｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅ：ＶＰ）はＭａｉｚｅｌらの方法により測定した。

２．評価方法
フローサイトメトリー分析
各細胞５×１０^５ｃｅｌｌｓを３％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μＬに懸濁し、Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＡＲ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＲｍｃＢ）、Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＣＤ４６ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍ１７７）もしくはＰｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１，κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌを１μＬ加え、１時間氷上、遮光で反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ４ｍＬで洗浄後、１５００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を吸引除去した。

細胞を再び２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μＬに懸濁し、ＰＥ標識Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｇを１μＬ加え、３０分間氷上、遮光で反応させた。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ４ｍＬで洗浄後、１５００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を吸引除去し、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ５００μＬに懸濁し、フローサイトメーター（ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて発現を解析した。データは、ＦＣＳマルチカラーデータ解析ソフトウェア（Ｆｌｏｊｏ）により解析した。

Ａｄゲノムコピー数の決定
各細胞を回収後、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＴｏｔａｌ ＤＮＡを抽出し、Ａｄゲノムコピー数をＴＨＵＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）および以下のプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った。測定にはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。

クリスタルバイオレットアッセイ
各細胞に腫瘍溶解性Ａｄを１００〜１０００ＶＰ／ｃｅｌｌで作用させ、５日後にクリスタルバイオレットにより生細胞を染色した。

細胞生存率アッセイ
各細胞に腫瘍溶解性Ａｄを３００ＶＰ／ｃｅｌｌで作用させ、細胞生存率をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を用いて測定した。

Ａｄ５ベクターによる免疫
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥ１欠損Ａｄ５ベクターを１×１０^１０ＶＰ／ｍｏｕｓｅで尾静脈内投与することにより、抗Ａｄ５免疫を誘導した。Ａｄ５ベクター投与１９日後に眼窩採血により血液を回収し、３７℃で１時間静置して完全に血液凝固をさせた後、４℃で一晩静置した。翌日遠心操作（３，０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清を抗Ａｄ５血清として回収した。

抗Ａｄ５血清存在下での各ＯＡｄの癌細胞溶解活性
Ｅ１欠損Ａｄ５ベクターで免疫を行ったマウスより採取した抗血清と各腫瘍溶解性Ａｄを、ＦＢＳを含まない培地で希釈し混合した。なお、マウス抗血清は最終希釈倍率が１／４００から１／１６００になるように２倍希釈ごとに段階希釈し、腫瘍溶解性Ａｄは３００ＶＰ／ｃｅｌｌとなるように調製した（ｔｏｔａｌ ５０ｍＬ）。調製した溶液を３０分間インキュベートした後、細胞に作用させた。１．５時間後、２０％ＦＢＳを含む培地を等量加えて、５日後に細胞生存率をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を用いて測定した。

Ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｐｈｔ ｍｏｄｅｌへの腫瘍内投与
Ｈ１２９９細胞（マウスあたり３ｘ１０^６細胞）を、５０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を含む５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（日本ＳＬＣ、浜松、日本）の右脇腹に皮下注射した。腫瘍が直径約５〜６ｍｍに成長した後、マウスをランダムに３つのグループに割り当てた。ＰＢＳ、ＯＡｄ５、およびＯＡｄ３５を各群に２．４×１０^９ＶＰ／マウスの用量で腫瘍内注射し、３日後に再注射した。腫瘍の大きさを３日ごとに測定した。腫瘍体積は次の式で計算した。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝１／２×ａ×ｂ^２ （ａは最長寸法（長径）、ｂは最短寸法（短径）を示す）。

３．結果
腫瘍溶解性Ａｄ３５（ＯＡｄ３５）の作製方法
本実施例では、Ａｄの自己増殖に必須であるＥ１遺伝子（Ｅ１Ａ遺伝子とＥ１Ｂ遺伝子に分かれる）を腫瘍特異的プロモーター下流に搭載することで、癌細胞特異的に増殖するように腫瘍溶解性Ａｄを設計した。腫瘍特異的プロモーターとしては多くのヒト癌細胞において活性が高いｈｕｍａｎ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター（配列番号１１）、又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーターを用いた。まず、腫瘍溶解性３５型Ａｄ（ＯＡｄ３５）の作製においては、Ａｄ３５の遺伝子配列情報（配列番号５）を参考に、Ｅ１Ａ遺伝子（５６９〜１４４１ｂｐ（配列番号６））を、癌細胞特異的プロモーターであるｈＴＥＲＴプロモーター又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター下流に挿入するとともに、ウイルス本来のプロモーターよりＡｄ３５のＥ１Ｂ遺伝子を発現するようにＥ１遺伝子発現カセットを作製した（図４）。ここで、Ｅ１Ａ遺伝子としては、上記の野生型のＥ１Ａ遺伝子（配列番号６）に代えて、変異型のＥ１Ａ遺伝子（配列番号７）も用いた。当該変異は、ウイルス増殖に必須のＥ１Ａ遺伝子の自然免疫の活性化を回避する塩基配列に変異を付与したものであり、具体的には、配列番号６の塩基配列中の第３４３番目のＴ（チミン）がＧ（グリシン）に、第３５０番目のＧがＣ（シトシン）に、第３５７番目のＡ（アデニン）がＴに、それぞれ置換されたもの（要するに、配列番号６の塩基配列中の第３４３〜３５７番目の塩基「ＴＴＧＣＡＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡ」が「ＧＴＧＣＡＣＴＣＣＴＡＴＧＡＴ」に置換されたもの）である。当該変異は、周知の遺伝子組換え技術を用いて適宜行うことができる。

Ａｄ３５のＥ１Ｂ遺伝子のプロモーター領域およびＥ１Ｂ遺伝子領域としては、Ａｄ３５の遺伝子配列情報（配列番号５）を参考に、１４４２〜３４００ｂｐ（配列番号８）をＥ１Ａ発現カセットの下流に挿入した。ここで、Ｅ１Ｂ遺伝子のプロモーター領域は、１４４２〜１６１０ｂｐ（配列番号９）と推定され、また、Ｅ１Ｂ遺伝子領域は、１６１１〜３４００ｂｐ（配列番号１０）である。
このように、Ｅ１遺伝子発現カセットとしては、「野生型Ｅ１Ａ遺伝子＋Ｅ１Ｂ遺伝子プロモーター領域＋Ｅ１Ｂ遺伝子」（配列番号１２）、及び「変異型Ｅ１Ａ遺伝子＋Ｅ１Ｂ遺伝子プロモーター領域＋Ｅ１Ｂ遺伝子」（配列番号１３）を用いた。
さらに、そのＥ１遺伝子発現カセットの両側にＡｄ３５のＥ１欠損領域の上流側約４５０ｂｐ（１〜４５５ｂｐ）と下流側約１２００ｂｐ（３４０１〜４６３４ｂｐ）をホモロジーアームとして付加したドナープラスミドを作製した。

ドナープラスミドとＡｄ３５のゲノムをコードしたプラスミドを制限酵素素処理により線状化し、Ｅ．ｃｏｌｉＢＪ５１８３（ｒｅｃＢＣ ａｎｄ ｓｂｃＢＣ）に同時に形質転換し、相同組換えを誘発することにより、Ａｄ３５ゲノムのＥ１欠損領域にＥ１遺伝子発現カセットを挿入した（図４）。腫瘍溶解性５型Ａｄ（ＯＡｄ５）についても、同様に、ｈＴＥＲＴプロモーター下流にＡｄ５のＥ１Ａ遺伝子を挿入するとともに、ウイルス本来のプロモーターよりＡｄ５のＥ１Ｂ遺伝子を発現するように設計したＥ１遺伝子発現カセットを、５型ＡｄゲノムのＥ１欠損領域に挿入した。

Ｅ１遺伝子発現カセットを挿入したＡｄゲノムをコードしたプラスミドを制限酵素処理して線状化した後、パッケージング細胞であるＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入することでＯＡｄ５およびＯＡｄ３５を回収した。その後、ＯＡｄ５に関してはＨ１２９９細胞に、ＯＡｄ３５に関してはＨＥＫ２９３細胞に４次感染させて大量調製した。ＨＥＫ２９３細胞は、そのゲノム内にＡｄ５のＥ１遺伝子を有しているため、ＨＥＫ２９３細胞でＯＡｄ５を増幅させると、ＯＡｄ５ゲノム中のＥ１遺伝子発現カセットと、細胞中のＥ１遺伝子領域が相同組換えを起こし、野生型のＡｄ５が混入してしまう恐れがあるため、ＯＡｄ５の増幅には、Ｅ１遺伝子を有してしないＨ１２９９細胞を用いた。

各ＯＡｄを大量調製した後、塩化セシウムの密度勾配遠心にて精製した。また各ＯＡｄの物理学的タイターであるＶｉｒｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＶＰ）／ｃｅｌｌを測定した結果、ＯＡｄ３５については、ＯＡｄ５と比較すると約１０倍低いタイターを得た。また、ＯＡｄ３５の物理的力価はＯＡｄ５の物理的力価よりも約１０倍低かった。ＯＡｄ３５の物理的力価と生物学的力価の比は１：８．５で、これはＯＡｄ５の力価と同等であった（表３）。

ヒト癌細胞株におけるＡｄ感染受容体の発現
今回作製したＯＡｄの基盤となるＡｄ５、Ａｄ３５は、それぞれＣＡＲ、ＣＤ４６を感染受容体としている。そこで、５種類のヒト癌細胞株（ＨｅｐＧ２細胞；ヒト肝癌由来、Ａ５４９細胞；ヒト肺癌由来、Ｈ１２９９細胞；ヒト肺癌由来、Ｔ２４細胞；ヒト膀胱癌由来、ＭＣＦ−７細胞；ヒト乳癌由来）における各受容体の発現量をフローサイトメトリーにより測定した（図５）。

その結果、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞では、ＣＡＲ、ＣＤ４６ともに高発現していた。一方、ＭＣＦ−７細胞ではＣＤ４６は高発現していたが、ＣＡＲはわずかしか発現していなかった。また、Ｔ２４細胞ではＣＡＲは全く発現していなかったが、ＣＤ４６は高発現していた。これらの結果から、以降はＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞はＣＡＲ陽性細胞、Ｔ２４細胞、ＭＣＦ−７細胞についてはＣＡＲ陰性細胞として用いることとした。

ヒト培養細胞における各ＯＡｄの殺細胞効果
次に、今回作製した各ＯＡｄのヒト癌細胞株における殺細胞効果を検討するため、各種ヒト癌細胞株に各ＯＡｄを作用させ、ウイルス作用５日後にクリスタルバイオレット染色を行い、細胞生存率を測定した（図６Ａ）。クリスタルバイオレット染色では生細胞のみが青紫色に染色される。

その結果、ＣＡＲ陽性細胞であるＨｅｐＧ２細胞では両ＯＡｄ作用群ともに高い殺細胞効果を示し、全てのウイルス用量でほぼ全ての細胞が死滅していた。また、Ａ５４９細胞では十分にＣＡＲが発現しているのに関わらず、ＯＡｄ５作用群では十分な殺細胞効果は見られず、ＯＡｄ３５作用群で高い殺細胞効果を示した。Ｈ１２９９細胞は、ＨｅｐＧ２細胞及びＡ５４９細胞と同様にＣＡＲ及びＣＤ４６が発現しているにも関わらず、ＯＡｄ５作用群の方がＯＡｄ３５作用群に比べて殺細胞効果が高かった。

一方、ＣＡＲ陰性細胞であるＴ２４細胞では、ＯＡｄ５作用群の全てのウイルス用量で殺細胞効果を示さなかったのに対し、ＯＡｄ３５作用群では３００ＶＰ／ｃｅｌｌにおいてほぼ全ての細胞が死滅していた。また、ＭＣＦ−７細胞では、ＯＡｄ５作用群で３００ＶＰ／ｃｅｌｌ、ＯＡｄ３５作用群で１０ＶＰ／ｃｅｌｌで、ほぼ全ての細胞が死滅していた。これは、ＭＣＦ−７細胞でわずかにＣＡＲの発現が見られたことにより、ＯＡｄ５が感染できたためと考えられる。なお、全ての細胞株のなかで乳癌細胞であるＭＣＦ−７に対するＡｄ３５の殺傷効果が最も高かった。この現象は、ＣＡＲやＣＤ４５などの受容体の発現だけでは説明することができず、まだ知られていない生活環の違いなど（感染経路、脱殻、核内移行、転写翻訳、ウイルス粒子形成等）が原因として考えられる。したがって本発明のウイルスは特に乳癌の治療に有用であると考えられる。

さらに、各ＯＡｄによる殺細胞効果を定量的に測定するため、ＷＳＴ−８試薬を用いて、細胞生存率を経時的に測定した（図６Ｂ）。その結果、クリスタルバイオレット染色の結果と相関した結果が得られた。具体的には、ＨｅｐＧ２細胞では両ＯＡｄ作用群とも高い殺細胞効果を示したが、Ａ５４９細胞、Ｔ２４細胞、Ｈ１２９９細胞、ＭＣＦ−７細胞ではＯＡｄ５作用群と比べＯＡｄ３５作用群で有意に高い殺細胞効果を示した。

次に、ヒト正常細胞に対する各ＯＡｄの安全性を検討するため、各種ヒト正常細胞（ＭＲＣ−５細胞；ヒト胎児由来肺線維芽細胞、ＮＨＬＦ；成人由来肺繊維芽細胞、ＨＵＶＥＣ；ヒト臍帯静脈内皮細胞）に各ＯＡｄを作用させ、上記と同様にクリスタルバイオレット染色を行い、細胞生存率を測定した（図６Ｃ）。その結果、各ＯＡｄ作用群ともに顕著な殺細胞効果を示さなかった。全てのヒト正常細胞において、ＯＡｄ３５作用群では高ウイルス用量（３００、１０００ＶＰ／ｃｅｌｌ）で細胞死が観察された。これは、生体内投与において想定される用量と比べ極めて高い用量でウイルスが感染したために、細胞にダメージを与えてしまい、細胞死が観察されたと考えられる。
さらに、各ＯＡｄを用いて、各種癌細胞に対する殺細胞効果を検討した（図６Ｄ、図６Ｅ）。
以上の結果、今回新たに作製したＯＡｄ３５は癌細胞特異的に殺細胞効果を示すことが明らかとなった。

各ＯＡｄの細胞表面への結合能
次に、各ＯＡｄの各ヒト癌細胞株への結合能を検討するため、各ＯＡｄを４℃で１．５時間作用させ、細胞表面に結合したＯＡｄのゲノム量を定量的ＰＣＲ法により測定した（図７）。その結果、ＣＡＲ陽性細胞に対してはＯＡｄ５、ＯＡｄ３５ともに同程度のＡｄゲノム量を示したことから、ＣＡＲ陽性細胞に対しては両ＯＡｄともに効率よく結合できることが示唆された。一方、ＣＡＲ陰性細胞では、ＯＡｄ５と比べ、ＯＡｄ３５作用群で高いＡｄゲノム量を示した。この結果より、ＯＡｄ５はＣＡＲ陰性細胞に対しては結合しにくいが、ＯＡｄ３５は標的細胞のＣＡＲの発現に関わらず、高い結合能を有することが示唆された。

各種ヒト癌細胞における各ＯＡｄの感染増殖能
次に、図６Ａ，６Ｂ，６Ｄ，６Ｅで示した各ＯＡｄ作用によるヒト癌細胞での細胞死が、Ａｄ増殖によるものであるかを検討するため、各種ヒト癌細胞に各ＯＡｄを作用し、ウイルス作用２４時間、７２時間後のＡｄゲノム量を測定した（図８）。その結果、各種ヒト癌細胞において、両ＯＡｄともに２４時間後から７２時間後にかけてＡｄゲノム量が増加していた。特に、ＣＡＲ陰性細胞において、ＯＡｄ３５作用群では、ＯＡｄ５作用群と比べ、Ａｄゲノムが大きく増加していた。以上の結果より、ＯＡｄ３５はＣＡＲ陽性細胞のみならず、ＣＡＲ陰性細胞に対しても効率よく感染増殖できることが示された。

抗Ａｄ５血清存在下における各ＯＡｄの殺細胞効果
最後に、今回作製したＯＡｄ３５が、Ａｄ５に対する抗体存在下でも標的細胞に感染し、殺細胞効果を示すのかを検討するため、１／４００希釈から１／１６００希釈まで２倍ずつ段階希釈した抗Ａｄ５血清と各ＯＡｄを３０分間インキュベートした後、各種ヒト癌細胞に作用し、ウイルス作用５日後における殺細胞効果を測定した。

抗Ａｄ５血清は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥ１欠損Ａｄ５ベクターを１×１０^１０ＶＰ／ｍｏｕｓｅで尾静脈内投与し、抗Ａｄ５免疫を誘導することで取得した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞において、抗Ａｄ５血清存在下では、ＯＡｄ５作用群での細胞死が抑制されたのに対し、ＯＡｄ３５作用群では抑制されなかった（図９Ａ）。また、Ｔ２４細胞においても、抗Ａｄ５血清存在下でもＯＡｄ３５による細胞死は抑制されなかった（図９Ｂ）。以上の結果より、ＯＡｄ３５は、抗Ａｄ５抗体存在下でも標的細胞に感染可能であることが示唆された。

ＯＡｄ３５のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果を調べるために、Ｈ１２９９細胞によりマウスの皮下に腫瘍を形成させたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌに対し、ＯＡｄを腫瘍内投与した（図１０）。ＯＡｄ５およびＯＡｄ３５の腫瘍内投与後、腫瘍の成長は有意に抑制した。Ｈ１２９９細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ癌細胞溶解活性はＯＡｄ５の方がＯＡｄ３５よりも高かったが（図６Ａ）、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍成長抑制効果ではＯＡｄ５とＯＡｄ３５との間で有意な差はなかった。これらの結果から、ＯＡｄ３５がｉｎ ｖｉｖｏにおいて十分な抗腫瘍効果があることが示された。

４．考察
本実施例では、Ａｄ３５を基盤とした新規腫瘍溶解性Ａｄの開発に取り組み、ヒト培養細胞株における殺細胞効果などのＯＡｄ３５の特性について検討した。今回開発したＯＡｄ３５は、ｈＴＥＲＴプロモーター又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター下流にＥ１Ａ遺伝子を挿入し、Ｅ１Ｂ遺伝子本来のプロモーターよりＥ１Ｂ遺伝子が発現するように設計した（図４）。

Ｅ１遺伝子発現カセットはＡｄの増殖を司る重要なファクターであり、様々な設計がなされているが、本実施例ではｈＴＥＲＴプロモーターを用いた。ｈＴＥＲＴプロモーターは、８０％以上の癌細胞において高い活性を示すと報告されており、多くの癌細胞に適用可能である点から、有用であると考えられる。本実施例において作製したＯＡｄ３５のゲノムをコードしたプラスミドは、Ｅ１遺伝子発現カセットのｈＴＥＲＴプロモーター領域の両側に制限酵素サイトを挿入しているので、腫瘍特異性を失わず、ｈＴＥＲＴよりも活性が高い優れた腫瘍特異的プロモーターが開発された場合や、特定の組織の癌細胞を標的とする場合には、プロモーターを簡便に交換可能になっている。

ヒト癌細胞におけるＯＡｄ３５の殺細胞効果をクリスタルバイオレット染色、ＷＳＴ−８試薬を用いて測定したところ、ＯＡｄ３５はＣＡＲ陽性細胞、ＣＡＲ陰性細胞どちらにも効率よく感染し、高い殺細胞効果を示した（図６Ａ，図６Ｂ）。Ａｄ３５のＦｉｂｅｒはＡｄ５感染受容体ＣＡＲには結合しないが、Ａｄ３５感染受容体であるＣＤ４６と結合するため、ＯＡｄ３５はＣＡＲ陽性および陰性細胞の両者に効率よく感染できたものと考えられる。

癌の悪性度が上がるとともに、ＣＡＲの発現が減少するという報告もあることから、ＯＡｄ３５は悪性度が高く、ＣＡＲの発現が減少、もしくは消失した癌細胞に対しても高効率に感染することが期待される。また、Ａ５４９細胞はＣＡＲ、ＣＤ４６ともに９０％以上発現していたににも関わらず、ＯＡｄ５による殺細胞効果は低く、ＯＡｄ３５により高い殺細胞効果が観察された。

一方、他のヒト肺癌細胞株であるＨ１２９９細胞に対しては、ＯＡｄ５がより高い殺細胞効果を示したことから、ＯＡｄ５がＡ５４９細胞に対して低い殺細胞効果しか示さなかったのは、肺癌細胞特異的な現象ではなく、Ａｄ５とＡｄ３５の生活環の違い（感染経路、脱殻、核内移行、転写翻訳、ウイルス粒子形成等）が原因として考えられる。

ＯＡｄ３５と各種ヒト癌細胞表面への結合についての検討を行ったが、ＣＡＲ陽性細胞では両ＯＡｄとも同程度の結合能を示した一方で、ＣＡＲ陰性細胞ではＯＡｄ３５が顕著に高い結合能を示した（図７）。
ＯＡｄ５とＯＡｄ３５の各種ヒト癌細胞における感染増殖能を検討したが、各種ヒト癌細胞において両ＯＡｄとも２４時間から７２時間後にかけて高い感染増殖能を示した（図８）。興味深いことに、ＣＡＲ陰性細胞においてもＯＡｄ５のゲノム増幅が見られたが、Ａｄ５はＣＡＲ依存的な感染経路だけでなく、細胞表面のαＶインテグリン依存的な感染や血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ）依存的な感染においても細胞に感染可能であるので、それらの経路を介してＯＡｄ５が感染したと考えられる。

８０％以上の成人は、自然暴露により抗Ａｄ５抗体を有していることが報告されており、腫瘍溶解性Ａｄを用いた癌治療において大きな問題となっている。今回、抗Ａｄ５抗体存在下におけるＯＡｄ３５の殺細胞効果について検討したが、ＯＡｄ５は抗Ａｄ５抗体存在下において殺細胞効果が抑制されたのに対し、ＯＡｄ３５では抑制されなかった（図９）。これにより、たとえ抗Ａｄ５抗体を有する実験動物やヒトに対してもＯＡｄ３５は抗腫瘍効果を発揮することが期待される。

現状、ＯＡｄを用いた癌治療では、腫瘍内投与のプロトコルが最も用いられている。腫瘍内投与の場合、抗Ａｄ５抗体が存在すると、血中に漏出した腫瘍溶解性Ａｄは直ちに抗体にトラップされ、転移巣に対して治療効果を発揮することは困難である。一方で、Ａｄ３５は抗体保持率が低く、特定の組織に集積しないという特徴を持つ。本実施例でＯＡｄ３５は抗Ａｄ５抗体の影響を受けないことが示されたので、ｉｎ ｖｉｖｏや臨床での投与においても、ＯＡｄ３５の腫瘍内投与の抗腫瘍効果だけでなく、静脈内投与後の転移癌に対する治療効果も期待できる

本発明における、ヒト３５型Ａｄによる高い自然免疫誘導能は、癌治療を目的とした腫瘍溶解性ウイルスの場合には逆に抗腫瘍免疫の増強につながり得る点で、極めて有用なものである。

配列番号１〜４：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
［配列表］

Claims (10)

1. ｈＴＥＲＴプロモーター又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、及びＥ１遺伝子が３５型アデノウイルスゲノムに組み込まれた、組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
2. ｈＴＥＲＴプロモーター又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、及びＥ１Ａ遺伝子が３５型アデノウイルスゲノムに組み込まれた、組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
3. ｈＴＥＲＴプロモーター又はＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂプロモーター及びＥ１Ｂ遺伝子が３５型アデノウイルスゲノムに組み込まれた、組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
4. Ｅ１Ａ遺伝子が変異型のものである、請求項２又は３に記載の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
5. 細胞死誘導関連タンパク質又は免疫賦活関連タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルスを含む、医薬組成物。
7. 癌の治療用のものである、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 癌が乳癌である、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性３５型アデノウイルス、又は請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物を癌患者に投与することを特徴とする、癌の治療方法。
10. 癌患者が乳癌患者である、請求項９に記載の治療方法。

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