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JP2003521252A - ユニバーサルプライミングを用いる核酸検出方法 - Google Patents

ユニバーサルプライミングを用いる核酸検出方法

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Publication number
JP2003521252A
JP2003521252A JP2001555892A JP2001555892A JP2003521252A JP 2003521252 A JP2003521252 A JP 2003521252A JP 2001555892 A JP2001555892 A JP 2001555892A JP 2001555892 A JP2001555892 A JP 2001555892A JP 2003521252 A JP2003521252 A JP 2003521252A
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Application number
JP2001555892A
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ジャン−ビン・ファン
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イルミナ インコーポレイテッド
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Publication date
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Application filed by イルミナ インコーポレイテッド filed Critical イルミナ インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、標的特異的増幅が最小限であるかまたは無い、遺伝子型形成についての感受的かつ正確なアッセイを提供することを関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本願は、２０００年２月７日提出のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第６０／１８０８１０号
および２０００年９月２２日提出のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第６０／２３４７３２号の
権利を主張し、どちらも出典明示することで本明細書の一部とする。
【０００２】 （本発明の分野） 本発明は、標的特異的増幅が最小限であるかまたは無い、単一ヌクレオチド多
型（ＳＮＰ）についての感受的かつ正確なアッセイを提供することを関する。
【０００３】 （本発明の背景） 特異的な核酸の検出は、診断医学および分子生物学の重要な研究手段である。
遺伝子プローブアッセイは、現在、感染性の生物、例えば、バクテリアおよびウ
ィルスの同定、正常および突然変異遺伝子の発現の調査および突然変異遺伝子、
例えば、腫瘍遺伝子の同定、組織移植に先立つ組織適合性の検査、法医学用の組
織または血液試料の適合、および異種遺伝子間の類似性の探査において重要な役
割を担う。 理想的には、遺伝子プローブアッセイは鋭敏、特異的および容易に自動化でき
るべきである（総説として、Nickerson、Current Opinion in Biotechnology 4:
48-51(1993)を参照）。感度の条件（例えば、低検出限界）は、研究者が分析前
に特異的に核酸を急激に増幅できるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および別の
増幅技術の発達により大幅に緩和された（総説として、Abramsonら, Current Op
inion in Biotechnology, 4:41-47(1993)を参照）。
【０００４】 その一方、特異性については、現在利用されている多くの遺伝子プローブアッ
セイで問題が残ったままである。プローブと標的間の分子相補性の規模によりそ
の相互作用の特異性を明確にする。 ハイブリダイゼーション培地中のプローブ、標的および塩の濃度、、反応温度
およびプローブの長さを変化させることはプローブ／標的相互作用の特異性を変
化させるか、または影響を及ぼしうる。 反応条件の小さな変化がハイブリダイゼーションを変化させるため、慣用的な
技法を用いるのは一般にとても難しいとはいえ、いくつかの条件下で完全な相補
性で、不適当な組み合わせで標的と標的を特徴付けることは可能であろう。標準
プローブでミスマッチを検出する新しい実験法は、プローブ開裂部位を作る１個
所のミスマッチはライゲーションおよびプローブ切断アッセイを妨げるＤＮＡラ
イゲーションアッセイを包含する。
【０００５】 現在の焦点は、多型ＤＮＡマーカーの使用による遺伝的変異と発現型との関係
の分析にある。以前の研究では、多型ポジショナルマーカーとしての短い縦列反
復（ＳＴＲｓ）を利用したが、現在の焦点は、ヒト遺伝的ＤＮＡにおいて１キロ
ベースあたり平均して１回以上の頻度で起こる単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ
）である。特に、コード配列の中および周囲でのＳＮＰｓは治療的に関連した表
現型変種の直接的原因および／または疾病素因である可能性が高い。周知の多型
の多くは臨床的に重要な表現型に起因し、例えば、ａｐｏＥ２／３／４変種はア
ルツハイマーおよび別の疾患のさまざまな相対危険度を伴う（Cordorら, Scienc
e 261 (1993)）。オリゴヌクレオチドアレイへの次のハイブリダイゼーションで
のＳＮＰ座の多重ＰＣＲ増幅は、少なくとも何百ものＳＮＰｓを同時に遺伝子型
を特定する正確で、確実な方法であることを示す（Wangら、Science, 280:1077(
1998)を参照；また、Schaferら, Nature Biotechnology 16:33-39(1998)を参照
）。本発明の合成は先の技術のアレイを代用していてもよい。 したがって、本発明の対象は、最小限または標的特異的な増幅なしで遺伝子型
を特定するためのとても鋭敏で正確な研究方法を提供することである。
【０００６】 （図面の簡単な説明） 図１ないし６は本発明の好ましい例を示す。 図７は、ハイブリダイズしていないプローブおよび標的を除去するために、ポ
リ（Ａ）−ポリ（Ｔ）捕獲を利用する本発明の好ましい例を示す。ポリ（Ａ）配
列６を含む標的配列５を、標的特異的配列７０、アダプター配列２０、分類され
ていないユニバーサルプライミング部位２５、および下流のユニバーサルプライ
ミング部位２６を含む標的プローブ１１５にハイブリダイズする。得られたハイ
ブリダイゼーション複合体をリンカー５５およびポリ（Ｔ）捕獲プローブ６１を
含むビーズ５１に接触させる。 図８は、ＯＬＡを用いて、ハイブリダイズされていない標的プローブを除去す
る好ましい例を示す。標的５を、第１の標的特異的配列１５、検出位置１０、ア
ダプター配列２０、分類されていないプライミング部位２５、および任意のラベ
ル３０を含む第１のライゲーションプローブ１００、第２の標的特異的配列１６
、下流のユニバーサルプライミング部位２６、およびヌクレアーゼ阻害剤３５を
含む第２のライゲーションプローブ１１０とハイブリダイズさせる。ライゲーシ
ョン、ハイブリダイゼーション複合体の変性およびエキソヌクレアーゼの付加後
、結紮されている標的プローブ１１５および第２のライゲーションプローブ１１
０が残る。検出可能な複合体中の第２のライゲーションプローブ１１０を洗い流
した後、アレイ（この実施例においては、基質４０、リンカー５５およびアダプ
ター配列２０相補的である捕獲プローブ６０を付随したビーズ５０を含むビーズ
アレイ）にこのプローブを付加する。
【０００７】 図９は２つのライゲーションプローブを使用する好ましいローリングサークル
の例を示す。標的５を第１の標的特異的配列１５、検出位置１０、アダプター配
列２０、分類されていないユニバーサルプライミング部位２５、アダプター配列
２０およびＲＣＡプライマー配列１２０を含む第１のライゲーションプローブ１
００、および第２の標的特異的配列１６および下流のユニバーサルプライミング
部位２６を含む第２のライゲーションプローブ１１０とハイブリダイズさせる。
ライゲーション後、第１のユニバーサルプライマー２７および第２のユニバーサ
ルプライマー２８を含むＲＣＡ配列１３０を加える。プライミング部位はプライ
マーとハイブリダイズし、ライゲーションが起こり、環状プローブが形成される
。ＲＣＡ配列１３０は次の増幅用ＲＣＡプライマーとして供する。任意の制限酵
素部位は示していない。 図１０は１つの標的プローブを使用する好ましいローリングサークルの例を示
す。標的５を第１の標的特異的配列１５、検出位置１０、アダプター配列２０、
上流のプライミング部位２５、ＲＣＡプライミング部位１４０、任意のラベル配
列１５０および第２の標的特異的配列１６を含む標的プローブ１１５とハイブリ
ダイズする。ライゲーション、変性、およびＲＣＡプライマーの付加およびポリ
メラーゼによる伸長後、増幅産物を生成する。任意の制限酵素部位は示していな
い。
【０００８】 （発明の要約） 前記した例に従って、本発明は、上流のユニバーサルプライミング部位（ＵＵ
Ｐ）を含む第１のプローブを提供し、アダプター配列、読み出し位置の最初の塩
基を含む第１の標的特異的配列、下流のユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ
）、前記した検出位置でユクレオチドと完全に相補的である場合に限り、最初の
塩基が第１のハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下での前記した標
的配列を前記した第１のプローブとの接触、ハイブリダイズされない第１のプロ
ーブの除去、前記したハイブリダイゼーション複合体の変性、複数個の増幅産物
を生成するための前記した第１のプローブの増幅、前記した増幅産物を捕獲プロ
ーブのアレイとの接触、および前記した検出位置でのヌクレオチドの検出を含む
標的配列中の検出位置でヌクレオチドの同一性を測定する方法を提供する。
【０００９】 加えて、本発明は、上流のユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）をそれぞ
れ含む複数の読み出しプローブを提供し、アダプター配列、読み出し位置での独
特の塩基を含む標的特異的配列、および下流のユニバーサルプライミング部位（
ＤＵＰ）、前記した読み出し位置での前記した塩基が前記したヌクレオチドと検
出位置で完全に相補的である場合に限り、第１のハイブリダイゼーション複合体
を形成する条件下での前記した検出プローブと前記した標的配列の接触、ハイブ
リダイズしていない第１のプローブの除去、前記した第１のハイブリダイゼーシ
ョン複合体の変性、複数の増幅産物を生成する前記した検出プローブの増幅、前
記した増幅産物と捕獲プローブのアレイとの接触、および前記した検出位置での
ヌクレオチドの検出を含む標的配列中の検出位置でのヌクレオチドの同一性を測
定する方法を提供する。
【００１０】 加えて、本発明は、第１の標的ドメインを含み、前記した検出位置および前記
した検出位置に隣接した第２の標的ドメインを含む標的配列中の検出位置でのヌ
クレオチドの同一性を測定する方法を提供し、前記した方法は第１のライゲーシ
ョンプローブと前記した第１の標的ドメインとをハイブリダイズすることを含み
、上流のユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）を含む前記した第１のライゲ
ーションプローブ、および第１の標的特異的配列、第２のライゲーションプロー
ブと前記した第２の標的ドメインをハイブリダイズし、下流のユニバーサルプラ
イミング部位（ＤＵＰ）を含む第２のライゲーションプローブ、および疑問位置
での第１の塩基を含む第２の標的特異的配列、前記した第１の塩基が前記した検
出位置で前記したヌクレオチドと完全に相補的である場合、ライゲーション複合
体は形成され、前記した第１および第２のライゲーションプローブがアダプター
配列の少なくとも１つを含み、ハイブリダイズされていない第１のプローブの除
去、前記した第１および第２のライゲーションプローブを結紮されているプロー
ブを形成するために結紮するリガーゼの提供、複数の増幅産物を生成するために
前記した結紮されているプローブの増幅、前記した増幅産物を捕獲プローブのア
レイの接触、および前記した検出位置でのヌクレオチドの測定を含む。 加えて、本発明は、第１の標的ドメインを含み、前記した検出位置および前記
した検出位置に隣接した第２の標的ドメインを含む標的配列中の検出位置でのヌ
クレオチドの同一性を測定する方法を提供し、前記した方法は、第１のライゲー
ションプローブと前記した第１の標的ドメインをハイブリダイズし、上流のユニ
バーサルプライミング部位（ＵＵＰ）および第１の標的特異的配列を含む前記し
た第１のライゲーションプローブ下流のユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ
）、および疑問位置での第１の塩基第２の標的特異的配列前記した第１の塩基が
前記した検出位置で前記したヌクレオチドと完全に相補的である場合、ライゲー
ション複合体を形成し、少なくとも１つの前記した第１および第２のライゲーシ
ョンプローブはアダプター配列を含み、ハイブリダイズしていない第１のプロー
ブの除去、結紮されているプローブを形成するために前記した第１および第２の
ライゲーションプローブを結紮するリガーゼの提供、上流のプライミング配列お
よび下流のプライミング配列を含むローリングサークル（ＲＣ）配列と前記した
結紮されているプローブとのハイブリダイズ、環状の結紮されているプローブを
形成するために前記した上流および下流のプライミング部位を結紮するリガーゼ
の提供、複数の増幅産物を生成するために前記した環状の結紮されているプロー
ブの増幅、前記した増幅産物と捕獲プローブのアレイとの接触、および前記した
検出位置でのヌクレオチドの測定を含む。
【００１１】 加えて、本発明は、前記した検出位置を含む第１の標的ドメインおよび前記し
た検出位置に隣接した第２の標的ドメインを含む標的配列中の検出位置でのヌク
レオチドの同一性を測定する方法を提供し、前記した方法は、ローリングサーク
ル（ＲＣ）プローブと前記した標的配列とのハイブリダイズ、前記したＲＣプロ
ーブは上流のユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）を含み、および第１の標
的特異的配列、疑問位置での第１の塩基を含む第２の標的特異的配列、およびア
ダプター配列、前記した第１の塩基は前記した検出位置で前記したヌクレオチド
と完全に相補的である場合、ライゲーション複合体は形成され、結紮されている
プローブを形成するために前記した第１および第２のライゲーションプローブを
結紮するリガーゼの提供、複数の増幅産物を生成するために前記した結紮されて
いるプローブの増幅、前記した増幅産物を捕獲プローブのアレイとの接触、およ
び前記した検出位置でのヌクレオチドの測定を含む。
【００１２】 （本発明の詳細な説明） 本発明は、様々な核酸反応、特に、ミクロスフェアアレイを用いる検出および
定量化を対象とする。特に、本発明は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ
のどれかを用いて、特異的標的の事前の増幅なしに遺伝子型を特定することに関
する。加えて、本発明は、ユニバーサルアレイを作成するためにアダプター配列
を使用することができる。ある実施例において、さらに、本発明はゲノム配列の
検出およびｃＤＮＡの定量化（発現モニタリングまたはプロファイリング）に関
する。 本発明は、一般的に以下のように記載することができる。複数のプローブ（時
々、「標的プローブ」として言及する）を、標的特異的である１つの部分および
上流および下流のユニバーサルプライミング配列である２つの「ユニバーサルプ
ライミング」部分といった、少なくとも３つの異なる部分を持つように設計する
。これらの標的プローブを、先の増幅なしで試料から標的配列にハイブリダイズ
し、ハイブリダイゼーション複合体を形成する。次いで、ハイブリダイズしてい
ない配列（目的の配列を含有していない標的プローブおよび試料核酸の両方）を
除去する。これは、一般的に、（１）１本鎖と２本鎖の核酸を区別することがで
きる方法を用いることにより、例えば、２本鎖の核酸を優先的に結合する支持と
してインターカレーターを用いることにより、または（２）標的特異的配列の使
用を通して、例えば、標的配列がポリ（Ａ）尾部を有するｍＲＮＡの転写物であ
る場合、支持としてのポリ（Ｔ）の使用により優先的に全てのハイブリッドを保
持することができる、といった２つの方法のうちの一つを行う。いったんハイブ
リダイズされていない標的プローブを除去すると、該ハイブリッドは変性する。
次いで、全ての標的プローブを、上流および下流のユニバーサルプライミング配
列にハイブリダイズするであろうユニバーサルプライマーを用いて、同時に増幅
することができる。直接的または非直接的に標識化することができる得られた増
幅産物を、次いで、アレイ、特に、ミクロスフェアアレイで検出することができ
る。これは標識配列の検出および定量化を認められるが、この実施例においてと
はいえ、ｍＲＮＡは好ましくないとしてよい。
【００１３】 当該分野で認識されているように、系はアッセイに応じて、多種多様の形態を
とることができる。例えば、遺伝子型を特定する情報が標的における個々の検出
位置で望まれる場合、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を
用いる前記した技法の変法を行うことができる。各々の末端、すなわち検出位置
で完全な相補性がある場合、ＯＬＡは、２つの隣接したハイブリダイズしたプロ
ーブがリガーゼによりともに結紮されるであろう事実に依存する。この例におい
て、標的配列の第１のドメインにハイブリダイズするであろう上流のユニバーサ
ルプライミング配列および第２の部分を含む第１または上流のライゲーションプ
ローブ、および第１のドメインに隣接する標的配列の第２のドメインにハイブリ
ダイズするであろう部分および下流のユニバーサルプライミング配列を含む第２
の部分を含む第２または下流のライゲーションプローブ、といった２つのライゲ
ーションプローブがある。接合部に完全な相補性があれば、結紮は起こり、次い
で、得られたハイブリダイゼーション複合体非反応プローブ（標的および結紮さ
れているプローブを含む）から前記した通り分離することができる。再び、ユニ
バーサルプライミング部位を用いて、ライゲーションプローブを増幅し、複数の
増幅産物を形成し、本明細所で述べたとおり、様々な方法で検出する。代わりに
、この趣旨の変化は増幅に続いて結紮されている単一のプローブを必要とするロ
ーリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用する。 加えて、前記した例のいずれかは１つ以上の「アダプター配列」（時々、「ジ
ップコード」として当該分野で言及される）を使って、「ユニバーサルアレイ」
の使用を可能にする。アレイは標的特異的ばかりでなく、個々の人工的なアダプ
ター配列にむしろ特異的である捕獲プローブを含有するものを生成する。該アダ
プター配列を標的プローブ（ライゲーションプローブの場合において、どちらも
プローブもアダプター配列を含有していてもよい）に付加し、プライミング配列
の間に重ね、すなわち、増幅産物に組み込む。次いで、該アダプターを該アレイ
で捕獲プローブにハイブリダイズし、検出を進める。
【００１４】 本発明は、種々の意味ある効果を提供する。該方法は、アニールされているプ
ローブのシグナル増幅のため、１つの細胞または数個の細胞からゲノムＤＮＡま
たは別の標的を検出するのに用いることができる。必要に応じて、ゲノム標識へ
のプローブの直接的なハイブリダイゼーションをする。さらに、ハイブリダイゼ
ーション反応は溶液よりむしろ表面上で起こるため、核酸はそれらの熱力学的性
質に基づく有利な動力学で予測通りにハイブリダイズする。最終的に、ユニバー
サルプライマーの使用はＰＣＲにおける偏ったシグナル増幅を避ける。
【００１５】 それゆえ、本発明は、試料中の特異的な標的核酸配列を検出し、遺伝子型を特
定するための組成物および方法を提供する。当該分野で認識されているように、
該試料溶液は、限定するものではないが、体液（実質的にはいかなる生物体、好
ましくは哺乳動物の試料、特に好ましくはヒトの試料の、血液、尿、血清、リン
パ液、唾液、肛門および膣分泌液、汗、および精液を包含するが限定するもので
はない）を含むいかなる物も含んでいてもよい。該試料は、一次細胞（バクテリ
アを含む）を含む個々の細胞および細胞株を含んでいてもよく、細胞株は全ての
種の腫瘍細胞（特に、黒色腫、骨髄性白血病、肺、乳、卵巣、結腸、腎臓、前立
腺、膵臓および睾丸癌）、肥満細胞、好酸球、血管内膜性、肝細胞、単核白血球
を含む白血球、造血などの幹細胞、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓およびミオサイ
ト幹細胞、破骨細胞、軟骨細胞および別の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラ
ニン形成細胞、肝臓細胞、腎臓細胞および含脂肪細胞を包含するが限定するもの
ではない。また、適当な細胞は、周知の研究細胞（ジャーカットＴ細胞、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、９２３、ヒーラ、ＷＩ−３８、Ｗｅｒｉ−１、Ｍ
Ｇ−６３などを含むが限定するものではない）を包含する。ＡＴＣＣ細胞株カタ
ログ（言及により本明細書の一部とする）を参照。 加えて、好ましい方法は、標的配列を含有する核酸試料を、標的、特に、ゲノ
ムＤＮＡ試料に処理およびハイブリダイズしやすい大きさに切断するための切断
および剪断する技法を利用する。核酸を機械的な力（例えば、ソニケーション）
を通して剪断または制限酵素を用いて核酸を開裂することにより行ってもよい。
【００１６】 本発明は、試料中の標的核酸配列の存在または非存在を検出する組成物および
方法を提供する。本明細書中の「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文
法的相当語句（ｇｒａｍｍａｔｉｃａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）は、ともに
共有結合した少なくとも２つ以上のヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、
一般的に、リン酸ジエステル結合を含有しているであろうが、ある場合において
、以下に示すように、特に、プローブとともに使用するために、核酸類似物は、
例えば、ホスホルアミド(Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993)
およびその中での言及；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970)；Sprinzl e
t al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977)；Letsinger et al., Nucl. Acids Res
. 14:3487 (1986)；Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al.,
J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；and Pauwels et al., Chemica Scripta
26:141 91986))、 ホスホロチオエート(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:14
37 (1991)；および特許出願番号５６４４０４８)、ホスホロジチオエート(Briu
et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989)、O−メチルホスホロアミダイト（
O-methylphosphoramidite）連鎖(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues:
A Practical Approach, Oxford University Press参照)およびペプチド核酸バッ
クボーンおよび連鎖(Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992)；Meier et a
l., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992)；Nielsen, Nature, 365:566 (1993)
；Carlsson et al., Nature 380:207 (1996)を参照（言及により全てを本明細書
の一部とする）)からなる代わりのバックボーンを有するものを含有する。別の
核酸の類似物はポジティブバックボーン(Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 92:6097 (1995)；非イオン性バックボーン(米国特許第５３８６０２３号
、第５６３７６８４号、第５６０２２４０号、第５２１６１４１号および第４４
６９８６３号；Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (
1991)；Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；Letsinger et
al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994)；Chapters 2 and 3, ASC Symp
osium Series 580, 「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」,
Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook；Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicin
al Chem. Lett. 4:395 (1994)；Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (19
94)；Tetrahedron Lett. 37:743 (1996))および米国特許第５２３５０３３号お
よび第５０３４５０６号Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, 「Carb
ohydrate Modifications in Antisense Research」, Ed. Y.S. Sanghui and P.
Dan Cookに記載のものを含む非リボースバックボーンを包含する。また、一つ以
上の単鎖環式の糖を含む核酸は核酸の定義内に包含される(Jenkins et al., Che
m. Soc. Rev. (1995) pp169-176を参照)。種々の核酸類似物はRawls, C & E N
ews June 2, 1997 page 35に記載されている。これらの引例は出典明示により本
明細書の一部とする。リボース・リン酸バックボーンのこれらの例は、標識の付
加を容易にし、または生理学的な環境においてかかる分子の安定性および半減期
を減少させていてもよい。
【００１７】 当業者に認識されているように、これらの核酸類似体は、いずれも本発明にお
ける用途を見出しうる。加えて、天然に存在する核酸および類似体の混合物を調
製することができる。あるいは、様々な核酸類似体の混合物ならびに天然に存在
する核酸および類似体の混合物を調製してもよい。
【００１８】 特に好ましいのは、ペプチド核酸類似体を包含するペプチド核酸(ＰＮＡ)であ
る。これらの骨格は、天然に存在する核酸の高度に荷電したホスホジエステル骨
格とは対照的に、中性条件下で実質的に非イオン性である。このことは、２つの
利点をもたらす。第１に、ＰＮＡ骨格は、改良されたハイブリダイゼーション動
力学を示す。ＰＮＡは、完全にマッチした塩基対に対してミスマッチの塩基対の
場合には、融点(Ｔｍ)の大きい変化を有する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、典型的に
は、内部ミスマッチの場合、Ｔｍの２〜４℃の低下を示す。非イオン性のＰＮＡ
骨格を用いれば、低下は７〜９℃により近い。このことはミスマッチのより良好
な検出を可能にする。同様に、それらの非イオン性により、これらの骨格に結合
した塩基のハイブリダイゼーションは、比較的、塩濃度に非感受性である。
【００１９】 核酸は、特定される場合には一本鎖または二本鎖であり、また、二本鎖または
一本鎖配列の両方の部分を含有しうる。かくして、例えば、標的配列がポリアデ
ニル化ｍＲＮＡである場合、標的プローブを含有するハイブリダイゼーション複
合体は、標的プローブがハイブリダイズされている二本鎖部分と１個またはそれ
以上の一本鎖部分(例えば、ポリ(Ａ)部分)とを有する。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム
およびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッド(ここで、核酸はデオキシリ
ボ-およびリボ-ヌクレオチドの組合せを含有する)、および塩基(例えば、ウラシ
ル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ハイポキ
サンチン、イソシトシン、イソグアニンなど)の組合せでありうる。好ましい具
体例は、米国特許第5,681,702号に一般的に記載されているように、これが非特
異的なハイブリダイザーションを減少させるので、標的配列よりむしろ他のプロ
ーブに相補的であるように設計された核酸にイソシトシンおよびイソグアニンを
利用する。ここで用いられているように、「ヌクレオシド」なる用語は、ヌクレ
オチドだけでなく、ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、ならびにアミノ修
飾ヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドを包含する。加えて、「ヌクレオシド」
は、天然に存在しない類似体構造物を包含する。かくして、例えば、ペプチド核
酸の個々の単位(各々は塩基を含有する)は、ここでは、ヌクレオシドと呼ばれる
。
【００２０】 本発明の組成物および方法は、標的配列の検出に向けられている。「標的配列
」もしくは「標的核酸」なる用語または文法的な等価物は、ここでは、核酸の単
一鎖上の核酸配列を意味する。標的配列は、遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、
ｃＤＮＡ、ＲＮＡ(ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含む)、またはその他の一部であり
うる。いくつかの具体例では、ポリアデニル化ｍＲＮＡが特に好ましい。ここで
概説するように、標的配列は、試料由来の標的配列、またはＰＣＲまたはＲＣＡ
などの増幅反応の生成物であるアンプリコンなどの２次標的でありうる。かくし
て、例えば、試料由来の標的配列を増幅して、検出されるアンプリコンを生成さ
せる。標的配列は、いかなる長さであってもよいが、長い配列ほど特異的である
と理解されている。当業者に認識されているように、相補的な標的配列は、多く
の形態を取りうる。例えば、それは、より大きい核酸配列(すなわち、特に、遺
伝子またはｍＲＮＡの全部または一部、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限断
片)内に含有されうる。本発明で特に好ましい標的配列としては、ゲノムＤＮＡ
、ポリアデニル化ｍＲＮＡ、およびその代わりとしてスプライスされたＲＮＡが
挙げられる。以下でより詳しく概説するように、プローブを標的配列にハイブリ
ダイズさせて、試料中における標的配列の存在、非存在、量または配列を決定す
る。一般的に言えば、この用語は当業者に理解されている。
【００２１】 また、標的配列は、隣接(すなわち、連続的)または分離されていてもよい様々
な標的ドメインからなりうる。例えば、以下で概説するＯＬＡ技術では、第１の
ライゲーションプローブは、第１の標的ドメインにハイブリダイズし、第２のラ
イゲーションプローブは第２の標的ドメインにハイブリダイズしうる；これらの
ドメインは直接的に隣接しているか、あるいは、以下でより詳しく概説するよう
に、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの使用と組み合わせて、それらは１個またはそ
れ以上のヌクレオチドで分離(例えば、間接的に隣接)されていてもよい。「第１
」および「第２」なる用語は、標的配列の５'−３'方向に関して配列の方向を与
えることを意味しない。例えば、相補的な標的配列の５'−３'方向を仮定すれば
、第１の標的ドメインは第２のドメインに対して５'側または第２のドメインに
対して３'側に位置しうる。加えて、当業者に認識されているように、アレイの
表面上における(例えば、ミクロスフェアに結合した)プローブは、いずれの方向
にも、それらが遊離の３'末端または遊離の５'末端のいずれかを有するように結
合されうる；いくつかの具体例では、プローブは、１個またはそれ以上の内部位
置、あるいは両方の末端に結合させることができる。
【００２２】 必要なら、標的配列は公知の技術を用いて調製される。例えば、公知の溶解緩
衝液、音波処理、エレクトロポレーションなどを用いて、細胞を溶解するように
試料を処理すればよい。当業者に認識されているように、以下で概説する精製お
よび増幅は、必要に応じて行われる。加えて、ここで概説する反応は、当業者に
認識されているように、様々な方法で達成しうる。反応の成分は、同時または順
次に、いかなる順番で加えてもよい。好ましい具体例は以下で概説する。加えて
、反応はアッセイに含まれうる様々な他の試薬を包含しうる。これらとしては、
塩、緩衝液、中性タンパク(例えば、アルブミン)、界面活性剤などの試薬が挙げ
られる。これらは最適なハイブリダイゼーションおよび検出を容易にし、および
/または非特異的なもしくはバックグラウンドの相互作用を減少させるのに用い
うる。また、試料の調製方法および標的に純度に依存して、それ以外にアッセイ
の効率を向上させる試薬(例えば、プロテアーゼ阻害薬、ヌクレアーゼ阻害薬、
抗菌薬など)を用いてもよい。
【００２３】 場合によっては、２つのポリ(Ｔ)工程が用いられることに注意すべきである。
ある具体例では、ポリ(Ｔ)サポートは、試料から未反応の標的プローブを除去す
るのに用いられる。しかし、ポリ(Ｔ)サポートは、アッセイを行う前に、試料か
らポリ(Ａ)ｍＲＮＡを精製または濃縮するのに用いてもよい。例えば、全ＲＮＡ
を細胞集団から単離し、次いで、全ＲＮＡからポリ(Ａ)ｍＲＮＡを単離し、以下
で説明するアッセイシステムに供給すればよい。
【００２４】 加えて、大抵の具体例では、二本鎖の標的核酸を変性して、本発明のプライマ
ーおよび他のプローブのハイブリダイゼーションを可能にするように、それらを
一本鎖にする。好ましい具体例は、ｐＨ変化および他の技術を用いてもよいが、
一般的には、反応の温度を約９５℃に上昇させることにより、熱的な工程を利用
する。
【００２５】 ここで概説するように、本発明は数多くの様々なプライマーおよびプローブを
提供する。本発明のプローブおよびプライマーは、標的配列と本発明のプローブ
とのハイブリダーゼーションが起こるように、少なくとも一部が標的配列(試料
の標的配列または他のプローブ配列のいずれか、例えば、以下で説明するように
、アンプリコンの一部)に相補的であるように設計される。以下で概説するよう
に、この相補性は完全である必要はない；標的配列と本発明の一本鎖核酸との間
のハイブリダイゼーションに干渉するかなり多数の塩基対のミスマッチが存在し
ていてもよい。しかし、突然変異の数が大きくて、最も少ないストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下でさえ、ハイブリダイゼーションが起こり得な
いなら、配列は相補的な標的配列ではない。かくして、「実質的に相補的な」と
は、ここでは、プローブが標的配列に十分に相補的であり、通常の反応条件下で
ハイブリダイズし、好ましくは所望の特異性を与えることを意味する。
【００２６】 本発明には、様々なハイブリダイゼーション条件(例えば、高い、適度なおよ
び低いストリンジェンシー条件)を用いうる；例えば、マニアティス(Maniatis)
ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular C
loning: A Laboratory Manual)、第２版、1989年、およびショート・プロトコル
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Short Protocols in Molecular Biolog
y)、アウスベル(Ausubel)ら編(これらは出典を示すことにより本明細書の一部を
なす)を参照。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、様々な状況によって
異なる。長い配列ほど高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイ
ゼーションに対する広範囲な指針は、タイセン(Tijssen)、テクニークズ・イン
・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー−ハイブリダイゼ
ーション・ウィズ・ヌクレイック・アシッド・プローブズ(Techniques in Bioch
emistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)、
「オーバービュー・オブ・プリンシプルズ・オブ・ハイブリダイゼーション・ア
ンド・ザ・ストラテジー・オブ・ヌクレイック・アシッド・アッセイズ(Overvie
w of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays
)」(1993年)に見出される。一般的には、ストリンジェントな条件は、所定のイ
オン強度およびｐＨにおいて特異的な配列の熱的な融点(Ｔｍ)より約５〜１０℃
低いように選択される。Ｔｍは標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で(
標的配列はＴｍで過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡状態で占有して
いる)標的配列にハイブリダイズする(所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下
での)温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイ
オンより低いものであり、典型的にはｐＨ７.０〜８.３において約０.０１〜１.
０Ｍナトリウムイオン濃度(または他の塩)であり、温度が短いプローブ(例えば
、１０〜５０ヌクレオチド)の場合は少なくとも約３０℃であり、長いプローブ(
例えば、５０ヌクレオチドより多い)の場合には少なくとも約６０℃である。ま
た、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどのらせん不安定化剤の添加に
より達成してもよい。また、ハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知の
ように、非イオン性骨格(すなわち、ＰＮＡ)を用いる場合には変化しうる。加え
て、架橋剤を標的の結合後に加えて、ハイブリダイゼーション複合体の２つの鎖
を架橋(すなわち、共有結合)させてもよい。
【００２７】 かくして、アッセイは、一般的には、標的の存在下だけで第１のハイブリダイ
ゼーション複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で行われる。ス
トリンジェンシーは、熱力学的な変数である工程パラメーター(例えば、温度、
ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、ｐＨ、有機溶媒濃度などで
あるが、これらに限定されない)を変更することにより制御することができる。
【００２８】 また、これらのパラメーターは、米国特許第5,681,697号に一般的に概説され
ているように、非特異的な結合を制御するのに用いてもよい。かくして、非特異
的な結合を減少させるためには、より高いストリンジェンシー条件でいくつかの
工程を行うことが望ましいかもしれない。
【００２９】 プライマーおよびプローブ核酸のサイズは、当業者に認識されているように、
プローブの各部分およびプローブの全長により変化しうる。一般的には、長さが
５〜５００ヌクレオチドの範囲内である。各部分は、用途および増幅技術に依存
して、好ましくは、１０〜１００が好ましく、１５〜５０が特に好ましく、１０
〜３５がとりわけ好ましい。かくして、例えば、プローブのユニバーサルプライ
ミング部位は、各々、好ましくは長さが約１５〜２０ヌクレオチドであり、１８
がとりわけ好ましい。プローブのアダプター配列は、好ましくは長さが１５〜２
５ヌクレオチドであり、２０がとりわけ好ましい。プローブの標的特異的な部分
は、好ましくは長さが１５〜５０ヌクレオチドである。
【００３０】 従って、本発明は、第１の標的プローブセットを提供する。「プローブセット
」とは、ここでは、特定のマルチプレックスアッセイに用いられる複数の標的プ
ローブを意味する。これに関連して、複数は少なくとも２つを意味し、アッセイ
、試料および試験の目的に依存して、１０より多いのが好ましい。
【００３１】 従って、本発明は、ユニバーサルプライミング部位を含有する第１の標的プロ
ーブセットを提供する。「ユニバーサルプライミングセット」とは、ここでは、
増幅用のＰＣＲプライマーを結合するプローブの配列を意味する。各プローブは
、好ましくは上流ユニバーサルプライミング部位(ＵＵＰ)および下流ユニバーサ
ルプライミング部位(ＤＵＰ)を含有する。また、「上流」および「下流」は、特
定の５'−３'方向を表現することを意味せず、システムの方向に依存する。当業
者に認識されているように、様々なアッセイまたは様々なマルチプレックス分析
は複数のユニバーサルプライミング配列を利用しうるが、好ましくは、単一のＵ
ＵＰ配列および単一のＤＵＰ配列がプローブセットに用いられる。加えて、ユニ
バーサルプライミングセットは、プライミング配列に隣接した配列だけが増幅さ
れるので、好ましくは標的プローブ(またはライゲーションされたプローブ)の５
'および３'末端に位置する。いくつかの具体例では、例えば、ローリングサーク
ルの具体例の場合には、単一のユニバーサルプライミング部位が存在しうる。
【００３２】 加えて、ユニバーサルプライミング配列は、一般的には、アッセイの特異性を
確保するために特定のアッセイおよび宿主ゲノムが与えられたとすると、できる
限りユニークであるように選択される。一般的に、ユニバーサルプライミング配
列はサイズが約５〜約２５塩基対の範囲内であり、約１０〜約２０が特に好まし
い。
【００３３】 当業者に認識されているように、２つのプライミング部位の方向は異なってい
る。すなわち、一方のＰＣＲプライマーは第１のプライミング部位に直接ハイブ
リダイズするのに対して、他方のＰＣＲプライマーは第２のプライミング部位の
相補体にハイブリダイズする。別な言い方をすれば、第１のプライミング部位は
センス方向にあり、第２のプライミング部位はアンチセンス方向にある。
【００３４】 ユニバーサルプライミング部位に加えて、標的プローブは標的配列に実質的に
相補的な少なくとも第１の標的特異的な配列を含有する。以下で概説するように
、ライゲーションプローブは、各々、標的特異的な配列を含有する。当業者に認
識されているように、標的特異的な配列は、標的配列の全部または一部にハイブ
リダイズする部分を含有し、１個またはそれ以上の特定の単一ヌクレオチド多形
(ＳＮＰ)を含む。
【００３５】 本発明は、配列情報が必要とされる１個またはそれ以上の位置(ここでは、一
般的に「検出位置」または「検出座」と呼ばれる)を含有する標的配列に向けら
れている。いくつかの具体例では、検出位置は互いに連続的であるか、あるいは
１個またはそれ以上のヌクレオチドで分離されている複数のヌクレオチドを含有
しうるが、好ましい具体例では、検出位置は単一のヌクレオチド(時々、単一ヌ
クレオチド多形(ＳＮＰ)と呼ばれる)である。「複数」とは、ここでは、少なく
とも２つを意味する。ここで用いるように、ハイブリッドにおいて検出位置塩基
と塩基対を形成するプローブ(例えば、標的プローブ)の塩基は、「読み出し位置
」または「呼び出し位置」と呼ばれる。かくして、標的配列は検出位置を含有し
、標的プローブは読み出し位置を含有する。一般的に、この具体例は、以下で説
明するように、ＯＬＡまたはＲＣＡアッセイを利用する。
【００３６】 好ましい具体例では、競合ハイブリダイゼーション標的プローブの使用は、検
出位置におけるヌクレオチドの同定またはミスマッチの存在のいずれかを明らか
にするために行われる。
【００３７】 これに関連して、「ミスマッチ」は相対的な用語であり、２つの配列間におい
て特定の位置(ここでは、「検出位置」と呼ばれる)での塩基の同一性の差を示す
ことを意味することに注意すべきである。一般的に、野生型配列と異なる配列は
、ミスマッチであると呼ばれる。しかし、特にＳＮＰの場合には、「野生型」を
構成するものが多数の対立遺伝子として決定されるのが困難であることは、集団
内で比較的頻繁に観察することができ、かくして、これに関連して、「ミスマッ
チ」は、１つの配列を標準として人為的に採用することを必要とする。かくして
、本発明の目的では、配列は、ここでは、「マッチ」および「ミスマッチ」と呼
ばれる。かくして、本発明は、野生型配列と比較して、置換、挿入または欠失を
検出するのに用いうる。すなわち、すべての他のパラメーターが等しいなら、完
全に相補的な読み出し標的プローブ(「マッチプローブ」)は、一般的には、より
安定であり、特定の温度でミスマッチを含有する標的プローブ(「ミスマッチプ
ローブ」)より遅いオフレート(off rate)を有する。
【００３８】 従って、この具体例は、２つ(またはそれ以上)の様式の１つで行うことができ
る。好ましい具体例では、(ここで概説するように)ＵＵＰ、アダプター配列、標
的特異的な配列(読み出し位置に第１の塩基を含有する)およびＤＵＰを含有する
単一のプローブだけを用いる。このプローブは、標的の検出位置とプローブの読
み出し位置との間に完全なマッチが存在する場合にだけハイブリダイゼーション
複合体を形成するような条件下で(熱的またはその他にかかわらず)標的配列と接
触させる。次いで、ここで概説するように、ハイブリダイズしないプローブを除
去し、ハイブリダイゼーション複合体を変性する。次いで、ここで概説するよう
に、プローブを増幅し、アレイで検出する。
【００３９】 好ましい具体例では、検出位置で塩基を同定するのに、複数の標的プローブ(
時々、ここでは、「読み出し標的プローブ」と呼ばれる)が用いられる。この具
体例では、各々の異なる読み出しプローブは、標的配列の検出位置にハイブリダ
イズする位置(ここでは、読み出しまたは呼び出し位置と呼ばれる)に異なる塩基
と、各々の異なる読み出し位置に対する異なるアダプター配列とを含有する。こ
のようにして、標的の配列に依存して、読み出し標的プローブのデファレンシャ
ルハイブリダイゼーションは、検出位置における塩基の同定をもたらす。この具
体例では、マッチとミスマッチとの間の識別を可能にする条件下で読み出しプロ
ーブを再びアレイと接触させて、ハイブリダイズしないプローブを除去するなど
である。
【００４０】 従って、様々な読み出し標的プローブ(各々は読み出し位置に異なる塩基を有
し、また、各々は異なるアダプターを有する)を用いることにより、検出位置に
おける塩基の同定を明らかにする。かくして、好ましい具体例では、１組の読み
出しプローブ(各々は読み出し位置に異なる塩基を有する)が用いられる。
【００４１】 好ましい具体例では、各々の読み出し標的プローブは異なるアダプター配列を
有する。すなわち、標的配列にハイブリダイズする各々の標的プローブがアレイ
上の異なるアドレスに結合するように、読み出し位置にアデニンを含有する読み
出し標的プローブは第１のアダプターを有し、読み出し位置にグアニンを有する
プローブは第２のアダプターを有するなどである。このことは、各反応に同一標
識の使用を可能にする。
【００４２】 用いる読み出し標的プローブの数は、アッセイの最終用途に依存して変化する
。例えば、多くのＳＮＰは二多型性(biallelic)であり、かくして２つの読み出
し標的プローブ(各々は、検出位置塩基の一方と塩基対を形成する呼び出し塩基
を含有する)である。配列決定には、例えば、ＳＮＰの発見用として、１組の４
つの読み出しプローブが用いられる。
【００４３】 この具体例では、検出位置におけるヌクレオチドの同定またはミスマッチの存
在のいずれかを決定するために、ストリンジェンシーパラメーターの変化に対す
る感受性が用いられる。予備的な事柄として、一本鎖標的配列およびプローブを
含有する二本鎖ハイブリッドにおけるミスマッチの存在または非存在を決定する
ために温度および緩衝液組成の変化などの様々なストリンジェンシー条件を用い
ることは公知である。
【００４４】 特に温度に関しては、当該分野で公知なように、完全なマッチとミスマッチと
の間の塩基対合の関数としての水素結合の数の差は、それらの様々なＴｍ(ハイ
ブリッドの５０％が変性する温度)の結果として活用することができる。従って
、完全な相補性を含有するハイブリッドは、すべての他のパラメーターが同一で
あるとして、少なくとも１つのミスマッチを含有するものより高い温度で融解す
る。(ここでの考察の目的では、すべての他のパラメーター(すなわち、ハイブリ
ッドの長さ、骨格の性質(すなわち、天然に存在するか、または核酸類似体)、ア
ッセイ溶液組成および塩基の組成(Ｇ-Ｃ含量を含む)が一定に保持されることに
注意すべきである。しかし、当業者に認識されているように、これらの因子を同
様に変化させた後、考慮してもよい。)
【００４５】 一般的に、ここで概説するように、高いストリンジェンシー条件は、完全なマ
ッチがハイブリダイゼーション複合体に残存するのに対して、不完全なマッチが
融解して除去されることをもたらすようなものである。同様に、低いストリンジ
ェンシー条件は、完全および不完全なマッチの両方を有するハイブリダイゼーシ
ョン複合体の形成を可能にするようなものである。高いストリンジェンシー条件
は当該分野で公知である；例えば、マニアティス(Maniatis)ら、モレキュラー・
クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual)、第２版、1989年、およびショート・プロトコルズ・イン・モレキュ
ラー・バイオロジー(Short Protocols in Molecular Biology)、アウスベル(Aus
ubel)ら編(両方とも出典を示すことにより本明細書の一部をなす)を参照。スト
リンジェントな条件は、配列に依存し、様々な状況によって異なる。長い配列ほ
ど高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する
広範囲な指針は、タイセン(Tijssen)、テクニークズ・イン・バイオケミストリ
ー・アンド・モレキュラー・バイオロジー−ハイブリダイゼーション・ウィズ・
ヌクレイック・アシッド・プローブズ(Techniques in Biochemistry and Molecu
lar Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)、「オーバービュー・
オブ・プリンシプルズ・オブ・ハイブリダイゼーション・アンド・ザ・ストラテ
ジー・オブ・ヌクレイック・アシッド・アッセイズ(Overview of principles of
hybridization and the strategy of nucleic acid assays)」(1993年)に見出
される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨに
おいて特異的な配列の熱的な融点(Ｔｍ)より約５〜１０℃低いように選択される
。Ｔｍは標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で(標的配列はＴｍで過剰
に存在するので、プローブの５０％が平衡状態で占有している)標的配列にハイ
ブリダイズする(所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での)温度である。ス
トリンジェントな条件は、塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオンより低いもので
あり、典型的にはｐＨ７.０〜８.３において約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオ
ン濃度(または他の塩)であり、温度が短いプローブ(例えば、１０〜５０ヌクレ
オチド)の場合は少なくとも約３０℃であり、長いプローブ(例えば、５０ヌクレ
オチドより多い)の場合には少なくとも約６０℃である。また、ストリンジェン
トな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成してもよい。別の
具体例では、より少ないストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が用い
られる；当該分野で公知なように、例えば、適度なまたは低いストリンジェンシ
ー条件を用いてもよい；マニアティス(Maniatis)およびアウスベル(Ausubel)(前
出)ならびにタイセン(Tijssen)(前出)を参照。
【００４６】 当業者に認識されているように、温度を用いたミスマッチ検出は、様々な方法
で進行させうる。
【００４７】 同様に、検出位置におけるミスマッチの存在または非存在を明らかにするため
に、緩衝液組成の変化を用いてもよい。適当な条件としては、ホルミアミド濃度
が挙げられるが、これに限定されない。かくして、例えば、「低い」または「許
容される」ストリンジェンシー条件は０〜１０％のホルムアミド濃度を包含する
に対して、「高い」または「ストリンジェントな」条件は４０％以上のホルムア
ミド濃度を利用する。低いストリンジェンシー条件は１Ｍ以上のＮａＣｌ濃度を
包含し、高いストリンジェンシー条件は０.３Ｍ以下の濃度を包含する。さらに
、低いストリンジェンシー条件は１０ｍＭ以上のＭａＣｌ２濃度を包含し、適度
なストリンジェンシーは１〜１０ｍＭとして、また、高いストリンジェンシー条
件は１ｍＭ以下の濃度を包含する。
【００４８】 この具体例では、温度に関しては、読み出し位置における様々な塩基および様
々なアダプターを有する複数の読み出しプローブを用いてもよい。許容的な条件
下でアッセイを行い、ストリンジェントな条件下で反復することは、検出位置に
おける塩基を明らかにすることを可能にする。
【００４９】 好ましい具体例では、ＯＬＡ(またはＲＣＡ)アッセイシステムの使用および特
異性を可能にするために、２つの標的プローブが用いられる。このことは、ここ
で概説するように、検出位置におけるヌクレオチドを同定するためのゲノタイピ
ング反応における特定の用途を見出す。
【００５０】 基本的なＯＬＡ法は、少なくとも２つの異なる方法で行うことができる；第１
の具体例では、標的配列の一方の鎖だけをライゲーションの鋳型として用いる；
あるいは、両方の鎖を用いてもよい；後者は、一般的には、ライゲーション連鎖
反応またはＬＣＲと呼ばれている。一般的には、米国特許第5,185,243号および
第5,573,907号；EP 0 320 308 B1；EP 0 336 731 B1；EP 0 439 182 B1；WO 90/
01069；WO 89/12696；およびWO 89/09835(すべて出典を示すことにより本明細書
の一部をなす)を参照。以下の考察はＯＬＡに焦点を合わせるが、当業者が認識
するように、これは容易にＬＣＲにも同様に適用することができる。
【００５１】 この具体例では、標的プローブは少なくとも第１のライゲーションプローブお
よび第２のライゲーションプローブを含有する。この方法は、２つのプローブが
標的鎖にハイブリダイズし、かつ、互いにライゲーションしている２つの呼び出
し塩基と標的鎖上の対応する検出位置との間に完全な相補性が存在するなら、２
つのプローブが優先的に互いにライゲーションすることができるという事実に基
づいている。かくして、この具体例では、標的配列は、検出位置を含有する連続
的な第１の標的ドメインと検出位置に隣接する第２の標的ドメインとを含有する
。すなわち、検出位置は、第１の標的ドメインの残りと第２の標的ドメインとの
「間」に存在する。また、プローブの方向は確定的ではない；検出位置は第１の
ライゲーションプローブの「最後」または第２のライゲーションプローブの「始
め」に存在しうる。
【００５２】 第１のライゲーションプローブを第１の標的ドメインにハイブリダイズさせ、
第２のライゲーションプローブ゛を第２の標的ドメインにハイブリダイズさせる
。第１のライゲーションプローブが検出位置の塩基に対して完全に相補的な塩基
を有しており、第２のプローブ上の隣接塩基がその位置に対して完全な相補性を
有している場合には、２つのプローブが一緒になってライゲーションしてライゲ
ーションしたプローブを形成するようにライゲーション構造が形成される。この
相補性が存在しない場合には、ライゲーション構造が形成されず、プローブは適
切な程度にまでは一緒になってライゲーションしない。このことは、熱サイクリ
ングを用いて行なわれてもよく、その場合、ライゲーションしたプローブが標的
配列から変性して離れ、それがさらなる反応の鋳型として役立ちうる。さらに、
後でさらに十分に説明するように、ｄＮＴＰｓおよびポリメラーゼが添加される
場合には（これを「ジェネティック・ビット（Genetic Bit）」分析ということ
がある）、この方法は、３つのライゲーションプローブまたは１またはそれ以上
のヌクレオチドにより隔てられているライゲーションプローブを用いて行なわれ
てもよい。
【００５３】 好ましい具体例において、２つの２本鎖標的配列鎖に対してＬＣＲが行なわれ
る。標的配列が変性され、２セットのプローブ：上で説明した標的の一方の鎖に
対する１のセット、および別個のセット（すなわち第３および第４のライゲーシ
ョン標的プローブ核酸）が添加される。この具体例において、好ましい方法は、
異なったアダプターを付した各セットのプローブを用いるものであり；このこと
は、さらなる特異性の制御において特に有用であり、すなわち、両方の鎖が見ら
れる場合にのみ「陽性」といわれる。
【００５４】 さらに、本明細書にて説明するように、種々の標的に対して実質的に相補的で
あるようにライゲーションプローブの標的特異的配列を設計することもできる。
【００５５】 一般的には、ライゲーションプローブの各標的特異的配列は少なくとも約５ヌ
クレオチドの長さであり、約８ないし１５ヌクレオチドの配列が好ましく、１０
ヌクレオチドの配列が特に好ましい。
【００５６】 好ましい具体例において、３個またはそれ以上のライゲーションプローブが使
用される。この一般的なアイディアを図６に示す。この具体例において、使用さ
れる標的配列の第３のドメインに対して特異的な介在ライゲーションプローブが
存在する。さらに、所望ならば、この具体例を行なってＳＮＰｓを検出してもよ
い。
【００５７】 好ましい具体例において、２つのライゲーション標的プローブは直接に隣接し
ていない。この具体例において、それらは１またはそれ以上の塩基により隔てら
れている。後で増幅反応に関して説明するように、ｄＮＴＰｓおよびポリメラー
ゼの添加、その後のライゲーション反応は、ライゲーションしたプローブの形成
を可能にする。
【００５８】 汎用プライミング部位および標的特異的配列（複数も可）のほかに、本発明の
標的プローブはさらに１またはそれ以上のアダプター配列を含む。「アダプター
配列」は、一般的には標的配列に対して外性的（exogenous）であり、例えば、
アレイ上の捕獲プローブに対して実質的に相補的（好ましくは完全に相補的）で
あるように設計された人工配列である。アダプター配列の使用は、より「汎用」
性のある表面の作出を可能にし、すなわち、限定されたセットの捕獲プローブを
含む１の標準アレイが作成され、いずれかの用途に用いられうる。最終ユーザー
は、異なった可溶性標的プローブを設計することによりアレイをカスタマイズす
ることができ、当業者により理解されるように、そのことは簡単で費用のかから
ないことである。好ましい具体例において、異なった、そして通常には人工的な
捕獲プローブのアレイが作成される；すなわち、捕獲プローブは既知標的配列に
対して相補性を有しない。そして、アダプター配列を標的プローブ中に含めるこ
とができる。
【００５９】 当業者により理解されるように、所望の結合の「強度」および所望の異なるア
ダプターの数によりアデプター配列の長さは様々であろう。好ましい具体例にお
いて、アダプター配列は約６ないし約５００塩基対の範囲の長さであり、約８な
いし約１００塩基対が好ましく、約１０ないし約２５塩基対が特に好ましい。
【００６０】 当業者により理解されるように、アッセイの形式およびアッセイ自体によりア
ダプター配列の位置および方向は様々でありうる。例えば、本明細書に示すＯＬ
Ａ具体例の大部分において、アダプター配列は「上流」ライゲーションプローブ
上に示される；しかしながら、下流プローブを用いてもよい；重要なことは、少
なくとも１のライゲーションプローブがアダプター配列を含むことである。基本
的には、当業者により理解されるように、汎用プライミング部位がプローブの最
も外側の端上に残り、それらの間にすべての配列が増幅されるかぎり、異なった
成分の標的プローブをいずれの順番で配置してもよい。一般的には、アダプター
配列は類似のハイブリダイゼーション特性、例えば、類似の融解温度、類似の（
Ｇ＋Ｃ）含量を有するであろう。
【００６１】 好ましい具体例において、ライゲーションしたプローブ１つあたり２つのアダ
プター配列が使用される。すなわち、図６に一般的に示されるように、各ライゲ
ーションプローブは異なるアダプター配列を含みうる。そして、ライゲーション
したプローブはアレイ上の２つの異なる位置にハイブリダイズするであろう；こ
のことは、一定レベルの品質管理および特異性を提供する。さらに、所望ならば
、単一の標的プローブに対して２つのアダプター配列を用いることも可能である
。
【００６２】 好ましい具体例において、標的プローブは標識配列、すなわち、標識プローブ
に結合するように使用でき、標識プローブに対して実質的に相補的である配列を
含んでいてもよい。このことは、時々、当該分野において「サンドイッチ型」ア
ッセイといわれる。すなわち、その後増幅され、アンプリコン中に存在すること
となる標識配列を標的プローブ中に入れることにより、アレイへの添加前または
後のいずれかにおいて、１次（または２次）標識を含む標識プローブを混合物に
添加することができる。このことは、有効なハイブリダイゼーションのために高
濃度の標識プローブの使用を可能にする。１の具体例において、アレイ上のすべ
ての標的プローブに対して同じ標識配列および標識プローブを用いることが可能
である；あるいはまた、異なる標的プローブが異なる標識配列を有していてもよ
い。同様に、異なる標識配列の使用により品質管理が容易となりうる；例えば、
１の標識配列（および１の色）を１の標的鎖に使用することができ、異なる標識
配列（異なる色を有する）を他の標的鎖に使用することができる；両方の色が同
じ基本的レベルで存在する場合にのみ、陽性といえる。
【００６３】 かくして、本発明は、汎用プライミング配列、標的特異的配列（複数も可）、
アダプター配列および所望により標識配列を含む標的プローブを提供する。次い
で、これらの標的プローブは標的配列に添加されて、ハイブリダイゼーション複
合体を形成する。当業者により理解されるように、ハイブリダイゼーション複合
体は、２本鎖である部分（標的配列の一部分にハイブリダイズした標的プローブ
の標的特異的配列）および１本鎖である部分（本明細書にて説明するように、汎
用プライミング配列およびアダプター配列を含む標的プローブの末端、ならびに
ポリ（Ａ）テイルのごとき標的配列の未ハイブリダイゼーション部分）を含む。
【００６４】 ハイブリダイゼーション複合体が形成されると、未ハイブリダイゼーションプ
ローブが除去される。すべての標的プローブが、汎用プライミング配列を用いた
増幅を複雑化させるいくつかの予想できない構造を形成しうるので、このことは
重要である。かくして、特異性（例えば、試料中に存在しない標的配列に指向さ
れた標的プローブが増幅されず、検出されないこと）を確実にするために、すべ
てのハイブリダイゼーションしないプローブを除去することが重要である。当業
者により理解されるように、標的配列に基づく方法、２本鎖特異的部分を用いる
方法、およびプローブ設計および成分に基づく方法を包含する種々のやり方でこ
のことを行なうことができる。
【００６５】 好ましい具体例において、標的特異的な方法が用いられる。すなわち、試料中
のすべての標的に共通したいずれかの特性を用いることができる。例えば、標的
配列がｍＲＮＡｓのごときポリ（Ａ）テイルを含む場合、ポリ（Ｔ）配列を含む
支持体を用いて未ハイブリダイズ標的プローブの分離を行なう。当該分野におい
て知られているように、ターミナルトランスフェラーゼを用いるポリマー化、あ
るいはオリゴＡリンカーの連結によりポリ（Ａ）テイルを標的に付加してもよい
。
【００６６】 かくして、例えば、支持体（後で定義する）、特に、ポリ（Ｔ）配列を含む磁
気ビーズを、標的配列および標的プローブを含む混合物に添加する。この具体例
において、第１のハイブリダイゼーション複合体は、一般的には１０ないし１０
０個のアデノシンであるポリ（Ａ）配列を含む１本鎖部分を含む。図７に示すよ
うに、第１のハイブリダイゼーション複合体は第２のハイブリダイゼーション複
合体を形成する。次いで、ポリ（Ｔ）支持体を用いて未ハイブリダイズ標的プロ
ーブをハイブリダイゼーション複合体から分離する。例えば、磁気ビーズを用い
る場合に、それらを混合物から除去し、洗浄することができる；遠心分離により
非磁気ビーズを除去し、次いで洗浄等を行なってもよい。次いで、温度工程のご
とき変性工程を用いてハイブリダイゼーション複合体をビーズから遊離（および
変性）させる。
【００６７】 好ましい具体例において、結合リガンドを標的配列に付加することに依存する
方法が行なわれる。この具体例において、ハイブリダイゼーション複合体を未ハ
イブリダイズプローブから分離するのに使用できる結合パートナーを付加するた
めに酵素が用いられる。例えば、ターミナルトランスフェラーゼ酵素を用いて、
ビオチン（または２次標識に関して本明細書で説明する他のもの）のごとき結合
リガンドを含むｄＮＴＰｓを標的配列（複数も可）の末端に付加する。次いで、
結合リガンドの結合パートナーを最終的に用いて未ハイブリダイズプローブを分
離または除去することができる。
【００６８】 当業者により理解されるように、このことを種々のやり方で行なうことができ
る。好ましい具体例において、ハイブリダイゼーション複合体形成前に結合リガ
ンドを標的配列に付加する。別法として、それを後から付加してもよいが、この
具体例において、結合リガンドは未ハイブリダイズプローブに結合するものであ
ってはならない；例えば、キャップされた末端を用いて末端（あるいは２つのラ
イゲーションプローブを用いる場合には末端（複数））がブロックされているプ
ローブを用いてこのことを行なうことができる。
【００６９】 好ましい具体例は、ターミナルトランスフェラーゼおよびビオチンで標識され
たジデオキシヌクレオチドを用いるものであるが、当業者により理解されるよう
に、結合リガンドは連鎖終止ヌクレオチドに結合される必要はない。
【００７０】 付加された場合、ハイブリダイゼーション複合体形成の前または後に標的配列
を固定化してもよい。好ましい具体例において、本発明のプローブ（複数も可）
とのハイブリダイゼーション複合体の形成前に結合リガンドの結合パートナーを
含む表面または支持体上に標的配列を固定化する。例えば、好ましい具体例は、
結合パートナーが被覆されたエッペンドルフチューブまたはマイクロタイターウ
ェルのごとき反応容器を用いるものである。別法として、支持体は磁気ビーズを
包含するビーズの形態であってもよい。この具体例において、標的配列が固定化
され、標的プローブが添加されてハイブリダイゼーション複合体が形成される。
次いで、未ハイブリダイズプローブを洗浄工程により除去し、その後、通常には
昇温して、あるいはバッファー条件（ｐＨ、塩等）により、結合プローブ（例え
ば、標的プローブ、ライゲーションしたプローブ、またはライゲーションしたＲ
ＣＡプローブ）を支持体から溶離させる。
【００７１】 別法として、ハイブリダイゼーション複合体、ライゲーション複合体および／
またはライゲーションした複合体の形成後に標的配列を固定化してもよい。すな
わち、溶液中の標的にプローブを添加し、必要に応じて酵素を添加等することが
できる。ハイブリダイゼーション複合体が形成され、そして／あるいはライゲー
ションされた後に、結合パートナーを含む支持体にハイブリダイゼーション複合
体を添加し、未ハイブリダイズプローブを除去することができる。
【００７２】 この具体例において、特に好ましい結合リガンド／結合パートナーのペアーは
ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジン、抗原と抗体であるが；他の化学
的方法を本明細書に記載する。
【００７３】 別法として、標的がポリ（Ａ）部分のごとき共通の特徴または配列を含まない
場合、あるいは結合リガンドが付加されない場合、１本鎖および２本鎖核酸の間
の相違に基づく分離方法を行なってもよい。例えば、１本鎖核酸よりも２本鎖核
酸と優先的に相互作用する種々の２本鎖特異的部分が知られている。例えば、２
本鎖核酸の積み重なった塩基対中に挿入する多種のインターカーレーターが知ら
れている。もっともよく知られた２つの例は臭化エチジウムおよびアクチノマイ
シンＤである、同様に、１本鎖および２本鎖を識別するために用いられうる多く
の主溝および副溝結合蛋白がある。ポリ（Ｔ）の具体例と同様に、これらの部分
を磁気ビーズのごとき支持体に結合させて、優先的にハイブリダイゼーション複
合体に結合させ、そして非ハイブリダイズ標識プローブおよび標的配列を洗浄工
程の間に除去するために使用してもよい。次いで、温度工程のごとき変性工程を
用いてハイブリダイゼーション複合体をビーズから遊離させる。
【００７４】 ＯＬＡ反応が行なわれる場合、図８に示されるさらなる具体例を行なって未ハ
イブリダイズプライマーを除去してもよい。この具体例において、アダプター配
列を含まない下流ライゲーションプローブの３’末端にヌクレアーゼ阻害剤を付
加する。かくして、阻害剤を含まないいずれの核酸も（５’未ライゲーションプ
ローブおよび標的配列自体を包含）、３’−エキソヌクレアーゼの添加により消
化されるであろう。例えば、４−ホスホロチオエート残基をそれらの３’末端に
含ませて、そのことによりそれらをエキソヌクレアーゼ消化耐性にすることによ
って、ライゲーション生成物がエキソＩ消化から保護される。未ライゲーション
検出オリゴヌクレオチドは保護されず、消化される。５’上流ライゲーションプ
ローブはアダプター配列を担持しているので、ヌクレアーゼ阻害剤を担持し、か
くして消化されない未ライゲーション下流プローブはアレイに結合せず、洗い流
されうる。
【００７５】 適当なヌクレアーゼ阻害剤が当該分野において知られており、チオールヌクレ
オチドを含む。この具体例において、適当な３’−エキソヌクレアーゼは、エキ
ソＩ、エキソＩＩＩ、エキソＶＩＩ、および３’−５’エキソホスホジエステラ
ーゼを包含するが、これらに限らない。
【００７６】 ハイブリダイズしないプローブ（さらに、好ましい場合には、興味の対象でな
い試料由来の他の配列）が除去されたならば、ハイブリダイゼーション複合体が
変性され、標的プローブが増幅されてアンプリコンを形成し、次いで、それらが
検出される。ＰＣＲ増幅およびローリングサークル増幅を包含するいくつかのや
り方のうちの１つで、このことを行なってもよい。さらに、後で説明するように
、種々のやり方で標識をアンプリコン中に含ませることができる。
【００７７】 好ましい具体例において、標的増幅法はＰＣＲである。ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）は広く用いられ、記載されており、標的配列を増幅するために熱サイ
クリングと組み合わされたプライマー伸長の使用を含む；米国特許第４６８３１
９５号および第４６８３２０２号、ならびにPCR Essential Data, J. W. Wiley
& sons, Ed. C. R. Newton, 1995参照（参照によりそれらすべてを本明細書に一
体化させる）。
【００７８】 一般的には、ＰＣＲは以下のように簡単に説明できる。一般的には温度を上昇
させることにより２本鎖ハイブリダイゼーション複合体を変性させ、次いで、過
剰のＰＣＲプライマー存在下で冷却し、ＰＣＲプライマーを第１の汎用プライミ
ング部位にハイブリダイズさせる。次いで、ＤＮＡポリメラーゼがｄＴＮＰを用
いて伸長されたプライマーに作用し、新たな鎖の合成を引き起こし、ハイブリダ
イゼーション複合体が形成される。次いで、試料を再加熱してハイブリダイゼー
ション複合体を解離させ、次いで、プロセスを繰り返す。第２の汎用プライミン
グ部位にハイブリダイゼーションする相補的な標的鎖に対する第２のＰＣＲプラ
イマーを用いることにより、迅速かつ指数的な増幅が起こる。かくして、ＰＣＲ
工程は変性、アニーリングおよび伸長である。ＰＣＲの詳細はよく知られており
、ＴａｑＩポリメラーゼのごとき耐熱性ポリメラーゼおよび温度サイクリングの
使用を包含する。適当なＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ
フラグメント、SEQUENASE1.0およびSEQUENASE2.0（U.S. Biochemical）、T5 DNA
ポリメラーゼならびにPhi29 DNAポリメラーゼを包含するが、これらに限らない
。
【００７９】 標的配列を含む標的プローブを、汎用プライマー、ポリメラーゼおよび１セッ
トのヌクレオチドを含む溶液に導入することにより反応を開始させる。この文脈
において、「ヌクレオチド」はデオキシヌクレオシド−三リン酸（デオキシヌク
レオチドまたはｄＮＴＰｓ、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧ
ＴＰとも呼ばれる）を意味する。いくつかの具体例において、後で説明するよう
に、１またはそれ以上のヌクレオチドが検出可能な標識を含んでいてもよく、そ
れらは１次または２次標識であってもよい。さらに、システムの形態によっては
ヌクレオチドはヌクレオチドアナログであってもよい。同様に、プライマーが１
次または２次標識を含んでいてもよい。
【００８０】 したがって、ＰＣＲ反応は少なくとも１つのＰＣＲプライマー、ポリメラーゼ
、および１セットのｄＮＴＰを必要とする。ここで説明するように、プライマー
が標識を含んでいてもよく、あるいは１またはそれ以上のｄＮＴＰが標識を含ん
でいてもよい。
【００８１】 好ましい具体例において、本発明の方法はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）
工程を含む。いくつかのやり方でこれを行なうことができる。１の具体例におい
て、１本鎖標的プローブまたはライゲーションしたプローブのいずれかをアッセ
イの遺伝子型決定部分に用い、次いで、ＰＣＲのかわりにＲＣＡを行なうことが
できる。別法として、より好ましくは、ＲＣＡ反応は遺伝子型決定反応の部分を
構成し、反応の方法において遺伝子型決定および増幅の両方に使用できる。
【００８２】 好ましい具体例において、方法はローリングサークル増幅に依存する。「ロー
リングサークル増幅」は標的配列にハイブリダイズした環状プローブの伸長に基
づくものである。プローブ配列を伸長させるポリメラーゼを添加する。環状プロ
ーブは末端を有しないので、ポリメラーゼは環状プローブを繰り返し伸長させ、
環状プローブのコンカタマーを生じさせる。そのようなものとして、プローブが
増幅される。一般的には、ローリングサークル増幅は、Baner et al. (1998) Nu
c. Acids Res. 26: 5073-5078; Barany, F. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 88: 189-193; およびLizardi et al. (1998) Nat. Genet. 19: 225-232に記載
されており、参照によりそれらすべてを本明細書に一体化させる。
【００８３】 一般的には、図９および１０に示されるように、ＲＣＡは２つのやり方で説明
される。第１に、後でより詳細に説明するように、単一の標的プローブを標的核
酸とハイブリダイズさせる。プローブの各末端は標的核酸上に隣接してハイブリ
ダイズし、上記ＯＬＡアッセイが行なわれる。ライゲーションした場合には、プ
ローブが環化し、その一方で標的核酸にハイブリダイズする。ポリメラーゼの添
加により環状プローブの伸長が起こる。しかしながら、プローブは末端を有しな
いので、ポリメラーゼはプローブを繰り返し伸長させ続ける。かくして環状プロ
ーブの増幅が起こる。
【００８４】 第２の別アプローチは２工程プロセスを含む。この具体例において、先ず、そ
れぞれ汎用プライミング配列を含んでいる２つのライゲーションプローブを一緒
にしてライゲーションさせる。次いで、汎用プライミング配列にハイブリダイゼ
ーションするであろう部分を有するローリングサークルプライマーを添加する。
次いで、リガーゼの存在により、その後上記のごとく増幅されるローリングサー
クルプライマーをポリメラーゼプライマーとして用いて元のプローブが環化され
る。
【００８５】 これらの具体例は、ライゲーションしていないプローブを必ずしも除去する必
要はないという利点も有する。なぜなら標的不存在下においては有意な増幅が起
こらないからである。プローブを設計することによりこれらの利益を最大化させ
てもよい；例えば、第１の具体例において、単一の標的プローブが存在する場合
に、プローブの５’末端に近いところに汎用プライミング部位を置く。このとは
、アダプターを用いずに、ライゲーション反応の不存在下において、短い末端切
断された断片の生成に役立つであろう。
【００８６】 したがって、好ましい具体例において、単一のオリゴヌクレオチドをＯＬＡ用
ならびにＲＣＡ用の環状鋳型として使用する（本明細書において「なんきん錠プ
ローブ」または「ＲＣＡプローブ」という）。すなわち、オリゴヌクレオチドの
各末端は標的核酸に対して相補的な配列を含み、上記のごとくＯＬＡプライマー
として機能する。すなわち、ＲＣＡプローブの第１の末端は第１の標的ドメイン
に対して実質的に相補的であり、ＲＣＡプローブの第２の末端は、第１のドメイ
ンに隣接した第２の標的ドメインに対して実質的に相補的である。標的核酸への
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション複合
体の形成を引き起こす。「プライマー」（単一オリゴヌクレオチドの別個の末端
である）のライゲーションは、環状プローブを含む修飾されたハイブリダイゼー
ション複合体、すなわちＲＣＡ鋳型複合体の形成を引き起こす。すなわち、オリ
ゴヌクレオチドが環化され、その一方で、やはり標的核酸とハイブリダイズする
。これはＲＣＡ用の環状鋳型として役立つ。ＲＣＡ鋳型複合体へのプライマーお
よびポリメラーゼの添加はアンプリコンの形成を引き起こす。
【００８７】 種々のやり方でアンプリコンの標識を行なうことができ、例えば、本明細書で
一般的に説明するように、ポリメラーゼが標識ヌクレオチドを含んでいてもよく
、あるいは別法として、ＲＣＡプローブの一部分に対して実質的に相補的で、使
用される少なくとも１の標識を含む標識プローブを用いる。
【００８８】 ポリメラーゼはいずれのポリメラーゼであってもよいが、好ましくは、３’エ
キソヌクレアーゼ活性（３’エキソ）を欠くものである。適当なポリメラーゼの
例は、エキソヌクレアーゼマイナスＤＮＡポリメラーゼＩ大（クレノウ）フラグ
メント、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等を包含
するが、これらに限らない。さらに、いくつかの具体例において、１本鎖ＤＮＡ
を複製（すなわち、２本鎖セクションを形成するプライマーなしで）できるであ
ろうポリメラーゼを用いることができる。
【００８９】 好ましい具体例において、ＲＣＡプローブは本明細書にて説明したアダプター
配列を含み、微小球アレイを用いる場合にはアレイ上、例えば微小球上のアダプ
ター捕獲プローブを伴う。別法として、ＲＣＡプローブのユニークな部分、例え
ば、標的配列に対応する配列の全部または一部を用いて捕獲プローブに結合させ
ることもできる。
【００９０】 好ましい具体例において、なんきん錠プローブは制限部位を含む。制限エンド
ヌクレアーゼ部位は、典型的にはＲＣＡの結果物である長いコンカタマーのより
小さいユニットへの開裂を可能にし、それらのユニットは、表面に結合した捕獲
プローブにより効率的またはより迅速にハイブリダイゼーションする。かくして
、ＲＣＡ後に、生成物である核酸を適当な制限エンドヌクレアーゼに接触させる
。このことにより、生成物である核酸が開裂されて小さいフラグメントとなる。
次いで、固定化された捕獲プローブにフラグメントをハイブリダイズさせ、微小
球上に一定濃度の生成物であるフラグメントを得る。さらに、本明細書にて説明
するように、１または２つのやり方でこれらのフラグメントを検出することがで
きる：複製工程の間に標識ヌクレオチドが取りこまれるか、あるいはさらなる標
識プローブが付加されるかである。
【００９１】 かくして、好ましい具体例において、なんきん錠プローブは標識配列；すなわ
ち、標識プローブへの結合に用いられ、標識プローブに対して実質的に相補的で
ある配列を含む。１の具体例において、アレイ上のすべてのなんきん錠プローブ
に対して同じ標識配列および標識プローブを使用することができる。
【００９２】 なんきん錠プローブはＲＣＡ反応をプライミングするためのプライミング部位
を含んでいてもよい。すなわち、各なんきん錠プローブは、プライマー核酸がハ
イブリダイズする配列を含み、ポリメラーゼ用の鋳型を形成する。プライマーは
環状プローブのいずれの部分において見出されるものであってもよい。好ましい
具体例において、プライマーはプローブ中の別個の部位にある。この具体例にお
いて、それぞれ別個のなんきん錠プローブ中のプライマー部位が同じであり、例
えば、汎用プライミング部位であるが、このことは必要なことではない。同じ配
列を伴うプライマー部位を用いることの利点は、複数の異なるハイブリダイゼー
ション複合体を伴うＲＣＡアッセイをプライムするために単一のプライマーオリ
ゴヌクレオチドのみを使用できることを包含する。すなわち、なんきん錠プロー
ブは、それが設計された標的核酸にユニークにハイブリダイズする。単一のプラ
イマーはユニークなハイブリダイゼーション複合体のすべてにハイブリダイゼー
ションし、ポリメラーゼ用のプライミング部位を形成する。次いで、ハイブリダ
イゼーション複合体のユニークな各なんきん錠プローブ中の同じ位置からＲＣＡ
が開始する。
【００９３】 別の具体例において、プライマー部位は、施錠（padlock）プローブの上記エ
レメントのいずれかのうちで重複し、包含し、または存在することができる。す
なわち、プライマーは例えば、重複することが見出され、または制限部位もしく
はアイデンティフィヤー（identifier）配列内で見出されることができる。該具
体例において、プライマー核酸が選択されたプライマー部位と塩基対になるよう
に設計される必要がある。
【００９４】 したがって、本発明の施錠プローブは各末端にて、ＯＬＡプライマーに対応す
る配列を含有する。施錠プローブの介在配列は、特定の順序はなく、アダプター
配列および制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。さらに、施錠プローブはＲ
ＣＡプライミング部位を含有する。
【００９５】 したがって、好ましい具体例において、ＯＬＡ／ＲＣＡが溶液中で行われ、次
いで、ＲＣＡ産物の制限エンドヌクレアーゼ切断が行われる。次いで、切断産物
を、ビーズを含んでなるアレイであって、各ビーズが施錠プローブ中に配置され
るアダプター配列に相補的なプローブを含むアレイに供する。増幅されたアダプ
ター配列は特定の標的核酸と相関する。したがって、エンドヌクレアーゼ部位の
組み込みは、短く、容易にハイブリダイズ可能な配列を生じさせる。さらに、各
配列はハイブリダイゼーション特異性に基づいて分析されるので、各ローリング
サークル施錠プローブ配列中の独特のアダプター配列により、核酸配列の異なっ
たセットをアレイ上で同時に分析することができる。
【００９６】 したがって、本発明はアンプリコン（時々、本明細書において二次標的ともい
う）の生成を提供する。 好ましい具体例において、アンプリコンを検出標識で標識する。本明細書にお
いて、「検出標識」または「検出可能な標識」なる語により、検出を可能にする
部分を意味する。これは、一次標識または二次標識であってもよい。したがって
、検出標識は一次標識（すなわち、直接検出可能）または二次標識（間接的に検
出可能）であってもよい。
【００９７】 好ましい具体例において、検出標識は一次標識である。一次標識は、直接検出
できるものであり、例えば、発蛍光団である。一般に、標識は３つのクラス：ａ
）放射能または重同位体であってもよい同位体標識；ｂ）磁気、電気、温度標識
；およびｃ）着色またはルミネセンス色素に分かれる。標識はまた、酵素（西洋
ワサビペルオキシダーゼなど）および磁性粒子を包含できる。好ましい標識は、
発色団または燐光体を包含するが、好ましくは蛍光色素である。本発明における
使用に適当な色素は、限定するものではないが、ユーロピウムおよびテルビウム
の複合体を包含する蛍光ランタニド複合体、フルオレセイン、ローダミン、テト
ラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル−クマリン、
量子ドット（「ナノクリスタル」ともいう；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１５，５
８４を参照のこと。出典明示により本明細書の一部とされる）、ピレン、マラカ
イトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＴＭ（登録
商標）（Cascade BlueTM)、テキサスレッド、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５など）
、alexa色素、フィコエリシン（phycoerythin）、bodipyおよびRichard P. Haug
landによるthe Molecular Probes Handbookの第６版（出典明示により特に本明
細書の一部とされる）に記載の他の色素を包含する。
【００９８】 好ましい具体例において、二次検出可能な標識を使用する。二次標識は間接的
に検出されるものであり、例えば、二次標識は検出用の一次標識と結合または反
応することができるか、一次標識を生じる付加的な生産物（例えば、酵素）上で
作用することができるか、または二次標識を含む化合物を非標識物質から分離す
ることが可能である。二次標識は、限定するものではないが、ビオチン／ストレ
プトアビジンのような結合パートナー対のうち１つ；化学的修飾可能な部分；ヌ
クレアーゼ阻害剤、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ル
シフェラーゼなどの酵素などを包含する。
【００９９】 好ましい具体例において、二次標識は結合パートナー対である。例えば、標識
は、その結合パートナーと結合するハプテンまたは抗原であってもよい。好まし
い具体例において、結合パートナーは固体支持体に結合して伸長および非伸長プ
ライマーの分離を可能とすることができる。例えば、適当な結合パートナー対は
、限定するものではないが、抗原（例えば、蛋白質（ペプチドを包含する）およ
び抗体（そのフラグメント（ＦＡｂｓなど）を包含する））；蛋白質および小型
分子（ビオチン／ストレプトアビジンを包含する）；酵素および基質または阻害
剤；他の蛋白質−蛋白質相互作用対；レセプター−リガンド；ならびに炭水化物
およびその結合パートナーを包含する。核酸−核酸結合蛋白質対もまた有用であ
る。一般に、対の小さい方をプライマー中に組み込むためのＮＴＰに結合させる
。好ましい結合パートナーは、限定するものではないが、ビオチン（またはイミ
ノ−ビオチン）およびストレプトアビジン、ジゲオキシニンおよびＡｂｓ、およ
びＰｒｏｌｉｎｘＴＭ（登録商標）試薬（www.prolinxinc.com/ie4/home.hmtlを
参照のこと）を包含する。
【０１００】 好ましい具体例において、結合パートナー対はビオチンまたはイミノ−ビオチ
ンおよびストレプトアビジンよりなる。イミノ−ビオチンはｐＨ４．０バッファ
ー中でストレプトアビジンから解離するが、ビオチンは苛酷な変性剤を必要とす
るので（例えば、６ＭグアニジニウムＨＣｌ、ｐＨ１．５または９０％ホルムア
ミド、９５℃）、イミノ−ビオチンが特に好ましい。
【０１０１】 好ましい具体例において、結合パートナー対は、一次検出標識（例えば、ＮＴ
Ｐに結合し、それによりアンプリコンに結合している）および一次検出標識に特
異的に結合する抗体よりなる。本明細書中において、「特異的に結合する」なる
語により、対と系の他の成分または汚染物質との間を区別するのに十分な特異性
をもってパートナーが結合することを意味する。結合は、非特異的結合を排除す
るための洗浄段階を包含するアッセイの条件下で結合したままであるのに十分な
ものであるべきである。いくつかの具体例において、対の解離定数は約１０−４ 〜１０−６Ｍ−１未満であり、約１０−５〜１０−９Ｍ−１未満が好ましく、約
１０−７〜１０−９Ｍ−１未満が特に好ましい。
【０１０２】 好ましい具体例において、二次標識は化学的に修飾可能な部分である。該具体
例において、反応性官能基を含む標識を核酸中に組み込む。次いで、官能基を一
次標識で標識することができる。適当な官能基は、限定するものではないが、ア
ミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基およびチオール基を包含し、ア
ミノ基およびチオール基が特に好ましい。例えば、アミノ基を含有する一次標識
をアミノ基を含む二次標識に、例えば、当該分野で既知のリンカー（例えば、ホ
モまたはヘテロ−二官能性リンカーがよく知られている（1994 Pierce Chemical
Company カタログ, 架橋剤のテクニカルセクション, 第155-200頁を参照のこと
。出典明示により本明細書の一部とされる））を用いて結合させることができる
。
【０１０３】 本明細書中に概説されるように、標識は、当業者に明らかなように種々の方法
で行うことができる。一般に、標識は３つの方法：標識をプライマー中に組み込
み、その結果、増幅反応が標識を含むアンプリコンを生じる；標識をｄＮＴＰに
結合させ、ポリメラーゼによってアンプリコン中に組み込む；またはアンプリコ
ンが標識プローブをハイブリダイズするために使用される標識配列を含み、標識
プローブが標識を含む、のうち１つで行うことができる。後者の場合、アンプリ
コンをアレイと接触させる前または後のいずれでも標識プローブを加えることが
できることに注目すべきである。
【０１０４】 好ましい具体例は、蛍光標識したストレプトアビジンに結合するために用いら
れるビオチンを含む１のプライマーを利用する。 本明細書中で概説される方法のほかに、本発明はまた、ゲノムＤＮＡのゲノタ
イピングを達成するための方法も提供する。一般に、該方法は、概ねＷＯ００／
６３４３７に記載されるように（出典明示により本明細書の一部とされる）、下
記のとおり記載することができる。ゲノムＤＮＡを試料細胞から調製する（一般
に、当該分野でよく知られているように、例えば、剪断することによって、また
はＤＮＡｓｅＩのような酵素での酵素的処理によって、より小さいセグメントに
切断する）。下記で概説するように、多数の技術を用いて、ゲノムフラグメント
を共有結合によるかまたは安定に、ビーズまたは反応ウェル（エッペンドルフチ
ューブ、ミクロタイターウェルなど）のような支持体に結合させる。次いで、下
記に概説するように、多数の異なるゲノタイピング反応を行うことができ、これ
らのゲノタイピング反応由来の反応産物を支持体から遊離し、必要ならば増幅し
、本明細書に概説するような捕獲プローブのアレイに加える。一般に、本明細書
に記載の方法はヌクレオチド置換の検出に関するが、当業者に明らかなように、
欠失、挿入、逆位なども検出可能である。また、必要に応じて、ユニバーサルプ
ライマーも包含することができる。
【０１０５】 これらのゲノタイピング技術は５つの一般的なカテゴリー：（１）検出位置で
ヌクレオチドを識別するために、ストリンジェンシーな条件の変化（温度、バッ
ファー条件など）を利用する伝統的なハイブリダイゼーション法による技術；（
２）検出位置でのヌクレオチドとの塩基対になるために塩基を加える伸長技術；
（３）完全な相補性が検出位置に存在する場合に選択的にライゲーション反応が
起こるための、リガーゼ酵素の特異性（またはある場合には、化学的技術の特異
性）によるライゲーション技術；（４）完全な相補性が存在する場合に選択的に
切断が起こるための、酵素的または化学的特異性による切断技術；および（５）
これらの方法を組み合わせた技術に分かれる。
【０１０６】 上記のように、必要ならば、標的ゲノム配列を既知の技術を用いて調製し、次
いで、本明細書で定義されるような固体支持体に結合させる。これらの技術は、
限定するものではないが、酵素的結合、化学的結合、光化学または熱による結合
および吸着を包含する。
【０１０７】 好ましい具体例において、本明細書で概説されるように、酵素的技術を用いて
ゲノムＤＮＡを支持体に結合する。例えば、ターミナルトランスフェラーゼ末端
標識技術を上記に概説するように使用できる（Hermanson, Bioconjugate Techni
ques, San Diego, Academic Press, pp640-643参照）。該具体例において、二次
標識（例えば、結合リガンド）で標識されたヌクレチドをゲノムＤＮＡの末端に
加え、かくして、コートされたまたは結合パートナーを含有する支持体を使用し
てゲノムＤＮＡを固定することができる。別法では、ターミナルトランスフェラ
ーゼを用いて、支持体に特異的に結合することができる特別の化学官能性を有す
るヌクレオチドを加えることができる。同様に、ランダムプライム標識またはニ
ック−トランスレーション標識（前掲、99.640-643）も用いることができる。
【０１０８】 好ましい具体例において、化学的標識（前掲、pp.6444-671）を用いることが
できる。該具体例において、重亜硫酸塩で触媒されるアミノ基転移、シトシン残
基のスルホン化、Ｔ、ＣおよびＧ塩基の臭素活性化、ＲＮＡの過ヨウ素酸塩酸化
または５’リン酸のカルボジイミド活性化を行うことができる。
【０１０９】 好ましい具体例において、光化学または熱活性化標識を行う（前掲、p162-166
）。かくして、例えば、アリールアジドおよびニトレンは、好ましくはアデノシ
ンを標識し、ＣおよびＴをほとんど標識しない（Aslamら、Bioconjugation: Pro
tein Coupling Techniques for Biomedical Sciences; New York, Grove's Dict
ionaries, 883pp.）。プソラレンまたはアンゲリシン化合物も使用できる（Asla
m, p492, 前掲）。白金錯体のインターカレーションによってグアニンの選択的
な修飾を達成することができる（Aslam, 前掲）。
【０１１０】 好ましい具体例において、ゲノムＤＮＡをアミン被覆固相のような陽荷電した
表面上に吸収させることができる。保持力増強のために、物理的吸収後にゲノム
ＤＮＡを表面に架橋させることができる（例えば、ＰＥＩコーティングおよびグ
ルタルアルデヒド架橋；Aslam, 前掲、p.485）。 好ましい具体例において、直接的な化学結合または光架橋を行って、固相基剤
上の直接的な化学基を用いることによってゲノムＤＮＡを固相に結合させること
ができる。例えば、５’リン酸のカルボジイミド活性化、ＤＮＡ塩基上の環外ア
ミンへの結合およびプソラレンを、ＤＮＡへの架橋のために固相に結合できる。
【０１１１】 いったん支持体に加えると、標的ゲノム配列を種々の原因の種々の反応に用い
ることができる。例えば、好ましい具体例において、ゲノタイピング反応を行う
。同様に、これらの反応を用いて標的ゲノム配列の存在または不在を検出するこ
ともできる。さらに、いずれかの反応において、標的ゲノム配列の定量を行って
もよい。下記の考察はゲノタイピング反応に焦点を合わせているが、該考察は等
しく、標的配列の存在を検出することおよび／またはそれらの定量にあてはまる
。
【０１１２】 当業者に明らかなように、下記の反応は幅広い種類の形式で行うことができる
。１の具体例において、ゲノムＤＮＡを固体支持体に結合させ、ユニバーサルプ
ライマーを含むプローブを加えて、本明細書に概説されるような種々の形式にお
いて、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる。次いで、ハイブリダイズし
ていないプローブを除去し、ハイブリダイゼーション複合体を変性させる。これ
によりプローブ（しばしば、いくつかの方法において改変されている）を遊離す
る。次いで、それらを増幅し、捕獲プローブのアレイに加える。好ましい具体例
において、酵素的工程の前にハイブリダイズしていないプライマーを除去する。
このいくつかの具体例を上記している。別法では、ゲノムＤＮＡを固体支持体に
結合させ、ゲノタイピング反応の間（例えば、熱循環を用いることによって）ま
たは後のいずれかに、ユニバーサルプライマーを用いることなく同様に増幅が可
能な形式でゲノタイピング反応を行う。かくして、例えば、標識プローブを用い
る場合、それらを固定したゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることができ、非結
合材料を除去し、次いで、溶出および収集してアレイに加える。これを増幅目的
で繰り返してもよく、溶出フラクションをプールし、アレイに加える。さらに、
侵入性切断反応（下記する）の生産物をユニバーサルプライマーまたはユニバー
サルプライマーとアダプターを含むように伸長するような別の増幅スキームを行
うことができる。１の具体例において、これにより、標的プローブの異なるセッ
トまたはセットを有する固定した標的配列の再使用が可能となる。
【０１１３】 いくつかの具体例において、ゲノタイピング反応の生産物の増幅は必要ない。
例えば、あまり複雑でないゲノム、例えば、細菌、酵母およびドロソフィラ（Dr
osophila）において、増幅の必要なく、検出可能なシグナルが達成される。これ
は、より詳しく下記に概説するように、特に典型的には、プライマー伸長が行わ
れ、１以上の塩基をプローブに加える場合である。 好ましい具体例において、ストレートハイブリダイゼーション法を用いて、検
出位置での塩基の正体を解明する。概して、これらの技術は２つの基本型の反応
：競合的ハイブリダイゼーション技術によるものおよびストリンジェンシーパラ
メーターおよびその組み合わせを用いて区別するものに分かれる。
【０１１４】 好ましい具体例において、競合的ハイブリダイゼーションプローブを使用して
、検出位置でのヌクレオチドの正体またはミスマッチの存在のいずれかを解明す
る。例えば、ハイブリダイゼーションによる配列決定が記載されている（Drmana
cら、Genomics 4: 114 (1989); Kosterら、Nature Biotechnology 14: 1123 (19
96); 特に米国特許第５，５２５，４６４号；５，２０２，２３１号および５，
６９５，９４０号（いずれも、出典明示により全体として本明細書の一部とする
）。
【０１１５】 上記に概説されるように、好ましい具体例において、複数の読出しプローブを
用いて検出位置での塩基を同定する。該具体例において、各々の異なる読出しプ
ローブは、異なる検出標識（下記に概説されるように、一次標識または二次標識
のいずれかであることができる）または異なるアダプターのいずれか、および標
的配列の検出位置（本明細書中では読出し位置という）にハイブリダイズする位
置に異なる塩基を含み、その結果、ディファレンシャルハイブリダイゼーション
が起こる。
【０１１６】 したがって、いくつかの具体例において、検出可能な標識を読出しプローブ中
に組み込む。好ましい具体例において、各プローブが読出し位置で異なる塩基を
含む読出しプローブのセットを用いる。いくつかの具体例において、各読出しプ
ローブは他と区別できる異なる標識を含む。例えば、第１の標識を読出し位置で
アデノシンを含むプローブに用いてもよく、第２の標識を読出し位置でグアニン
を含むプローブに用いてもよい。好ましい具体例において、各読出しプローブの
長さおよび配列は読出し位置を除いて同一であるが、このことは全ての具体例に
おいて当てはまる必要はない。
【０１１７】 読出しプローブの数はアッセイの最終目的によって変化するであろう。例えば
、多くのＳＮＰｓは二対立性であって、したがって、各々が検出位置の塩基のう
ち１つと塩基対になる呼びかけ塩基（interrogation base）を含む２つの読出し
プローブである。配列決定の場合、例えば、ＳＮＰｓの発見について、４つの読
出しプローブのセットを用いるが、ＳＮＰｓはより少数の読出しパラメーターを
用いて見出され得る。
【０１１８】 １の具体例において、読出しプローブとして用いられるプローブは、Whitcomb
eら、Nature Biotechnology 17: 804 (1999)（出典明示により本明細書の一部と
される）において広く記載されるような「モレキュラー・ビーコン（Molecular
Beacon）」プローブである。当該分野で知られているように、モレキュラー・ビ
ーコンプローブは「ヘアピン」型構造を形成し、一端に蛍光標識を有し、もう一
端にクエンチャーを有する。標的配列の不在下で、ヘアピンの末端がハイブリダ
イズし、標識のクエンチングを引き起こす。標的配列の存在下で、標的配列が結
合するためにヘアピン構造が失われ、その結果、クエンチングの喪失をもたらし
、かくして、シグナルが増加する。
【０１１９】 好ましい具体例において、伸長ゲノタイピングを行う。該具体例において、多
数の技術を用いてヌクレオチドを検出位置に隣接する標的配列にハイブリダイズ
されるプローブの読出し位置に加える。酵素特性によって、完全に相補的な塩基
を選択的に加える。これらの方法の全ては、検出位置でのヌクレオチドの酵素的
組み込みに依存する。これは、単一の塩基だけが組み込まれるような（例えば、
単一塩基伸長法）チェーンターミネーティングｄＮＴＰを用いて行ってもよく、
または単一型のヌクレオチドだけを加え、その後、加えたヌクレオチドを同定す
る（伸長およびパイロシークエンシング技術）条件下で行ってもよい。
【０１２０】 好ましい具体例において、単一塩基伸長（ＳＢＥ；時々、「ミニシークエンシ
ング」ともいう）を用いて、検出位置での塩基の正体を決定する。ＳＢＥは、検
出位置に隣接する標的核酸にハイブリダイズしてハイブリダイズ複合体を形成す
る少なくとも１つのアダプター配列を有する伸長プライマーを利用する。ポリメ
ラーゼ（一般にＤＮＡポリメラーゼ）を用いて、本明細書に記載のような検出標
識で標識されたヌクレオチドアナログを用いてプライマーの３’末端を伸長する
。酵素の忠実度（fidelity）に基づいて、検出位置での標的ストランドにおける
塩基に完全に相補的である場合、ヌクレオチドは単に、成長中の核酸ストランド
の読出し位置に組み込まれるだけである。該ヌクレオチドは、さらなる伸長が起
こらないように誘導体化されてもよく、それゆえ、単一のヌクレオチドのみが加
えられる。いったん標識したヌクレオチドが加えられると、標識の検出を本明細
書に概説するように行う。さらに、この場合、反応／溶出の循環または反復ラウ
ンドによって増幅が達成されるが、いくつかの具体例において、増幅は必要とさ
れない。
【０１２１】 反応は、支持体上に標的ゲノム配列を含むハイブリダイゼーション複合体を第
１のヌクレオチドを含む溶液に導入することによって開始する。一般に、ヌクレ
オチドは、検出可能な標識を含み、それは、一次または二次標識のいずれであっ
てもよい。さらに、系の配置に依存して、ヌクレオチドはヌクレオチドアナログ
であってもよい。例えば、単一型のｄＮＴＰのみを加えることができるようにｄ
ＮＴＰを一連の反応に加える場合、ヌクレオチドはチェーンターミネーティング
される必要はない。さらに、該具体例において、ｄＮＴＰは全て、同じ型の標識
を含んでいてもよい。
【０１２２】 別法では、反応が１より多くのｄＮＴＰを含む場合、ｄＮＴＰはチェーンター
ミネーティングされるべきであり、すなわち、それらは、さらなるｄＮＴＰが酵
素によって加えられないように、３’位置に遮断基または保護基をを有する。当
業者に明らかなように、ポリメラーゼ酵素が依然として読出し位置にてヌクレオ
チドを組み込むかぎり、多数のヌクレオチドアナログを用いてもよい。好ましい
具体例は、ジデオキシ−３リン酸ヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）およびハロゲン化
されたｄＮＴＰを利用する。一般に、各々が異なる検出可能な標識を有するｄｄ
ＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰを含むヌクレオチドのセット
を用いるが、本明細書に概説されるように、これは必要ではないかもしれない。
別の好ましい具体例はアシクロヌクレオチド（ＮＥＮ）を用いる。これらのチェ
ーンターミネーティングヌクレオチドアナログは、Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ（ｅｘｏ
−）およびサーモシークエナーゼ（thermosequenase）の特に良好な基質である
。
【０１２３】 さらに、当業者に明らかなように、本発明の単一塩基伸長反応は、成長中の核
酸ストランド中への修飾塩基の正確な組み込みを可能にする。かくして、多数の
修飾ヌクレオチドが、構造−機能関係（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡまたはＤＮＡ：
蛋白質相互作用）を調べること、核酸を開裂すること、核酸を架橋すること、ミ
スマッチを組み込むことなどを包含する多数の理由で組み込まれ得る。 当業者に明らかなように、ゲノタイピングＳＢＥ系の配置はいくつかの形態を
とることができる。
【０１２４】 さらに、伸長しないプライマーは標識を含まないので、伸長しないプライマー
を除去する必要はない。しかしながら、それらは所望により下記に概説されると
おりであり；例えば、非常に過剰のプライマーを用いる場合、表面への結合につ
いて競合する伸長プライマーからの十分なシグナルは存在し得ない。 別法では、当業者は、単一の標識および温度を用いて塩基の正体を決定するこ
とができ；すなわち、伸長プライマーの読出し位置は捕獲プローブ上の位置にハ
イブリダイズする。しかしながら、３つのミスマッチが完全な合致より低温のＴ
ｍを有するので、温度の使用は検出位置の塩基の正体を解明できた。
【０１２５】 固相アッセイ 別法では、標的配列を捕獲し、次いで、ＳＢＥ反応を実施することによって、
図９Ａに図示したサンドイッチ型形式において反応を行ってもよい。該具体例に
おいて、捕獲プローブは、標的配列（内在性または増幅反応の間に加えられた外
来性アダプター配列であることができる）の第１のドメインにハイブリダイズし
、伸長プライマーは、検出位置に隣接する第２の標的ドメインにハイブリダイズ
する。酵素および必要とされるＮＴＰの添加は、呼びかけ塩基の添加をもたらす
。該具体例において、各ＮＴＰは独特な標識を有さなければならない。別法では
、各ＮＴＰ反応は連続的に異なるアレイ上で行ってもよい。当業者に明らかなよ
うに、ＤＮＡポリメラーゼを添加酵素とする場合、ｄｄＮＴＰおよびｄＮＴＰが
好ましい基質であり；ＲＮＡポリメラーゼを添加酵素とする場合、ＮＴＰが好ま
しい基質である。
【０１２６】 さらに、より詳細に下記され、図９Ｄに図示されるように、捕獲伸長プローブ
を用いて標的配列をビーズに結合することができる。該具体例において、ハイブ
リダイゼーション複合体は捕獲プローブ、標的配列およびアダプター配列を含む
。
【０１２７】 同様に、捕獲プローブ自体を伸長プローブとして使用することができ、その末
端は検出位置に直接隣接している。これを図９Ｂに模式的に示す。標的配列およ
びＳＢＥ試薬の添加に際して、検出可能な標識を含んで修飾プライマーが形成さ
れ、そして検出される。溶液ベースの反応に関しては、各ＮＴＰは特有の標識を
有しなければならず、反応は連続的に進行しなければならないか、または異なる
アレイを使用しなければならない。当業者の知るところとなるように、添加され
る酵素がＤＮＡポリメラーゼである場合は、ｄｄＮＴＰおよびｄＮＴＰが好まし
い基質であり；添加される酵素がＲＮＡポリメラーゼである場合、ＮＴＰが好ま
しい基質である。
【０１２８】 好ましい実施態様において、遺伝子型決定用の特異性は切断酵素によって提供
される。配列特異性に基くか（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）または構造特
異性を使用するか（例えば、侵襲性切断技術の使用を介して実施されるような）
のいずれかで、特異的部位において切断することが知られている種々の酵素が存
在する。
【０１２９】 好ましい実施態様において、標的配列の検出位置における塩基の同一性の決定
は、侵襲性切断技術を使用して進行する。増幅について上記したように、侵襲性
切断技術は構造特異的ヌクレアーゼの使用に依存する。ここで、構造はミスマッ
チの存在または不在の結果として形成され得る。一般に、侵襲性切断技術を以下
のように説明し得る。標的核酸が２つの異なるプローブによって認識される。第
１のプローブ（一般に本明細書において「インベーダー」プローブという）は標
的核酸の第１の部分に実質的に相補的である。第２のプローブ（一般に本明細書
において「シグナルプローブ」という）は標的核酸に部分的に相補的である；シ
グナルオリゴヌクレオチドの３’末端は標的配列に実質的に相補的であり、一方
５’末端は非相補的であり、好ましくは一本鎖の「テール」または「アーム」を
形成する。第２のプローブの非相補的末端は好ましくは「包括的または特有の配
列」を含む。これは本明細書においてしばしば「検出配列」といい、下記のよう
に標的核酸の存在または不在を示すために使用される。第２のプローブの検出配
列は少なくとも１個の検出可能標識（サイクリング目的用）を含んでもよく、ま
たは好ましくは１個以上のユニバーサルプライマー部位および／またはアダプタ
ー配列を含む。別法は捕獲プローブ用の標的配列として機能する検出配列を有し
、従って標識プローブを使用するサンドイッチ立体配置に依存する。
【０１３０】 標的ゲノム核酸上での互いに近接または隣接する第１および第２のオリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーションによって多数の構造が形成される。
【０１３１】 従って、本発明は、標的配列の検出位置における塩基の同一性を決定する方法
を提供する。この実施態様において、標的配列は、５’から３’に向かって、検
出位置におけるヌクレオチドを少なくとも含む重複ドメインを含む第１の標的ド
メイン、および検出位置に隣接した第２の標的ドメインを含む。第１のプローブ
（「インベーダープローブ」）は標的配列の第１の標的ドメインにハイブリダイ
ズする。第２のプローブ（「シグナルプローブ」）は標的配列の第２の標的ドメ
インにハイブリダイズする第１の部分および標的配列にはハイブリダイズしない
第２の部分を含み、第２の標的ドメインにハイブリダイズする。第２のプローブ
が検出位置に完全に相補的な塩基を含む場合、切断構造が形成される。米国特許
第５，８４６，７１７号；同第５，６１４，４０２号；同第５，７１９，０２９
号；同第５，５４１，３１１号および同第５，８４３，６６９号（出典明示で援
用する）に記載されるような切断酵素の添加によって、検出配列がシグナリング
プローブから切断される。次いでこれをアッセイ複合体中の標的配列として使用
することができる。
【０１３２】 さらに、本明細書に記載する種々の技術に関しては、未反応プローブ（すなわ
ち、侵襲性切断の場合シグナリングプローブ）を多数の技術のいずれかを使用し
て除去してもよい。例えば、結合対の他方のメンバーを含む固体支持体に結合し
た結合パートナーを使用することができる。同様に、一次シグナルプローブの切
断後、新たに作製された切断産物を、酵素的または化学的方法を使用して３’末
端または５’末端において選択的に標識することができる。
【０１３３】 上記したように、侵襲性切断反応の検出を直接的（検出配列が少なくとも１つ
の標識を含む場合）または間接的（さらなるプローブの使用を介したサンドイッ
チアッセイを使用して）に生じさせることができる；すなわち、検出配列が標的
配列として作用し得、検出に増幅プローブ、捕獲プローブ、捕獲伸長プローブ、
標識プローブおよび標識伸長プローブなどを利用してもよい。１つの実施態様に
おいて、第２の侵襲性切断反応を固相上で実施し、それによって複数の反応を実
施することが容易になる。
【０１３４】 さらに、本明細書に記載の技術の大部分に関しては、これらの技術を２本鎖標
的配列の２つの鎖に対して実施してもよい。標的配列を変性し、以下の２組のプ
ローブを添加する：標的の一方の鎖に対する上記のような１つの組、および標的
の他方の鎖に対する別の組。
【０１３５】 従って、侵襲性切断反応は、特定の順序なしに、インベーダープローブ、シグ
ナリングプローブおよび切断酵素を必要とする。
【０１３６】 以下を含む２つ以上のこれらの技術の組合せで、ＷＯ００／６３４３７（出典
明示で援用する）に記載のような配列の遺伝子型決定、定量、検出などを実施す
ることも可能である：競合ハイブリダイゼーションおよび伸長（特にＳＢＥ）の
組合せ；競合ハイブリダイゼーションおよび侵襲性切断の組合せ；侵襲性切断お
よびライゲーション；侵襲性切断および伸長反応の組合せ；ＯＬＡおよびＳＢＥ
の組合せ；ＯＬＡおよびＰＣＲの組合せ；競合ハイブリダイゼーションおよびラ
イゲーションの組合せ；ならびに競合ハイブリダイゼーションおよび侵襲性切断
の組合せ。
【０１３７】 本発明は核酸の検出に有用な方法および組成物、特に本明細書に記載の標識ア
ンプリコンを提供する。以下でより詳細に記載するように、本発明の好ましいシ
ステムは以下のように作用する。アンプリコンをアレイ部位に（ハイブリダイゼ
ーションを介して）結合させる。この結合は、本明細書に記載のように、アダプ
ターの使用を介する表面上の捕獲プローブへの直接的な結合、または捕獲伸長プ
ローブを使用する間接的な結合のいずれかであり得る。いくつかの実施態様にお
いて、標的配列自体は標識を含む。あるいは、次いで標識プローブを添加し、ア
ッセイ複合体を形成させる。標識プローブの結合は直接的（すなわち、標的配列
の部分へのハイブリダイゼーション）であってもよく、または間接的（すなわち
、標的配列にハイブリダイズする増幅プローブへのハイブリダイゼーション）で
あってもよく、全ての必要とされる核酸がアッセイ複合体を形成する。
【０１３８】 従って、本発明は、個々の部位を含む表面を有する第１の基材を少なくとも含
むアレイ組成物を提供する。本明細書において「アレイ」または「バイオチップ
」は、アレイ形式の複数の核酸を意味する；アレイのサイズはアレイの構成およ
び最終用途に依存する。核酸アレイは当該分野において公知であり、多数の方法
で分類することができ；秩序アレイ（例えば、分離した部位における化学反応を
分解する能力）およびランダムアレイの両方が包含される。秩序アレイは、限定
するものではないが、写真印刷技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＴＭ ）、スポッティング技術（Ｓｙｎｔｅｎｉなど）、印刷技術（Ｈｅｗｌｅｔ
ｔ ＰａｃｋａｒｄおよびＲｏｓｅｔｔａ）、三次元「ゲルパッド」アレイなど
を使用して作製されるものを包含する。好ましい実施態様は、ＰＣＴ ＵＳ９８
／２１１９３、ＰＣＴ ＵＳ９９／１４３８７およびＰＣＴ ＵＳ９８／０５０
２５；ＷＯ９８／５０７８２；ならびにＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２８７，５７３
、０９／１５１，８７７、０９／２５６，９４３、０９／３１６，１５４、６０
／１１９，３２３、０９／３１５，５８４（出典明示で援用する）に記載のよう
な光ファイバーバンドルを含む種々の基材上のミクロスフェアを利用する。下記
の考察の多くは光ファイバーバンドル上でのミクロスフェアアレイの使用に関す
るが、固体支持体上のいずれのアレイ形式の核酸を利用してもよい。
【０１３９】 約２個から数百万個の異なる生物活性因子を含むアレイ（例えば、ビーズを使
用する場合、異なるビーズ）を作製することができ、非常に大きなアレイが可能
である。一般に、アレイは、ビーズのサイズ、基材およびアレイの最終用途に依
存して２個から１０億個以上までを含む。従って、超高密度、高密度、中密度、
低密度および超低密度アレイを作製してもよい。超高密度アレイの好ましい範囲
は約１０，０００，０００〜約２，０００，０００，０００であり、約１００，
０００，０００〜約１，０００，０００，０００が好ましい（数字は全て平方ｃ
ｍ）。高密度アレイは約１００，０００〜約１０，０００，０００の範囲であり
、約１，０００，０００〜約５，０００，０００が特に好ましい。中密度アレイ
は好ましくは約１０，０００〜約１００，０００の範囲であり、約２０，０００
〜約５０，０００が特に好ましい。低密度アレイは一般に１０，０００未満であ
り、約１，０００〜約５，０００が好ましい。超低密度アレイは１，０００未満
であり、約１０〜約１０００が好ましく、約１００〜約５００が特に好ましい。
いくつかの実施態様において、本発明の組成物はアレイ形式でなくてもよい；す
なわち、いくつかの実施態様について、単一の生物活性因子を含む組成物を作製
してもよい。さらに、いくつかのアレイにおいて、異なるまたは同一の組成物の
、複数の基材を使用してもよい。従って、例えば、大きなアレイは複数のより小
さな基材を含んでもよい。
【０１４０】 さらに、本発明の組成物の１つの利点は、特に光ファイバー技術の使用を介し
て、非常に高密度のアレイを作製することができることである。従って、例えば
、２００μｍ以下のビーズを使用でき（２００ｎｍのビーズが可能である）、非
常に小さなファイバーが知られているので、１ｍｍ２の光ファイバーバンドル中
に４０，０００以上（いくつかの場合、百万）の異なる要素（例えば、ファイバ
ーおよびビーズ）を有することが可能であり、０．５ｃｍ２当り２５，０００，
０００（いくつかの場合５千万から１億）の個々のビーズおよびファイバーより
高い密度が得られる（中心から中心５μの場合１平方ｃｍ当り４百万、中心から
中心１μの場合、１平方ｃｍ当り１億）。
【０１４１】 本明細書において「基材」または「固体支持体」または他の文法上等価な語は
、ビーズの結合または会合に適切な分離した個々の部位を含むように修飾可能で
あり、少なくとも１つの検出方法に使用可能ないずれかの材料を意味する。当業
者に理解されるように可能な基材の数は非常に多い。可能な基材は、限定するも
のではないが、ガラスおよび修飾または官能基付与ガラス、プラスティック（ア
クリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレ
ン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）などを
含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリカベ
ースの材料（シリコンおよび修飾シリコンを含む）、炭素、金属、無機ガラス、
プラスティック、光ファイバーバンドルならびに種々のその他のポリマーを含む
。一般に、基材は光学的検出を可能にし、それ自体は認識可能な蛍光を発しない
。
【０１４２】 一般に、基材は平ら（平面）であるが、当業者に理解されるように、基材の他
の立体配置を使用してもよい；例えば、試料のビーズへの接近を可能にするプラ
スティックの多孔性ブロック中にビーズを包埋し、検出用に共焦点顕微鏡を使用
することによって三次元立体配置を使用することができる。同様に、素通り試料
分析のために、ビーズをチューブの内側表面に配置して試料容積を最小化しても
よい。好ましい基材は、下記の光ファイバーバンドル、ならびに平面基材（例え
ば、紙、ガラス、ポリスチレンおよび他のプラスティックおよびアクリル）を包
含する。
【０１４３】 好ましい実施態様において、基材は光ファイバーバンドルまたはアレイであり
、これはＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４４，８５０および０８／５１９，０６２、
ＰＣＴ ＵＳ９８／０５０２５およびＰＣＴ ＵＳ９８／０９１６３（出典明示
で援用する）に一般的に記載されている。好ましい実施態様は事前形成ユニタリ
ー光ファイバーアレイを利用する。本明細書において、「事前形成ユニタリー光
ファイバーアレイ」は、同軸配置され、その長さに沿って連結された分離した個
々の光ファイバーストランドのアレイを意味する。一般にファイバーストランド
は個々に被覆されている。しかし、事前形成ユニタリーアレイと他の光ファイバ
ー形式を区別する１つの事項は、ファイバーが個々に物理的に操作可能でないこ
とである；すなわち、１つのストランドは一般にその長さに沿ったいかなる点に
おいても別のファイバーストランドから物理的に分離できない。
【０１４４】 一般に、本発明のアレイ組成物のアレイをいくつかの方法で配置することがで
きる；例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／４７３，９０４（出典明示で援用する）
を参照のこと。好ましい実施態様において、以下でより詳細に記載するように、
「１成分」システムを使用する。すなわち、マイクロタイタープレートのような
複数のアッセイ位置（本明細書においてしばしば「アッセイウェル」ともいう）
を含む第１の基材を、各アッセイ位置が個々のアレイを含むように配置する。す
なわち、アッセイ位置とアレイ位置は同じである。例えば、マイクロタイタープ
レートのプラスティック材料を、各々のアッセイウェルの底に複数の「ビーズウ
ェル」を含むように形成することができる。以下により詳細に記載するように、
次いで、本発明の捕獲プローブを含むビーズを各アッセイ位置のビーズウェル中
に負荷することができる。
【０１４５】 あるいは、「２成分」システムを使用することができる。この実施態様におい
て、個々のアレイを第２の基材上に形成させ、次いでこれを第１のマイクロタイ
タープレート基材に合わせるかまたは「つける」ことができる。好ましい実施態
様は、個々のアレイとして光ファイバーバンドルを利用する。一般に、捕獲プロ
ーブを含むビーズが光ファイバーバンドルの末端に負荷されるように、各々の個
々の光ファイバーの１つの表面に「ビーズウェル」がエッチングされている。従
って、複合アレイは、マイクロタイタープレートのウェル内に合うように配置さ
れた多数の個々のアレイを含む。
【０１４６】 本明細書において「複合アレイ」または「組合せアレイ」または文法上等価な
語は、上記のような複数の個々のアレイを意味する。一般に、個々のアレイの数
は使用するマイクロタイタープレートのサイズによって設定される；従って、９
６ウェル、３８４ウェルおよび１５３６ウェルマイクロタイタープレートは９６
個、３８４個および１５３６個の個々のアレイを含む複合アレイを利用するが、
当業者に理解されるように、各マイクロタイターウェルが個々のアレイを含んで
いる必要はない。複合アレイが同一、類似または異なる個々のアレイを含み得る
ことに留意すべきである。すなわち、いくつかの実施態様において、同じ２，０
００回のアッセイを９６個の異なる試料に対して実施するか；あるいは１９２，
０００回の実験を同じ試料（すなわち、９６ウェルの各々中の同じ試料）に対し
て実施することが望ましくあり得る。あるいは、重複性／品質管理のために、複
合アレイの各行または列が、同じであり得る。当業者に理解されるように、シス
テムを配置するための種々の方法が存在する。さらに、アレイのランダムな性質
は、ビーズの同じ集団を２つの異なる表面に添加し、実質的に類似するがおそら
く同一ではないアレイを生じさせ得ることを意味し得る。
【０１４７】 基材の少なくとも１つの表面は、後のミクロスフェアの会合のために、分離し
た個々の部位を含むように修飾される。これらの部位は、物理的に変化した部位
、すなわち物理的立体配置、例えばミクロスフェアがウェル中に留まることがで
きるようにビーズを保持できる基材中のウェルまたは小さなくぼみ、または他の
力（磁気力もしくは圧縮力）の使用、または化学的に変化したもしくは活性な部
位、例えば化学的官能基付与部位、静電的に変化した部位、疎水性／親水性官能
基付与部位、接着剤のスポットなどを含んでもよい。
【０１４８】 部位はパターン、すなわち規則正しいデザインもしくは立体配置であってもよ
く、またはランダムに分布していてもよい。好ましい実施態様は、部位にＸ−Ｙ
座標平面においてアドレスし得るように、規則正しい部位のパターンを利用する
。この意味での「パターン」は、繰り返し単位セル、好ましくは基材上でのビー
ズの高密度を可能にするものを含む。しかし、これらの部位が分離した部位でな
くてもよいことに留意すべきである。すなわち、例えば、いずれかの位置でのビ
ーズの結合を可能にする接着剤または化学官能基の均質な表面を使用することが
可能である。すなわち、基材の表面は、個々の部位における（これらの部位が他
の部位と連続的であっても不連続であっても）ミクロスフェアの結合を可能にす
るように修飾される。従って、基材の表面は、単一の会合したビーズのみを有す
ることができる分離した部位が形成されるように修飾されていてもよく、あるい
は基材の表面は修飾され、ビーズはどこにでも下るが、最後に分離した部位に至
る。すなわち、ビーズはアレイ上の各部位を占有する必要はないが、１個以下の
ビーズが各部位を占有する。
【０１４９】 好ましい実施態様において、基材の表面は、基材の表面中にウェル、すなわち
くぼみを含むように修飾される。これは当該分野において一般に知られるように
種々の技術を使用して実施し得る。この技術は、限定するものではないが、写真
印刷、打抜技術、成形技術およびミクロエッチング技術を含む。当業者に理解さ
れるように、使用する技術は基材の組成および形状に依存する。
【０１５０】 好ましい実施態様において、基材の表面において物理的変化を作製し、部位を
生じさせる。好ましい実施態様において、０８／８１８，１９９および０９／１
５１，７８７７（出典明示で援用する）に一般的に記載されるように、基材は光
ファイバーバンドルであり、基材の表面はファイバーバンドルの末端である。こ
の実施態様において、個々のファイバーを含む光ファイバーバンドルの末端また
は遠位端においてウェルを作製する。この実施態様において、小さなウェルまた
はくぼみがファイバーの一方の末端において形成されるように、被覆に関して、
個々のファイバーのコアをエッチングする。必要なウェルの深さはウェルに添加
しようとするビーズのサイズに依存する。
【０１５１】 この実施態様において一般に、ミクロスフェアはウェルに非共有的に会合して
いるが、以下で一般的に記載するように、ウェルをさらに化学的に官能基付与し
てもよく、架橋剤を使用してもよく、または物理的障害、すなわちビーズをおお
うフィルムまたはメンブレンを使用してもよい。
【０１５２】 好ましい実施態様において、本発明のミクロスフェアを基材上の分離した部位
または位置に結合（共有または非共有）させるために使用できる化学的修飾部位
を含むように基材の表面を修飾する。この関連での「化学的修飾部位」は、限定
するものではないが、以下を含む：一般に対応する反応性官能基もまた含む、ミ
クロスフェアを共有結合させるために使用できる化学官能基（アミノ基、カルボ
キシ基、オキソ基およびチオール基を含む）のパターンの付加；ミクロスフェア
を結合させるために使用できる接着剤のパターンの付加（接着剤の付加のための
従来の化学官能基付与または接着剤の直接的付加による）；ミクロスフェアの静
電結合のための（すなわち、ミクロスフェアが部位と反対の荷電基を含む場合）
荷電基（化学官能基付与に類似）のパターンの付加；部位を差次的に疎水性また
は親水性にする化学官能基のパターンの付加（その結果、同様に疎水性または親
水性のミクロスフェアを適切な実験条件下で添加するとミクロスフェアがハイド
ロアフィニティに基いて部位に会合する）。例えば、水性系中で疎水性部位を疎
水性ビーズとともに使用すると、ビーズは優先的に部位に会合させられるる。上
記のように、この意味での「パターン」は、分離した部位におけるビーズの結合
を可能にする均質な表面処理および分離した部位を生じる表面処理の使用を含む
。当業者に理解されるように、これを種々の方法によって達成し得る。
【０１５３】 いくつかの実施態様において、ビーズは基材に会合していない。すなわち、ビ
ーズは溶液中に存在するか、パターン化された基材上に分布していない。
【０１５４】 好ましい実施態様において、本発明の組成物はさらにミクロスフェアの集団を
含む。本明細書において「集団」はアレイについて上記したように複数のビーズ
を意味する。集団内に個別の亜集団が存在し、これは単一のミクロスフェアまた
は複数の同一のミクロスフェアであり得る。すなわち、いくつかの実施態様にお
いて、以下でより詳細に記載するように、アレイは各捕獲プローブについて単一
のビーズのみを含んでもよく；好ましい実施態様は各タイプの複数のビーズを利
用する。
【０１５５】 本明細書において「ミクロスフェア」または「ビーズ」または「粒子」または
文法上等価な語は、小さな分離した粒子を意味する。ビーズの成分は捕獲プロー
ブの分類および合成方法によって変動する。適切なビーズ成分はペプチド、核酸
および有機部分合成に使用されるものを包含し、限定するものではないが、プラ
スティック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポ
リマー、常磁性材料、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテ
ックスまたは架橋デキストラン、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ、セルロース、ナイ
ロン、架橋ミセルおよびテフロンの全てを使用してもよい。「Microsphere Dete
ction Guide」Bangs Laboratories, Fishers INは有用な手引きである。
【０１５６】 ビーズは球体である必要はない；不均整な粒子を用いることができる。加えて
、ビーズは、多孔性であってよく、かくして、捕獲プローブ付着またはタグ付着
のいずれに対しても利用可能なビーズ表面積を増大させる。ビーズの大きさは、
ナノメーター、すなわち、１００ｎｍから、ミリメーター、すなわち、１ｍｍま
での範囲であり、好ましくは、約０.２ミクロン〜約２００ミクロンのビーズで
あり、特に好ましくは、約０.５〜約５ミクロンのビーズであるが、実施態様に
よっては小さいビーズを用いてもよい場合がある。
【０１５７】 本発明の基本構成要素は基材の表面上の別々の部位でのビーズの会合または付
着を許容してアッセイの過程中にビーズが動かないようにした基材／ビーズ対形
成を用いることであることに注目すべきである。
【０１５８】 各ミクロスフェアは捕獲プローブを含んでいるが、当業者により理解されるよ
うに、合成法に依存して捕獲プローブを含まないミクロスフェアもある。
【０１５９】 核酸の付着は、当業者により理解されるように、化学的または親和性捕獲（例
えば、核酸を表面に付着させるために用いることができるＡｍｉｎｏＬｉｎｋま
たはビオチン標識ヌクレオチドのような誘導体化ヌクレオチドの取込み、ならび
にハイブリダイゼーションによる親和性捕獲を包含する）、架橋、および静電付
着などを包含するがそれらに限定されない種々の方法で行われ得る。好ましい実
施態様において、親和性捕獲を用いてビーズに核酸を付着させる。例えば、結合
対の片方のメンバーで核酸を誘導体化することができ、結合対のもう一方のメン
バーでビーズを誘導体化することができる。適当な結合対は、ＩＢＬ／ＤＢＬ対
について本明細書に記載するとおりである。例えば、核酸をビオチン標識しても
よい（例えば、ビオチンの光活性架橋による場合、ビオチン標識ヌクレオチドの
酵素的取込みを用いる）。次いで、当該技術分野で知られているように、ビオチ
ン標識核酸をストレプトアビジン被覆ビーズ上で捕獲することができる。同様に
、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体のような他のハプテン−受容体組合せ
を用いることができる。別法として、該表面に核酸を付加するために用いること
ができる化学基を誘導体化ヌクレオチドの形態で付加することができる。
【０１６０】 好ましい付着は共有的であるが、各核酸につき複数の付着部位がある場合には
比較的弱い相互作用（すなわち、非共有的）であっても表面に核酸を付着させる
のに十分である。かくして、例えば、ビーズに生物活性剤と反対の荷電を担持さ
せることによって、付着のために静電相互作用を用いることができる。
【０１６１】 同様に、ハイブリダイゼーションを用いる親和性捕獲を用いてビーズに核酸を
付着させることができる。
【０１６２】 別法としては、当該技術分野で知られているように、例えば、チミジンの反応
性基への光活性架橋によって、化学架橋を行ってもよい。
【０１６３】 好ましい実施態様において、各ビーズは１種類の捕獲プローブを含むが、複数
の個々の捕獲プローブを各ビーズに付着させるのが好ましい。同様に、好ましい
実施態様は、固有の捕獲プローブを含有する１個よりも多いミクロスフェアを用
いる；すなわち、亜集団中の各ミクロスフェアが同一の捕獲プローブを含有して
いるミクロスフェアの亜集団の使用により系に重複性がつくられる。
【０１６４】 当業者によって理解されるように、捕獲プローブはビーズ上で直接合成しても
よく、または、それらを調製し、次いで、合成後に付着させてもよい。好ましい
実施態様において、リンカーを用いてビーズに捕獲プローブを付着させ、良好な
付着および十分なフレキシビリティーを共に許容し、標的分子との良好な相互作
用を許容し、望ましくない結合反応を回避する。
【０１６５】 好ましい実施態様において、捕獲プローブをビーズ上で直接合成する。当該技
術分野で知られているように、ペプチド、有機的成分および核酸のような多くの
種類の化学物質が、現在、固体支持体上で合成されている。ビーズを用いるよう
に現行の合成技法を調節することは比較的容易なことである。
【０１６６】 好ましい実施態様において、まず、捕獲プローブを合成し、次いで、ビーズに
共有付着させる。当業者によって理解されるように、これは、捕獲プローブとビ
ーズとの組成に依存して行われる。チオール類、アミン類、カルボキシル類など
の化学反応性基を有するある種のポリマーのような固体支持体表面の官能基付与
は当該技術分野において一般に知られている。したがって、ユーザーによる所望
の官能基の付着を容易にする界面化学を有する「ブランク」ミクロスフェアを用
いることができる。ブランクミクロスフェアについてのこれらの界面化学のいく
つかの例としては、脂肪族および芳香族アミンを包含するアミノ基、カルボン酸
、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホ
ネートおよびスルフェートが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６７】 ランダムアレイを用いる場合、コード化／解読系を用いなければならない。例
えば、ミクロスフェアレイを用いる場合、一般に、基材上にビーズをランダムに
置く；それには、いずれかの特定のビーズ上で核酸を同定するために用いること
ができる固有の光学サイン、一般に、蛍光色素の取込みを包含するビーズ上の官
能基をその位置と相互に関係させるためのいくつかの方法がある。これは、アレ
イ上のそれらの位置から分離されるべき捕獲プローブの合成を許容する；すなわ
ち、ビーズ上で捕獲プローブを合成し、次いで、パターン化された表面上に該ビ
ーズをランダムに分布させる。該ビーズはまず光学サインでコードされるので、
これは、アレイが後に「解読」されることを意味する；すなわち、アレイが調製
された後、アレイ上の個々の部位の位置と該特定部位のビーズまたはプローブと
を相互に関連付けることができる。これは、ビーズがアレイ上にランダムに分布
されることを意味し、従来技術の in situ 合成法またはスポッティング技法の
いずれと比較しても早くかつ廉価なプロセスである。
【０１６８】 しかしながら、これらの方法の欠点は、大きいアレイについて、系が、使用す
るのが困難であるかまたは使用するのに時間を浪費するかもしれない多数の異な
る光学サインを必要とすることである。したがって、本発明は、一般にアレイの
コード化および解読方法に関するこれらの方法に対するいくつかの改良を提供す
る。すなわち、当業者により理解されるように、捕獲プローブの位置は、一般に
ランダムであり、かくして、コード化／解読系は、アレイにおける各位置でプロ
ーブを同定することを必要とする。これは、以下にさらに詳しく概説するように
、種々の方法で行われ、一般に、ａ）ビーズに付着した捕獲プローブまたはアイ
デンティファイアー結合リガンド（ＩＢＬ）のいずれかと結合する、一般に直接
標識された、解読結合リガンド（ＤＢＬ）の使用；ｂ）以下にさらに詳しく概説
するように、例えば、ビーズの位置を標的にすることによる（例えば、光活性性
または光切断性成分を用いてビーズの特定位置への選択的付加を許容することに
よる）か、または、サブバンドルもしくは部位の選択的付加を用いることによる
位置解読；ｃ）標的と結合するこれらのビーズだけを解読する選択的解読；また
はｄ）これらのいずれかの併用を包含する。以下にさらに詳しく概説するように
、場合によっては、この解読が全てのビーズに対して、または、特定の標的配列
を結合するビーズだけに対して生じてもよい。同様に、これは、標的配列の付加
の前または後のいずれで生じてもよい。加えて、以下に概説するように、検出さ
れる標的配列は、一次標的配列（例えば、患者の試料）または本明細書に記載し
た方法の一からの反応生成物（例えば、伸長ＳＢＥプローブ、結合したプローブ
、切断されたシグナルプローブなど）のいずれであってもよい。
【０１６９】 アレイにおける各ミクロスフェアの同一性（すなわち、実際の因子）および位
置が決定されるとすぐに、標的配列を含有する試料にアレイを暴露させるが、以
下に概説するように、標的配列を含有する試料のアレイへの暴露は、同様に、分
析の前またはその間に行うことができる。標的配列は、以下にさらに詳しく概説
するように、捕獲プローブと（直接または間接的に）ハイブリダイズすることが
でき、特定のビーズの光学シグナルの変化を生じる。
【０１７０】 本発明において、「解読」は、光学サインの使用に頼らず、むしろ、解読工程
の間に付加される解読結合リガンドの使用に頼る。解読結合リガンドは、ビーズ
上に置かれる異なったアイデンティファイアー結合リガンド相手、または捕獲プ
ローブ自体と結合する。解読結合リガンドは、直接または間接的に標識され、か
くして、標識の存在を検出することによって解読が生じる。逐次的な方法で解読
結合リガンドのプールを使用することによって、必要な解読工程の数をかなり最
小限度にすることが可能である。
【０１７１】 実施態様よっては、ミクロスフェアがさらにある種の解読系において用いるた
めのアイデンティファイアー結合リガンドを含んでもよい場合がある。本明細書
において、「アイデンティファイアー結合リガンド」または「ＩＢＬ」とは、対
応するデコーダー結合リガンド（ＤＢＬ）を特異的に結合してビーズに付着した
捕獲プローブの同一性の解明を容易にする化合物を意味する。すなわち、ＩＢＬ
および対応するＤＢＬは結合パートナー対を形成する。本明細書において「特異
的に結合する」とは、ＩＢＬがそのＤＢＬを、対応するＤＢＬと他のＤＢＬ（す
なわち、他のＩＢＬに対するＤＢＬ）または系の他の成分もしくは夾雑物との間
で区別するのに十分な特異性をもって結合することを意味する。該結合は、非特
異的結合を除去するための洗浄を包含する解読工程の条件下で依然として結合し
たままであるために十分であるべきである。実施態様によっては、例えば、ＩＢ
Ｌおよび対応するＤＢＬがタンパク質または核酸である場合、ＩＢＬのそのＤＢ
Ｌに対する解離定数が約１０−４〜１０−６Ｍ−１未満、好ましくは、約１０− ５ 〜１０−９Ｍ−１未満、特に好ましくは、約１０−７〜１０−９Ｍ−１未満で
ある場合もある。
【０１７２】 ＩＢＬ−ＤＢＬ結合対は、知られているものであるか、または、公知技法を用
いて容易に見出すことができる。例えば、ＩＢＬがタンパク質である場合、ＤＢ
Ｌとしては、タンパク質（特に、抗体またはそのフラグメント（ＦＡｂなど）を
包含する）もしくは小分子が挙げられるか、またはその反対の場合がある（ＩＢ
Ｌが抗体であり、ＤＢＬがタンパク質である）。金属イオン−金属イオンリガン
ドまたはキレーター対もまた有用である。抗原−抗体対、酵素と基質または阻害
物質、他のタンパク質−タンパク質相互作用対、受容体−リガンド、相補核酸、
および炭水化物とそれらの結合相手もまた適当な結合対である。核酸−核酸結合
タンパク質対もまた有用である。同様に、米国特許第5,270,163号、第5,475,096
号、第5,567,588号、第5,595,877号、第5,637,459号、第5,683,867号、第5,705,
337号および関連特許（出典明示により本明細書の記載とする）に一般的に記載
されているように、核酸「アプタマー」を、実質的にはいずれもの標的との結合
のために開発することができる；かかるアプタマー−標的対は、ＩＢＬ−ＤＢＬ
対として用いることができる。同様に、コンビナトリアル・ケミストリー法に基
づく結合対の開発に関連している広範囲に及ぶ多数の文献がある。
【０１７３】 好ましい実施態様において、ＩＢＬは、色またはルミネセンス特性が選択的結
合ＤＢＬの存在下で変化する分子である。例えば、ＩＢＬは、発光強度がｐＨに
より変化する蛍光ｐＨ指示薬であってよい。同様に、ＩＢＬは、発光特性がイオ
ン濃度により変化する蛍光イオン指示薬であってよい。
【０１７４】 別法として、ＩＢＬは、色またはルミネセンス特性が種々の溶媒の存在下で変
化する分子である。例えば、ＩＢＬは、蛍光強度が疎水性環境において増大する
エチジウム塩のような蛍光分子であってよい。同様に、ＩＢＬは、色が水性溶媒
と非極性溶媒との間で変化するフルオレセインの誘導体であってよい。
【０１７５】 一の実施態様において、ＤＢＬは、フルオロフォアのような標識を担持してい
てよいビーズ、すなわち、「デコーダービーズ」に付着してもよい。
【０１７６】 好ましい実施態様において、ＩＢＬ−ＤＢＬ対は、実質的に相補的な一本鎖核
酸を含む。この実施態様において、結合リガンドは、「アイデンティファイアー
プローブ」および「デコーダープローブ」と称することができる。一般に、アイ
デンティファイアープローブおよびデコーダープローブは、約４〜約１０００塩
基対長の範囲であり、好ましくは、約６〜約１００塩基対長の範囲であり、特に
好ましくは、約８〜約４０塩基対長の範囲である。重要なことは、プローブが、
特異的である、すなわち、異なるＩＢＬ−ＤＢＬ対間で区別するのに十分な長さ
であり、しかも、ａ）必要に応じて、適当な実験条件下での解離、およびｂ）効
果的なハイブリダイゼーションを許容するのに十分に短いことである。
【０１７７】 好ましい実施態様において、以下にさらに詳しく概説するように、ＩＢＬは、
ＤＢＬと結合しない。むしろ、ＩＢＬは、例えば、質量分光分析法の使用を介す
るように、直接同定されるアイデンティファイアー部分（ＩＭ）として用いられ
る。
【０１７８】 別法として、好ましい実施態様において、ＩＢＬと捕獲プローブとは同一部分
である；かくして、例えば、本明細書において概説するように、特に、光学サイ
ンを用いない場合、捕獲プローブは、アイデンティファイアーおよび因子の両方
として役立つ。例えば、核酸の場合、ビーズ結合プローブ（捕獲プローブとして
役立つ）もまたデコーダープローブを結合することができ、ビーズ上でプローブ
の配列を同定することができる。かくして、この実施態様において、ＤＢＬは、
捕獲プローブと結合する。
【０１７９】 好ましい実施態様において、ミクロスフェアは、光学サインを含んでよい。す
なわち、米国出願番号第08/818,199号および第09/151,877号に概説されているよ
うに、従前の研究は、ミクロスフェアの各亜集団に、ミクロスフェアの亜集団の
固有の捕獲プローブを同定するために用いられる固有の光学サインまたは光学タ
グを含ませた；すなわち、解読は、固有の光学サインを含むビーズを異なる光学
サインを有する他の位置のビーズと区別することができるようなビーズの光学特
性を利用する。かくして、従前の研究は、捕獲プローブを含むミクロスフェアが
該サインに基づいて同定可能であるような固有の光学サインを各捕獲プローブに
付与した。これらの光学サインは、ビーズ自体にエントラップされたかまたは付
着された色素、通常、クロモフォアまたはフルオロフォアを含んだ。光学サイン
の多様性は、種々の蛍光色素、種々の割合の蛍光色素混合物、および種々の濃度
（強度）の蛍光色素を用いていた。
【０１８０】 好ましい実施態様において、本発明は、単にアレイを解読するための光学特性
の使用に頼るわけではない。しかしながら、当業者によって理解されるように、
実施態様によっては、本発明の系と協同して、さらなるコード化方法として光学
サインを用いることが可能な場合がある。かくして、例えば、以下にさらに詳し
く概説するように、アレイの大きさは、いくつかの方法で一組の解読部分を用い
て有効に増大され得、その方法のうちの一は、いくつかのビーズ上の光学サイン
を使用するものである。かくして、例えば、一「組」の解読分子を用いて、光学
サインを有するものと光学サインを有していないものとの２つのビーズ集団の使
用は、アレイの大きさの有効な倍増を許容する。同様に、複数の光学サインの使
用は、アレイの起こり得る大きさを増大させる。
【０１８１】 好ましい実施態様において、ビーズの各亜集団は、複数の異なるＩＢＬを含む
。各捕獲プローブをコードするために複数の異なるＩＢＬを用いることによって
、起こり得る固有のコードの数を実質的に増加させる。すなわち、捕獲プローブ
１個につき１個の固有のＩＢＬを用いることによって、アレイの大きさは、（以
下に概説するように、「再使用」が生じないと仮定すると）固有のＩＢＬの数で
ある。しかしながら、ビーズ１個につき複数の異なるＩＢＬ ｎ個を用いること
によって、指標として各ＩＢＬの存在または不在を用いる場合、アレイの大きさ
は、２ｎに増大することができる。例えば、ビーズ１個につき１０個のＩＢＬの
付与は、１０ビット二進法コードを生じる（ここで、各ビットは、「１」（ＩＢ
Ｌが存在する）または「０」（ＩＢＬが存在しない）と示すことができる）。１
０ビット二進法コードは、２１０種類の起こり得る変種を有する。しかしながら
、以下にさらに詳しく検討するように、アレイの大きさは、濃度または強度のよ
うな別のパラメーターが含まれる場合にはさらに増大させることができる；かく
して、例えば、２種類の濃度のＩＢＬを用いる場合、アレイの大きさは、３ｎに
増大する。かくして、この実施態様において、アレイにおける個々の捕獲プロー
ブは、各々、捕獲プローブの付加前、捕獲プローブの合成の後、またはその間（
すなわち、ＩＢＬと捕獲プローブ要素との同時付加）にビーズに付加することが
できるＩＢＬの組合せを付与される。
【０１８２】 別法として、種々のＩＢＬの組合せを用いて、核酸の配列を解明することがで
きる。かくして、例えば、２種類のＩＢＬ（ＩＢＬ１およびＩＢＬ２）を用いて
、核酸の１番目の位置を解明することができる；例えば、アデノシンは、ＩＢＬ
１およびＩＢＬ２の両方が存在することによって表すことができ；チミジンは、
ＩＢＬ１が存在するが、ＩＢＬ２が存在しないことによって表すことができ；シ
トシンは、ＩＢＬ２が存在するが、ＩＢＬ１が存在しないことによって表すこと
ができ、グアノシンは、両方が存在しないことによって表すことができる。核酸
の２番目の位置は、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４を用いて同様に行うことができ；か
くして、ＩＢＬ１、ＩＢＬ２、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４の存在はＡＡの配列を示
し；ＩＢＬ１、ＩＢＬ２およびＩＢＬ３の存在は配列ＡＴを示し；ＩＢＬ１、Ｉ
ＢＬ３およびＩＢＬ４の存在は配列ＴＡを示すなどである。３番目の位置は、Ｉ
ＢＬ５およびＩＢＬ６を用いるなどである。このようにして、２０種類のアイデ
ンティファイアーの使用により、全ての起こり得る１０量体に対する固有のコー
ドを得ることができる。
【０１８３】 このようにして、各配列に対する一種の「バーコード」を構築することができ
る；異なったＩＢＬの各々の存在または不在は、各捕獲プローブの同定を許容す
る。
【０１８４】 加えて、種々の濃度または密度のＩＢＬの使用は、種類の「再使用」を許容す
る。例えば、第１の因子を含むビーズが１倍濃度のＩＢＬを有しており、第２の
因子を含む第２のビーズが１０倍濃度のＩＢＬを有する場合、対応する標識ＤＢ
Ｌの飽和濃度を用いてユーザーに２つのビーズを区別させる。
【０１８５】 捕獲プローブを含むミクロスフェアが得られるとすぐに、それらを基材に付加
してアレイを形成させる。本明細書に記載された方法のほとんどは、アッセイ前
にビーズを基材に付加するが、アレイの調製、使用および解読の順序を変えるこ
とができる。例えば、アレイを調製し、解読し、次いで、アッセイを行うことが
できる。別法として、アレイを調製し、アッセイにおいて使用し、次いで、解読
することができる；これは、少数のビーズを解読することだけが必要な場合に特
定の使用を見出すことができる。別法として、基材にビーズを付加する前に、ア
ッセイ混合物、すなわち、標的配列を含有する試料にビーズを付加することがで
きる；付加およびアッセイの後、アレイを解読することができる。これは、ビー
ズを含む試料を撹拌または混合した場合に特に好ましい；これは、単位時間あた
りビーズに結合した標的配列の量を増加させることができ、かくして、（核酸ア
ッセイの場合）ハイブリダイゼーションキネティクスを増大させることができる
。これは、試料中の標的配列の濃度が低い場合に特定の使用を見出すことができ
る；一般に、低濃度については、長い結合時間を用いなければならない。
【０１８６】 一般に、アレイの調製方法およびアレイの解読方法は、固有にコードされ得る
種々の候補因子の数を最大にするように行われる。本発明の組成物は、種々の方
法で調製される。一般に、アレイは、ビーズの付着のための部位を含有する表面
にビーズを含む溶液またはスラリーを添加することによって調製される。これは
、水性溶媒および有機溶媒を包含する種々のバッファーおよび混合物において行
われる。溶媒を蒸発させることができ、過剰のビーズは除去される。
【０１８７】 好ましい実施態様において、非共有方法を用いてビーズをアレイと会合させる
場合、ビーズをアレイに負荷させる新規方法が用いられる。この方法は、アレイ
を粒子（ミクロスフェアおよび細胞を包含する）の溶液に暴露させ、次いで、エ
ネルギーを供給すること、例えば、該混合物を撹拌または振動させることを含む
。この結果、弱く結合したビーズを減少させる（壁の場合には、落とす）のに十
分なエネルギーを用いて撹拌が行われた場合には、さらに密に会合した粒子を含
むアレイを生じる。そのうえ、これらの部位は異なるビーズを結合するのに利用
可能である。このようにして、該部位に対して高い親和性を示すビーズを選択す
る。このようにして調製したアレイは、より静的な負荷と比較して２つの主要な
利点を有している：第１に、高いパーセンテージのこの部位を容易に充填するこ
とができ、第２に、このようにして負荷されたアレイは、アッセイの間のビーズ
の損失が実質的に低下することを示す。かくして、好ましい実施態様において、
これらの方法を用いて、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％
、特に好ましくは、少なくとも約９０％の充填部位を有するアレイが得られる。
同様に、このようにして得られたアレイは、好ましくは、アッセイの間にビーズ
の約２０％未満、好ましくは、約１０％未満、特に好ましくは、約５％未満を損
失する。
【０１８８】 この実施態様において、別個の部位を有する表面を含む基材を、粒子（ビーズ
、細胞など）を含む溶液中に浸漬する。表面は、本明細書に記載するように、ウ
ェル、または、該部位に対して示差親和性があるようなパターン化された表面上
の他のタイプの部位を含んでもよい。この示差親和性は、競合プロセスを引き起
こして、さらに密に会合する粒子が選択される。好ましくは、ビーズで「負荷」
されるべき全表面は溶液と流動接触している。この溶液は、一般に、ビーズ：溶
液（ｖｏｌ：ｖｏｌ）が約１０,０００：１〜１：１の範囲であるスラリーであ
る。一般に、該溶液は、水性バッファー、有機溶媒、塩、他の試薬成分などを包
含する多くの試薬を含むことができる。加えて、該溶液は、好ましくは、過剰の
ビーズを含む；すなわち、アレイ上の部位よりも多くのビーズがある。好ましい
実施態様は、２倍〜１０億倍過剰のビーズを用いる。
【０１８９】 浸漬は、アッセイ条件を模倣することができる；例えば、アレイが上から試料
を含むマイクロタイタープレート中に「浸漬」される場合、この立体配置は、負
荷に対して反復することができ、かくして、重力により落ちると考えられるビー
ズを最小限度にすることができる。
【０１９０】 表面が浸漬されるとすぐに、基材、溶液またはその両方を競合プロセスに付し
、それにより、低い親和性を有する粒子を基材から解離して、部位に対して高い
親和性を示す粒子と置き換えることができる。この競合プロセスは、熱の形態で
のエネルギーの導入、溶液もしくは基材またはその両方の音波処理、撹拌もしく
は混合、振動または撹拌によって行われる。
【０１９１】 好ましい実施態様は、撹拌または振動を用いる。一般に、基材の操作の量を最
小限度にしてアレイに対するダメージを防止する；かくして、好ましい実施態様
はアレイよりもむしろ溶液の撹拌を用いるが、いずれも有効に作用する。当業者
により理解されるように、この撹拌は多くの形態をとることができ、好ましい実
施態様は、マイクロタイタープレート振盪器を用いて撹拌されるビーズ溶液を含
むマイクロタイタープレートを用いる。
【０１９２】 攪拌をアレイが所望の量で満たされるのに十分な時間行う。ビーズの大きさお
よび濃度ならびにアレイの大きさに応じて、この時間は約１秒から数日の範囲と
することが可能であり、約１分から約２４時間が好ましい。 アレイの部位のすべてがすべてビーズを含むものではないこと、すなわち、基
材表面に空の部位があってもよいことに留意すべきである。加えて、好ましいわ
けではないが、１個よりも多くのビーズを含有する部位があってもよい。 ある場合において、例えば、化学的付着を行う場合、ビーズをランダムではな
く、または秩序立てて付着させることが可能である。例えば、光活性化可能な付
着性リンカーまたは光活性化可能な付着物質またはマスクを用い、ビーズの一定
の集団に播種するように、アレイ上の選択された部位を連続的に付着に適するよ
うにすることができる。
【０１９３】 捕獲プローブの同一性についての情報がアレイの中に組み込まれるように本発
明のアレイを構築する。その結果、ファイバーウェル中のビーズのランダムな堆
積が「解読」され、あらゆる位置での捕獲プローブを同定することができる。こ
のことは、アレイを使用する前、間、または後のいずれであっても、標的とする
分子を検出するための種々の方法にて行うことができる。 かくして、アレイを作製した後に、基材表面上にある、１またはそれ以上の捕
獲プローブ、すなわち、ビーズの各部分集団の位置を同定するためにそのアレイ
を「解読」する。 好ましい具体例においては、出典明示により明らかにこの中に組み入れられる
、１９９９年１０月２２日出願の（まだ出願番号は付与されていない）「微小球
アレイを用いる核酸配列決定」に記載されるような、ピロシーケンシング技法を
用いてアレイを解読する。
【０１９４】 好ましい具体例においては、選択的解読システムを使用する。この場合、標的
配列の結合の結果として光シグナルの変化を示す微小球だけが解読される。この
操作は、一般に、「ヒット」の数、すなわち、解読される部位の数が一般に少な
い場合に行われる。すなわち、標的配列の不存在の下にある実験的条件下でまず
アレイをスキャンする。標的配列を含有する試料を加え、光シグナルの変化を示
す位置だけを解読する。例えば、ビーズの正または負のシグナル位置を選択的に
タグ化またはアレイから放出させ（例えば、光切断可能なリンカーを用いて）、
その後、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）にて分類または豊富化させる。す
なわち、すべての負のビーズを放出させ、ついで正のビーズを放出させるかもし
くはインサイチュにて分析するか、あるいはまたすべての正のビーズを放出させ
て分析する。別法として、標識はハロゲン化芳香族化合物を含んでいてもよく、
その標識の検出を、例えば、ガスクロマトグラフィー、化学タグ、アイソトープ
タグ、マススペクトルタグを用いて行う。
【０１９５】 当業者に明らかなように、このことはまた、アレイが解読されていない；すな
わち、今までにビーズの組成と位置とを相関付ける必要もなかった、システムに
て行うこともできる。この具体例においては、ビーズをアレイ上に負荷させて、
アッセイを行う。ついで、「正」の、すなわち、以下により詳細に示すように光
シグナルの変化を示すそれらのビーズを、「負」のビーズと区別または分離する
ように「マーク」を付す。この操作は、数種の方法、好ましくは光ファイバーア
レイを用いて行うことができる。好ましい具体例において、各ビーズは蛍光染料
を含有する。アッセイを行い、「正」または「活性ビーズ」を同定した後、一般
に、光活性化試薬（典型的には、溶存酸素）の存在下で、正のファイバーだけに
、または負のファイバーだけに光を照らす。前者の場合、活性ビーズはすべて光
漂白される。かくして、すべてのビーズを、例えば、蛍光活性化細胞ソーター（
ＦＡＣＳ）装置を用いるその後の分類操作で非選択的放出に付した後、非蛍光的
な活性ビーズを蛍光的な負のビーズから分類することができる。また、負のファ
イバーに光を照らすと、負はすべて非蛍光的であり、正は蛍光的であり、分類を
進めることができる。付着した捕獲プローブの特徴化を、例えば、質量分光器を
用いて直接行うこともできる。
【０１９６】 また、同一化が、ＩＢＬに類似するが、必ずしもＤＢＬに結合する必要のない
、アイデンティファイアー基（「ＩＭｓ」）の使用を介して起こるかもしれない
。すなわち、捕獲プローブの構造を直接解明するよりもむしろ、ＩＭｓの組成物
をアイデンティファイアーとして供することができる。かくして、例えば、ＩＭ
ｓの特異的な組み合わせをビーズをコードするのに供し、それをビーズからの放
出でビーズ上にある物質を同定し、つづいてその後の、例えば、ガスクロマトグ
ラフィーまたは質量分光器を用いる、分析に用いることができる。 別法として、各ビーズは、蛍光染料を含有するというよりもむしろ、蛍光染料
の非蛍光前駆体を含む。例えば、蛍光分子上の特定のオルトニトロベンジル基な
どの光切断可能な保護基を用い、蛍光色素の光活性化を行うことができる。アッ
セイを行った後、再び「正」または「負」のファイバーのいずれかに光を照射し
、これらの集団を区別する。ついで、そのイルミネートされた先駆体を化学的に
蛍光染料に変える。ついで、すべてのビーズを分類操作に付しながら、アレイか
ら放出させ、蛍光および非蛍光ビーズ（正および負あるいはその逆）の集団を形
成させる。
【０１９７】 別の好ましい具体例において、ビーズ（例えば、ウェル）の付着部位が光重合
可能な試薬を含むか、あるいは光重合可能な試薬が集合アレイに付加されている
。試験アッセイを行った後、光を再び「正」または「負」のファイバーのいずれ
かに照射し、これらの集団を区別する。その照射の結果として、すべての正また
はすべての負が重合して、その部位にトラップまたは結合され、他のビーズの集
団を該アレイから放出させることができる。 好ましい具体例において、あらゆる捕獲プローブの位置を解読結合リガンド（
ＤＢＬ）を用いて測定する。上述したように、ＤＢＬは、存するとすればアイデ
ンティファイアー結合リガンドに、あるいは、好ましくは捕獲プローブが核酸ま
たは蛋白である場合の、捕獲プローブそれ自身に結合するはずの結合リガンドで
ある。 好ましい具体例において、ＤＢＬは、上述したように、ＩＢＬに結合する。
【０１９８】 好ましい具体例において、捕獲プローブは一本鎖核酸であり、ＤＢＬは、本明
細書中、デコーダープローブと称される、捕獲プローブに結合（ハイブリッド形
成）する実質的に相補的な一本鎖核酸である。候補プローブの各々に実質的に相
補的なデコーダープローブを製造し、アレイを解読するのに使用する。この具体
例において、候補プローブおよびデコーダープローブは特異性を付与するのに十
分な長さ（解読工程は適当な条件下で行う）でなければならず；すなわち、候補
プローブは各々、各候補プローブの区別を可能とするのに十分に特異的に、その
対応するデコーダープローブに結合しなければならない。 好ましい具体例において、ＤＢＬは直接的または間接的のいずれかで標識され
ている。好ましい具体例において、ＤＢＬは直接的に標識されている；すなわち
、ＤＢＬは一の標識を含む。もう一つ別の具体例において、ＤＢＬは間接的に標
識されている；すなわち、ＤＢＬに結合するであろう標識化結合リガンド（ＬＢ
Ｌ）を使用する。この具体例において、標識化結合リガンド−ＤＢＬ対をＩＢＬ
−ＤＢＬ対について上述したものとすることができる。 したがって、個々のビーズ（またはビーズの部分集団）の位置の同定を、標識
化ＤＢＬとＩＢＬまたは捕獲プローブの間の結合（すなわち、候補プローブと、
捕獲プローブが核酸である場合のデコーダープローブとの間のハイブリダイゼー
ション）を含む１またはそれ以上の解読工程を用いて行う。解読した後、ＤＢＬ
を除去し、そのアレイを用いることができる；しかし、ある環境下、例えば、Ｄ
ＢＬが捕獲プローブではなく、ＩＢＬに結合する場合、（ある環境下では望まし
いかもしれないが）ＤＢＬの除去は不要である。加えて、本明細書中で述べたよ
うに、アレイをアッセイに使用する前、アッセイの間、またはアッセイの後のい
ずれにおいても解読を行うことができる。
【０１９９】 一の具体例において、単一の解読工程を行う。この具体例において、ＤＢＬの
各々を独特標識で標識化する。そのために、独特なタグの数は捕獲プローブの数
に等しいか、またはそれより多い（ただし、ある場合には、本明細書中に記載さ
れるように、独特な標識を「再利用」することもできる；同様に、候補プローブ
の少数の変種が別の次元にて、すなわち、ビーズの大きさまたは標識にてコード
化されているならば、そのような変種は同じデコーダーを共有することができる
）。捕獲プローブまたはＩＢＬの各々の場合、それと特異的に結合し、独特なタ
グ、例えば１またはそれ以上の蛍光色素を含有するＤＢＬを調製する。かくして
、各ＤＢＬの同一性、その組成（すなわち、核酸である場合のその配列）および
その標識は共に知られている。ついで、ＤＢＬと捕獲プローブまたはＩＢＬのい
ずれかの間の複合体（成分が核酸である場合にハイブリダイゼーション複合体と
称される）の形成を可能とする条件下、ＤＢＬを捕獲プローブを含有するアレイ
に付加することにより、各ＤＢＬの位置を解明することができる。このことによ
り、各捕獲プローブの位置を同定することができ；ランダムなアレイが解読され
る。ついで、必要ならば、ＤＢＬを取りだし、標的とする試料を適用することが
できる。
【０２００】 好ましい具体例において、独特標識の数を独特な捕獲プローブの数よりも少な
くし、そうして一連の解読工程を使用する。この実施態様においては、デコーダ
ープローブを解読操作のためにｎ個のセットに分ける。セットの数は独特タグの
数に対応する。各デコーダープローブをｎ個の別々のタグを有するｎ個の別々の
反応にて標識化する。デコーダープローブはすべて同じｎ個のタグを共有する。
各プールが各デコーダーのｎ個のタグのバージョンの１個だけを含有し、２つの
デコーダープローブがすべてのプールを通して同じ配列のタグを有することがな
いように、デコーダープローブをプールする。これを正当化するために必要なプ
ールの数は、デコーダープローブの数およびｎの数により決定される。各プール
をアレイにハイブリダイゼーションすると、処理毎にシグナルを発生する。各プ
ールを、順次、連続的にハイブリダイゼーションすると、各候補プローブにつき
独特な配列特異的コードが得られる。これにより各処理のアレイにおける候補プ
ローブを同定する。例えば、４個のタグを用いる場合、４ｘｎ回の連続したハイ
ブリダイゼーションで、理想的には４ｎ個の配列を区別することができるが、あ
る場合には、さらなる工程を必要とするかもしれない。各プールをハイブリダイ
ゼーションに付した後、ハイブリッドは変性され、デコーダープローブは除去さ
れているため、次のハイブリダイゼーションに備えて、プローブを一本鎖にする
（ただし、利用可能なプローブが飽和状態とならないように、標的の数を限定し
てハイブリダイズすることも可能である。逐次的ハイブリダイゼーションは前の
ハイブリダイゼーションから前に存在するシグナルを減ずることにより行い、分
析することができる）。
【０２０１】 一例を挙げる。１６個のプローブの核酸（番号１−１６）のアレイと、４個の
独特なタグ（４個の異なるフルオル、例えば；標識Ａ−Ｄ）を想定する。ビーズ
上に該プローブに対応するデコーダープローブ１−１６を作製する。第１の工程
はデコーダープローブ１−４をタグＡで、デコーダープローブ５−８をタグＢで
、デコーダープローブ９−１２をタグＣで、およびデコーダープローブ１３−１
６をタグＤで標識することである。そのプローブを混合し、そのプールを候補プ
ローブの付着したビーズを含有するアレイと接触させる。ついで、各タグ（およ
び各デコーダーと候補プローブの対）の位置を決定する。ついで、デコーダープ
ローブの第１のセットを除去する。第２のセットを加えるが、この時、デコーダ
ープローブ１、５、９および１３はタグＡで標識化されており、デコーダープロ
ーブ２、６、１０および１４はタグＢで標識化されており、デコーダープローブ
３、７、１１および１５はタグＣで標識化されており、デコーダープローブ４、
８、１２および１６はタグＤで標識化されている。このように、両方の解読工程
にてタグＡを含有するビーズは候補プローブ１を含有し；第１解読工程にてタグ
Ａおよび第２解読工程にてタグＢを含有するビーズは候補プローブ２を含有し；
第１解読工程にてタグＡおよび第２解読工程にてタグＣを含有するビーズは候補
プローブ３を含有する等である。一の実施態様において、デコーダープローブを
インサイチュにて標識化する；すなわち、解読反応の前に標識化する必要はない
。この実施態様において、移住するデコーダープローブは候補プローブよりも短
く、デコーダープローブ上に５’「オーバーハング」を創製する。標識されたｄ
ｄＮＴＰ（各々、独特なタグで標識されている）およびポリメラーゼを付加して
配列特異的方式にてタグの付加を可能とし、こうしてシグナルの配列特異的方式
を創製する。同様に、ライゲーション等を含む、他の修飾を行うこともできる。
【０２０２】 加えて、アレイの大きさは独特な解読結合リガンドの数により定められるであ
ろうから、より多くの数の試験部位についても独特なＤＢＬのセットを再利用す
ることが可能である。このことはいくつかの方法；例えば、光学的特徴を含む部
分集合を用いることにより行うことができる。同様に、アレイの中の位置コード
化スキーム；異なるサブバンドルを用いてＤＢＬのセットを再利用することがで
きる。同様に、一の具体例はコード化様式としてビーズの大きさを利用し、各ビ
ーズの大きさについての独特なＤＢＬのセットを再利用することができる。また
、アレイをビーズで逐次的部分負荷に付し、ＤＢＬを再利用することもできる。
さらには、「コードシェアリング」も起こり得る。 好ましい具体例において、ＤＢＬはビーズの部分集合が光学的特徴を含むこと
により再利用することができる。好ましい具体例において、光学的特徴は、一般
に、レポーター染料、好ましくは蛍光性物質の混合物である。混合物の組成（す
なわち、一の染料の他の染料に対する割合）および染料の濃度（シグナル強度の
違いをもたらす）の両方を変えることにより独特な光学的特徴のマトリックスを
生成することができる。このことは染料をビーズの表面に共有結合させることに
より、あるいはまた染料をビーズの内部にトラップさせることにより行うことが
できる。
【０２０３】 好ましい具体例において、例えば、コード化の次元をさらにビーズの大きさに
加えることもできるが、コード化は少なくとも２つの染料の比率において達成す
ることができる。加えて、標識を相互に区別することもでき；このように２つの
異なる標識が異なる分子（すなわち、２つの異なるフルオル）を含んでいてもよ
く、あるいはまた一つの標識が２種の異なる濃度または強度であってもよい。 好ましい具体例において、染料はビーズの表面に共有結合する。この操作はビ
ーズの表面にある官能基を用い、捕獲プローブの付着について概説されている記
載に従って行うことができる。当該分野にて明らかであるように、これらの付着
は染料に対する作用を最小限にするようになされる。 好ましい具体例において、一般に、染料がビーズの孔にトラップされることで
、染料がビーズと非共有結合する。 加えて、単一の染料の濃度よりも２つまたはそれ以上の染料の比率にてコード
化することが好ましい。というのも、それはレポーター染料の特徴を信号化する
のに用いられる光の強度に対して非感受性を提供し、かつ検出物感受性を提供す
るからである。
【０２０４】 好ましい具体例において、空間的または位置的コード化システムを行う。この
具体例において、利用することのできるサブバンドルまたはサブアレイ（すなわ
ち、アレイ全体の一部分）がある。テレホーンシステムから類推することにより
、各サブアレイは、サブアレイの位置により分離される、他のサブアレイの同じ
タグ（すなわち、電話番号）を有しうる「領域コード」である。かくして、例え
ば、同じ独特なタグをバンドルにより再利用することができる。かくして、５０
個の独特なタグを１００個の異なるサブアレイと組み合わせて使用することによ
り５０００種の異なる捕獲プローブのアレイを形成することができる。この具体
例において、バンドル相互において同定することができることが重要となる；一
般に、このことは手作業によるか、またはマーカービーズ、すなわち、各サブア
レイで独特なタグを含有するビーズを用いることによりなされる。
【０２０５】 別の具体例において、微小球の大きさなどの付加的なコード化変数を付加する
ことができる。例えば、異なる大きさのビーズの使用はまた、ＤＢＬのセットの
再利用を可能とし；すなわち、微小球のコード化の次元を拡張するように異なる
大きさの微小球の使用を可能とする。異なるファイバー径または断面を有するピ
クセル；あるいは２またはそれ以上の光ファイバーバンドルであって、個々のフ
ァイバーの断面が各々異なり、より長いバンドルを形成するのに一緒に付加する
ことができる、または同じ大きさの断面のファイバーの光ファイバーバンドルを
用いることができるが、大きさが異なるだけである、光ファイバーバンドルを含
有する光ファイバーアレイを組み立てることができる。種々の径を有する、最大
のウェルを最大の微小球で満たし、ついであらゆる大きさのウェルが満たされる
までより小さい微小球をより小さいウェルに段々に移す。このように、同じ染料
比を用いて異なる大きさの微小球をコード化し、それによりアレイ中に存在する
異なるオリゴヌクレオチド配列または化学的官能基の数を拡張させることができ
る。光ファイバー基材について説明されているが、この方法ならびに本明細書に
記載の他の方法で、同様に他の基材ならびに他の付着様式を用いることができる
。
【０２０６】 好ましい具体例において、微小球をアレイに連続的にローディングすることに
よりコード化および解読がなされる。空間的コード化について上述したように、
この具体例において、光学的特徴を「再利用」することができる。この具体例に
おいて、種々の捕獲プローブを含む微小球の各ライブラリー（あるいは各部分集
合は種々の捕獲プローブを含む）を、例えば、所望とするアレイの大きさおよび
独特なタグの数に応じて、複数のサブライブラリーに分け、各サブライブラリー
が略同じ独特なタグを含む、ライブラリー全体の約１０％を含む１０個のサブラ
イブラリーを製造することができる。ついで、第１のサブライブラリーをウェル
を含む光ファイバーバンドルに加え、一般にはＤＢＬの使用を介して各捕獲プロ
ーブの位置を決定する。次に、第２のサブライブラリーを加え、各捕獲プローブ
の位置を再び測定する。この場合のシグナルは「第１の」ＤＢＬおよび「第２の
」ＤＢＬから由来のシグナルを含み；２つのマトリックスを比較することにより
、各サブライブラリーにおける各ビーズの位置を決定することができる。同様に
、第３、第４などのサブライブラリーを連続的に加えることでアレイを満たすこ
ともできるであろう。
【０２０７】 好ましい具体例において、コードを数種の方法にて「共有」することができる
。第１の具体例において、標的となる配列がその結合強度において十分に異なる
のであれば、単一のコード（すなわち、ＩＢＬ／ＤＢＬ対）を２またはそれ以上
の作用剤に帰属させることができる。例えば、ｍＲＮＡの定量アッセイに用いら
れる２つの核酸プローブは、そのハイブリダイゼーションシグナルの強度の範囲
が重複しない場合、同じコードを共有することができる。このことは、例えば、
標的となる配列の一つが他の配列よりもずっと高濃度で常に存在する場合に起こ
り得る。また、２つの標的となる配列が常に同じような濃度で存在していてもよ
いが、ハイブリダイゼーション効率の点で異なる。 また、作用剤が機能的に均等であるならば、単一のコードを複数の作用剤に帰
属させることができる。例えば、一連のオリゴヌクレオチドのプローブが特定の
遺伝子の存在を検出するという共通の目的のために設計されるとすれば、たとえ
配列が異なっているとしても、プローブは機能的に均等である。同様に、この型
のアレイを用いて既知の遺伝子の相同物を検出することもできる。この具体例に
おいて、各遺伝子は異なる領域の遺伝子（したがって、配列において異なる遺伝
子）にハイブリッド形成する異種の一連のプローブにより発現される。このプロ
ーブのセットは共通のコードを共有する。一の相同物が存在する場合、すべてで
はないが、いくつかのプローブとハイブリッド形成することもできる。相同性の
レベルはハイブリッド形成するプローブの断片ならびに平均ハイブリダイゼーシ
ョン強度により表すことができる。同様に、同じ蛋白に対する複数の抗体はすべ
て同じコードを共有することができる。
【０２０８】 好ましい具体例において、自己集合したランダムアレイの解読をｐＨ滴定を基
礎に行う。この具体例において、ビーズは、捕獲プローブに加えて、光学的特徴
を含む。ここで、この光学的特徴は発蛍光団などのｐＨ−応答性染料（本明細書
中で「ｐＨ染料」ということも多い）を用いることで生成される。この具体例は
ＰＣＴ／ＵＳ９８／０５０２５およびＵＳＳＮ０９／１５１８７７に記載されて
いるのと同様であり、その両者を出典明示により本明細書の一部とする；ただし
、本発明で使用する染料は、溶液のｐＨをｐＫａ以下からｐＫａ以上に（または
その逆に）調整した場合に、蛍光度（または他の特性）において変化を示す。好
ましい具体例において、少なくとも０．５のｐＨ単位で分離されていることが好
ましい、各々が種々のｐＫａを有する、一連のｐＨ染料を用いる。好ましい具体
例は、ｐＫａが２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５
．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１
０．０、１０．５、１１および１１．５のｐＨ染料を利用することである。各ビ
ーズはいずれのサブセットのｐＨ染料を含有することもでき、この方法において
捕獲プローブに独特なコードを生成する。かくして、アレイの解読は、アレイを
ｐＨ１からｐＨ１３まで滴定し、各ビーズから由来の蛍光シグナルを溶液のｐＨ
の関数として測定することによりなされる。
【０２０９】 かくして、本発明は表面に別個の部位を含む基材からなるアレイ組成物を提供
する。微小球の集団をそれらの部位に分配する。その集団は少なくとも第１およ
び第２の部分集団からなる。各部分集団は捕獲プローブを、加えて、少なくとも
１個の所定のｐＫａを有する光学染料を含む。異なる光学染料のｐＫａは異なる
。 好ましい具体例において、重複性の数種のレベルを本発明のアレイの中に構築
する。重複性をアレイの中に構築することで、データについての信頼性を定量的
に評価する能力および感度を有意に増加させる能力を含め、いくつかの有意な利
点が得られる。かくして、好ましい具体例はアレイの重複性を利用するものであ
る。当業者に明らかなように、アレイの中に構築することができる少なくとも２
つの型の重複性がある：すなわち、複数の同一のセンサーエレメント（本明細書
において、「センサー重複性」という）を用いる型と、同じ標的分析物に対して
定方向性であるが、異なる化学官能基を含む、複数のセンサーエレメント（本明
細書において、「標的重複性」という）を用いる型である。例えば、核酸を検出
する場合、センサー重複性は、同一の結合リガンド、例えばプローブを含むビー
ズなどの複数のセンサーエレメントを利用する。標的重複性は同じ標的に対して
異なるプローブを有するセンサーエレメントを用いる：一のプローブは標的の最
初の２５個の塩基に広がり、第２のプローブ標的の第２の２５個の塩基に広がる
などの可能性がある。これらのいずれかまたは両方の型の重複性をアレイの中に
構築することにより、有意な利益が得られる。例えば、種々の統計学的分析を行
うことができる。
【０２１０】 加えて、これは、本明細書中、一般にビーズアレイについて記載するが、当業
者にとって明らかなように、この方法は標的を分析するために設計されたいずれ
の型のアレイに用いることもできる。 好ましい具体例において、センサー重複性を用いる。この具体例において、複
数のセンサーエレメント、例えば、同一の生物活性な試剤を含むビーズを用いる
。すなわち、各部分集団は同一の生物活性な試剤（例えば、結合リガンド）を含
む複数のビーズを含む。所定のアレイについての多数の同一のセンサーエレメン
トを用いることにより、各センサーエレメントからの光シグナルを合し、以下に
示すように、かなり多数の統計学的分析物を分析することができる。このことは
種々の理由から行うことができる。例えば、時間変動の測定において、重複性は
システムにおけるノイズを有意に減少させることができる。時間を基礎としない
測定の場合、重複性はデータの信頼性を有意に増加させることができる。
【０２１１】 好ましい具体例において、複数の同一のセンサーエレメントを用いる。当業者
に明らかなように、同一のセンサーエレメントの数はセンサーアレイの適用およ
び使用と共に変化するであろう。一般に、２から数千を用いることができるが、
２ないし１００が好ましく、２ないし５０が特に好ましく、５ないし２０が特に
好ましい。一般に、仮の結果から、ある適用では、１０個より多くのビーズを用
いることもできるが、約１０個で十分な利点が得られることが判る。 一旦得られたならば、各ビーズ部分集団の範囲内にある複数のセンサービーズ
からの光学応答シグナルを操作し、基線調整、平均化、標準偏差分析、分布およ
びクラスター分析、信頼区間分析、平均試験などを含む、多種の方法にて分析す
ることができる。
【０２１２】 好ましい具体例において、光学応答シグナルの第１の操作は任意の基線調整で
ある。一の典型的な操作において、標準化された光学応答をすべてのデータから
整数１．０を減じることにより調整して０．０の値で開始する。この操作を行う
ことにより、基線−ループデータを一緒に合わせた時でさえそれが０を保持し、
ランダムな応答シグナルノイズを削除することができる。試料が流体である場合
、流体パルス−ループ経時領域は、試料パルスに付す前に、正、負または中性の
いずれかの特徴的な応答変化を示すことが頻繁であるが、ＣＣＤカメラにおける
チャージビルドアップによる最初の２、３のデータポイントにおけるドリフトに
関連するノイズを克服するために基線調整を必要とすることも多い。ドリフトが
無ければ、典型的には、各ビーズセンサーについての第１のデータポイントから
の基線データを同じビーズについてのすべての応答データから減じる。基線調整
を行うことにより、複数のビーズ応答を一緒に加えた場合に、基線は０を保持し
ながら、その応答を増幅させることができる。すべてのビーズは同じ時間に試料
（例えば、試料パルス）に応答するため、それらはすべて全く同じ時間にパルス
を見、その応答をオーバーレイするために記録または調整する必要はない。加え
て、使用するシステムの要件および出力に応じて、他の型の基線調整を行っても
よい。
【０２１３】 一旦、ベースラインを調整し、できるだけ多くの統計学的分析を行って、公知
の統計学的パラメータを得ることができる。重複性に基づく分析は公知のもので
あり、一般にFreund and Walpole、Mathematical Statistics、Prentice Hall、
Inc. New Jersey, 1980のようなテキストに記載されており、これらは出典明示
し本明細書に組み入れる。 好ましい具体例において、シグナル合計は各々の時間点での全ての応答の強度
値を単純に加算することにより行われ、全てのビーズ応答の合計から成る新規の
一時的な応答を生じる。これらの値はベースライン調整または生のものであって
もよい。本明細書に記載の全ての分析に関して、シグナル合計はリアルタイムで
またはデータ取得後のデータを換算し、分析する間に行うことができる。一の具
体例において、シグナル合計は、見かけの応答データを収集した後、市販の計算
プログラム（Ｅｘｃｅｌ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）で行う
。 好ましい具体例において、蓄積応答データは、連続的な時間間隔における全て
のデータを単に加算することにより得られる。ついで、特別な時間間隔での全て
のデータの合計から成るこの最終柱は各々のビーズ応答で比較またはプロットで
き、シグナル強度の程度または改善ノイズに対するシグナル率を決定できる。 好ましい具体例において、部分母集団（すなわち、一致するビーズの過半数）
の平均値はよく知られた式１を使用して決定される。
【０２１４】 式１
【数１】
【０２１５】 いくつかの具体例において、部分母集団は再評価され、必要な場合（例えば、
以下に議論する明らかな異常値に関する）、いくつかのビーズを除く。 好ましい具体例において、部分母集団の標準偏差は、一般的に、式２（完全部
分母集団に関する）および式３（完全な母集団より小さいものに関する）を使用
して決定できる。
【０２１６】 式２
【数２】
【０２１７】 式３
【数３】
【０２１８】 平均値に関して、部分母集団は再評価でき、必要な場合（例えば、以下に討論
する明らかな異常値に関する）、いくつかのビーズを除く。 好ましい具体例において、統計学的分析を行い、限定するものではないが、ｔ
分布および群分析を含む方法を使用して、部分母集団の特別なデータ点が統計学
的に妥当であるか評価する。これを行い、別に結果を歪曲し、いずれかの特別な
実験のノイズに対するシグナル率を増加させる異常値を統計学的に放棄する。こ
れを式４を使用して行う。
【０２１９】 式４
【数４】
【０２２０】 好ましい具体例において、データの質は当該分野で公知の信頼区間を使用して
評価する。信頼区間を、より包括的データ過程を容易にするために使用し、結果
の統計学的正当性を測定する。 好ましい具体例において、ビーズの部分母集団の統計学的パラメータを仮定試
験を行うために使用する。１つの適用は平均値に対する試験であり、また平均値
試験とも称される。この適用において、統計学的評価を行い、２つの部分母集団
が異なるかどうかを測定する。例えば、１つのサンプルを配列中の各々の部分母
集団に対して他のサンプルと比較でき、バリエーションが統計学的に有意である
場合決定される。 加えて、また平均値試験は、同様のコードを共有する２つの異なる分析を識別
するために使用される。２つの分析が各々他から統計学的に識別できる結果を与
える場合、同様のコードを共有する部分母集団は、以下の式５に示される分析お
よび平均値試験に基づいて各々他から識別できる。
【０２２１】 式５
【数５】
【０２２２】 さらに、検出元素の各々の部分母集団の各一員の分布の分析を行うことができ
る。例えば、部分母集団分布は、分布が２項、ポアソン、超幾何学的等であるか
どうかを決定するために評価できる。 検出重複性に加えて、好ましい具体例は、単標的検体に検出されるが、同定さ
れていない検出元素の過半数に有用である。例えば、単標的核酸検体は、各々異
なるプローブを含む２つまたはそれ以上の検出元素を有することができる。これ
は、非特異性結合相互作用が統計学的に最小であるとして、確認レベルが増す。
核酸標的検体分析は評価されるべきであい、余剰核酸プローブは重複、調整また
は空間的に分離できる。しかし、２つのプローブが単結合部位に関して競合しな
いことが好ましいので調整または分離プローブが好ましい。同様に、蛋白様標的
検体は評価されるべきであり、好ましい具体例は、標的の異なる部位に結合する
生物活性剤結合剤に有用である。例えば、抗体（または抗体フラグメント）は生
物活性剤として、標的蛋白の結合のために使用され、好ましい具体例は、異なる
エピトープに対する抗体に有用である。
【０２２３】 この具体例において、異なる検出元素の過半数は、好ましくは約２〜約２０、
さらに好ましくは約２〜約１０、特に好ましくは２〜５で使用され、２、３、４
または５を含む。しかし、また、上記のように適用に依存してより多くが使用で
きる。 上記のように、統計学的分析はいくらでも標的余剰検出からのデータで行うこ
とができる。 検出元素合計の１つの利点（本明細書では、ビーズが使用される場合「ビーズ
合計」を意味する）は、生じうる感受性を増加させる。 本明細書の概要として、本発明は広範囲の適用における使用を見出す。本明細
書に示された全ての参考文献は出典明示し本明細書に組み入れる。
【０２２４】 実施例 ゲノムＤＮＡの固体担体への付着
【０２２５】 １．ゲノムＤＮＡの断片化
【表１】 ３７℃で１０分間インキュベートする。０．５ＭのＥＤＴＡ１．２５μｌを添加
し、９９℃で１５分間加熱する。
【０２２６】 ２．断片化ゲノムＤＮＡの沈殿
【表２】 −２０℃で２０分間保存する。１２，５００ｒｐｍで回転する。７０％ＥｔＯＨ
で２度ペレットを洗浄し、空気乾燥する。
【０２２７】 ３．ビオチンで末端標識する末端転移酵素
【表３】 ３７℃で６０分間インキュベートする。０．５ＭのＥＤＴＡ１μｌを添加し、つ
いで９９℃で１５分間加熱する。
【０２２８】 ４．ビオチン標識ゲノムＤＮＡの沈殿
【表４】 −２０℃で２０分間貯蔵し、および１２，５００ｒｐｍで５分間回転し、７０％
ＥｔＯＨで２度洗浄し、空気乾燥する。
【０２２９】 ５．ビオチン標識ゲノムＤＮＡのストレプトアビジンコート化ＰＣＲチューブ
への固定化 ９５℃熱ブロック上で１０分間熱変性させたゲノムＤＮＡ
【表５】 ６０℃で６０分間インキュベートする。 １Ｘ結合緩衝液で１度、 １Ｘ洗浄緩衝液で１度、 １Ｘ連結緩衝液で１度洗浄する。 １Ｘライゲーション緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５
ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ １Ｘ洗浄緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ＭのＮａＣ
ｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １Ｘライゲーション緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２５ｍ
Ｍの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの
ＮＡＤ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００
【０２３０】 ６．ストレプトアビジンコート化ＰＣＲチューブ中でのライゲーション 主溶液を生成し、その各々は、 １Ｘライゲーション緩衝液４９μｌ、 ＴａｑＤＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μｌ）１μｌ を含む。 ６０℃で６０分間インキュベートする。 各々のチューブを １Ｘ洗浄緩衝液で１度、 ｄｄＨ２Ｏで１度 洗浄する。
【０２３１】 ７．ライゲーション生成物 ５０μｌのｄｄＨ２Ｏを各々のチューブに加え、９５℃で５分間インキュベー
トし、氷上で冷却し、上清を汚れていないチューブに移す。
【０２３２】 ８．ＰＣＲ設定
【表６】 ＰＤＲ条件： ９４℃ １０分 ９４℃の３５回 ３０秒 ６０℃ ３０秒 ついで、 ７２℃ ３０秒
【図面の簡単な説明】
【図１】 アレイを基礎とする遺伝子発現を検出するためのフローチャート
を示す。
【図２】 アレイを基礎とするＲＮＡ可変スプライシングを検出するための
フローチャートを示す。
【図３】 オリゴ−ライゲーション法を用いるゲノム幅遺伝子発現のプロフ
ァイリングを示す。
【図４】 オリゴ−ライゲーション法を用いるゲノム幅ＲＮＡ可変スプライ
シングのモニターリングを示す。
【図５】 全ゲノムオリゴ−ライゲーション法を用いる直接的遺伝子型形成
を示す。
【図６】 全ゲノムオリゴ−ライゲーション法を示す。
【図７】 ハイブリダイズしていないプローブおよび標的を除去するために
、ポリ（Ａ）−ポリ（Ｔ）捕獲を利用する本発明の好ましい一例を示す。
【図８】 ＯＬＡフォーマットを用いて、ハイブリダイズされていない標的
プローブを除去する一の好ましい具体例を示す。
【図９】 ２つのライゲーションプローブを使用する一の好ましいローリン
グサークルの具体例を示す。
【図１０】 １つの単一標的プローブを使用する好ましい一のローリングサ
ークルの具体例を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的配列中の検出ポジションにあるヌクレオチドの同一性を
    決定する方法であって、 ａ）ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）； ｉｉ）アダプター配列； ｉｉｉ）読み出しポジションに第一塩基を含む第一標的特異的配列；および、 ｉｖ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）； を含む第一プローブを得； ｂ）該第一塩基が該検出ポジションのヌクレオチドに完全に相補的である場合に
    のみ第一ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、該第一プローブ
    を該標的配列と接触させ； ｃ）ハイブリッドを形成していない第一プローブを除去し； ｄ）該ハイブリダイゼーション複合体を変性させ； ｅ）該第一プローブを増幅して複数のアンプリコンを作成し； ｆ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｇ）該検出ポジションにあるヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  2. 【請求項２】 アンプリコンが標識を含む、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 さらに、 ａ）ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）； ｉｉ）アダプター配列； ｉｉｉ）該読み出しポジションに第二塩基を含む第二標的特異的配列；および ｉｖ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）； を含む第二プローブを得； ｂ）該第二塩基が該検出ポジションにあるヌクレオチドに完全に相補的である場
    合にのみ第二ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、該第二プロ
    ーブを該標的配列と接触させ； ｃ）ハイブリッドを形成していない第二プローブを除去し； ｄ）該第二ハイブリダイゼーション複合体を変性させ； ｅ）該第二プローブを増幅して複数のアンプリコンを作成し； ｆ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｇ）該検出ポジションにあるヌクレオチドを決定する； ことを含む、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 標的配列中の検出ポジションにあるヌクレオチドの同一性を
    決定する方法であって、 ａ）読み出しプローブが、各々、 ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）； ｉｉ）アダプター配列； ｉｉｉ）読み出しポジションにある独特な塩基を含む標的特異的配列；および ｉｖ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）； を含む複数の読み出しプローブを得； ｂ）該読み出しポジションの該塩基が該検出ポジションのヌクレオチドに完全に
    相補的である場合にのみ第一ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下
    で、該検出プローブを該標的配列と接触させ； ｃ）ハイブリッドを形成していない第一プローブを除去し； ｄ）該第一ハイブリダイゼーション複合体を変性させ； ｅ）該検出プローブを増幅して複数のアンプリコンを作成させ； ｆ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｇ）該検出ポジションのヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  5. 【請求項５】 検出ポジションを含む第一標的ドメインおよび検出ポジショ
    ンに隣接する第二標的ドメインを含む標的配列中の検出ポジションにあるヌクレ
    オチドの同一性を決定する方法であって、 ａ）該第一標的ドメインに第一ライゲーションプローブをハイブリダイズさせる
    ；ここで、該第一ライゲーションプローブは、 ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）；および ｉｉ）第一標的特異的配列： を含む：および ｂ）該第二標的ドメインに第二ライゲーションプローブをハイブリダイズさせる
    ；ここで、該第二ライゲーションプローブは、 ｉ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）；および ｉｉ）インターロゲーションポジションに第一塩基を含む第二標的特異的配列： を含む、ここで該第一塩基が該検出ポジションの該ヌクレオチドに完全に相補的
    である場合、ライゲーション複合体が形成され、および該第一ライゲーションプ
    ローブと第二ライゲーションプローブの少なくとも一つはアダプター配列を含む
    ； ｃ）ハイブリダイズしていない第一プローブを除去し； ｄ）該第一および第二ライゲーションプローブをライゲートするリガーゼを得、
    ライゲートされたプローブを形成し； ｅ）該ライゲートされたプローブを増幅して、複数のアンプリコンを作成し； ｆ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｇ）該検出ポジションにあるヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  6. 【請求項６】 検出ポジションを含む第一標的ドメインおよび検出ポジショ
    ンに隣接する第二標的ドメインを含む標的配列中の検出ポジションにてヌクレオ
    チドの同一性を決定する方法であって、 ａ）該第一標的ドメインに第一ライゲーションプローブをハイブリダイズさせる
    ；ここで、該第一ライゲーションプローブは、 ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）；および ｉｉ）第一標的特異的配列： を含む：および ｂ）該第二標的ドメインに第二ライゲーションプローブをハイブリダイズさせる
    ；ここで、該第二ライゲーションプローブは、 ｉ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）；および ｉｉ）インターロゲーションポジションに第一塩基を含む第二標的特異的配列： を含む、ここで該第一塩基が該検出ポジションの該ヌクレオチドに完全に相補的
    である場合、ライゲーション複合体が形成され、および該第一ライゲーションプ
    ローブと第二ライゲーションプローブの少なくとも一つはアダプター配列を含む
    ； ｃ）ハイブリダイズしていない第一プローブを除去し； ｄ）該第一および第二ライゲーションプローブをライゲートするリガーゼを得、
    ライゲートされたプローブを形成し； ｅ）ｉ）上流プライミング配列；および、 ｉｉ）下流プライミング配列： を含むローリングサークル（ＲＣ）配列に、ライゲートされたプローブをハイブ
    リダイズさせ； ｆ）該上流および下流プライミング部位にライゲートするリガーゼを得て、環状
    にライゲートされたプローブを形成し； ｇ）環状にライゲートされたプローブを増幅して、複数のアンプリコンを作成さ
    せ； ｆ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｇ）該検出ポジションにあるヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  7. 【請求項７】 検出ポジションを含む第一標的ドメインおよび検出ポジショ
    ンに隣接する第二標的ドメインを含む標的配列中の検出ポジションにあるヌクレ
    オチドの同一性を決定する方法であって、 ａ）該標的配列にローリングサークル（ＲＣ）プローブをハイブリダイズさせる
    ；ここで、ＲＣプローブは、 ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）； ｉｉ）第一標的特異的配列： ｉｉｉ）インターロゲーションポジションに第一塩基を含む第二標的特異的配列
    ：および ｉｖ）アダプター配列； を含む、ここで、該第一塩基が該検出ポジションの該ヌクレオチドに完全に相補
    的である場合、ライゲーション複合体が形成され； ｃ）該第一および第二ライゲーションプローブをライゲートするリガーゼを得、
    ライゲートされたプローブを形成し； ｄ）該ライゲートされたプローブを増幅して、複数のアンプリコンを作成させ； ｆ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｇ）該検出ポジションのヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  8. 【請求項８】 ハイブリダイズしていないＲＣプローブを除去することをさ
    らに含む、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 除去が、 ａ）結合しているリガンドを該標的配列に酵素付加し； ｂ）該結合リガンドを含む該標的配列を含むハイブリダイゼーション複合体を、
    固体支持体に固定された結合パートナーに結合させ； ｃ）ハイブリダイズしていないプローブを洗浄除去し；および ｄ）該固体支持体から該プローブを溶出させる： ことを含む、請求項１、４、５、６または８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 二本鎖特異的部分を用いて除去を行う、請求項１、４、５
    、６または８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 二本鎖特異的部分が、支持体に結合されたインターカレー
    ターである、請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 支持体がビーズである、請求項９記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ａ）第一ユニバーサルプライマーをＵＵＰにハイブリダイ
    ズさせ； ｂ）該第一ユニバーサルプライマーが伸長されるようにポリメラーゼおよびｄＮ
    ＡＰを得； ｃ）第二ユニバーサルプライマーを該ＤＵＰにハイブリダイズさせ； ｄ）該第二ユニバーサルプライマーが伸長されるように、ポリメラーゼおよびｄ
    ＮＴＰを得；および ｅ）工程ａ）からｄ）を繰り返す； ことにより増幅を行う、請求項１、４、５、６または７記載の方法。
  14. 【請求項１４】 アレイが、 ａ）別個の部位を含むパターン化された表面を持つ基材：および ｂ）第一捕獲プローブを含む第一部分集団および第二捕獲プローブを含む第二部
    分集団を少なくとも含む微小球の集団： を含む、請求項１、４、５、６または７記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該別個の部位がウェルを含む、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 基材が光ファイバーバンドルを含む、請求項１４または１
    ５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ゲノム標的配列中の検出ポジションにあるヌクレオチドの
    同一性を決定する方法であって、 ａ）ゲノム標的配列のライブラリーを固体支持体に結合させ； ｂ）少なくとも一のプローブおよび酵素を添加して、伸長プライマーを形成し； ｃ）該標的配列から伸長されたプライマーを変性させ； ｄ）該伸長プライマーを、捕獲プローブを含むアレイにハイブリダイズさせ；お
    よび ｅ）該検出ポジションにある該ヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  18. 【請求項１８】 さらに、ハイブリダイズしていないプローブを除去するこ
    とを含む、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 さらに、標的配列が固定された支持体を提供することを含
    む、請求項１、４、５、６または７記載の方法。
  20. 【請求項２０】 支持体から標的配列を除去することなくハイブリダイズし
    ていない第一プローブを除去する、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 さらに、標的配列を支持体に結合することを含む、請求項
    １、４、５、６または７記載の方法。
  22. 【請求項２２】 標的配列を官能基結合部分で標識すること、帯電した支持
    体上に標的配列を吸着させること、標的配列を支持体に直接化学的に結合させる
    こと、および標的配列を支持体に光重合させることからなる群から選択される方
    法により、標的配列を支持体に結合させる、請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 支持体が、紙、プラスチックおよびチューブからなる群か
    ら選択される、請求項１、４、５、６または７記載の方法。
  24. 【請求項２４】 標的配列中の検出ポジションにあるヌクレオチドの同一性
    を決定するための方法であって、 ａ）標的配列が固定された支持体を得； ｂ）ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）； ｉｉ）アダプター配列； ｉｉｉ）読み出しポジションに第一塩基を含む第一標的特異的配列；および、 ｉｖ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）； を含む第一プローブを得； ｃ）第一塩基が検出ポジションにあるヌクレオチドに完全に相補的である場合に
    のみ第一ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、該第一プローブ
    を該標的配列と接触させ； ｄ）ハイブリッドを形成していない第一プローブを除去し； ｅ）ハイブリダイゼーション複合体を変性させ； ｆ）第一プローブを増幅して複数のアンプリコンを生成し； ｇ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｈ）該検出ポジションにあるヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  25. 【請求項２５】 標的配列中の検出ポジションにあるヌクレオチドの同一性
    を決定する方法であって、 ａ）標的配列が固定された支持体を得； ｂ）読み出しプローブが、各々、 ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）； ｉｉ）アダプター配列； ｉｉｉ）読み出しポジションにユニーク塩基を含む標的特異的配列；および ｉｖ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）； を含む複数の読み出しプローブを得； ｃ）該読み出し部位の該塩基が該検出ポジションのヌクレオチドに完全に相補的
    である場合にのみ第一ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、該
    検出プローブを該標的配列と接触させ； ｄ）ハイブリッドを形成していない第一プローブを除去し； ｅ）該第一ハイブリダイゼーション複合体を変性させ； ｆ）該検出プローブを増幅して複数のアンプリコンを生成し； ｇ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｈ）該検出ポジションのヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  26. 【請求項２６】 検出ポジションを含む第一標的ドメインおよび検出ポジシ
    ョンに隣接する第二標的ドメインを含む標的配列中の検出ポジションにあるヌク
    レオチドの同一性を決定する方法であって、 ａ）標的配列が固定された支持体を得； ｂ）第一ライゲーションプローブを該第一標的ドメインにハイブリダイズさせる
    ；ここで、該第一ライゲーションプローブは、 ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）；および ｉｉ）第一標的特異的配列； を含む、および ｃ）第二ライゲーションプローブを該第二標的ドメインにハイブリダイズさせる
    ；ここで、該第二ライゲーションプローブは、 ｉ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）；および ｉｉ）インターロゲーションポジションに第一塩基を含む第二標的特異的配列： を含み、ここで、該第一塩基が該検出ポジションの該ヌクレオチドに完全に相補
    的である場合、ライゲーション複合体が形成され、および、該第一よび第二ライ
    ゲーションプローブの少なくとも一つはアダプター配列を含む； ｄ）ハイブリッドを形成していない第一プローブを除去し； ｅ）該第一および第二ライゲーションプローブをライゲートするリガーゼを得、
    ライゲートされたプローブを形成し； ｆ）該ライゲートされたプローブを増幅して、複数のアンプリコンを生成し； ｆ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｈ）該検出ポジションのヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  27. 【請求項２７】 検出ポジションを含む第一標的ドメインおよび検出ポジシ
    ョンに隣接する第二標的ドメインを含む標的配列中の検出ポジションにてヌクレ
    オチドの同一性を決定する方法であって、 ａ）標的配列が固定された支持体を得； ｂ）第一ライゲーションプローブを該第一標的ドメインにハイブリダイズさせる
    ；ここで、該第一フライゲーションプローブは、 ｉ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）；および ｉｉ）第一標的特異的配列； を含む、および ｃ）第二ライゲーションプローブを該第二標的ドメインにハイブリダイズさせる
    ；ここで、該第二ライゲーションプローブは、 ｉ）下流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）；および ｉｉ）インターロゲーションポジションに第一塩基を含む第二標的特異的配列： を含み、ここで、該第一塩基が該検出ポジションの該ヌクレオチドに完全に相補
    的である場合にライゲーション複合体が形成され、および、該第一よび第二ライ
    ゲーションプローブの少なくとも一つはアダプター配列を含む； ｄ）ハイブリッドを形成していない第一プローブを除去し； ｅ）該第一および第二ライゲーションプローブをライゲートするリガーゼを得、
    ライゲートされたプローブを形成させ； ｆ）ｉ）上流プライミング配列；および ｉｉ）下流プライミング配列； を含むローリングサークル（ＲＣ）配列に、該ライゲートされたプローブをハイ
    ブリダイズさせ； ｇ）該上流および下流プライミング部位をライゲートするリガーゼを得、ライゲ
    ートされた環状プローブを形成させ； ｈ）ライゲートされた環状プローブを増幅して、複数のアンプリコンを生成し； ｉ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｊ）該検出ポジションのヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  28. 【請求項２８】 検出ポジションを含む第一標的ドメインおよび検出ポジシ
    ョンに隣接する第二標的ドメインを含む標的配列中の検出ポジションにあるヌク
    レオチドの同一性を決定する方法であって、 ａ）標的配列が固定された支持体を得； ｂ）ローリングサークル（ＲＣ）プローブを該標的配列にハイブリダイズさせる
    ；ここで、該ＲＣプローブは、 ｉ）上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）；および ｉｉ）第一標的特異的配列； ｉｉｉ）インターロゲーションポジションに第一塩基を含む第二標的特異的配列
    ：および ｉｖ）アダプター配列； を含む、ここで、該第一塩基が該検出ポジションのヌクレオチドに完全に相補的
    である場合にライゲーション複合体が形成される； ｃ）該第一および第二ライゲーションプローブをライゲートするリガーゼを得、
    ライゲートされたプローブを形成させ； ｄ）該ライゲートされたプローブを増幅して、複数のアンプリコンを生成し； ｅ）該アンプリコンを捕獲プローブのアレイと接触させ；および ｈ）該検出ポジションのヌクレオチドを決定する： ことを含む方法。
  29. 【請求項２９】 さらに、ハイブリダイズしていないＲＣプローブを除去す
    ることを含む、請求項２８記載の方法。
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