【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養基材及びその製造方法、並びに細胞培養方法に関する。より詳細には、細胞培養により２次元又は３次元組織体を形成でき、さらに培養後の組織を簡便に回収できる細胞培養基材及びその製造方法、並びに該細胞培養基材を用いた細胞培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞培養技術は、１）細胞産生物の生産、２）生体病変部や欠損部への補綴材、３）薬剤の毒性及び薬理活性評価用のシミュレーターなどの分野で、研究、応用されている。
今日、細胞培養に用いられている動物細胞は２種類に分類される。即ち、接着非依存性細胞（ａｎｃｈｏｒａｇｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）と接着依存性細胞（ａｎｃｈｏｒａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）である。前者の接着非依存性細胞は、生存、増殖、物質産生能などの細胞機能が細胞の足場である基質が存在しなくても正常に発現される細胞である。典型的な例として、ミエローマ細胞、リンホーマ細胞などから形成されるハイブリドーマが挙げられる。一方、後者の接着依存性細胞は、生存、増殖、物質産生などの細胞機能が細胞の足場である基質が存在しなくては正常に発現されない細胞である。初代培養細胞をはじめとした正常二倍体細胞の大部分は、接着依存性である。さらに無限に増殖可能な樹立細胞系にも、接着依存性を示すものが数多く知られている。例えば、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイン類、エリスロポエチン、コロニー・スティミュレイティング・ファクター、トロンボポエチンなどの各種分化成長ホルモン、ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチベーター、ワクチンなどの有用な細胞産生物を産生する樹立細胞系にも接着依存性を示すものが多く知られている。
【０００３】
従来、細胞培養は、ガラス表面上或いは種々の処理を行った合成高分子材料の表面上において行われていた。その一例として、ポリスチレンに対して種々の表面処理（例えば、プラズマ処理、コロナ処理、等）を施したもの、或いはコラーゲン、フィブロネクチン、ポリリジンなどの細胞接着性タンパク質をコートしたものなどの種々の形状の容器が細胞培養用基材として普及している。
【０００４】
また、細胞と細胞培養用基材との相互作用に関しては、細胞は基材表面の化学的な性質のみならず微細な形状によっても影響を受けることが知られている。そこで、半導体産業等に利用されているマイクロパターン技術を利用した細胞接着面のサイズコントロール、培養基板への微小溝構造の導入、マイクロスフィアによる微細凹凸の作製が行われ、細胞培養用基材として生産されている。しかし、これらのマイクロパターン技術を使った表面設定は、非常に高度な技術が必要であり、大量生産が出来ない、高コストになる、などの多くの問題を抱えているのが現状である。
【０００５】
そして、上述のような細胞培養基材を用いて培養、増殖された細胞は、従来、トリプシンのようなタンパク質分解酵素やＥＤＴＡのような化学薬品により処理することで基材表面から剥離、回収されていた。しかしながら、このような手段により細胞を回収した場合、処理工程が煩雑になること、不純物混入の可能性が多くなること、また増殖した細胞が前記処理により変性し、細胞本来の機能が損なわれること、等の欠点が指摘されている。
【０００６】
これらの欠点を解消するために、トリプシンのようなタンパク質分解酵素やＥＤＴＡのような化学薬品等による処理を必要とせず、培養支持体周囲の温度を変化させるだけで、培養・増殖させた細胞を剥離、回収させることのできる細胞培養用支持体材料、及びその製造方法が提案されている（例えば、特許文献１〜４参照。）。このような技術における細胞培養基材としては、ポリイソプロピルアクリルアミド（以下、ＰＮＩＰＡＭと略称する。）が用いられている。
【０００７】
ＰＮＩＰＡＭは、水溶液中において下限臨界点温度（ＬＣＳＴ）３１℃を有する感温性高分子である。具体的には、臨界点温度以下の温度では分子表面が親水性又は水溶性を呈して水に溶けるが、臨界点温度以上の温度では分子表面が疎水性を示すので水中に析出するという、いわゆる感温性の相分離特性を有している高分子である。しかも、臨界点温度以上の温度環境では、表面が疎水性を有することで細胞に対する接着性を発現する。即ち、細胞培養後に培養液中において、ＰＮＩＰＡＭ層を臨界点温度以下の温度にすれば、ＰＮＩＰＡＭ層の表面は親水性になって細胞が接着できなくなると共に、ＰＮＩＰＡＭ層は水に溶解する。その結果、培養された細胞層は、培養皿の表面から剥離して回収される。しかし、この方法ではポリマーを洗浄することが容易でない等の問題点があった。
【０００８】
また、細胞を培養し３次元組織体を形成させるには、コラーゲン、アルギン酸、アガロースなどのような天然高分子材料を用いたゲルやポリ（メタクリル酸−２−ヒドロキシエチル）などのような合成高分子材料を用いたゲルの内部やスポンジ状に成形された基材で細胞培養が行われてきた。例えば、アルギン酸ゲルを用いて培養を行い、カルシウムキレイト剤を添加することにより回収する方法が示されている（例えば、特許文献５参照。）。
また、従来の多くの方法においては、培養した細胞を回収するために、トリプシンのようなタンパク質分解酵素やＥＤＴＡのような化学薬品により処理するため、細胞本来の機能が損なわれること等の欠点が指摘されている。
【０００９】
これらの欠点を解消するために、温度変化によってゾル−ゲル転移するハイドロゲルを用いて細胞培養を行い、回収する方法が示されている（例えば、特許文献６〜１３参照。）。しかし、この方法は、ゲル内部で細胞培養を行うため、３次元組織体を形成させるには、拡散による栄養の供給と老廃物の除去が問題となり、培地交換時にゲルをゾル状態にしなければならないなど工程の煩雑さ、ポリマーを洗浄することが容易でない等の問題点があった。
【００１０】
【特許文献１】
特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】
特開平４−２７８０８３号公報
【特許文献３】
特開平９−２３８７６号公報
【特許文献４】
特開平１１−３４９６４３号公報
【特許文献５】
特開平１０−２４８５５７号公報
【特許文献６】
特願平４−１６１１４号公報
【特許文献７】
特願平５−１８６９７号公報
【特許文献８】
特願平７−１８７９０２号公報
【特許文献９】
特願平７−１８７９０３号公報
【特許文献１０】
特開平９−１２６５１号公報
【特許文献１１】
特開平９−１２６５２号公報
【特許文献１２】
特開２００２−１８２７０号公報
【特許文献１３】
特開２００１−３２９１８３号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、細胞培養を行うに際して、細胞の足場となる細胞接着面、栄養の供給、及び老廃物の除去ルートを有しており、かつ形成された２次元又は３次元組織体を簡便に回収できる細胞培養基材、該細胞培養基材の製造方法、並びに、該細胞培養基材を用いた細胞培養方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための手段は以下の通りである。
＜１＞ 少なくとも、微粒子と、親水性成分と、を含む微粒子含有親水性高分子ゲルからなることを特徴とする細胞培養基材である。
＜２＞ 少なくとも、微粒子と、疎水性成分と、親水性成分と、を含む微粒子含有高分子ゲルからなることを特徴とする細胞培養基材である。
【００１３】
＜３＞ 前記親水性成分が、アニオン成分又はカチオン成分を含むことを特徴とする前記＜２＞に記載の細胞培養基材である。
＜４＞ 前記親水性成分が、生物由来成分を含むことを特徴とする前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の細胞培養基材である。
＜５＞ 感温性高分子成分を含むことを特徴とする前記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の細胞培養基材である。
【００１４】
＜６＞ 前記微粒子が、無機材料であることを特徴とする前記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の細胞培養基材である。
＜７＞ 前記微粒子が、有機材料であること特徴とする前記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の細胞培養基材である。
＜８＞ 前記微粒子が、金属材料であることを特徴とする前記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の細胞培養基材である。
＜９＞ 前記微粒子の濃度が、３〜９０質量％の範囲であることを特徴とする前記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の細胞培養基材である。
【００１５】
＜１０＞ 前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の細胞培養基材を敷き詰めた培養皿上で、細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法である。
＜１１＞ 前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の細胞培養基材からなる集合体中で、細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法である。
【００１６】
＜１２＞ 少なくとも、微粒子と、親水性モノマーと、を混合し架橋反応させることを特徴とする微粒子含有親水性高分子ゲルからなる細胞培養基材の製造方法である。
＜１３＞ 少なくとも、微粒子と、疎水性モノマーと、親水性モノマーと、を混合し架橋反応させることを特徴とする微粒子含有高分子ゲルからなる細胞培養基材の製造方法である。
＜１４＞ 少なくとも、微粒子と、疎水性成分及び親水性成分を含む共重合体と、を混合し架橋させることを特徴とする微粒子含有高分子ゲルからなる細胞培養基材の製造方法である。
＜１５＞ 少なくとも、微粒子と、疎水性成分及び親水性成分を有する共重合体と、を混合して分散溶液を調製し、該分散溶液を分散媒に添加し懸濁させて、架橋させることを特徴とする微粒子含有高分子ゲルからなる細胞培養基材の製造方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の細胞培養基材及びその製造方法、並びに細胞培養方法にについて詳細に説明する。
【００１８】
［細胞培養基材］
本発明の細胞培養基材の第１の態様は、少なくとも、微粒子と、親水性成分と、を含む微粒子含有親水性高分子ゲルからなることを特徴とする。
本発明の細胞培養基材の第２の態様は、少なくとも、微粒子と、疎水性成分と、親水性成分と、を含む微粒子含有高分子ゲルからなることを特徴とする。
【００１９】
ここで、上記第１の態様における微粒子含有親水性高分子ゲルは、少なくとも、微粒子と親水性成分とを含み、高分子ゲルが全体として親水性を示すものであればよい。なお、本発明の細胞培養基材においては、細胞培養時に培養される細胞の足場（接着面）となりうる疎水性部分の存在が必要であるが、微粒子含有高分子ゲルが親水性成分のみにより構成される場合には、疎水性の微粒子を用いることで当該疎水性部分とすることができる。
【００２０】
本発明の細胞培養基材は、上記構成としたことにより、細胞培養の際における細胞の足場となる細胞接着面を提供し得るとともに、高分子ゲルが含む微粒子の存在に起因して、培養に必要な栄養分や培養中に生じる老廃物の拡散速度が大きくなり、培養組織体（２次元組織体、又は３次元組織体）を効率よく形成することができる。更に、高分子ゲル中に微粒子が存在することで、培養後の組織体の基材からの分離・回収が、煩雑な工程を経ずに簡便に且つ速やかに行うことができる。
【００２１】
〔微粒子含有高分子ゲル〕
本発明の細胞培養基材を構成する微粒子含有高分子ゲルについて説明する。
前記本発明の第１の態様における微粒子含有高分子ゲルは、微粒子と親水性成分とを含む微粒子含有親水性高分子ゲルである。
また、前記第２の態様における微粒子含有高分子ゲルは、微粒子と、親水性成分と、疎水性成分と、を含む微粒子含有高分子ゲルである。
以下、本発明における微粒子含有高分子ゲル（以下、適宜「高分子ゲル」と称する。）を構成する各成分について説明する。
【００２２】
＜微粒子＞
微粒子について説明する。
本発明における微粒子としては、無機材料、有機材料、及び、金属材料からなる微粒子が使用できる。
【００２３】
無機材料からなる微粒子（無機微粒子）の具体例としては、酸化鉄等、フェライト、バリウム系化合物等の磁性体、酸化亜鉛、塩基性炭酸鉛、塩基性硫酸鉛、硫酸鉛、リトボン、白雲母、金雲母、紅雲母、黒雲母、リチア雲母、硫化亜鉛、酸化チタン、酸化アンチモン、鉛白、酸化ジルコニウム、アルミナ、マイカナイト、マイカレックス、石英、炭酸カルシウム、石膏、クレー、シリカ、ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸バリウム、珪素土、タルク、カオリン、セリサイト、パーミキュライト、塩基性炭酸マグネシウム、アルミナホワイト、グロスホワイト、サチン白、硫酸バリウム、ケイ酸ストロンチウム、ヒドロキシアパタイト、ゼオライト、窒化ホウ素、セラミックスパウダー、等が挙げられる。
【００２４】
有機材料からなる微粒子（有機微粒子）の具体例としては、フェノール樹脂、フラン樹脂、キシレン・ホルムアルデヒド樹脂、ユリア樹脂、メラミン樹脂、アニリン樹脂、アルキド樹脂、不飽和ポリエステル、エポキシ樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ−ｐ−キシリレン、ポリ酢酸ビニル、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、フッ素系プラスチック、ポリアクリロニトリル、ポリビニルエーテル、ポリビニルケトン、ポリエーテル、ポリカーボネート、熱可塑性ポリエステル、ポリアミド、ジエン系プラスチック、ポリウレタン系プラスチック、ポリフェニレン、ポリフェニレンオキシド、ポリスルホン、芳香族ヘテロ環ポリマー、シリコーン、天然ゴム系プラスチック、セルロース系プラスチック等やこれら２種類以上の高分子材料の混合材料（ポリマーブレンド）などの高分子材料、等が挙げられる。
【００２５】
金属材料からなる微粒子（金属微粒子）の具体例としては、亜鉛、アルメル、アンチモン、アルミニウム、アルミニウム合金、イリジウム、インジウム、オスミウム、クロム、クロメル、コバルト、ジルコニウム、ステンレス鋼、金、銀、洋銀、銅、青銅、すず、タングステン、タングステン鋼、鉄、鉛、ニッケル、ニッケル合金、ニッケリン、白金、白金ロジウム、タンタル、ジュラルミン、ニクロム、チタン、クルップ・オーステナイト鋼、コンスタンタン、真鍮、白金イリジウム、パラジウム、パラジウム合金、モリブデン、モリブデン鋼、マンガン、マンガン合金、ロジウム、ロジウム金、等が挙げられる。
【００２６】
上記した微粒子は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。微粒子は、用途によって適宜選択することができる。例えば、顕微鏡下における観察の容易さ等の観点からは、シリカ微粒子や、ポリスチレン等の有機微粒子などの無着色で光透過性を有する微粒子を用いることが好ましい。また、培養後の組織体を、培養基材から簡便かつ効率的に分離・回収する観点からは、磁性体微粒子を用いることが好ましい。
【００２７】
本発明における微粒子の粒径としては、１次粒子の平均粒径で０．００１μｍ〜５μｍのものが好ましい。細胞の足場となる細胞接着面、培養に必要な栄養分や培養中に生じる老廃物の拡散などの観点からは、０．０１μｍ〜０．５μｍのものが特に好ましい。
また、微粒子の比重としては、培養後の組織体の分離・回収等の観点から、１．００１〜１０が好ましく、１．００５〜５がより好ましい。
【００２８】
高分子ゲル中における微粒子の含有量としては、０．１〜９０質量％の範囲から一般的に選択される。特に、ゲル粒子内／外部への溶液の浸透、拡散を速やかに効率的に行う観点からは、その濃度が３〜９０質量％、より好ましくは５〜８０質量％の範囲であることが好ましい。
【００２９】
＜親水性成分＞
親水性成分としては、ノニオン成分、アニオン成分、及びカチオン成分の各親水性成分を用いることができる。
本発明においては、細胞の足場（細胞接着面）を充分に確保し細胞培養を効率よく行う観点から、親水性成分としては、アニオン成分又はカチオン成分を含むことが好ましい。アニオン成分及びカチオン成分の双方を含んでいてもよい。
但し、多量の電荷を導入することは、細胞に毒性を与えることが知られており、適当な電荷密度とすることが必要である。例えば、正電荷を導入したマイクロキャリアーの場合は、約２．０（ｍｅｑ／ｇｍ）が適当（Ｄ．Ｗ．Ｌｅｖｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ２１， ８２１， １９７９）なことが知られている。従って、アニオン成分、カチオン成分の導入量は、細胞毒性がない範囲で適宜決定される。
【００３０】
本発明において、アニオン成分とは、カルボン酸基、スルフォン酸基、硫酸基、リン酸基等の酸基およびこれらの塩を有する成分を意味する。また、カチオン成分とは、アミノ基、４級アミノ基等のイオン性基を有する成分を意味する。
【００３１】
これらの各成分は下記のモノマーを用いて合成できる。
ノニオン成分として用いられる親水性モノマーとしては、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、等が挙げられる。
【００３２】
酸基やその塩を有するモノマーの具体例としては、（メタ）アクリル酸あるいはその塩；マレイン酸あるいはその塩；フマル酸あるいはその塩；イタコン酸あるいはその塩；クロトン酸あるいはその塩；ビニルスルホン酸あるいはその塩；ビニルベンゼンスルホン酸あるいはその塩；２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸のようなアクリルアミドアルキルスルホン酸あるいはその塩；２−アクリロイルエタンスルホン酸、２−アクリロイルプロパンスルホン酸、２−メタクロイルエタンスルホン酸等のような（メタ）アクリロイルアルキルスルホン酸あるいはその塩；等が挙げられる。
【００３３】
一方、アミノ基や４級アミノ基等のイオン性基を有するモノマーの具体例としては、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドとその４級化物；ジエチルアミノプロピル（メタ）クリルアミドとその４級化物；ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレートやその４級化物；ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレートやその４級化物；等が挙げられる。
【００３４】
＜疎水性成分＞
疎水性成分としては、疎水性基を有するモノマーから構成されることが好ましい。疎水性基を有するモノマーとしては、スチレン、メチルスチレン、ジメチルスチレン、トリメチルスチレン、エチルスチレン、ジエチルスチレン、トリエチルスチレン、プロピルスチレン、ブチルスチレン、ヘキシルスチレン、ヘプチルスチレン、オクチスチレン等のスチレン誘導体；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体；フッ素化アルキル（メタ）アクリレート；等が挙げられる。これらは代表的な材料例であるため、これらに限定されるものではない。また、上記各モノマーは複数種類用いてもよい。
【００３５】
なお、本明細書中において、「（メタ）アクリルアミド」なる記述は、「（メタ）アクリルアミド」及び「アクリルアミド」のいずれをも含むことを意味する。
【００３６】
また、本発明においては、細胞の足場（細胞接着面）を充分に確保し細胞培養を効率よく行う観点から、親水性成分として生物由来成分を含むことが好ましい。
生物由来成分としては、コラーゲン、ゼラチン、カゼイン、アルブミン、ミオシン、フィブリノーゲン、フィブリン、ケラチン、γ−グロブリン、ラミニン、フィブロネクチン、メチルセルロース、デキストランなどのタンパク質、糖タンパク質、ポリペプタイド、多糖類、等が挙げられる。これらに限定されるものではない。上記生物由来成分の高分子ゲル中における含有の態様としては、高分子ゲル中に遊離した状態で含まれる態様であってもよいし、高分子ゲルに固着した態様であってもよい。
【００３７】
本発明における高分子ゲルは、感温性高分子成分を含むことが好ましい。
本発明に適用される感温性高分子成分としては、細胞培養温度下（通常、３７℃程度）において疎水性を示し、培養した組織体の回収時の温度下において親水性を示すものが好ましい。なお、感温性高分子が、疎水性から親水性に変化する温度としては、特に限定されないが、培養後の組織体の回収の容易さの観点からは、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。
このような感温性高分子成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の足場（細胞接着面）が充分に確保されるため細胞培養を効率よく行うことができる。その一方、培養後の組織体の回収時においては、疎水性部分を親水性に変化させ、培養された組織体を細胞培養基材から分離させることで、当該組織体の回収をより一層容易にすることができる。
【００３８】
感温性高分子成分の具体例としては、ポリ［Ｎ−イソプロピルアクリルアミド］などのポリ［Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド］；Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミドと（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステルなどから選択される１種以上との共重合体；ポリビニルメチルエーテルやメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのアルキル置換セルロース誘導体；ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；などが挙げられる。本発明においては、これらの成分が、目的に応じて適宜選択される。
【００３９】
本発明における微粒子含有高分子ゲルの形態としては、特に制限はなく、粒子状、ブロック状、不定形状、繊維状など種々ものが適用可能である。中でも、粒子状の形態は、微細凹凸の作製が簡便であること、積層するなどの集合体としたときの非占有空間の制御が簡便であることから好ましい。粒子状における形態についても特に限定はないが、球体、楕円体、多面体、星状などのものが適用できる。
【００４０】
また、微粒子含有高分子ゲルが粒子状の形態である場合の粒径としては、細胞培養の効率と細胞の回収の観点から、０．００１ｍｍ〜１ｍｍ程度が好ましく、０．００５ｍｍ〜０．３ｍｍ程度がより好ましい。
【００４１】
［微粒子含有高分子ゲルからなる細胞培養基材の製造方法］
次に、本発明の微粒子含有高分子ゲルから細胞培養基材の好ましい製造方法について説明する。
【００４２】
本発明の細胞培養基材を構成する微粒子含有高分子ゲルの製造方法としては、少なくとも、微粒子と、親水性モノマー（或いは、疎水性成分及び親水性成分のモノマー）と、を混合し架橋反応させて製造する方法が挙げられる。
具体的には、微粒子、親水性成分のモノマー（或いは、疎水性成分及び親水性成分のモノマー）、架橋剤、及び溶媒を均一に分散、混合した後に重合して製造する方法である。
【００４３】
また、少なくとも、微粒子と、疎水性成分及び親水性成分を含む共重合体と、を混合し架橋させる方法が挙げられる。
具体的には、初めに、疎水性成分及び親水性成分のモノマーを用いて高分子ゲルの主鎖を構成する共重合体を合成し、この共重合体に微粒子を均一に分散、混合した後に架橋することにより製造する方法である。
【００４４】
さらに、少なくとも、微粒子と、疎水性成分及び親水性成分を有する共重合体と、を混合して分散溶液を調製し、該分散溶液を分散媒に添加し懸濁させて、架橋させることにより製造する方法が挙げられる。
【００４５】
粒子等の形状を有する微粒子含有高分子ゲルを製造するには、乳化法、懸濁法、分散法、機械的粉砕法などの方法を併用し粒子などの形状に加工することも可能である。
【００４６】
高分子ゲルにおける酸基やイオン性基といった親水性成分の含有量としては、０．０１ｍｏｌ％〜３０ｍｏｌ％が好ましく、０．０５ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％がより好ましい。
また、高分子ゲルが前記生物由来成分を含む場合の含有量は、目的に応じて適宜決定されるが、高分子ゲルの乾燥重量に対して、０．００１質量％〜２質量％の範囲で含有されることが好ましく、０．００５質量％〜１質量％の範囲で含有されることがより好ましい。
【００４７】
高分子ゲルにおける疎水基の含有量としては、０．１ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％の範囲である。疎水性基の含有量が０．１ｍｏｌ％以下では細胞の足場となり得ない場合がある。一方、５０ｍｏｌ％以上ではゲルの吸液量が低下するとともに細胞接着が強固となり所望の特性が発現しない場合がある。
【００４８】
また、上記共重合体の種類としては、ブロック型、ランダム型及びグラフト型のいずれであってもよい。
共重合体の分子量としては重量平均分子量で１０００以上が好ましく、より好ましくは重量平均分子量で３０００以上である。共重合体の分子量があまりにも小さい場合、架橋しても高分子ゲルにならなかったり、高分子ゲルとなっても所望の特性が得られない場合がある。
また、重量平均分子量の上限は、微粒子の分散に問題がないかぎり限定されない。つまりは、分散装置の性能と分散溶液粘度によって満足な分散状態を得られる範囲内で重量平均分子量を高くすることができる。
【００４９】
共重合体の架橋方法としては、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩） 等のカルボジイミド類、デナコール（商品名）等の多官能エポキシ、多官能イソシアネート等の架橋剤を用いたり、γ線、Ｘ線、電子線等の活性光線、ラジカルを発生させる開始剤を用いることができる。
【００５０】
重合時において微粒子を添加する場合には、重合性基や不対電子（ラジカル）を有する微粒子を使用し、高分子ゲルに対して化学結合させることも好ましい。また、微粒子は、高分子ゲル中に極力均一に分散されていることが望ましい。
微粒子を均一に分散するには、機械的混練法、攪拌法や超音波分散法を用い、適宜、分散剤などを利用することが好ましい。
【００５１】
［細胞培養方法］
次に、本発明の微粒子含有高分子ゲルからなる細胞培養基材を用いた細胞培養方法について説明する。
本発明の細胞培養方法としては、以下の方法を挙げることができる。
（１）前記本発明の細胞培養基材を敷き詰めた培養皿上で、細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。この方法によれば、２次元組織体を形成し、かつ簡便に分離・回収することができる。
（２）前記本発明の細胞培養基材からなる集合体中で、細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。この方法によれば、３次元組織体を形成し、かつ簡便に分離・回収することができる。
これらの方法に適用される微粒子含有高分子ゲルとしては、粒子形状のものであることが好ましい。
【００５２】
上記（１）の方法について具体的に説明する。
２次元組織体を形成し、その組織を回収するには、培養皿上に本発明の微粒子含有高分子ゲル粒子を敷き詰めその上で通常の細胞培養を行う。充分に細胞が増殖したのを確認した後、大量の培養液を添加し、培養皿をシェイクしていると培養皿から微粒子含有高分子ゲル粒子と２次元組織体が剥がれてくる。ピペットなどで微粒子含有高分子ゲル粒子に培養液を吹きかけていると微粒子含有高分子ゲル粒子と２次元組織体が分離してくるので２次元組織体だけを回収する。あるいは微粒子含有高分子ゲル粒子と２次元組織体とを回収し、接着性のない培養用フラスコ中で攪拌していると、微粒子含有高分子ゲル粒子と２次元組織体とが分離してくるので２次元組織体だけを回収する。
この方法で、微粒子含有高分子ゲル粒子と２次元組織体とを分離回収するために添加する液体は、特に培養液である必要はなく、細胞組織体に悪影響を与えない液体であれば、如何なる液体でも使用できる。
また、この方法において用いられる微粒子含有高分子ゲル粒子径は、培養する細胞の大きさと同等以下の微粒子含有高分子ゲル粒子を用いるのが好ましい。微粒子含有高分子ゲル粒子の粒径が大きいと増殖性、剥離性が不良になる傾向がある。
【００５３】
上記（２）の方法について具体的に説明する。
３次元組織体を形成し、その組織を回収するには、従来の細胞培養に用いられている培養皿に本発明の微粒子含有高分子ゲル粒子からなる細胞培養基材を積層し、その積層された微粒子含有高分子ゲル粒子の集合体中で、通常の細胞培養を行う。充分に細胞が増殖したのを確認した後、大量の培養液を添加し余分な微粒子含有高分子ゲル粒子を取り除いた後、接着性のない培養用フラスコ中で攪拌していると微粒子含有高分子ゲル粒子と３次元組織体が分離してくるので３次元組織体だけを回収する。
この方法において、微粒子含有高分子ゲル粒子と３次元組織体とを分離回収するために添加する液体は、特に培養液である必要はなく、細胞組織体に悪影響を与えない液体であれば、如何なる液体でも使用できる。また、３次元組織体を培養するためには、栄養の供給、老廃物の除去が重要となるため、集合体中での微粒子含有高分子ゲル粒子以外の空間（非占有空間）が必要となる。
上記非占有空間としては、個々の大きさが０．１〜１０μｍの範囲であることが好ましい。このような大きさの非占有空間を形成しうるものであれば、微粒子含有高分子ゲルの粒子経は特に限定されないが、ゲル粒子内における栄養分や老廃物の拡散等を考慮すると、上記（２）の方法における微粒子含有高分子ゲル粒子径としては１ｍｍ以下であることが好ましい。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
＜微粒子含有高分子ゲル粒子１の調製＞
微粒子を含有した感熱型（高温膨潤型）高分子ゲルの粒子を以下のようなプロセスにより製造した。
アクリルアミド８ｇ、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミド１．０ｍｇ、過硫酸アンモニウム０．００４ｇ、ポリスチレン微粒子３．５ｇに蒸留水０．５７５ｇ、を攪拌混合した水溶液を調製した。
ソルビトール系界面活性剤（ＳＯ−１５Ｒ：ニッコーケミカル（株）製）３．９ｇをシクロヘキサン３００ｍｌに溶解した溶液を窒素置換された反応容器に加え、これに、先に調製した水溶液を添加し、回転式攪拌羽根を用いて１２００ｒｐｍで３０分攪拌して懸濁させた後、６０℃に加熱して６時間、重合を行った。
得られた微粒子含有高分子ゲル粒子を、蒸留水による膨潤、アセトンによる収縮を繰り返し、精製した。得られた粒子を、メッシュを用いて篩分することで、膨潤時の平均粒径が約３０μｍの微粒子含有高分子ゲル粒子１を得た。
【００５６】
＜微粒子含有高分子ゲル粒子２の調製＞
重合容器内に、アクリルアミド５．４４ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート０．７ｇと、アリルアミン塩酸塩０．１ｇとをジメチルスルホキシド３６ｍｌに投入し、これを窒素置換した後にアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．０１５ｇを添加し、６０℃、２０時間、重合を行った。生成したポリマーは、メタノール再沈し、ろ過後、大量のメタノールで洗浄し乾燥して、目的のアクリルアミド−ｎ−ブチルメタクリレート−アリルアミン塩酸塩共重合体を６ｇ得た。
ゲルパーミエーション（ＧＰＣ）の測定結果から得られた共重合体の重量平均分子量は約５．２万であった。また、元素分析結果をもとに計算から共重合率はほぼ仕込み比と同等であった。
【００５７】
合成したアクリルアミド−ｎ−ブチルメタクリレート−アリルアミン塩酸塩共重合体６ｇを、蒸留水１２．６ｍｌに溶解した後、含有する微粒子としてシリカ分散液（日産化学工業（株）社製、濃度３０質量％）８．６ｇを添加し、分散させた後、デナコールＥＸ−８１０（ナガセ化成工業（株）社製のエチレングリコールジグリシジルエーテル）を０．４ｇ添加し、反応溶液を作製した。
反応溶液を、ソルビトール系界面活性剤（ＳＯ−１５Ｒ：ニッコーケミカル（株）製）１６ｇをｎ−ヘキサン２リットルに溶解した溶液に加え、ウルトラトラックスを用いて５０００ｒｐｍで１０分間攪拌して安定した懸濁状態を得た後、懸濁液を６０℃に昇温し３００ｒｐｍで攪拌しながら６時間反応させ微粒子含有高分子ゲル粒子を得た。
得られた微粒子含有高分子ゲル粒子は、蒸留水による膨潤、アセトンによる収縮を繰り返し、精製した。得られた粒子をメッシュを用いて篩分することで、膨潤時の平均粒径が約３０μｍの微粒子含有高分子ゲル粒子２を得た。
【００５８】
＜微粒子含有高分子ゲル粒子３の調製＞
実施例１において、微粒子含有高分子ゲル粒子を作製する反応溶液中に、コラーゲン０．６ｇを添加した以外は実施例１と同様にして、膨潤時の体積平均粒径が約３０μｍの微粒子含有高分子ゲル粒子（３）を得た。
【００５９】
＜微粒子含有高分子ゲル粒子４の調製＞
重合容器内に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド６．６８ｇと、アクリロイルスクシンイミド１．３２ｇと、をジメチルスルホキシド３６ｍｌに投入し、これを窒素置換した後にアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．０１５ｇを添加し、６０℃、２０時間、重合を行った。生成したポリマーは、ジエチルエーテル再沈し、ろ過後、大量のジエチルエーテルで洗浄し乾燥して目的のＮ−イソプロピルアクリルアミド−アクリロイルスクシンイミド共重合体を７．８ｇ得た。
ゲルパーミエーション（ＧＰＣ）の測定結果から得られた共重合体の重量平均分子量は約４万であった。また、元素分析結果をもとに計算から共重合率はほぼ仕込み比と同等であった。
【００６０】
合成したＮ−イソプロピルアクリルアミド−アクリロイルスクシンイミド共重合体６ｇとアミンＰＥＯ６０００（川研ファインケミカル社製 両末端に一級アミノ基を有するポリエチレンオキサイド）３ｇとをジメチルスルホキシド６０ｍｌに溶解した。その後、含有する微粒子としてポリスチレン微粒子３．９ｇを添加し、分散させた後ソルビトール系界面活性剤（ＳＯ−１５Ｒ：ニッコーケミカル（株）製）１６ｇを流動パラフィン２リットルに溶解した溶液に加え、ウルトラトラックスを用いて５０００ｒｐｍで１０分間攪拌して安定した懸濁状態を得た後、懸濁液を６０℃に昇温し３００ｒｐｍで攪拌しながら６時間反応させ微粒子含有高分子ゲル粒子を得た。
得られた微粒子含有高分子ゲル粒子は、蒸留水で透析を行い精製した。得られた粒子をメッシュを用いて篩分することで、膨潤時の平均粒径が約３０μｍの微粒子含有高分子ゲル粒子４を得た。
【００６１】
＜比較粒子１の調製＞
逆相懸濁重合法を用いてポリアクリルアミドゲル粒子を作製した。得られた粒子をメッシュを用いて篩分することで、膨潤時の平均粒径が約３０μｍの親水性高分子ゲル粒子（比較粒子１）を得た。
【００６２】
＜比較粒子２の調製＞
比較粒子２としては、平均粒径が約３０μｍの市販ポリスチレン粒子（株式会社モリテック製）を用いた。
【００６３】
（実施例１）
＜２次元組織体の培養＞
ヒト真皮由来の線維芽細胞をダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ．１０％牛胎児血清含有、ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、最終細胞濃度が約２×１０５細胞／ｍｌになるように細胞分散液を調製し、培養溶液で膨潤している上記で作製した微粒子含有高分子ゲル粒子１、２、３、及び４をそれぞれ敷き詰めた疎水性培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ １００８、日本ベクトン・ディッキンソン製）に細胞分散液を２ｍｌずつ注入した。これを素早く３７℃の炭酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス）内に移し培養した。
なお、コントロール（照査実験）として、微粒子含有高分子ゲル粒子を敷き詰めていない疎水性培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ １００８、日本ベクトン・ディッキンソン製）でも同様の条件下で培養した。
【００６４】
１日間培養後、大量の培養液を添加し、振とう装置で培養皿をシェイクすると、２次元組織体と微粒子含有高分子ゲル粒子が分離し、２次元組織体が回収できた。特に微粒子含有高分子ゲル粒子４は振とう装置で培養皿を振とう攪拌する温度を２５℃程度にすることで疎水性部位が親水性部位へ変化し、より容易に回収することができた。疎水性培養ディッシュからは回収できなかった。
【００６５】
得られた２次元組織体を集め、トリプシンで処理した後、位相差顕微鏡（ＯＰＴＩＰＨＯＴ２−ＰＯＬ、ニコン社製）を用いて細胞の数を測定した。疎水性培養ディッシュから離脱しなかった細胞の数も同様の手法で数を測定した比較した結果、どの培養細胞数も同等であった。
この結果は、用いた微粒子含有高分子ゲル粒子１、２、３、及び４は、細胞増殖に必要な良好な足場を提供していることを示している。また、回収された２次元組織体に接着して残存している粒子は確認されなかった。
【００６６】
（実施例２）
＜３次元組織体の培養＞
コラゲナーゼ消化法によりウシ胸部大動脈から採取した内皮細胞（ＥＣ）を、ＦＢＳ１５％、ペニシリン５０ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌおよびアンホテリシンＢ２．５μｇ／ｍｌを補充したＤＭＥＭ中で、３７℃の炭酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス）内に移し培養した。最終細胞濃度が１×１０５細胞／ｍｌになるように細胞分散液を調製した。
その細胞分散液１ｍｌを疎水性培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ １００８、日本ベクトン・ディッキンソン製）中に積層されている微粒子含有高分子ゲル粒子１、２、３、４がそれぞれ固形分４ｗｔ％に調整した集合体中に添加し、これを素早く３７℃の炭酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス）内に移し培養した。
コントロール（照査実験）として、微粒子含有高分子ゲル粒子がない疎水性培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ １００８、日本ベクトン・ディッキンソン製）でも同様の条件下で培養した。
【００６７】
１日間培養後、大量の培養液を添加し、振とう装置で培養皿を振とう攪拌して３次元組織体だけを回収した。特に微粒子含有高分子ゲル粒子４は振とう装置で培養皿を振とう攪拌する温度を２５℃程度にすることでゲル粒子中の疎水性部位が親水性部位へ変化し、より容易に回収することができた。
【００６８】
得られた３次元組織体を集め、トリプシンで処理した後、位相差顕微鏡（ＯＰＴＩＰＨＯＴ２−ＰＯＬ、ニコン社製）を用いて細胞の数を測定した。疎水性培養ディッシュから離脱しなかった細胞の数も同様の手法で数を測定した比較した。
その結果、いずれの微粒子含有高分子ゲル粒子集合体中で培養された細胞数についても、疎水性培養ディッシュから離脱しなかった細胞の細胞数より２倍以上多かった。また、接着して残存している粒子は確認されなかった。
【００６９】
（比較例１）
実施例１に用いた微粒子含有高分子ゲル粒子を、比較粒子１に変更して、同様の評価を行った。
その結果、本比較例においては、充分に細胞増殖しなかったため２次元組織体として回収できなかった。また、細胞数は培養前の調整細胞数と比べ増殖はしていたが、疎水性培養ディッシュから離脱しなかった細胞の細胞数より少なかった。このことは、比較粒子１を構成する親水性高分子ゲルにおいては、細胞増殖に必要な良好な足場がないためであると考えられる。
【００７０】
（比較例２）
実施例１に用いた微粒子含有高分子ゲル粒子を、比較粒子２に変更して、同様の評価を行った。
その結果、比較粒子２は疎水性粒子であるため、細胞増殖に必要な良好な足場になるため増殖が良好であり、振とう装置で培養皿を振とう攪拌することにより培養ディッシュから２次元組織体を回収できたが、比較粒子と２次元組織体とが強固に接着しており、これらを分離することができなかった。
【００７１】
（比較例３）
実施例２に用いた微粒子含有高分子ゲル粒子を比較粒子１に変更して、同様の評価を行った。その結果、本比較例においては、上記比較例１と同様に、充分に細胞増殖しておらず、３次元組織体を回収できなかった。
【００７２】
（比較例４）
実施例３に用いた微粒子含有高分子ゲル粒子を比較粒子２にして、同様の評価を行った。その結果、比較粒子２は疎水性粒子であるため、細胞増殖に必要な良好な足場になるため増殖が良好であり、振とう装置で培養皿を振とう攪拌することにより培養ディッシュから粒子を含む３次元組織体として回収できた。しかし、比較粒子２と３次元組織体とが強固に接着しており、これらを分離することができなかった。
【００７３】
【発明の効果】
本発明によれば、細胞培養を行うに際しての、細胞の足場となる細胞接着面、栄養の供給、及び老廃物の除去ルートを有しており、かつ形成された２次元又は３次元組織体を簡便に回収できる細胞培養基材、該細胞培養基材の製造方法、並びに、該細胞培養基材を用いた細胞培養方法を提供することにある。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a cell culture substrate, a production method thereof, and a cell culture method. More specifically, a cell culture substrate capable of forming a two-dimensional or three-dimensional tissue body by cell culture, and further capable of easily recovering the cultured tissue, a method for producing the same, and a cell culture method using the cell culture substrate About.
[0002]
[Prior art]
Cell culture techniques are being researched and applied in fields such as 1) production of cell products, 2) prosthetic materials for living lesions and defects, and 3) simulators for evaluating drug toxicity and pharmacological activity.
Today, animal cells used for cell culture are classified into two types. That is, an adhesion-independent cell and an anchorage-dependent cell. The former adhesion-independent cells are cells that normally express cell functions such as survival, proliferation, and substance production ability even in the absence of a substrate that is a cell scaffold. Typical examples include hybridomas formed from myeloma cells, lymphoma cells, and the like. On the other hand, the latter adhesion-dependent cells are cells that are not normally expressed without the presence of a substrate in which cell functions such as survival, proliferation, and substance production are the scaffolds of the cells. Most normal diploid cells, including primary cultured cells, are adhesion-dependent. Many established cell lines that can grow indefinitely are known to exhibit adhesion dependence. For example, establishment of production of useful cell products such as cytokines such as interferon and interleukin, erythropoietin, colony stimulating factor, various growth hormones such as thrombopoietin, tissue plasminogen activator, vaccine, etc. Many cell lines are known to exhibit adhesion dependence.
[0003]
Conventionally, cell culture has been performed on a glass surface or a surface of a synthetic polymer material subjected to various treatments. As an example, polystyrene having various surface treatments (for example, plasma treatment, corona treatment, etc.) or those coated with cell adhesive proteins such as collagen, fibronectin, polylysine, etc. Containers are prevalent as cell culture substrates.
[0004]
In addition, regarding the interaction between the cell and the cell culture substrate, it is known that the cell is influenced not only by the chemical properties of the substrate surface but also by the fine shape. Therefore, cell adhesion surface size control using micro-pattern technology used in the semiconductor industry, introduction of micro-groove structures into the culture substrate, and production of micro irregularities by microspheres are carried out as a cell culture substrate. Has been produced. However, the surface setting using these micropattern technologies requires a very advanced technology, and currently has many problems such as incapability of mass production and high cost.
[0005]
The cells cultured and grown using the cell culture substrate as described above are conventionally peeled off and recovered from the substrate surface by treatment with a proteolytic enzyme such as trypsin or a chemical such as EDTA. It was. However, when cells are collected by such means, the treatment process becomes complicated, the possibility of contamination is increased, and the grown cells are denatured by the treatment, and the original function of the cells is impaired. , Etc. have been pointed out.
[0006]
In order to eliminate these drawbacks, treatment with proteolytic enzymes such as trypsin or chemicals such as EDTA is not required. A cell culture support material that can be peeled off and collected and a method for producing the same have been proposed (see, for example, Patent Documents 1 to 4). As a cell culture substrate in such a technique, polyisopropylacrylamide (hereinafter abbreviated as PNIPAM) is used.
[0007]
PNIPAM is a temperature-sensitive polymer having a lower critical point temperature (LCST) of 31 ° C. in an aqueous solution. Specifically, at a temperature below the critical point temperature, the molecular surface exhibits hydrophilicity or water solubility and dissolves in water, but at a temperature above the critical point temperature, the molecular surface exhibits hydrophobicity, so that it precipitates in water. A polymer having temperature-sensitive phase separation characteristics. In addition, in a temperature environment higher than the critical point temperature, the surface has hydrophobicity and expresses adhesion to cells. That is, if the PNIPAM layer is brought to a temperature lower than the critical point temperature in the culture solution after cell culture, the surface of the PNIPAM layer becomes hydrophilic and the cells cannot adhere, and the PNIPAM layer dissolves in water. As a result, the cultured cell layer is detached from the surface of the culture dish and collected. However, this method has a problem that it is not easy to wash the polymer.
[0008]
In addition, in order to culture cells and form a three-dimensional tissue, a synthetic polymer such as gel or poly (2-hydroxyethyl methacrylate) using a natural polymer material such as collagen, alginic acid, or agarose. Cell culture has been performed on the inside of a gel using a molecular material or a base material formed into a sponge shape. For example, a method of recovering by culturing using an alginate gel and adding a calcium chelate agent is shown (for example, refer to Patent Document 5).
In addition, in many conventional methods, in order to recover the cultured cells, the cells are treated with a proteolytic enzyme such as trypsin or a chemical such as EDTA, so that the original functions of the cells are impaired. It has been pointed out.
[0009]
In order to eliminate these drawbacks, a method of culturing and recovering cells using a hydrogel that undergoes a sol-gel transition with a change in temperature has been shown (see, for example, Patent Documents 6 to 13). However, since this method performs cell culture inside the gel, in order to form a three-dimensional tissue body, supply of nutrients by diffusion and removal of waste products are problematic, and the gel must be in a sol state when the medium is changed. There are problems such as complicated processes and the difficulty of washing the polymer.
[0010]
[Patent Document 1]
JP-A-2-21865
[Patent Document 2]
JP-A-4-278083
[Patent Document 3]
JP-A-9-23876
[Patent Document 4]
Japanese Patent Laid-Open No. 11-34943
[Patent Document 5]
JP-A-10-248557
[Patent Document 6]
Japanese Patent Application No. 4-16114
[Patent Document 7]
Japanese Patent Application No. 5-18697
[Patent Document 8]
Japanese Patent Application No. 7-187902
[Patent Document 9]
Japanese Patent Application No. 7-187903
[Patent Document 10]
JP-A-9-12651
[Patent Document 11]
Japanese Patent Laid-Open No. 9-12552
[Patent Document 12]
JP 2002-18270 A
[Patent Document 13]
JP 2001-329183 A
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide a cell adhesion surface, a nutrient supply, and a waste removal route for cell scaffolding when cell culture is performed, and to easily form a formed two-dimensional or three-dimensional tissue. It is an object of the present invention to provide a cell culture substrate that can be collected in a continuous manner, a method for producing the cell culture substrate, and a cell culture method using the cell culture substrate.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
Means for solving the above problems are as follows.
<1> A cell culture substrate comprising a fine particle-containing hydrophilic polymer gel containing at least fine particles and a hydrophilic component.
<2> A cell culture substrate comprising a fine particle-containing polymer gel containing at least fine particles, a hydrophobic component, and a hydrophilic component.
[0013]
<3> The cell culture substrate according to <2>, wherein the hydrophilic component includes an anionic component or a cationic component.
<4> The cell culture substrate according to any one of <1> to <3>, wherein the hydrophilic component includes a biological component.
<5> The cell culture substrate according to any one of <1> to <4>, comprising a thermosensitive polymer component.
[0014]
<6> The cell culture substrate according to any one of <1> to <5>, wherein the fine particles are an inorganic material.
<7> The cell culture substrate according to any one of <1> to <5>, wherein the fine particles are an organic material.
<8> The cell culture substrate according to any one of <1> to <5>, wherein the fine particles are a metal material.
<9> The cell culture substrate according to any one of <1> to <8>, wherein the concentration of the fine particles is in the range of 3 to 90% by mass.
[0015]
<10> A cell culture method comprising culturing cells on a culture dish on which the cell culture substrate according to any one of <1> to <9> is spread.
<11> A cell culture method comprising culturing cells in an assembly comprising the cell culture substrate according to any one of <1> to <9>.
[0016]
<12> A method for producing a cell culture substrate comprising a fine particle-containing hydrophilic polymer gel, wherein at least fine particles and a hydrophilic monomer are mixed and subjected to a crosslinking reaction.
<13> A method for producing a cell culture substrate comprising a polymer gel containing fine particles, wherein at least fine particles, a hydrophobic monomer, and a hydrophilic monomer are mixed and subjected to a crosslinking reaction.
<14> A method for producing a cell culture substrate comprising a polymer gel containing fine particles, wherein at least fine particles and a copolymer containing a hydrophobic component and a hydrophilic component are mixed and crosslinked.
<15> At least fine particles and a copolymer having a hydrophobic component and a hydrophilic component are mixed to prepare a dispersion solution, and the dispersion solution is added to a dispersion medium to be suspended and crosslinked. This is a method for producing a cell culture substrate comprising a polymer particle containing fine particles.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the cell culture substrate, the production method thereof, and the cell culture method of the present invention will be described in detail.
[0018]
[Cell culture substrate]
The first aspect of the cell culture substrate of the present invention is characterized by comprising a fine particle-containing hydrophilic polymer gel containing at least fine particles and a hydrophilic component.
The second aspect of the cell culture substrate of the present invention is characterized by comprising a fine particle-containing polymer gel containing at least fine particles, a hydrophobic component, and a hydrophilic component.
[0019]
Here, the fine particle-containing hydrophilic polymer gel in the first aspect may include at least fine particles and a hydrophilic component, and the polymer gel exhibits hydrophilicity as a whole. The cell culture substrate of the present invention requires the presence of a hydrophobic portion that can serve as a scaffold (adhesive surface) for cells cultured during cell culture, but the fine particle-containing polymer gel is composed only of hydrophilic components. In this case, the hydrophobic portion can be obtained by using hydrophobic fine particles.
[0020]
The cell culture substrate of the present invention, which has the above-described configuration, can provide a cell adhesion surface that serves as a scaffold for cells during cell culture, and can be cultured due to the presence of fine particles contained in the polymer gel. The diffusion rate of necessary nutrients and waste products generated during culture increases, and a cultured tissue (two-dimensional tissue or three-dimensional tissue) can be efficiently formed. Further, the presence of fine particles in the polymer gel allows the tissue body after culture to be separated and collected from the base material simply and quickly without complicated steps.
[0021]
[Polymer-containing polymer gel]
The fine particle-containing polymer gel constituting the cell culture substrate of the present invention will be described.
The fine particle-containing polymer gel according to the first aspect of the present invention is a fine particle-containing hydrophilic polymer gel containing fine particles and a hydrophilic component.
The fine particle-containing polymer gel in the second aspect is a fine particle-containing polymer gel containing fine particles, a hydrophilic component, and a hydrophobic component.
Hereinafter, each component constituting the fine particle-containing polymer gel in the present invention (hereinafter, appropriately referred to as “polymer gel”) will be described.
[0022]
<Fine particles>
The fine particles will be described.
As the fine particles in the present invention, fine particles made of an inorganic material, an organic material, and a metal material can be used.
[0023]
Specific examples of fine particles (inorganic fine particles) made of an inorganic material include iron oxide, magnetic materials such as ferrite and barium compounds, zinc oxide, basic lead carbonate, basic lead sulfate, lead sulfate, lithobon, muscovite, Phlogopite, phlogopite, biotite, lithia mica, zinc sulfide, titanium oxide, antimony oxide, lead white, zirconium oxide, alumina, micanite, micalex, quartz, calcium carbonate, gypsum, clay, silica, silicic acid, silica Magnesium silicate, calcium silicate, aluminum silicate, barium silicate, silicon earth, talc, kaolin, sericite, permiculite, basic magnesium carbonate, alumina white, gloss white, satin white, barium sulfate, strontium silicate, hydroxyapatite , Zeolite, boron nitride, ceramic powder, etc. It is.
[0024]
Specific examples of fine particles (organic fine particles) made of organic materials include phenol resin, furan resin, xylene / formaldehyde resin, urea resin, melamine resin, aniline resin, alkyd resin, unsaturated polyester, epoxy resin, polyethylene, polypropylene, polystyrene , Poly-p-xylylene, polyvinyl acetate, acrylic resin, methacrylic resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, fluoroplastic, polyacrylonitrile, polyvinyl ether, polyvinyl ketone, polyether, polycarbonate, thermoplastic polyester, polyamide, diene Plastic, polyurethane plastic, polyphenylene, polyphenylene oxide, polysulfone, aromatic heterocyclic polymer, silicone, natural rubber plastic, cell Mixed material (polymer blend) polymeric materials such as over scan-based plastic, or the like, or two or more polymeric materials, and the like.
[0025]
Specific examples of fine particles (metal fine particles) made of metal materials include zinc, alumel, antimony, aluminum, aluminum alloys, iridium, indium, osmium, chromium, chromel, cobalt, zirconium, stainless steel, gold, silver, foreign silver, copper , Bronze, tin, tungsten, tungsten steel, iron, lead, nickel, nickel alloy, nickelel, platinum, platinum rhodium, tantalum, duralumin, nichrome, titanium, krupp austenitic steel, constantan, brass, platinum iridium, palladium, palladium alloy , Molybdenum, molybdenum steel, manganese, manganese alloys, rhodium, rhodium gold, and the like.
[0026]
The fine particles described above may be used alone or in combination of two or more. The fine particles can be appropriately selected depending on the application. For example, from the viewpoint of ease of observation under a microscope, it is preferable to use non-colored and light-transmitting fine particles such as silica fine particles and organic fine particles such as polystyrene. From the viewpoint of easily and efficiently separating and recovering the cultured tissue from the culture substrate, it is preferable to use magnetic fine particles.
[0027]
The particle diameter of the fine particles in the present invention is preferably 0.001 μm to 5 μm in terms of average particle diameter of primary particles. From the viewpoint of cell adhesion surface serving as a cell scaffold, diffusion of nutrients necessary for culture and waste products generated during the culture, those of 0.01 μm to 0.5 μm are particularly preferable.
Moreover, as specific gravity of microparticles | fine-particles, from viewpoints, such as isolation | separation and collection | recovery of the tissue body after culture | cultivation, 1.001-10 are preferable and 1.005-5 are more preferable.
[0028]
The content of fine particles in the polymer gel is generally selected from the range of 0.1 to 90% by mass. In particular, from the viewpoint of quickly and efficiently penetrating and diffusing the solution into / outside the gel particles, the concentration is preferably in the range of 3 to 90 mass%, more preferably 5 to 80 mass%.
[0029]
<Hydrophilic component>
As a hydrophilic component, each hydrophilic component of a nonionic component, an anion component, and a cation component can be used.
In the present invention, the hydrophilic component preferably contains an anionic component or a cationic component from the viewpoint of sufficiently securing a cell scaffold (cell adhesion surface) and efficiently performing cell culture. Both an anionic component and a cationic component may be included.
However, it is known that introduction of a large amount of charge is toxic to cells, and it is necessary to achieve an appropriate charge density. For example, in the case of a microcarrier into which a positive charge is introduced, it is known that about 2.0 (meq / gm) is appropriate (DW Levin, et al., Biotechnol. Bioeng. 21, 821, 1979). It has been. Therefore, the introduction amount of the anionic component and the cationic component is appropriately determined within a range where there is no cytotoxicity.
[0030]
In the present invention, an anionic component means a component having an acid group such as a carboxylic acid group, a sulfonic acid group, a sulfuric acid group, or a phosphoric acid group, and a salt thereof. Moreover, a cation component means the component which has ionic groups, such as an amino group and a quaternary amino group.
[0031]
Each of these components can be synthesized using the following monomers.
Examples of the hydrophilic monomer used as the nonionic component include N-vinylpyrrolidone, vinylpyridine, acrylamide, methacrylamide, N-methylacrylamide, hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, hydroxymethyl methacrylate, hydroxymethyl acrylate, and the like. It is done.
[0032]
Specific examples of the monomer having an acid group or a salt thereof include (meth) acrylic acid or a salt thereof; maleic acid or a salt thereof; fumaric acid or a salt thereof; itaconic acid or a salt thereof; crotonic acid or a salt thereof; Or its salt; Vinylbenzenesulfonic acid or its salt; Acrylamide alkylsulfonic acid or its salt like 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid; 2-acryloylethanesulfonic acid, 2-acryloylpropanesulfonic acid, 2-methacryl And (meth) acryloylalkylsulfonic acid or a salt thereof such as irethanesulfonic acid.
[0033]
On the other hand, specific examples of the monomer having an ionic group such as an amino group or a quaternary amino group include dimethylaminopropyl (meth) acrylamide and a quaternized product thereof; diethylaminopropyl (meth) acrylamide and a quaternized product thereof; dimethylamino Examples thereof include ethyl (meth) acrylate and quaternized products thereof; diethylaminoethyl (meth) acrylate and quaternized products thereof.
[0034]
<Hydrophobic component>
The hydrophobic component is preferably composed of a monomer having a hydrophobic group. Examples of the monomer having a hydrophobic group include styrene derivatives such as styrene, methyl styrene, dimethyl styrene, trimethyl styrene, ethyl styrene, diethyl styrene, triethyl styrene, propyl styrene, butyl styrene, hexyl styrene, heptyl styrene, octyl styrene; (Meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, n-butyl (meth) acrylate, isobutyl (meth) acrylate, t-butyl (meth) acrylate, isobornyl (meth) acrylate, octyl (meth) acrylate, stearyl (meth) acrylate, (Meth) acrylic acid ester derivatives such as 2-ethylhexyl (meth) acrylate; fluorinated alkyl (meth) acrylates; and the like. Since these are representative material examples, they are not limited thereto. Moreover, you may use multiple types of said each monomer.
[0035]
In the present specification, the description “(meth) acrylamide” means that both “(meth) acrylamide” and “acrylamide” are included.
[0036]
Moreover, in this invention, it is preferable that a biological origin component is included as a hydrophilic component from a viewpoint of ensuring sufficient cell scaffold (cell adhesion surface) and performing cell culture efficiently.
Examples of biological components include collagen, gelatin, casein, albumin, myosin, fibrinogen, fibrin, keratin, γ-globulin, laminin, fibronectin, methylcellulose, dextran, and other proteins, glycoproteins, polypeptides, polysaccharides, etc. . It is not limited to these. As an aspect of inclusion of the biological component in the polymer gel, an aspect of being contained in the polymer gel in a released state or an aspect of being fixed to the polymer gel may be employed.
[0037]
The polymer gel in the present invention preferably contains a temperature-sensitive polymer component.
As the thermosensitive polymer component applied to the present invention, those that exhibit hydrophobicity at a cell culture temperature (usually about 37 ° C.) and exhibit hydrophilicity at a temperature at the time of recovery of the cultured tissue are preferable. . The temperature at which the thermosensitive polymer changes from hydrophobic to hydrophilic is not particularly limited, but is lower than the cell culture temperature from the viewpoint of ease of recovery of the tissue body after culture. It is preferable.
By including such a temperature-sensitive polymer component, a cell scaffold (cell adhesion surface) is sufficiently ensured during cell culture, so that cell culture can be performed efficiently. On the other hand, at the time of recovery of the cultured tissue, the hydrophobic part is changed to hydrophilic, and the cultured tissue is separated from the cell culture substrate, thereby making it easier to recover the tissue. can do.
[0038]
Specific examples of the thermosensitive polymer component include poly [N-alkyl-substituted (meth) acrylamide] such as poly [N-isopropylacrylamide]; N-alkyl-substituted (meth) acrylamide and (meth) acrylic acid, (meth ) Copolymers with at least one selected from acrylamide, alkyl (meth) acrylate, hydroxyalkyl ester (meth) acrylate; alkyl-substituted cellulose derivatives such as polyvinyl methyl ether, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, etc. A polyalkylene oxide block copolymer represented by a block copolymer of polypropylene oxide and polyethylene oxide and the like; a polyalkylene oxide block copolymer; and the like. In the present invention, these components are appropriately selected according to the purpose.
[0039]
The form of the fine particle-containing polymer gel in the present invention is not particularly limited, and various forms such as a particulate form, a block form, an indeterminate form, and a fibrous form are applicable. Among these, the particulate form is preferable because it is easy to produce fine irregularities and it is easy to control the unoccupied space when an aggregate such as a laminate is formed. There is no particular limitation on the form of particles, but spheres, ellipsoids, polyhedra, stars, and the like can be applied.
[0040]
In addition, the particle size when the fine particle-containing polymer gel is in a particulate form is preferably about 0.001 mm to 1 mm, and preferably about 0.005 mm to 0.3 mm from the viewpoint of cell culture efficiency and cell recovery. Is more preferable.
[0041]
[Method for Producing Cell Culture Substrate Containing Microparticle-Containing Polymer Gel]
Next, a preferred method for producing a cell culture substrate from the fine particle-containing polymer gel of the present invention will be described.
[0042]
As a method for producing the polymer gel containing fine particles constituting the cell culture substrate of the present invention, at least fine particles and a hydrophilic monomer (or a monomer of a hydrophobic component and a hydrophilic component) are mixed and subjected to a crosslinking reaction. And manufacturing method.
Specifically, it is a method in which fine particles, a monomer of a hydrophilic component (or a monomer of a hydrophobic component and a hydrophilic component), a crosslinking agent, and a solvent are uniformly dispersed and mixed, followed by polymerization.
[0043]
Further, there is a method of mixing and crosslinking at least fine particles and a copolymer containing a hydrophobic component and a hydrophilic component.
Specifically, first, a copolymer constituting the main chain of the polymer gel is synthesized using the monomers of the hydrophobic component and the hydrophilic component, and the fine particles are uniformly dispersed and mixed in the copolymer. It is a method of manufacturing by crosslinking.
[0044]
Furthermore, at least fine particles and a copolymer having a hydrophobic component and a hydrophilic component are mixed to prepare a dispersion solution, and the dispersion solution is added to a dispersion medium, suspended, and crosslinked. The method of doing is mentioned.
[0045]
In order to produce a fine particle-containing polymer gel having a shape such as particles, it is also possible to use a method such as an emulsification method, a suspension method, a dispersion method, or a mechanical pulverization method to process the particles into a shape such as particles.
[0046]
The content of hydrophilic components such as acid groups and ionic groups in the polymer gel is preferably 0.01 mol% to 30 mol%, more preferably 0.05 mol% to 10 mol%.
Moreover, although content when a polymer gel contains the said biological origin component is suitably determined according to the objective, in the range of 0.001 mass%-2 mass% with respect to the dry weight of a polymer gel. It is preferable to contain, and it is more preferable to contain in 0.005 mass%-1 mass%.
[0047]
As content of the hydrophobic group in a polymer gel, 0.1 mol%-50 mol% are preferable, More preferably, it is the range of 0.5 mol%-40 mol%. If the content of the hydrophobic group is 0.1 mol% or less, it may not be a cell scaffold. On the other hand, if it is 50 mol% or more, the amount of absorbed liquid of the gel decreases and the cell adhesion becomes strong and the desired characteristics may not be exhibited.
[0048]
Further, the type of the copolymer may be any of a block type, a random type, and a graft type.
The molecular weight of the copolymer is preferably 1000 or more in terms of weight average molecular weight, and more preferably 3000 or more in terms of weight average molecular weight. If the molecular weight of the copolymer is too small, it may not become a polymer gel even if it is crosslinked, or desired properties may not be obtained even if it becomes a polymer gel.
Further, the upper limit of the weight average molecular weight is not limited as long as there is no problem in dispersion of fine particles. That is, the weight average molecular weight can be increased within a range in which a satisfactory dispersion state can be obtained depending on the performance of the dispersion device and the dispersion solution viscosity.
[0049]
Examples of the crosslinking method of the copolymer include aldehydes such as glutaraldehyde, carbodiimides such as WSC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), and polyfunctional epoxy such as Denacol (trade name). In addition, a crosslinking agent such as a polyfunctional isocyanate or an initiator that generates actinic rays and radicals such as γ rays, X rays, and electron beams can be used.
[0050]
When adding fine particles during polymerization, it is also preferable to use fine particles having a polymerizable group or an unpaired electron (radical) and chemically bond them to the polymer gel. The fine particles are desirably dispersed as uniformly as possible in the polymer gel.
In order to uniformly disperse the fine particles, it is preferable to use a dispersing agent or the like as appropriate using a mechanical kneading method, a stirring method or an ultrasonic dispersion method.
[0051]
[Cell culture method]
Next, the cell culture method using the cell culture substrate comprising the fine particle-containing polymer gel of the present invention will be described.
Examples of the cell culture method of the present invention include the following methods.
(1) A cell culture method comprising culturing cells on a culture dish on which the cell culture substrate of the present invention is spread. According to this method, a two-dimensional tissue can be formed, and can be easily separated and collected.
(2) A cell culture method comprising culturing cells in an assembly comprising the cell culture substrate of the present invention. According to this method, a three-dimensional tissue can be formed, and can be easily separated and collected.
The fine particle-containing polymer gel applied to these methods is preferably in the form of particles.
[0052]
The method (1) will be specifically described.
In order to form a two-dimensional tissue body and collect the tissue, the fine particle-containing polymer gel particles of the present invention are spread on a culture dish, and normal cell culture is performed thereon. After confirming that the cells have sufficiently grown, if a large amount of culture solution is added and the culture dish is shaken, the polymer gel particles containing fine particles and the two-dimensional tissue are peeled off from the culture dish. When the culture solution is sprayed onto the fine particle-containing polymer gel particles with a pipette or the like, the fine particle-containing polymer gel particles and the two-dimensional tissue are separated, so that only the two-dimensional tissue is recovered. Alternatively, if the fine particle-containing polymer gel particles and the two-dimensional tissue are collected and stirred in a non-adhesive culture flask, the fine particle-containing polymer gel particles and the two-dimensional tissue are separated. Collect only 2D tissue.
In this method, the liquid added to separate and collect the microparticle-containing polymer gel particles and the two-dimensional tissue body need not be a culture solution, and any liquid can be used as long as it does not adversely affect the cell tissue body. It can also be used as a liquid.
In addition, it is preferable to use fine particle-containing polymer gel particles having a particle diameter equal to or less than the size of the cells to be cultured. When the particle size of the fine particle-containing polymer gel particles is large, the proliferation property and the peelability tend to be poor.
[0053]
The method (2) will be specifically described.
In order to form a three-dimensional tissue body and collect the tissue, the cell culture substrate made of the fine particle-containing polymer gel particles of the present invention is laminated on a culture dish used for conventional cell culture, Normal cell culture is performed in the aggregate of the polymer gel particles containing fine particles. After confirming that the cells have sufficiently proliferated, after adding a large amount of culture solution to remove excess fine particle-containing polymer gel particles and stirring in a non-adhesive culture flask, the fine particle-containing polymer Since the gel particles and the three-dimensional structure are separated, only the three-dimensional structure is recovered.
In this method, the liquid added to separate and recover the fine particle-containing polymer gel particles and the three-dimensional tissue body need not be a culture solution, and any liquid can be used as long as it does not adversely affect the cell tissue body. It can also be used as a liquid. In addition, in order to culture a three-dimensional tissue body, it is important to supply nutrients and remove waste products, so a space (unoccupied space) other than the fine particle-containing polymer gel particles in the aggregate is required. .
The unoccupied space preferably has an individual size in the range of 0.1 to 10 μm. The particle size of the fine particle-containing polymer gel is not particularly limited as long as it can form an unoccupied space of such a size, but considering the diffusion of nutrients and wastes in the gel particles, the above (2 In the method (1), the particle diameter of the fine particle-containing polymer gel is preferably 1 mm or less.
[0054]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[0055]
<Preparation of fine particle-containing polymer gel particle 1>
Thermosensitive (high temperature swelling) polymer gel particles containing fine particles were produced by the following process.
An aqueous solution prepared by stirring and mixing 8 g of acrylamide, 1.0 mg of methylenebisacrylamide as a crosslinking agent, 0.004 g of ammonium persulfate, 3.5 g of polystyrene fine particles and 0.575 g of distilled water was prepared.
A solution prepared by dissolving 3.9 g of sorbitol-based surfactant (SO-15R: manufactured by Nikko Chemical Co., Ltd.) in 300 ml of cyclohexane is added to a nitrogen-substituted reaction vessel, and the previously prepared aqueous solution is added thereto. The suspension was stirred for 30 minutes at 1200 rpm using a mechanical stirring blade, and then heated to 60 ° C. for polymerization for 6 hours.
The resulting fine particle-containing polymer gel particles were purified by repeating swelling with distilled water and shrinking with acetone. The obtained particles were sieved using a mesh to obtain fine particle-containing polymer gel particles 1 having an average particle size of about 30 μm when swollen.
[0056]
<Preparation of fine particle-containing polymer gel particle 2>
In the polymerization vessel, acrylamide (5.44 g), n-butyl methacrylate (0.7 g) and allylamine hydrochloride (0.1 g) were added to dimethyl sulfoxide (36 ml), which was purged with nitrogen, and then azobisisobutyronitrile (AIBN) 0 .015 g was added and polymerization was carried out at 60 ° C. for 20 hours. The produced polymer was reprecipitated with methanol, filtered, washed with a large amount of methanol and dried to obtain 6 g of the desired acrylamide-n-butyl methacrylate-allylamine hydrochloride copolymer.
The weight average molecular weight of the copolymer obtained from the measurement result of gel permeation (GPC) was about 52,000. Moreover, the copolymerization rate was almost equal to the charged ratio from the calculation based on the elemental analysis results.
[0057]
6 g of the synthesized acrylamide-n-butyl methacrylate-allylamine hydrochloride copolymer is dissolved in 12.6 ml of distilled water, and then a silica dispersion (Nissan Chemical Industry Co., Ltd., concentration: 30% by mass) is contained as fine particles. After adding 8.6 g and dispersing, 0.4 g of Denacol EX-810 (ethylene glycol diglycidyl ether manufactured by Nagase Kasei Kogyo Co., Ltd.) was added to prepare a reaction solution.
The reaction solution was added to a solution obtained by dissolving 16 g of a sorbitol-based surfactant (SO-15R: manufactured by Nikko Chemical Co., Ltd.) in 2 liters of n-hexane, and stirred at 5000 rpm for 10 minutes using Ultratrax to stabilize the suspension. After obtaining a turbid state, the suspension was heated to 60 ° C. and reacted for 6 hours while stirring at 300 rpm to obtain fine particle-containing polymer gel particles.
The obtained fine particle-containing polymer gel particles were purified by repeating swelling with distilled water and shrinking with acetone. By sieving the obtained particles using a mesh, fine particle-containing polymer gel particles 2 having an average particle size at the time of swelling of about 30 μm were obtained.
[0058]
<Preparation of fine particle-containing polymer gel particle 3>
In Example 1, in the same manner as in Example 1 except that 0.6 g of collagen was added to the reaction solution for producing the fine particle-containing polymer gel particles, the fine particle-containing high particle having a volume average particle diameter at the time of swelling of about 30 μm. Molecular gel particles (3) were obtained.
[0059]
<Preparation of fine particle-containing polymer gel particle 4>
Into the polymerization vessel, 6.68 g of N-isopropylacrylamide and 1.32 g of acryloyl succinimide were put into 36 ml of dimethyl sulfoxide, and after this was replaced with nitrogen, 0.015 g of azobisisobutyronitrile (AIBN) was added. Polymerization was carried out at 60 ° C. for 20 hours. The produced polymer was reprecipitated with diethyl ether, filtered, washed with a large amount of diethyl ether and dried to obtain 7.8 g of the desired N-isopropylacrylamide-acryloyl succinimide copolymer.
The weight average molecular weight of the copolymer obtained from the measurement result of gel permeation (GPC) was about 40,000. Moreover, the copolymerization rate was almost equal to the charged ratio from the calculation based on the elemental analysis results.
[0060]
6 g of the synthesized N-isopropylacrylamide-acryloylsuccinimide copolymer and 3 g of amine PEO6000 (manufactured by Kawaken Fine Chemical Co., Ltd., polyethylene oxide having primary amino groups at both ends) were dissolved in 60 ml of dimethyl sulfoxide. Thereafter, 3.9 g of polystyrene fine particles were added as fine particles to be contained, and after dispersion, 16 g of sorbitol-based surfactant (SO-15R: manufactured by Nikko Chemical Co., Ltd.) was added to a solution dissolved in 2 liters of liquid paraffin. After stirring at 5000 rpm for 10 minutes using Trax to obtain a stable suspension, the suspension was heated to 60 ° C. and reacted at 300 rpm for 6 hours to obtain fine particle-containing polymer gel particles.
The obtained fine particle-containing polymer gel particles were purified by dialysis with distilled water. By sieving the obtained particles using a mesh, fine particle-containing polymer gel particles 4 having an average particle size at the time of swelling of about 30 μm were obtained.
[0061]
<Preparation of Comparative Particle 1>
Polyacrylamide gel particles were prepared using the reverse phase suspension polymerization method. By sieving the obtained particles using a mesh, hydrophilic polymer gel particles (comparative particles 1) having an average particle size at the time of swelling of about 30 μm were obtained.
[0062]
<Preparation of Comparative Particle 2>
As comparative particles 2, commercially available polystyrene particles (manufactured by Moritec Co., Ltd.) having an average particle size of about 30 μm were used.
[0063]
(Example 1)
<Culture of two-dimensional tissue>
Using fibroblasts derived from human dermis using Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM, containing 10% fetal bovine serum, manufactured by GIBCO), the final cell concentration is about 2 × 10. 5 A hydrophobic dispersion dish (Falcon 1008) in which a cell dispersion is prepared so as to be cells / ml and each of the above-prepared fine particle-containing polymer gel particles 1, 2, 3, and 4 swollen with a culture solution is spread. 2 ml each of the cell dispersion was injected into Nippon Becton Dickinson). This was quickly transferred to a 37 ° C. carbon dioxide incubator (5% carbon dioxide) and cultured.
In addition, as a control (checking experiment), a hydrophobic culture dish (Falcon 1008, manufactured by Nihon Becton Dickinson) in which fine particle-containing polymer gel particles were not spread was also cultured under the same conditions.
[0064]
After culturing for 1 day, when a large amount of culture solution was added and the culture dish was shaken with a shaking device, the two-dimensional tissue and the polymer gel particles containing fine particles were separated, and the two-dimensional tissue was recovered. Particularly, the polymer gel particles 4 containing fine particles could be more easily recovered by changing the hydrophobic part to the hydrophilic part by setting the temperature at which the culture dish was shaken and stirred with a shaker to about 25 ° C. It could not be recovered from the hydrophobic culture dish.
[0065]
The obtained two-dimensional tissue was collected and treated with trypsin, and then the number of cells was measured using a phase contrast microscope (OPTIPHOT2-POL, manufactured by Nikon Corporation). The number of cells that did not detach from the hydrophobic culture dish was compared by measuring the number using the same method. As a result, the number of cultured cells was the same.
This result shows that the fine particle-containing polymer gel particles 1, 2, 3, and 4 used provide a good scaffold necessary for cell growth. In addition, no particles remained adhered to the collected two-dimensional tissue.
[0066]
(Example 2)
<Culture of three-dimensional tissue>
Endothelial cells (EC) collected from bovine thoracic aorta by collagenase digestion were treated with a carbon dioxide incubator (37 ° C.) in DMEM supplemented with 15% FBS, penicillin 50 IU / ml, streptomycin 50 μg / ml and amphotericin B 2.5 μg / ml. 5% carbon dioxide gas) and cultured. Final cell concentration is 1 x 10 5 A cell dispersion was prepared so as to be cells / ml.
Aggregates in which 1 ml of the cell dispersion is adjusted to a solid content of 4 wt% in each of the polymer gel particles 1, 2, 3, and 4 containing fine particles laminated in a hydrophobic culture dish (Falcon 1008, Nihon Becton Dickinson). The solution was quickly transferred into a 37 ° C. carbon dioxide incubator (5% carbon dioxide) and cultured.
As a control (checking experiment), a hydrophobic culture dish (Falcon 1008, manufactured by Nippon Becton Dickinson) without fine particle-containing polymer gel particles was also cultured under the same conditions.
[0067]
After culturing for one day, a large amount of culture solution was added, and the culture dish was shaken and stirred with a shaker to collect only the three-dimensional tissue. In particular, the polymer gel particle 4 containing fine particles can be recovered more easily by changing the hydrophobic part in the gel particle to the hydrophilic part by setting the temperature at which the culture dish is shaken and stirred with a shaker to about 25 ° C. I was able to.
[0068]
The obtained three-dimensional tissue was collected and treated with trypsin, and then the number of cells was measured using a phase contrast microscope (OPTIPHOT2-POL, manufactured by Nikon Corporation). The number of cells that did not detach from the hydrophobic culture dish was also compared by measuring the number using the same method.
As a result, the number of cells cultured in any of the fine particle-containing polymer gel particle aggregates was more than twice as many as the number of cells that had not detached from the hydrophobic culture dish. Moreover, the particle | grains which adhere | attach and remain | survived were not confirmed.
[0069]
(Comparative Example 1)
The microparticle-containing polymer gel particles used in Example 1 were changed to the comparative particles 1 and the same evaluation was performed.
As a result, in this comparative example, since the cells did not sufficiently proliferate, they could not be recovered as a two-dimensional tissue body. In addition, the number of cells was proliferating as compared with the number of adjusted cells before culture, but was smaller than the number of cells that did not leave the hydrophobic culture dish. This is probably because the hydrophilic polymer gel constituting the comparative particle 1 does not have a good scaffold necessary for cell growth.
[0070]
(Comparative Example 2)
The microparticle-containing polymer gel particles used in Example 1 were changed to the comparative particles 2 and the same evaluation was performed.
As a result, since the comparative particle 2 is a hydrophobic particle, it becomes a good scaffold necessary for cell growth, so that the growth is good. By shaking and agitating the culture dish with a shaker, the two-dimensional tissue is obtained from the culture dish. Although the body could be recovered, the comparative particles and the two-dimensional tissue were firmly adhered, and they could not be separated.
[0071]
(Comparative Example 3)
The microparticle-containing polymer gel particles used in Example 2 were changed to comparative particles 1 and the same evaluation was performed. As a result, in this comparative example, as in Comparative Example 1, cells were not sufficiently proliferated, and the three-dimensional tissue body could not be recovered.
[0072]
(Comparative Example 4)
The same evaluation was performed using the fine particle-containing polymer gel particles used in Example 3 as the comparative particles 2. As a result, since the comparative particle 2 is a hydrophobic particle, it becomes a good scaffold necessary for cell growth, so that the growth is good, and the particles are contained from the culture dish by shaking and stirring the culture dish with a shaking device. It was recovered as a three-dimensional tissue. However, the comparative particles 2 and the three-dimensional tissue were firmly adhered, and they could not be separated.
[0073]
【The invention's effect】
According to the present invention, a two-dimensional or three-dimensional tissue body that has a cell adhesion surface, a nutrient supply, and a waste removal route for cell scaffolding when cell culture is performed. An object of the present invention is to provide a cell culture substrate that can be easily collected, a method for producing the cell culture substrate, and a cell culture method using the cell culture substrate.