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JP2003520200A - ２’−ｏ−アセトアミド修飾モノマーおよびオリゴマー - Google Patents

２’−ｏ−アセトアミド修飾モノマーおよびオリゴマー

Info

Publication number
JP2003520200A
JP2003520200A JP2001518729A JP2001518729A JP2003520200A JP 2003520200 A JP2003520200 A JP 2003520200A JP 2001518729 A JP2001518729 A JP 2001518729A JP 2001518729 A JP2001518729 A JP 2001518729A JP 2003520200 A JP2003520200 A JP 2003520200A
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JP
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lys
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Pending
Application number
JP2001518729A
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English (en)
Inventor
マノハーラン，ムーティア
カワサキ，アンドリュー・エム
クック，フィリップ・ダン
フレイザー，アリスター・エス
プラカーシュ，サーザ・ピー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
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Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
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Pending legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom

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Abstract

(57)【要約】 ヌクレオシドモノマーと、それから製造されるオリゴマー化合物とを提供する。オリゴマー化合物の新規な脱保護方法も提供する。少なくとも１つの２’−アセトアミド修飾ヌクレオシドモノマーを有するオリゴマー化合物は増大したヌクレアーゼ耐性と、核酸の相補的鎖への増大した結合アフィニティとを有すると期待される。このようなオリゴマー化合物は、診断及びその他の研究目的のために、生物におけるタンパク質の発現をモジュレートするために、並びにオリゴヌクレオチド治療法に反応する他の状態の診断、検出及び治療のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、２’−Ｏ−アセトアミド修飾ヌクレオシドおよびこれらヌクレオシ
ドの少なくとも一つを有して製造されたオリゴマー化合物に関する。更に含まれ
るのは、本発明の少なくとも一つのヌクレオシドを有する、固体支持体に結合し
たオリゴマーの脱保護の方法である。本発明のオリゴマー化合物は、増加したヌ
クレアーゼ耐性および優れたハイブリダイゼーション特性を有すると考えられる
。オリゴマー化合物は、研究および治療目的に有用である。
【０００２】 発明の背景 大部分の疾患状態を含めた哺乳動物の身体的状態の大部分が、タンパク質に影
響されるということは周知である。古典的治療方式は、概して、それら疾患を引
き起こすまたは疾患を増強する機能を軽減する努力において、このようなタンパ
ク質との相互作用に焦点を合わせている。しかしながら、最近、このようなタン
パク質の実際の生産を、それらの合成を支配する細胞内ＲＮＡのような分子との
相互作用によって軽減する試みが成されている。タンパク質の生産を妨げること
により、最大限の治療効果および最小限の副作用を実現することができる。この
ような治療的アプローチの一般的な目的は、望ましくないタンパク質形成をもた
らす遺伝子発現を妨げるまたはそれ以外の場合には軽減することである。
【０００３】 特定の遺伝子発現を阻害する一つの方法は、オリゴヌクレオチドの使用である
。オリゴヌクレオチドは、現在、極めて将来性のある治療薬として認められてい
る。オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子にハイブリッド形成
することが知られている。ハイブリダイゼーションは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ
分子の核酸塩基へのオリゴヌクレオチドの核酸塩基の配列特異的塩基対水素結合
である。このような核酸塩基対は、互いに相補的であるといわれる。標的ＲＮＡ
配列へのオリゴヌクレオチドの配列特異的結合の使用によって遺伝子発現を阻害
する概念は、アンチセンス阻害としても知られ、生細胞を含めた様々な系におい
て示されている。Wagner et al., Science (1993) 260:1510-1513; Milligan et
al., J.Med.Chem., (1993) 36:1923-37; Uhlmann et al., Chem.Reviews, (199
0) 90:543-584; Stein et al., Cancer Res., (1988) 48:2659-2668 を参照され
たい。
【０００４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる核酸機能の破壊を提供すること（Cohe
n in Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, (1989) C
RC Press,Inc., Boca Raton, FL）は、二つの種類によると考えられる。第一の
ハイブリダイゼーション阻止は、オリゴヌクレオチド阻害剤が標的核酸に結合し
、それによって、しばしばリボソームである必須タンパク質の核酸への結合を単
純な立体障害によって妨げる終結を示す。メチルホスホン酸オリゴヌクレオチド
（Miller and Ts'O, Anti-Cancer Drug Design, 1987,2:117-128）およびα−ア
ノマーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション阻止によって核酸機能を
破壊すると考えられる二つの最も広範囲に研究されたアンチセンス薬である。
【０００５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドの終結の第二の種類は、標的とされるＲＮＡ
の細胞内ＲＮアーゼＨによる酵素的切断を伴う。２’−デオキシリボフラノシル
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、標的のＲＮＡとハイブ
リッド形成し、そしてこの二重らせんは、ＲＮアーゼＨ酵素を活性化して、ＲＮ
Ａ鎖を切断し、それによって、ＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドは、この種類のアンチセンス終結によって機能するアン
チセンス薬の最も顕著な例である。
【０００６】 オリゴヌクレオチドは、二重らせん核酸に結合して、フーグスティーン型塩基
対によって配列特異的な方式で三重らせん複合体を形成することもできる（Beal
et al., Science, (1991) 251:1360-1363; Young et al., Proc.Natl.Acad.Sci
. (1991) 88:10023-10026）。アンチセンスおよび三重らせん両方の治療計画は
、疾患状態の確定または維持に関与するまたはその原因になる核酸配列に対して
向けられている。このような標的核酸配列は、細菌、酵母、真菌、原生動物、寄
生生物、ウイルスを含めた病原性生物のゲノム中で見出されうるし、または天然
に内因性でありうる。疾患状態の確定、維持または脱離に重要な遺伝子にハイブ
リッド形成することおよびその発現を変更させることにより、該当する状態を治
癒させ、予防しまたは改善することができる。
【０００７】 あるオリゴヌクレオチドの相補的核酸へのハイブリダイゼーションの程度を決
定する場合、相補的核酸に結合するオリゴヌクレオチドの相対能力は、具体的な
ハイブリダイゼーション複合体の融解温度を決定することによって比較すること
ができる。二重らせんの特徴的な物理的性質である融解温度（Ｔm）は、５０％
のらせん（ハイブリッド形成）型対コイル（非ハイブリッド形成）型が存在する
温度を示す。Ｔmは、ＵＶスペクトルを用いることによって測定されて、ハイブ
リダイゼーション複合体の形成および分解（融解）を決定する。塩基スタッキン
グは、ハイブリダイゼーション中に起こり、ＵＶ吸収の減少を伴う。したがって
、ＵＶ吸収の減少は、より高いＴmを示す。Ｔmが高いほど、鎖間結合の強度は大
きい。
【０００８】 オリゴヌクレオチドは、細胞内または細胞外ポリペプチド、タンパク質または
酵素などの非核酸生体分子にそれらが結合する場合、治療的価値もありうる。こ
のようなオリゴヌクレオチドは、しばしば、‘アプタマー’と称され、典型的に
は、タンパク質標的に結合し、その機能を妨げる（Griffin et al., Blood, (19
93),81:3271-3276; Bock et al., Nature, (1992) 355:564-566）。
【０００９】 オリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体は、診断目的、治療用途におよび研
究試薬として開発され且つ用いられている。治療薬としての使用には、オリゴヌ
クレオチドは、細胞膜を越えて輸送されるかまたは細胞によって取り込まれ、標
的ＤＮＡまたはＲＮＡに適当にハイブリッド形成する必要がある。これら臨界的
機能は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期安定性に依る。治
療目的の標的ＤＮＡまたはＲＮＡとの可能なハイブリダイゼーションに影響する
非修飾オリゴヌクレオチドの重大な欠点は、ヌクレアーゼと称される種々の細胞
内および細胞外の遍在性核酸分解酵素による投与されたオリゴヌクレオチドの酵
素分解である。オリゴヌクレオチドが治療薬または診断薬として有用であるため
には、それらオリゴヌクレオチドは、相補的標的核酸への増加した結合親和性を
示し、好ましくは、ヌクレアーゼにかなり安定であり且つ分解に耐えるべきであ
る。研究試薬のような非細胞使用には、オリゴヌクレオチドは、必ずしもヌクレ
アーゼ安定性を有する必要はない。
【００１０】 オリゴヌクレオチドの標的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合親和性を増加させるよ
うにおよびヌクレアーゼ分解への耐性を増加させるように、多数の化学修飾がオ
リゴヌクレオチド中に導入されている。
【００１１】 修飾は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼへの耐性を増加させるように、そ
れらのリボースリン酸主鎖に行われている。これら修飾には、メチルホスホネー
ト、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートのような結合の使用、およ
び２’−Ｏ−アルキルリボースのような修飾糖残基の使用が含まれる。他のオリ
ゴヌクレオチド修飾には、取込みおよび細胞内分布を調節するように行われるも
のが含まれる。ヌクレオチド間結合の性状を劇的に変化させる多数の修飾は、参
考文献にも報告されている。これらには、非リン結合、ペプチド核酸（ＰＮＡ）
および２’−５’結合が含まれる。オリゴヌクレオチドへのもう一つの修飾は、
通常は、診断および研究用途のために、非同位体標識、例えば、フルオレセイン
、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリ性ホスファターゼまたは他のレポーター
分子を用いて標識することである。
【００１２】 種々の修飾リン含有結合は、オリゴヌクレオチド中の天然の容易に切断される
ホスホジエステル結合の代用として研究されている。概して、ホスホロチオエー
ト、ホスホロアミデート、ホスホネートおよびホスホロジチオエートのようなそ
れらの大部分はいずれも、相補的標的への減少した結合および減少したハイブリ
ッド安定性を有するオリゴヌクレオチドを生じる。治療薬を有効にさせるために
は、したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドのこの結合およびハイブリッ
ド安定性を改善する必要がある。
【００１３】 行われ且つ研究された大多数の修飾で、臨床的評価に値する発見および開発に
よって充分に先まで発展しているものはほとんどない。この根拠となる理由には
、合成の難しさ、標的核酸への不充分な結合、標的核酸への特異性の欠如、ヌク
レアーゼへの不充分な in vitro および in vivo 安定性、および不充分な薬物
動態が含まれる。いくつかのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび誘導
体は、現在、種々の疾患状態の治療のためにヒト臨床試験においてアンチセンス
薬として用いられている。アンチセンス薬フォミビルセン（Fomivirsen）を用い
てヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜炎を治療することへの認可は、最
近、米国および欧州双方の規制機関によって付与された。
【００１４】 化学修飾された核酸の構造および安定性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド
の設計に極めて重要である。ここ１０年間にわたって、ヌクレアーゼ耐性を増加
させるために、またはアンチセンス鎖のその標的ｍＲＮＡへの親和性を増加させ
るために、いろいろな合成的修飾が考えられてきている（Crooke et al., Med.R
es.Rev., 1996,16,319-344; De Mesmaeker et al., Acc.Chem.Res., 1995,28,36
6-374）。多くの情報は、二重らせん形成を改善する修飾の種類について集めら
れているが、認められる改善された親和性に関する構造的基準についてはほとん
ど知られていない。
【００１５】 ＲＮＡは、“Ａ形”と称される幾何学的形で存在するが、ＤＮＡは、“Ｂ形”
の幾何学的形で存在する。概して、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重らせんは、ＤＮＡ：ＤＮ
Ａ二重らせんより安定であるし、またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する（Sa
nger et al., Principles of Nucleic Acids Structure, 1984, Springer-Verla
g; New York, NY; Lesnik et al., Biochemistry, 1995,34,10807-10815; Conte
et al, Nucleic Acids Res., 1997,25,2627-2634）。ＲＮＡの増加した安定性
は、いくつかの構造的特徴、特に、Ａ形幾何学的形によって生じる塩基スタッキ
ング相互作用に起因している（Searle et al., Nucleic Acids Res., 1993,21,2
051-2056）。ＲＮＡ中の２’ヒドロキシルの存在は、Ｃ３’エンドパッカー、す
なわち、ノーザンパッカーとも称される、二重らせんを容易にＡ形幾何学的形に
させるものに対して糖を偏らせる。もう一方において、デオキシ核酸は、Ｃ２’
エンドパッカー、すなわち、サザンパッカーとしても知られる、あまり安定でな
いＢ形幾何学的形を与えると考えられるものを選択する（Sanger,W. (1984) Pri
nciples of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, New York, NY）。更に
、ＲＮＡの２’ヒドロキシル基は、ＲＮＡ二重らせんを安定化させるのを助ける
水に媒介された水素結合の網状構造を形成することができる（Egli et al., Bio
chemistry, 1996,35,8489-8494）。
【００１６】 しかしながら、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二重らせんは、通常は、純粋なＲ
ＮＡ：ＲＮＡ二重らせんよりも安定ではなく、それらの配列に依って、ＤＮＡ：
ＤＮＡ二重らせんより安定であるかまたは安定でないことがありうる（Searle e
t al., Nucleic Acids Res., 1993,21,2051-2056）。ハイブリッド二重らせんの
構造は、Ａ形とＢ形との間の中間の幾何学的形であり、これは、不充分なスタッ
キング相互作用を生じることがありうる（Lane et al., Eur.J.Biochem., 1993,
215,297-306; Fedoroff et al., J.Mol.Biol., 1993,233,509-523; Gonzalez et
al., Biochemistry, 1995,34,4969-4982; Horton et al., J.Mol.Biol., 1996,
264,521-533）。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの安定性は、修飾ＤＮＡ鎖のｍＲ
ＮＡ鎖への結合をその機構が必要とするように、アンチセンス療法にとって中心
的である。ｍＲＮＡを効果的に阻害するためには、アンチセンスＤＮＡは、ｍＲ
ＮＡとの極めて高い結合親和性を有する必要がある。それ以外の場合、ＤＮＡと
標的ｍＲＮＡ鎖との間における所望の相互作用はまれにしか起こらないので、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を減少させるであろう。
【００１７】 増加したヌクレアーゼ耐性および極めて高い結合親和性をヌクレオチドに与え
る一つの合成的２’修飾は、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ，２’−ＯＣＨ2
ＣＨ2ＯＣＨ3）側鎖である（Baker et al., J.Biol.Chem., 1997,272,11944-120
00; Freier et al., Nucleic Acids Res., 1997,25,4429-4443）。ＭＯＥ置換の
直接の利点の一つは、結合親和性の改善であるが、これは、Ｏ−メチル、Ｏ−プ
ロピルおよびＯ−アミノプロピルのような多数の同様の２’修飾より優れている
（Freier and Altmann, Nucleic Acids Research, (1997) 25:4429-4443）。２
’−Ｏ−メトキシエチル置換を有するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チド類似体は、in vivo 使用について将来を約束されている遺伝子発現のアンチ
センス阻害剤であると示されてもいる（Martin, Helv.Chim.Acta, 1995,78,486-
504; Altmann et al., Chimia, 1996,50,168-176; Altmann et al., Biochem.So
c.Trans., 1996,24,630-637; および Altmann et al., Nucleosides Nucleotide
s, 1997,16,917-926）。ＤＮＡに相対して、それらは、改善されたＲＮＡ親和性
およびより高いヌクレアーゼ耐性を示す。２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレ
オシドウイングおよび中心のＤＮＡ−ホスホロチオエートウインドウを有するキ
メラオリゴヌクレオチドは、動物モデルにおいて低用量で腫瘍の成長を有効に減
少させると示されてもいる。ＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドは、いくつかの疾患
状態においてアンチセンス薬として顕著な将来性を示している。一つのこのよう
なＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドは、現在、ＣＭＶ網膜炎の治療に利用可能であ
る。
【００１８】 あまり注目されていない修飾は、モノマーおよびオリゴマー中の２’−Ｏ−ア
セトアミド修飾である。主な中心部ではないが、数種類の化合物が、参考文献お
よび特許公報で報告されている。包含されるのは、２’−Ｏ−アセトアミド基の
窒素原子に結合した２−アミノアントラキノン基、２’−６−Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノヘキシルアセトアミド基、トリフルオロアセトアミドヘキシル基およびモ
ノアルキル基である（Keller et al., Nucleic Acids Res., 1993,21,4499-4505
; Keller et al., Helv.Chim.Acta., 1993,76,884-892）。ヌクレオチドおよび
オリゴヌクレオチド中のジアルキルアミノアルキル基、アミノアルキル基、およ
び薬物置換および非置換の２’−Ｏ−アセトアミド基も、米国特許第５，４６６
，７８６号、同第Ｂ１ ５，４６６，７８６号および同第５，７９２，８４７号
に報告されている。前述の公報は、それらの主な中心部が他の２’修飾にあるの
で、数種類の具体的な２’修飾モノマーおよびオリゴマーだけを開示している。
【００１９】 ２’−Ｏ−メトキシエチル修飾の使用を含めたオリゴヌクレオチドへの既知の
修飾は、様々な用途へのオリゴヌクレオチドの開発に寄与しているが、当該技術
分野において、増加したハイブリッド結合親和性および／または増加したヌクレ
アーゼ耐性をオリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体に与える更に別の修飾が
なお必要とされている。
【００２０】 発明の要旨 本発明の一つの態様により、式
【００２１】
【化４】
【００２２】 （式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり； Ｔ1およびＴ2は、それぞれ独立して、ＯＨ、保護されたヒドロキシルであり；
または Ｔ1およびＴ2の一方は、ＯＨまたは保護されたヒドロキシルであり、Ｔ1およ
びＴ2のもう一方は、固体支持体または活性リン基であり； Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｃ1−Ｃ10アルキルであり；または Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｈ、−（ＣＨ2）m−Ｓ−Ｒ4、ポリアミ
ン、ポリペプチド、葉酸部分またはコレステロール部分であり、但し、Ｅ1およ
びＥ2の一つだけはＨであるという条件付きであり；そして Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、Ｃ2−Ｃ10アルキニル
、Ｃ6−Ｃ14アリールまたはチオ保護基である） を有する化合物を提供する。
【００２３】 一つの態様において、Ｅ1およびＥ2は両方ともＣ1−Ｃ10アルキルである。も
う一つの態様において、Ｅ1はＨであり、Ｅ2は−（ＣＨ2）m−Ｓ−Ｒ4である。
好ましくは、Ｒ4はＣ1−Ｃ10アルキルである。より好ましくは、Ｒ4はメチルで
ある。
【００２４】 もう一つの態様において、Ｅ2はポリアミンである。好ましいポリアミンは、
スペルミンまたはスペルミジンである。更に別の態様において、Ｅ2はポリペプ
チドである。好ましいポリペプチドは、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｔｒ
ｐ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓである。もう一つの態様にお
いて、Ｅ2は葉酸部分である。更に別の態様において、Ｅ2はコレステロール部分
である。
【００２５】 更に別の態様において、複素環式塩基部分は、プリンまたはピリミジンである
。好ましい複素環式塩基部分には、アデニン、シトシン、５−メチルシトシン、
チミン、ウラシル、グアニンおよび２−アミノアデニンが含まれる。
【００２６】 一つの好ましい態様において、Ｔ1は保護されたヒドロキシルであり、Ｔ2は活
性リン基である。 本発明の一つの態様により、式
【００２７】
【化５】
【００２８】 （式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり； Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｃ1−Ｃ10アルキルであり；または Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｈ、−（ＣＨ2）m−Ｓ−Ｒ4、ポリアミ
ン、ポリペプチド、結合基を有していてよい葉酸部分、または結合基を有してい
てよいコレステロール部分であり、但し、Ｅ1およびＥ2の一つだけはＨであると
いう条件付きであり；そして Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、Ｃ2−Ｃ10アルキニル
、Ｃ6−Ｃ14アリールまたはチオ保護基である） を有する少なくとも１個の部分を有するオリゴマー化合物を提供する。
【００２９】 本発明の一つの態様において、Ｅ1およびＥ2は両方ともＣ1−Ｃ10アルキルで
ある。もう一つの態様において、Ｅ1はＨであり、Ｅ2は−（ＣＨ2）m−Ｓ−Ｒ4
である。好ましくは、Ｒ4はＣ1−Ｃ10アルキルである。より好ましくは、Ｒ4は
メチルである。
【００３０】 もう一つの態様において、Ｅ2はポリアミンである。好ましいポリアミンは、
スペルミンまたはスペルミジンである。更に別の態様において、Ｅ2はポリペプ
チドである。好ましいポリペプチドは、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｔｒ
ｐ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓである。もう一つの態様にお
いて、Ｅ2は、場合により結合基を有していてよい葉酸部分である。更に別の態
様において、Ｅ2は、場合により結合基を有していてよいコレステロール部分で
ある。
【００３１】 一つの態様において、複素環式塩基部分は、プリンまたはピリミジンである。
複素環式塩基部分は、アデニン、シトシン、５−メチルシトシン、チミン、ウラ
シル、グアニンまたは２−アミノアデニンであるのが好適である。
【００３２】 一つの好ましい態様において、Ｔ1は保護されたヒドロキシルであり、Ｔ2は活
性リン基である。 一つの態様において、オリゴマー化合物は、約５〜約５０個のヌクレオシドを
含む。好ましい態様において、オリゴマー化合物は、約８〜約３０個のヌクレオ
シドを含み、より好ましい態様において、オリゴマー化合物は、約１５〜約２５
個のヌクレオシドを含む。
【００３３】 本発明は、更に、脱保護されたオリゴマー化合物を製造する方法であって、 （ａ）式
【００３４】
【化６】
【００３５】 ［式中、Ｂｘは、保護されていてよい複素環式塩基部分であり； Ｅ3およびＥ4は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換または非置換のＣ 1 −Ｃ10アルキル、置換または非置換のＣ2−Ｃ10アルケニル、置換または非置換
のＣ2−Ｃ10アルキニルであり、ここにおいて、この置換は、ＯＲ3、ＳＲ3、Ｎ
Ｈ3 +、Ｎ（Ｒ3）（Ｒ4）、グアニジノまたはアシルであり、但し、このアシルは
、酸アミドまたはエステルであり； Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アル
ケニル、Ｃ2−Ｃ10アルキニル、Ｃ6−Ｃ14アリール、窒素保護基、チオ保護基で
あり、またはＲ3およびＲ4は一緒に、窒素保護基であり；または Ｒ3およびＲ4は、ＮおよびＯより選択される追加のヘテロ原子を含んでいてよ
い環構造中で結合している］ を有する少なくとも１個の部分を有する、固体支持体に結合したオリゴマー化合
物を選択し； （ｂ）その固体支持体に結合したオリゴマー化合物と水酸化アンモニウム溶液
とを周囲温度で接触させて、塩基性混合物を生じ；そして （ｃ）メチルアミンの溶液をその塩基性混合物に周囲温度で加えて、脱保護さ
れたオリゴマー化合物を提供する工程を含む方法を提供する。
【００３６】 一つの態様において、固体支持体に結合したオリゴマー化合物を、水酸化アン
モニウムと約１時間〜約３時間接触させるが、約２時間が好適である。 もう一つの態様において、その溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は、約２０
％〜飽和状態であり、飽和溶液が好適である。
【００３７】 更に別の態様において、周囲温度は約１５℃〜約３０℃であり、２０℃〜約２
５℃が好適である。 一つの態様において、メチルアミンの溶液は、水中に約３０％〜約５０％メチ
ルアミンであり、４０％が好適である。
【００３８】 もう一つの態様において、工程（ｃ）は、約１０時間〜約３０時間にわたって
行われ、２６時間が好適である。 好ましい態様において、固体支持体はＣＰＧである。
【００３９】 好ましい態様の詳細な説明 本発明は、２’−Ｏ−アセトアミド修飾ヌクレオシドモノマー、それから製造
されるオリゴマー化合物、およびそのオリゴマー化合物の固体支持体からの新規
な脱保護方法を提供する。本発明の２’−Ｏ−アセトアミド修飾オリゴマー化合
物は、改善されたハイブリダイゼーション特性およびヌクレアーゼ耐性を有する
と考えられる。
【００４０】 本発明は、修飾ヌクレオシドモノマーおよびそれから製造されるオリゴマーを
提供する。それらモノマーは、それぞれ、好ましくは糖の２’位であるが、３’
位または５’位であってよい、または複素環式塩基位置であってよい少なくとも
一つの修飾を有するヌクレオシドを含む。本発明のヌクレオシドモノマーかまた
はオリゴマー中では、１ヶ所より多い位置が修飾されうる。本発明のオリゴマー
化合物は、ＲＮＡまたはＤＮＡの識別または定量に、またはＲＮＡまたはＤＮＡ
分子の活性を調節するのに有用である。修飾ヌクレオシドモノマーを中に有する
オリゴマー化合物は、好ましくは、一本鎖または二本鎖標的ＤＮＡまたはＲＮＡ
分子の予め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成しうるよう
に製造される。最終的に合成が調節されるまたは完全に阻害されるタンパク質の
生産に関与するＤＮＡまたはＲＮＡの配列を選択すること、または診断試験にお
いてその存在、不存在または具体的な量が確認されるＲＮＡまたはＤＮＡの配列
を選択することは、概して望ましい。
【００４１】 本発明の一つの側面において、本発明のヌクレオシドモノマーは、式Ｉ
【００４２】
【化７】
【００４３】 （式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり； Ｔ1およびＴ2は、それぞれ独立して、ＯＨ、保護されたヒドロキシルであり；
または Ｔ1およびＴ2の一方は、ＯＨまたは保護されたヒドロキシルであり、Ｔ1およ
びＴ2のもう一方は、固体支持体または活性リン基であり； Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｃ1−Ｃ10アルキルであり；または Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｈ、−（ＣＨ2）m−Ｓ−Ｒ4、ポリアミ
ン、ポリペプチド、結合基を有していてよい葉酸部分、または結合基を有してい
てよいコレステロール部分であり、但し、Ｅ1およびＥ2の一つだけはＨであると
いう条件付きであり；そして Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、Ｃ2−Ｃ10アルキニル
、Ｃ6−Ｃ14アリールまたはチオ保護基である） を有する少なくとも１個の２’−Ｏ−アセトアミド修飾を有して製造される。
【００４４】 本発明のオリゴマー化合物は、モジュレーションに選択される標的ＲＮＡまた
はＤＮＡのヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成しうるように適応され
るのが好適である。本発明の一つまたはそれ以上の態様の実施に特に適したオリ
ゴマー化合物は、２’−糖修飾ヌクレオシドを含むが、ここにおいて、修飾はア
セトアミド部分である。例えば、オリゴマー化合物は、上の式Ｉに示されるよう
に修飾された１個またはそれ以上のヌクレオシド単位の包含が含まれるがこれに
制限されるわけではない置換を含有するように修飾される。
【００４５】 本発明は、更に、上の式Ｉの少なくとも一つの修飾ヌクレオシドを包含するオ
リゴマー化合物を固体支持体から脱保護する新規な方法を開示する。この方法は
、固体支持体からの脱保護／切断の際に、オリゴマー化合物中に包含された２’
−Ｏ−アセトアミド修飾ヌクレオシドの完全さを維持する利点を有する。この方
法は有効であるが、高温をより長時間用いる常套手段によって用いられる標準法
より穏やかである。この方法は、固体支持体からのオリゴマー化合物の切断と同
時に、複素環式塩基保護基も除去する。この方法は、２’−Ｏ−アセトアミド修
飾されているものの他に、オリゴマー化合物を脱保護するのに応用できる。しか
しながら、本発明の方法は、余分の工程を有し、そのために、標準的な脱保護工
程の下で不安定であるオリゴマー化合物を脱保護するのに特に有用であると考え
られる。
【００４６】 保護されていてよい固体支持体に結合したオリゴマー化合物は、水酸化アンモ
ニウムの溶液を用いて周囲温度（約１５℃〜約３０℃）で約２時間処理される。
得られた溶液に、メチルアミンの溶液（商業的に入手可能な４０％水性）を加え
る。約２５％〜約５０％の他のメチルアミン濃度は、本発明にしたがう。これら
濃度のメチルアミン溶液は調製される必要があるが、これは、商業的に入手可能
な試薬については必要がない。メチルアミン溶液は、それが混合物の全容量の約
１０％を構成するまで加える。この混合物を周囲温度で約１０時間〜約３０時間
放置する。約２６時間で、大部分の脱保護反応が完了した。
【００４７】 本発明のヌクレオシドモノマーには、活性リン酸基および活性亜リン酸基のよ
うな適当な活性リン基が含まれうる。本明細書中で用いられる活性リン酸基およ
び活性亜リン酸基という用語は、別のモノマーまたはオリゴマー化合物のヒドロ
キシル基と反応してリン含有ヌクレオチド間結合を形成する活性モノマーまたは
オリゴマーを意味する。このような活性リン基は、ＰIIIまたはＰV原子価状態の
活性リン原子を含有する。このような活性リン原子は、当該技術分野において知
られ、ホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネートおよびリン酸トリエステルが含ま
れるが、これに制限されるわけではない。好ましい合成固相合成法は、ホスホロ
アミダイトを活性リン酸として用いる。ホスホロアミダイトは、ＰIII化学を用
いる。引き続き、中間体亜リン酸化合物を、既知の方法を用いて酸化してＰV状
態にして、好ましい態様においては、ホスホジエステルまたはホスホロチオエー
トヌクレオチド間結合を生じる。更に別の活性リン酸または亜リン酸は、Tetrah
edron Report Number 309（Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 1992,48,2223-23
11）に開示されている。
【００４８】 本発明のオリゴマー化合物は、好都合には、既知の方法の固相合成法を用いて
合成され、好ましくは、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの予め選択されたヌクレオチド
配列に相補的であるまたはそれと特異的にハイブリッド形成しうるように設計さ
れる。オリゴマー化合物の合成のための標準的な液相法および固相法は、当業者
に周知である。これら方法は、これら複雑な化合物を合成するのに必要な時間お
よび費用を減少させるように絶えず改良されている。代表的な液相法は、１９９
３年５月１１日発行の、本発明と同一譲渡人の米国特許第５，２１０，２６４号
に記載されている。標準的なホスホロアミダイト化学を用いてオリゴマー化合物
の合成に用いられる代表的な固相法は、Protocols For Oligonucleotides And A
nalogs, S.Agrawal, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1993 に記載されている
。
【００４９】 本発明のオリゴマー化合物には、荷電結合によって連結されたヌクレオシドを
含むものも含まれ、その配列は、少なくとも二つの領域に分けられる。若干の好
ましい態様において、その第一領域には、第一の種類の結合によって結合した２
’−Ｏ−アセトアミド置換ヌクレオシドが含まれ、そして第二領域には、第二の
種類の結合によって結合したヌクレオシドが含まれる。他の好ましい態様におい
て、本発明のオリゴマーは、第一領域中で用いられるようなヌクレオシドから成
る第三領域が更に含まれ、第二領域が第一領域と第三領域との間に位置している
。このようなオリゴマー化合物は、“キメラ”、“キメラの”または“ギャップ
付き”オリゴマーとして知られる（例えば、本明細書中にその内容が援用される
１９９７年４月２２日発行の米国特許第５，６２３，０６５号を参照されたい）
。
【００５０】 ギャップマー技術（gapmer technology）は、オリゴマー化合物の末端（“ウ
イング”）に修飾を包含するために開発されており、ＲＮアーゼＨ活性化のため
に中央にホスホロチオエートギャップを残している（Cook,P.D., Anti-Cancer D
rug Des., 1991,6,585-607; Monia et al., J.Biol.Chem., 1993,268,14514-145
22）。最近の報告では、ＨＵＶＥＣ細胞中のヒトＩＣＡＭ−１転写物の５’−キ
ャップ領域にアンチセンスであった一連の均一に２’−Ｏ修飾された２０マーＲ
ＮアーゼＨ非依存オリゴヌクレオチドの活性を、親２’−デオキシホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドと比較した（Baker et al., J.Bio.Chem., 1997,272,
11994-12000）。２’−ＭＯＥ／Ｐ＝Ｏオリゴマーは、２．１ｎＭのＩＣ50の最
大活性を示したが（Ｔm＝８７．１℃）、親Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチド類似体は
、６．５ｎＭのＩＣ50を有した（Ｔm＝７９．２℃）。活性と結合親和性との相
関は、２’−Ｆ／Ｐ＝Ｓ（Ｔm＝８７．９℃）が２’−ＭＯＥ／Ｐ＝Ｓ（Ｔm＝７
９．２℃）より４倍だけ活性が小さいので、必ずしも認められない。ＲＮアーゼ
Ｈコンピテント２’−デオキシＰ＝Ｓ親オリゴヌクレオチドは、ＩＣ50＝４１ｎ
Ｍを示した。
【００５１】 本発明の場合、“オリゴマー”および“オリゴマー化合物”という用語は、特
定の配列中で互いに結合した複数の天然に存在するまたは天然に存在しないヌク
レオシドを意味する。“オリゴマー”および“オリゴマー化合物”という用語に
は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシドおよ
びキメラのオリゴマー化合物が含まれ、この場合、オリゴマー化合物を領域に分
割する２種類以上のヌクレオシド間結合が存在する。“オリゴヌクレオチド”と
いう用語は、当該技術分野において充分に定義された意味を有するが、“オリゴ
マー化合物”または“オリゴマー”という用語は、当該技術分野において知られ
ている全ての修飾様式を有するオリゴマーを含めた、より広い意味である。若干
の好ましい態様において、本発明のオリゴマー化合物はそれぞれ、修飾が本発明
のアセトアミド化合物である少なくとも一つの修飾ヌクレオシドを有する。
【００５２】 本発明にしたがう複素環式塩基部分（当該技術分野においてしばしば、簡単に
“塩基”と称される）には、天然に存在するおよび天然に存在しない両方の核酸
塩基が含まれる。この複素環式塩基部分は、更に保護されていてよく、この場合
、塩基の一つまたはそれ以上の官能基は保護基を有する。本明細書中で用いられ
る“非修飾の”または“天然の”核酸塩基には、プリン塩基であるアデニンおよ
びグアニン、およびピリミジン塩基であるチミン、シトシンおよびウラシルが含
まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロ
キシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデ
ニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグ
アニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオ
チミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピ
ニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−
ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８
−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニン
およびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび
他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルア
デニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび
７−デアザアデニン、および３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのよ
うな他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。追加の核酸塩基には、米国特許
第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Concise Encyclopedia Of Polymer
Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz,J.I.,ed. John Wiley &
Sons, 1990 に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, Intern
ational Edition, 1991,30,613 に開示されたもの、および Sanghvi,Y.S., Chap
ter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke,S.T.
and Lebleu,B.,ed., CRC Press, 1993 に開示されたものが含まれる。
【００５３】 特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに
特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウ
ラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めた、５−置換ピリミジン、６−アザ
ピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メ
チルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させるこ
とが示されており（同上，276-278頁）、現在のところ、なお一層具体的には、
２’−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、好ましい塩基置換である。
【００５４】 修飾核酸塩基の製造を示す代表的な米国特許には、いくつかは共通に所有され
、本明細書中にそれぞれ援用される、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４
，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；
同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７
２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４
，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，
５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号；同
第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，
９４１号、および本明細書中にも援用される１９９６年１２月１０日出願の共通
に所有される米国特許出願第０８／７６２，４８８号が含まれるが、これに制限
されるわけではない。
【００５５】 好ましい糖部分は、デオキシリボースまたはリボースである。しかしながら、
当該技術分野において知られている他の糖置換基も本発明にしたがう。 本明細書中で用いられる“糖置換基”という用語は、本発明の化合物またはオ
リゴマーを構成するヌクレオシドの糖部分に結合している基を意味する。糖置換
基は、糖の２’位、３’位および５’位に共有結合している。若干の好ましい態
様において、糖置換基は、糖の２’、３’および／または５’炭素原子に直接結
合した酸素原子を有する。好ましくは、糖置換基は２’位に結合しているが、糖
置換基は、また、３’位および５’位に位置していてもよい。
【００５６】 本発明にしたがう糖置換基には、フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミ
ノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルア
ミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾール、および式（Ｏ−アルキル）m（式中
、ｍは１〜約１０である）を有するポリエーテルが含まれる。これらポリエーテ
ルの中で好ましいのは、直鎖状または環状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
、およびクラウンエーテルおよび、本明細書中にそれぞれそのまま援用される、
Ouchi et al.（Drug Design and Discovery 1992,9,93）、Ravasio et al.（J.O
rg.Chem. 1991,56,4329）および Delgardo et al.（Critical Reviews in Thera
peutic Drug Carrier Systems 1992,9,249）によって開示されているものなどの
（ＰＥＧ）含有基である。更に別の糖修飾は、Cook,P.D., Anti-Cancer Drug De
sign., 1991,6,585-607 に開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アル
キルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキルおよびア
ルキルアミノ置換は、本明細書中にそのまま援用される、Oligomeric Compounds
having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions と称される
１９９５年３月６日出願の米国特許出願第０８／３９８，９０１号に記載されて
いる。
【００５７】 本発明にしたがう追加の糖置換基には、−ＳＲ基および−ＮＲ2基が含まれ、
ここにおいて、Ｒはそれぞれ独立して、水素、保護基または置換または非置換の
アルキル、アルケニルまたはアルキニルである。２’−ＳＲヌクレオシドは、本
明細書中にそのまま援用される１９９７年９月２３日発行の米国特許第５，６７
０，６３３号に開示されている。２’−ＳＲモノマーシントンの挿入は、Hamm e
t al., J.Org.Chem., 1997,62,3415-3420 によって開示されている。２’−ＮＲ 2 ヌクレオシドは、Goettingen,M., J.Org.Chem., 1996,61,6273-6281; および P
olushin et al., Tetrahedron Lett., 1996,37,3227-3230 によって開示されて
いる。
【００５８】 本発明にしたがう更に別の代表的な糖置換基には、式IIまたはIII
【００５９】
【化８】
【００６０】 （式中、Ｚ0は、Ｏ、ＳまたはＮＨであり； Ｅは、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）またはＮ＝Ｃ（Ｒ4）（Ｒ5）で
あり； Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換または非置換のＣ 1 −Ｃ10アルキル、置換または非置換のＣ2−Ｃ10アルケニル、置換または非置換
のＣ2−Ｃ10アルキニルであり、ここにおいて、この置換は、ＯＲ6、ＳＲ6、Ｎ
Ｈ3 +、Ｎ（Ｒ6）（Ｒ7）、グアニジノまたはアシルであり、但し、このアシルは
、酸アミドまたはエステルであり；または Ｒ4およびＲ5は、一緒に、窒素保護基であり、またはＮおよびＯより選択され
る追加のヘテロ原子を含んでいてよい環構造中で結合していて；そして Ｒ6およびＲ7は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、窒素保護基で
あり、またはＲ3およびＲ4は、一緒に、窒素保護基であり；または Ｒ6およびＲ7は、ＮおよびＯより選択される追加のヘテロ原子を含んでいてよ
い環構造中で結合していて； Ｒ3は、ＯＸ、ＳＸまたはＮ（Ｘ）2であり； Ｘは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8ハロアルキル、Ｃ
（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＺまたはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚで
あり； Ｚは、ＨまたはＣ1−Ｃ8アルキルであり； Ｌ1、Ｌ2およびＬ3は、約４〜約７個の炭素原子を有する、または約３〜約６
個の炭素原子および１個または２個のヘテロ原子であって、酸素、窒素および硫
黄より選択されるヘテロ原子を有する環系であって、脂肪族、不飽和脂肪族、芳
香族、または飽和若しくは不飽和の複素環式である環系を含み； Ｙは、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキルまたはハロアルキル、２〜約
１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキ
ニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）ＯＲ4、ハ
ロ、ＳＲ4またはＣＮであり； ｑ1は、それぞれ独立して、２〜１０の整数であり； ｑ2は、それぞれ独立して、０または１であり； ｐは、１〜１０の整数であり；そして ｒは、１〜１０の整数であり； 但し、ｐが０である場合、ｒは１より大きいという条件付きである） を有する一つを有するものが含まれる。
【００６１】 式IIの代表的な２’−Ｏ−糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、“
Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides”と称される１９９８年８月７日出願の
米国特許出願第０９／１３０，９７３号に開示されている。
【００６２】 式IIIの代表的な環状２’−Ｏ−糖置換基は、本明細書中にそのまま援用され
る、“RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationall
y Preorganized”と称される１９９８年７月２７日出願の米国特許出願第０９／
１２３，１０８号に開示されている。
【００６３】 特に好ましい糖置換基には、Ｏ［（ＣＨ2）nＯ］mＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＣＨ 3 、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2、Ｏ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＮＨ2およびＯ（Ｃ
Ｈ2）nＯＮ［（ＣＨ2）nＣＨ3］2が含まれ、但し、ｎおよびｍは、１〜約１０で
ある。
【００６４】 本発明の若干の好ましいオリゴマー化合物は、２’−Ｏ−アセトアミド修飾ヌ
クレオシドの他に、次の内の一つを有する少なくとも一つのヌクレオシドを２’
位に含有する。Ｃ1−Ｃ10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラ
ルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＯＣＮ、Ｃｌ
、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＳＯＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3 、ＮＨ2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルア
ミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インタ
ーカレーター、オリゴマー化合物の薬物動態学的性質を改善する基、またはオリ
ゴマー化合物の薬力学的性質を改善する基、および同様の性質を有する他の置換
基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ 3 ，２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる］
（Martin et al., Helv.Chim.Acta, 1995,78,486）、すなわち、アルコキシアル
コキシ基が含まれる。更に好ましい修飾は、本明細書中にその内容が援用される
１９９８年１月３０日出願の共通に所有される米国特許出願第０９／０１６，５
２０号に記載の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡ
ＯＥとしても知られる基Ｏ（ＣＨ2）2ＯＮ（ＣＨ3）2である。
【００６５】 他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ3）、２’−アミノ
プロポキシ（２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）および２’−フルオロ（２’−Ｆ
）が含まれる。同様の修飾は、ヌクレオシドおよびオリゴマー上の他の位置、具
体的には、３’末端ヌクレオシド上または２’−５’結合オリゴマー中の糖の３
’位および５’末端ヌクレオシドの５’位に行われてもよい。オリゴマーは、シ
クロブチル部分のような糖模擬体をペンタフラノシル糖の代わりに有していても
よい。このような修飾糖構造の製造を示す代表的な米国特許には、いくつかは共
通に所有され、本明細書中にそれぞれ援用される、米国特許第４，９８１，９５
７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９
，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，
４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同
第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２
号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，
０５３１号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，
６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号および同第５，７００，９２０号
、および本明細書中にも援用される１９９５年６月５日出願の共通に所有される
米国特許出願第０８／４６８，０３７号が含まれるが、これに制限されるわけで
はない。
【００６６】 リボシル環上にＯ−置換を有する糖も、本発明にしたがう。環Ｏへの代表的な
置換には、Ｓ、ＣＨ2、ＣＨＦおよびＣＦ2が含まれるが、これに制限されるわけ
ではない。例えば、本明細書中にそのまま援用される Secrist et al., Abstrac
t 21, Program & Abstracts, Tenth International Roundtable, Nucleosides,N
ucleotides and their Biological Applications, Park City, Utah, Sept.16-2
0,1992 を参照されたい。
【００６７】 本発明の複素環式環構造は、完全飽和、部分飽和、不飽和でありうるしまたは
、多環式複素環式環については、それぞれの環が、利用可能な飽和状態のいずれ
かでありうる。本発明の複素環式環構造には、縮合環の一つまたはそれ以上がヘ
テロ原子を含有しない系を含めた縮合系を含むヘテロアリールも含まれる。本発
明による窒素複素環を含めた複素環には、イミダゾール基、ピロール基、ピラゾ
ール基、インドール基、１Ｈ−インダゾール基、α−カルボリン基、カルバゾー
ル基、フェノチアジン基、フェノキサジン基、テトラゾール基、トリアゾール基
、ピロリジン基、ピペリジン基、ピペラジン基およびモルホリン基が含まれるが
、これに制限されるわけではない。窒素複素環のより好ましい基には、イミダゾ
ール基、ピロール基、インドール基およびカルバゾール基が含まれる。
【００６８】 本発明は、好ましいヌクレオシド間結合が３’，５’結合である複数の結合ヌ
クレオシドを含むオリゴマー化合物を提供する。或いは、２’，５’結合を用い
ることができる（１９９８年７月１４日出願の米国特許出願第０９／１１５，０
４３号に記載のように）。２’，５’結合は、一つのヌクレオチドサブユニット
の糖部分の２’位と、隣接するヌクレオチドサブユニットの糖部分の５’位とを
共有結合によって連結している結合である。
【００６９】 本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約５〜約５０塩基長さである。
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、８〜約３０個の塩基、より好まし
くは、約１５〜約２５個の塩基を有する。
【００７０】 本発明の一つの好ましい態様において、遮断された／保護されたおよび適当に
活性化されたヌクレオシドモノマーを、通常の遮断されたおよび活性化された標
準ヌクレオチドの包含に関する標準法でオリゴマー化合物中に包含させる。例え
ば、官能基の保護を含むことができる２’−Ｏ−アセトアミド部分を有するＤＭ
Ｔホスホロアミダイトヌクレオシドモノマーを選択する。そのヌクレオシドモノ
マーを、当該技術分野において知られている通常の活性化剤を用いて処理するこ
とによって成長するオリゴマー化合物に加えて、そのホスホロアミダイト部分と
成長するオリゴマー化合物とを反応させる。この後、当該技術分野において知ら
れている標準法でのＤＭＴ基の除去、および当該技術分野において標準である通
常のヌクレオチドアミダイト単位を用いたオリゴマー化合物の伸長の継続を行う
ことができる。或いは、ホスホロアミダイトは、オリゴマー化合物の末端である
ようにすることができるが、その場合、それは、固体支持体からの切断後に、Ｄ
ＭＴ基が付着していてもはずれていても精製することができる。当該技術分野に
おいて周知である、本発明のオリゴマー化合物を製造するための複数の代わりの
方法が存在する。ホスホロアミダイト法は、これら方法の一つを代表するもので
ある。
【００７１】 本明細書中の文脈中、アルキル（概して、Ｃ1−Ｃ10）基、アルケニル（概し
て、Ｃ2−Ｃ10）基およびアルキニル（概して、Ｃ2−Ｃ10）基には、概して、Ｃ 1 −Ｃ20アルキル基が含まれ、他の高級炭素アルキル基も含まれる、置換および
非置換の直鎖、分岐状鎖および脂環式の炭化水素が含まれるが、これに制限され
るわけではない。追加の例には、２−メチルプロピル、２−メチル−４−エチル
ブチル、２，４−ジエチルブチル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシ
ル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチ
ルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシルおよ
び他の分岐状鎖基、アリル、クロチル、プロパルギル、２−ペンテニル、および
π結合を含有する他の不飽和基、シクロヘキサン、シクロペンタン、アダマンタ
ン、更には、他の脂環式基、３−ペンテン−２−オン、３−メチル−２−ブタノ
ール、２−シアノオクチル、３−メトキシ−４−ヘプタナール、３−ニトロブチ
ル、４−イソプロポキシドデシル、４−アジド−２−ニトロデシル、５−メルカ
プトノニル、４−アミノ−１−ペンテニル、更には、他の置換された基が含まれ
る。
【００７２】 更に、本発明の文脈中、直鎖化合物とは、アルキル、アルケニルまたはアルキ
ニル化合物を含めた脂肪族化合物のような開鎖化合物を意味し；本明細書中で用
いられる低級アルキル、アルケニルまたはアルキニルには、約１〜約６個の炭素
原子のヒドロカルビル化合物が含まれるがこれに制限されるわけではない。本明
細書中で用いられる分岐状化合物は、直鎖の炭素原子に結合した追加の直鎖また
は分岐状鎖を有する、アルキル、アルケニル、アルキニル化合物のような直鎖化
合物を含む。本明細書中で用いられる環状化合物とは、閉鎖化合物、すなわち、
脂環式または芳香族化合物のような炭素原子の環を意味する。直鎖状、分岐状ま
たは環状の化合物は、アルコキシまたは複素環式化合物の場合のように、内部で
中断されていてよい。本発明の文脈中、内部で中断されるとは、炭素鎖が、Ｏ、
ＮまたはＳのようなヘテロ原子で中断されていてよいことを意味する。しかしな
がら、所望ならば、その炭素鎖はヘテロ原子を有していなくてよい。
【００７３】 本明細書中で用いられる“ポリアミン”とは、複数のアミンまたは置換アミン
官能基を含有する部分を意味する。本発明によるポリアミンは、少なくとも２個
のアミン官能基を有する。“ポリペプチド”とは、ペプチド結合によって結合し
た複数のアミノ酸を含むポリマーを意味し、ジペプチドおよびトリペプチドが含
まれる。それらアミノ酸は、天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸で
あってよい。本発明によるポリペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含む。
【００７４】 本発明の若干の好ましい態様において、オリゴマー化合物はリン結合によって
結合している。好ましいリン結合には、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエ
ート結合およびホスホロジチオエート結合が含まれる。本発明の一つの好ましい
態様において、ヌクレアーゼ耐性は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を
利用することによってオリゴヌクレオチドに与えられる。
【００７５】 本明細書中で用いられるオリゴヌクレオシドという用語には、非リン結合部分
を有する２個またはそれ以上のヌクレオシドサブユニットを含有するオリゴマー
またはポリマーが含まれる。本発明によるオリゴヌクレオシドは、グリコシル結
合によって複素環式塩基部分に結合したリボフラノース部分を有するモノマーサ
ブユニットまたはヌクレオシドを有する。
【００７６】 オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、キメラオリゴマー化合物を
生じるように結合しうる。天然に存在するホスホジエステル結合基に加えて、本
発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよびオリゴマーキメラ化合物
（オリゴマー化合物）を製造するのに用いることができるリンおよび非リン含有
結合基は、先行技術において充分に証明されており、これには、制限されること
なく次が含まれる。
【００７７】 リン含有結合 ホスホロジチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｓ）−Ｏ−）； ホスホロチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）−Ｏ−）； ホスホロアミデート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｏ−）； ホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｊ）（Ｏ）−Ｏ−）； ホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（ＯＪ）（Ｏ）−Ｏ−）； ホホスホロアミデート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｓ−）； チオノアルキルホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｊ）−Ｏ−）； チオノアルキルホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＪ）−Ｓ−）； ボラノホスフェート（−Ｒ5−Ｐ（Ｏ）（Ｏ）−Ｊ−）； 非リン含有結合 チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）； チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｓ−）； シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｊ）2−Ｏ−）； カルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−および−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）； スルファメート（−Ｏ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｎ−および−Ｎ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−
Ｎ−）； モルホリノスルファミド（−Ｏ−Ｓ（Ｏ）（Ｎ（モルホリノ）−）； スルホンアミド（−Ｏ−ＳＯ2−ＮＨ−）； スルフィド（−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−）； スルホネート（−Ｏ−ＳＯ2−ＣＨ2−）； Ｎ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−）； チオホルムアセタール（−Ｓ−ＣＨ2−Ｏ−）； ホルムアセタール（−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−）； チオケタール（−Ｓ−Ｃ（Ｊ）2−Ｏ−）；および ケタール（−Ｏ−Ｃ（Ｊ）2−Ｏ−）； アミン（−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−）； ヒドロキシルアミン（−ＣＨ2−Ｎ（Ｊ）−Ｏ−）； ヒドロキシルイミン（−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−）；および ヒドラジニル（−ＣＨ2−Ｎ（Ｈ）−Ｎ（Ｈ）−）。
【００７８】 “Ｊ”は、一般的には水素またはアルキル基であるが、一つの種類から別の種
類の結合へと異なるより複雑な基でありうる置換基を示す。 天然に存在する結合の−Ｏ−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−原子の一つまたはそれ以上の修
飾または置換を含む上記の結合基の他に、本発明の範囲内に含まれるのは、５’
−メチレン基、更には、天然に存在する結合の原子の一つまたはそれ以上の修飾
を含む結合基である。この種類の結合基（または結合）は、参考文献で充分に証
明されており、制限されることなく次が含まれる。
【００７９】 アミド（−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ））および−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ＝Ｃ
Ｈ−；および アルキルリン（−Ｃ（Ｊ）2−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＪ）−Ｃ（Ｊ）2−Ｃ（Ｊ）2−
）。 式中、Ｊは上記の通りである。
【００８０】 上記の代替ヌクレオシド間結合の合成に関する合成スキームは、ＷＯ９１／０
８２１３号；ＷＯ９０／１５０６５号；ＷＯ９１／１５５００号；ＷＯ９２／２
０８２２号；ＷＯ９２／２０８２３号；ＷＯ９１／１５５００号；ＷＯ８９／１
２０６０号；ＥＰ２１６８６０号；ＵＳ９２／０４２９４号；ＵＳ９０／０３１
３８号；ＵＳ９１／０６８５５号；ＵＳ９２／０３３８５号；ＵＳ９１／０３６
８０号；米国特許第０７／９９０，８４８号；同０７，８９２，９０２号；同０
７／８０６，７１０号；同０７／７６３，１３０号；同０７／６９０，７８６号
；同第５，４６６，６７７号；同５，０３４，５０６号；同５，１２４，０４７
号；同５，２７８，３０２号；同５，３２１，１３１号；同５，５１９，１２６
号；同４，４６９，８６３号；同５，４５５，２３３号；同５，２１４，１３４
号；同５，４７０，９６７号；同５，４３４，２５７号；Stirchak,E.P.,et al.
, Nucleic Acid Res., 1989,17,6129-6141；Hewitt,J.M.,et al., 1992,11,1661
-1666；Sood,A.,et al., J.Am.Chem.Soc., 1990,112,9000-9001；Vaseur,J.J. e
t al., J.Amer.Chem.Soc., 1992,114,4006-4007；Musichi,B.,et al., J.Org.Ch
em., 1990,55,4231-4233；Reynolds,R.C.,et al., J.Org.Chem., 1992,57,2983-
2985；Mertes,M.P.,et al., J.Med.Chem., 1969,12,154-157；Mungall,W.S.,et
al., J.Org.Chem., 1977,42,703-706；Stirchak,E.P.,et al., J.Org.Chem., 1
987,52,4202-4206；Coull,J.M.,et al., Tet.Lett., 1987,28,745；および Wang
,H.,et al., Tet.Lett., 1991,32,7385-7388 に開示されている。
【００８１】 他の修飾は、糖、塩基、またはヌクレオシドのリン酸基に行われうる。代表的
な修飾は、本出願の譲受人にいずれも付与された、１９９１年７月２５日公開の
国際公開第ＷＯ９１／１０６７１号、１９９２年２月２０日公開のＷＯ９２／０
２２５８号、１９９２年３月５日公開のＷＯ９２／０３５６８号、および米国特
許第５，１３８，０４５号、同５，２１８，１０５号、同５，２２３，６１８号
、同５，３５９，０４４号、同５，３７８，８２５号、同５，３８６，０２３号
、同５，４５７，１９１号、同５，４５９，２５５号、同５，４８９，６７７号
、同５，５０６，３５１号、同５，５４１，３０７号、同５，５４３，５０７号
、同５，５７１，９０２号、同５，５７８，７１８号、同５，５８７，３６１号
、同５，５８７，４６９号に開示されている。上に挙げられた公報それぞれの開
示は、本明細書中に援用される。
【００８２】 オリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体へのコンジュゲート基の結合は、先
行技術で充分に証明されている。本発明の化合物には、第一または第二ヒドロキ
シル基のような官能基に共有結合したコンジュゲート基が含まれうる。本発明の
コンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポ
リアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質
を向上させる基、およびオリゴマーの薬物動態学的性質を向上させる基が含まれ
る。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、リン脂質、ビオチン、フ
ェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、
ローダミン、クマリン、および染料が含まれる。薬力学的性質を向上させる基に
は、本発明の場合、オリゴマー取込みを改善し、オリゴマー耐分解性を増強し、
および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含
まれる。薬物動態学的性質を向上させる基には、本発明の場合、オリゴマーの取
込み、分布、代謝または分泌を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート
基は、１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９
６号、１９９７年７月１日発行の米国特許第５，５７８，７１８号、および米国
特許第５，２１８，１０５号に開示されている。前述のそれぞれが、本出願に共
通に譲渡される。それぞれの開示はそのまま本明細書中に援用される。
【００８３】 本発明にしたがう好ましいコンジュゲート基には、コレステロール部分（Lets
inger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1989,86,6553）、コール酸（Manohara
n et al., Bioorg.Med.Chem.Lett., 1994,4,1053）、チオエーテル、例えば、ヘ
キシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann.N.Y.Acad.Sci., 1992,
660,306; Manoharan et al., Bioorg.Med.Chem.Let., 1993,3,2765）、チオコレ
ステロール（Oberhauser et al., Nucl.Acids Res., 1992,20,533）、脂肪族鎖
、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et
al., EMBO J., 1991,10,111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990,259,327; Svi
narchuk et al., Biochimie, 1993,75,49）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシ
ル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム−１，２−ジ−Ｏ−ヘ
キサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Te
trahedron Lett., 1995,36,3651; Shea et al., Nucl.Acids Res., 1990,18,377
7）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleos
ides & Nucleotides, 1995,14,969）、アダマンタン酢酸（Manoharan et al., T
etrahedron Lett., 1995,36,3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim
.Biophys.Acta, 1995,1264,229）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルア
ミノカルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J.Pharmacol.Exp.T
her., 1996,277,923）のような脂質部分が含まれる。
【００８４】 アンチセンス性状を変更する他の基には、ＲＮＡ切断用複合体、ピレン類、金
属キレート化剤、ポルフィリン類、アルキル化剤、ハイブリッドインターカレー
ター／リガンドおよび光架橋剤が含まれる。ＲＮＡ切断剤には、ｏ−フェナント
ロリン／Ｃｕ複合体およびＲｕ（ビピリジン）3 2+複合体が含まれる。Ｒｕ（ｂ
ｐｙ）3 2+複合体は、核酸と相互作用し且つ核酸を光化学的に切断する。金属キ
レート化剤には、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡおよびｏ−フェナントロリンが含まれる。
アルキル化剤には、ヨードアセトアミドのような化合物が含まれる。ポルフィリ
ン類には、ポリフィン、その置換された形、および金属複合体が含まれる。ピレ
ン類には、ピレンおよび、同様のプロトコールを用いてコンジュゲート化されう
る他のピレンを基にしたカルボン酸が含まれる。
【００８５】 ハイブリッドインターカレーター／リガンドには、フォトヌクレアーゼ／イン
ターカレーターリガンド６−［［［９−［［６−（４−ニトロベンズアミド）ヘ
キシル］アミノ］アクリジン−４−イル］カルボニル］アミノ］ヘキサノイルペ
ンタフルオロフェニルエステルが含まれる。この化合物は、二つの注目に値する
特徴、すなわち、インターカレーターであるアクリジン部分およびフォトヌクレ
アーゼであるｐ−ニトロベンズアミド基を有する。
【００８６】 光架橋剤には、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニイミジル−４−アジドベンゾ
エート（ＨＳＡＢ）およびＮ−スクシンイミジル−６（−４’−アジド−２’−
ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）のようなアリールアジ
ドが含まれる。オリゴヌクレオチドにコンジュゲート化されたアリールアジドは
、照射によって核酸およびタンパク質と架橋する。それらは、担体タンパク質（
ＫＬＨまたはＢＳＡなど）とも架橋して、オリゴヌクレオチドに対する抗体を上
昇させる。
【００８７】 本発明によるビタミン類は、概して、水溶性または脂溶性として分類すること
ができる。水溶性ビタミン類には、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸または
ナイアシン、ビタミンＢ6ピリドキサール群、パントテン酸、ビオチン、葉酸、
Ｂ12コバミド補酵素、イノシトール、コリンおよびアスコルビン酸が含まれる。
脂溶性ビタミン類には、ビタミンＡ系、ビタミンＤ、ビタミンＥトコフェロール
系およびビタミンＫ（およびフィトール）が含まれる。レチノイン酸およびレチ
ノールを含めたビタミンＡ系は、細胞質ゾルレチノール結合タンパク質II型（Ｃ
ＲＢＰ−II）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）および細胞内レチノール結
合タンパク質（ＣＲＢＰ）のような特定のタンパク質とのそれらの相互作用によ
って標的組織に吸収され且つ輸送される。これらタンパク質は、ヒトの様々な身
体部分で見出されており、約１５ｋＤの分子量を有する。それらは、ビタミンＡ
系の化合物、特に、レチノイン酸およびレチノールとの特異的相互作用を有する
。
【００８８】 本発明の文脈中、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオチド間の
、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素
結合であってよい水素結合を意味するものである。例えば、アデニンおよびチミ
ンは、水素結合の形成によって対になる相補的核酸塩基である。本明細書中で用
いられる“相補的”とは、二つのヌクレオチド間の配列相補性も意味する。例え
ば、オリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子
の同様の位置のヌクレオチドと水素結合することができる場合、そのオリゴヌク
レオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置で互いに相補的であると考えら
れる。そのオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、それぞれの分子中
の充分に多数の対応する位置が、互いに水素結合しうるヌクレオチドによって占
められている場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリッド
形成可能”および“相補的”は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的
との間に安定且つ特異的な結合が生じるような充分な程度の相補性を示すのに用
いられる用語である。オリゴヌクレオチドは、その標的ＤＮＡ配列に特異的にハ
イブリッド形成可能であるのに１００％相補的である必要はないということが理
解される。オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの標的ＤＮＡまたは
ＲＮＡ分子への結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨げ、そして特異
的結合が望まれる条件下において、すなわち、in vivo 検定または治療的処置の
場合の生理学的条件下において、または in vitro 検定の場合、その検定が行わ
れる条件下において、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避け
る充分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリッド形成可能である。
【００８９】 核酸分解酵素によるオリゴヌクレオチドの切断には、酵素−基質複合体、また
は特に、ヌクレアーゼ−オリゴヌクレオチド複合体の形成を必要とする。ヌクレ
アーゼ酵素は、概して、適当な結合のためにオリゴヌクレオチド上に特異的結合
部位を必要とするであろう。ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドに結合できない
ようにオリゴヌクレオチド結合部位が除去されまたは遮断される場合、それらオ
リゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性であろう。配列特異的パリンドローム二本
鎖ＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼの場合、複素環式塩基部分の３位お
よび７位の環窒素ような特定の結合部位が、必要な結合部位として識別されてい
る。オリゴヌクレオチド中のこれら部位の一つまたはそれ以上の除去またはこれ
ら特定の位置へのヌクレアーゼの接近を立体的に阻止することは、特定のヌクレ
アーゼへのいろいろなレベルの耐性を提供している。
【００９０】 本発明は、優れたハイブリダイゼーション特性を有すると考えられるオリゴマ
ー化合物を提供する。構造−活性関係研究は、特定の２’−糖修飾オリゴヌクレ
オチドのＲＮＡ標的（補体）への結合の増加（Ｔm）が、ヘテロ二本鎖の増加し
た“Ａ”形コンホメーションと相関するということを示している。
【００９１】 核酸繊維のＸ線回折分析（Arnott and Hukins, Biochem.Biophys.Res.Comm.,
1970,47,1504）および二本鎖核酸の結晶の分析から、ＤＮＡは“Ｂ”形構造をと
り、ＲＮＡはより堅い“Ａ”形構造をとるということが知られている。ＤＮＡお
よびＲＮＡのヌクレオシドの糖パッカリング（“Ｂ”形ＤＮＡのＣ２’エンドお
よび“Ａ”形ＲＮＡのＣ３’エンド）間の相違は、二本鎖核酸間の主なコンホメ
ーションの相違である。
【００９２】 ペントフラノシル部分のコンホメーションに主に寄与するのは、２’位の置換
基の性状である。したがって、Ｃ３’−エンド形の集団は、Ｃ２’−エンド形に
関して、２’−置換基の電気陰性度が増加するにつれて増加する。例えば、２’
−デオキシ−２’−ハロアデノシンの中で、２’−フルオロ誘導体は、最大のＣ
３’−エンド形集団（６５％）を示し、２’−ヨードは最低の集団（７％）を示
す。アデノシン（２’−ＯＨ）およびデオキシアデノシン（２’−Ｈ）のそれら
は、それぞれ３６％および１９％である。更に、アデノシン二量体（２’−デオ
キシ−２’−フルオロアデノシン−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシン
）の２’−フルオロ基の作用は、スタッキングしたコンホメーションの安定化に
更に相関する。研究は、ジヌクレオシドリン酸が、Ａ−Ａの場合と幾何学的に同
様であるが、Ａ−Ａより大きい塩基−塩基重複度を有するスタッキングしたコン
ホメーションを有するということを示している。Ｃ２’−Ｆ結合の極めて極性の
性状およびＣ３’−エンドパッカリングへの極端な優先は、“Ａ”形構造でのス
タッキングしたコンホメーションを安定化させうると考えられる。
【００９３】 ＵＶ淡色性、円偏光二色性および1Ｈ ＮＭＲからのデータも、スタッキング
の程度が、ハロ置換基の電気陰性度が減少するにつれて減少することを示してい
る。更に、糖部分の２’位の立体的嵩高（steric bulk）は、“Ｂ”形二重らせ
んよりも“Ａ”形二重らせんにおいてより多く与えられる。
【００９４】 したがって、ジヌクレオシド一リン酸の３’−ヌクレオチジル単位上の２’−
置換基は、スタッキングコンホメーションに多数の作用、すなわち、立体反発、
フラノースパッカリング優先、静電反発、疎水性引力および水素結合能を及ぼす
と考えられる。これら置換基作用は、置換基の分子サイズ、電気陰性度および疎
水性によって決定されると考えられる。
【００９５】 ２’−デオキシグアノシン、シチジンおよびウリジンジヌクレオシドリン酸の
２’−ＯＭｅ修飾を用いた研究は、該当する非メチル化種（２’−ＯＨ）に関し
て増加したスタッキング作用を示す。この場合、メチル基の疎水性引力は、その
立体的嵩高の脱安定化作用を克服する性質があると考えられる。
【００９６】 融解温度（相補的結合）は、２’−置換アデノシン二リン酸を用いて増加する
。コンホメーションの３’−エンド優先かまたは置換基の存在が、増加した結合
の原因となっているのかどうか明らかでない。しかしながら、隣接する塩基の一
層大きい重なり（スタッキング）は、３’−エンドコンホメーションを用いて得
ることができる。
【００９７】 いずれか特定の理論に拘束されたくはないが、アセトアミド修飾オリゴマー化
合物の設計は、２’−連結部位の電気陰性原子を含む多数の因子に集中しており
、これは、Ｏ4'−Ｏ2'ゴーシュ作用（結合親和性の増加）および２’−置換基−
Ｏ−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（−）−のゴーシュ作用（結合親和性／ヌクレアーゼ
耐性の増加）によってＣ3'−エンドコンホメーションに必要であると考えられる
。考えられる構造を、１個のモノマーについて下に示す。
【００９８】
【化９】
【００９９】 本発明の化合物は、診断薬、治療薬および研究用試薬としておよびキットで利
用することができる。それらは、有効量の本発明のオリゴマー化合物を適当な薬
学的に許容しうる希釈剤または担体に加えることによって医薬組成物中で利用す
ることができる。それらは、更に、望ましくないタンパク質生産を特徴とする疾
患を有する生物を治療するのに用いることができる。生物は、望ましくないタン
パク質をコードする標的核酸鎖と特異的にハイブリッド形成することができる配
列を有する本発明のオリゴマー化合物と接触することができる。
【０１００】 治療用組成物の製剤化および引き続きの投与は、当業者の技術の範囲内である
と考えられる。概して、治療薬には、このような療法を必要としている患者に、
本発明によるオリゴマーを、一般的には、薬学的に許容しうる担体中において、
患者の年齢および治療される疾患状態の重症度に依って０．０１μｇ〜１００ｇ
／ｋｇ（体重）の範囲の用量で投与する。更に、治療は、１回の投薬であってよ
いし、または具体的な疾患の性状、その重症度および患者の全身状態に依って異
なるであろう一定期間継続してよく、しかも１日１回〜２０年毎に１回まで延長
しうる治療計画であってよい。処置後、患者は、その状態の変化についておよび
疾患状態の症状の緩和について監視される。オリゴマーの用量は、現在の用量レ
ベルに患者がほとんど応答しない場合に増加させることができるかまたは、疾患
状態の症状の緩和が認められる場合または疾患状態が消散している場合、用量を
減少させることができる。
【０１０１】 ある場合には、本発明のオリゴマーを、他の伝統的な治療方式と一緒に用いて
患者を治療することがより有効でありうる。例えば、ＡＩＤＳに関して治療され
ている患者には、ＡＺＴと一緒にオリゴマーを投与してよいし、またはアテロー
ム性動脈硬化症の患者は、被処置動脈の再閉塞を防止する血管形成術後に、本発
明のオリゴマーを用いて治療してよい。
【０１０２】 投薬は、治療される疾患状態の重症度および応答性に依り、治療過程は、数日
〜数ヶ月、または治癒するまでまたは疾患状態の軽減が達成されるまで継続され
る。最適の投薬計画は、患者体内の薬物蓄積の測定値から計算することができる
。熟練者は、最適用量、投薬法および反復率を容易に決定することができる。最
適用量は、個々のオリゴマーの相対力価に依って異なることがありうるし、概し
て、in vitro および in vivo 動物モデルにおいて有効であると判明したＥＣ50 に基づいて推定することができる。概して、用量は、０．０１μｇ〜１００ｇ／
ｋｇ（体重）であり、１日に、１週間に、１ヶ月にまたは１年に１回またはそれ
以上、または２年〜数年毎に１回でも与えられてよい。
【０１０３】 成功した治療後、疾患状態の再発を防止するように患者が維持療法を受けるの
が望ましいことがありうるが、この場合、オリゴマーは、０．０１μｇ〜１００
ｇ／ｋｇ（体重）の維持用量で１日に１回またはそれ以上〜数年毎に１回投与さ
れる。
【０１０４】 本発明の医薬組成物は、局所かまたは全身の処置が望まれるのかどうかに依っ
ておよび処置される部位に依って多数の方式で投与することができる。投与は、
局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含めた）、経口または非経口であってよい
。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、または脊髄内
または脳室内投与が含まれる。
【０１０５】 局所投与用製剤には、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル
剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤が含まれうる。慣用的な医薬担体、水
性、粉末または油状基剤、粘稠化剤等は、必要であるかまたは望まれることがあ
りうる。コーティングコンドーム、グローブ等も有用でありうる。
【０１０６】 経口投与用組成物には、散剤または顆粒剤、水中または非水性基剤中の懸濁剤
または液剤、カプセル剤、サシェ剤または錠剤が含まれる。粘稠化剤、フレーバ
ー剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤は望まれることがありうる。
【０１０７】 脊髄内または脳室内投与用組成物には、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加
剤も含有しうる滅菌水性液剤が含まれうる。 非経口投与用製剤には、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有しうる
滅菌水性液剤が含まれうる。
【０１０８】 本発明は、単細胞の原核生物および真核生物から多細胞真核生物までの種々の
生物で実施することができる。遺伝、代謝または細胞機構の基本部分としてＤＮ
Ａ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−タンパク質翻訳を利用するいずれの生物も、この
ような治療的および／または予防的処置に感受性である。細菌、酵母、原生動物
、藻類、植物、および温血動物を含めた高等動物の型のような外観上異なる生物
を、この方式で処置することができる。更に、多細胞真核生物の細胞はそれぞれ
、それらの細胞活性の不可欠な要素としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写もＲＮＡ−タンパ
ク質翻訳も含むので、このような療法および／または診断法は、このような細胞
集団にも実施することができる。更に、真核細胞のオルガネラの多く、例えば、
ミトコンドリアおよび葉緑体も、転写および翻訳の機構を含む。単細胞、細胞集
団またはオルガネラも、そのままで、本発明の治療用または診断用オリゴヌクレ
オチドを用いて処置することができる生物の定義の範囲内に含まれうる。本明細
書中で用いられる療法とは、疾患状態の根絶、微生物、例えば、細菌、原生動物
または他の感染の致死、または異常なまたは望ましくない細胞の成長または発現
の抑制を含む意味である。
【０１０９】 天然に存在するオリゴヌクレオチド、更には、ホスホロチオエートのような本
発明のオリゴマー化合物の製造に選択される現在の方法は、制御多孔質ガラス（
ＣＰＧ）；オキサリル制御多孔質ガラス（例えば、Alul,et al., Nucleic Acids
Research 1991,19,1527 を参照されたい）；ＴＥＮＴＡＧＥＬ Support（例え
ば、Wright,et al., Tetrahedron Letters 1993,34,3373 を参照されたい）；ま
たは Perceptive Biosystems から入手可能なポリスチレン樹脂であるＰＯＲＯ
Ｓなどのポリマー支持体（固体支持体）を用いた固相合成による。このような合
成のための装置は、例えば、Applied Biosystems（Foster City, CA）を含めた
いくつかの業者によって販売されている。当該技術分野において知られているこ
のような合成のための他の手段はいずれも、更にまたは代わりに用いることがで
きる。自動合成法を含めた適当な固相技術は、F.Eckstein (ed.), Oligonucleot
ides and Analogues, a Practical Approach, Oxford University Press, New Y
ork (1991) に記載されている。
【０１１０】 固相合成法は、成長するオリゴヌクレオチド鎖の一方の末端へのヌクレオチド
の逐次的付加に頼る。典型的には、最初のヌクレオシド（存在する任意の環外ア
ミン官能基上に保護基を有する）を、適当なガラスビーズ支持体に結合させ、そ
して活性亜リン酸化合物（典型的には、適当な保護基も有するヌクレオチドホス
ホロアミダイト）を段階的に加えて、その成長するオリゴヌクレオチドを伸長さ
せる。固相合成のための追加の方法は、Caruthers 米国特許第４，４１５，７３
２号；同第４，４５８，０６６号；同第４，５００，７０７号；同第４，６６８
，７７７号；同第４，９７３，６７９号；および同第５，１３２，４１５号；お
よび Koster 米国特許第４，７２５，６７７号；およびＲｅ．３４，０６９号に
見出されうる。
【０１１１】 本発明による固体支持体には、制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル制御
多孔質ガラス（例えば、Alul,et al., Nucleic Acids Research 1991,19,1527
を参照されたい）、TentaGel Support、すなわち、アミノポリエチレングリコー
ル誘導体化支持体（例えば、Wright,et al., Tetrahedron Letters 1993,34,337
3 を参照されたい）、または Poros、すなわち、ポリスチレン／ジビニルベンゼ
ンのコポリマーが含まれる。
【０１１２】 ２’−置換オリゴヌクレオチドは、標準的な固相核酸合成により、３８０Ｂ型
（Perkin Elmer/Applied Biosystems）または MilliGen/Biosearch ７５００ま
たは８８００のような自動合成機を用いて合成された。トリエステル、ホスホロ
アミダイトまたはホスホン酸水素塩（エステル）(hydrogen phosphonate)のカッ
プリング化学物質（Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Express
ion. M.Caruthers, p.7, J.S.Cohen (Ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida,
1989）を、これら合成機を用いて、所望のオリゴヌクレオチドを与える。Beauca
ge 試薬（J.Amer.Chem.Soc., 1990,112,1253）または元素硫黄（Beaucage et al
., Tet.Lett., 1981,22,1859）を、ホスホロアミダイトまたはホスホン酸水素塩
（エステル）化学物質と一緒に用いて、２’−置換ホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドを与える。
【０１１３】 有用な硫化剤には、例えば、Iyer et al., J Am Chem Soc, 112,1253-1254(19
90); および Iyer et al., J Org Chem, 55,4693-4699(1990) に記載の Beaucag
e 試薬；Vu et al., Tetrahedron Lett, 32,3005-3007(1991) に記載のテトラエ
チルチウラムジスルフィド；Rao et al., Tetrahedron Lett, 33,4839-4842(199
2) に記載のジベンゾイルテトラスルフィド；Kamer et al., Tetrahedron Lett,
30,6757-6760(1989) に記載のジ（フェニルアセチル）ジスルフィド；ビス（Ｏ
，Ｏ−ジイソプロポキシホスフィノチオイル）ジスルフィド、Stec., Tetrahedr
on Letters, 1993,34,5317-5320；硫黄；およびトリアリール−、トリアルキル
−またはトリアラルキル−またはトリアルカリルホスフィンのようなリガンドと
組み合わせた硫黄が含まれる。有用な酸化剤には、上記のものに加えて、ヨウ素
／テトラヒドロフラン／水／ピリジン；過酸化水素／水；tert−ブチルヒドロペ
ルオキシド；またはｍ−クロロ過安息香酸のような過酸が含まれる。硫化の場合
、その反応は、空気、特に酸素の除去を用いた無水条件下で行われるが；酸化の
場合、その反応は水性条件下で行うことができる。
【０１１４】 必要な２’−置換ヌクレオシド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）、および修飾核酸塩基
または追加の糖修飾を有する他のヌクレオシド）は、下記の手順を用いて製造さ
れる。
【０１１５】 本発明のヌクレオシドモノマーおよびオリゴマー化合物の合成中、化学保護基
を用いて、１個またはそれ以上の官能基の変換を容易にすることができるが、他
の官能基は不活性にされる。多数の化学官能基を、ブロックされた形で本発明の
化合物中に導入後、脱ブロックして、最終の所望の化合物を形成することができ
る。概して、保護基は、分子の化学官能基を特定の反応条件に不活性にし、その
後、その分子の残部をほとんど損なうことなく、分子中のこのような官能基から
除去することができる（Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synth
esis, 2d edition, John Wiley & Sons, New York, 1991）。例えば、アミノ基
は、フタルイミド基として、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）
基として、トリフェニルメチルスルフェニル基、ｔ−ＢＯＣ基、ベンゾイル基ま
たはベンジル基を用いてブロックすることができる。カルボキシル基は、アセチ
ル基として保護することができる。代表的なヒドロキシル保護基は、Beaucage e
t al., Tetrahedron 1992,48,2223 によって記載されている。好ましいヒドロキ
シル保護基は、トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、
トリメトキシトリチル基、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）基
および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）基のよう
な酸反応活性である。化学官能基は、それらを前駆体の形に含むことによっても
“ブロックされ”うる。したがって、アジド基は、容易にアミンに変換されるの
で、アジド基をアミンの“ブロックされた”形と考えて用いることができる。オ
リゴヌクレオチド合成に利用される代表的な保護基は、Agrawal et al., Protoc
ols for Oligonucleotide Conjugates, Eds, Humana Press; New Jersey, 1994;
Vol.26 pp.1-72 に考察されている。
【０１１６】 その他の使用の内、本発明のオリゴマー化合物は、ｒａｓ−ルシフェラーゼト
ランス活性化を用いるｒａｓ−ルシフェラーゼ融合系において有用である。本出
願と共通に譲渡され、本明細書中にそのまま援用される１９９２年１２月２３日
公開の国際公開第ＷＯ９２／２２６５１号および米国特許第５，５８２，９７２
号および同第５，５８２，９８６号に記載のように、ｒａｓ癌遺伝子は、原形質
膜の内面に局在する関連タンパク質をコードする遺伝子ファミリーのメンバーで
ある。ｒａｓタンパク質は、アミノ酸レベルで高度に保存され、ＧＴＰを高い親
和性および特異性で結合し、そしてＧＴＰアーゼ活性を有することが示されてい
る。ｒａｓ遺伝子産物の細胞内機能は知られていないが、それらの生化学的性質
は、ＧＴＰ結合タンパク質またはＧタンパク質として知られるシグナル伝達タン
パク質のクラスとの有意の配列相同性に加えて、ｒａｓ遺伝子産物が、原形質膜
を越える細胞外シグナルの伝達に関連する基本的細胞調節機能においてある基本
的な役割を果たしていることを示唆している。
【０１１７】 Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓと称される３種類のｒａｓ遺伝子が
、哺乳動物ゲノム中で識別されている。哺乳動物ｒａｓ遺伝子は、それらコーデ
ィング配列中の単一点突然変異によって形質転換を誘導する性質を獲得する。天
然に存在するｒａｓ癌遺伝子中の突然変異は、コドン１２、１３および６１に局
在している。ヒト腫瘍で見出される最も一般的に検出される活性化ｒａｓ突然変
異は、Ｈ−ｒａｓ遺伝子のコドン−１２においてであり、この場合、ＧＧＣから
ＧＴＣへの塩基変化は、ｒａｓタンパク質産物のＧＴＰアーゼ調節ドメイン中で
グリシン−バリン置換を引き起こす。この単一アミノ酸変化は、ｒａｓタンパク
質機能の正常な制御を無効にし、それによって、普通に調節される細胞タンパク
質を絶えず活性であるタンパク質に変換すると考えられる。正常なｒａｓタンパ
ク質機能のこのような調節解除は、正常から悪性の成長への形質転換の原因であ
ると考えられる。
【０１１８】 ｒａｓ遺伝子のモジュレーションに加えて、他の核酸と特異的にハイブリッド
形成可能である本発明のオリゴマー化合物は、このような他の核酸の発現を調節
するのに用いることができる。例には、異常な細胞増殖および腫瘍形成に関連し
ている活性型に時々変換する天然に存在する細胞性遺伝子であるｒａｆ遺伝子が
含まれる。他の例には、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の発現を調節すること
が判っているＰＫＣに関するもの、ＩＣＡＭのような細胞接着分子に関するもの
、多剤耐性関連タンパク質に関するものが含まれ、ウイルスゲノム核酸には、Ｈ
ＩＶ、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス、サイトメガロウイル
ス、乳頭腫ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスが含まれ
る（本出願と共通に譲渡され、本明細書中にその開示が援用される米国特許第５
，１６６，１９５号、同第５，２４２，９０６号、同第５，２４８，６７０号、
同第５，４４２，０４９号、同第５，４５７，１８９号、同第５，５１０，４７
６号、同第５，５１０，２３９号、同第５，５１４，５７７号、同第５，５１４
，７８６号、同第５，５１４，７８８号、同第５，５２３，３８９号、同第５，
５３０，３８９号、同第５，５６３，２５５号、同第５，５７６，３０２号、同
第５，５７６，９０２号、同第５，５７６，２０８号、同第５，５８０，７６７
号、同第５，５８２，９７２号、同第５，５８２，９８６号、同第５，５９１，
７２０号、同第５，５９１，６００号および同第５，５９１，６２３号を参照さ
れたい）。
【０１１９】 理解されるように、本発明の方法の工程は、任意の具体的な回数または任意の
具体的な配列順序で行われる必要はない。本発明の追加の目的、利点および新規
な特徴は、詳しく説明するためのものであって制限するものではない次の実施例
の検討によって当業者に明らかになるであろう。
【０１２０】 （実施例） 実施例１ Ｎ３−ベンジルオキシメチル−２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン−５−メ
チルウリジン（２） ５℃の無水ＤＭＦ（２５０ｍｌ）中のＮ３−ベンジルオキシメチル−５−メチ
ルウリジン（９．７０ｇ，２５．６ｍｍｏｌ）（米国特許出願第０８／４６４，
９５３号、１９９５年６月６日出願に例示された方法によって製造）の溶液に、
水素化ナトリウム（１．０２５ｇ，２５．６ｍｍｏｌ，６０％油分散液）を加え
た。この反応混合物を周囲温度にまで温度上昇させ、１時間撹拌した。この懸濁
液をＣＨ3ＣＮ−ＣＯ2浴中で−４０℃に冷却し、メチル２−ブロモアセテート（
２．３６ｍｌ、２５．６ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。この反応混合物を周囲温度
までに１時間にわたって徐々に温度上昇させてから、周囲温度において１６時間
撹拌した。ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を加えた後に、氷ＡｃＯＨ（５ｍｌ）を添加し
、反応混合物を５分間撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させて、油状物を得て、こ
れをＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）中に溶解し、有機層を水（３ｘ５０ｍｌ）とブラ
イン（５０ｍｌ）とによって洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4によって乾燥させた
後に、溶媒を真空下で蒸発させて、油状物を得て、これを無水ＭｅＯＨ（６４ｍ
ｌ）中の２Ｍ ＮＥｔ3中に溶解した。周囲温度において１時間撹拌した後に、
溶媒を真空下で蒸発させた。得られた油状物を、溶離剤としてＣＨ2Ｃｌ2：Ｍｅ
ＯＨ（９５／５，ｖ／ｖ）を用いてカラムクロマトグラフィーによって精製して
、２．９９ｇ（２６％）の標題化合物を吸湿性白色泡状物として得た。少量の不
純物を有する二次フラクションは５．５７（〜５％）の標題化合物を泡状物とし
て生じた。
【０１２１】
【数１】
【０１２２】 実施例２ ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン−５−メチルウリジン（３） 化合物２（２．９９ｇ，６．６４ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（８０ｍｌ）中に
溶解して、アルゴン雰囲気下で、炭素付き１０％Ｐｄ（７５０ｍｇ）を含有する
圧力ボトルに加えた。この容器を水素によって３０ｐｓｉに加圧して、１６時間
振とうした。容器の中身をセライト・パッドに通して濾過して、濾液を真空下で
蒸発させた。得られた油状物を無水ＭｅＯＨ中の１Ｍ ＮＥｔ3中に溶解し、こ
の溶液を還流温度において２時間加熱した。溶媒を真空下で蒸発させて、２．７
３５ｇ（９５％）の標題化合物を白色固体として得た。
【０１２３】
【数２】
【０１２４】 実施例３ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン−５−メチルウリジ
ン（４） 無水ピリジン（６０ｍｌ）中に溶解した化合物３（３９ｍｇ，０．３２ｍｍｏ
ｌ，無水ピリジンと共に２回蒸発させて乾燥させ、次に周囲温度において真空（
０．１ｔｏｒｒ）下で１２時間乾燥させたもの）とジメチルアミノピリジン（３
９ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）との溶液に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリ
ド（２．７９ｇ，８．２４ｍｍｏｌ）を１２時間撹拌しながら加えた。ＭｅＯＨ
（１０ｍｌ）を３０分間撹拌しながら加えて、溶媒を真空下で蒸発させた。得ら
れた油状物をＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）中に溶解し、有機層を水（３ｘ５０ｍｌ
）によって、次にブライン（５０ｍｌ）によって洗浄した。ＮＥｔ3（５ｍｌ）
を加えて、有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、溶媒を真空下で蒸発させた。得ら
れた泡状物を、溶離剤としてＣＨ2Ｃｌ2：ＥｔＯＡｃ（６０／４０，ｖ／ｖ）を
用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、２．４４５ｇ（５９％）の
標題化合物を泡状物として得た。
【０１２５】
【数３】
【０１２６】 実施例４ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン−５−メチルウリジ
ン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
（５） 化合物４（１．２９ｇ，２．０４ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中に溶
解して、ジイソプロピルエチルアミン（０．７８ｍｌ，４．４８ｍｍｏｌ）と２
−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．５０１ｍｌ，２
．２４ｍｍｏｌ）とを周囲温度において滴加した。周囲温度において１．５時間
撹拌した後に、追加のジイソプロピルエチルアミン（０．７８ｍｌ，４．４８ｍ
ｍｏｌ）と２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．５
０１ｍｌ，２．２４ｍｍｏｌ）とを周囲温度において滴加した。さらに１時間後
に、ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）を反応混合物に加えて、有機層(organic)を半飽
和ＮａＨＣＯ3によって２回洗浄し、ブラインによって洗浄し、有機層をＭｇＳ
Ｏ4上で乾燥させ、真空下で蒸発させた。得られた油状物をＣＨ2Ｃｌ2中に溶解
し、溶離剤としてＣＨ2Ｃｌ2：ＥｔＯＡｃ：ＮＥｔ3（７０／３０／０．５，ｖ
／ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって精製して、
１．４３ｇの標題化合物を油状物として得た。溶離剤としてＥｔＯＡｃ：ＮＥｔ 3 （９５．５／０．５，ｖ／ｖ）を用いるさらなる溶離によって、生成物の第２
フラクションを得た。生成物フラクションを丸底フラスコに移し、ＣＨ2Ｃｌ2（
１４ｍｌ）中に溶解した。生じた溶液に激しく撹拌しながらヘキサン（２００ｍ
ｌ）を加えて、白色ガムとやや濁った上澄み液とを得た。混合物を数時間沈降さ
せて、上澄み液をデカントし、ガムをヘキサンによって３回洗浄した。ヘキサン
洗浄液(washes)をデカントして、生成物を真空（０．１ｔｏｒｒ）下で１２時間
乾燥させて、９１７ｍｇの標題化合物を白色泡状物として得た。生成物の第２フ
ラクションを白色固体（１１８ｍｇ，７％）として単離した。
【０１２７】
【数４】
【０１２８】 実施例５ ２’−Ｏ−（メトキシカルボニルメチレン）アデノシン（１８ａ） アデノシン（２５．０ｇ，９３．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（９００ｍｌ）中にア
ルゴン雰囲気下で溶解した。生じた溶液を−５０℃に冷却して、ＮａＨ（鉱油中
６０％分散液）（４．８６ｇ，１２２ｍｍｏｌ）を２回に分けて加え、反応混合
物を−３０℃に温度上昇させて、３０分間撹拌した。この反応混合物を−５０℃
に再冷却した後に、メチル２−ブロモアセテート（１１．５ｍｌ，１２２ｍｍｏ
ｌ）を滴加し、反応を周囲温度に温度上昇させた。周囲温度において１時間撹拌
した後に、ＭｅＯＨ（１００ｍｌ）を加えて、反応を１０分間撹拌し、溶媒を真
空下で蒸発させて、泡状物を得た。生成物をＥｔＯＡｃと共に同時蒸発させて(c
oevaporated)、標題化合物を粗固体として得た、これはその後の反応にさらに精
製せずに用いるために充分な純度であった。生成物の小部分をカラムクロマトグ
ラフィーによって精製して、特徴付けた。
【０１２９】
【数５】
【０１３０】 実施例６ ５’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（メトキシカルボニルメチ
レン）−アデノシン（１８） 粗物質としての２’−Ｏ−（メトキシカルボニルメチレン）アデノシン（２３
ｇ，６７．８ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（５００ｍｌ）中に溶解して、ｔ−ブチ
ルジフェニルシリルクロリド（２１．２ｍｌ，８１．３ｍｍｏｌ）を加えて、反
応混合物を周囲温度において１５時間撹拌した。溶媒を真空下で２５０ｍｌ量に
なるまで蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）を加えて、この溶液を水（２００ｍｌ）
によって、次にブライン（１００ｍｌ）によって洗浄して、ＭｇＳＯ4によって
乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させて、残渣を得て、この残渣を最少量のＥｔ
ＯＡｃ（４０ｍｌ）中に溶解して、この溶液をヘキサンの激しく撹拌した溶液（
４Ｌ）に滴加して、沈殿を得た。混合物を１２時間沈降させて、この時間後に、
上澄み液をデカントし、固体を濾過して、ヘキサンによって２回洗浄して、標題
化合物を固体（４６．６８ｇ）として得た。生成物の小部分をカラムクロマトグ
ラフィーによって精製して、特徴付けた。
【０１３１】
【数６】
【０１３２】 実施例７ ５’−Ｏ−［（２，２−ジメチル−１，１−ジフェニル−１−シラプロポキシ）
メチル］−２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミノ）カルボニル
メチレン）アデノシン（１９ａ） 無水ＤＭＦ（２１ｍｌ）中に溶解した化合物１８（２．４４ｇ，４．２２ｍｍ
ｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（７．８１ｍｌ，７１ｍｍｏｌ）を
周囲温度において２０時間撹拌しながら加えた。この反応混合物を蒸発させて、
得られた油状物をＥｔＯＡｃ（４２０ｍｌ）中に溶解し、有機層を水によって３
回（３ｘ５０ｍｌ）、ブラインによって洗浄し、有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥さ
せ、溶媒を真空下で蒸発させて、２．４０ｇ（９０％）の標題化合物を白色固体
として得た。
【０１３３】
【数７】
【０１３４】 実施例８ ２’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−Ｎ−（２−メ
チルチオエチル）−アセトアミド）−５−メチルウリジン（６２） 化合物４（８４１ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（４．０ｍｌ）中に
溶解して、２−メチルチオエチルアミン（０．６２２ｍｌ，６．６５ｍｍｏｌ）
を加えて、周囲温度において２０時間撹拌した後に、溶媒を２８℃において真空
下で蒸発させて、油状物を得て、これをＥｔＯＡｃ（８５ｍｌ）中に溶解した。
有機相を水（３ｘ１０ｍｌ）、ブライン（１０ｍｌ）によって洗浄し、ＭｇＳＯ 4 によって乾燥させた。溶媒を３５℃において真空下で蒸発させて、泡状物を得
て、これをフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、７９０ｍｇ（８６
％）の標題化合物を白色泡状物として得た。
【０１３５】
【数８】
【０１３６】 実施例９ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン−５−メチルウリジ
ン−３’−Ｏ−スクシネート（４ａ） 化合物４（０．２５ｇ，０．３８ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．０５７ｇ，
０．５７ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（０．０２３ｇ，０．１９ｍｍ
ｏｌ）と混合した。この混合物を真空下、４０℃においてＰ2Ｏ5上で一晩乾燥さ
せた。乾燥した物質をジクロロメタン（１ｍｌ）中に溶解し、トリエチルアミン
（０．１０６ｍｌ，０．７６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、周囲温度において
４時間撹拌しながら加えた。この反応をジクロロメタン（３０ｍｌ）によって希
釈し、１０％クエン酸（氷冷，３０ｍｌ）と水（３０ｍｌ）とによって洗浄した
。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で蒸発させた。得られた泡
状物を溶離剤としてメタノール：ジクロロメタン：ピリジン（１／８．９／０．
１，ｖ／ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって精製
して、０．２ｇ（７１％）の標題化合物を白色泡状物として得た。
【０１３７】
【数９】
【０１３８】 実施例１０ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン−５−メチルウリジ
ン−３’−Ｏ−スクシニル−ＣＰＧ（４ｂ） ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，０．６４ｍｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリア
ゾール−１−イル）−１，２，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレ
ート（ＴＢＴＵ，０．８３ｇ，０．２６ｍｍｏｌ）及び４−メチルモルホリン（
０．５３ｇ，０．５２ｍｍｏｌ）を、真空下においてＰ2Ｏ5上で乾燥させた化合
物４ａ（０．１９ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）に加えた。この混合物が透明な溶液に
なるまで、この混合物を渦流させた。無水ＤＭＦ（２．２ｍｌ）と活性化ＣＰＧ
（１．１３ｇ，１１５．２μｍｏｌ／ｇ）とを加えて、シェーカー上で１８時間
振とうさせた。この混合物を濾過し、官能化したＣＰＧ(functionalized CPG)を
ＤＭＦ、ジクロロメタン及びジエチルエーテルによって徹底的に洗浄した。ＣＰ
Ｇを真空下でＰ2Ｏ5上で乾燥させた。ＣＰＧ上の非官能化部位にキャップするた
めに、ＣＰＧをキャッピング試薬(capping reagent)（Ｃａｐ Ａ＝２ｍｌ，Ｃ
ａｐ Ｂ＝２ｍｌ，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）
と混合して、シェーカー上で２時間振とうさせた。次に、これを濾過して、アセ
トニトリルとジエチルエーテルとによって洗浄して、官能化ＣＰＧ（２００ｍｇ
）を得た。真空下で乾燥させた後に、負荷容量(loading capacity)を測定した（
１．２０ｇ，４５．３４ｍｍｏｌ／ｇ）。
【０１３９】 実施例１１ 少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有する修飾オ
リゴヌクレオチド（２２）の一般的合成方法 ホスホロアミダイト５を無水アセトニトリル中に溶解して、０．１Ｍ溶液を得
て、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ）上に負荷して、オリゴヌクレオチドを合成する。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
によって供給されたプロトコールをこの合成に用いる。アミダイト５のカップリ
ングのために、カップリング時間を１０分間に延長して、この工程を２回実施し
た。カップリング効率は９５％より大きかった。アセトニトリル中の（１Ｒ）−
（−）−（１０−カンファースルホニル）オキサジリジン（ＣＳＯ）（０．５Ｍ
）の溶液を酸化剤として用いた。２’−デオキシホスホロアミダイトと、この合
成に用いる全ての他の試薬とはＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｉｎｃ．からのものであった。 種々なアミンを用いて、以下のセクションにお
いて述べるようにオリゴヌクレオチドを官能化した。
【０１４０】 実施例１２ 少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチルアセトアミド
］修飾を有する修飾オリゴヌクレオチド（２３）の一般的合成方法 ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰＧ結合オリゴヌク
レオチド２２をメタノール中の５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン中に懸
濁させて、周囲温度に２４時間維持する。これらの条件下で、アミンコンジュゲ
ーションがメトキシ基の求核性置換によって生じた。同時に、オリゴヌクレオチ
ドはＣＰＧから脱保護され、環外アミノ及びリン酸基上の保護基も除去された。
得られた混合物を蒸発乾燥させて、５’−Ｏ−ＤＭＴ含有オリゴヌクレオチドを
得て、これをＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃ−４，７．８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０
ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセトニトリル５〜６
０％Ｂ，５５分間中，流量２．５ｍｌ／分，λ２６０ｎｍ）によって精製した。
８０％酢酸水溶液による脱トリチル及び蒸発と、その後のＷａｔｅｒｓＣ−４カ
ラム上でのＨＰＬＣによる脱塩とが修飾オリゴヌクレオチド（配列番号１〜４）
を生じた。オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ、ＣＧＥ及び質量分析によって分析し
た。
【０１４１】
【表１】
【０１４２】
【表２】
【０１４３】 ΔＴｍ／ｍｏｄは第１欄ではＲＮＡ対非修飾ＤＮＡ／℃に対してであり、第２
欄ではＲＮＡ対非修飾デオキシホスホロチオエートＤＮＡ／℃に対してである。 実施例１３ 少なくとも１つの２’−Ｏ−［（Ｎ−メチル）−アセトアミド］修飾を有する修
飾オリゴヌクレオチド（２４）の一般的合成方法 ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰＧ結合オリゴヌク
レオチド（２２）を水中の４０％Ｎ−メチルアミンによって周囲温度において２
４時間処理した、これは固体支持体からの結合オリゴヌクレオチドの切断も行な
う（表ＩＩＩ）。同時に、環外アミノ及びリン酸基上の保護基が除去された。混
合物を蒸発乾燥させて、５’−Ｏ−ＤＭＴ含有オリゴヌクレオチドを得た。オリ
ゴヌクレオチドをＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃ−４，７．８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝
５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセトニトリル５
〜６０％Ｂ，５５分間中，流量２．５ｍｌ／分，λ２６０ｎｍ）によって精製し
、８０％酢酸水溶液によって脱トリチルし、ＷａｔｅｒｓＣ−４カラム上でのＨ
ＰＬＣによって脱塩して、最終修飾オリゴヌクレオチドを得た。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】 実施例１４ 少なくとも１つの２’−Ｏ−アセトアミド修飾を有する修飾オリゴヌクレオチド
（２５）の一般的合成方法 ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰＧ結合オリゴヌク
レオチドを飽和メタノール性アンモニアによって処理し、５５℃において１２時
間加熱して、２’−Ｏ−アセトアミド含有オリゴヌクレオチド（表ＩＶ）を得た
。これらの条件下で、オリゴヌクレオチドはＣＰＧから脱保護されて、環外アミ
ノとリン酸基上の保護基も除去された。混合物を蒸発乾燥させて、５’−Ｏ−Ｄ
ＭＴ含有オリゴヌクレオチドを得た。粗オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ（Ｗａｔ
ｅｒｓ，Ｃ−４’，７．８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭトリエチルアンモニウム
アセテート，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセトニトリル５〜６０％Ｂ，５５分間中，流量２
．５ｍｌ／分，λ２６０ｎｍ）によって精製し、８０％酢酸水溶液によって脱ト
リチルし、ＷａｔｅｒｓＣ−４カラムを用いるＨＰＬＣによって脱塩して、修飾
オリゴヌクレオチドを得た。
【０１４６】
【表４】
【０１４７】 実施例１５ 少なくとも１つの２’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジエチル）−アセトアミド］修飾を有
する修飾オリゴヌクレオチド（２６）の一般的合成方法 ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰＧ結合オリゴヌク
レオチドをジエチルアミン（２ｍｌ）によって周囲温度において２４時間処理し
て、２’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）アセトアミドオリゴヌクレオチドを得る。
これらの条件下で、オリゴヌクレオチドはＣＰＧから脱保護されて、環外アミノ
とリン酸基上の保護基も除去される。混合物をさらに蒸発乾燥させて、５’−Ｏ
−ＤＭＴ含有オリゴヌクレオチドを得た。オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ（Ｗａ
ｔｅｒｓ，Ｃ−４，７．８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭトリエチルアンモニウム
アセテート，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセトニトリル５〜６０％Ｂ，５５分間中，流量２
．５ｍｌ／分，λ２６０ｎｍ）によって精製し、８０％酢酸水溶液を用いて脱ト
リチルし、ＷａｔｅｒｓＣ−４カラムを用いるＨＰＬＣによって脱塩して、修飾
オリゴヌクレオチドを得る。
【０１４８】 実施例１６ 少なくとも１つのコンジュゲート化スペルミン基(conjugated spermine group)
を有する修飾オリゴヌクレオチド（２７）の一般的合成方法 少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰ
Ｇ結合オリゴヌクレオチド（２２）をメタノール中スペルミン（１Ｍ）の溶液中
に懸濁させ、周囲温度に２４時間維持した。メトキシ基を求核性置換によりスペ
ルミンによって置換した、これらの条件下で修飾オリゴヌクレオチドはＣＰＧか
ら切断され、環外アミノとリン酸基も除去された。溶媒を蒸発によって除去して
、５’−Ｏ−ＤＭＴ含有オリゴヌクレオチドを得た。修飾オリゴヌクレオチドを
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムに通すことによって、過剰なスペルミンを除去
した。オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃ−４，７．８ｘ３００
ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセト
ニトリル５〜６０％Ｂ，５５分間中，流量２．５ｍｌ／分，λ２６０ｎｍ）によ
ってさらに精製し、８０％酢酸水溶液を用いて脱トリチルし、ＷａｔｅｒｓＣ−
４カラムによるＨＰＬＣを用いて脱塩して、スペルミン修飾オリゴヌクレオチド
を得た。
【０１４９】 実施例１７ 少なくとも１つのコンジュゲート化スペルミジン基(conjugated spermidine gro
up)を有する修飾オリゴヌクレオチド（２８）の一般的合成方法 少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰ
Ｇ結合オリゴヌクレオチド（２２）をメタノール中スペルミジン（１Ｍ）の溶液
中に懸濁させ、周囲温度に２４時間維持した。メトキシ基を求核性置換によりス
ペルミジンによって置換した、これらの条件下で修飾オリゴヌクレオチドはＣＰ
Ｇから切断され、環外アミノとリン酸基も除去された。溶媒を蒸発によって除去
して、５’−Ｏ−ＤＭＴ含有オリゴヌクレオチドを得た。修飾オリゴヌクレオチ
ドをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムに通すことによって、過剰なスペルミジン
を除去した。オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃ−４，７．８ｘ
３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート，ｐＨ＝７，Ｂ＝
アセトニトリル５〜６０％Ｂ，５５分間中，流量２．５ｍｌ／分，λ２６０ｎｍ
）によってさらに精製し、８０％酢酸水溶液を用いて脱トリチルし、Ｗａｔｅｒ
ｓＣ−４カラムによるＨＰＬＣを用いて脱塩して、スペルミジン修飾オリゴヌク
レオチドを得た。
【０１５０】 実施例１８ 少なくとも１つのコンジュゲート化ペプチド基(conjugated peptide group)を有
する修飾オリゴヌクレオチド（２９）の一般的合成方法 少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰ
Ｇ結合５’−Ｏ−ＤＭＴ−オリゴヌクレオチドをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
）中オリゴペプチド（０．１Ｍ）（例えば、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ；Ｌｙｓ−
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ；及びＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを包含する）の溶液中に
懸濁させ、周囲温度に２４時間維持する。ＤＭＦを蒸発させ、残渣を水酸化アン
モニウム水溶液（２ｍｌ）と混合し、５５℃において６時間加熱した。混合物を
蒸発乾燥させて、５’−Ｏ−ＤＭＴ含有オリゴヌクレオチドを得た。修飾オリゴ
ヌクレオチドをＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃ−４，７．８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５
０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセトニトリル５〜
６０％Ｂ，５５分間中，流量２．５ｍｌ／分，λ２６０ｎｍ）によって精製し、
８０％酢酸水溶液を用いて脱トリチルし、ＷａｔｅｒｓＣ−４カラムによるＨＰ
ＬＣを用いて脱塩して、ペプチド修飾オリゴヌクレオチドを得た。
【０１５１】 実施例１９ 少なくとも１つのコレステロール基を有する修飾オリゴヌクレオチド（３０）の
一般的合成方法 ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰＧ結合オリゴヌク
レオチド（実施例１０等参照）に、クロロホルムとエタノールとの混合物中のコ
レステロールヘキシルアミンコンジュゲートの溶液を加える。この混合物を室温
に数時間維持する。反応の進行をＨＰＣＬによってモニターする。反応が完成ま
で進行したときに、生成物を標準プロトコールに従って脱保護して、コンジュゲ
ート化オリゴヌクレオチド３０を得る。
【０１５２】 実施例２０ 葉酸コンジュゲート化５−メチルウリジン（３１） ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰＧ結合オリゴヌク
レオチド（実施例１０等参照）に、ＤＭＦ中のヘキシルアミンコンジュゲート化
葉酸の溶液をを加える。この反応混合物を室温に維持し、ＨＰＬＣによってモニ
ターする。反応の完成時に、生成物を標準プロトコールに従って脱保護し、精製
して、コンジュゲート化オリゴヌクレオチド３１を得る。
【０１５３】 実施例２１ ５−メチル−テトラヒドロ葉酸コンジュゲート化５−メチルウリジン（３２） ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰＧ結合オリゴヌク
レオチド（実施例１０等参照）に、ＤＭＦ中のヘキシルアミンコンジュゲート化
５−メチルテトラヒドロ葉酸の溶液を加える。この反応混合物を室温に維持し、
ＨＰＬＣによってモニターする。反応の完成時に、生成物を標準プロトコールに
従って脱保護し、精製して、コンジュゲート化オリゴヌクレオチド３２を得る。
【０１５４】 実施例２２ ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレンアデノシン（４１） 水素化ナトリウム（４．８６ｇ，１．３当量，１２２ｍＭ，鉱油中６０％分散
液）をヘキサンによって洗浄して、−５０℃におけるＤＭＦ（９００ｍｌ）中に
溶解したアデノシン（２５ｇ，９３．５ｍＭ）の混合物に２回に分けて加えて、
外側温度が−３０℃になるまで撹拌した。この混合物を−５０℃に再び冷却して
、この反応にメチル−２−ブロモアセテートを滴加した。この反応が室温に温度
上昇するまで、この反応を撹拌した。さらに１時間後に、このＮａＨをＭｅＯＨ
（１００ｍｌ）によってクエンチした。次に、この混合物を酢酸エチル（ＥｔＯ
Ａｃ）との同時蒸発によって泡状物になるまで濃縮した。次の合成工程のために
さらなる精製は不要であった。
【０１５５】
【数１０】
【０１５６】 ２Ｄ ＴＯＣＳＹ ＮＭＲは、ＯＨに対する２’水素の２Ｄ相互関係を示さない
ことによって２’アルキル化生成物を実証し、３’水素と３’−ＯＨとの間の相
互関係を見出した。ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ［ＭＨ］+３４０．１２５７（Ｃ1 3 Ｈ17Ｎ5Ｏ6は３３９．１１７８を必要とする）。
【０１５７】 実施例２３ ５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレンアデノシン（
４２） 実施例２２からの２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレンアデノシン（４１）
（約２３ｇ）を乾燥ピリジン（５００ｍｌ）中に溶解して、ｔ−ブチルクロロジ
フェニルシラン（ＴＢＤＰＳｉ−Ｃｌ）（２１．１５ｍｌ，１．２当量，８１．
３４ｍＭ）を加えた。この反応を一晩撹拌し、ｔｌｃによって判定したときに、
反応は完成に達した。次に、反応の溶媒量を真空下で約半分（〜２５０ｍｌ）ま
でに減少させ、残部をＥｔＯＡｃとＨ2Ｏとに分配した。生成物をＥｔＯＡｃ中
に抽出し、これをブライン（１００ｍｌ）によって１回洗浄し、ＭｇＳＯ4によ
って乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。次に、残渣を最少量のＥｔＯＡｃ
（〜４０ｍｌ）中に溶解し、４リットルの激しく撹拌した乾燥エチルエーテル（
Ｅｔ2Ｏ）中に徐々に滴下した。生成物は溶液混合物から沈殿した。混合物を一
晩沈降させ、この時点で溶媒をデカントした。後に残された固体を濾過によって
回収し、Ｅｔ2Ｏによって洗浄した。４６．６８ｇの粗生成物固体が回収された
。
【０１５８】
【数１１】
【０１５９】 実施例２４ ５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミ
ノ）カルボニル−メチレン）アデノシン（４３） 化合物４２（２．４４ｇ，４．２２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２１ｍｌ）中に
溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（７．８１ｍｌ，７１ｍｍｏｌ）を
加え、反応混合物を周囲温度において２０時間撹拌した。混合物を濃縮して、油
状物を得て、これをＥｔＯＡｃ（４２０ｍｌ）中に溶解し、有機層を水（３ｘ５
０ｍｌ）、ブライン（１ｘ５０ｍｌ）によって洗浄し、この有機層をＭｇＳＯ4
によって乾燥させ、溶媒を真空下で蒸発させて、２．４０ｇ（９０％）の標題化
合物を白色固体として得た。
【０１６０】
【数１２】
【０１６１】 実施例２５ ５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミ
ノ）カルボニル−メチレン）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（４４） 化合物４３（２３．２１ｇ，１４．７１ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１６０ｍ
ｌ）中に溶解し、氷浴中で冷却した。クロロトリメチルシラン（１１．７８ｍｌ
，９２．８４ｍｍｏｌ）を滴加し、反応を３０分間撹拌し、この時点でベンゾイ
ルクロリド（１０．８７ｍｌ，９２．８４ｍｍｏｌ）を反応に滴加した。３０分
間後に、氷浴を除去し、反応を３時間撹拌した。この反応をもう一度氷浴中で冷
却した。水（３２ｍｌ）を加え、続いて、３０分間後に濃ＮＨ4ＯＨ（３２ｍｌ
）を加えた。１時間後に、反応を水と酢酸エチルと（２００／２００ｍｌ）に分
配した。水層を酢酸エチル（５０ｍｌ）によってさらに２回抽出した。酢酸エチ
ル抽出物をプールし、ブライン（５０ｍｌ）によって１回洗浄し、ＭｇＳＯ4に
よって乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて、油状物を得た。得られた粗物質
を溶離剤としてＥｔ2Ｎ：ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ：ＣＨＣｌ3（２／５／６０／３
３，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって
精製した。適当なフラクションを回収し、真空下で濃縮して、１５．１３ｇ（８
８％）の標題化合物を得た。
【０１６２】
【数１３】
【０１６３】 実施例２６ ２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミノ）カルボニルメチレン）
−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（４５） ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフルオリド（７０ｍｌ，７０．１５ｍｍ
ｏｌ，１Ｍ）をＴＨＦ（２００ｍｌ）中に溶解した化合物４４（１４．８２ｇ，
２３．３８ｍｍｏｌ）に撹拌しながら加えた。４時間後に、ｔｌｃによって実証
されるように、反応は完成に達した。溶媒を蒸発させて、黄色を帯びた橙色油状
物を残し、これを溶離剤としてＥｔ2Ｎ：ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3（３／５／９２，
ｖ／ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって精製した
。適当なフラクションをプールし、濃縮して、７．０６ｇ（６０％）の標題化合
物を得た。
【０１６４】
【数１４】
【０１６５】 実施例２７ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミノ）カ
ルボニルメチレン）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（４６） 化合物４５（７．０９ｇ，１５．７７ｍｍｏｌ）をピリジンと３回同時蒸発さ
せてから、乾燥ピリジン（２５０ｍｌ）中に溶解した。４，４’−ジメトキシト
リチルクロリド（６．９５ｇ，２０．５０ｍｍｏｌ）を２回に分けて反応混合物
に加えた。２０時間目のＴＬＣは反応が完成したことを示した。真空下での蒸発
によって溶媒量を半分に減少させた。残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）と水（２
００ｍｌ）とに分配した。水相をＥｔＯＡｃ（２ｘ５０ｍｌ）によって抽出した
。このＥｔＯＡｃをプールし、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮
した。残渣を溶離剤としてのＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3（５／９５，ｖ／ｖ）を用い
て溶出しながら(luting)シリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって精製し
た。適当なフラクションを回収し、濃縮して、６．３３ｇ（５６％）の標題化合
物を得た。
【０１６６】
【数１５】
【０１６７】 実施例２８ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミノ）カ
ルボニルメチレン）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン−３’−（２−シアノエチル
−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（４７） ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）中に溶解した化合物４６とジイソプロピルアミンテ
トラゾリド（１．１９ｇ，６．９５ｍｍｏｌ）との混合物に、２−シアノエチル
−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（２．４１ｍｌ
，７．５９ｍｍｏｌ）を一晩撹拌しながら滴加した。この反応をＥｔＯＡｃ（２
００ｍｌ）によって希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3（１００ｍｌ）によって２回抽出
してから、ブライン（１００ｍｌ）によって１回洗浄した。このＥｔＯＡｃを次
にＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を最少量のＣＨ2Ｃｌ2（５
ｍｌ）中に溶解し、激しく撹拌しながら、乾燥ヘキサン（２５０ｍｌ）を加えて
、標題化合物を沈殿させた。溶媒を沈殿からデカントして、残渣を真空下で乾燥
させ、沈殿をもう一度繰り返して、５．９１ｇ（９３％）の標題化合物を得た。 31 Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１５１．０８及び１５１．４１。
【０１６８】 実施例２９ ５’−ＴＢＤＰＳｉ−２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミノ）
カルボニルメチレン）−グアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルホスホロアミダイト）（４８） 上記実施例２２に例示した方法に従って、グアノシンをメチル−２−ブロモア
セテートと反応させた。得られた２’−Ｏ−（メトキシカルボニルメチレン）グ
アノシン（４８ａ）を上記実施例２３に例示した方法に従って処理して、５’−
Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−２’−Ｏ−（メトキシカルボニルメチレン）グアノシン（４
８ｂ）を得た。ＤＭＦ（２００ｍｌ）中に溶解した５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−２
’−Ｏ−（メトキシカルボニルメチレン）グアノシン（２０ｇ，３３．６９ｍｍ
ｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（３６．９８ｍｌ，３３７ｍｍｏｌ
）を、一晩撹拌しながら、滴下ロートから加えた。溶媒量を真空下で半分に減少
させ、得られた混合物をＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）と水（５００ｍｌ）とに分配
した。この水をさらにＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）によって２回抽出した。このＥ
ｔＯＡｃをプールし、水（１００ｍｌ）によって２回、ブライン（１００ｍｌ）
によって１回洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。ＥｔＯＡｃ
の蒸発中に、白色沈殿が形成され、これを濾過した。次に、濾液を真空下で濃縮
して、黄色を帯びた泡状物を得た。沈殿と泡状物とのプロトンＮＭＲは所望の生
成物構造と一致した。一緒にした生成物フラクションは１８．２０ｇ（８３％）
の標題化合物を生じた。
【０１６９】
【数１６】
【０１７０】 実施例３０ ５’−Ｏ−［（２，２−ジメチル−１，１−ジフェニル−１−シラプロポキシ）
メチル］−２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミノ）カルボニル
メチレン）−Ｎ２−イソブトリルグアノシン（４９） 化合物４８（７．０５ｇ，１０．８５ｍｍｏｌ）を１３０ｍｌのピリジン中に
溶解し、氷浴中で冷却した。クロロトリメチルシラン（５．５１ｍｌ，４３．４
０ｍｍｏｌ）を滴加し、反応混合物を０℃において３０分間撹拌して、この時点
においてイソブチリルクロリド（７．２０ｍｌ，４３．４０ｍｍｏｌ）を反応混
合物に滴加し、１時間撹拌してから、氷浴を除去した。この反応混合物をさらに
３時間撹拌して、この時点において反応を氷浴中で冷却して、Ｈ2Ｏ（２６ｍｌ
）を３０分間撹拌しながら加えた。濃ＮＨ4ＯＨ（２６ｍｌ）を１時間撹拌しな
がら加えて、この時点でＴｌｃは反応が完成まで進行したことを実証した。この
反応混合物をＥｔＯＡｃ（２５０ｍｌ）とＨ2Ｏ（２５０ｍｌ）とに分配した。
有機相を水（１００ｍｌ）によって２回抽出して、ブライン（１００ｍｌ）によ
って洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。乾燥によって６．７
１ｇ（８６％）の標題化合物を得た。この物質をさらに精製せずに用いた。
【０１７１】
【数１７】
【０１７２】 実施例３１ ２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミノ）カルボニルメチレン）
−Ｎ２−イソブトリルグアノシン（５０） ＴＨＦ（１００ｍｌ）中に溶解した化合物４９（７．８９，１０．９６ｍｍｏ
ｌ）に、ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフルオリド（３２．８８ｍｌ，３
２．８８ｍｍｏｌ，１Ｍ）を一晩撹拌しながら加えた。この混合物のｔｌｃは反
応の完成を示した。溶媒を真空下で除去して、残渣をシリカゲル・カラムクロマ
トグラフィーによって精製した。適当なフラクションの濃縮によって、アンモニ
ウム塩に関連した少量の不純物を有する４．９３ｇ（９２％）の標題化合物を得
た。
【０１７３】
【数１８】
【０１７４】 実施例３２ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミノ）カ
ルボニルメチレン）−Ｎ２−イソブトリルグアノシン（５１） 乾燥ピリジン（７０ｍｌ）中に溶解した化合物５０（４．９３ｇ，１．０２ｍ
ｍｏｌ，未加工）の溶液に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４．８３
ｇ，１４．２５ｍｍｏｌ）を１回で加えて、一晩撹拌した。この反応はｔｌｃに
よって実証されるように完成まで進行した。溶媒を２／３量まで減少させ、Ｅｔ
ＯＡｃ（２００ｍｌ）と水（２００ｍｌ）とに分配した。この水をＥｔＯＡｃ（
５０ｍｌ）によって２回抽出した。このＥｔＯＡｃをプールして、ブライン（１
００ｍｌ）によって１回洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。
残渣を３つのシリカゲル・カラム（第１カラム：３％Ｅｔ2Ｎ／１０％ＭｅＯＨ
／ＣＨＣｌ3，第２及び第３カラム：１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3）に通して、最
少量のテトラブチルアンモニウム塩とトリエチルアミン不純物を含有する３．４
４ｇ（４０％）の標題化合物を得た。
【０１７５】
【数１９】
【０１７６】 実施例３３ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンアミノ）カ
ルボニルメチレン）−Ｎ２−イソブトリルグアノシン−３’−（２−シアノエチ
ル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（５２） 乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中に溶解した化合物５１（２．８８ｇ，３．６７ｍｍｏｌ）の
溶液とジイソプロピルアミンテトラゾリド（６９２ｍｇ，４．０４ｍｍｏｌ）と
に、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミ
ダイト（１．４０ｍｌ，４．４１ｍｍｏｌ）を一晩撹拌しながら加えた。この反
応はｔｌｃによって実証されるように完成まで進行した。反応をＥｔＯＡｃ（１
００ｍｌ）によって希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3（５０ｍｌ）によって２回抽出し
、ブライン（５０ｍｌ）によって１回洗浄した。この混合物をＭｇＳＯ4上で乾
燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（４ｍｌ）中に溶解し、アミ
ダイトを沈殿させるために加えたヘキサン（２００ｍｌ）と共に激しく撹拌した
。この沈殿を２回行なって、３．１５ｇ（８７％，テトラブチルアンモニウム塩
不純物を含む）を得た。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１４８．７０ｐｐｍ及
び１４９．９１ｐｐｍ。
【０１７７】 実施例３４ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）−５−メ
チルウリジン（５３） ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン−５−メチルウリ
ジン（化合物４）（１．００ｇ，１．５８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ中の２．０Ｍジ
メチルアミン中に溶解し、反応フラスコをセプタム(septum)によってシールし、
反応混合物を周囲温度において１８時間撹拌した。溶媒を真空下、周囲温度にお
いて蒸発させて、０．９７ｇ（９５％）の標題化合物を泡状物として得た。
【０１７８】
【数２０】
【０１７９】 実施例３５ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）−５−メ
チルウリジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロア
ミダイト）（５４） ＣＨ2Ｃｌ2（１４ｍｌ）中に溶解した化合物５３（９１４ｍｇ，１．４２ｍｍ
ｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルアミンテトラゾリド（１４６ｍｇ，０．８６ｍ
ｍｏｌ）と２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホ
ロジアミダイト（０．５４ｍｌ，１．７０ｍｍｏｌ）とを加えた。追加の３回分
の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミ
ダイト（３ｘ０．５４ｍｌ，１．７０ｍｍｏｌ）を１０時間にわたって加えた。
ＥｔＯＡｃ（１２０ｍｌ）を加えて、真空下での蒸発によって量を約１５ｍｌの
溶媒だけ減少させた。有機相を飽和ＮａＨＣＯ3（３ｘ１２ｍｌ）によって、次
にブライン（２ｘ１２ｍｌ）によって洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。溶媒
を真空下、２７℃において蒸発させて、油状物を得て、これをＣＨ2Ｃｌ2（４ｍ
ｌ）中に溶解し、次に、急激に撹拌したこの溶液に滴下ロートからヘキサン（２
００ｍｌ）を徐々に加えて、ワックスを得た。上澄み液をデカントし、ワックス
をヘキサンによって３回洗浄して、洗浄液をデカントした。沈殿をさらに２回繰
り返して、白色ワックスを得て、これを真空下、周囲温度において乾燥させて、
１．０９ｇ（９１％）の標題化合物を泡状物として得た。
【０１８０】
【数２１】
【０１８１】 実施例３６ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−
アセトアミド）−５−メチルウリジン（５５） 無水ＴＨＦ（６６ｍｌ）中に溶解した化合物１（５．３７８ｇ，８．５０ｍｍ
ｏｌ）の溶液にＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（１８．７ｍｌ，１７０ｍｍ
ｏｌ）を、周囲温度において６時間撹拌しながら、加えた。トルエン（８０ｍｌ
）を加え、溶媒を真空下で蒸発させて、６．１２ｇ（９５％）の標題化合物を白
色泡状物として得た。
【０１８２】
【数２２】
【０１８３】 実施例３７ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−
アセトアミド）−５−メチルウリジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピルホスホロアミダイト）（５６） ＣＨ2Ｃｌ2（６０ｍｌ）中に溶解した、無水ピリジン（２ｘ７５ｍｌ）との同
時蒸発によって乾燥させた化合物５５（５．７５４ｇ，８．３５ｍｍｏｌ）の溶
液に、ジイソプロピルアミンテトラゾリド（７１５ｍｇ，４．１８ｍｍｏｌ）と
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダ
イト（３．１８ｍｌ，１０．０２ｍｍｏｌ）とを加えた。この反応混合物を１３
時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（４２０ｍｌ）を加えた。溶媒量を真空下での蒸発によ
って約６０ｍｌだけ減少させた。有機相を半飽和ＮａＨＣＯ3（３ｘ８０ｍｌ）
によって、次にブライン（２ｘ４０ｍｌ）によって洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥
させた。溶媒を真空下、２７℃において蒸発させて、油状物を得て、これをトル
エン（２ｘ３００ｍｌ）と共に同時蒸発させた。得られた泡状物をＣＨ2Ｃｌ2（
２０ｍｌ）中に溶解し、次に、急激に撹拌したこの溶液に滴下ロートからヘキサ
ン（１０００ｍｌ）を徐々に加えて、ワックスを得た。上澄み液をデカントし、
ワックスをヘキサンによって３回洗浄して、洗浄液をデカントした。沈殿をさら
に１回繰り返して、白色ワックスを得て、これを真空下、周囲温度において乾燥
させて、６．６０ｇ（８９％）の標題化合物を泡状物として得た。31Ｐ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3）：δ１５１．５，１５１．０。
【０１８４】 実施例３８ ２’−Ｏ−（２−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−アセトアミド）−５
−メチルウリジン（５７） 無水ＤＭＦ（１７８ｍｌ）中に溶解した化合物３（１１．４６ｇ，３４．７ｍ
ｍｏｌ）に、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（５０ｍｌ，４５６ｍｍｏｌ）
を、周囲温度において１６時間撹拌しながら、加えた。溶媒を真空下で蒸発させ
て、油状物を得て、これにｐ−キシレン（２００ｍｌ）を加えた。溶媒を真空下
で蒸発させて、１５．６４ｇの標題化合物を泡状物として得た。この粗生成物の
少量（２３０ｍｇ）をＥｔ2Ｏ（３ｘ５ｍｌ）と共に磨砕して、白色固体を得て
、これを分析データのために用いた。
【０１８５】
【数２３】
【０１８６】 実施例３９ ２’−Ｏ−２−アセトアミド−５−メチルシチジン（５８） 化合物５７（１３．４ｇ，３４．７ｍｍｏｌ）を、確立された文献方法に従っ
て、シチジン誘導体に転化させた（Ｄｉｖａｋａｒ，Ｋ．，Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ
．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋ．，Ｔｒａｎｓ Ｉ，１９８２，１１７１
）。メタノール性アンモニアによる生成物の最終処理は白色沈殿を生じた、これ
を濾過し、ＭｅＯＨによって洗浄して、２．１８６ｇの標題化合物を白色固体と
して得た。
【０１８７】
【数２４】
【０１８８】 実施例４０ ２’−Ｏ−（２−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−アセトアミド）−５
−メチルシチジン（５９） 化合物５８（３１４ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を熱ＤＭＦ（４．４ｍｌ）に溶解
し、次にＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（４．４ｍｌ，４０ｍｍｏｌ）を、
１００℃において１６時間撹拌し、加熱しながら加えた。溶媒を真空下で蒸発さ
せて、少量の液体（３ｍｌ）を得て、これにＥｔ2Ｏ（２５ｍｌ）を徐々に加え
て、油状物を得た。上澄み液をデカントして、油状物をＭｅＯＨ（１ｍｌ）中に
溶解し、Ｅｔ2Ｏ（５０ｍｌ）を撹拌しながら徐々に加えて、油状物を得た。上
澄み液をデカントし、生成物を真空下で蒸発させて、３２８ｍｇ（８５％）の標
題化合物を泡状物として得た。
【０１８９】
【数２５】
【０１９０】 実施例４１ ５−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アセトアミド］−３’−Ｏ
−スクシニル−５−メチルウリジン（６０） 化合物５３（０．２ｇ，０．３ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．０６ｇ，０．
６１ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（０．０４ｇ，０．３８ｍｍｏｌ）
と共に混合した。この混合物を真空下でＰ2Ｏ5上において一晩乾燥させた。ジク
ロロエタン（０．９ｍｌ）を加えて、反応混合物を周囲温度において４時間撹拌
した。ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）を加えて、有機層を氷冷クエン酸水溶液（１０％
溶液，４０ｍｌ）とブライン（４０ｍｌ）とによって洗浄した。有機相を無水Ｎ
ａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濃縮乾燥させて、０．２２ｇ（９６％）の標題化合物を
泡状物として得た。
【０１９１】
【数２６】
【０１９２】 実施例４２ ５−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アセトアミド］−３’−Ｏ
−スクシニル−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシニル−ＣＰＧ（６１） 真空下で一晩乾燥させた化合物６０（０．２２ｇ，０．２９ｍｍｏｌ）に無水
ＤＭＦ（０．９ｍｌ）を加え、続いて２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１イル
）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（０．１ｇ
，０．３ｍｍｏｌ）と４−メチルモルホリン（６５μｌ，０．５９ｍｍｏｌ）と
を渦流させながら加えて、透明な溶液を得た。ＣＰＧ（１．２８ｇ，１１８．９
μｍｏｌ／ｇ，粒度８０／１２０，平均孔径５６９Å）を加えて、シェーカー上
で周囲温度において１８時間振とうさせた。アリコートを取り出し、ＤＭＦ、Ｃ
Ｈ3ＣＮ及びＥｔ2Ｏによって洗浄して、真空下で乾燥させた。負荷容量(loading
capacity)を下記標準方法によって測定した（５８．４６μｍｏｌ／ｇ）。次に
、官能化ＣＰＧをＤＭＦ、ＣＨ3ＣＮ及びＥｔ2Ｏによって洗浄して、真空下で乾
燥させた。ＣＰＧ上の非官能化部位をＴＨＦ中の無水酢酸／コリジン／Ｎ−メチ
ルイミダゾール（ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．か
らの２ｍｌ Ｃａｐ Ａと２ｍｌ Ｃａｐ Ｂ溶液）によってキャップして、シ
ェーカー上で２時間振とうさせた。ＣＰＧを濾過し、ＣＨ3ＣＮとＥｔ2Ｏとによ
って洗浄し、真空下で乾燥させた。最終負荷容量は５７．８９μｍｏｌ／ｇであ
ると測定された。
【０１９３】
【表５】
【０１９４】 実施例４３ ２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）修飾を有するヌクレオシドの調製、 ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチル
アセトアミド）−５−メチルウリジン（６３） ＴＨＦ（８ｍｌ）中に溶解した２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−
５−メチルウリジン（６８）の溶液に、４０％ＮＨ2Ｍｅ−Ｈ2Ｏ（２．２６ｍｌ
，２０ｍｍｏｌ）を、周囲温度において１４時間撹拌しながら、加えた。真空下
、２８℃において溶媒を蒸発させて、泡状物を得て、これをフラッシュクロマト
グラフィーによって精製して、５９９ｍｇ（９５％）の標題化合物を白色泡状物
として得た。
【０１９５】
【数２７】
【０１９６】 ２−ヒドロキシ−Ｎ−メチルアセトアミド（６６） マグネチックスターラー、滴下ロート及び温度計を装備した５Ｌ三つ口フラス
コ中でテトラヒドロフラン（１Ｌ）を氷浴を用いて、１０℃に冷却した。メチル
アミン水溶液（４０％，８２５ｍｌ，１０．６３ｍｏｌ）を加え、エチルグリコ
レート（６５）（Ｓｙｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ，５００ｇ，４．８０ｍｏｌ）を、
１５〜２０℃の内部温度を維持する速度で撹拌しながら徐々に滴下した（約１時
間）。完了時に、ＴＬＣは完成した反応を実証した（出発エステルのＲｆ ０．
８０、生成物 ０．２５、酢酸エチル−メタノール ９：１中、ヨウ素への暴露
時に可視化）。反応を減圧（最後には２５ｍｍ，５０℃において）下で濃縮して
、７５０ｇの油状物を得た。この油状物を無水アセトニトリル（１Ｌ）と共に同
時蒸発させて、４６０ｇの油状物を得た。この油状物にエチルエーテル（１Ｌ）
を加えると、白色固体が発熱的に形成された（注意：エーテルの突沸(boiling o
ver)を防ぐために徐々に加える）。撹拌した後に、スラリーを濾過し、得られた
固体をエーテル（５００ｍｌ）で、次にヘキサン（２ｘ５００ｍｌ）で洗浄して
から、２５℃、１ｍｍにおいて２４時間乾燥させて、一定重量の４１７ｇ（９７
％）の白色の不規則な結晶を得た。
【０１９７】
【数２８】
【０１９８】 ２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−５−メチル−ウリジン（６８） ８Ｌ Ｐａｒｒステンレス鋼圧力反応器に、テトラヒドロフラン中のボラン（
７２０ｍｌ，１．５Ｍ，１．０７ｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（６．４５ｇ
，０．０７６ｍｏｌ）と、２−ヒドロキシ−Ｎ−メチルアセトアミド（４００ｇ
，４．４９ｍｏｌ）とを加えた。水素ガスの発生が停止するまで（約５分間）、
蓋をとって混合物を撹拌した。２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（２
１５．９ｇ，０．８９９ｍｏｌ）を加えて、反応器をシールし、撹拌しながら１
５０℃（約１１０ｐｓｉの圧力での内部温度）に加熱した。２０時間後に、サン
プルを取り出した。ＴＬＣは反応の９０％完成を実証した（出発アンヒドロのＲ
ｆ ０．２０、生成物 ０．２５、酢酸エチル−メタノール ４：１中）。この
反応をさらに４８時間加熱し、周囲温度に冷却させた。ＴＬＣはもはや反応が進
行しないことと、付加的な分解とを実証した。この暗色溶液をデカントし、減圧
下（５０℃，２０ｍｍ）で濃縮して、暗色油状物を得た。水（１Ｌ）を加え、混
合物を１００℃に３０分間加熱して、ボレートエステルを加水分解した。混合物
を前記と同様に濃縮してから、残渣をジクロロメタン−アセトン−メタノールの
混合物（１Ｌ，４０：１０：１）中に溶解し、シリカゲル・カラム（２．５ｋｇ
）上に供給した。生成物を同混合物の４０：１０：１〜６の勾配によって溶出し
た。生成物含有フラクションは出発アミドによって重度に汚染されていた。濃縮
後に、残渣をメタノール（１Ｌ）中に溶解して、周囲温度において２０時間静置
させた。結晶が形成された。フラスコを−１０℃に２時間冷却し、得られた固体
を回収して、白色固体が残留するまでメタノールによって徹底的に洗浄した。こ
の固体を乾燥させ（５０℃，１ｍｍ，２時間）、５１ｇの第１回収生成物を得た
。母液を再カラム処理し、前記と同様に結晶化させて、アミドによってまだ汚染
されている若干の生成物を含めた、さらなる４４．５ｇを得た。ＮＭＲによる約
９７％の推定純度を有する、複合収量９５．５ｇ（３２％）の白色固体。
【０１９９】 小サンプルをメタノールから再結晶させて、微細な白色針状結晶，ｍｐ１９３
〜１９４℃を得た。
【０２００】
【数２９】
【０２０１】 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−５−メチル−ウリジン（６９） ２Ｌ丸底フラスコにおいて、２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチル−アセトアミド）−
５−メチル−ウリジン（９３．０ｇ，０．２８２ｍｏｌ）を無水ピリジン（５０
０ｍｌ）と同時蒸発させてから、同無水ピリジン（１Ｌ）中に溶解した。ジメト
キシトリチルクロリド（９７ｇ，０．２８６ｍｏｌ）を４回に分けて２時間にわ
たって加えた。１時間後に、ＴＬＣは完成した反応を実証した（出発ヌクレオシ
ドのＲｆ ０．２５、生成物 ０．６０、ジクロロメタン−アセトン−メタノー
ル，２０：５：３中）。この反応を減圧下で濃縮して、濃厚な油状物を得て、次
に、これを酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（各１Ｌ）のミックス中
に再溶解した（非常にゆっくりと）。層が分離した。水層をさらなる酢酸エチル
（２００ｍｌ）によって抽出し、一緒にした有機層をさらなる炭酸水素塩溶液（
２００ｍｌ）によって洗浄した。有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濃縮し
、次にジクロロメタン（２００ｍｌ）中に再溶解した。この溶液をシリカゲル・
カラム（２．５ｋｇ）上に供給し、酢酸エチル中メタノール（０〜１０％）の勾
配によって溶出した。生成物含有フラクションを２つのプール中に一緒にし、次
に濃縮して、無水アセトニトリルと同時蒸発させ、白色泡状物として乾燥させた
（２５℃，１ｍｍ，２４時間）。第１プール、１１２．５ｇは５％の３，５−ビ
ス−ＤＭＴ生成物によって汚染されていた。第２プール、５５ｇは純粋な生成物
であった。不純物含量の低い９０％生成物のさらなる６ｇも回収された。最初の
２つのフラクションの収量は１６７．５ｇ（９４％）であった。第１フラクショ
ンをそのままＣ類似体への転化のために用いた。
【０２０２】
【数３０】
【０２０３】 ［５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド
）−５−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−イル］シアノエチルジイソプロピルホス
ホロアミダイト（７０） ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−５−メチル−ウリジン（３３．６ｇ，０．０５３２ｍｏｌ）を、使用直前に、
無水アセトニトリル（１５０ｍｌ）と同時蒸発させた。得られた油状物に、無水
ジクロロメタン（２００ｍｌ）、シアノエチルテトライソプロピルホスホロジア
ミダイト（１６．８３ｇ，０．０５５９ｍｏｌ）及びジシアノイミダゾール（１
．９ｇ，０．０１６０ｍｏｌ）を加えて、この溶液を周囲温度において２０時間
撹拌した。ＴＬＣは９５％完成した反応を実証した（出発物質のＲｆ ０．１５
、生成物ジアステレオマー ０．３５及び０．３０、酢酸エチル）。試薬のＨ−
ホスホネート副生成物はジアステレオマーの間で溶出する。追加の０．８ｇのア
ミダイト試薬を加えた。４時間後に、ＴＬＣはやや大きく完成した反応を実証し
た。溶液を追加のジクロロメタン（４００ｍｌ）によって希釈してから、飽和炭
酸水素ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）によって洗浄した。水相を追加の有機溶
媒（１００ｍｌ）によって逆抽出した。一緒にした有機層を乾燥させ（硫酸ナト
リウム）、約１００ｍｌまで濃縮した。ミルキーな懸濁液が形成されるまで、ヘ
キサンを加え（約２００ｍｌ）、この懸濁液を、生成物がフラスコの側面に粘着
するガムを丁度形成するまで、減圧下で濃縮した。溶媒をデカントし、ガムをヘ
キサン（１００ｍｌ）と共に磨砕して、再びデカントした。このガムをジクロロ
メタン（１００ｍｌ）中に再溶解して、シリカゲル・カラム（８００ｇ）に供給
した。生成物を酢酸エチル−ヘキサン−トリエチルアミン（８０：２０：１）か
ら出発する勾配、次にストレート酢酸エチル、次に酢酸エチル−メタノール ９
：１で溶出した。適当な生成物含有フラクションを一緒にして、３つのプールを
得て、これらを次に濃縮して、ＮＭＲによって分析した。プール１、１３．５ｇ
は３％試薬不純物を含む上部ジアステレオマーを含有した（Ｐ−ＮＭＲ １４ｐ
ｐｍ）。プール２、５ｇは上部スポットと５０％試薬不純物を含有した。プール
３、２０ｇはクリーンな下部スポットを含有した。プール２を上述した方法から
処理してガム状物にし、次にプール１と一緒にして、この方法を繰り返した。全
ての生成物フラクションを一緒にして、アセトニトリル（２００ｍｌ）と同時蒸
発させ、ストリップして、乾燥させて（０．１ｍｍ，２４時間）、３７．０ｇ（
８４％）を得た。
【０２０４】 ＮＭＲは約２〜３％の未反応試薬不純物を示した。
【０２０５】
【数３１】
【０２０６】 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−５−メチル−シチジン １０Ｌジャケット付き反応器にメカニカルスターラー、温度計、Ａｒライン、
滴下ロートを装備して、この反応器を再循環ヒーター／チラー(chiller)に接続
した。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミ
ド）−５−メチル−ウリジン（６９）（１１２．４ｇ，０．１７８，約９５％純
度）を無水アセトニトリル（１Ｌ）と同時蒸発させてから、同無水アセトニトリ
ル（４Ｌ）中に再溶解した。トリエチルアミン（３９６ｍｌ，２．８５ｍｏｌ）
を加えて、この溶液を−１０℃に冷却した（全て温度は内部温度）。トリメチル
シリルクロリド（１１３ｍｌ，０．８９０ｍｏｌ）を１５分間にわたって滴下し
た、ごく軽度の発熱が認められた。この溶液を０℃に温度上昇させ、この温度に
１時間維持した。ＴＬＣは完成した反応を実証した（出発物質のＲｆ ０．２０
、ＴＭＳ中間体 ０．６５、酢酸エチル−メタノール，９５：５）。１，２，４
−トリアゾール（１２３ｇ，１．７８ｍｏｌ）を固体として加えた。この反応を
−１２℃に冷却し、オキシ塩化リン（４９．７ｍｌ，０．５３４ｍｏｌ）を−１
０℃未満の温度を維持するように徐々に滴下した（約３０分間）。この反応を２
時間にわたって３５℃に温度上昇させ、やや赤色の懸濁液を得た。ＴＬＣは約９
５＋％完成した反応を実証した（ＴＭＳ Ｕ中間体のＲｆ ０．６５、ＴＭＳト
リアゾール中間体 ０．３５、長ＵＶ光でのグローによる、酢酸エチル−メタノ
ール，９５：５）。水（２Ｌ）と酢酸エチル（３Ｌ）とを加えた。撹拌し、分離
させた後に、水層を取り出し、有機層をさらなる水（３Ｌ）によって前記のよう
に洗浄した。有機層を減圧下で濃縮して、泡状物を得た。この泡状物をジオキサ
ン（１Ｌ）中に溶解した。濃水酸化アンモニウム水溶液を２回に分けて（各５０
ｍｌ）１時間にわたって加えた。（注釈：アミド基転移(transamidation)の可能
性を減ずるために、最少量のアンモニアを用いて、反応の進行をＴＬＣによって
フォローした）。ＴＬＣは約９５＋％完成した反応を実証した（ＴＭＳトリアゾ
ール中間体のＲｆ ０．６５、非ブロック生成物 ０．２５、ジクロロメタン−
アセトン−メタノール，２０：５：３）。この反応をストリップして、泡状物を
得て、これを最少量のジクロロメタン中に溶解してから、シリカゲル・カラム（
２．５ｋｇ）上に供給した。生成物をジクロロメタン−アセトン４：１中の０〜
１５％メタノールによって溶出した。適当なフラクションを一緒にして、ストリ
ップして、乾燥させて（０．１ｍｍ，２５℃，２４時間）、７７．３ｇの白色泡
状物（純粋な出発物質を基準にして６９％）を得た。
【０２０７】
【数３２】
【０２０８】 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−シチジン（７１） ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−５−メチル−シチジン（７７．３ｇ，０．１２３ｍｏｌ）と無水安息香酸（３
３．２５ｇ，０．１４７）とを無水ＤＭＦ（３５０ｍｌ）中に溶解し、周囲温度
に２０時間静置させた。ＴＬＣは完成した反応を実証した（出発物質のＲｆ ０
．１５、生成物 ０．８０、酢酸エチル−メタノール，９：１）。この反応を酢
酸エチル（１．２Ｌ）によって希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２Ｌ）
によって（注釈：界面には固体炭酸水素塩によるエマルジョンが形成された）及
び水（２ｘ１Ｌ）によって洗浄した。有機層を減圧下で濃縮し、白色泡状物を得
て、これを次に最少量のジクロロメタン中に再溶解して、２つのランとしてシリ
カゲル・カラム上に供給し、酢酸エチル−ヘキサン４：１によって溶出した。適
当なフラクションを一緒にして、減圧下で濃縮し、乾燥させて（０．１ｍｍ，２
５℃，２４時間）、白色泡状物７４．８ｇを得た。カラムをより大きい極性の溶
媒によって洗浄し、５．４ｇの回収出発物質を得た。有効収率は８９．４％であ
った。
【０２０９】
【数３３】
【０２１０】 ［５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド
）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−シチジン−３’−Ｏ−イル］シアノエチル
ジイソプロピル−ホスホロアミダイト（７２） ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−シチジン（３８．５ｇ，０．０５２４ｍｏｌ
）を、使用の直前に、無水アセトニトリル（１５０ｍｌ）と同時蒸発させた。得
られた油状物に、無水ジクロロメタン（１５０ｍｌ）、シアノエチルテトライソ
プロピルホスホロジアミダイト（１６．５８ｇ，０．０５５０ｍｏｌ）及びジシ
アノイミダゾール（１．８７ｇ，０．０１５７ｍｏｌ）を加え、この溶液を周囲
温度において４時間撹拌した。ＴＬＣは完成した反応を実証した（出発物質のＲ
ｆ ０．３０、生成物ジアステレオマー ０．７０と０．７５、酢酸エチル）。
この溶液を追加のジクロロメタン（３００ｍｌ）によって希釈し、飽和炭酸水素
ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）によって洗浄した。水層をさらに有機溶媒（１
００ｍｌ）によって逆抽出した。一緒にした有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム
）、約１００ｍｌにまで濃縮した。ミルキーな懸濁液が形成されるまでヘキサン
を加え（約２００ｍｌ）、生成物がフラスコの側面に粘着するガムを丁度形成す
るまで、この懸濁液を減圧下で濃縮した。溶媒をデカントし、ガムをヘキサン（
１００ｍｌ）と共に磨砕して、再びデカントした。このデカントをストリップし
て、生成物を殆ど含まず、主としてＰ−５不純物を含む油状物 ２ｇを得た。ガ
ムはワックス状物になった、これをジクロロメタン（１００ｍｌ）中に徐々に再
溶解し、シリカゲル・カラム（８００ｇ）上に供給した。生成物を酢酸エチル−
ヘキサン−トリエチルアミン（６０：４０：１）から出発し、次に８０：２０：
１に上昇し、次に酢酸エチル−メタノール ９：１に上昇する勾配で溶出した。
適当な生成物含有フラクションを一緒にし、減圧下で濃縮し、アセトニトリル（
２００ｍｌ）と同時蒸発させ、ストリップし、乾燥させて（０．１ｍｍ，２４時
間）、４１．６ｇ（８５％）の白色泡状物を得た。
【０２１１】
【数３４】
【０２１２】 ２’−Ｏ−（２−メチルアセテート）−２−アミノ−アデノシン（７４） ２−アミノ−アデノシン（７３）（又は２，６−ジアミノプリンリボシド）（
３００ｇ，１．０６ｍｏｌ）を無水ジメチルスルホキシド（１Ｌ）中に懸濁させ
、溶解するまで８０℃に、アルゴン雰囲気下で機械的に撹拌しながら加熱した。
周囲温度に冷却した後に、無水ジメチルホルムアミド（２Ｌ）を加えてから、水
素化ナトリウム（６３．７ｇ，油中６０％，１．５９ｍｏｌ）を４回に分けて１
時間にわたって加え、混合物をさらに２時間撹拌して、懸濁液を得た。メチル−
２−ブロモアセテート（２４３．９ｇ，１．５９ｍｏｌ）を周囲温度において２
時間にわたって滴下し、反応を１８時間撹拌した。ＴＬＣは５０〜６０％完成し
た反応を実証した（所望の２’生成物のＲｆ 約０．３５、ジクロロメタン−ア
セトン−メタノール，２０：５：３）。注釈：反応をさらに推し進めると、出発
物質よりも除去が困難である２’，３’ビス生成物がより多く生ずる。メタノー
ル（１５０ｍｌ）を加えて、反応をクエンチし、反応を減圧（６５℃浴、５０〜
１０ｍｍ）下で濃縮して、濃厚な油状物を得た。この油状物をジクロロメタン（
４Ｌ）中に溶解して、１６時間撹拌した。沈殿を回収し、ジクロロメタン（３ｘ
２００ｍｌ）とジクロロメタン−メタノール（１：１，３ｘ１００ｍｌ）とによ
って洗浄した。この固体と濾液のＴＬＣは、この固体が主として塩、出発物質及
び極性不純物であり、濾液が該ビス生成物と３’生成物と共に、主として生成物
であることを明らかにした。濾液を乾燥するまでストリップし、メタノール（５
００ｍｌ）中に再溶解して、次にシリカゲル（８００ｇ）を加えた。このミック
スを濃縮し、乾燥させて、自由流動性粉末を得た。この粉末を、シリカゲルを充
填した６Ｌ焼結ガラスロートから成るスクラブシリカゲル・カラムの頂部に載せ
た。生成物を最初はエーテル（４Ｌ）によって、次にジクロロメタン−アセトン
−メタノール，２０：５：３によって、生成物が無くなるまで溶出した。適当な
フラクションを一緒にして、ストリップし、残渣をメタノールから結晶化して、
７９．６ｇの約９５％純度の生成物と７２．８ｇの母液（ＮＭＲにより約８５％
純度）とを得た。両方のフラクションをさらに精製せずに次の工程に用いた。
【０２１３】 ２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）グアノシン ２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセテート）−２−アミノ−アデノシン（７４）
（１００ｇ，０．２８ｍｏｌ，約９５％純度）を水（３００ｍｌ）中に溶解し、
４０％メチルアミン水溶液（８７．６ｍｌ，１．００８ｍｏｌ）を機械的に撹拌
しながら周囲温度において１回で加えた。４時間後に、ＴＬＣは完成した反応を
実証した（生成物は極性がより大きい）。この反応をストリップしてから、リン
酸塩バッファー（０．１Ｍ、１Ｌ，ｐＨ７．０）中に再溶解した。アデノシンデ
アミナーゼ（１．５ｇ）を加えて、混合物を３７℃において１８時間非常に緩慢
に機械的に撹拌した。ＴＬＣは約６０％完成した反応を実証し、ｐＨは８．５に
上昇していた。このｐＨをリン酸によって７．０に調節し、他の部分の酵素（０
．５ｇ）を加えた。２４時間後に、反応は完成し、沈殿が形成された。固体を回
収し、水（３ｘ５０ｍｌ）によって洗浄し、乾燥させて、６０．９ｇ（６１％ニ
段階収率）の純粋な２’生成物を得た。
【０２１４】
【数３５】
【０２１５】 濾液を濃縮したが、二次回収物(second crop)は形成されなかった。クロマトグ
ラフィー後に、さらなる生成物が得られていたと考えられた。 ２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−Ｎ２−イソブチリル−グアノシ
ン（７５） ２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）グアノシン（５５．８５ｇ，０．
１５８ｍｏｌ）を無水ピリジン（２ｘ２００ｍｌ）と同時蒸発させてから、同無
水ピリジン（７００ｍｌ）中に再溶解した。フラスコにメカニカルスターラー、
ドライアイス−アセトン浴、温度計、滴下ロート及びアルゴン雰囲気を装備した
。トリメチルシリルクロリド（１００ｍｌ，０．７９０ｍｏｌ）を、２０〜２５
℃の内部温度を維持するような速度で滴下した。この反応を周囲温度において９
０分間撹拌した。この反応を−１５℃に冷却し、イソブチリルクロリド（８３．
２５ｍｌ，０．７９０ｍｏｌ）を−１０〜０℃の内部温度を維持するような速度
で加えた。この反応を周囲温度において１８時間撹拌した。ＴＬＣは完成した反
応を実証した。この反応を、最初に０℃に冷却し、次に水（５０ｍｌ）を徐々に
加えることによって、クエンチした。１０分間後に、溶媒をストリップし、残渣
をジクロロメタン−アセトン−メタノール（５００ｍｌ，４０：１０：３）の混
合物中に溶解した。沈殿を回収し、無機塩として同定した。濾液をシリカゲル・
カラム（８００ｇ）上に載せ、最初に同じ溶媒比率で、次に極性を４：１：１に
高めて溶出した。適当なフラクションをプールし、濃縮した。主生成物フラクシ
ョンは４３．５ｇの白色固体を生じ、上部不純物によってやや汚染されたフラク
ションは別の１０ｇを生じた（総合収量５３．５ｇ，８１％）。
【０２１６】
【数３６】
【０２１７】 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−Ｎ２−イソブチリル−グアノシン（７６） ２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−Ｎ２−イソブチリル−グアノシ
ン（４２．５ｇ，０．１０１ｍｏｌ）を無水ピリジン（２ｘ２００ｍｌ）と同時
蒸発させてから、同溶媒（５００ｍｌ）中に再溶解した。ジメトキシトリチルク
ロリド（３７．６３，１．１１ｍｏｌ）を１回で加えて、反応をアルゴン下で１
８時間撹拌した。ＴＬＣは完成した反応を実証した。この反応をメタノール（２
０ｍｌ）の添加によってクエンチしてから、ストリップして、濃厚な油状物を得
た。この油状物を酢酸エチルと１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（各５００ｍｌ）と
に分配した。有機層を濃縮してから、シリカゲル・カラム（８００ｇ）上に供給
した。生成物を酢酸エチル中メタノールの勾配（０〜１０％）によって溶出した
。生成物含有フラクションを一緒にし、ストリップして、乾燥させて（２５℃，
０．１ｍｍ，２４時間）、４７ｇ（６４％）の生成物を白色泡状物として得た。
【０２１８】 ［５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド
）−Ｎ２−イソブチリル−グアノシン−３’−Ｏ−イル］シアノエチルジイソプ
ロピルホスホロアミダイト ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−Ｎ２−イソブチリル−グアノシン（２５．０ｇ，０．０３４５ｍｏｌ）とジイ
ソプロピルアミンテトラゾリド（１．７７ｇ，０．０１０ｍｏｌ）とを、使用直
前に、無水アセトニトリル（１５０ｍｌ）と同時蒸発させた。得られた油状物に
、無水アセトニトリル（１７０ｍｌ）とシアノエチルテトライソプロピルホスホ
ロジアミダイト（１１．４６ｇ，０．０３８ｍｏｌ）とを加えて、この溶液を周
囲温度において２４時間撹拌した。ＴＬＣは完成した反応を実証した。この溶液
を濃縮して、油状物を得て、これをジクロロメタン（３００ｍｌ）と飽和炭酸水
素ナトリウム水溶液（３００ｍｌ）とに分配した。水相を追加の有機溶媒（１０
０ｍｌ）によって逆抽出した。一緒にした有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）
、濃縮して、油状物を得た。この油状物をシリカゲル・カラム（４００ｇ）上に
供給し、酢酸エチル−トリエチルアミン（９９：１）中メタノールの勾配（０〜
１０％）によって溶出した。適当な生成物含有フラクションを一緒にし、減圧下
で濃縮して、アセトニトリル（２００ｍｌ）と同時蒸発させ、ストリップして、
微量の不純物によってまだ汚染されている泡状物を得た。この泡状物を酢酸エチ
ル−ジクロロメタンの混合物（１：１，４０ｍｌ）中に溶解してから、濁りが維
持されるまで、ヘキサンを徐々に加えた。２０分間後に、沈殿が形成され、この
沈殿を回収し、ヘキサン−酢酸エチル−ジクロロメタン（８：１：１）によって
洗浄し、乾燥させて、１４．４６ｇの白色非晶質固体を得た、これはＮＭＲとＴ
ＬＣによって約９８％純度であった。濾液をストリップして、約９０％純度の泡
状生成物 １０ｇを得た。
【０２１９】
【数３７】
【０２２０】 実施例４４ １つ以上の２’−Ｏ−｛Ｎ−［２−（メチルチオ）エチル］アセトアミド｝修飾
（オリゴ合成後）を有するオリゴヌクレオチドの一般的合成方法 ２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有する１つ以上のヌクレオシ
ドを組み入れたオリゴヌクレオチドを既述したような固相方法を用いて調製する
。１つ以上の２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレン官能基を有するＣＰＧ結合
オリゴヌクレオチドを、メタノール中の５０％２−（メチルチオ）エチルアミン
中に懸濁させ、周囲温度に２４時間維持する。これらの条件下で、メトキシ基の
求核性置換によってアミン・コンジュゲーションが生ずる。同時に、オリゴヌク
レオチドがＣＰＧから切断されて、環外アミノ及びリン酸基上の保護基も除去さ
れる。混合物を濾過し、蒸発乾燥させて、粗５’−Ｏ−ＤＭＴオリゴヌクレオチ
ドを得る。この粗オリゴヌクレオチドを次にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム
に通して、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃ−４，７．８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍ
Ｍトリエチルアンモニウムアセテート，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセトニトリル５〜６０
％Ｂ，５５分間中，流量２．５ｍｌ／分，λ２６０ｎｍ）によって精製した。８
０％酢酸水溶液による脱トリチル及び蒸発と、その後のＷａｔｅｒｓＣ−４カラ
ムを用いるＨＰＬＣによる脱塩とが、合成後修飾オリゴヌクレオチドを生じる。
【０２２１】 この方法を用いて調製されるオリゴヌクレオチドを下記表ＶＩに示す。
【０２２２】
【表６】
【０２２３】 実施例４５ ２’−Ｏ−アセトアミド修飾を含有するオリゴマー化合物の脱保護 ２’−Ｏ−アセトアミド・オリゴヌクレオチドを担持するＣＰＧをＮＨ3水溶
液（３０％溶液）中に懸濁して、室温に維持した。これらの条件下で、オリゴヌ
クレオチドは脱保護され／ＣＰＧから切断された。シチジン・ヌクレオシド上の
保護された環外アミノ基（例えば、ベンゾイル、アセチル等）もこれらの条件下
で同時に脱保護された。得られた混合物に、（生じた量の約１０％まで）メチル
アミン水溶液（４０％）を加え、混合物を室温に２２時間維持して、全ての基（
例えば、グアニジン・ヌクレオシド上のイソブチリル及びアデノシン・ヌクレオ
シド上のベンゾイル）の脱保護を完成させた。
【０２２４】 １μｍｏｌ合成のために、ＣＰＧに結合したオリゴヌクレオチドをＮＨ3水溶
液（１．８ｍｌ，３０重量％）中に懸濁させ、室温に２時間維持した。これに、
メチルアミン水溶液（０．２ｍｌ，４０重量％溶液）を加えて、室温にさらに２
２時間維持して、脱保護を完成させた。
【０２２５】 この方法を用いて、配列ＣＴＣ ＧＴＡ ＣＴ★Ｔ★ Ｔ★Ｔ★Ｃ ＣＧＧ
ＴＣＣを有するオリゴヌクレオチド配列番号６を調製した、この場合、Ｔ★は２
’−Ｏ−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ2）2基を有するＴを表す（計算値ｍ＋６０
９９．８３、実測値 ６０９８．１６）。
【０２２６】 実施例４６ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチル−アセトアミド）
−５−メチル−ウリジン・スクシネート（７７）の調製 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−５−メチル−ウリジン（５ｇ，７．９２ｍｍｏｌ）に無水コハク酸（１．５８
ｇ，１５．８ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（０．４８３ｇ，３．９５ｍｍｏｌ）とを混
合した。この混合物を真空下、４０℃においてＰ2Ｏ5上で一晩乾燥させた。乾燥
した物質をピリジン３０ｍｌ中に溶解し、撹拌した。２時間後に、ＴＬＣは反応
の９５％完成を実証した。この反応を一晩進行させた。水（５ｍｌ）を加えて、
混合物を１５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に移して、２０％クエン酸（１００ｍｌ）によ
って洗浄した。このクエン酸層を２０％ＣＨ2Ｃｌ2によって洗浄した。一緒にし
た有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて、泡状物を得、これを５０ｍｌ
のＣＨ3ＣＮ及び３ｍｌのトリエチルアミンと共に同時蒸発させて、黄色泡状物
（収量５．７９ｇ，９７％）を得た。
【０２２７】 実施例４７ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−
５−メチル−ウリジン−３’Ｏ−スクシニルＣＰＧ（７８）の調製 真空下においてＰ2Ｏ5上で乾燥させた５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−
Ｏ−（２−Ｎ−メチル−アセトアミド）−５−メチル−ウリジン・スクシネート
（１．２５ｇ，１．７１ｍｍｏｌ）に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，６．４
ｍｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，２，３−テトラメ
チル ウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ ８．３ｇ，２．６ｍｍ
ｏｌ）及び４−メチルモルホリン（５．３ｇ，５．２ｍｍｏｌ）を加える。混合
物を渦流させる。無水ＤＭＦ（２０ｍｌ）と活性化ＣＰＧ（１０ｇ，１１５．２
μｍｏｌ／ｇ）とを加えて、シェーカー上で１８時間振とうさせる。この混合物
を濾過し、官能化されたＣＰＧをＤＭＦ、ジクロロメタン及びジエチルエーテル
によって徹底的に洗浄する。このＣＰＧを真空下、Ｐ2Ｏ5上で乾燥させる。ＣＰ
Ｇ上の非官能化部位にキャップするために、ＣＰＧにＣａｐ ＡとＣａｐ Ｂ（
Ｃａｐ Ａ＝１０ｍｌ、Ｃａｐ Ｂ＝１０ｍｌ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を混合し、シェーカー上で２時間振とうさせる。Ｃ
ＰＧを濾過し、アセトニトリルとジエチルエーテルとによって洗浄して、官能化
ＣＰＧを得る。真空下で乾燥した後に、負荷容量を測定する。
【０２２８】 実施例４８ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−
５−メチル−シチジン−３’−Ｏ−スクシネート（７９）の調製 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−シチジン（０．２５ｇ，０．３８ｍｍｏｌ）
に、無水コハク酸（０．０５７ｇ，０．５７ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジ
ン（０．０２３ｇ，０．１９ｍｍｏｌ）とを混合した。この混合物を真空下、４
０℃においてＰ2Ｏ5上で一晩乾燥させた。乾燥した物質をジクロロメタン（１ｍ
ｌ）中に溶解し、トリエチルアミン（０．１０６ｍｌ，０．７６ｍｍｏｌ）をア
ルゴン雰囲気下、周囲温度において４時間撹拌しながら加えた。この反応をジク
ロロメタン（３０ｍｌ）によって希釈して、１０％クエン酸水溶液（氷冷、３０
ｍｌ）と水（３０ｍｌ）とによって洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で
乾燥させ、真空下で蒸発させた。得られた泡状物を、溶離剤としてメタノール：
ジクロロメタン：ピリジン（１／８．９／０．１，ｖ／ｖ／ｖ）を用いたシリカ
ゲル・カラムクロマトグラフィーによって精製して、０．２ｇ（７１％）の標題
化合物を白色泡状物として得た。
【０２２９】 実施例４９ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−
５−メチル−シチジン−３’Ｏ−スクシニルＣＰＧ（８０）の調製 真空下においてＰ2Ｏ5上で予め乾燥させた化合物１６（０．２５ｍｍｏｌ）に
、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，０．６４ｍｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリア
ゾール−１−イル）−１，２，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボ
レート（ＴＢＴＵ ０．８３ｇ，０．２６ｍｍｏｌ）及び４−メチルモルホリン
（０．５３ｇ，０．５２ｍｍｏｌ）を加える。この混合物が透明な溶液になるま
で、混合物を渦流させる。無水ＤＭＦ（２．２ｍｌ）と活性化ＣＰＧ（１．１３
ｇ，１１５．２μｍｏｌ／ｇ）とを加えて、シェーカー上で１８時間振とうさせ
る。この混合物を濾過し、官能化されたＣＰＧをＤＭＦ、ジクロロメタン及びジ
エチルエーテルによって徹底的に洗浄する。このＣＰＧを真空下、Ｐ2Ｏ5上で乾
燥させる。ＣＰＧ上の非官能化部位にキャップするために、ＣＰＧにＣａｐ Ａ
とＣａｐ Ｂ（Ｃａｐ Ａ＝２ｍｌ、Ｃａｐ Ｂ＝２ｍｌ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を混合し、シェーカー上で２時間振とう
させる。ＣＰＧを濾過し、アセトニトリルとジエチルエーテルとによって洗浄し
て、官能化ＣＰＧを得る。真空下で乾燥した後に、負荷容量を測定する。
【０２３０】 実施例５０ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−
Ｎ２−イソブチリル−グアノシン−３’−Ｏ−スクシネート（８１）の調製 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）
−Ｎ２−イソブチリル−グアノシン（５ｇ，６．９ｍｍｏｌ）に、無水コハク酸
（２．７６ｇ，２７．６ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（０．４２３ｇ，
３．４ｍｍｏｌ）とを混合した。この混合物を真空下、４０℃においてＰ2Ｏ5上
で一晩乾燥させた。乾燥した物質をピリジン（６０ｍｌ）中にアルゴン雰囲気下
、周囲温度において４時間撹拌しながら溶解した。この反応をジクロロメタン（
３００ｍｌ）によって希釈して、２０％クエン酸（氷冷、３００ｍｌ）と水（３
００ｍｌ）とによって洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真
空下で蒸発させた。得られた泡状物を、溶離剤としてメタノール：ジクロロメタ
ン：ピリジン（１／８．９／０．１，ｖ／ｖ／ｖ）を用いたシリカゲル・カラム
クロマトグラフィーによって精製して、５．１９ｇ（７１％）の標題化合物を白
色泡状物として得た。
【０２３１】 実施例５１ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−
Ｎ２−イソブチリル−グアノシン−３’Ｏ−スクシニルＣＰＧ（８１）の調製 真空下においてＰ2Ｏ5上で乾燥させた５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−
Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−Ｎ２−イソブチリル−グアノシン−３’
−Ｏ−スクシネート（１．０ｇ，１．２１ｍｍｏｌ）に、ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ，１６ｍｌ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴ
Ｕ ０．４６２ｇ，１．２１ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．
６３ｇ，０．８１ｍｌ，４．８４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物が透明な溶液
になるまで、混合物を渦流させた。無水ＤＭＦ（３５ｍｌ）と活性化ＣＰＧ（７
．１３ｇ，１１５．２μｍｏｌ／ｇ）とを加えて、シェーカー上で１８時間振と
うさせた。この混合物を濾過し、官能化されたＣＰＧをＤＭＦ、ジクロロメタン
及びジエチルエーテルによって徹底的に洗浄した。このＣＰＧを真空下、Ｐ2Ｏ5 上で乾燥させた。ＣＰＧ上の非官能化部位にキャップするために、ＣＰＧにＣａ
ｐ ＡとＣａｐ Ｂ（Ｃａｐ Ａ＝２０ｍｌ、Ｃａｐ Ｂ＝２０ｍｌ、Ｐｅｒｓ
ｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を混合し、シェーカー上で２
時間振とうさせた。次に、ＣＰＧを濾過し、アセトニトリルとジエチルエーテル
とによって洗浄して、官能化ＣＰＧを得た。真空下で乾燥した後に、負荷容量を
測定した（７．２０ｇ，６０．９ｍｍｏｌ／ｇ）。
【０２３２】 実施例５２ ５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−２’−Ｏ−（（Ｎ−メチル−アセトアミド）アデノシ
ン（８３） ５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−２’−Ｏ−メトキシカルボニルメチレンアデノシン
（８９．６３ｇ，１５５．１５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１．３Ｌ）中に溶解し
て、Ｎ−メチルアミン（３１０ｍｍｏｌ，水中−４０重量％メチルアミン３５０
ｍｌ）を加え、反応混合物を周囲温度において１８時間撹拌した。混合物を濃縮
して、油状物を得て、これをＥｔＯＡｃ（４２０ｍｌ）中に溶解した。有機相を
水（３ｘ３５０ｍｌ）、ブライン（１ｘ３５０ｍｌ）によって洗浄して、有機相
を無水ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させて、８４．８０ｇ（
９５％）の標題化合物を白色固体として得た。
【０２３３】 実施例５３ ５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−２’−Ｏ−（（Ｎ−メチル−アセトアミド）−Ｎ６−
ベンゾイルアデノシン（８４） ５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−２’−Ｏ−（（Ｎ−メチル−アセトアミド）アデノ
シン（８４ｇ，１４６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（５００ｍｌ）中に溶解し、氷
浴中で冷却した。クロロトリメチルシラン（７０ｍｌ，５８２．６ｍｍｏｌ）を
滴加し、反応を３０分間撹拌し、この時点でベンゾイルクロリド（６８ｍｌ，５
８２．６ｍｍｏｌ）を反応に滴加した。３０分間後に氷浴を除去し、反応を３時
間撹拌した。反応をもう一度氷浴中で冷却した。水（１００ｍｌ）を加えた後に
、３０分間後に濃ＮＨ4ＯＨ（１００ｍｌ）を加えた。１時間後に、反応を水と
酢酸エチル（６００／６００ｍｌ）とに分配した。水層を酢酸エチル（５００ｍ
ｌ）によってさらに２回抽出した。酢酸エチル抽出物を一緒にプールして、ブラ
イン（５００ｍｌ）によって洗浄し、ＭｇＳＯ4によって乾燥させ、濾過し、真
空下で蒸発させて、油状物を得た。得られた粗物質を、溶離剤としてＥｔ2Ｎ：
ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ：ＣＨＣｌ3（２／５／６０／３３，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を
用いるシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって精製した。適当なフラク
ションを回収して、真空下で濃縮して、７９．３２ｇの標題化合物を得た。
【０２３４】 実施例５４ ２’−Ｏ−（（Ｎ−メチル−アセトアミド）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（８
５） トリエチルアンモニウムトリヒドロフルオリド（４５ｍｌ，２７９ｍｍｏｌ）
をＴＨＦ（２８０ｍｌ）に加えた。この溶液に、トリエチルアミン（１９．４４
ｍｌ，１３９．５ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ−
２’−Ｏ−（（Ｎ−メチル−アセトアミド）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（１
９ｇ，２７．９１ｍｍｏｌ）に加えて、室温において１８時間撹拌した。ｔｌｃ
によって実証されるように、反応は完成に達した。溶媒を蒸発させて、黄色を帯
びた橙色油状物を残し、これを、溶離剤としてＥｔ2Ｎ：ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3（
３／５／９２，ｖ／ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル・カラムクロマトグラフィーに
よって精製した。適当なフラクションをプールし、濃縮して、１１．１１ｇ（９
０％）の標題化合物を得た。
【０２３５】 実施例５５ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（（Ｎ−メチル−アセトアミド）−Ｎ６−ベンゾ
イルアデノシン（８６） ２’−Ｏ−（（Ｎ−メチル−アセトアミド）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（
５．７ｇ，１２．９ｍｍｏｌ）をピリジンと共に３回同時蒸発させてから、乾燥
ピリジン（１２９ｍｌ）中に溶解し、この反応混合物に４，４’−ジメトキシト
リチルクロリド（５．２４ｇ，１５．４６ｍｍｏｌ）を２回に分けて加えた。２
０時間目のＴＬＣは反応が完成したことを示した。真空下での蒸発によって、溶
媒量を半分に減少させた。残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）と水（２００ｍｌ）
とに分配した。水相をＥｔＯＡｃ（２ｘ５０ｍｌ）によって抽出した。このＥｔ
ＯＡｃをプールし、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。残渣
を、溶離剤としてのＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3（５／９５，ｖ／ｖ）によって溶出す
るシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによって精製した。適当なフラクショ
ンを回収し、濃縮して、６．２４ｇ（６５％）の標題化合物を得た。
【０２３６】 実施例５６ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチル−アセトアミド）
−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプ
ロピルホスホロアミダイト）（８７）の調製 ＣＨ3ＣＮ（２５ｍｌ）中に溶解した５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（（Ｎ−
メチル−アセトアミド）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（３．７６ｇ，５．０６
ｍｍｏｌ）の混合物に、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプ
ロピルホスホロアミダイト（２．４１ｍｌ，７．５９ｍｍｏｌ）を滴加した。ジ
イソプロピルアミンテトラゾリド（０．８７ｇ，５．０６ｍｍｏｌ）を加え、混
合物を一晩撹拌した。この反応をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）によって希釈し、飽
和ＮａＨＣＯ3（１００ｍｌ）によって２回抽出し、次にブライン（１００ｍｌ
）によって１回洗浄した。このＥｔＯＡｃを次にＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過
し、濃縮した。残渣を最少量のＣＨ2Ｃｌ2（５ｍｌ）中に溶解して、激しく撹拌
した乾燥ヘキサン（２５０ｍｌ）に加えて、標題化合物を沈殿させた。溶媒を沈
殿からデカントし、残渣を真空下で乾燥させた。この沈殿をもう一度繰り返して
、総収量３．３４ｇ（７０％）の標題化合物を得た。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3
）：δ１５１．０８及び１５１．４１。
【０２３７】 実施例５７ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチル−アセトアミド）
−Ｎ６−ベンゾイル−アデノシン−３’−Ｏ−スクシネート（８８）の調製 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（（Ｎ−メチル−アセトアミド）−Ｎ６−ベン
ゾイルアデノシン（１．５ｇ，２．０３ｍｍｏｌ）を、無水コハク酸（０．４ｇ
，４．０３ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（０．１３ｇ，１．０４ｍｍ
ｏｌ）と混合した。この混合物を真空下、４０℃においてＰ2Ｏ5上で一晩乾燥さ
せた。乾燥した物質をジクロロメタン（６ｍｌ）中に溶解し、トリエチルアミン
（１．１２ｍｌ，８．６６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、周囲温度において４
時間撹拌しながら加えた。この反応をジクロロメタン（４０ｍｌ）によって希釈
し、１０％クエン酸（氷冷，５０ｍｌ）によって、次に水（５０ｍｌ）によって
洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で蒸発させた。得
られた泡状物を溶離剤としてメタノール：ジクロロメタン：ピリジン（１／８．
９／０．１，ｖ／ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル・カラムクロマトグラフィーによ
って精製して、１．７１ｇ（９８％）の標題化合物を白色泡状物として得た。
【０２３８】 実施例５８ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−
Ｎ６−ベンゾイル−アデノシン−３’−Ｏ−スクシニルＣＰＧ（８９）の調製 真空下においてＰ2Ｏ5上で予め乾燥させた５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２
’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）−Ｎ２−イソブチリル−グアノシン−
３’−Ｏ−スクシネート（１．０ｇ，１．１８ｍｍｏｌ）に、ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ，１６ｍｌ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ
，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡ
ＴＵ ０．４５ｇ，１．１８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．
６３ｇ，０．８１ｍｌ，４．８４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物が透明な溶液
になるまで、混合物を渦流させた。無水ＤＭＦ（３３ｍｌ）と活性化ＣＰＧ（７
．００ｇ，１１５．２μｍｏｌ／ｇ）とを加えて、シェーカー上で１８時間振と
うさせた。この混合物を濾過し、官能化されたＣＰＧをＤＭＦ、ジクロロメタン
及びジエチルエーテルによって徹底的に洗浄した。このＣＰＧを真空下、Ｐ2Ｏ5 上で乾燥させた。非官能化部位にキャップするために、ＣＰＧにＣａｐ ＡとＣ
ａｐ Ｂ（Ｃａｐ Ａ＝２０ｍｌ、Ｃａｐ Ｂ＝２０ｍｌ、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を混合し、シェーカー上で２時間振とう
させた。次に、ＣＰＧを濾過し、アセトニトリルとジエチルエーテルとによって
洗浄して、官能化ＣＰＧを得た。真空下で乾燥した後に、負荷容量を測定した（
７．００ｇ，７０．３ｍｍｏｌ／ｇ）。
【０２３９】 実施例５９ ２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）官能基を有する修飾オリゴヌクレオ
チドの一般的合成方法 Ａ、5meＣ、Ｇ及びＴの２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチルアセトアミド）アミダイ
トを無水アセトニトリル中に溶解して、０．１Ｍ溶液を得た。Ａ、5meＣ、Ｇ及
びＴの２’−デオキシアミダイトはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＶＡから入手
した。これらのアミダイト溶液をＥｘｐｅｄｉｔｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に装填して、所望のオリゴヌク
レオチドを合成した。オリゴヌクレオチド合成は、次の改変を加えた、製造者か
ら提供された合成プロトコールを用いて行なった。合成は１μｍｏｌ規模で行な
った。カップリング効率は９５％より大きかった。２’−Ｏ−（２−Ｎ−メチル
アセトアミド）アミダイトのカップリングのためには、カップリング時間を１０
分間に延長し、この工程を２回行なった。カップリング時間を延長した以外は、
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから提供されたプロトコールにおける全ての他の工程を用い
た。Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（アセトニトリル中０．１Ｍ）を硫化剤として用いた
。アンモニア水溶液（３０重量％、２ｍｌ）中に懸濁させることによって、オリ
ゴマーを制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）支持体から切断し、室温に２時間維持した
。得られたスラリーにメチルアミン水溶液を室温において２４時間加えて（０．
３ｍｌ，水中４０重量％）、保護基を除去した。得られた溶液を濾過し、スピー
ドバク(speed vac)中で濃縮した。５’−Ｏ−ＤＭＴ含有オリゴマーを次に逆相
高速液体クロマトグラフィー（Ｃ−４、Ｗａｔｅｒｓ，７．８ｘ３００ｍｍ，Ａ
＝５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセトニトリル
，６０分間中に５〜６０％Ｂ，流量１．５ｍｌ／分）によって精製した。８０％
酢酸水溶液による脱トリチルと蒸発、続いてのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラ
ムにおける脱塩によって、２’−修飾オリゴヌクレオチドを得た。オリゴヌクレ
オチドをＨＰＬＣ、ＣＧＥ及び質量分析によって分析した。
【０２４０】
【表７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本発明のある一定の中間体とある一定の２’−Ｏ−基とを示す。
【図２】 図２は化合物７２の合成を示す。
【図３】 図３は化合物７７の合成を示す。
【図４】 図４は化合物８７の合成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/712 Ａ６１Ｋ 31/712 38/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｈ 19/10 Ｃ０７Ｈ 19/10 19/167 19/167 19/20 19/20 21/00 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カワサキ，アンドリュー・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， カールズバッド，パセオ・ジャキータ 6126 (72)発明者 クック，フィリップ・ダン アメリカ合衆国カリフォルニア州92028， フォールブルック，オリーブ・ヒル・ロー ド 5237 (72)発明者 フレイザー，アリスター・エス アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， カールズバッド，クアイル・プレイス 6909−エフ (72)発明者 プラカーシュ，サーザ・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， カールズバッド，メラルーカ 961，アパ ートメント・ビー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA11 4C057 AA17 AA18 CC03 DD03 LL10 LL14 LL17 LL18 LL23 LL29 LL40 LL41 LL46 MM02 MM05 MM09 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA15 BA16 BA23 BA42 CA62 NA14 ZB212 4C086 AA01 AA03 EA17 EA18 MA01 MA04 NA14 ZB21

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 【化１】 ［式中、Ｂｘは、保護されていてよい複素環式塩基部分であり； Ｔ1およびＴ2は、それぞれ独立して、ＯＨ、保護されたヒドロキシルであり；
    または Ｔ1およびＴ2の一方は、ＯＨまたは保護されたヒドロキシルであり、Ｔ1およ
    びＴ2のもう一方は、固体支持体または活性リン含有置換基であり； Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｃ1−Ｃ10アルキルであり、またはＥ1お
    よびＥ2の一方はＨであり、Ｅ1およびＥ2のもう一方は−ＣＨ3であり；または Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｈ；−（ＣＨ2）m−Ｓ−Ｒ4（但し、ｍ
    は１〜１０である）；−｛（ＣＨ2）nn−Ｎ（Ｈ）｝nnn−（ＣＨ2）nnＮＨ2（但
    し、それぞれｎｎは２〜４であり、ｎｎｎは２〜１０である）；２〜１０個のペ
    プチド結合アミノ酸を有するポリペプチド；葉酸部分であって、該葉酸部分をα
    またはγカルボキシル基から２’−置換基に結合する結合基を有していてよく、
    該結合基が−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ2）6−であるもの；またはコレステロール部分で
    あって、該コレステロール部分をヒドロキシル基から２’−置換基へ結合する結
    合基を有していてよく、該結合基が−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ2）6−であ
    るものであり、但し、Ｅ1およびＥ2の一つだけはＨであるという条件付きであり
    ；そして Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、Ｃ2−Ｃ10アルキニル
    、Ｃ6−Ｃ14アリールまたはチオ保護基である］ を有する化合物。
  2. 【請求項２】 Ｅ1およびＥ2がそれぞれＣ1−Ｃ10アルキルである請求項１
    に記載の化合物。
  3. 【請求項３】 Ｅ1がＨであり、Ｅ2が−（ＣＨ2）m−Ｓ−Ｒ4である請求項
    １に記載の化合物。
  4. 【請求項４】 Ｒ4がＣ1−Ｃ10アルキルである請求項３に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 Ｒ4がメチルである請求項４に記載の化合物。
  6. 【請求項６】 Ｅ2が｛（ＣＨ2）nn−Ｎ（Ｈ）｝nnn−（ＣＨ2）nnＮＨ2で
    あり、但し、それぞれｎｎは２〜４であり、ｎｎｎは２〜１０である請求項１に
    記載の化合物。
  7. 【請求項７】 Ｅ2が−（ＣＨ2）3−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ2）4−Ｎ（Ｈ）−（
    ＣＨ2）3−ＮＨ2または−（ＣＨ2）4−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ2）3−ＮＨ2である請求
    項６に記載の化合物。
  8. 【請求項８】 Ｅ2が前記ポリペプチドである請求項１に記載の化合物。
  9. 【請求項９】 前記ポリペプチドが、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｔ
    ｒｐ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓである請求項８に記載の化
    合物。
  10. 【請求項１０】 Ｅ2が、結合葉酸部分または５−メチルテトラヒドロ葉酸
    部分である請求項１に記載の化合物。
  11. 【請求項１１】 Ｅ2がコレステロール部分である請求項１に記載の化合物
    。
  12. 【請求項１２】 前記複素環式塩基部分が、プリンラジカルまたはピリミジ
    ンラジカルである請求項１に記載の化合物。
  13. 【請求項１３】 前記複素環式塩基部分が、アデニニル、シトシニル、５−
    メチルシトシニル、チミニル、ウラシリル、グアニニルまたは２−アミノアデニ
    ニルである請求項１２に記載の化合物。
  14. 【請求項１４】 Ｔ1が保護されたヒドロキシルであり、Ｔ2が活性リン含有
    置換基である請求項１に記載の化合物。
  15. 【請求項１５】 Ｅ1およびＥ2がＣＨ3である請求項１に記載の化合物。
  16. 【請求項１６】 Ｅ1がＨであり、Ｅ2がＣＨ3である請求項１に記載の化合
    物。
  17. 【請求項１７】 式 【化２】 ［式中、Ｂｘは、保護されていてよい複素環式塩基部分であり； Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｃ1−Ｃ10アルキルであり、またはＥ1お
    よびＥ2の一方はＨであり、Ｅ1およびＥ2のもう一方は−ＣＨ3であり；または Ｅ1およびＥ2は、それぞれ独立して、Ｈ；−（ＣＨ2）m−Ｓ−Ｒ4（但し、ｍ
    は１〜１０である）；−｛（ＣＨ2）nn−Ｎ（Ｈ）｝nnn−（ＣＨ2）nnＮＨ2（但
    し、それぞれｎｎは２〜４であり、ｎｎｎは２〜１０である）；２〜１０個のペ
    プチド結合アミノ酸を有するポリペプチド；葉酸部分であって、該葉酸部分をα
    またはγカルボキシル基から２’−置換基に結合する結合基を有していてよく、
    該結合基が−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ2）6−であるもの；またはコレステロール部分で
    あって、該コレステロール部分をヒドロキシル基から２’−置換基へ結合する結
    合基を有していてよく、該結合基が−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ2）6−であ
    るものであり、但し、Ｅ1およびＥ2の一つだけはＨであるという条件付きであり
    ；そして Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、Ｃ2−Ｃ10アルキニル
    、Ｃ6−Ｃ14アリールまたはチオ保護基である］ を有する少なくとも１個の部分を含むオリゴマー化合物。
  18. 【請求項１８】 Ｅ1およびＥ2がそれぞれＣ1−Ｃ10アルキルである請求項
    １７に記載のオリゴマー化合物。
  19. 【請求項１９】 Ｅ1がＨであり、Ｅ2が−（ＣＨ2）m−Ｓ−Ｒ4である請求
    項１７に記載のオリゴマー化合物。
  20. 【請求項２０】 Ｒ4がＣ1−Ｃ10アルキルである請求項１９に記載のオリゴ
    マー化合物。
  21. 【請求項２１】 Ｒ4がメチルである請求項２０に記載のオリゴマー化合物
    。
  22. 【請求項２２】 Ｅ2が−｛（ＣＨ2）nn−Ｎ（Ｈ）｝nnn−（ＣＨ2）nnＮＨ 2 であり、但し、それぞれｎｎは２〜４であり、ｎｎｎは２〜１０である請求項
    １７に記載のオリゴマー化合物。
  23. 【請求項２３】 Ｅ2が−（ＣＨ2）3−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ2）4−Ｎ（Ｈ）−
    （ＣＨ2）3−ＮＨ2または−（ＣＨ2）4−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ2）3−ＮＨ2である請
    求項２２に記載のオリゴマー化合物。
  24. 【請求項２４】 Ｅ2が、結合葉酸部分または５−メチルテトラヒドロ葉酸
    部分である請求項１９に記載のオリゴマー化合物。
  25. 【請求項２５】 Ｅ2がコレステロール部分である請求項１７に記載のオリ
    ゴマー化合物。
  26. 【請求項２６】 Ｅ2が前記ポリペプチドである請求項１７に記載のオリゴ
    マー化合物。
  27. 【請求項２７】 前記ポリペプチドが、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−
    Ｔｒｐ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓである請求項２６に記載
    のオリゴマー化合物。
  28. 【請求項２８】 前記複素環式塩基部分が、プリンラジカルまたはピリミジ
    ンラジカルである請求項１７に記載のオリゴマー化合物。
  29. 【請求項２９】 前記複素環式塩基部分が、アデニニル、シトシニル、５−
    メチルシトシニル、チミニル、ウラシリル、グアニニルまたは２−アミノアデニ
    ニルである請求項２８に記載のオリゴマー化合物。
  30. 【請求項３０】 約５〜約５０個のヌクレオシドを含む請求項１７に記載の
    オリゴマー化合物。
  31. 【請求項３１】 約８〜約３０個のヌクレオシドを含む請求項１７に記載の
    オリゴマー化合物。
  32. 【請求項３２】 約１５〜約２５個のヌクレオシドを含む請求項１７に記載
    のオリゴマー化合物。
  33. 【請求項３３】 Ｅ1およびＥ2がＣＨ3である請求項１７に記載のオリゴマ
    ー化合物。
  34. 【請求項３４】 Ｅ1がＨであり、Ｅ2がＣＨ3である請求項１７に記載のオ
    リゴマー化合物。
  35. 【請求項３５】 オリゴマー化合物を製造する方法であって、 （ａ）式 【化３】 ［式中、Ｂｘは、保護されていてよい複素環式塩基部分であり； Ｅ3およびＥ4は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換または非置換のＣ 1 −Ｃ10アルキル、置換または非置換のＣ2−Ｃ10アルケニル、置換または非置換
    のＣ2−Ｃ10アルキニルであり、ここにおいて、該置換は、ＯＲ3、ＳＲ3、ＮＨ3 + 、Ｎ（Ｒ3）（Ｒ4）、グアニジノ、−（ＣＨ2）nn−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、−（Ｃ
    Ｈ2）nn−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2または−（ＣＨ2）nn−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ2） nn −ＣＨ3であり、但し、ｎｎはそれぞれ１〜１０であり； Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アル
    ケニル、Ｃ2−Ｃ10アルキニル、Ｃ6−Ｃ14アリール、窒素保護基、チオ保護基で
    あり、またはＲ3およびＲ4は一緒に、窒素保護基であり；または Ｒ3およびＲ4は、ＮおよびＯより選択される追加のヘテロ原子を含んでいてよ
    い環構造中で結合している］ を有する少なくとも１個の部分を有する、固体支持体に結合したオリゴマー化合
    物を選択し； （ｂ）該固体支持体に結合したオリゴマー化合物と水酸化アンモニウム溶液と
    を周囲温度で接触させて、塩基性混合物を生じ；そして （ｃ）アルキルアミン溶液を該塩基性混合物に周囲温度で加えて、該オリゴマ
    ー化合物を提供する工程を含む方法。
  36. 【請求項３６】 前記水酸化アンモニウムとの前記接触が約１時間〜約３時
    間である請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記接触が約２時間である請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記溶液中の水酸化アンモニウムの濃度が約２０％〜飽和
    状態である請求項３５に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記溶液中の水酸化アンモニウムの濃度が飽和状態である
    請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記周囲温度が約１５℃〜約３０℃である請求項３５に記
    載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記周囲温度が約２０℃〜約２５℃である請求項４０に記
    載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記アルキルアミンがメチルアミンである請求項３５に記
    載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記メチルアミンの溶液が、水中に約３０％〜約５０％メ
    チルアミンである請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記メチルアミンの溶液が４０％である請求項４３に記載
    の方法。
  45. 【請求項４５】 工程（ｃ）を約１０時間〜約３０時間にわたって行う請求
    項３５に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 工程（ｃ）を約２６時間にわたって行う請求項４４に記載
    の方法。
  47. 【請求項４７】 前記固体支持体が制御細孔ガラス（ＣＰＧ）である請求項
    ３５に記載の方法。
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