JP2005194244A

JP2005194244A - 亜鉛イオン蛍光センサー

Info

Publication number: JP2005194244A
Application number: JP2004003707A
Authority: JP
Inventors: Shigenobu Yano; 重信矢野; Yuji Mikata; 裕司三方
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 2004-01-09
Filing date: 2004-01-09
Publication date: 2005-07-21
Also published as: US7541467B2; US20050182253A1

Abstract

【課題】亜鉛イオン蛍光センサーとして有用な化合物を提供する。
【解決手段】下記の一般式(I)：
【化１】

（式中、R¹、R²、R³、及びR⁴はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい2-キノリル基、置換基を有していてもよい1-イソキノリル基、又は置換基を有していてもよい3-イソキノリル基を示し、m、n、p、及びqはそれぞれ独立に１又は２を示し、Ｌは単結合又は炭素数１〜５個のアルキレン基（該アルキレン基は主鎖中にヘテロ原子を含んでいてもよく、主鎖上に置換基を有していてもよい）で表される化合物又はその塩。
【選択図】なし

Description

亜鉛イオンが酵素触媒作用、遺伝子発現、アポトーシス、神経伝達などを含む細胞内過程において重要な働きをしていることから、亜鉛イオンに対するセンサーの開発は生物無機化学者にとって魅力ある分野である。生きた細胞において、リアルタイムでの亜鉛イオンの測定および亜鉛イオンの分布の視覚化によって、生体内過程における亜鉛イオンの機能をさらに解明することができる。

亜鉛イオンに特異的に結合する化合物としては、細胞膜透過性の亜鉛キレーターN,N,N',N'-tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN)が知られている（Helv. Chim. Acta, 50, 2330, 1967）。また、近年、光誘起電子移動 (photoinduced electron-transfer，PET)機構に基づいた亜鉛イオンセンサーが盛んに開発されている。これらは、亜鉛イオンが蛍光色素の近傍に位置するヘテロ原子に結合し、PETを阻害することによりセンサー分子の蛍光をオンにするものである。これまで、蛍光性のフルオレセイン誘導体に亜鉛キレーター部位を導入した化合物としてZnAF-2 (J. Am Chem. Soc., 122,12399, 2000)、Newport Green (Molecular Probe社のカタログである“Handbook of Fluorescent Probes and Research Products"8th edition by Richard P. Haugland pp.805-817)、Zinpyr-1 (J. Am. Chem. Soc., 122, 5644, 2000)などが開発されている。

さらに、キノリン発色団をベースとする亜鉛イオンセンサーも種々開発されている。これらは錯形成によって誘起される蛍光 (Chelation Enhanced Fluorescence, CHEF)を利用しており、その発光原理は2,6-Bis(quinolinecarboxy)methylpyridine (P2Q)−亜鉛錯体により詳細に研究されている (J. Comput. Chem. Jpn., 2, pp.57-62, 2003)。このキノリン発色団をベースとする亜鉛イオンセンサーとしてはTSQ (J. Neurosci. Methods, 20, 91, 1987)、Zinquin (Biochem. J., 296, 403, 1993)などが実用化されているが、これらは、亜鉛イオンとの間に蛍光性の１：１錯体と１：２錯体の両方を形成するため、亜鉛イオン測定に用いた場合、定量的解析が困難となる場合があった。さらに、これらの亜鉛イオンセンサーのうちZnAF-2など一部を除いては、高いバックグラウンド蛍光を有していたり、あるいは生理的条件のpH=6-8の範囲でpHの影響を受けやすいという問題があった。また、これらの亜鉛イオンセンサーの合成には複数の工程が必要であり、安価かつ大量に製造することができないという問題があった。

Helv. Chim. Acta, 50, 2330, 1967 J. Comput. Chem. Jpn., 2, pp.57-62, 2003 J. Neurosci. Methods, 20, 91, 1987 Biochem. J., 296, 403, 1993

本発明の課題は、高選択的な亜鉛イオン蛍光センサーとして利用可能な化合物又はその塩を提供することにある。より具体的には、亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、捕捉後の錯体の蛍光特性に優れた化合物又はその塩を提供することが本発明の課題である。また、生理的なpHで影響を受けず、安価に製造可能な亜鉛イオンセンサーとして利用可能な化合物を提供することも本発明の課題である。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、細胞膜透過性の亜鉛キレーターであるTPENのピリジン環をキノリン環に置き換えた化合物が、亜鉛イオン存在下で亜鉛イオンと１：１錯体を形成し、該錯体が強い蛍光を発すること、及びこの化合物が亜鉛イオン蛍光センサーとして極めて優れた性質を有していることをを見出した。本発明はこれらの知見を基に完成されたものである。

すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：

（式中、R¹、R²、R³、及びR⁴はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい2-キノリル基、置換基を有していてもよい1-イソキノリル基、又は置換基を有していてもよい3-イソキノリル基を示し、m、n、p、及びqはそれぞれ独立に１又は２を示し、Ｌは単結合又は炭素数１〜５個のアルキレン基（該アルキレン基は主鎖中にヘテロ原子を含んでいてもよく、主鎖上に置換基を有していてもよい）で表される化合物又はその塩が提供される。

別の観点からは、本発明により、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩を含む亜鉛イオン蛍光センサー；及び上記一般式(I)で表される化合物又はその塩と亜鉛イオンとから形成される亜鉛錯体が提供される。この亜鉛イオン蛍光センサーは、組織や細胞内の亜鉛イオンを測定するために用いることができる。

さらに別の観点からは、本発明により、亜鉛イオンの測定方法であって、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩を亜鉛イオン蛍光センサーとして用いる方法；亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：(a) 上記一般式(I)で表される化合物又はその塩と亜鉛イオンとを反応させる工程、及び(b)上記工程で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程を含む方法；並びに、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩の亜鉛イオン蛍光センサーとしての使用が提供される。

上記一般式(I)で表される化合物又はその塩は、エチレンジアミンと2-クロロメチルキノリンなどとを反応させることにより１段階で高収率に合成可能であり、亜鉛イオンを特異的に捕捉することができるという特徴がある。また、亜鉛イオンを捕捉後の錯体は蛍光特性に優れており、生理的なpHで影響を受けることがないので、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩は亜鉛イオン蛍光センサーとして有用である。

R¹、R²、R³、及びR⁴はそれぞれ独立に2-キノリル基、1-イソキノリル基、又は3-イソキノリル基を示し、2-キノリル基、1-イソキノリル基、又は3-イソキノリル基は任意の位置に１個又は２個以上の任意の置換基を有していてもよい。R¹、R²、R³、及びR⁴は互いに異なる基であってもよいが、これらのうちのいずれか２個以上が同一の基であってもよい。

2-キノリル基、1-イソキノリル基、又は3-イソキノリル基が置換基を有する場合には、置換基の種類、個数、及び置換位置は特に限定されない。好ましい置換位置としては、2-キノリル基、1-イソキノリル基、又は3-イソキノリル基における5位、6位、及び7位から選ばれる１又は２以上の位置である。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、置換基がこれらの位置に存在する場合には、一般式(I)で表される化合物と亜鉛イオンとの間での亜鉛錯体の形成に障害とならない。2-キノリル基、1-イソキノリル基、3-イソキノリル基に置換する置換基の好ましい数は１ないし３個程度である。2-キノリル基、1-イソキノリル基、又は3-イソキノリル基が無置換であることも好ましい。

2-キノリル基、1-イソキノリル基、又は3-イソキノリル基に存在可能な置換基としては、例えば、アルキル基（アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組合わせのいずれでもよく、炭素数は１〜１２個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜６個程度である。アルキル部分を有する他の置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分についても同様である）、アルコキシ基、水酸基、アルキルカルボニルオキシ基、アルキルオキシカルボニルアルキルオキシ基、カルボキシル基、アルキルオキシカルボニル基、スクシミジルオキシカルボニル基、アルキルカルボニルオキシメチルオキシカルボニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ハロゲン基（ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい）、チオール基、アルキルチオ基、ハロゲン化アルキル基、ニトロ基、スルホ基及びそのエステル、ホスホノ基及びそのエステルなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。上記に例示した置換基には、さらに１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。

一般式(I)において、m、n、p、及びqはそれぞれ独立に１又は２を示す。m、n、p、又はqが１であるときにはメチレン基であることを意味しており、m、n、p、又はqが２であるときにはエチレン基であることを意味している。m、n、p、及びqはそれぞれ１であることが好ましい。Ｌは単結合又は炭素数１〜５個のアルキレン基を示す。該アルキレン基は主鎖中にヘテロ原子を含んでいてもよく、主鎖上に置換基を有していてもよい。本明細書において、ヘテロ原子とは窒素原子、酸素原子、又はイオウ原子などの炭素原子以外の非金属原子を意味している。該アルキレン基は分枝鎖を有していてもよいが、直鎖状のアルキレン基であることが好ましい。主鎖とは、Ｌのそれぞれ両端に結合する窒素原子及び炭素原子を最小個数の原子で結ぶＬ中の原子鎖のことである。Ｌの主鎖中にヘテロ原子を含む例としては、例えば、Ｌが-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-S-CH₂-、-CH₂(CH₃)-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-である場合などが挙げられるが、これらに限定されることはない。Ｌの主鎖上に存在可能な置換基の個数、置換位置、及び種類は特に限定されない。置換基としては、上記の2-キノリル基、1-イソキノリル基、又は3-イソキノリル基に存在可能な置換基として例示したものなどが用いられる。

以下に一般式(I)で表される化合物の好ましい例を示すが、本発明の化合物はこれらに限定されることはない。

上記一般式(I)で表される本発明の化合物は酸付加塩として存在することができ、置換基の種類によっては塩基付加塩として存在することもできる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩は、例えばカルボキシル基などの置換基を有する場合に形成され、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。

上記一般式(I)で表される本発明の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。

一般式(I)で表される本発明の化合物のうち、R¹、R²、R³、及びR⁴が2-キノリル基であり、m、n、p、及びqが１であり、Ｌがメチレン基である化合物は、例えば、2-クロロメチルキノリンとエチレンジアミンとを反応させることにより１工程で製造することができる。この合成方法の詳細を実施例に示した。当業者は、実施例の製造方法を参照しつつ、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、一般式(I)に包含される他の化合物も容易に合成することが可能である。

上記一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩は、亜鉛イオン蛍光センサーとして有用である。上記一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩は、それ自体は強い蛍光を発する性質を有していないが、亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯体を形成すると、強い蛍光を発するようになる。上記化合物又はその塩は亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、極めて錯体形成が速やかであるという特徴を有している。また、本発明の化合物はバックグラウンド蛍光がほとんどなく、しかも形成された亜鉛錯体は中性領域(pHが６ないし８)の領域でpHの影響を受けにくく安定した強い蛍光を発するという特徴がある。従って、上記一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩は、生細胞や生組織中の亜鉛イオンを生理条件下で測定するための亜鉛イオン蛍光センサーとして極めて有用である。本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量及び定性を含めて最も広義に解釈すべきものである。

本発明の亜鉛イオン蛍光センサーの使用方法は特に限定されず、従来公知の亜鉛イオンセンサーと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記一般式(I)で表される化合物及びその塩からなる群から選ばれる一の物質を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の亜鉛イオン蛍光センサーを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、pH調節剤などの添加物と組み合わせることができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：N,N,N',N'-テトラキス(2-キノリルメチル)エチレンジアミン(TQEN)の合成
2-クロロメチルキノリン塩酸塩（1.07 g, 5 mmol）、エチレンジアミン（7.50 mg, 1.25 mmol）、炭酸カリウム（2.07 g, 15 mmol）、アセトニトリル（10 mL）の混合物を48時間加熱還流した。溶媒を減圧留去後、残渣をクロロホルム／水で分液し，有機層を乾燥して溶媒を留去した。残渣をアセトンで洗浄して目的物を白色粉末として得た（0.70 g, 89%）。
mp 196-198℃
¹H NMR (CDCl₃) δ(ppm): 2.89 (s, 4H), 3.96 (s, 8H), 7.49-7.54 (m, 8H), 7.66-7.71 (q, 8H), 7.87 (d, 4H), 7.99 (d, 4H)
¹³C NMR (CDCl₃) δ(ppm): 52.58, 61.56, 120.85, 125.95, 127.16, 127.34, 128.88, 129.23, 136.08, 147.40, 160.29
ESI-MS calcd. for C₄₂H₃₇N₆ ([M+H]⁺): 625.3074; Found: 625.3070
Anal. calcd. for C₄₂H₃₆N₆: C, 80.61; H, 5.96; N, 13.43. Found: C, 80.69; H, 5.92; N, 13.41

例２：[Zn(TQEN)](ClO₄)₂の合成
TQEN（0.31 g, 0.50 mmol）と過塩素酸亜鉛（0.18 g, 0.49 mmol）の混合物をアセトニトリル中で室温下に４日間撹拌した。少量の不要物を濾別後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をアセトニトリル−エーテルから再結晶してX線結晶構造解析に適した単結晶を得た。
¹H NMR (CD₃CN) δ(ppm): 3.18 (s, 4H), 4.1 (br., 4H), 4.43 (d, 4H), 7.3 (br., 4H), 7.46 (d, 4H), 7.5-7.7 (m, 4H), 8.07 (d, 4H), 8.56 (d, 4H)
¹³C NMR (CD₃CN) δ(ppm): 57.00, 63.18, 123.17, 126.45, 129.19, 130.45, 130.79, 132.83, 142.94, 145.72, 160.78
ESI-MS calcd. for C₄₂H₃₆N₆ZnClO₄ ([Zn(TQEN)]ClO₄): 787.1773; Found: 787.1766
Anal. calcd. for C₄₂H₃₈N₆ZnCl₂O₉ ([Zn(TQEN)](ClO₄)₂・H₂O): C, 55.61; H, 4.22; N, 9.26. Found: C, 55.85; H, 4.18; N, 9.35

試験例１
TQENをジメチルホルムアミド(DMF)又は水含有DMF溶液（DMF：水＝１：１）中で317nmの光を照射したところ、ほとんど蛍光を発しなかった。一方、亜鉛イオンの添加によりTQENからの蛍光が観測された（383nmの蛍光、図１）。また、ジョブプロット解析により、TQENは１当量の亜鉛イオンと錯形成することがわかった（図２）。

試験例２
図３に各種の金属イオン存在下でのTQENの蛍光応答を示す。TQENは亜鉛イオンの存在下及びカドミウムイオン存在下（亜鉛イオンの約60%の蛍光強度）で強い蛍光を発したが、他の金属イオンはTQENの蛍光にほとんど影響を及ぼさなかった。ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ニッケル、及びマンガンの各イオンはTQEN-亜鉛錯体の蛍光に影響を及ぼさなかったが、１当量の銅、コバルト、カドミウム、銀、及び過剰の鉄イオンはTQENの亜鉛による蛍光を妨げることから、これらの金属イオンは亜鉛よりも強く錯形成する可能性がある。

試験例３
TQENを亜鉛イオンで滴定し、その変化を紫外可視吸収スペクトルによって追跡した。吸収変化は等吸収点をもち、１当量の亜鉛イオンを加えたところでストップした（図４）。このことは、１当量より多い亜鉛イオンが含まれるTQEN錯体はTQENと亜鉛の１：１錯体と同じ吸収を持っていることを示している。競争実験で前者のイオングループ（ナトリウム，カリウムなど）の金属はTQENの吸収スペクトルの変化を引き起こさなかったが、後者のイオングループ（銅，コバルトなど）は亜鉛と同様のスペクトル変化を引き起こした。

試験例４
TQENの亜鉛による滴定をNMRを用いて行ったところ、TQENとTQENの亜鉛錯体とでは別々のピークが観測された。これはTQENと亜鉛が結合したTQENとの間の交換速度がNMRのタイムスケールよりも遅いことを示している（図５）。亜鉛錯体においては、ベンジル位の水素原子が錯体内での配座の自由度が制限されることによりABカルテットとして観測された。また、１当量のTPENの存在下での競争実験により、TQEN-亜鉛錯体からの蛍光は完全に消失した。このことは、TQEN-亜鉛錯体の亜鉛イオンがより強い亜鉛配位子であるTPENにより完全に除かれることを示している。一方、１当量のEGTA（エチレングリコール-ビス(2-アミノメチル)-N,N,N',N'-テトラ酢酸, K_Zn = 〜10⁹ M）を用いた実験では、TQEN-亜鉛錯体から亜鉛イオンは完全には取り除かれず、DMF含有水溶液中でTQEN-亜鉛錯体の蛍光はEGTAにより約40%消光されたにとどまった。

試験例５
図６にTQEN-亜鉛錯体の蛍光強度に対するpHの影響を示した。pH4から10の範囲で安定した強い蛍光強度が得られており、TQEN-亜鉛錯体が広いpH領域で亜鉛イオン蛍光センサーとして使用できることが明らかである。

試験例６
[Zn(TQEN)](ClO₄)₂・2.5CH₃CNの単結晶をパラトンオイルで被い，グラスファイバーにマウントした。測定は173 Kで行った。測定には単色化された50 kV/40 mAのMoKaを線源として用い、理学Mercury CCD検出器を用いた。測定中にピークの減少はほとんど見られなかった。データはCrystalClearソフトウェア（理学）を用いてPCで解析した。構造は直接法（SIR-92）を用い、F²に対して最小自乗法を用いて最適化した。水素原子はriding modelとして取り扱った。結晶学的データは表１にまとめた。主要な結合距離，角度は表２にまとめた。

TQEN-亜鉛錯体は2つの結晶学的に独立な分子を持ち、そのうちの１つを図７に示した。TQENは６つの窒素原子により亜鉛イオンに結合しており、亜鉛イオンの周辺にゆがんだ八面体構造の配位環境とねじれ構造を提供している。TQEN-亜鉛錯体は２つのキノリン環どうしの立体障害により４つ全てのキノリン環がプロペラ状の配置をとっており（ねじれ角２１度）、この特徴的な結合様式がTQEN-亜鉛錯体の望ましい蛍光特性を与えているものと考えられる。

本発明の亜鉛イオン蛍光センサー(TQEN)の蛍光特性を示した図である。 TQENと亜鉛イオンとの錯体形成のジョブプロット解析の結果を示した図である。各種の金属イオン存在下でのTQENの蛍光応答を示した図である。 TQENを亜鉛イオンで滴定し、その変化を紫外可視吸収スペクトルによって追跡した結果を示した図である。 TQENの亜鉛イオンによる滴定をNMRを用いて行った結果を示した図である。 TQEN-亜鉛錯体の蛍光強度に対するpHの影響を示した図である。 TQEN-亜鉛錯体のＸ線構造解析の結果を示した図である。

Claims

下記の一般式(I)：

（式中、R¹、R²、R³、及びR⁴はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい2-キノリル基、置換基を有していてもよい1-イソキノリル基、又は置換基を有していてもよい3-イソキノリル基を示し、m、n、p、及びqはそれぞれ独立に１又は２を示し、Ｌは単結合又は炭素数１〜５個のアルキレン基（該アルキレン基は主鎖中にヘテロ原子を含んでいてもよく、主鎖上に置換基を有していてもよい）で表される化合物又はその塩。
R¹、R²、R³、及びR⁴が置換基を有していてもよい2-キノリル基であり、m、n、p、及びqが１であり、Ｌがメチレン基である請求項１に記載の化合物又はその塩。
請求項１に記載の一般式(I)で表される化合物又はその塩を含む亜鉛イオン蛍光センサー。
請求項１に記載の一般式(I)で表される化合物又はその塩と亜鉛イオンとから形成される亜鉛錯体。
亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：
(a)請求項１に記載の一般式(I)で表される化合物又はその塩と亜鉛イオンとを反応させる工程、及び
(b)上記工程で生成した請求項４に記載の亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む方法。