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JP2003519478A - Ｇ−ｃｓｆ結合体 - Google Patents

Ｇ−ｃｓｆ結合体

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JP2003519478A
JP2003519478A JP2001551094A JP2001551094A JP2003519478A JP 2003519478 A JP2003519478 A JP 2003519478A JP 2001551094 A JP2001551094 A JP 2001551094A JP 2001551094 A JP2001551094 A JP 2001551094A JP 2003519478 A JP2003519478 A JP 2003519478A
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csf
amino acid
conjugate
acid sequence
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Maxygen Holdings Ltd
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、G-CSF活性を有し、非ポリペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基が少なくとも１つ特異的に導入および／または除去されている点においてヒトG-CSFのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有し、G-CSF活性を有しているポリペプチドを含有し、該ポリペプチドの結合基に結合している少なくとも１つの非ポリペプチド部分を有しているポリペプチド結合体に関する。結合基は例えば、リジン、システイン、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基またはグリコシル化部位であってよく、非ポリペプチド部分は例えば、ポリエチレングリコールまたはオリゴサッカライドなどの重合体であってよい。本発明の結合体は、生物学的半減期の増大および副作用の減少など、１つまたはそれ以上の改良された特性を有している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）活性を有する新規なポリペプチ
ド、G-CSF活性を有するポリペプチドと非ポリペプチド部分との結合体、このよ
うなポリペプチドまたは結合体を調製するための方法、およびこのようなポリペ
プチドまたは結合体の治療、特に白血球減少症の処置における使用に関する。
【０００２】
【発明の背景】
白血球が骨髄において成長し、分裂し、分化する工程は血球新生と呼ばれる（
Dexter and Spooncer、Ann. Rev. Cell. Biol.、3:423, 1987）。血液細胞タイ
プそれぞれは、多能性幹細胞から生じる。インビボにおいて産生される血液細胞
には一般に、赤血球、血小板および白血球の３つのクラスがあり、大多数の後者
が宿主免疫防御に関与している。造血性前駆細胞の増殖および分化は、G-CSFや
インターロイキン類などのコロニー刺激因子（CSFs）などのサイトカインのファ
ミリーによって調節されている（Arai et al.、Ann. Rev. Biochem.、59:783-83
6, 1990）。インビボにおけるG-CSFの基本的な生物作用は、好中顆粒球または好
中球として知られている特定の白血球の成長および発育の刺激である（Welte et
al.、PNAS-USA 82:1526-1530, 1985、Souza et al.、Science、232:61-65, 198
6）。好中顆粒球は血流に放出されると、細菌感染と戦うよう機能する。
【０００３】 ヒトG-CSF (hG-CSF) のアミノ酸配列はNagata et al. Nature 319:415-418, 1
986によって報告された。hG-CSFは、２つのG-CSF分枝と２つの受容体の２：２複
合体の形成によってG-CSF受容体を二量体化する単量体タンパク質である(Horan
et al. (1996)、Biochemistry 35(15): 4886-96)。Aritomi et al. Nature 401:
713-717, 1999は、hG-CSFとG-CSF受容体のBN-BCドメインとの複合体のX線構造を
記載している。彼らは、以下のhG-CSF残基を受容体結合界面の一部として同定し
ている：G4、P5、A6、S7、S8、L9、P10、Q11、S12、L15、K16、E19、Q20、L108
、D109、D112、T115、T116、Q119、E122、E123、およびL124。大腸菌（Escheric
hia coli）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）お
よび哺乳動物細胞におけるrhG-CSFの発現が報告されている (Souza et al.、Sci
ence 232:61-65, 1986、Nagata et al.、Nature 319: 415-418, 1986、Robinson
and Wittrup、Biotechnol. Prog. 11:171-177, 1985)。
【０００４】 組換えヒトG-CSF (rhG-CSF)は一般に、種々の形態の白血球減少症の処置に使
用される。つまり、rhG-CSFの市販品は、フィルグラスチン（filgrastim：GranT M およびNeupogenTM）、レノグラスチン（lenograstim：NeutroginTMおよびGran
ocyteTM）、およびナルトグラスチム（nartograstim：Neu-upTM）の名称にて入
手可能である（「TM」は登録商標を示す）。GranTM およびNeupogenTM は非グリ
コシル化型であり、組換え大腸菌細胞において産生される。NeutroginTM および
GranocyteTM はグリコシル化型であり、組換えCHO細胞において、Neu-upTM は
非グリコシル化型であり、組換え大腸菌細胞において産生される無傷のrhG-CSF
のN末端領域において５つのアミノ酸が置換されている。
【０００５】 hG-CSFのいくつかのタンパク質工学的変異体が報告されている(US 5,581,476
、US 5,214,132、US 5,362,853、US 4,904,584 および Riedhaar-Olson et al.
Biochemistry 35: 9034-9041, 1996)。hG-CSFおよび他のポリペプチドを修飾し
、天然のポリペプチドに比較して少なくとも１つの付加的な炭水化物鎖を導入す
ることが示唆されている(US 5,218,092)。ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミ
ノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸挿入によって修飾し、付加的な炭水化物
鎖を付加することができると述べられている。さらに、PEG基の結合等の天然hG-
CSFの重合化修飾が報告されている(Satake-Ishikawa et al.、Cell Structure a
nd Function 17:157-160、1992、US 5,824,778、US 5,824,784、WO 96/11953、W
O 95/21629、WO 94/20069)。
【０００６】 Bowen et al.、Experimental Hematology 27 (1999), 425-432は、PEG結合G-C
SFムテインの分子塊と活性持続との関係に関する研究を開示している。タンパク
質に結合するPEG部分の分子量とインビトロ活性との明白な逆相関が示唆された
が、インビボ活性は分子量の増大に伴って増大した。受容体介在性のエンドサイ
トーシシ（飲食作用）は造血成長因子のレベルを調節する重要な機序であるため
、結合体の低親和性は半減期を増大させるよう作用すると考えられる。
【０００７】 市販されているrhG-CSFは、短期の薬理作用しか有しておらず、白血球減少状
態期に１日１回以上を投与しなければならないことが多い。長い循環半減期を有
する分子は、白血球減少症を緩和し結果として生じる感染症を予防するに必要な
投与回数を減少させる。現在市販されているrG-CSF製品の別の問題は、用量依存
的な骨の痛みが生じることである。骨の痛みはrG-CSFでの処置の重要な副作用と
して患者に経験され、従って、この副作用を本来的に有さない産物、あるいは骨
の痛みを起こさないほどに充分な低用量にて有効である産物によって、骨の痛み
を生じさせないrG-CSF産物が望まれる。このように、改良された組換えG-CSF様
分子が要求されていることは明らかである。
【０００８】 半減期に関して、タンパク質の循環半減期を増大させる１つの方法は、タンパ
ク質のクリアランス、詳細には腎クリアランスおよび受容体介在せいクリアラン
スを減少させることである。これは、見かけのサイズを増大できる化学部分にタ
ンパク質を結合させることにより達成でき、それにより腎クリアランスは減少し
、インビボ半減期は増大する。さらに、タンパク質に化学部分を結合させると、
タンパク分解酵素がタンパク質に物理的に接触するのを効果的にブロックするこ
とができ、それにより非特異的なタンパク分解による分解を防止できる。ポリエ
チレングリコール（PEG）は、１つのこのような化学部分であり、これは治療的
タンパク質産物の調製に用いられている。単一のPEG基によってN末端が修飾され
ているG-CSF分子（SD/01と命名）は、現在臨床試験に供されている。このPEG化G
-CSF分子は非GEG化G-CSFよりも半減期が増大していることが示されているが、低
活性であるため、その高用量を投与しなければならない。その結果、上述の骨の
痛みの問題はこの分子では依然解決されていない。さらに、既知のG-CSF分子に
は、半減期の点においてさらなる改良の余地がある。 このように、白血球減少症を処置するのに有用であり、かつ半減期増大および
副作用減少の点において改良されている、G-CSF活性を有する新規な分子を提供
する要望は依然存在する。本発明はこのような分子に関する。
【０００９】
【発明の概要】
より詳細には、本発明は、G-CSF活性を有するポリペプチドおよび非ポリペプ
チド部分を含有する特定の結合体、その調製方法、および医療的処置および医薬
の製造におけるそれらの使用に関する。従って、第１の態様として、本発明は、
非ポリペプチド部分との結合基を含む少なくとも１つの特定の改変アミノ酸残基
の点において配列番号１のヒトG-CSFの既知のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配
列を含有する、G-CSF活性を有するポリペプチドを含有し、かつ該ポリペプチド
の結合基と結合している少なくとも１つの非ポリペプチド部分を有する、種々の
具体的な結合体に関する。本発明の結合体は、市販されているrhG-CSFと比較し
て改良されている１つまたはそれ以上の特性、例えば機能的インビボ半減期の増
大、血清半減期の増大、副作用の減少、免疫原性の減少および／またはバイオア
ベイラビリティーの増大を有している。従って、本発明の結合体による医療的処
置は、現在利用可能なG-CSF化合物に比し、数多くの利点を提供するものである
。
【００１０】 別の態様では、本発明は、本発明の結合体の一部を形成するG-CSF活性を有す
るポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、治療、診断または他の用途
に有用であると考えられるが、本発明の結合体の調製における中間生成物として
特に興味深い。
【００１１】 さらに別の態様では、本発明は、非ポリペプチド部分との結合基を含む導入ま
たは除去アミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の点において
hG-CSFのアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸配列を有する）と異なるアミノ酸
配列を含有する、G-CSF活性を有するポリペプチドを含有するポリペプチド結合
体であって、既知の組換えG-CSF産物と比較して増大した半減期を有する結合体
を提供するに充分な数またはタイプの非ポリペプチド部分を含有する該ポリペプ
チド結合体に関する。
【００１２】 さらなる別の態様として、本発明は、本発明の結合体を調製する方法に関し、
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、そのようなヌクレオチド
配列を含有する発現ベクター、およびそのようなヌクレオチド配列または発現ベ
クターを含有する宿主細胞を包含する。
【００１３】 最後の態様として本発明は、本発明の結合体またはポリペプチドを含有する組
成物、医薬組成物を調製する方法、本発明の結合体または組成物における医薬と
しての使用、このような組成物によるほどの処置方法に関する。詳細には、本発
明のポリペプチド、結合体または組成物は、特定のタイプの放射線療法、化学療
法および骨髄移植を受けている癌患者における感染症を予防し、末梢血前駆細胞
移植において前駆細胞を流動化させて採取し、重篤な慢性または相対的白血球減
少症をその原因を問わず処置し、そして急性骨髄性白血病の患者の処置を補助す
るために使用することができる。さらに、本発明のポリペプチド、結合体または
組成物は、AIDSまたは他の免疫不全疾患、および細菌感染症の処置に使用するこ
とができる。
【００１４】
【発明の詳しい説明】定 義 本明細書および請求の範囲では、次の定義が採用される： 「結合体」なる用語は、１つまたはそれ以上のポリペプチド、典型的には単一
のポリペプチドが１つまたはそれ以上の非ポリペプチド部分、例えば重合体分子
、脂肪親和性化合物、炭水化物部分または有機誘導化剤と共有結合することによ
り形成される異種性分子を意味する。共有結合なる用語は、ポリペプチドおよび
非ポリペプチド部分が、共有結合により互いに直接結合していること、または架
橋、スペーサーもしくは連結部分（群）などの介在部分（群）を介して共通結合
により互いに間接的に結合していることのいずれかを意味する。結合体は、適当
な濃度および条件にて可溶性であること、即ち血液などの生理学的体液にて可溶
性であることが好ましい。「非結合ポリペプチド」とは、結合体のポリペプチド
部分について使用することができる。 「ポリペプチド」なる用語は、本明細書では「タンパク質」なる用語と交換可
能に使用できる。
【００１５】 「重合体分子」とは２つまたはそれ以上の単量体の共有連結によって形成され
る分子であり、ここに単量体は、重合体がヒトアルブミンまたは他の豊富な血漿
タンパク質である場合を除き、いずれもアミノ酸残基ではない。「重合体」なる
用語は、「重合体分子」なる用語と交換可能に使用することができる。この用語
は炭水化物分子も包含するが、通常この用語はインビボN-またはO-グリコシル化
によってポリペプチドと結合されるタイプの炭水化物分子（以下の詳細を示す）
は包含せず、このような分子は本明細書では「オリゴサッカライド部分」と称す
る。重合体分子の数を明示する場合を除き、本発明のポリペプチドに含まれるま
たは本発明にて他の用途に使用される「重合体」、「重合体分子」、「該（その
）重合体」または「該（その）重合体分子」なるすべての用語は、１つまたはそ
れ以上の重合体分子を意味するものである。
【００１６】 「結合基」なる用語は、適当な非ポリペプチド部分とカップリングできるポリ
ペプチドのアミノ酸残基の基を意味する。例えば、重合体結合、特にPEGに対し
て頻繁に使用される結合基は、リジンのε-アミノ基またはN-末端アミノ基であ
る。他の重合体結合基には、遊離カルボン酸基（例えば、C-末端アミノ酸残基ま
たはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基の遊離カルボン酸基）、適当に活
性化されたカルボニル基、酸化炭水化物部分およびメルカプト基がある。有用な
結合基およびその適合非ペプチド部分は以下の表から明らかである。
【００１７】
【表１】
【表２】
【表３】
【００１８】 インビボN-グリコシル化について、「結合基」なる用語は、N-グリコシル化部
位を構成するアミノ酸残基（配列：N-X'-S/T/C-X''、ここにX'はプロリンを除く
アミノ酸残基であり、X''はX'と同一であってもなくてもよい、好ましくはプロ
リンとは異なるアミノ酸残基であり、Nはアスパラギンであり、S/T/Cはセリン、
スレオニンまたはシステインであり、好ましくはセリンまたはスレオニンであり
、最も好ましくはスレオニンである）を示すものとして通常でない態様で使用さ
れる。N-グリコシル化部位のアスパラギン残基はオリゴサッカライド部分がグリ
コシル化する際に結合する部分であるが、そのような結合はN-グリコシル化部位
の他のアミノ酸残基が存在しない限り起こり得ない。従って、非ペプチド部分が
オリゴサッカライド部分であり、結合がN-グリコシル化によって起こる場合は、
目的ペプチドのアミノ酸配列の改変に関連して使用される「非ペプチド部分との
結合基を含むアミノ酸残基」とは、機能的N-グリコシル化部位がアミノ酸配列に
導入されるかまたは該配列から除去されるようにN-グリコシル化部位を構成する
１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変される意味と理解されるべきである。
【００１９】 本発明出願では、アミノ酸名および元素名（例えば、CA、CB、NZ、N、O、Cな
ど）はProtein DataBank (PDB) (www.pdb.org) にしたがって使用しており、こ
れは、IUPAC 命名法 (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and
Peptides (残基名、元素名など), Eur. J. Biochem.，138、9-37 (1984) を基
準にしてEur. J. Biochem., 152、1 (1985)にて修正されている。「アミノ酸残
基」なる用語は、20個の天然に存在するアミノ酸を構成する群に包含されるアミ
ノ酸残基を主として示している：即ち、アラニン (AlaまたはA)、システイン (C
ysまたはC)、アスパラギン酸 (AspまたはD)、グルタミン酸 (GluまたはE)、フェ
ニルアラニン (PheまたはF)、グリシン (GlyまたはG)、ヒスチジン (HisまたはH
)、イソロイシン (IleまたはI)、リジン (LysまたはK)、ロイシン (LeuまたはL)
、メチオニン (MetまたはM)、アスパラギン (AsnまたはN)、プロリン (Proまた
はP)、グルタミン (GlnまたはQ)、アルギニン (ArgまたはR)、セリン (Serまた
はS)、スレオニン (ThrまたはT)、バリン (ValまたはV)、トリプトファン (Trp
またはW)、およびチロシン (TyrまたはY) 残基である。
【００２０】 アミノ酸部位/置換を同定するために使用する用語は次のようである： F13は
参照アミノ酸配列においてフェニルアラニンが13位を占めていることを示してい
る。F13Kは、13位のフェニルアラニン残基とリジン残基が置換されていることを
示している。特に明記しない限り、本明細書に示すアミノ酸残基の番号は、配列
番号１のhG-CSFのアミノ酸配列に対して示している。別の置換は「/」によって
示され、例えばQ67D/Eは、67位のグルタミンがアスパラギン酸またはグルタミン
酸のいずれかと置換されているアミノ酸配列を意味する。多数の置換は「+」に
よって示され、例えばS53N+G55S/Tは、53位のセリン残基がアスパラギン残基と
置換され、かつ55位のグリシン残基がセリンまたはスレオニン残基と置換されて
いるアミノ酸配列を意味している。
【００２１】 「ヌクレオチド配列」なる用語は、２つまたはそれ以上のヌクレオチド分子の
連続した繋がりを示している。ヌクレオチド配列はゲノム、cDNA、RNA、半合成
または合成起源、またはこれらの組合わせであることができる。
【００２２】 「ポリメラーゼ鎖反応」または「PCR」なる用語は一般に、所望のヌクレオチ
ド配列をインビトロにおいて増幅する方法を意味し、例えばUS 4,683,195に記載
されている。一般に、PCR法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズできるオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用する、プライマー伸張合成の反復サイクルを包
含する。
【００２３】 「細胞」、「宿主細胞」、「細胞系統」および「細胞培養（物）」は本明細書
では交換可能に用いられ、これらはすべて、細胞の発育または培養から生じる子
孫を包含するものと理解すべきである。「形質転換」および「トランスフェクシ
ョン」は交換可能に用いられ、DNAを細胞に導入する方法を意味する。
【００２４】 「作動可能に連結」とは、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が通常の機
能を保持するよう互いに相対的配座を持ちつつ、酵素的連結またはそれ以外によ
りそれら配列が共有結合することを意味する。例えば、プレ配列または分泌リー
ダーをコードするヌクレオチド配列がポリペプチドのヌクレオチドと作動可能に
連結しているとは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として
発現された場合である； プロモーターまたはエンハンサーが作動可能にコード
配列と連結しているとは、それが配列の転写に影響する場合である； リボゾー
ム結合部位がコード配列と作動可能に連結しているとは、それが翻訳できるよう
に位置している場合である。一般に、「作動可能に連結」とは、連結するヌクレ
オチド配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接および解読枠内である。
連結は、通常の制限部位における結合によって行われる。このような部位が存在
しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを標準的な組換
えDNA法とともに使用する。
【００２５】 「導入」なる用語は、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基
の導入を意味し、特に存在するアミノ酸残基の置換によるもの、または付加的な
アミノ酸残基の挿入によるものである。「除去」なる用語は、非ポリペプチド部
分のための結合基を含むアミノ酸残基の除去を意味し、特に別のアミノ酸残基に
よって除去されるアミノ酸残基の置換によるもの、または除去するアミノ酸残基
の欠失（置換を除く）によるものである。
【００２６】 親ポリペプチドに対して置換を行う場合、「保存的置換」が好ましく、即ち類
似の特性を有するアミノ酸群間、例えば小アミノ酸群間、酸性アミノ酸群間、極
性アミノ酸群間、塩基性アミノ酸群間、疎水性アミノ酸群間および芳香族アミノ
酸群間での置換が好ましい。 本発明において好ましい置換は具体的には、以下の表に示す保存的置換の中か
ら選択することができる。
【００２７】
【表４】 保存的置換群
【００２８】 特定の物質に関連して使用している「免疫原性」なる用語は、免疫系由来の応
答を誘導できるその物質の能力を示す。免疫応答は細胞または抗体性応答のいず
れであってもよい（例えば、さらに詳細な免疫原性についてはRoitt: Essential
Immunology (8th Edition、Blackwell)を参照）。通常、抗体反応の減少は、免
疫原性の減少を示している。免疫原性の減少は、当業者に既知の適当なインビボ
またはインビトロ方法によって測定することができる。
【００２９】 「機能的インビボ半減期」なる用語は通常の意味で用いており、即ちポリペプ
チドまたは結合体の生物活性の50%が体内/標的器官において依然存在している時
間、またはポリペプチドまたは結合体の活性が初期値の50％になる時間である。
機能的インビボ半減期を測定するための代替法として「血清半減期」、即ちポリ
ペプチドまたは結合体分子の50%が消失前に血漿または血流中に循環する時間を
測定すればよい。血清半減期の別の用語には、「血漿半減期」、「循環半減期」
、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」
などがある。ポリペプチドまたは結合体は、細網内皮系(RES)、腎、脾または肝
臓の１つまたはそれ以上の作用により、受容体介在性分解により、特異的または
非特異的タンパク質分解により、具体的には受容体介在性クリアランスおよび腎
クリアランスの作用により消失する。通常、クリアランスはタンパク質のサイズ
（糸球体濾過の遮断性と比較したサイズ）、帯電性、結合する炭水化物鎖、およ
びタンパク質に対する細胞受容体の存在に応じて変動する。保持されるべき機能
は通常、増殖または受容体結合活性から選択される。機能的インビボ半減期およ
び血清半減期は、当業者に既知の適当な手法により測定でき、その詳細は以下の
材料および方法にて説明している。
【００３０】 機能的インビボ半減期または血清半減期について使用している「増大」なる用
語は、結合体またはポリペプチドの適当な半減期が非結合hG-CSF (例えば Neupo
genTM)などの対照分子に対して、同等の条件下で測定して統計的に有意に増大・
増加していることを示している。例えば、相当する半減期は、少なくとも約25％
、例えば少なくとも約50%、例えば少なくとも約100%、200%、500%または1000%増
大することがある。
【００３１】 「腎クリアランス」なる用語は、腎臓にて起こるクリアランスを示す通常の意
味で使用しており、例えば糸球体濾過、尿細管排泄または尿細管除去による。腎
クリアランスは結合体の物性、例えばサイズ（直径）、対称性、形状/剛性およ
び帯電性によって変動する。腎クリアランスの減少は、例えば確立されたインビ
ボ検定などの適当な検定によって確立することができる。典型的には、腎クリア
ランスは、標識（例えば放射線または蛍光標識）ペプチド結合体を患者に投与し
、患者から採取した尿中の標識活性を測定することにより測定される。腎クリア
ランスの減少は、対応する対照ポリペプチド、例えば対応する非結合ポリペプチ
ド、非結合対応野生型ポリペプチドまたは別の結合ポリペプチド（例えば、本発
明に関するものでない結合ポリペプチド）を同等の条件下で比較して測定される
。好ましくは、本発明の結合体の腎クリアランス速度は相当する対照ポリペプチ
ドと比較して少なくとも約50%減少しており、より好ましくは少なくとも75%、最
も好ましくは少なくとも90%減少するものである。
【００３２】 一般に、受容体の活性化は受容体介在性クリアランス(RMC)と共役しており、
そこではポリペプチドのその受容体に対する、活性化を伴わない結合はRMCを導
かず、他方で受容体の活性化はRMCを導びく。クリアランスは受容体結合ポリペ
プチドの内部移行とその後のリソゾーム分解に由来する。RMCの減少は、最適な
インビボ生物応答を得るに充分な数の受容体であって、そのような応答を得るの
に必要な数より多い受容体の活性化を回避している数の受容体と結合し活性化で
きるよう、結合体をデザインすることにより行うことができる。これは、インビ
トロ生物活性の減少および/またはオフ・レイト(off-rate)の増大に反映され得
る。
【００３３】 典型的には、インビトロ生物活性の減少は、効能/効果の減少および/または力
価の減少に反映され、それらの性質のいずれかを測定するための適当な方法によ
って測定できる。例えば、インビトロ生物活性はルシフェラーゼ基本検定におい
て測定できる（材料および方法の項参照）。本発明の結合体のインビトロ生物活
性は、同等の条件下で測定される対応する対照ポリペプチドのインビトロ生物活
性と比較して少なくとも30%、例えば少なくとも50%、60%または75%、例えば少な
くとも90%減少することができる。換言すれば、本発明の結合体は、対応する非
結合ポリペプチドまたは対応する野生型ポリペプチドのインビトロ生物活性の約
1%ほどに小さく、典型的には少なくとも約2%、例えば少なくとも約5%であり得る
。例えば、インビトロ生物活性は同等の条件下に測定される対照ポリペプチドの
約1-50%の範囲、例えば約2-40%、例えば約5-25%の範囲であり得る。受容体介在
生クリアランスを減少させるためにインビトロ生物活性の減少が望まれる場合に
は、所望の受容体活性を得るために充分な生物活性が依然維持されなければなら
ないことは明らかであろう。
【００３４】 ポリペプチド結合体とその受容体間のオフ・レイトの増大は大きいほうが好ま
しく、それにより受容体−リガンド複合体の実質的な内部移行が起こる前に受容
体からポリペプチド結合体が遊離される。受容体−ポリペプチド結合親和性（オ
フ・レイトなど）は以下の材料および方法の項において説明するようにして測定
できる。インビトロRMCは、ポリペプチド結合体を標識（例えば放射活性または
蛍光標識）し、ポリペプチドの受容体を含む細胞を刺激し、その細胞を洗浄し、
そして標識活性を測定することにより測定できる。あるいは、結合体を、相当す
る受容体を発現している細胞に暴露させてもよい。適当なインキュベート時間の
後、上清を取り出し、類似の細胞を含むウエルに移す。その細胞の上清に対する
生物学的応答を非結合ペプチドまたは別の対照ポリペプチドと比較して測定し、
そうすればRMCの減少の程度が測定される。
【００３５】 通常、結合体のインビトロ生物活性は、非ポリペプチド部分による修飾の結果
として得られる。しかし、インビトロ生物活性をさらに減少させるため、または
他の理由により、結合体のポリペプチド部分をさらに修飾することが興味深い場
合がある。例えば、ポリペプチドの受容体結合部位にまたはその近傍に位置する
少なくとも１つのアミノ酸残基を対応する野生型ポリペプチドと比較して置換す
ることによりインビトロ生物活性を減少させることができることが１例である。
置換により導入するアミノ酸残基は結合体のインビトロ生物活性を減少できるあ
らゆるアミノ酸残基とすることができる。通常、導入されたアミノ酸残基は本明
細書にて定義する非ポリペプチド部分との結合基を含む。具体的には、非ポリペ
プチド部分がPEGなどの重合体分子である場合、導入されるアミノ酸残基はリジ
ン残基とすることができる。
【００３６】 「G-CSF活性を有する」なる用語は、ポリペプチドまたは結合体が天然のG-CSF
、具体的には配列番号１に示すアミノ酸配列を有するhG-CSFの１つまたはそれ以
上の機能を有していることを意味し、それにはG-CSF受容体との結合能が含まれ
る(Fukunaga et al.、J. Bio. Chem、265:14008, 1990)。G-CSF活性は通常、以
下に示す材料および方法の項に記載する一次検定によって検定される。G-CSF活
性を「有する」ポリペプチドは、測定可能な増殖活性または受容体結合活性（例
えば材料および方法の項に記載する一次検定によって測定される）などの測定可
能な機能を表示するとこのような活性を有すると考えられる。G-CSF活性を有す
るポリペプチドを本明細書では「G-CSF分子」と称することがある。
【００３７】 「親G-CSF」または「親ポリペプチド」なる用語は、本発明によって修飾され
る分子を示している。親G-CSFは通常hG-CSFまたはその変異体である。「変異体
」とは親ポリペプチドとは１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なっているポ
リペプチドであり、通常1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 or 1
5個のアミノ酸残基が異なっている。rhG-CSFの例は、フィルグラスチン（filgra
stim：GranTM およびNeupogenTM）、レノグラスチン（lenograstim：NeutroginT M およびGranocyteTM）、およびナルトグラスチム（nartograstim：Neu-upTM）な
どである。
【００３８】本発明の結合体 上述のように、本発明は第１の態様として、非ポリペプチド部分との結合基を
含む特定の導入または除去アミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸
残基の点において配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有する、
G-CSF活性を有するポリペプチドを含有し、かつ該ポリペプチドの結合基と結合
している少なくとも１つの非ポリペプチド部分を有する、結合体に関する。導入
および/または除去されるアミノ酸残基は以下の項にてさらに詳細に説明する。
本発明の結合体自身、G-CSF活性を有していることも理解されよう。
【００３９】 非ポリペプチド部分との結合基を含むアミノ酸残基の除去および／または導入
によって、ポリペプチドを、選択した非ポリペプチド部分との結合性に対して感
受性にし、結合パターンを最適化（例えば非ポリペプチド部分のG-CSF分子表面
における分布を最適にし、また結合しようとする結合基のみが分子に存在するよ
うにする）するよう特異的に適合することが可能となり、それによりG-CSF活性
を有しかつさらに現在利用されているG-CSF分子と比較して改良された１つまた
はそれ以上の特性を有する新たな結合体分子が得られる。
【００４０】 ポリペプチドの起源は特に哺乳類起源などいずれでもよいが、ヒト起源が本発
明では好ましい。 本発明の好ましい態様では、G-CSF活性を有するポリペプチドの１つ以上のア
ミノ酸残基を改変、例えば改変により選択して非ポリペプチド部分の結合基を含
むアミノ酸残基を除去および導入する。 非ポリペプチド部分の結合基を除去および／または導入する目的にて本明細書
に開示しているアミノ酸改変に加え、本明細書のポリペプチドのアミノ酸配列は
要すれば、結合部位の導入または除去には必要でない別の改変、例えば別の置換
、挿入または欠失も含むことができることは理解されよう。これには例えば、１
つまたはそれ以上のアミノ酸残基が断頭しているN-および／またはC-末端、また
はN-および／またはC-末端における１つまたはそれ以上の付加的な残基の付加、
例えばN-末端におけるメチオニン残基の付加がある。
【００４１】 本発明の結合体はhG-CSF、特にrhG-CSF（例えばfilgrastim、lenograstim ま
たはnartograstim）または既知のhG-CSF変異体と比較して改良されている１つま
たはそれ以上の以下の性質を有している：機能的インビボ半減期の増大、血清半
減期の増大、腎クリアランスの減少、受容体介在性クリアランスの減少、骨の痛
みなどの副作用の減少、および免疫原性の減少。
【００４２】 非ポリペプチド部分との結合基を含むアミノ酸残基はそれが除去されたもので
あろと導入されたものであろうと、選択する非ポリペプチド部分の性質に基づい
て選択され、最も多くの場合、ポリペプチドと非ポリペプチド部分との結合体が
得られる方法に基づいて選択される。例えば、非ペプチド部分がポリエチレング
リコールまたはポリアルキレンオキサイド誘導化分子などの重合体分子の場合、
結合基を含有するアミノ酸残基はリジン、システイン、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択することができる。リ
ジン残基との結合体を得る場合、適当な活性化分子は、例えばShearwater Polym
ers, Inc.から得られるmPEG-SPA、オキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシイ
ミド-PEG (US 5,122,614)、またはPolyMASC Pharmaceuticals plcから市販され
ているPEGである。その最初の例示は以下にて詳細に説明する。
【００４３】 親hG-CSF分子の構造および機能の過ぎたる破壊を避けるため、本発明によって
改変されるべきアミノ酸残基の総数は例えば、本明細書の以下の項に記載すると
おりであり（配列番号１のアミノ酸配列と対比）、通常は１５を越えない。導入
または除去されるアミノ酸残基の正確な数や残基の型は具体的には、結合体にお
ける所望の性質やその程度に依存する（例えば、非ポリペプチド部分が何である
か、ポリペプチドと結合できるまたは結合を望む非ポリペプチド部分の数、結合
体をどこで所望するか、または回避すべきであるか、等）。好ましくは、本発明
の結合体のポリペプチド部分または本発明のポリペプチドは配列番号１のアミノ
酸配列と1-15アミノ酸残基が、典型的には配列番号１のアミノ酸配列と2-10アミ
ノ酸残基、例えば3-8アミノ酸残基、例えば4-6アミノ酸残基が相違している。従
って、本発明の結合体のポリペプチド部分またはポリペプチドは、配列番号１の
アミノ酸配列と1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミ
ノ酸残基が相違しているアミノ酸配列を含有する。
【００４４】 本発明結合体のポリペプチド部分は典型的には、配列番号１と少なくとも約８
０％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％の同
一性を有するアミノ酸配列を有している。アミノ酸配列相同性/同一性は通常、
配列のアライメントによって決定され、ここでは例えば、デフォルト・パラメー
ター（Thompson et al., 1994、ClustalW: Improving the sensitivity of prog
ressive multiple sequence alignment through sequence weighting、position
-specific gap penalties and weight matrix choice、Nucleic Acids Research
、22: 4673-4680）を用いるClustalWプログラム、バージョン1.8（1999、6月）
またはGENEDOC バージョン 2.5 (Nicholas、K.B.、Nicholas H.B. Jr.、and Dee
rfield、D.W. II. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Var
iation、EMBNEW.NEWS 4:14; Nicholas、K.B. and Nicholas H.B. Jr. 1997 Gene
Doc: Analysis and Visualization of Genetic Variation)を用いるPFAMファミ
リーデータベース、バージョン4.0（http://pfam.wustl.edu/）（Nucleic Acids
Res. 1999 Jan 1; 27(1):260-2）を用いる。
【００４５】 好ましい態様では、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１のアミ
ノ酸配列との１つの相違は、非ポリペプチド部分との結合基を含む少なくとも１
つの、多くはそれ以上の例えば1-15のアミノ酸残基がアミノ酸配列に好ましくは
置換によって導入されている。それにより、ポリペプチド部分は選択した非ポリ
ペプチド部分が結合する特定のアミノ酸残基について改変され、そうすることに
よりより効率的な特異的なおよび/または膨大な結合体が得られる。例えば、選
択する非ポリペプチドの結合基を含むアミノ酸残基の総数を最適レベルにまで変
動すると、得られた結合体のクリアランスは通常、その改変された結合体分子の
形状、サイズおよび/または帯電性によって有意に減少する。さらに、選択する
非ポリペプチドの結合基を含むアミノ酸残基の総数を増やすと、割合の増えたポ
リペプチド分子が選択した非ポリペプチド部分によって遮蔽され、免疫応答性が
低くなる。
【００４６】 本明細書にて使用している「１つの相違」なる用語は、それ以上の相違の存在
を許容する意味で用いられる。従って、特定したアミノ酸相違の他に、特定した
残基以外のアミノ酸残基も変異され得る。
【００４７】 さらに好ましい態様では、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１
のアミノ酸配列との１つの相違は、非ポリペプチド部分との結合基を含む少なく
とも１つの、好ましくはそれ以上の例えば1-15のアミノ酸残基がアミノ酸配列か
ら好ましくは置換によって除去されている。選択した非ポリペプチド部分との結
合基を含む１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を除去することにより、ポリペプ
チドの非ポリペプチド部分との部分的結合を回避することができ、そのような結
合とは、例えばポリペプチドの機能部位にまたはその近傍に位置するアミノ酸残
基にとって不都合である（それは、そのような部位での結合体は障害された受容
体認識により結合体のG-CSF活性が不活化されているか、減少されているからで
ある）。ここで、「機能的部位」なる用語はhG-CSFの機能または挙動に必須のま
たはそれ他、関与している１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を示す。このよう
なアミノ酸残基は機能部位の一部である。機能的部位は、当業者に既知の方法に
よって決定でき、好ましくは相当する受容体、例えばhG-CSF受容体と複合体化し
たポリペプチドの構造分析によって同定される（Aritomi et al. Nature 401:71
3-717, 1999を参照）。
【００４８】 さらに別の好ましい態様では、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番
号１のアミノ酸配列と、a) 非ポリペプチド部分との結合基を含有し配列番号１
のアミノ酸配列中に存在する少なくとも１つの特定アミノ酸残基が好ましくは置
換により除去されている点、およびb) 非ポリペプチド部分との結合基を含有す
る少なくとも１つの特定アミノ酸残基がアミノ酸配列に好ましくは置換により導
入されている点、において相違しており、該特定アミノ酸残基は本明細書の以下
の項に記載されている。この態様は、選択する非ポリペプチド部分との最適な結
合体が得られるようポリペプチドを特異的にデザインできる点において特に興味
深いと考えられる。例えば、以下の項にて説明する選択アミノ酸残基を導入し除
去することにより、選択した非ポリペプチド部分との結合基を最適に分布するこ
とができ、それにより大きな構造破壊がなくポリペプチドの機能を障害せずに、
a) ポリペプチドのエピトープおよび他の表面部分を効果的に遮蔽し、b) 得ら
れる結合体の最適なストーク範囲を確保できるよう非ペプチド部分が配置されて
いる結合体が得られる。
【００４９】 本発明の結合体は一般に、hG-CSF、例えばfilgrastim、lenograstimまたはnar
tograstim、好ましくは単一の20 kDa PEG 部分がN末端に結合しているrhG-CSFと
比較して増大された機能的インビボ半減期および/または血清半減期を得られた
結合体に付与するに充分な数とタイプの非ポリペプチド部分を含有している。機
能的インビボ半減期の増大は、本明細書の材料および方法の項に記載しているよ
うにして常法により測定される。
【００５０】 本発明の結合体は、非ポリペプチド部分に対する非結合の、結合可能な結合基
を少なくとも１つ含有できる。ここに、「結合可能な結合基」とは、結合体と接
近し得るポリペプチドにおける位置に配置され、結合に供されると特別の配慮も
必要無く相当する非ポリペプチド部分と結合する結合基を示す。例えば、このよ
うな結合基は、その活性を発揮するに必須のまたは活性に関与しているポリペプ
チドのアミノ酸残基の一部であり得る。結合可能な結合基でないものとの結合を
回避する簡便な方法は、ヘルパー分子、例えば「機能的部位のブロッキング」と
題する項にて説明しているような分子によって結合基を遮蔽することである。非
結合の、結合可能な基は、個々のG-CSFポリペプチドおよび結合可能な結合基の
位置に依存している。例えば、ポリペプチド結合体は、１つまたは２つの非結合
の、結合可能な結合基、および少なくとも１つの、好ましくは１つまたはそれ以
上の結合された結合基を含有する。
【００５１】非ポリペプチド部分がリジンまたはN-末端アミノ酸残基と結合している本発明の 結合体 本発明の１つの態様では、 ｉ）以下の群から選ばれる少なくとも１つの置換を有する点において配列番号１
のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF活性を有するポリペプ
チド： T1K、P2K、L3K、G4K、P5K、A6K、S7K、S8K、L9K、P10K、Q11K、S12K、F
13K、L14K、L15K、E19K、Q20K、V21K、Q25K、G26K、D27K、A29K、A30K、E33K、A
37K、T38K、Y39K、L41K、H43K、P44K、E45K、E46K、V48K、L49K、L50K、H52K、S
53K、L54K、I56K、P57K、P60K、L61K、S62K、S63K、P65K、S66K、Q67K、A68K、L
69K、Q70K、L71K、A72K、G73K、S76K、Q77K、L78K、S80K、F83K、Q86K、G87K、Q
90K、E93K、G94K、S96K、P97K、E98K、L99K、G100K、P101K、T102K、D104K、T10
5K、Q107K、L108K、D109K、A111K、D112K、F113K、T115K、T116K、W118K、Q119K
、Q120K、M121K、E122K、E123K、L124K、M126K、A127K、P128K、A129K、L130K、
Q131K、P132K、T133K、Q134K、G135K、A136K、M137K、P138K、A139K、A141K、S1
42K、A143K、F144K、Q145K、S155K、H156K、Q158K、S159K、L161K、E162K、V163
K、S164K、Y165K、V167K、L168K、H170K、L171K、A172K、Q173K および P174K、
および ｉｉ）該ポリペプチドのリジン残基に結合している少なくとも１つの非ポリペ
プチド部分、 を含有するポリペプチド結合体に関する。
【００５２】 hG-CSFは４つのリジン残基を含有し、それぞれはK16が受容体結合ドメイン内
に、他のものはすべて受容体結合ドメインに近接している23、34および40位に位
置している。これらリジン残基の１つまたはそれ以上との結合を回避するため（
これは得られる結合体を不活化またはその活性を重度に減少させるため）、少な
くとも１つの、例えば２つまたはすべてのリジン残基を除去するのが望ましいこ
とがある。従って、別の例では、本発明のより好ましい態様として、K16、K23、
K34 および K40から選ばれる少なくとも１つの残基が欠失され、または別のアミ
ノ酸残基と置換されている上記のポリペプチド結合体が挙げられる。好ましくは
、少なくともK16を別のアミノ酸残基と置換する。
【００５３】 好ましいアミノ酸置換の例には、１つまたはそれ以上のQ70K、Q90K、T105K、Q
120KおよびT133Kが挙げられ、例えばこれらの置換の２つ、３つまたは４つであ
り、具体的には：Q70K+Q90K、Q70K+T105K、Q70K+120K、Q70K+T133K、Q90K+T105K
、Q90K+Q120K、Q90K+T133K、T105K+Q120K、T105K+T133K、Q120K+T133K、Q70K+Q9
0K+T105K、Q70K+Q90K+Q120K、Q70K+Q90K+T133K、Q70K+T105K+T120K、Q70K+T105K
+T133K、Q70K+Q120K+T133K、Q09K+T105K+Q120K、Q90K+T105K+T133K、Q90K+Q120K
+T133K、T105K+T120K+T133K、Q90K+T105K+Q120K+T133K、Q70K+T105K+Q120K+T133
K, Q70K+Q90K+Q120K+T133K、Q70K+Q90K+T105K+T133K または Q70K+Q90K+T105K+
Q120Kである。
【００５４】 この項にて説明する本発明結合体のポリペプチドの第２の態様（即ち、少なく
とも１つが導入され、１つが除去リジン）は好ましくは、K16R、K16Q、K23R、K2
3Q、K34R、K34Q、K40R および K40Qからなる群から選ばれる少なくとも１つ、例
えば１つ、２つ、３つまたは４つの置換を含有し、より好ましくは少なくとも１
つのK16R および K23Rの置換を含有し、これによりこれら残基への結合が回避さ
れる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、K16R+K23R、K16R+K34R、K16R+K40
R、K23R+K34R、K23R+K40R、K34R+K40R、K16R+K23R+K34R、K16R+K23R+K40R、K23R
+K34R+K40R、K16R+K34R+K40R および K16R+K23R+K34R+K40Rから選ばれる少なく
とも１つの置換を含有する。これらの置換は、天然または親ポリペプチドと比較
しても最も小さい構造の相違しか生じさせないようである。
【００５５】 上記列挙した置換に加え、本発明のポリペプチド結合体はさらに、R22K、R146
K、R147K、R166K およびR169Kから選ばれる１つまたはそれ以上の置換も含むこ
とができる。
【００５６】 本発明のこの態様における結合体の非ポリペプチド部分は、炭水化物部分など
の結合基としてリジンを含む特定の結合方法を使用するのであればいずれの分子
でもよいが、その非ポリペプチド部分は重合体分子が好ましい。重合体分子は「
重合体分子との結合」と題する項にて説明するあらゆる分子であることができる
が、線状または分枝状ポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンオキサ
イドから選ばれるのが好ましい。好ましい重合体分子は例えば、Shearwater Pol
ymers, Inc.からのmPEG-SPA、またはオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシ
イミド PEG(US 5,122,614)である。 この項にて特定したあらゆるアミノ酸変異、特に置換は、本明細書における特
定のアミノ酸修飾を開示している別の項にて説明するあらゆるアミノ酸変異、例
えばグリコシル化部位の導入および/または除去、好ましくは置換と組合わせる
ことができることは理解されよう。
【００５７】非ポリペプチド部分が結合基としてシステインを含む分子である本発明の結合体 本発明の別の態様は、 ｉ）以下の群から選ばれる少なくとも１つの置換を有する点において配列番号１
のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF活性を有するポリペプ
チド： T1C、P2C、L3C、G4C、P5C、A6C、S7C、S8C、L9C、P10C、Q11C、S12C、F
13C、L14C、L15C、E19C、Q20C、V21C、R22C、Q25C、G26C、D27C、A29C、A30C、E
33C、A37C、T38C、Y39C、L41C、H43C、P44C、E45C、E46C、V48C、L49C、L50C、H
52C、S53C、L54C、I56C、P57C、P60C、L61C、S62C、S63C、P65C、S66C、Q67C、A
68C、L69C、Q70C、L71C、A72C、G73C、S76C、Q77C、L78C、S80C、F83C、Q86C、G
87C、Q90C、E93C、G94C、S96C、P97C、E98C、L99C、G100C、P101C、T102C、D104
C、T105C、Q107C、L108C、D109C、A111C、D112C、F113C、T115C、T116C、W118C
、Q119C、Q120C、M121C、E122C、E123C、L124C、M126C、A127C、P128C、A129C、
L130C、Q131C、P132C、T133C、Q134C、G135C、A136C、M137C、P138C、A139C、A1
41C、S142C、A143C、F144C、Q145C、R146C、R147C、S155C、H156C、Q158C、S159
C、L161C、E162C、V163C、S164C、Y165C、R166C、V167C、L168C、R169C、H170C
、L171C、A172C、Q173C およびP174C、および ｉｉ）該ポリペプチドのシステイン残基に結合している少なくとも１つの非ポ
リペプチド部分、 を含有する結合体に関する。
【００５８】 hG-CSFの受容体結合ドメインは17位にシステイン残基を含有し、それはシスチ
ンが関与せず、該システインと非ポリペプチド部分との結合を回避するために好
都合に除去できる。従って、別の態様として、本発明のより好ましい態様は、 ｉ）以下の群から選ばれる少なくとも１つの置換を有する点において配列番号１
のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF活性を有するポリペプ
チド：C17の除去、好ましくはC17が別のアミノ酸残基、例えばセリン残基と置換
されると共に、T1C、P2C、L3C、G4C、P5C、A6C、S7C、S8C、L9C、P10C、Q11C、S
12C、F13C、L14C、L15C、E19C、Q20C、V21C、R22C、Q25C、G26C、D27C、A29C、A
30C、E33C、A37C、T38C、Y39C、L41C、H43C、P44C、E45C、E46C、V48C、L49C、L
50C、H52C、S53C、L54C、I56C、P57C、P60C、L61C、S62C、S63C、P65C、S66C、Q
67C、A68C、L69C、Q70C、L71C、A72C、G73C、S76C、Q77C、L78C、S80C、F83C、Q
86C、G87C、Q90C、E93C、G94C、S96C、P97C、E98C、L99C、G100C、P101C、T102C
、D104C、T105C、Q107C、L108C、D109C、A111C、D112C、F113C、T115C、T116C、
W118C、Q119C、Q120C、M121C、E122C、E123C、L124C、M126C、A127C、P128C、A1
29C、L130C、Q131C、P132C、T133C、Q134C、G135C、A136C、M137C、P138C、A139
C、A141C、S142C、A143C、F144C、Q145C、R146C、R147C、S155C、H156C、Q158C
、S159C、L161C、E162C、V163C、S164C、Y165C、R166C、V167C、L168C、R169C、
H170C、L171C、A172C、Q173C および P174C、および ｉｉ）結合基としてシステイン残基を有する非ポリペプチド部分、 を含有する結合体に関する。 この態様における好ましい置換は、システインとのアルギニンの置換であり、
例えば１つまたはそれ以上のR146C、R147C、R166C および R169Cである。
【００５９】 この項にて特定したあらゆるアミノ酸修飾、特に置換は、本明細書における特
定のアミノ酸修飾を開示している別の項にて説明するあらゆるアミノ酸変異、例
えばグリコシル化部位の導入および/または除去、好ましくは置換と組合わせる
ことができることは理解されよう。
【００６０】非ポリペプチド部分が酸基またはC-末端アミノ酸残基と結合している本発明の結 合体 本発明のさらなる態様として、 ｉ）以下の群から選ばれる少なくとも１つの置換を有する点において配列番号１
のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF活性を有するポリペプ
チド： T1D、P2D、L3D、G4D、P5D、A6D、S7D、S8D、L9D、P10D、Q11D、S12D、F
13D、L14D、L15D、K16D、Q20D、V21D、R22D、K23D、Q25D、G26D、A29D、A30D、K
34D、A37D、T38D、Y39D、K40D、L41D、H43D、P44D、V48D、L49D、L50D、H52D、S
53D、L54D、I56D、P57D、P60D、L61D、S62D、S63D、P65D、S66D、Q67D、A68D、L
69D、Q70D、L71D、A72D、G73D、S76D、Q77D、L78D、S80D、F83D、Q86D、G87D、Q
90D、G94D、S96D、P97D、L99D、G100D、P101D、T102D、T105D、Q107D、L108D、A
111D、F113D、T115D、T116D、W118D、Q119D、Q120D、M121D、L124D、M126D、A12
7D、P128D、A129D、L130D、Q131D、P132D、T133D、Q134D、G135D、A136D、M137D
、P138D、A139D、A141D、S142D、A143D、F144D、Q145D、R146D、R147D、S155D、
H156D、Q158D、S159D、L161D、V163D、S164D、Y165D、R166D、V167D、L168D、R1
69D、H170D、L171D、A172D、Q173D および P174D； または以下の群から選ばれ
る少なくとも１つの置換：T1E、P2E、L3E、G4E、P5E、A6E、S7E、S8E、L9E、P10
E、Q11E、S12E、F13E、L14E、L15E、K16E、Q20E、V21E、R22E、K23E、Q25E、G26
E、A29E、A30E、K34E、A37E、T38E、Y39E、K40E、L41E、H43E、P44E、V48E、L49
E、L50E、H52E、S53E、L54E、I56E、P57E、P60E、L61E、S62E、S63E、P65E、S66
E、Q67E、A68E、L69E、Q70E、L71E、A72E、G73E、S76E、Q77E、L78E、S80E、F83
E、Q86E、G87E、Q90E、G94E、S96E、P97E、L99E、G100E、P101E、T102E、T105E
、Q107E、L108E、A111E、F113E、T115E、T116E、W118E、Q119E、Q120E、M121E、
L124E、M126E、A127E、P128E、A129E、L130E、Q131E、P132E、T133E、Q134E、G1
35E、A136E、M137E、P138E、A139E、A141E、S142E、A143E、F144E、Q145E、R146
E、R147E、S155E、H156E、Q158E、S159E、L161E、V163E、S164E、Y165E、R166E
、V167E、L168E、R169E、H170E、L171E、A172E、Q173E および P174E、および ｉｉ）結合基としてアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を有する非ポリペ
プチド部分、 を含有する結合体に関する。
【００６１】 この態様における好ましい置換の例は、Q67D/E、Q70D/E、Q77D/E、Q86D/E、Q9
0D/E、Q120D/E、Q131D/E、Q134D/E、Q145D/E および Q173D/Eである。
【００６２】 上記列挙した置換に加え、いずれの態様の結合体におけるポリペプチドも、D2
7、D104、D109、D112、E19、E33、E45、E46、E93、E98、E122、E123、および E1
63から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の除去、好ましくは置換を含有す
ることができる。置換は、別のアミノ酸残基であればよく、具体的にはアスパラ
ギンまたはグルタミン残基であり、これによりこれら残基での結合を回避するこ
とができる。具体的には、本発明のポリペプチドは少なくとも１つの以下の置換
を含有することができる：D27N、D104N、D109N、D112N、E19Q、E33Q、E45Q、E46
Q、E93Q、E98Q、E122Q、E123Q および E163Q。好ましくは、加えて、上記部位の
１つまたはそれ以上の部位におけるアミノ酸置換を次の置換と組合わせることが
できる：D109N、D112N、E19Q、E122Q および E123Q。これらアミノ酸残基いずれ
かとの置換は構造的相違を最小限にするであろう。
【００６３】 本発明におけるこの態様の結合体における、結合基として酸基を有する非ペプ
チド部分は上記の性質を有するいずれの非ポリペプチド部分でもよいが、本発明
では、非ペプチド部分は重合体分子または有機誘導化剤、特に重合体分子であり
、結合体は例えば、Sakane and Pardridge、Pharmaceutical Research、Vol. 14
、No. 8, 1997、pp 1085-1091に記載のようにして調製されるのが好ましい。
【００６４】 この項にて特定したあらゆるアミノ酸変異、特に置換は、本明細書における特
定のアミノ酸変異を開示している別の項にて説明するあらゆるアミノ酸変異、例
えばグリコシル化部位の導入および/または除去、好ましくは置換と組合わせる
ことができることは理解されよう。
【００６５】本発明の他の結合体 「本発明の結合体」と題する項にて例えば上記特定している非ポリペプチド部
分に加え、本発明の結合体はさらに炭水化物部分を含むことができ、その結果、
グリコシル化する宿主細胞において発現され、グリコシル化部位においてグリコ
シル化が起こりまたはグリコシル化部位が導入されるポリペプチドとなる。
【００６６】非ポリペプチド部分が炭水化物部分である本発明の結合体 本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの非天然グリコシル化部位が、以下
の群から選ばれる少なくとも１つの置換によってアミノ酸配列に導入されている
点において配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF
活性を有するグリコシル化ポリペプチドを含有する結合体： L3N+P5S/T、P5N、
A6N、S8N+P10S/T、P10N、Q11N+F13S/T、S12N+L14S/T、F13N+L15S/T、L14N+K16S/
T、K16N+L18S/T、E19N+V21S/T、Q20N+R22S/T、V21N+K23S/T、R22N+I24S/T、K23N
+Q25S/T、Q25N+D27S/T、G26N+G28S/T、D27N+A29S/T、A29N+L31S/T、A30N+Q32S/T
、E33N+L35S/T、A37N+Y39S/T、T38N+K40S/T、Y39N+L41S/T、P44N+E46S/T、E45N+
L47S/T、E46N+V48S/T、V48N+L50S/T、L49N+G51S/T、L50N+H52S/T、H52N+L54S/T
、S53N+G55S/T、P60N、L61N、S63N+P65S/T、P65N+Q67S/T、S66N+A68S/T、Q67N+L
69S/T、A68N+Q70S/T、L69N+ L71S/T、Q70N+A72S/T、L71N+G73S/T、G73N+L75S/T
、S76N+L78S/T、Q77N+H79S/T、L78N、S80N+L82S/T、F83N+Y85S/T、Q86N+L88S/T
、G87N+L89S/T、Q90N+L92S/T、E93N+I95S/T、P97N+L99S/T、L99N+P101S/T、P101
N+L103S/T、T102N+D104S/T、D104N+L106S/T、T105N+Q107S/T、Q107N+D109S/T、L
108N+V110S/T、D109N+A111S/T、A111N+F113S/T、D112N+A114S/T、F113N、T115N+
I117S/T、T116N+W118S/T、W118N+Q120S/T、Q119N+M121S/T、 Q120N+E122S/T、M1
21N+E123S/T、E122N+L124S/T、E123N+G125S/T、 L124N+M126S/T、M126N+P128S/T
、P128N+L130S/T、L130N+P132S/T、P132N+Q134S/T、T133N+G135S/T、Q134N+A136
S/T、A136N+P138S/T、P138N+F140S/T、A139N+A141S/T、A141N+A143S/T、S142N+F
144S/T、A143N+Q145S/T、F144N+R146S/T、Q145N+R147S/T、R146N+A148S/T、R147
N+G149S/T、S155N+L157S/T、H156N+Q158S/T、S159N+L161S/T、L161N+V163S/T、E
162N、V163N+Y165S/T、S164N+R166S/T、Y165N+V167S/T、R166N+L168S/T、V167N+
R169S/T、L168N+H170S/T、R169N+L171S/T および H170N+A172S/T（ここに、S/T
はSまたはT残基を示す、好ましくはT残基である）。
【００６７】 この態様の結合体を調製するには、ポリペプチドは、オリゴサッカライド部分
をグリコシル化部位に結合できるグリコシル化可能宿主細胞において発現し、あ
るいはインビトログリコシル化に供さねばならないことは理解されよう。グリコ
シル化可能宿主細胞の例は、「オリゴサッカライド部分とのカップリング」と題
する以下の項にて詳細に挙げている。
【００６８】 さらに、この態様の結合体は、P5N、A6N、P10N、P60N、L61N、L78N、F113N お
よび E162Nの群、特にP5N、A6N、P10N、P60N、L61N、F113N および E162Nの群、
例えばP60N、L61N、F113N および E162Nの群から選ばれる少なくとも１つの置換
の点において、配列番号１の配列と異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF活性
を有するポリペプチドを含有する。
【００６９】 さらに、この態様の結合体は、D27N+A29S、D27N+A29T、D104N+L106S、D104N+L
106T、D109N+A111S、D109N+A111T、D112N+A114S および D112N+A114Tの群、好ま
しくはD27N+A29S、D27N+A29T、D104N+L106S、D104N+L106T、D112N+A114S および
D112N+A114Tの群、例えばD27N+A29S、D27N+A29T、D104N+L106S および D104N+L
106Tの群から選ばれる少なくとも１つの置換の点において、配列番号１の配列と
異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF活性を有するポリペプチドを含有する。
【００７０】 炭水化物分子に加え、この項において説明する態様の結合体はさらなる非ポリ
ペプチド部分、特に結合体のポリペプチド部分に存在する１つまたはそれ以上の
結合基と結合している、本明細書に記載するような重合体分子を含むことができ
る。 この項にて特定したあらゆるアミノ酸変異、特に置換は、本明細書における特
定のアミノ酸変異を開示している別の項にて説明するあらゆるアミノ酸変異、好
ましくは置換と組合わせることができることは理解されよう。
【００７１】環状に順置換された変異体（Circularly permuted variants） さらなる態様では、本発明のポリペプチド結合体のポリペプチド部分は、本明
細書に別途記載しているポリペプチド配列の環状に順置換された変異体の形態を
とることができる。このような環状に順置換されたポリペプチドでは、元のN-末
端およびC-末端を、ペプチド結合によって直接的にまたはペプチドリンカーを介
して間接的に結合させ、元々ペプチド結合によって結合されていた２つの隣接す
るアミノ酸残基間に新たなN-およびC-末端を形成させる。元のN-およびC-末端は
互いに若干の距離を置いて配置されているのが通常であるので、得られる結合体
の構造および活性に悪影響を与えない適当な長さと組成を有するペプチドリンカ
ーによって連結されるのが典型的であろう。新たなN-末端およびC-末端は、ポリ
ペプチドの活性を妨害かもしれないアミノ酸残基対間に形成させてはならない。
環状に順置換されたG-CSF受容体アゴニストはUS 6,100,070に記載されており、
これを参照すれば、ペプチドリンカーおよび新たなN-末端およびC-末端ならびに
このような変異体自身を調製するための方法に関するさらなる情報が得られる。
【００７２】本発明結合体の白血球および好中球形成 別の態様として、本発明のポリペプチド結合体は、G-CSF活性を有し、少なく
とも１つのアミノ酸残基の点において配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドを含有し、そしてポリペプチドの結合基と結合し
ている少なくとも１つの非ポリペプチド部分を有する結合体であって、以下に示
す(A)-(D)の少なくとも１つの基準をさらに満たしている該ポリペプチド結合体
として特徴付けることができる； (A) ラットへの100μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに白血球形成（細胞数／Ｌ
血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約96時間、好ましくは少なくとも約120時間に、白血球レベ
ル（細胞数／Ｌ血液として測定）を投与前の白血球レベル以上に増大させる； (B) ラットへの25μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに白血球形成（細胞数／Ｌ
血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約72時間、好ましくは少なくとも約96時間、より好ましくは
少なくとも約120時間に、白血球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を投与前
の白血球レベル以上に増大させる； (C) ラットへの100μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに好中球形成（細胞数／Ｌ
血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約96時間、好ましくは少なくとも約120時間に、好中球レベ
ル（細胞数／Ｌ血液として測定）を投与前の好中球レベル以上に増大させる； (D) ラットへの25μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに好中球形成（細胞数／Ｌ
血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約72時間、好ましくは少なくとも約96時間、より好ましくは
少なくとも約120時間に、好中球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を投与前
の好中球レベル以上に増大させる。
【００７３】本発明の結合体の非ポリペプチド部分 先に示したように、本発明の結合体の非ポリペプチド部分は、重合体分子、脂
肪親和性化合物、炭水化物部分（例えば、インビボグリコシル化による）および
有機誘導化剤からなる群から好ましくは選択される。これらの物質はすべて、本
発明結合体のポリペプチド部分に所望の性質、具体的には機能的インビボ半減期
の増大および/または血清半減期の増大を付与することができる。本発明結合体
のポリペプチド部分は通常、ただ１つの型の非ポリペプチド部分と結合している
が、２つまたはそれ以上の異なる型の非ポリペプチド部分、例えば重合体分子と
オリゴサッカライド部分、脂肪親和性基とオリゴサッカライド部分、脂肪親和性
基と重合体分子、などとも結合することができる。２つまたはそれ以上の異なる
型の非ポリペプチド部分との結合は同時にまたは別個に行うことができる。
【００７４】本発明の結合体の調製方法 「脂肪親和性化合物との結合」、「重合体分子との結合」、「オリゴサッカラ
イド部分との結合」および「有機誘導化剤との結合」の以下に記載の項では、特
定の型の非ポリペプチド部分との結合を説明している。一般に、本発明のポリペ
プチド結合体は、ポリペプチドの発現を誘導する条件下に適当な宿主細胞を培養
し、得られたペプチドを回収することにより生産することができ、ここでは、ａ
）得られるポリペプチドは少なくとも１つのN-またはO-グリコシル化部位を含有
し、かつ宿主細胞はインビボ グリコシル化が可能な真核生物宿主細胞であり、
および／またはｂ）得られたポリペプチドを非ポリペプチド部分とインビトロに
て結合させる。
【００７５】脂肪親和性化合物との結合 ポリペプチドおよび脂肪親和性化合物は、直接またはリンカーを使用して互い
に結合することができる。脂肪親和性化合物は、飽和または不飽和脂肪酸、脂肪
酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドまたはス
テロイドなどの天然化合物、または炭酸、アルコール、アミンおよびスルホン酸
などの１つまたはそれ以上のアルキル、アリール、アルケニルもしくは他の多重
不飽和化合物との合成化合物であることができる。ポリペプチドおよび脂肪親和
性化合物との、好ましくはリンカーを介した結合は、Bodanszky in Peptide Syn
thesis、John Wiley、New York, 1976 および WO 96/12505に記載されているよ
うな、当業者に既知の方法によって行うことができる。
【００７６】重合体分子との結合 ポリペプチドとカップリングされる重合体分子は、天然または合成ホモ重合体
またはヘテロ重合体などの適当な重合体分子であることができ、典型的には分子
量約300-100,000 Da、例えば約500-20,000 Da、好ましくは約1000-15,000 Da、
より好ましくは約2000-12,000 Da、例えば約3000-10,000 Daの範囲のものである
。本明細書において重合体分子について用いる「約」なる用語は、およその平均
分子量を示しており、これは通常、特定の重合体調製物が特定の分子量分布を有
している事実を反映している。
【００７７】 ホモ重合体の例としては、ポリオール（即ち、ポリ-OH）、ポリアミン（即ち
、ポリ-NH2）およびポリカルボン酸（即ち、ポリ-COOH）が挙げられる。ヘテロ
重合体は、種々のカップリング基、例えばヒドロキシ基およびアミン基を含む重
合体である。
【００７８】 適当な重合体分子の例としては、ポリアルキレンオキサイド (PAO)、例えばポ
リアルキレングリコール(PAG)、例えば線状または分枝状ポリエチレングリコー
ルおよびポリプロピレングリコール (PPG)、ポリビニルアルコール (PVA)、ポリ
カルボキシレート、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリエチレン共マレイン酸無水
物、ポリスチレン共マレイン酸無水物、デキストラン、例えばカルボキシメチル
デキストラン、または免疫原性の減少および/または機能的インビボ半減期およ
び/または血清半減期に適した他の生重合体を挙げることができる。重合体分枝
の他の例としては、ヒトアルブミンまたは他の豊富な血漿炭水化物が挙げられる
。一般に、ポリアルキレングリコール誘導化重合体は生分解性、非毒性、非抗原
性、非免疫原性であり、種々の水溶解性を有し、生物から容易に抽出される。
【００７９】 PEGは、デキストランなどのポリサッカライドと比較して、架橋できる反応基
が極めて少ないので、好ましい重合体分子である。具体的には、モノ機能性PEG
、例えばメトキシポリエチレングリコール（ｍPEG)が、そのカップリング化学が
比較的単純であるので（ただ１つの反応基がポリペプチド上の結合基との結合に
利用される）、興味深い。結果、架橋の危険性が減じられ、得られるポリペプチ
ド結合体は比較的均質であり、重合体分子とポリペプチドとの反応性を比較的制
御しやすい。
【００８０】 重合体分子をポリペプチドに共有結合させるには、重合体分子のヒドロキシ末
端基を活性化型にて、即ち反応性機能基を提示させる。適当な活性化絨剛体分子
は市販されており、例えばShearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA、
またはPolyMASC Pharmaceuticals plc, UKから入手可能である。あるいは、重合
体分子は当業者に既知の、例えばWO 90/13540に記載されているような通常の方
法によって活性化することができる。本発明に使用するための、活性化線状また
は分枝状重合体分枝の特殊な例は、Shearwater Polymers, Inc. 1997 および 20
00 カタログ (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and phar
maceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives、これは引用によって本明
細書に包含される) に記載されている。活性化PEG絨剛体の特例としては次の線
状PEG：NHS-PEG (例えば SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-P
EG、SG-PEG、および SCM-PEG)、および NOR-PEG)、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG
、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、および MAL-PEG
、ならびに分枝状 PEG、例えば PEG2-NHS、および US 5,932,462 や US 5,643,5
75に開示されているもの（これらは引用によって本明細書に包含される）が挙げ
られる。さらに、以下の文献（これらは引用によって本明細書に包含される）は
有用な重合体分子および/またはPEG化化学を開示している： US 5,824,778、US
5,476,653、WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、US 4,902,502、US 5,281,
698、US 5,122,614、US 5,219,564、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、
WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13
090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO
99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/060
58、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、US 5,
736,625、WO 98/05363、EP 809 996、US 5,629,384、WO 96/41813、WO 96/07670
、US 5,473,034、US 5,516,673、EP 605 963、 US 5,382,657、EP 510 356、EP
400 472、EP 183 503 および EP 154 316。
【００８１】 ポリペプチドおよび活性化重合体分子の結合は、以下の文献（ここには重合体
分子を活性化するために適当な方法も記載されている）に記載されているような
通常の方法によって行われる：R.F. Taylor、(1991)、"Protein immobilisation
. Fundamental and applications"、Marcel Dekker、N.Y.; S.S. Wong, (1992)
、"Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking"、CRC Press, Boca R
aton; G.T. Hermanson et al, (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniq
ues"、Academic Press、N.Y.。当業者は、使用される活性化方法および/または
結合化学がポリペプチドの結合基（その例は上記した）、および重合体の機能基
（例えば、アミン、ヒドロキシ、カルボキシ、アルデヒド、スルフィドリル、ス
クシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、またはハロアセテート）によっ
て変動することは知っている。PEG化は、ポリペプチド上の結合基において利用
可能なものすべて（即ち、ポリペプチドの表面に暴露されているような結合基）
に対する結合を目的とすることができ、あるいは１つまたはそれ以上の特定の結
合基、例えばN-末端アミノ基 (US 5,985,265)を目的とすることができる。さら
に、結合は、１工程でも、段階的にでも行うことができる（例えば、WO 99/5537
7に記載されているようにして）。
【００８２】 PEG化は、結合するPEG分子の数、その分子のサイズおよび形態（例えば線状か
分枝状かなど）、およびそのような分枝が結合するポリペプチドの位置に関して
最適な分子が調製されるようデザインできることは理解されよう。使用する重合
体の分子量は、達成しようとする所望の効果を考慮して選択される。例えば、結
合の主たる目的が高分子かつ比較的大きさサイズ（例えば、腎クリアランスを減
じるため）を有する結合体である場合、１つまたは数個の高分子量重合体分子ま
たは低分子量の重合体分子を数多く結合させ、所望の効果を達成することができ
る。しかし、低分子量の重合体分子を幾つかしようするのが好ましい。高い程度
のエピトープ遮蔽を望む場合、ポリペプチドにおけるすべてまたはほとんどのエ
ピトープを効果的に遮蔽するに充分に多くの数の低分子量重合体分子（例えば、
分子量約5,000 Da）を使用することができる。例えば、2-8個、例えば3-6個の重
合体を使用できる。以下に例示するように、高分子量の重合体分子を少数（例え
ば、分子量12,000-20,000を1-3個）使用する場合に比較し低分子量の重合体分子
を多く（例えば分子量5000を4-6個）使用するほうが、たとえ結合した重合体分
子の総分子量が両者同じであったとしても、得られるポリペプチド結合体の機能
的インビボ半減期に関して好都合であり得る。小重合体分子を多く存在させると
、得られるポリペプチドは、少なくとも、重合体分子が比較的不均一にポリペプ
チド表面に分布する場合には、例えば単一の巨大重合体分子と比較してより大き
な直径または見かけのサイズになると考えられる。
【００８３】 １つの重合体分子しか結合させない場合、単一の重合体分子だけをタンパク質
の単一の結合基に結合させることは好ましくなく、一般に、重合体分子はそれが
線状または分枝状であっても、比較的高分子量、例えば約20 kDaを有するのが好
都合である。
【００８４】 通常、可能な限り多くの利用可能な重合体結合基を重合体分子と反応させるこ
とを目的とした条件下にて、重合体結合は行われる。これは、ポリペプチドに比
較して適度に過剰量のモル濃度の重合体を使用することによって為される。活性
化重合体分子とポリペプチドとの典型的なモル比は、約1000-1以下、例えば約20
0-1以下または約100-1以下である。しかし、この比は若干低くてもよく、例えば
約50-1、10-1 または 5-1以下であってもよい場合がある。
【００８５】 本発明では、重合体分子をリンカーを介してポリペプチドとカップリングさせ
ることも考えられる。適当なリンカーは当業者に周知である。好ましい例は塩化
シアヌル(Abuchowski et al.、(1977)、J. Biol. Chem.、252、3578-3581; US 4
,179,337; Shafer et al.、(1986)、J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed.、24、37
5-378）である。
【００８６】 結合反応の後、残りの活性化重合体分子は当業者に既知の方法、例えば第１級
アミンを反応混合物に加えることによってブロックし、得られた不活化重合体分
子を適当な方法によって取り出す（材料および方法を参照）。
【００８７】 好ましい態様では、本発明のポリペプチド結合体は、PEG化に利用されるポリ
ペプチド内のリジン残基のいくつか、殆どまたは好ましくは実質的にすべてと結
合しているPEG分子、具体的には例えば1-15 kDa、典型的には約 2-12 kDa、例え
ば約 3-10 kDa、例えば約 5 or 6 kDaの線状または分枝状PEG分枝、を含む。
【００８８】 ポリペプチドのアミノ酸配列、使用する活性化PEG化合物の性質および特殊なP
EG化条件、例えばPEGとポリペプチドとのモル比などの状況に応じて、PEG化の程
度は種々得られ、高程度のPEG化は一般に高いPEG：ポリペプチド比率によって得
られることは理解されよう。しかし、特定のPEG化反応によって得られるPEG化ポ
リペプチドは通常、若干相違する程度のPEG化を有するポリペプチド結合体の確
立分布を含むであろう。 別の態様では、本発明のポリペプチド結合体は、ポリペプチドのN-末端アミノ
酸残基に加え、PEG化に利用されるポリペプチド内のリジン残基と結合しているP
EG分子を含む。
【００８９】オリゴサッカライド部分とのカップリング オリゴサッカライド部分とのカップリングはインビボまたはインビトロのいず
れでも起こり得る。１つまたはそれ以上ののグリコシル化部位を含有するG-CSF
分子をインビボグリコシル化するには、そのポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を、グリコシル化可能な宿主細胞発現宿主に挿入しなければならない。
発現宿主細胞は真菌（糸状菌または酵母）、昆虫または動物細胞から、あるいは
トランスジェニック植物細胞から選択できる。１つの態様では、宿主細胞は哺乳
類細胞、例えばCHO細胞、BHKまたはHEK、例えばHEK 293細胞、あるいは昆虫細胞
、例えばSF9 細胞または酵母細胞、例えば S. cerevisiae または Pichia pasto
ris、あるいは本明細書に記載のあらゆる宿主細胞である。本発明ポリペプチド
のアミノ酸残基へのグリコシド（例えば、デキストラン）のインビトロ共有カッ
プリングも、例えばWO 87/05330 および Aplin et al., CRC Crit Rev. Biochem
., pp. 259-306, 1981に記載のようにして使用することができる。
【００９０】 オリゴサッカライド部分またはPEGをタンパク質-およびペプチド-結合Gln残基
にインビトロカップリングするには、トランスグルタミナーゼ(TG'ases)によっ
て行うことができる。トランスグルタミナーゼは、供与体アミン基をタンパク質
-およびペプチド-結合Gln残基に移動させる、いわゆる架橋反応を触媒する。供
与体-アミン基は例えばリジン残基におけるε-アミノ基として、タンパク質-ま
たはペプチド-結合され、または有機小分子または高分子の一部であってもよい
。TG'ase-触媒架橋においてアミノ-供与体として機能する有機小分子の例にはプ
トレスシン（putrescine；1,4-ジアミノブタン）がある。TG'ase-触媒架橋にお
いてアミノ-供与体として機能する有機高分子の例にはアミン-含有PEGがある(Sa
to et al.、Biochemistry 35、13072-13080)。
【００９１】 TG'aseは一般に、高度に特異的な酵素であり、タンパク質の表面に暴露されて
いるすべてのGln残基がアミノ含有基質とのTG'ase-触媒架橋に関与するわけでは
ない。そうではなく、２、３個のGln残基しか自然にはTG'ase基質として機能せ
ず、いずれのGln残基が良好なTG'ase基質であるかを探る正確なパラメーターは
依然知られていない。従って、タンパク質をTG'ase-触媒架橋反応に感受性にす
るには、TG'ase基質として充分に機能することが知られているアミノ酸配列の続
きを好適な位置に付加することが前提条件となることが多い。幾つかのアミノ酸
配列が良好な天然のTG'ase基質、例えば基質P、エラフィン、フィブリノーゲン
、フィブロネクチン、α2-プラスミンインヒビター、α-カゼイン類、およびβ-
カゼイン類である、あるいは含むことが知られている。
【００９２】有機誘導化剤とのカップリング G-CSF活性を有するポリペプチドの共有修飾は、ポリペプチドの１つまたはそ
れ以上の結合基を有機誘導化剤と反応させることによって行うことができる。適
当な誘導化剤および方法は当業界にて周知である。例えば、システイン残基を、
α-ハロアセテート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロ
アセトアミドと最も普通に反応させれば、カルボキシメチルまたはカルボキシア
ミドメチル誘導体が得られる。システイン残基はまた、ブロモトリふるおろアセ
トン、α-ブロモ-β-(4-イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルホスフェ
ート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジル・ジスルフィド、メチル 2-
ピリジル・ジスルフィド、p-クロロメルクリベンゾエート、2-クロロメルクリ-4
-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールと
の反応によっても誘導化される。ヒスチジル残基はジエチルピロカルボネートと
ｐH5.5-7.0にて反応させることにより誘導化されるが、この物質はヒスチジル側
鎖に比較的特異的だからである。パラ-ブロモフェナシル・ブロミドも有用であ
る。この反応は好ましくは、pH 6.0の0.1 M カコジル酸ナトリウム中にて行う。
リジルおよびアミノ末端残基は無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応さ
せる。これらの物質との誘導化はリジル残基の荷電を反対にする効果がある。α
アミノ-含有残基を誘導化する他の適当な試薬には、メチル ピコリンイミデート
、ピリドキサール ホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリ
ニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4-ペンタンジオンおよび、グ
リオキシレートとのトランスアミナーゼ-触媒反応がある。アルギニル残基は、
１つまたはそれ以上の通常の試薬、特にフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジ
オン、1,2-シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンなどと反応させることによ
り修飾される。アルギニン残基の誘導化には、反応をアルカリ条件下にて行う必
要があり、それはグアニジン機能基のpKaが高いからである。
【００９３】 さらに、これらの試薬はリジンの基、およびアルギニンのグアニジノ基と反応
することができる。カルボキシ側鎖基（アスパラギンまたはグルタミン）は、カ
ルボジイミド類(R-N=C=N-R'、ここにR および R'は別個のアルキル基、例えば1-
シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3
-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドである)と反応させて選択
的に修飾できる。さらに、アスパルチルまたはグルタミル残基はアンモニウムイ
オン類と反応させてアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【００９４】機能的部位のブロッキング 過剰の重合体結合は、重合体が結合するポリペプチドの活性を喪失させる場合
があることが報告されている。この問題は、例えば機能的部位に位置する結合基
を除去、または機能的部位を結合前にブロックし機能的部位が結合反応時にはブ
ロックされるようにすることにより解消され得る。後者のストラテジーは、本発
明のさらなる態様を構成する（最初のストラテジーは先に例示しており、機能的
部位に近接して位置し得るリジン残基を除去することにより行う）。より詳細に
は、第２のストラテジーでは、ポリペプチドと非ポリペプチド部分との結合を、
ポリペプチドの機能的部位と結合できるヘルパー分子によってポリペプチドの機
能的部位をブロックする条件下に行う。 好ましくは、ヘルパー分子は、ポリペプチドの機能的部位を特異的に認識する
もの、例えば受容体、具体的にはG-CSF受容体またはG-CSF受容体の部分である。 さらに、ヘルパー分子は抗体、特にG-CSF活性を有するポリペプチドを認識す
るモノクローナル抗体であることができる。具体的には、ヘルパー分子は中和性
モノクローナル抗体であることができる。
【００９５】 結合を行う前に、ポリペプチドをヘルパー分子と相互作用させる。これにより
、ポリペプチドの機能的部位が遮蔽または保護され、結果として重合体などの非
ポリペプチド部分による誘導化に利用されなくなる。ヘルパー分子から遊離させ
れば、少なくとも１つの部分的に保存された機能的部位を有する、非ポリペプチ
ド部分とポリペプチドとの結合体が回収できる。 ブロックされた機能的部位を有するポリペプチドを重合体、脂肪親和性化合物
、オリゴサッカライド部分、有機誘導化剤、または他の別の化合物とその後結合
させるのは、「.....との結合」と題する上記の項にて説明しているような、通
常の方法によって行われる。
【００９６】 ポリペプチドの機能的部位を結合に対して遮蔽するのに使用されるヘルパー分
子の性質とは無関係に、ヘルパー分子は、分子における選択した部分的な非ポリ
ペプチド部分との結合基（この結合基との結合はヘルパー分子が結合化ポリペプ
チドの脱着を阻害しかねない）を欠いている、またはそれを２、３個しか含まな
いのが望ましい。それにより、ポリペプチドの遮蔽されていない部分に存在する
結合基と選択結合を達成でき、結合を反復サイクルするためのヘルパー分子を再
利用することができる。例えば、非ポリペプチド部分が、リジンまたはN末端相
身残基のイプシロンアミノ基を結合基として含むPEGなどの重合体分子である場
合、ヘルパー分子は結合可能なイプシロンアミノ基を実質的に欠如し、好ましく
はイプシロンアミノ基を欠如していることが望ましい。従って、好ましい態様で
は、ヘルパー分子はポリペプチドの機能的部位と結合できるタンパク質またはペ
プチドであり、このタンパク質またはペプチドは選択する非ポリペプチド部分と
の結合可能な結合基を欠如している。
【００９７】 ポリペプチド結合体を、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
様々な集合体から調製する、本発明の態様において特に興味深いのは、機能基の
ブロックを結合前にマイクロタイタイー平板にて行うことであり、例えば発現さ
れたポリペプチド変異体を、固定化したブロッキング基、例えば受容体、抗体な
どを含有するマイクロタイター平板に入れることにより、行う。
【００９８】 さらに別の態様では、ヘルパー分子をまず、材料をパッキングするカラム、例
えばセファデックスまたはアガロースビーズまたは反応容器などの表面、などの
固相に共有結合により連結させる。次いで、ポリペプチドを、ヘルパー分子を担
持するカラム材料に流し、「....との結合」と題する上記の項にて説明している
ように、当業者に既知の方法により結合を行う。この方法により、ポリペプチド
結合体がヘルパー分子と溶出により分離される。ペプチド結合体は、得られるポ
リペプチド結合体を実質的に分解しない物理化学的条件下に通常の手法によって
溶出される。ポリペプチド結合体を含有する液相は、ヘルパー分子が共有結合に
より残っている固相から分離される。分離は、他の方法によっても行うことがで
きる：例えば、ヘルパー分子は特定のバインダー（例えばストレプトアビジン）
によって認識され得る第２の分子（例えばビオチン）によって誘導化され得る。
特定のバインダーは固相に連結でき、それによりヘルパー分子−第２分子複合体
は以後の溶出の際に残るがポリペプチド結合体は残らないであろう第２ヘルパー
−固相カラムに通すことで、ヘルパー分子−第２分子複合体からポリペプチド結
合体を分離することができる。ポリペプチド結合体は、適当な手法によりヘルパ
ー分子から遊離させることができる。ヘルパー分子が結合しているG-CSFの機能
的部位からヘルパー分子が解離する条件に置くことで、脱保護を行うことができ
る。例えば、重合体が結合している抗体と抗−イディオタイプ抗体との複合体は
、pHを酸性またはアルカリ性pHに調節することで解離させることができる。
【００９９】タグ化ポリペプチドの結合 別の態様では、本発明ポリペプチドは、タグ、即ち典型的には1-30、例えば1-
20アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列またはペプチド伸張との融合タンパ
ク質として発現される。迅速かつ容易な精製を可能とすることに加え、タグはタ
グ化ポリペプチドと非ポリペプチド部分との結合を行うための簡便なツールであ
る。具体的には、タグは、タグ化ポリペプチドをタグを介して固定化できるマイ
クロタイタイー平板または常磁性ビーズなどの他の担体中での結合に使用できる
。タグ化ポリペプチドを例えばマイクロタイター平板にて結合させると、タグ化
ポリペプチドを培養ブロスから直接にマイクロタイター平板に固定化でき（原理
的には精製なしに）、結合反応に供することができるという利点を有している。
これにより、反応工程の総数（発現から結合までの）が減じられる。さらに、タ
グはスペーサー分子として機能でき、結合させようとする固定化ポリペプチドへ
の接近性が高められる。タグ化ポリペプチドを使用する、例えばPEGなどの重合
体分子との結合は、本明細書に記載の非ポリペプチド部分であることができる。
【０１００】 使用される特定のタグの種類は、ポリペプチドとともに発現でき、適当な表面
または担体材料上に固定できる限り、重要でない。多くの適当なタグが市販され
ており、例えばUnizyme Laboratories, Denmarkから入手できる。例えば、タグ
は以下の配列から構成され得る： His-His-His-His-His-His Met-Lys-His-His-His-His-His-His Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln または、以下のもの： EQKLI SEEDL (Mol. Cell. Biol. 5:3610-16,1985に記載されているC末端タグ) DYKDDDDK (C- または N-末端タグ) YPYDVPDYA。
【０１０１】 上記タグに対する抗体は市販されており、例えばADI、Aves Lab and Research
Diagnosticsから入手できる。 タグ化ポリペプチドをPEG化に使用する簡便な方法は、以下の材料および方法
の項にて説明している。ポリペプチドからのタグの以後の開裂は、市販の酵素を
用いて行うことができる。
【０１０２】本発明のポリペプチドまたは本発明の結合体のポリペプチド部分の調製方法 本発明のポリペプチドまたは本発明結合体のポリペプチド部分、要すればグリ
コシル化形態のものは、当業者に既知の適当な方法により調製することができる
。このような方法には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の構築、適
当な形質転換またはトランスフェクト宿主細胞における配列の発現が含まれる。
しかし、本発明のポリペプチドは効率が低いものの、化学合成または化学合成の
組合わせ、または化学合成と組換えDNA技術との組合わせによっても調製できる
。
【０１０３】 本発明のポリペプチドまたは本発明結合体のポリペプチド部分をコードするヌ
クレオチド配列は、親G-CSF、例えば配列番号１のアミノ酸配列を有するhG-CSF
をコードするヌクレオチド配列を単離または合成し、次いでそのヌクレオチド配
列を相当するアミノ酸残基(群）が導入（即ち、挿入または置換）または欠失（
即ち、除去または置換）できるように変異させることにより、構築することがで
きる。
【０１０４】 ヌクレオチド配列は常法による部位特異的突然変異によって簡便に修飾される
。さらに、ヌクレオチド配列は化学合成、例えばオリゴヌクレオチド合成装置を
使用して調製され、ここではオリゴヌクレオチドは所望のポリペプチドのアミノ
酸配列に基づいてデザインされ、好ましくは組換えポリペプチドを産生させる宿
主細胞に好まれるコドンを優先的に選択することにより調製する。例えば、所望
のポリペプチドの部分をコードする幾つかの小オリゴヌクレオチドを合成し、PC
R、連結または連結鎖反応（LCR）(Barany、PNAS 88:189-193, 1991)により組合
わせる。個々のオリゴヌクレオチドは通常、相補的組立てのための5' または 3'
突出部を含有する。
【０１０５】 ハイスループットスクリーニング用のポリペプチド変異体のための別のヌクレ
オチド配列修飾方法が利用でき、例えば相同クロスオーバー、例えばUS 5,093,2
57に記載のもの、および遺伝子シャッフリング、即ち出発ヌクレオチド配列と比
較して多くのヌクレオチド改変を有する新たなヌクレオチド配列を与える２つま
たはそれ以上の相同ヌクレオチド配列間の組換えを含む方法である。遺伝子シャ
ッフリング（DNAシャッフリングとしても知られている）は、ヌクレオチド配列
の無作為断片化と組立ての１つまたはそれ以上のサイクルと、所望の性質を有す
るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するためのその後のスクリ
ーニングとを含む。相同性基本的な核酸シャッフリングを起こすため、ヌクレオ
チド配列の相当する部分は好ましくは、少なくとも50%同一、例えば少なくとも6
0%同一、より好ましくは少なくとも70%同一、例えば少なくとも80%同一である。
組換えはインビトロまたはインビボにて行うことができる。
【０１０６】 適当なインビトロ遺伝子シャッフリング法の例は、Stemmer et al. (1994)、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA; vol. 91、pp. 10747-10751; Stemmer (1994)、Nat
ure、vol. 370、pp. 389-391; Smith (1994)、Nature vol. 370、pp. 324-325;
Zhao et al.、Nat. Biotechnol. 1998、Mar; 16(3): 258-61; Zhao H. and Arno
ld、FB、Nucleic Acids Research, 1997、Vol. 25. No. 6 pp. 1307-1308; Shao
et al.、Nucleic Acids Research 1998、Jan 15; 26(2): pp. 681-83; および
WO 95/17413に記載されている。適当なインビボシャッフリング法の例はWO 97/0
7205に記載されている。インビトロまたはインビボ組換えによる核酸配列の突然
変異のための別の手法は、例えばin WO 97/20078 および US 5,837,458に記載さ
れている。特定のシャッフリング法の例としては「ファミリーシャッフリング」
、「合成シャッフリング」および「イン・シリコ(in silico)シャッフリング」
がある。ファミリーシャッフリングは種々の種由来の相同遺伝子のファミリーを
、１つまたはそれ以上のシャッフリングサイクルおよび以後のスクリーニングま
たは選択に供する。ファミリーシャッフリング手法は、例えばCrameri et al. (
1998)、Nature、vol. 391、pp. 288-291; Christians et al. (1999)、Nature B
iotechnology、vol. 17、pp. 259-264; Chang et al. (1999)、Nature Biotechn
ology、vol. 17、pp. 793-797; および Ness et al. (1999)、Nature Biotechno
logy、vol. 17、893-896に記載されている。合成シャッフリングは、例えば目的
の相同遺伝子の配列アライメントに基づき重複合成オリゴヌクレオチドのライブ
ラリーを得る。合成的に創製されたオリゴヌクレオチドを組換え、得られた組換
え核酸配列をスクリーニングし、要すればさらなるシャッフリングサイクルに供
する。合成シャッフリング手法はWO 00/42561に記載されている。イン・シリコ
シャッフリングとは、コンピューターシステムを使用して行うまたはモデル化す
るDNAシャッフリング手法を意味し、それにより物理的な核酸製造の必要性が部
分的にまたは全体的に回避される。イン・シリコ シャッフリングの手法は、WO
00/42560に記載されている。
【０１０７】 一旦組立てれば（合成、部位特異的突然変異または他の方法により）、得られ
たポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を組換えベクターに挿入し、所望の形
質転換宿主細胞においてG-CSFを発現するひ必要な制御配列と作動可能に連結す
る。
【０１０８】 当然ながら、すべてのベクターおよび発現制御配列が同等に、本明細書に記載
のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するよう良好に機能すると
は限らないと考えられる。同じ発現系によってすべての宿主細胞が同等に良好に
機能するとも限らない。しかし、当業者であれば、これらのベクター、発言制御
配列および宿主細胞の中から不当な実験を行うことなく選択することが可能であ
る。例えば、ベクターの選択に当たり、宿主細胞を考慮しなければならない、そ
れはベクターは宿主細胞中で複製し、または染色体に組込まれなければならない
からである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクタ
ーによってコードされている他のタンパク質の発現、例えば抗生物質マーカーも
考慮しなければならない。発現制御配列を選択するには、種々の因子を考慮しな
ければならない。それには例えば、配列の相当する強度、その制御性、およびポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列との適合性、特に可能性ある分泌構造
がある。宿主は、その選択したベクターとの適合性、ヌクレオチドによってコー
ドされる産物の毒性、その分泌特性、ポリペプチドが正しく折り畳まれる能力、
発酵または培養要件、およびヌクレオチド配列によってコードされる産物の精製
の容易さ、を考慮して選択しなければならない。
【０１０９】 組換えベクターは自律的に複製するベクター、即ち染色体外物質として存在し
、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドである
ことができる。別のベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノムに組込
まれ、組込まれた染色体と一緒に複製されるものである。
【０１１０】 ベクターは好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
がヌクレオチド配列の転写に要する別のセグメントと作動可能に連結されている
発現ベクターである。ベクターは典型的には、プラスミドまたはウイルスDNAか
ら誘導される。本明細書に記載している宿主細胞での発現に適した多くの発現ベ
クターが市販され、または文献に記載されている。真核生物のための有用な発現
ベクターには例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサ
イトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターがある。具体的ベクター
は例えば、pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen、Carlsbad、CA、USA) および pCI-neo
(Stratagene、La Jolla、CA、USA)である。酵母細胞に有用な発現ベクターは、
2μ プラスミドおよびその誘導体、POT1 ベクター (US 4,931,373)、Okkels、An
n. New York Acad. Sci. 782、202-207, 1996に記載されているpJSO37 ベクター
、およびpPICZ A、B または C (Invitrogen)である。昆虫細胞に有用な発現ベク
ターには、pVL941、pBG311 (Cate et al.、"Isolation of the Bovine and Huma
n Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human G
ene In Animal Cells"、Cell、45、pp. 685-98 (1986)、pBluebac 4.5 および p
Melbac (両者ともInvitrogenから入手可能）がある。細菌宿主細胞に有用な発現
ベクターには、既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌由来のプラスミド、例えば
pBR322、pET3a および pET12a(ともにNovagen Inc.、WI、USAから入手可能)、広
範囲宿主プラスミド、例えばRP4、ファージDNA、例えば多くのラムダファージ誘
導体、例えばNM989、および他のDNAファージ、例えばM13および繊維性１本鎖DNA
ファージがある。
【０１１１】 本発明に使用される他のベクターには、ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列をコピー数に増幅できるものがある。このような増幅可能なベクターは当
業界にて周知である。それには例えば、DHFR増幅によって増幅され得るベクター
（例えば、Kaufman、U.S. Pat. No. 4,470,461、Kaufman and Sharp、"Construc
tion Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals
Utilized For Efficient Expression"、Mol. Cell. Biol.、2、pp. 1304-19 (1
982)を参照）、およびグルタミン合成（「GS」）増幅（例えば、US 5,122,464
および EP 338,841を参照）がある。
【０１１２】 組換えベクターはさらに、ベクターを問題の宿主細胞にて複製できるDNA配列
を含有できる。そのような配列の例としては（宿主細胞が哺乳類細胞の場合）、
SV40複製起点がある。宿主細胞が酵母細胞の場合、ベクターを複製できる適当な
配列は酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP 1-3および複製起点である。
【０１１３】 ベクターは選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を相補する
遺伝子、例えばジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR)またはSchizosaccharomyces po
mbe TPI遺伝子（P.R. Russell、Gene 40, 1985、pp. 125-130に記載）、または
アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオ
マイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付
与する遺伝子を含有できる。Saccharomyces cerevisiaeでの選択マーカーには、
ura3 および leu2がある。糸状菌類の選択マーカーには、amdS、pyrG、arcB、ni
aD および sCがある。
【０１１４】 「制御配列」なる用語は本明細書では、本発明のポリペプチドを発現させるの
に必須のまたは有益なすべての成分を包含するものと規定される。各制御配列は
天然でも、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって外来性でもよい。このよ
うな配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモ
ーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転
写ターミネーターがあるが、これらに限定されない。最小限度、制御配列はプロ
モーターを含む。
【０１１５】 本発明では、広範な発現制御配列を使用できる。このような有用な発現制御配
列には、上記の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列、および原核
生物または真核生物またはそれらのウイルスの遺伝子発現を制御すると知られて
いる配列、およびそれらの種々の組合わせがある。
【０１１６】 哺乳類細胞において転写させるのに適当な制御配列の例としては、SV40および
アデノウイルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウイルス2主要後
期プロモーター、MT-1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター、ヒトサイトメガ
ロウイルス即座遺伝子プロモーター（CMV）、ヒト伸張因子１α(EF-1α）プロモ
ーター、Drosophila哺乳類熱ショックタンパク質70プロモーター、ラウス肉腫ウ
イルス(RSV)プロモーター、ヒトユビキチンC (UbC)プロモーター、ヒト成長ホル
モンターミネーター、SV40またはアデノウイルス Elb 領域ポリアデニル化シグ
ナル、および Kozak 保存配列 (Kozak、M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947
-50)などが挙げられる。
【０１１７】 哺乳類細胞における発現を改良するには、ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列の5'非翻訳領域に合成イントロンを挿入すればよい。合成イントロンの
例としては、プラスミドpCI-Neo由来の合成イントロンがある (Promega Corpora
tion、WI、USAから入手可能)。
【０１１８】 昆虫細胞において転写させるのに適当な制御配列の例としては、ポリヘドロン
プロモーター、P10 プロモーター、Autographa californica ポリヘドロシスウ
イルス基本タンパク質プロモーター、バキュロウイルス即座遺伝子1 プロモータ
ー、バキュロウイルス39K 遅延型-初期遺伝子プロモーター、およびSV40 ポリア
デニル化配列が挙げられる。酵母細胞において有用な適当な制御配列の例として
は、酵母α-交配系のプロモーター群、酵母トリオースホスフェートイソメラー
ゼ (TPI) プロモーター、酵母解糖系遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ
遺伝子由来のプロモーター群、ADH2-4c プロモーター、および誘導性GAL プロモ
ーターなどが挙げられる。糸状菌宿主細胞において有用な適当な制御配列の例と
しては、ADH3 プロモーターおよびターミネーター、Aspergillus oryzae TAKA
アミラーゼトリオースホスフェートイソメラーゼまたはアルカリホスファターゼ
、A. niger α-アミラーゼ、A. niger またはA. nidulans グルコアミラーゼ、A
. nidulans アセトアミダーゼ、Rhizomucor miehei アスパラギンプロテイナー
ゼまたはリパーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、TPI1 ターミネータ
ーおよびADH3 ターミネーターが挙げられる。細菌宿主細胞において有用な適当
な制御配列の例としては、lac系、trp系、TACまたはTRC系のプロモーター群、お
よびラムダファージの主要プロモーター領域などが挙げられる。合成イントロン
の例としては、プラスミドpCI-Neo由来の合成イントロンがある (Promega Corpo
ration、WI、USAから入手可能)。
【０１１９】 シグナルペプチドの存在または不存在は例えば、発現させようとするポリペプ
チド（それが細胞内または細胞外ポリペプチドのいずれでも）の産生に使用され
る発現宿主細胞に、およびそれが分泌されるのを望むか否かによって変動する。
糸状菌にて使用するには、シグナルペプチドは通常、Aspergillus sp.アミラー
ゼまたはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、Rhizomucor mieheiリパーゼま
たはプロテアーゼまたはHumicola lanuginosaリパーゼをコードする遺伝子から
誘導できる。シグナルペプチドは好ましくは、A. oryzae TAKAアミラーゼ、A. n
iger中性α-アミラーゼ、A. niger酸安定アミラーゼ、またはA. nigerグルコア
ミラーゼをコードする遺伝子から誘導する。昆虫細胞にて使用するには、シグナ
ルペプチドは通常、昆虫遺伝子（WO 90/05783を参照）、例えばLepidopteran ma
nduca sexta脂質動員ホルモン前駆体（US 5,023,328）、ミツバチメリチン(Invi
trogen)、エクジステロイドUDPグルコシルトランスフェラーゼ(egt) (Murphy et
al.、Protein Expression and Purification 4、349-357 (1993)またはヒト膵
リパーゼ(hpl) (Methods in Enzymology 284、pp. 262-272, 1997)から誘導でき
る。哺乳類細胞にて使用される好ましいシグナルペプチドは、hG-CSFまたはネズ
ミIgカッパ軽鎖シグナルペプチド (Coloma、M (1992) J. Imm. Methods 152:89-
104)である。酵母にて使用するのに適したシグナルペプチドは、S. cereviciae
由来のα-因子シグナルペプチド(US 4,870,008参照)、主食カルボキシペプチダ
ーゼ シグナルペプチド(L.A. Valls et al.、Cell 48, 1987、pp. 887-897を参
照)、酵母BAR1 シグナルペプチド(WO 87/02670を参照)、酵母アスパラギンプロ
テアーゼ 3 (YAP3) シグナルペプチド(M. Egel-Mitani et al.、Yeast 6, 1990
、pp. 127-137を参照)、および合成リーダー配列 TA57 (WO98/32867)であること
を見出されている。大腸菌にて使用するのに適したシグナルペプチドは、シグナ
ルペプチドompAであることが見出されている。
【０１２０】 G-CSF活性を有するポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列はそ
れが部位特異的突然変異、合成、PCRまたは他の方法のいずれで調製されようと
も、要すればシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をも含有できる。
シグナルペプチドは、ポリペプチドが発現される細胞から分泌される場合に存在
する。このようなシグナルペプチドはそれが存在すれば、ポリペプチドの発現に
ついて選択される細胞によって認識されるはずである。シグナルペプチドはポリ
ペプチドに対してホモローガス（例えば、hG-CSFに通常伴われるもの）でもヘテ
ロローガス（即ちhG-CSFとは別個の供給源由来）でもよく、または宿主細胞に対
してホモローガスでもヘテロローガスでもよく、即ち宿主細胞から通常発現され
るシグナルペプチドであっても、宿主細胞から通常発現されないものであっても
よい。従って、シグナルペプチドは原核性、例えば大腸菌などの細菌由来でも、
真核性、例えば哺乳類または昆虫もしくは酵母細胞由来でもよい。
【０１２１】 細菌、真菌（酵母など）、植物、昆虫、哺乳類または他の適当な哺乳類もしく
は細胞系統、ならびにトランスジェニック動物または植物など、適当な宿主を使
用すれば、本発明のポリペプチドまたは本発明の結合体のポリペプチド部分を調
製できる。細菌宿主細胞の例としては、グラム陽性細菌、例えばバシラス株、例
えばB. brevis or B. subtilis、シュードモナスまたはストレプトマイセス、ま
たはグラム陰性細菌、例えば大腸菌株などがある。ベクターを細菌宿主細胞に導
入するには、例えばコンピーテント細胞(例えばYoung and Spizizin, 1961、Jou
rnal of Bacteriology 81: 823-829、またはDubnau and Davidoff-Abelson, 197
1、Journal of Molecular Biology 56: 209-221を参照）を使用するプロトプラ
スト形質転換(例えば、Chang and Cohen, 1979、Molecular General Genetics 1
68: 111-115を参照)、エレクトロポレーション（例えばShigekawa and Dower, 1
988、Biotechniques 6: 742-751を参照）、またはコンジュゲーション（例えばK
oehler and Thorne, 1987、Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照）
によって行うことができる。適当な糸状菌宿主細胞の例としては、アスペルギル
スの株、例えばA. oryzae、A. nigerまたは A. nidulans、Fusarium または Tri
chodermaが挙げられる。真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形
質転換、おｙびそれ自体既知の方法による細胞壁の再構成によって形質転換する
ことができる。アスペルギルス宿主細胞を形質転換する適当な手法は、EP 238 0
23 および US 5,679,543に記載されている。Fusarium種を形質転換する適当な方
法はMalardier et al., 1989、Gene 78: 147-156 および WO 96/00787に記載さ
れている。適当な酵母宿主細胞の例としては、サッカロマイセス、例えばS. cer
evisiae、Schizosaccharomyces、Klyveromyces、Pichia、例えばP. pastoris or
P. methanolica、Hansenula、例えば H. polymorpha または Yarrowiaが挙げら
れる。酵母は、Becker および Guarente、In Abelson、J.N. and Simon、M.I.、
editors、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzym
ology、Volume 194、pp 182-187、Academic Press、Inc.、New York; Ito et al
., 1983、Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen et al., 1978、Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences USA 75: 1920:に記載されている手
法によって、およびClontech Laboratories、Inc、Palo Alto、CA、USA (Yeastm
akerTM 酵母形質転換系キットの製品プロトコール)に記載されているようにして
形質転換することができる。適当な昆虫宿主細胞の例としては、鱗翅目（Lepido
ptora）細胞系統、例えばSpodoptera frugiperda (Sf9 または Sf21) またはTri
choplusioa ni 細胞 (High Five) (US 5,077,214)が挙げられる。昆虫細胞を形
質転換し、ヘテロローガスなポリペプチドをそこで産生させるのは、Invitrogen
に記載されているようにして行うことができる。適当な哺乳類宿主細胞の例とし
ては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系統、（例えばCHO-K1; ATCC CCL-
61）、ミドリザル細胞系統(COS) (例えば COS 1 (ATCC CRL-1650)、COS 7 (ATCC
CRL-1651))；マウス細胞 (例えば NS/O)、幼若ハムスター腎 (BHK) 細胞系統 (
例えば ATCC CRL-1632または ATCC CCL-10)、およびヒト細胞 (例えば HEK 293
(ATCC CRL-1573))、ならびに組織培養における植物細胞などが挙げられる。さら
に適当な細胞系統は当業者に既知であり、例えばAmerican Type Culture Collec
tion、ロックビル、メリーランドから入手可能である。外来性DNAを哺乳類宿主
細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、エレク
トロポレーション、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リボゾーム
仲介トランスフェクション、ウイルスベクターおよびLipofectamin 2000を使用
するLife Technologies Ltd、Paisley、UK に記載されている方法などがある。
これらの方法は当業界にて周知であり、例えばAusbel et al. (eds.), 1996、Cu
rrent Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、USAに
記載されている。哺乳類細胞の培養は、確立された方法、例えばAnimal Cell Bi
otechnology、Methods and Protocols、Nigel Jenkins編, 1999、Human Press I
nc、Totowa、ニュージャージー、USA および Harrison MA and Rae IF、General
Techniques of Cell Culture、Cambridge University Press 1997に記載されて
いるようにして行う。
【０１２２】 本発明の生産方法では、当業者に既知の方法によりポリペプチド産生に適した
栄養培地中にて細胞を培養する。例えば、細胞はフラスコ振盪培養、小規模また
は大規模発酵（例えば、連続、バッチ、床バッチ、または固体状態発酵）など、
研究室または工業用発酵槽において培養し、ポリペプチドが発現および／または
単離できるに適した培地および条件下に行う。培養は当業者に既知の手法により
、炭素および窒素原および無機塩を含む適当な栄養培地において起こる。適当な
培地は市販品として入手可能であり、または開示されている組成（例えば、Amer
ican Type Culture Collectionのカタログ）に従って調製することができる。ポ
リペプチドが栄養培地に分泌されるなら、そのポリペプチドは培地から直接回収
することができる。ポリペプチドが分泌されないなら、細胞溶解によって回収す
ることができる。
【０１２３】 得られたポリペプチドは当業者に既知の方法により回収できる。例えば、ポリ
ペプチドは、遠心、濾過、抽出、スプレー乾燥、留去または沈降などの通常の手
法（これらに限定されない）によって回収することができる。
【０１２４】 ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、
クロマトフォーカッスング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、調製用
等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば硫安沈殿）、SDS-PAGE、または抽出（例
えばProtein Purification、J.-C. Janson and Lars Ryden、editors、VCH Publ
ishers、New York, 1989を参照）などの当業者に既知の種々の手法（これらに限
定されない）によって精製することができる。G-CSF活性を有するポリペプチド
を精製するための具体的な方法は、C. S. Bae らによるD. Metcalf および N. A
. Nicola の造血コロニー刺激因子、p. 50-51、Cambridge University Press (1
995)、Appl. Microbiol. Biotechnol、52:338-344 (1999) およびUS 4,810,643
に記載されている。
【０１２５】本発明の医薬組成物およびその使用 さらなる態様において、本発明は、本明細書中に記載のポリペプチドまたは結
合体および少なくとも１つの製薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物
を包含する。
【０１２６】 本発明に基づくポリペプチド、結合体または医薬組成物は、疾病の処置、特に
、特定のタイプの化学療法、放射線療法および骨髄移植を受けている癌患者にお
ける感染症の予防、末梢血前駆細胞移植における採集のための前駆細胞の流動化
、重篤な慢性または血縁性白血球減少症の処置、急性骨髄性白血病を患った患者
の処置、AIDSまたは他の免疫不全疾病の処置、並びに抗真菌療法、特に全身性ま
たは湿潤性カンジダ症の処置のための医薬製品に用いることができる。
【０１２７】 その他の態様について、本発明に基づくポリペプチド、結合体または医薬組成
物を、放射線療法または化学療法から生じる疾患を含む一般的な造血疾患、特に
白血球減少症、AIDSまたは他の免疫不全疾病を有する哺乳動物を処置する方法で
あって、それを必要とする該哺乳動物にポリペプチド、結合体または医薬組成物
を投与することを含む処置方法に用いる。
【０１２８】 本発明のポリペプチドおよび結合体は、「治療的に有効な」用量、即ち、投与
される状態に関連する所望の効果を起こすのに十分な用量にて、患者に投与され
るだろう。正確な用量は、処置する疾患に依存し、当業者であれば周知の技術を
用いて確認できよう。本発明のポリペプチドまたは結合体を、例えば、ネウポジ
ン(Neupogen)(登録商標)などのrhG-CSFを用いる治療において使用される用量と
同等の用量にて投与することができる。本発明の結合体の好ましい用量は、約５
〜３００μｇ/体重ｋｇ（結合体のタンパク質部分の重量に基づく）、例えば、
１０〜２００μｇ/ｋｇ、２５〜１００μｇ/ｋｇなどの範囲であると考えられる
。当業者であれば、本発明のポリペプチド、結合体または組成物の有効量が、特
に、疾病、用量、投与スケジュール、ポリペプチドまたは結合体あるいは組成物
を単独または他の治療物質と組み合わせて投与されるか否か、組成物の血清半減
期、患者の全身健康および投与の頻度に依存することは理解されよう。本発明の
ポリペプチド、結合体、製剤または組成物を、有効量、特に、問題の患者の白血
球、特に好中球の数を正常にするのに十分な量にて投与することが好ましい。白
血球数の正常化は、従来法に基づき、定期的に白血球数を単に計数することによ
って決定することができる。
【０１２９】 本発明のポリペプチドまたは結合体は、１つまたはそれ以上の製薬的に許容さ
れる担体または賦形剤を含む組成物にて投与するのが好ましい。ポリペプチドま
たは結合体は、本質的に当分野に周知の様式にて医薬組成物に製剤化することで
十分に貯蔵安定となる、ヒトまたは動物に投与するのに適しているポリペプチド
医薬とすることができる。この医薬組成物は、液体若しくはゲル、または凍結乾
燥、またはその他の適当な剤形を含む種々の剤形に製剤化することができる。好
ましい剤形は、処置される特定の指標に依存する、および当業者には明らかであ
ろう。
【０１３０】 結果的に、本発明は、種々の形態の白血球減少症を処置する組成物および方法
を提供する。特に、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、特定のタイ
プの放射線療法、化学療法および骨髄移植を受けている癌患者における感染症を
予防するのに、末梢血前駆細胞移植における採集のための前駆細胞を流動化する
のに、重篤な慢性または血縁性白血球減少症の処置のために、そして急性骨髄性
白血病を患った患者の処置を支持するのに用いることができる。加えて、本発明
のポリペプチド、結合体または組成物を、AIDSまたは他の免疫不全疾病の処置の
ために、および抗真菌療法、特に全身性または湿潤性カンジダ症の処置のために
、および細菌感染症の処置のために用いることができる。
【０１３１】 剤形 本発明のポリペプチドまたは結合体は、「そのまま」および／またはその塩型
にて用いることができる。適当な塩には、アルカリ金属またはアルカリ土類金属
、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩、例えば亜
鉛塩などが挙げられるが、これらに制限されない。これらの塩または結合体は、
結晶質構造および／または非晶質構造として存在できる。
【０１３２】 賦形剤 「製薬的に許容される」とは、用いられる投薬量および濃度において、投与さ
れる患者に、厄介な効果を全く引き起こさない担体または賦形剤を意味する。そ
のような製薬的に許容される担体および賦形剤は、当分野にて周知である (Remi
ngton's Pharmaceutical Sciences、18th edition、A. R. Gennaro、Ed.、Mack
Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Pep
tides and Proteins、S. FrokjaerおよびL. Hovgaard、Eds.、Taylor ＆ Franci
s [2000] ; および Handbook of Pharmaceutical Excipients、3rd edition、A.
Kibbe、Ed.、Pharmaceutical Press [2000]を参照のこと)。
【０１３３】 薬物混合 本発明の医薬組成物は、単独または他の治療物質と組み合わせて投与すること
ができる。この物質は、同じ医薬組成物の一部として組み込むことができるか、
または本発明のポリペプチドまたは結合体から分離して、同時にまたはその他の
処置スケジュールに基づいて投与することができる。加えて、本発明のポリペプ
チド、結合体または医薬組成物は、他の治療に対する補助剤として用いることが
できる。
【０１３４】 患者 本発明の目的において「患者」には、ヒトおよび他の哺乳動物が含まれる。従
って、本方法は、ヒト治療および獣医応用に適用できる。
【０１３５】 投与経路 本発明の製剤の投与は、経口、皮下、静脈内、大脳内、鼻腔内、経皮的、腹腔
内、筋肉内、肺内、膣、直腸、眼内、または他の任意の許容される様式を含む種
々の方法により行なうことができる(これらに制限されない)。製剤は、ボーラス
注射が許容されるとはいえ、当分野にて周知の技術を用いて注入により連続的に
投与することができる。
【０１３６】 非経口 医薬組成物の例としては、非経口投与のために設計された溶液がある。多くの
場合、製薬的な溶剤は、即時の使用に適する液状にて提供されるとはいえ、その
ような非経口製剤は、凍結剤形または凍結乾燥剤形においてもまた提供できる。
前者の場合、組成物を使用前に解凍しなければならない。凍結乾燥製剤が、その
液体の対応物よりも、一般的により安定であることが当業者には理解されるため
に、後者の形態が、多種多様の保存条件下において、組成物中に含まれる活性化
合物の安定性を高めるのにしばしば用いられる。そのような凍結乾燥製剤は、使
用する前に、１つまたはそれ以上の適当な製薬的に許容される希釈剤、例えば注
射用の滅菌水または滅菌生理食塩水を加えてることによって元に戻される。
【０１３７】 非経口の場合、これらは、凍結乾燥剤、または所望の純度のポリペプチドを、
１つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体、賦形剤または当分野にて典型的
に用いられる安定剤 (「賦形剤」と称されるもの全て)、例えば、緩衝剤、安定
物質、防腐剤、等張剤(isotonifier)、非−イオン洗浄剤、抗酸化剤および／ま
たは他の多種の添加剤を用いて、適当に混合された水溶液として貯蔵用に調製さ
れる。
【０１３８】 緩衝剤は、ｐＨ範囲を適当な生理条件に維持する助けとなる。これらは、典型
的に約２ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度範囲にて典型的に存在する。本発明と共に用い
るのに適当な緩衝剤には、有機酸および無機酸並びにそれらの塩、例えば、クエ
ン酸緩衝液 (例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合液、ク
エン酸−クエン酸三ナトリウム混合液、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合液
など)、コハク酸緩衝液 (例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合液、コ
ハク酸−水酸化ナトリウム混合液、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合液など
)、酒石酸緩衝液 (例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合液、酒石酸−酒石酸
カリウム混合液、酒石酸−水酸化ナトリウム混合液など)、フマル酸緩衝液 (例
えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合液、フマル酸−フマル酸二ナトリウ
ム混合液、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合液など)、グルコ
ン酸緩衝液 (例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合液、グルコン酸−
水酸化ナトリウム混合液、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合液など)、シュ
ウ酸緩衝液 (例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合液、シュウ酸−水酸化
ナトリウム混合液、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合液など)、乳酸緩衝液 (例
えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合液、乳酸−水酸化ナトリウム混合液、乳酸−乳
酸カリウム混合液など) および酢酸緩衝液 (例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合
液、酢酸−水酸化ナトリウム混合液など) が含まれる。加えて、リン酸緩衝液、
ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩、例えばトリスが可能である。
【０１３９】 防腐剤は細菌増殖を遅らせるのに加えられ、典型的に約０.２％〜１％（ｗ/ｖ
）の量にて加えられる。本発明と共に用いるのに好ましい防腐剤には、フェノー
ル、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベ
ン、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、ベンズアルコニウムハラ
イド (例えば、 ベンズアルコニウムクロライド、ブロミドまたはヨージド)、ヘ
キサメトニウムクロライド、アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプ
ロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−
ペンタノールが挙げられる。
【０１４０】 等張剤を、液体組成物の等張を保証するために添加し、多価糖アルコール、好
ましくは三水和糖アルコールまたは高級糖アルコール、例えば、グリセリン、エ
リトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール
が含まれる。多価アルコールは、他の成分との相対量を考慮し、重量当たり０.
１％〜２５％量、典型的には１％〜５％にて存在させることができる。
【０１４１】 安定剤は、治療物質を可溶化するか、または変性若しくは容器の壁への付着を
防ぐのを助ける、充填剤から添加剤までの機能を範囲とし得る賦形剤の幅広い範
疇を意味する。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（以上に列挙する）；アル
ギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン
、オミシン(omithine)、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、
スレオニンなどのアミノ酸、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニ
トール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール(myoinis
itol)、ガラクチトール、グリセロールなどのオーガニックシュガーまたは糖ア
ルコール、イノシトールなどのシクリトールを含む；ポリエチレングリコール；
アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリ
ウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム
などの硫黄含有還元剤；低分子量のポリペプチド (即ち、＜１０残基)；ヒト血
清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタン
パク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース
、フルクトースおよびグルコースなどの単糖；ラクトース、マルトースおよびス
クロースなどの二糖；ラフィノースなどの三糖；デキストランなどの多糖の場合
がある。安定剤は、典型的に活性タンパク質重量に基づく重量当たり０.１〜１
０,０００パートの範囲に存在する。
【０１４２】 非−イオン性の界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られている）
は、治療物質の可溶化を助け、攪拌誘導性の凝集から治療ポリペプチドを防護す
るのに存在させる場合があり、ポリペプチドの変性を引き起こすことなく、尖断
表面圧力(shear surface stress)に曝して製剤化することもできる。適当な非−
イオン性界面活性剤には、ポリソルベート(２０、８０など)、ポリオキサマー(
１８４、１８８など)、プロニック(Pluronic)(登録商標)ポリオール、ポリオキ
シエチレンソルビタン(sorbitan)モノエーテル（ツウィーン(Tween)(登録商標)
−２０、Tween(登録商標)−８０など）が挙げられる。
【０１４３】 さらに多種の賦形剤には、充填剤または増量剤 (例えば、デンプン)、キレー
ト剤 (例えば、ＥＤＴＡ)、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、
ビタミンＥ) および助溶剤が挙げられる。
【０１４４】 活性成分を、例えば共確認(coascervation)技術または界面重合により調製し
たマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ
−(メチルメタクリラート)マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系 (例えば
、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ−微粒
子およびナノカプセル) またはマクロエマルジョン中に含ませることもできる。
そのような技術は、上記のRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されて
いる。
【０１４５】 インビボ投与に用いられる非経口製剤は、滅菌状態でなければならない。これ
は、例えば滅菌濾過膜を通じて滅菌することで容易に達成される。
【０１４６】 徐放性製剤 徐放性製剤の適当な例としては、ポリペプチドまたは結合体を含む固体疎水性
ポリマーの半透性物質、フィルムまたはマイクロカプセルなどの適当な形態を有
する物質が含まれる。徐放性物質の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル(例
えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリラート) またはポリ(ビニルアルコ
ール))、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸の共ポリマーおよびエチル−Ｌ−グル
タメート、非−分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸
共ポリマー、例えばプロリース(登録商標)テクノロジー(ProLeasetechnology)ま
たはルプロデポット(登録商標)(Lupron Depot)(乳酸−グリコール酸共ポリマー
およびロイプロリドアセテートから成る注射用ミクロスフェア)、およびポリ−
Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニルアセテートおよび
乳酸−グリコール酸などのポリマーが最大１００日またはそれ以上の長期間の分
子放出が可能であるのに対して、特定のヒドロゲルは、短期間でタンパク質を放
出する。カプセル封入されたポリペプチドが長期間体内に残留する場合、３７℃
にて湿気に曝される結果として、変性または凝集する場合があり、その結果とし
て、生物活性を喪失し、免疫原性に変化が生じる可能性がある。包含される機構
に依存する安定性に対して、合理的なストラテジーを工夫することができる。例
えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換による分子内Ｓ−Ｓ結合形成である
ことが見出された場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾すること、酸溶液か
ら凍結乾燥すること、含水率を調節すること、適当な添加剤を用いること、およ
び特有のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成できる。
【０１４７】 非経口送達 噴霧器、ジョットまたは超音波のいずれかを用いて使用するのに適当な製剤は
、例えば、約０.０１〜２５結合体ｍｇ/溶液ｍＬの濃度、好ましくは約０.１〜
１０ｍｇ/ｍＬの濃度にて水中に溶解したポリペプチドまたは結合体を典型的に
含有しよう。また、その製剤には、緩衝液および単糖（例えば、タンパク質安定
化および浸透圧調整のため）および／またはヒト血清アルブミンを濃度範囲０.
１〜１０ｍｇ/ｍｌにて含ませることもできる。用いることができる緩衝液の例
としては、酢酸ナトリウム、シトレートおよびグリシンがある。緩衝液は、溶液
のｐＨを３〜９の範囲に調整できる、適当な組成物およびモル濃度を有すること
が好ましい。一般に、１ｍＭ〜５０ｍＭのモル濃度の緩衝液が、この目的に対し
て適している。利用できる糖の例としては、ラクトース、マルトース、マンニト
ール、ソルビトール、トレハロースおよびキシロースがあり、通常、製剤の重量
当たり１％〜１０％の範囲の量である。
【０１４８】 また、噴霧製剤は、エアロゾル形成における溶液の噴霧化によって生じる、タ
ンパク質の表面誘導性凝集を減少させるか、または防止する界面剤を含ませても
よい。従来の種々の界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルお
よびアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが用いら
れる。量は、製剤の重量当たり０.００１％〜４％の範囲が典型的であろう。本
発明の目的のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン
モノオレエートである。
【０１４９】 本発明の液体粒子の適当な散布を起こす特有の製剤および方法は、WO 94/2006
9、米国5,915,378、米国5,960,792、米国5,957,124、米国5,934,272、米国5,915
,378、米国5,855,564、米国5,826,570および米国5,522,385に記載されている（
これらは、引用により本明細書中に包含される)。
【０１５０】 計量式吸入器と共に用いるための製剤には、典型的に細かく分離した粉末を含
まれよう。この粉末は凍結乾燥後、液体複合製剤を粉末化することによって製造
でき、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)などの安定剤も含ませることができる。典型
的に、ＨＳＡは０.５％（ｗ/ｗ）を越えて加えられる。さらに、１つまたはそれ
以上の糖または糖アルコールを、必要であれば、添加して製造することができる
。例としては、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、ソルビ
トース(sorbitose)、トレハロース、キシリトールおよびキシロースが挙げられ
る。製剤に加えられる量は、結合体パーセントの約０.０１〜２００％（ｗ/ｗ)
、好ましくは、およそ１〜５０％の範囲であろう。その後、その製剤を凍結乾燥
し、所望の粒子サイズに粉末化する。
【０１５１】 その後、この適切な大きさの粒子を、界面活性剤の補助と共に噴霧剤中に懸濁
する。噴霧剤は、この目的のために用いられる任意の慣習的な物質、例えば、ク
ロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボ
ンまたはチオクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテト
ラフルオロエタノール、および１,１,１,２−テトラフルオロエタンを含むヒド
ロカーボン、あるいはその組合せなどの場合がある。適当な界面活性剤には、ソ
ルビタントリオレアートおよびダイズレクチンが挙げられる。オレイン酸は、界
面活性剤としても有用である。その後、この混合物を送達機器に充填する。本発
明の使用に適した商業的に入手可能な計量式吸入器としては、Glaxo Inc.、Rese
arch Triangle Park、N.C.製のベントリン(Ventolin)計量式吸入器がある。
【０１５２】 粉末吸入器のための製剤には、結合体を含有する細かく分離した乾燥粉末を含
みよう、そして、この装置からの粉末の分散を容易にする量、例えば、製剤の重
量当たり５０％〜９０％にて、ラクトース、ソルビトール、スクロース、または
マンニトールなどの充填剤もまた含ませることができる。この粉末の粒子は、肺
において、中位径１０μｍより小さい、好ましくは０.５〜５μｍ、最も好まし
くは１.５〜３.５μｍである約１ｇ/ｃｍ２の濃度の粒子に相当する空気力学的
特徴を有するだろう。本明細書中の技術に基づく使用に適した粉末吸入器の例と
しては、Fisons Corp.、Bedford、Mass製のスピンハラー(Spinhaler)粉末吸入器
がある。
【０１５３】 この装置のための粉末は、米国5,997,848、米国5,993,783、米国5,985,248、
米国5,976574、米国5,922,354、米国5,785,049および米国5,654,007に開示され
た方法によって作り出すか、および／または誘導することができる。
【０１５４】 治療産物の肺送達のために設計された機械装置には、噴霧器、計量式噴霧器お
よび粉末吸入器が含まれるが、これらに制限されず、これらは全て、当業者に周
知である。本発明の目的のために適当な商業的に入手可能な特定の装置の例とし
ては、Mallinckrodt、Inc.、St. Louis、Missouri製のウルトラベント噴霧器(Ul
travent nebulizer)；Marquest Medical Products、Englewood、Colorado製のア
コーン(Acorn)II噴霧器；Glaxo Inc.、Research Triangle Park、North Carolin
a製のベントリン計量式噴霧器；Fisons Corp.、Bedford、Massachusetts製のス
ピンハラー粉末噴霧器；Inhale Therapeutic Systems、Inc.、San Carlos、Cali
fornia製の「スタンディングクラウド(standing cloud)」装置；Alkermes、Camb
ridge、Massachusetts製のＡＩＲ吸入器；およびAradigm Corporation、Hayward
、California製のＡＥＲｘ肺薬物送達系がある。
【０１５５】 また、遺伝子治療応用における本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の
使用が考えられる。特に、上記標題「非−ポリペプチド部分が炭化水素部分であ
る、本発明の結合体」のセクション中に記載したポリペプチドをコードする核酸
配列を使用することに見込みがあろう。このように、ポリペプチドのグリコシル
化は、遺伝子治療の進行の間、即ち、ヒト体内における核酸配列の発現後に行な
われる。
【０１５６】 考えられる遺伝子治療応用には、ポリペプチドが有効な治療を提供することが
期待される疾患の処置が含まれる。これには、種々の形態の白血球減少症の処置
、特に特定のタイプの化学療法および骨髄移植を受けている癌患者の感染症の予
防、末梢血前駆細胞における採集のための前駆細胞の流動化、重篤な慢性または
血縁性白血球減少症の処置、急性骨髄性白血病を患った患者の処置およびAIDSま
たは他の免疫不全疾病の処置が含まれる。
【０１５７】 遺伝子治療に用いるG-CSFの局部送達は、治療物質を標的領域に提供できると
同時に、非特異的投与に関連して生じる潜在的な毒問題を回避できる。
【０１５８】 インビトロおよびインビボ双方の遺伝子治療方法論が考えられる。
【０１５９】 潜在的な治療遺伝子を規定された細胞群に導入する幾つかの方法が知られてい
る。さらに、参考資料として、例えば、Mulligan、「遺伝子治療の基礎科学」、
Science、260、pp. 926−31 (1993)を参照のこと。これらの方法には： ダイレクト遺伝子トランスファー、例えば、Wolff et al.、「インビボにおけ
るマウス筋肉中へのダイレクト遺伝子トランスファー」、Science 247、pp. 146
5−68 (1990)により開示されている； リポソーム−媒介ＤＮＡトランスファー、例えば、Caplen et al.、「嚢胞性
線維症を患った患者の鼻上皮へのリポソーム−媒介ＣＦＴＲ遺伝子トランスファ
ー」Nature Med.、3、pp. 39−46 (1995)；Crystal、「薬物としての遺伝子」、
Nature Med.、1、pp. 15−17 (1995)；GaoおよびHuang、「哺乳動物細胞の効果
的なトランスフェクションのための新規カチオン性リポソーム試薬」、Biochem.
Biophys Res. Comm.、179、pp. 280−85 (1991)により開示されている; レトロウイルス−媒介性ＤＮＡトランスファー、例えば、Kay et al.、「イン
ビボにおける、Ｂ型血友病の遺伝子治療：因子ＩＸ−欠乏ドッグにおける持続性
部分採集」、Science、262、pp. 117−19 (1993)；Anderson、「ヒト遺伝子治療
」、Science、256、pp.808−13(1992)により開示されている； ＤＮＡウイルス−媒介ＤＮＡトランスファー。そのようなＤＮＡウイルスには
、アデノウイルス (好ましくは、Ａｄ−２またはＡｄ−５基礎ベクター)、ヘル
ペスウイルス (好ましくは、単純ヘルペスウイルス基礎ベクター)、およびパル
ボウイルス (好ましくは、「欠損」または非−自立性パルボウイルス基礎ベクタ
ー、より好ましくは、アデノ−結合ウイルス基礎ベクター、最も好ましくはＡＡ
Ｖ−２基礎ベクター)が含まれる。例えば、Ali et al.、「遺伝子治療用ベクタ
ーとしてのＤＮＡウイルスの使用」、Gene Therapy、1、pp. 367−84 (1994)；
米国4,797,368および米国5,139,941を参照のこと。
【０１６０】 本発明を非制限的な例として以下にさらに記載する。
【０１６１】 配列表 添付の配列表は、以下の配列を含む： 配列番号：１：ヒトG-CSFのアミノ酸配列。 配列番号：２：Ｅ.ｃｏｌｉ中の発現を最適化したコドン使用頻度を有する、ヒ
トG-CSFをコードする合成ＤＮＡ配列。 配列番号：３：ＯｍｐＡシグナル配列のアミノ酸配列。 配列番号：４：ＯｍｐＡシグナル配列をコードする合成ＤＮＡ配列。 配列番号：５：合成ヒスチジン標識。 配列番号：６：配列番号：５のヒスチジン標識をコードする合成ＤＮＡ配列。 配列番号：７：ヒトG-CSFシグナルペプチドのアミノ酸配列。 配列番号：８：ＣＨＯ細胞中の発現を最適化したコドン使用頻度を有する、配列
番号７のシグナルペプチドを含む、ヒトG-CSFをコードする合成ＤＮＡ配列。
【０１６２】 材料および方法 改変されるアミノ酸を決定するのに用いた方法 最近接包絡面積 (ＡＳＡ) ＮＭＲ分光法によって決定された１０構造の３Ｄアンサンブル (Zink et al.
(1994) Biochemistry 33: 8453−8463) は、プロテインデータバンク (ＰＤＢ)(
www.rcsb.org/pdb/)から入手できる。この情報は、コンピュータープログラムア
クセス(Access) (B. LeeおよびF.M. Richards、J. Mol. Biol. 55: 379−400 (1
971)) バージョン２ ((著作権) 1983 Yale University) 中に組み込むことがで
き、構造中の個々の原子の最近接包絡面積 (ASA) を計算するのに用いることが
出来る。この方法は、典型的に１.４Åの探索サイズを用い、探索の中心により
形成される領域として最近接包絡面積 (ASA) を規定する。他の原子がタンパク
質に直接関連すべきでないために、この計算の前に、水分子および水素原子の全
てを、座標設置から取り除くべきである。
【０１６３】 側鎖の分画ＡＳＡ 側鎖原子の分画ＡＳＡは、伸張したALA−x−ALAトリペプチドの残基タイプの
側鎖原子のＡＳＡを表す値を用いて、側鎖中の原子のＡＳＡの合計を割ることに
よって計算する。Hubbard、Campbell ＆ Thornton (1991) J.Mol.Biol.220、507
−530を参照のこと。この実施例について、ＣＡ原子は、残存する残基について
ではなく、グリシン残基の側鎖の一部として評価される。以下の表中の値は、側
鎖についての１００％ＡＳＡ標準として用いる。
【表５】 Ala 69.23 Å２ Leu 140.76 Å２ Arg 200.35 Å２ Lys 162.50 Å２ Asn 106.25 Å２ Met 156.08 Å２ Asp 102.06 Å２ Phe 163.90 Å２ Cys 96.69 Å２ Pro 119.65 Å２ Gln 140.58 Å２ Ser 78.16 Å２ Glu 134.61 Å２ Thr 101.67 Å２ Gly 32.28 Å２ Trp 210.89 Å２ His 147.00 Å２ Tyr 176.61 Å２ Ile 137.91 Å２ Val 114.14 Å２
【０１６４】 可動部中の残基と考えられるために、この構造において決定されない残基は、
１００％露光を有するとして規定される。
【０１６５】 原子間距離の決定： この原子間距離は、モレキュラーグラフィックソフトウエアー、例えばインサ
イト(Insight)II(登録商標)v.98.0、MSI INC.を用いて容易に決定される。
【０１６６】 改変されるアミノ酸残基に関しての一般的な考察 以上に説明したように、本発明に関連して改変されるアミノ酸残基は、その側
鎖が表面に曝されているアミノ酸が好ましく、特にその分子の表面において、側
鎖が約２５％を越えて曝されているアミノ酸、より好ましくは、側鎖が５０％を
超えて曝されているアミノ酸である。その他の考察としては、受容体結合または
活性化を伴う干渉を回避できるか、少なくとも極小化できるために、受容体界面
中に位置する残基を排除することが好ましい。さらなる考察としては、近接する
Lys (Glu、Asp)ＣＢ−ＣＢ(GlyについてのCA) から１０Å未満の残基もまた、排
除すべきである。最後に、改変について好ましい位置は、親水性および／または
電荷を有する残基、即ち、Asp、Asn、Glu、Gln、Arg、His、Tyr、SerおよびThr
の位置であり、アルギニン残基の位置が特に好ましい。
【０１６７】 改変のためのG-CSFアミノ酸残基の同定 以下の情報は、本発明に関連して改変されるアミノ酸残基を同定する場合に、
一般に考慮すべき要素を例示する。
【０１６８】 ヒトG-CSFについての３次元構造が、Ｘ線結晶学により(Hill et al. (1993) P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 5167−5171)、そしてＮＭＲ分光学(Zink et al. (1
994) Biochemistry 33: 8453−8463)により報告された。上記のように、Aritomi
et al(Nature 401:713−717、1999)は、受容体結合界面の一部であるとして、
以下のhG-CSF残基を同定した：G4、P5、A6、S7、S8、L9、P10、Q11、S12、L15、
K16、E19、Q20、L108、D109、D112、T115、T116、Q119、E122、E123およびL124
。従って、これらの残基を改変することができるとはいえ、これらの残基は改変
から除かれることが好ましい。
【０１６９】 Zink et al. (1994)により同定されたG-CSFの１０ＮＭＲ構造を投入構造とし
て用い、側鎖の平均ＡＳＡを計算し、以下の残基を、２５％を越えるＡＳＡを有
すると同定した：M0、T1、P2、L3、G4、P5、A6、S7、S8、L9、P10、Q11、S12、F
13、L14、L15、K16、C17、E19、Q20、V21、R22、K23、Q25、G26、D27、A29、A30
、E33、K34、C36、A37、T38、Y39、K40、L41、H43、P44、E45、E46、V48、L49、
L50、H52、S53、L54、I56、P57、P60、L61、S62、S63、P65、S66、Q67、A68、L6
9、Q70、L71、A72、G73、C74、S76、Q77、L78、S80、F83、Q86、G87、Q90、E93
、G94、S96、P97、E98、L99、G100、P101、T102、D104、T105、Q107、L108、D10
9、A111、D112、F113、T115、T116、W118、Q119、Q120、M121、E122、E123、L12
4、M126、A127、P128、A129、L130、Q131、P132、T133、Q134、G135、A136、M13
7、P138、A139、A141、S142、A143、F144、Q145、R146、R147、S155、H156、Q15
8、S159、L161、E162、V163、S164、Y165、R166、V167、L168、R169、H170、L17
1、A172、Q173、P174。
【０１７０】 同様に、以下の残基は、５０％を越えるＡＳＡを有する：M0、T1、P2、L3、G4
、P5、A6、S7、S8、L9、P10、Q11、S12、F13、L14、L15、K16、C17、E19、Q20、
R22、K23、G26、D27、A30、E33、K34、T38、K40、L41、H43、P44、E45、E46、L4
9、L50、S53、P57、P60、L61、S62、S63、P65、S66、Q67、A68、L69、Q70、L71
、A72、G73、S80、F83、Q90、G94、P97、E98、P101、D104、T105、L108、D112、
F113、T115、T116、Q119、Q120、E122、E123、L124、M126、P128、A129、L130、
Q131、P132、T133、Q134、G135、A136、A139、A141、S142、A143、F144、R147、
S155、S159、E162、R166、V167、R169、H170、L171、A172、Q173、P174。
【０１７１】 分子グラフィックプログラムインサイトII(登録商標) v.98.0を用いて、リシ
ンのＮＺ原子およびＮ末端残基Ｔ１のＮ原子として規定された、近接アミノ基か
ら１５Åを越える距離にある、ＣＢ原子（グリシンの場合、ＣＡ）を有する残基
を決定する。以下の表中には、１０ＮＭＲ構造の少なくとも１つについて判定基
準を満たす残基が含まれる。G4、P5、A6、S7、S8、L9、P10、Q11、L14、L15、L1
8、V21、R22、Q25、G26、D27、G28、A29、Q32、L35、C36、T38、Y39、C42、H43
、P44、E45、E46、L47、V48、L49、L50、G51、H52、S53、L54、G55、I56、P57、
W58、A59、P60、L61、S62、S63、C64、P65、S66、Q67、A68、L69、Q70、L71、A7
2、G73、C74、L75、S76、Q77、L78、H79、S80、G81、L82、F83、L84、Y85、Q86
、G87、L88、L89、Q90、A91、L92、E93、G94、I95、S96、P97、E98、L99、G100
、P101、T102、L103、D104、T105、L106、Q107、L108、D109、V110、A111、D112
、F113、A114、T115、T116、I117、W118、Q119、Q120、M121、E122、E123、L124
、G125、M126、A127、P128、A129、L130、Q131、P132、T133、Q134、G135、A136
、M137、P138、A139、F140、A141、S142、A143、F144、Q145、R146、R147、A148
、G149、G150、V151、L152、V153、A154、S155、H156、L157、Q158、S159、F160
、L161、E162、V163、S164、Y165、R166、V167、L168、R169、H170、L171、A172
、Q173、P174。
【０１７２】 インサイトII(登録商標) v.98.0 プログラムを同様に用い、アスパラギン酸の
ＣＧ原子、グルタミン酸のＣＤ原子およびＣ−末端残基Ｐ１７４のＣ原子として
規定された近接酸基から１０Åを超える位置にある、ＣＢ原子 (グリシンの場合
、ＣＡ原子) を有する残基を決定した。１０ＮＭＲ構造の少なくとも１つについ
て判定基準を満たす残基が含まれる。M0、T1、P2、L3、G4、P5、A6、S7、S8、L9
、P10、Q11、S12、F13、L14、T38、Y39、K40、L41、C42、L50、G51、H52、S53、
L54、G55、I56、P57、W58、A59、P60、L61、S62、S63、C64、P65、S66、Q67、A6
8、L69、Q70、L71、A72、G73、C74、L75、S76、Q77、L78、H79、S80、G81、L82
、F83、L84、Y85、Q86、G87、L88、I117、M126、A127、P128、A129、L130、Q131
、P132、T133、Q134、G135、A136、M137、P138、A139、F140、A141、S142、A143
、F144、Q145、R146、R147、A148、G149、G150、V151、L152、V153、A154、S155
、H156、L157、V167、L168、R169、H170、L171。
【０１７３】 上記の表を組合せ、比較することで、改変のために個々のアミノ酸残基を選択
することができるようになり、結果として、与えられたG-CSFポリペプチドにお
ける改変が所望の性質となるであろうアミノ酸残基の限定された数を含む表とな
る。
【０１７４】 hG-CSFおよびその変異体のＰＥＧ化(ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ)のための方法 溶液中におけるhG-CSFおよびその変異体のＰＥＧ化 ヒトG-CSFおよびその変異体を、ｐＨ８.５の５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１
００ｍＭ ＮａＣｌ中、濃度２５０μｇ/ｍｌにてＰＥＧ化した。タンパク質のＰ
ＥＧ化部位に関して、１００倍の過剰モル濃度のＰＥＧにする。この反応混合物
を、熱混合機(thermo mixer)に移し、３７℃、１２００ｒｐｍにて３０分間混合
する。３０分後、過剰モル濃度のグリシンを加えることにより、反応を停止させ
た反応物を得る。
【０１７５】 陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、この反応混合物から過剰量のＰＥ
Ｇ、グリシンおよび他の副産物を除去する。このＰＥＧ化反応混合物を、イオン
強度が７ｍＳ/ｃｍより小さくなるまで、ｐＨ２.５の２０ｍＭクエン酸ナトリウ
ムを用いて希釈する。ｐＨを、５Ｎ ＨＣｌを用いて、２.５に調整する。この混
合物を、ｐＨ２.５の２０ｍＭ クエン酸ナトリウムを用いて平衡化したＳＰ−セ
ファロースＦＦカラムにかける。非結合物質を、等張緩衝液の４倍量を用いてカ
ラムから洗い出す。ＰＥＧ化タンパク質を、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、７
５０ｍＭ 塩化ナトリウムを加え、３倍カラム容量中に溶出する。純粋なＰＥＧ
化G-CSFを濃縮し、ビバスピン(VivaSpin)濃縮機を用いて、緩衝交換を行なう、
切り捨て(cut-off)分子量(mwco)：１０ｋＤａ。
【０１７６】 G-CSF活性を用いた標識化ポリペプチドのマクロタイタープレートにおけるＰＥ
Ｇ化 G-CSF活性提示ポリペプチドを、適当な標識、例えば上記概要中に例示した任
意の標識を用いて表出させ、標識化ポリペプチドを固定化できるマイクロプレー
トの１つまたはそれ以上のウェル中に培養液を移す。標識がMet−Lys−His−Gln
−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−Glnの場合、キアゲン(
QIAGEN)から商業的に入手可能なニッケル−ニトリロトリ酢酸 (Ni-NTA) ヒズソ
ルブ(HisSorb)マイクロタイタープレートを用いることができる。
【０１７７】 標識化ポリペプチドをマイクロタイタープレートに固定化した後、ウェルを結
合に適した緩衝液中にて洗浄し、次いで最適な活性化ＰＥＧと一緒にウェルをイ
ンキュベートすることによりＰＥＧ化する。例としては、シェアウォーターポリ
マーズ(Shearwater Polymaers)由来のＭ−ＳＰＡ−５０００を用いる。ポリペプ
チドに対する活性化ＰＥＧのモル比を最適化すべきあるが、典型的には１０：１
を越えるであろう、例えば、最大１００：１若しくはそれ以上である。周囲温度
にて適当な反応時間、典型的にはおよそ１時間の後、その反応を活性化ＰＥＧ溶
液を取り除くことにより停止させる。連結タンパク質を適当な緩衝液と一緒にイ
ンキュベートすることにより、プレートから溶出する。適当な溶出緩衝液は、イ
ミダゾール、過剰量のＮＴＡまたはその他のキレート化合物を含む場合がある。
この連結タンパク質を、必要に応じて生物学的活性および免疫原性を検定する。
標識を場合によっては当分野にて周知の方法を用いて、例えばジアミダーゼを用
いて切断することができ、ｐｏｓ１中のＧｌｎを、ＧＣＴ(グルタミルシクロト
ランスフェラーゼ)を用いて、ピログルタミルに変換することができ、最終的に
ＰＧＡＰ(ピロ−グルタミル−アミノペプチダーゼ)を用いて切断し、非標識化パ
ンパク質を得る。この過程には、幾つかの金属キレートアフィニティークロマト
グラフィーの過程が含まれる。他の方法として、標識化ポリペプチドを連結する
ことができる。
【０１７８】 hG-CSF活性提示する、およびブロックされた受容体結合部位を有するポリペプチ
ドのＰＥＧ化 受容体認識を含む、リシンのＰＥＧ化を排除する様式にてhG-CSFのＰＥＧ化を
最適化するために、以下の方法を開発した： 精製したhG-CSFを、実施例３に記載のように得る。２：２化学量論のhG-CSFポ
リペプチドとG-CSF受容体の可溶性ドメインから成るホモ二量体結合体を、ｐＨ
７のリン酸緩衝生理食塩溶液(ＰＢＳ)バッファー中にて形成させる。hG-CSFポリ
ペプチドの濃度を、およそ２０μｇ/ｍｌまたは１μＭにし、受容体は等モル濃
度存在させる。
【０１７９】 Shearwater Polymers, Inc.由来のＭ−ＳＰＡ−５０００を、過剰量の５、２
０および１００モル濃度のhG-CSFポリペプチドに相当する３種の異なる濃度レベ
ルにて添加する。反応時間は室温にて３０分間である。３０分の反応期間後、反
応混合物のｐＨをｐＨ２.０に調整し、その反応混合物を、バイダック(Vydac)Ｃ
１８カラムにかけ、実質的に(Utsumi et al.、J. Biochem.、Vol. 101、1199−1
208、(1987)に記載のアセトニトリル勾配を用いて溶出する。あるいは、イソプ
ロパノール勾配を用いることができる。
【０１８０】 本明細書中に記載の第一スクリーニング検定を用いて、フラクションを分析し
、この方法により得た活性ＰＥＧ化hG-CSFポリペプチドを、−８０℃にて、１ｍ
ｇ/ｍｌヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を含む、ｐＨ７のＰＢＳ中にて保存する。
【０１８１】 連結および非連結hG-CSFおよびその変異体を特徴付けるために用いた方法 hG-CSFおよびその変異体の分子サイズの決定 連結または非連結hG-CSFまたはその変異体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲ
ル濾過、マトリックス補助(matrix assisted)レーザー脱離質量分析または平衡
遠心分離のいずれかを用いて決定する。
【０１８２】 ポリペプチド濃度の決定 ポリペプチド濃度は、２８０ｎｍの光学密度測定、酵素結合免疫吸着測定法(
ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫測定法(ＲＩＡ)または他の当分野にて周知の免疫検出
技術を用いて測定することができる。さらに、試料中のポリペプチド濃度を、ポ
リペプチドに特異的な抗体を用いてコートしたビアコア(Biacore)チップを用い
るビアコア(登録商標)機器を用いて測定できる。
【０１８３】 そのような抗体を、ビアコア(登録商標)チップに、種々の化学により共有的に
結合させることができる。その他の方法として、例えば、抗ポリペプチド抗体の
Ｆｃ部分に対して特異的な抗体を用いることよって、抗体を非共有的に結合させ
ることができる。Ｆｃ特異的抗体を、最初にチップに共有的に結合させる。その
後、抗−ポリペプチド抗体をチップに流すことで、直接的様式にて第一の抗体に
より結合される。さらに、ビオチン化抗体を、ストレプトアビジンコートした表
面 (例えば、 ビアコアセンサーチップＳＡ(登録商標)）を用いて固定化するこ
とができる (生体分子相互作用の経時分析、NagataおよびHanda (Eds.)、2000、
Springer Verlag、Tokyo; Biacore 2000 Instrument Handbook、1999、Biacore
AB)。
【０１８４】 試料をチップに流した場合、ポリペプチドはコートした抗体に結合し、その質
量の増加を測定することができる。既知濃度のポリペプチドの標本を用いること
により、標準曲線を得ることができ、次いで試料中のポリペプチド濃度を決定す
ることができる。それぞれの試料を注入した後、そのセンサーチップを、適当な
溶出剤（例えば、低いｐＨ緩衝液）により結合検体を除去することで再利用でき
る。
【０１８５】 典型的に、適用する抗体は、野生型ポリペプチドに対して産生されたモノクロ
ーナル抗体であろう。変異の導入または野生型ポリペプチドの他の操作（特別な
グリコシル化またはポリマー連結）により、該抗体による認識を改変することが
できる。さらに、ポリペプチドの分子量を増加させるような操作は、プラスモン
共鳴シグナルを増加させる結果となろう。このため、試験するそれぞれの分子に
ついての標準曲線の確立が必要である。
【０１８６】 結合体および非結合体hG−CSFおよびその変異体のインビトロおよびインビボ活
性の測定に用いる方法 プライマリーアッセイ１−インビトロG−CSF活性のアッセイ マウスセルラインNFS−60（Dr. J. Ihle、St. Jude Children's Research Hos
pital、Tennessee、USA より入手）の増殖は、生育培地中の活性なG−SCFの存在
に依存する。これゆえ、hG−CSFおよびその変異体のインビトロの生物学的活性
は、G−CSFサンプルを生育培地に添加し、一定時間インキュベートした後の分裂
NFS−60細胞の数を測定することによって決定できる。
【０１８７】 NFS−60細胞は、10% w/w FBS (胎児ウシ血清)、1% w/w Pen/Strep、10 μg/L
hG−CSFおよび2 mM Glutamaxを含有するIscoves DME培地に維持する。 サンプル
添加前に、hG−CSFを含まない生育培地で細胞を２回洗浄し、 濃度2.2 x 105細
胞／ｍＬに希釈する。細胞懸濁液100 μlを９６ウェルマイクロタイタープレー
ト(Corning)の各ウェルに加える。
【０１８８】 結合体または非結合体G−CSFまたはその変異体を含有するサンプルを生育培地
中濃度1.1x10−6 M〜1.1x10−13 Mに希釈する。各サンプル10 μlをNFS−60を含
有する３ウェルに加える。哺乳類生育培地10 μlから構成されるコントロールを
各マイクロタイタープレートの８ウェルに加える。この細胞を４８時間インキュ
ベー(37oC、5% CO2)トし、WST−1細胞増殖剤(Roche Diagnostics GmbH、Mannhei
m、Germany)を用い、各ウェル中の分裂細胞の数を定量する。ウェルに0.01 ml W
ST−1を加えた後、１５０分間、３７℃、５％CO2空気雰囲気中でインキュベート
する。生存細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩WS
T−1の分解は、ホルマザン（formazan）の形成生じさせ、これは450 nmでの吸光
度を測定することによって定量する。これにより、各ウェル中の生存細胞数を定
量する。
【０１８９】 これらの測定に基づいて、各結合体および非結合体G−CSF分子またはその変異
体の用量依存曲線を計算し、その後、各分子に関するEC50値が決定できる。この
値は、非結合体ヒトG−CSFの最大増殖活性の５０％を得るために必要とされる活
性なG−CSFタンパク質と等しい。したがって、EC50値はそのタンパク質のインビ
トロ活性の直接測定値である。
【０１９０】 プライマリーアッセイ２−インビトロG−CSF活性アッセイ ヒトG−CSFレポーターおよび、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の前に転写調
節因子fosのプロモーターを含むプラスミドを用いてマウス造血性セルラインBaF
3をトランスフェクトする。このようなセルラインをG−CSFサンプルで刺激する
と、多数の細胞内反応によりfos発現の刺激が導かれ、その結果、ルシフェラー
ゼが発現される。この刺激はSteady−Glo（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ
系(Promega、Cat. No. E2510)によってモニターし、これにより、G−CSFサンプ
ルのインビトロ活性を定量することができる。
【０１９１】 BaF3/hGCSF−R/pfos−lux細胞を、湿度調節された5% CO2雰囲気中の完全培地(
RPMI−1640/HEPES (Gibco/BRL、Cat. No. 22400)、10% FBS (HyClone、特徴化)
、1x ペニシリン/ストレプトマイシン (Gibco/BRL、Cat. No. 15140−122)、1x
L−グルタミン (Gibco/BRL、Cat. No. 25030−081)、10% WEHI−3条件化培地(mu
IL−3のソース)中37℃で維持し、密度5 x 105細胞/mL (集密)まで培養する。細
胞を約2 x 104細胞/mLで２〜３日毎に再度まく。
【０１９２】 アッセイの１日前に、対数期の細胞を欠乏培地(DMEM/F−12 (Gibco/BRL、Cat.
No. 11039)、1% BSA (Sigma、Cat. No. A3675)、1x ペニシリン/ストレプトマ
イシン (Gibco/BRL、Cat. No. 15140−122)、1x L−グルタミン (Gibco/BRL、Ca
t. No. 25030−081)、0.1% WEHI−3条件化培地)中、2 x 105細胞/mLで再懸濁し
、２０時間欠乏させる。細胞をPBSで２回洗浄し、トリパンブルー生存性染色を
用いて生存に関して試験する。細胞をアッセイ培地(RPMI−1640 (フェノール−
レッド フリー、Gibco/BRL、Cat. No. 11835)、25 mM HEPES、1% BSA (Sigma、C
at. No. A3675)、1x ペニシリン/ストレプトマイシン (Gibco/BRL、Cat. No. 15
140−122)、1x L−グルタミン (Gibco/BRL、Cat. No. 25030−081)に4 x 106細
胞/mLで再懸濁し、50 μLを９６ウェルマイクロタイタープレート(Corning)の各
ウェルに配分する。結合体または非結合体G−CSFまたはその変異体を含むサンプ
ルをアッセイ培地中、濃度1.1x10−7 M〜1.1x10−12 Mに希釈する。各サンプル5
0 μlを、BaF3/hGCSF−R/pfos−lux細胞を含む３ウェルに加える。培地50 μlを
含む負のコントロールを各マイクロタイタープレートの８ウェルに加える。プレ
ートを穏やかに混合し、３７℃で２時間インキュベートする。Promega Steady−
Glo（登録商標）プロトコル(Promega Steady−Glo（登録商標）ルシフェラーゼ
アッセイ系、Cat. No. E2510)にしたがってルシフェラーゼ活性を測定する。ウ
ェル当たり基質100 μLを加え、次いで穏やかに混合した。TopCountルミノメー
ター(Packard)をＳＰＣ（シングルフォトン計測）モードで用いて発光を測定す
る。
【０１９３】 これらの測定に基づいて、各結合体および非結合体G−CSF分子またはその変異
体の用量応答曲線を計算し、その後、各分子のEC50値を決定できる。
【０１９４】 第二のアッセイ−G−CSFまたはその変異体のhG−CSF受容体に対する結合親和力 rhG−CSFまたはその変異体のhG−CSF受容体に対する結合を標準的結合アッセ
イを用いて研究する。この受容体は、精製された細胞外受容体ドメイン、精製さ
れた細胞原形質膜に結合した受容体、または全細胞−G−CSFレセプターを本来発
現するセルライン(例えば、 NFS−60)であるか、あるいはこの受容体をコードす
るｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞である細胞ソースであってよい。rhG
−CSFまたはその変異体の、天然G−CSFとの結合部位に関して拮抗する能力は、
ラベルされたG−CSF−アナログ、例えばビオチニル化hG−CSFまたは放射性ヨウ
素化されたhG−CSFとインキュベートすることによって分析する。このようなア
ッセイの例は Yamasaki et al. (Drugs. Exptl. Clin. Res. 24:191−196 (1998
))に記載されている。
【０１９５】 hG−CSF受容体の細胞素ドメインは場合によりFcとカップリングでき、９６ウ
ェルプレート中で固定できる。次いでrhG−CSFまたはその変異体を加え、特異的
抗hG−CSF抗体またはビオチニル化または放射性ヨウ素化hG−CSFを用いてこれら
の結合を検出する。
【０１９６】 結合体および非結合体rhG−CSFおよびその変異体のインビボ半減期の測定 本発明の重要な側面は、このポリペプチドのこのポリマー部分への結合を伴う
か、あるいは伴わないhG−CSFの構築によって得られる、延長された生物学的半
減期である。hG−CSF 血清濃縮物の迅速な分解は、結合体および非結合体hG−CS
Fおよびその変異体での処置に対する生物学的応答を評価することを重要にする
。好ましくは、本発明の結合体および非結合体hG−CSFおよびその変異体はまた
、静脈内投与後の延長された血清半減期を有し、例えば、ELISA法またはプライ
マリースクリーニングアッセイによって測定することを可能にする。インビボ生
物学的半減期の測定は以下に記載のように行った。
【０１９７】 雄性Sprague Dawleyラット(7週齢)を用いた。処置の日、動物の体重を測定し
た(動物当たり280〜310ｇ)。100 μg/体重kgの非結合体および結合体hG−CSFサ
ンプルをそれぞれ３ラットの尾部静脈に静脈内注射した。注射の１分、３０分、
1、2、4、6、および24時間後、CO2−麻酔下、各ラットの眼から血液500 μlを採
取した。血液サンプルを室温で１時間半保存し、次いで遠心分離(4℃、18000xg
、5分)によって血清を単離した。この血清サンプルを-80℃で分析の日まで保存
した。サンプルを氷上で解凍した後、血清サンプル中の活性G−CSF量をG−CSFイ
ンビトロ活性アッセイ（プライマリーアッセイ１および２参照）によって定量し
た。
【０１９８】 G−CSFまたはその変異体のインビボ半減期を測定するアッセイの別の例は、US
5,824,778に記載されており、この開示内容は引用により本明細書中に包含され
る。
【０１９９】 結合体および非結合体hG−CSFおよびその変異体のインビボ生物学的活性の測定 SPF Sprague Dawley(M ＆ B A/S、Denmarkから購入)におけるhG−CSFのインビ
ボ生物学的作用の測定を用いて、結合体および非結合体G−CSFおよびその変異体
の生物学的作用を評価する。
【０２００】 到着の日、ラットを無作為に６群に分ける。動物を７日間順応させ、ここに貧
困な状態または極端な体重の個体を却下する。順応の開始時点での体重範囲は25
0〜270gである。
【０２０１】 処置の日、ラットを１６時間絶食させ、次いで100 μg/体重kgのhG−CSFまた
はその変異体を皮下注射する。各hG−CSFサンプルを無作為の６ラットの一群に
注射する。投与前、投与6、12、24、36、48、72、96、120および144時間後に、E
DTA安定化血液300 μlの血液サンプルをラットの尾部静脈から採取する。血液サ
ンプルを以下の血液学的パラメータに関して分析する：ヘモグロビン、赤血球数
、ヘマトクリット、平均細胞容量、平均ヘモグロビン濃度、平均細胞ヘモグロビ
ン、白血球数、示差白血球数(differential leucocyte count)(好中球、リンパ
球、好酸球、好塩基球、単球)。これらの測定に基づいて、結合体および非結合
体hG−CSFおよびその変異体の生物学的作用を評価する。
【０２０２】 hG−CSFまたはその変異体のインビボ生物学的活性測定に関するアッセイのさ
らなる例は、US 5,681,720、US 5,795,968、US 5,824,778、US 5,985,265および
Bowen et al., Experimental Hematology 27:425−432 (1999)に記載されている
。
【０２０３】 ポリペプチド受容体の測定−結合アッセイ（オンおよびオフ速度） 受容体およびリガンド間の結合強度は酵素−連結免疫吸着アッセイ(ELISA)、
放射性免疫アッセイ(RIA)、または当分野に周知の他のこのような免疫検出技術
を用いて測定できる。リガンド−受容体結合相互作用はまた、プラズモン共鳴検
出(Zhou et al.、Biochemistry、1993、32、8193−98; Faegerstram and O'Shan
nessy、1993、In Handbook of Affinity Chromatography、229−52、Marcel Dek
ker、Inc.、NY)を利用するBiacore(登録商標)装置を用いて測定できる。
【０２０４】 Biacore（登録商標）テクノロジーは、受容体を金表面に結合させ、それに対
してリガンドをフローさせることを可能にする。プラズモン共鳴検出により、実
時間でその表面に結合した量を直接定量する。このテクノロジーはオンレートお
よびオフレート定数の両者を生じ、したがってリガンド−受容体解離定数および
アフィニティー定数を直接測定できる。
【０２０５】 hG−CSF結合体のインビトロ免疫原性試験 本発明の結合体の減少した免疫原性は、ELISA法の使用により、参照分子また
は調製物と比較した結合体の免疫反応性を測定することにより決定できる。参照
分子または調製物は通常、組換えヒトG−CSF調製物、例えばNeupogen（登録商標
）または他の組換えヒトG−CSF調製物、例えば、US 5,824,784に記載のN−末端P
EG化rhG−CSF分子である。ELISA法は、これらの組換えG−CSF調製物の１つで処
置された患者の抗体をベースとする。免疫原性は、本発明のコンジュゲートがア
ッセイにおいて、参照分子より統計学的に有意に低い応答を有する場合に減少さ
れたと考える。
【０２０６】 G−CSFバイオアッセイにおける活性の中和 抗G−CSF血清によるhG−CSF結合体の中和は、上記G−CSFバイオアッセイを用
いて分析する。 G−CSF参照分子で処置された患者由来の血清または免疫化された動物由来の血
清を用いる。固定濃度(希釈1:20−1:500 (pt血清) または 20−1000 ng/ml (動
物血清))または1:20 (pt血清) または 1000 ng/ml (動物血清)で出発する５倍連
続希釈物の血清を加える。HG−CSF結合体は、トータル容量80μlのDMEM培地 + 1
0% FCS中、10 nMで出発する７倍希釈物または固定濃度(1−100 pM)で加える。血
清は１時間、３７℃でhG−CSF結合体とインキュベートする。
【０２０７】 次いでサンプル(0.01 ml)を0.1 ml DMEM培地中のNFS−60細胞を含む９６ウェ
ル組織培養プレートに移す。この培養を5% CO2空気雰囲気中３７℃で４８時間イ
ンキュベートする。0.01 ml WST−1 (WST−1細胞増殖剤、Roche Diagnostics Gm
bH、Mannheim、Germany)を培養に加え、5% CO2空気雰囲気中３７℃で１５０分間
インキュベートした。生存細胞におけるミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる
テトラゾリウム塩 WST−1 の分解はホルマザンの形成を生じ、これは450 nmでの
吸光度を測定することによって定量される。
【０２０８】 hG−CSF結合体サンプルを固定量の血清の存在下で滴定する場合、中和効果はE
C50(血清有り)/EC50(血清なし)として定量される阻害率(FI)として定義される。
G−CSF変異体タンパク質の抗体中和の減少は以下として定義される： (1 − (FI 変異体 −1)/(FI wt −1)) x 100%
【０２０９】 実施例１ hG-CSFをコードする合成遺伝子の構築およびクローニング- Stemmer et al. (1995)、Gene 164、pp. 49-53に記載されている一般的手法に
従い、以下のＤＮＡ断片を合成した： 断片１： Bam HI 消化部位、YAP3 シグナルペプチド (WO 98/32867)をコード
する配列、TA57 リーダー配列 (WO 98/32867)、KEX2 プロテーゼ認識部位をコー
ドする配列 (AAAAGA)、大腸菌での発現に対して最適化されたコドン・ユーセイ
ジを有するhG-CSFをコードする配列(配列番号2) およびXba I 消化部位から構成
される：、 断片２： Bam HI 消化部位、YAP3 シグナルペプチドをコードする配列 (WO 9
8/32867)、TA57 リーダー配列をコードする配列 (WO 98/32867)、ヒスチジンダ
グをコードする配列 (配列番号5)、KEX2 プロテアーゼ認識部位をコードする配
列 (AAAAGA)、大腸菌での発現に対して最適化されたコドン・ユーセイジを有す
るhG-CSFをコードする配列(配列番号2)、およびXba I 消化部位から構成される
： 断片3： Nde I 消化部位、OmpA シグナルペプチドをコードする配列 (配列番
号3)、大腸菌での発現に対して最適化されたコドン・ユーセイジを有するhG-CSF
をコードする配列(配列番号2)、およびBam HI 消化部位から構成される： 断片４： Bam HI 消化部位、Kozak コンセンサス配列 (Kozak、M. J Mol Biol
1987 Aug 20;196(4):947-50)、hG-CSFシグナルペプチド (配列番号7)とCHO 細胞
での発現に対して最適化されたコドン・ユーセイジを有するhG-CSF (配列番号8)
をコードする配列、およびXba I 消化部位から構成される。
【０２１０】 標準的なＤＮＡ手法によって、ＤＮＡ断片１および２をプラスミドpJSO37 (Ok
kels、Ann. New York Acad. Sci. 782:202-207, 1996)のBam HI および Xba I
消化部位に挿入した。これにより、プラスミド pG-CSFcerevisiae および pHISG
-CSFcerevisiaeを得た。 標準的なＤＮＡ手法によって、ＤＮＡ断片３をプラスミドpET12a (Invitrogen
)の Nde I および Bam HI 消化部位に挿入した。これにより、プラスミドpG-CSF
coliを得た。 標準的なＤＮＡ手法によって、ＤＮＡ断片４をプラスミドpcDNA3.1(+) (Inv
itrogen)の Bam HI および Xba I消化部位に挿入した。これにより、プラスミド
pG-CSFCHOを得た。
【０２１１】 実施例２ S. セレビシアエおよび大腸菌におけるhG-CSFの発現 文献記載の標準的手法により、サッカロマイセス・セレビシアエ YNG318 (the
American Type Culture Collection、VA、USA as ATCC 208973から入手可能)
をプラスミド pG-CSFcerevisiae または pHISG-CSFcerevisiaeのいずれかで形質
転換し、それら２つのプラスミドのいずれかを含有する形質転換体を単離し、次
いでHISタグを有するまたは有さないhG-CSFをそれぞれ細胞外発現させた。Novag
en のpET System Manual (8版) に記載されているように、大腸菌 BL21 (DE3) (
Novagen、Cat. No. 69387-3) をpG-CSFcoliで形質転換し、そのプラスミドを含
有する形質転換体を単離し、次いでその上清および細胞のペリプラズムにhG-CSF
に発現させた。 S. セレビシアエおよび大腸菌からのhG-CSF発現の確認は、ImmunoPure Ultra-
Sensitive ABC Rabbit IgG Staining kit (Pierce) および hG-CSFに対するポリ
クローナル抗体 (Pepro Tech EC Ltd.)を用いたウエスターンブロット分析によ
って行った。これにより、そのタンパク質は正確なサイズを有することが観察さ
れた。 S. セレビシアエおよび大腸菌におけるN末端ヒスチジンタグを有するまたは有
さないhG-CSFの発現レベルは、市販のG-CSF 特異的 ELISA キット (Quantikine
Human G-CSF Immunoassay、R&D Systems Cat. No. DCS50)を用いて定量化した。
測定値を以下に列挙する。
【０２１２】
【表６】
【０２１３】 実施例３ S. セレビシアエ培養上清からのhG-CSFおよびその変異体の精製 hG-CSFの精製は次のようにして行った。 遠心により細胞を除去する。次いで、細胞を除去した上清を0.22μmフィルタ
ーにより滅菌濾過する。フィルター滅菌した上清を10mM酢酸ナトリウムpH 4.5に
より5倍に希釈する。希釈上清5リットル当たり濃酢酸10mlを加えてpHを調節する
。カチオン交換カラムに適当する前に、イオン強度を8mS/cm以下とすべきである
。 カラムからの溶出液が安定なUVを与え伝導率基準に達するまで50mM酢酸ナトリ
ウムpH 4.5によって平衡化したSPセファロースFF(Pharmacia)カラムに、一次流
速90cm/hにより希釈上清を流した。未結合物質を除去するため、カラムを平衡化
緩衝液を用いて洗浄し、カラムからの溶出液のUV吸収および伝導率が安定なレベ
ルに達せしめた。結合した G-CSF タンパク質を、一次勾配溶液（30 カラム容量
; 0-80% 緩衝液 B (50mM NaAc、pH 4.5、750mM NaCl)；流速 45cm/h）によって
溶出させた。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づき、G-CSF を含有する
画分をプールした。塩化ナトリウムを加え、溶液のイオン強度を80mS/cm以上と
した。
【０２１４】 タンパク質溶液を、50mM NaAc、pH 4.5、750mM NaClで平衡化したPhenyl Toyo
Pearl 650S カラムに適用した。平衡化緩衝液を用いて、未結合物質をカラムか
ら洗い流した。G-CSF の溶出は、MilliQ 水の段階勾配溶液を適用して行った。G
-CSF を含有する画分をプールした。この２段階下流加工ストラテジーを用い、9
0% 以上の純度のG-CSFを得ることができる。次いで、精製したタンパク質を、28
0nmにおける分光測定および／またはアミノ酸分析によって定量する。 G-CSFを含む画分をプールする。VivaSpin 濃縮装置 (mwco: 5kDa)により、緩
衝液交換および濃縮を行う。
【０２１５】 実施例４ 非結合および結合hG-CSFおよびその変異体の同定と定量SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製し濃縮した G-CSF をSDS-PAGEによって分析した。約17kDaの見かけの分子
量を有する単一バンドが主なバンドであった。吸光度 G-CSF濃度の算定は分光光学的手法によリ行う。280nmでの吸光度を測定し、理
論的吸光計数０.83を用い、タンパク質濃度を計算することができる。アミノ酸分析 より正確なタンパク質測定はアミノ酸分析によって行うことができる。精製G-
CSFに基づき行ったアミノ酸分析により、実験的に測定したアミノ酸組成が、DNA
配列に基づく理論的アミノ酸組成に一致していることが判明した。
【０２１６】 実施例５ PEG化野生型G-CSF および G-CSF変異体のMALDI-TOF 質量スペクトル分析 MALDI-TOF 質量分析を用い、PEG化野生型G-CSFおよび選択したPEG化 G-CSF変
異体に結合しているPEG基の数を算定した。 野生型G-CSFは、SPA-PEGに対する結合部位と期待される１級アミンを５つ含有
している（N末端アミノ基、およびK16、K23、K34 および K40のεアミノ基）。S
PA-PEG 5000によりG-CSFをPEG化し、MALDI-TOF質量分析すると、主として４、５
および６個のPEG基が結合している野生型G-CSFの種の存在が示された。さらに、
７個のPEG基が結合している野生型G-CSFが少量ながらも明らかに認められた。 置換：K16R、K34R、K40R、Q70K、Q90KおよびQ120Kを有するG-CSF変異体も５つ
の１級アミンを有している（N末端アミノ基、およびK23、K70、K90 および K120
のεアミノ基）。SPA-PEG 5000によりこのG-CSF変異体をPEG化し、MALDI-TOF質
量分析すると、主として４、５および６個のPEG基が結合しているG-CSF変異体の
種の存在が示された。さらに、７個のPEG基が結合しているG-CSF変異体が少量な
がらも明らかに認められた。
【０２１７】 置換：K16R、K34RおよびK40Rを有するG-CSF変異体は２つの１級アミンを有し
ている（N末端アミノ基、およびK23のεアミノ基）。SPA-PEG 12000によりこのG
-CSF変異体をPEG化し、MALDI-TOF質量分析すると、主として２および３個のPEG
基が結合しているG-CSF変異体の種の存在が示された。さらに、４個のPEG基が結
合しているG-CSF変異体が少量ながらも明らかに認められた。 これらの観察事項は明らかに、アミノ酸残基が含有するアミン基に加えて、別
のアミノ酸残基が、使用したPEG化条件下においてPEG化されることがあることを
示している。さらに、これは、アミン基が導入されるPEG化にとって幾分重要で
あることを示している。このことは、野生型G-CSF およびG-CSF変異体をSDS-PAG
E分析した場合でも観察された。 実施例１１において説明しているように、SPA-PEG化学を使用すると、ヒスチ
ジン170が完全にPEG化されることが示された。さらに、K23およびS159は部分的
にPEG化される。このことは、hG-CSFや作製した変異体における１級アミンの他
に、１−２個の過剰なPEG化部位が存在することを示している。
【０２１８】 実施例６ PEG化および非PEG化G-CSF変異体のペプチドマッピング G-CSFおよびG-CSF変異体に対するSPA-PEGの付加的な結合部位をマッピングす
るため、以下のストラテジーを使用した。 期待されるPEG化部位の数を最小限に抑えるため、少数のアミン基を有するG-C
SF変異体を選択した。選択したG-CSF変異体は、K16R、K34R、K40R および H170Q
の置換を有している。従前のデータでは大きな程度ではPEG化されないと示され
たK23のεアミノ基とは別に、この変異体はN末端に唯一の１級アミンを有してい
る。従って、このG-CSF変異体では、アミン基に対するPEG化のバックグランドは
実質的に減じられている。G-CSF変異体はSPA-PEG5000を用いてPEG化した。PEG化
の後、G-CSF変異体を変性し、ジスルフィド結合を還元し、得られたチオール基
をアルキル化し、そのアルキル化しPEG化したタンパク質をグルタミン酸特異的
プロテアーゼによって分解した。最後に、得られたペプチドを逆相HPLCによって
分離した。
【０２１９】 これと並行し、K16R、K34RおよびK40Rの置換を有する非PEG化G-CSF変異体を同
じく処理し、参照HPLCクロマトグラフィーを作成した。 この際、PEG化G-CSF変異体および非PEG化G-CSF変異体の分解をHPLCクロマトグ
ラフィーで比較し、どのペプチドがPEG化によって消失するのかが明らかとなる
。これら両ペプチドを、N末端アミノ酸配列決定に基づいてペプチドを非PEG化G-
CSF変異体から同定すると、PEG化される位置が間接的に示される。 原理的には、K16R、K34R、K40R および H170Qの置換すべてを有するG-CSF変異
体の非PEG化体を使用するのが好ましいが、実際に的にはすべての場合において
これが重要であるとは限らない。
【０２２０】 より詳細には、K16R、K34R、K40R および H170Qの置換を有するPEG化G-CSF変
異体約１ｍｇとK16R、K34Rおよび K40Rの置換を有する非PEG化G-CSF変異体約500
μg をSpeedVac濃縮装置により乾燥した。これら２つの試料をそれぞれ400 μl
6 M グアニジウム、0.3 M Tris-HCl、pH 8.3に溶解し、37 ℃において一晩変性
した。変性後、6 M グアニジウム、0.3 M Tris-HCl、pH 8.3中0.1 M DTT50 μl
を添加してタンパク質のジスルフィド結合を還元した。環境温度にて2時間イン
キュベートした後、6 M グアニジウム、0.3 M Tris-HCl、pH 8.3中、0.6 M ヨー
ドアセトアミド50 μlを添加して、出現したチオール基をアルキル化した。アル
キル化は環境温度にて30分間起こり、次いで還元されアルキル化されたタンパク
質の緩衝液を、NAP5カラムを用いて50 mM NH4HCO3に変換した。SpeedVac濃縮装
置により試料の容量を約200 μlに減少させ、次いでグルタミン酸特異的プロテ
アーゼをそれぞれ20 μg および 10 μg加えた。グルタミン酸特異的プロテアー
ゼによる分解は、37 ℃にて16時間行った。0.1% 水性 TFA中、アセトニトリルの
一次勾配溶液で溶出するPhenomenex Jupiter C18 カラム (0.2 ＊ 5 cm)の逆相H
PLCによって、得られたペプチドを分離した。MALDI-TOF質量分析によって、捕集
した画分を分析し、次いで選択されたペプチドをN末端アミノ酸配列分析にかけ
た。
【０２２１】 PEG化G-CSF変異体と非PEG化G-CSF変異体のHPLCクロマトグラフィーを比較する
ことにより、PEG化により僅かに２つの画分が消失していることが判明した。非P
EG化G-CSF変異体から得られた２つの画分のN末端アミノ酸配列分析は、これらの
ペプチドが共にG-CSFのN末端から誘導されていることを示した。一方のペプチド
はGln11以後の予期しない開裂によって生じるアミノ酸残基1-11から構成されて
いた。他方のペプチドは、Glu19以後の予期しない開裂によって生じるアミノ酸
残基1-19から構成されていた。 G-CSFのN末端アミノ基は容易にPEG化されるので、N末端ペプチドがこのアプロ
ーチによって同定されると期待された。しかし、SPA-PEG 5000の付加的な結合部
位はこのアプローチでは何ら同定されなかった。
【０２２２】 PEG 5000結合部位を間接的に同定するための別の方法は、PEG化ペプチドにお
ける結合部位の直接的同定である。しかし、分解されたPEG化G-CSF変異体のHPLC
分離においてPEG化ペプチドを含有する画分は相互に、かつ非PEG化ペプチドを含
有する幾つかの画分から分離するのが容易でない。従って、これらの画分のN末
端アミノ酸配列分析は、K23が部分的にPEG化し得るという示唆以外、なんら有用
なデータを与えなかった。 これらの問題を克服するため、最初のHPLC分離から得られた画分からPEG化ペ
プチドの２つのプールを作成した。これら２つのプールをSpeedVac濃縮装置にお
いて乾燥し、調製したばかりの50 mM NH4HCO3 200μlに溶解し、キモトリプシン
１μg によってさらに分解した。得られたペプチドを、0.1% 水性 TFA中、アセ
トニトリルの一次勾配溶液で溶出するPhenomenex Jupiter C18 カラム (0.2 ＊
5 cm)の逆相HPLCによって分離した。採取した画分をMALDI-TOF質量分析によって
分析し、次いで選択されたペプチドをN末端アミノ酸配列分析にかけた。 N末端アミノ酸配列決定により、K23 および S159が部分的にPEG化されている
ことが判定できた。これら２つの部位におけるPEG化の正確な程度は測定するこ
とができなかったが、K23 および S159が修飾されていないペプチドが最初のHPL
C分離により同定され、配列決定されていたので、そのPEG化は部分的に過ぎない
。
【０２２３】 実施例７ 野生型G-CSFおよびG-CSF変異体のグリコシル化 精製した野生型G-CSFおよびG-CSF変異体のMALDI-TOF質量分析による分析の際
に一貫して観察されたことは、分析したG-CSF分子の質量よりも約324Da大きな質
量を有する付加的な成分の存在である。最も低い質量を有するこの成分はG-CSF
分子の質量を一様に有しており、またG-CSF分子は正確なN末端アミノ酸配列を有
しているので、この付加的な成分は、２つのヘキソース残基を有する修飾G-CSF
分子であると結論された。多くの場合、非修飾G-CSF分子が最も強力なシグナル
を発生させるが、修飾G-CSF分子のシグナルの強度が最も強力である場合もある
。 付加的なPEG化部位を同定するために作成したペプチドを分析し、グリコシル
化部位を同定する対象である２つのペプチドがそれぞれの分解において同定され
た。
【０２２４】 HPLC分離の両者ともに、それぞれの次に溶出される２つのペプチドおよびMALD
I-TOF質量分析は、２つのペプチド間の質量の相違が約324 Daであることを示し
ている。質量分析データは、ペプチドがアミノ酸残基124-162を網羅しているこ
とを示している。これら４つすべてのペプチドのN末端アミノ酸配列分析は、上
記同定が正しく、またThr133が修飾の唯一の部位であることを示していた。修飾
されていないペプチドの質量を有するペプチドでは、Thr133 が明らかに配列中
に認められ、324Daの付加的な質量を有するペプチドには133位にいずれのアミノ
酸残基も同定できない。この配列には他のすべてのアミノ酸残基が同定できたの
で、Thr133は修飾の唯一の部位であると結論された。このグリコシル化部位は、
CHO細胞において発現された組換えG-CSFにおいて使用されていると既に報告され
ているが、そのグリカンは酵母において結合されるものと異なっている。 0.1% TFA中、51％アセトニトリルによって定組成的に溶出するVydac C18 カラ
ム (0.21 ＊ 5 cm)を用いる逆相HPLCにより、非グリコシル化野生型G-CSFは、野
生型G-CSFの非グリコシル化型しか含有していない画分としてMALDI-TOF質量分析
によって示され、グリコシル化野生型G-CSFと分離されている。
【０２２５】 実施例８ 異なる数のPEG分子が共有結合されているG-CSF分子の分離 4、5 または 6 PEG基が共有結合しているG-CSF分子は次のようにして分離した
。20mM クエン酸ナトリウム、pH 2.5中のPEG化タンパク質を、20mM クエン酸ナ
トリウム pH 2.5で平衡化したSP-セファロース FF カラムに適用した。非結合物
質をカラムから洗い流した。溶出は、pH勾配溶液を用いて行った。PEG化G-CSFは
、約pH 3.8においてカラムから溶出し始め、pH 3.8 から 4.5の範囲にわたる画
分にまで溶出が続く。
【０２２６】 画分をSDS-PAGEおよび質量スペクトル分析にかけた。これらの分析は、最も高
くPEG化されているG-CSFが「低pH画分」に位置されることを示している。PEG化
の程度が低いPEG化G-CSFは「高pH画分」中に溶出される。 PEG化G-CSFに行ったアミノ酸分析では、吸光計数の理論値および実験値間に良
好な一致が認められた。
【０２２７】 実施例９ hG-CSF変異体の構築 hG-CSFに存在するアミノ酸を他のアミノ酸残基に特異的に置換、例えば上記の
一般的説明において論じた特定の置換を、当業者に既知の標準的DNA手法により
導入した。HISタグを有さない、hG-CSFをコードする遺伝子を含有するプラスミ
ド pG-CSFcerevisiaeを、PCR反応のDNA鋳型として用いて、新規なG-CSF変異体を
作成した。この変異体をS. セレビシアエから発現させ、実施例３に記載のよう
にして精製した。構築したG-CSF変異体の幾つかを以下の表に列記する（実施例
９および１０を参照）。
【０２２８】 実施例１０ hG-CSFまたはその変異体へのSPA-PEGの共有結合 ヒトG-CSFおよびその変異体を上述（「hG-CSFおよびその変異体の溶液におけ
るPEG化」）のようにして、SPA-PEG 5000、SPA-PEG 12000 および SPA-PEG 2000
0 (Shearwater)に共有結合した。これら結合体のインビトロ活性を実施例１２に
列挙する。
【０２２９】 実施例１１ 部位特異的突然変異およびその後の精製変異体のPEG化による、G-CSFにおけるSP
A-PEG結合部位の同定 SPA-PEGは、G-CSFのリジン以外のアミノ酸残基に結合させることができる。SP
A-PEGがヒスチジン、セリン、スレオニンおよびアルギニンに結合しているか否
かを調べるため、これらのアミノ酸をリジン、アラニンまたはグルタミンと置換
した変異体を作成した。変異体はS. セレビシアエにて発現させ、精製し、PEG化
し、次いで結合したSPA-PEG分子の数をSDS-PAGEにて分析した。特定のアミノ酸
をグルタミンまたはアラニンと置換した後における結合SPA-PEG分子の数の減少
は、そのアミノ酸がSPA-PEGによってPEG化されていることを強く示しており、こ
の観察事項は、アミノ酸をリジンに置換した後における変動しないPEG化の程度
によってさらに支持される。分析した変異体を以下に列挙する。
【０２３０】
【表７】
【表８】
【０２３１】 上記データは、SPA-PEG が、N末端、K16、K34 および K40に加えて、H170にも
共有結合することを示している。さらに、このデータは、利用可能なK23アミノ
酸残基は10％しかPEG化されず、S159はおよそ10％PEG化されることを示している
。
【０２３２】 実施例１２ 非結合および結合hG-CSFおよびその変異体におけるインビトロ生物活性 非結合および結合hG-CSFおよびその変異体におけるインビトロ生物活性は、「
一次検定２−インビトロhG-CSF活性検定」において上述のようにして測定した。
SPA-PEG 5000が利用可能なPEG化部位に結合している、および結合していない各
変異体におけるEC50の測定値を以下に列挙する。以下の測定値は、非結合hG-CSF
（Neupogen TM）のEC50値に対して正規化している。この値は変異体用いて、各
時点同一の検定条件にて同時に測定した。記載している検定におけるhG-CSF のE
C50は30 pMである。
【０２３３】
【表９】
【０２３４】
【表１０】
【０２３５】
【表１１】
【０２３６】 上記データは、K23のアルギニンへの置換が結合タンパク質の活性を増大させ
ないことを示している。これは、K23が10％しかPEG化されておらず、それにより
結合K23R変異体はhG-CSFと比較して、実質的に同じ数の結合PEG基を有し、かつ
同じPEG化部位の位置を有している事実に由来する。K16、K34 および K40位の残
存リジンを除去すると、PEG化後に有意な活性を有するG-CSF変異体となる。この
変異体にSPA-PEG 5000を結合させても、非結合変異体と比較して活性が有意に減
少しない。従って、N末端およびH170をSPA-PEG 5000でPEG化しても、hG-CSFの活
性は減少しない。hG-CSF K16R K34R K40Rを、新たなPEG化部位挿入のための骨格
に使用することに決定した。E45 および H159残基間の 21個の新たなPEG化部位
をこの骨格に導入した。これらの残基は、G-CSF受容体と相互作用しない、hG-CS
Fにおける部分にわたって分布している。Q70、Q90、T105、Q120、T133 および S
142位に新たなPEG化部位を導入すると、SPA-PEG 5000によるPEG化後に有意な量
の活性を保持しているhG-CSFとなった。従って、これら新たなPEG化部位を、２
つまたは３つの新たなPEG化部位を有するhG-CSF変異体と組合わせた。SPA-PEG 5
000によるPEG化後において最も活性な変異体は、hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q
120K、およびhG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120Kであった。 さらに、SPA-PEG 5000、SPA-PEG 12000 および SPA-PEG 20000 をhG-CSF K16R
K34R K40Rに結合させた。そのインビトロEC50値はそれぞれ、非結合hG-CSF（Ne
upogenTM）の35%、10% および 1%であった。
【０２３７】 実施例１３ 非結合および結合hG-CSFおよびその変異体のインビボ半減期 非結合hG-CSF（NeupogenTM）およびSPA-PEG 5000 結合化hG-CSF K16R K34R K4
0R Q70K Q90K Q120Kのインビボ半減期を上述のようにして測定した（「結合およ
び非結合rhG-CSFおよびその変異体のインビボ半減期の測定）。得られた結果は
図１に示している。NeupogenTM、およびSPA-PEG 5000 結合化hG-CSF K16R K34R
K40R Q70K Q90K Q120Kのインビボ半減期は、それぞれ2.01 時間および 12.15 時
間と測定された。このように、新たなPEG化部位をhG-CSFに導入し、それにSPA-P
EG 5000を結合すると、インビボ半減期が有意に増大した。初期の実験では、Neu
pogenTMのインビボ半減期は、より大きなN末端結合PEG分子（10kDa）を有するhG
-CSFに匹敵していた。ここでは、そのインビボ半減期はそれぞれ、1.75 時間お
よび7.01時間であった。従って、SPA-PEG 5000 結合化 hG-CSF K16R K34R K40R
Q70K Q90K Q120Kは、NeupogenTMおよび末端結合PEG分子（10kDa）を有するhG-CS
Fの両者よりも有意に長い半減期を有している。
【０２３８】 実施例１４ 非結合および結合hG-CSFおよびその変異体のインビボ生物活性 非結合hG-CSF（NeupogenTM）、ならびにSPA-PEG 5000 結合化 hG-CSF K16R K3
4R K40R Q70K Q120K および SPA-PEG 5000 結合化 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K
Q90K Q120Kのインビボ生物活性を上述のようにして測定した（「結合および非
結合hG-CSFおよびその変異体のインビボ生物活性の測定）。得られた結果は図２
に示している。NeupogenTMは、100 μg/kg体重の注射（t=0時）の後48時間にお
いて、活性を検出することができなかった。SPA-PEG 5000 結合化 hG-CSF K16R
K34R K40R Q70K Q120Kの活性は、最初の注射後72時間まで検出することができ、
SPA-PEG 5000 結合化 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120Kは最初の注射後9
6時間までその活性を保持した。このように、両結合変異体は、NeupogenTMより
もインビボ生物活性が長期であり、またSPA-PEG 5000 結合化 hG-CSF K16R K34R
K40R Q70K Q90K Q120KはNeupogenTMよりも2倍インビボにおいて活性を保持して
いることが示された。
【０２３９】 さらに、NeupogenTM、SPA-PEG 12000 結合化 hG-CSF K16R K34R K40R、および
種々の用量のSPA-PEG 5000 結合化 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120Kに
おけるインビボ生物活性を測定した。得られた結果を図３に示す。初期に観察さ
れていたように、NeupogenTMは、100 μg/kg体重の初期注射後48時間では活性を
検出することができなかった。SPA-PEG 5000 結合化 hG-CSF K16R K34R K40R Q7
0K Q90K Q120Kを5 μg/kg体重で投与すると、NeupogenTMよりも若干インビボ生
物活性は長期化し、この化合物を25 μg/kg体重で、および100 μg/kg体重で投
与すると、それぞれ、初期注射後72時間および96時間までhG-CSF活性が認められ
た。SPA-PEG 12000 結合化 hG-CSF K16R K34R K40Rは100 μg/kg体重での投与後
72時間までインビボにおいて活性を保持した。実施例５にて説明しているように
、SPA-PEG 12000 結合化hG-CSF K16R K34R K40Rは２または３つのSPA-PEG 12000
基が結合しており、SPA-PEG 5000 結合化 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q1
20K は５または６つのSPA-PEG 5000基が結合している。従って、これら２つの化
合物の分子量はそれぞれ、42-54 kDa および 43-48 kDaである。SPA-PEG 5000
結合化 hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K が実質的に同じ分子量を有し
ている SPA-PEG 12000 結合化 hG-CSF K16R K34R K40R と比較して長期のインビ
ボ生物活性を保持していることは、PEG分子の結合分布がインビボ生物活性の持
続期間にとって重要であることを示している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 インビボにおける、rhG-CSF (ネウポジン(Neupogen)(登録商標))
およびＳＰＡ−ＰＥＧ５０００−連結hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K
の半減期。
【図２】 インビボにおける、rhG-CSF (Neupogen(登録商標))、ＳＰＡ−Ｐ
ＥＧ５０００−連結hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120KおよびＳＰＡ−ＰＥＧ５
０００−連結hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120Kの生物活性。
【図３】 ビンビボにおける、rhG-CSF (Neupogen(登録商標))、ＳＰＡ−Ｐ
ＥＧ１２０００−連結hG-CSF K16R K34R K40Rおよび種々の用量のＳＰＡ−ＰＥ
Ｇ５０００−連結hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120Kの生物活性。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/535 ＺＮＡ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ＰＡ ２０００ ００９４３ (32)優先日 平成12年６月16日(2000．6．16) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 トーベン・ラウスゴー・ニッセン デンマーク、デーコー−2970ヘルショル ム、アゲルン・アレー１番、マキシゲン・ アンパルトセルスカブ内 (72)発明者 キム・ヴィルボウ・アナセン デンマーク、デーコー−2970ヘルショル ム、アゲルン・アレー１番、マキシゲン・ アンパルトセルスカブ内 (72)発明者 クリスチャン・カーステン・ハンセン デンマーク、デーコー−2970ヘルショル ム、アゲルン・アレー１番、マキシゲン・ アンパルトセルスカブ内 (72)発明者 ヤン・メラー・ミケルセン デンマーク、デーコー−2970ヘルショル ム、アゲルン・アレー１番、マキシゲン・ アンパルトセルスカブ内 (72)発明者 ハンス・タルスゴー・シャンビー デンマーク、デーコー−2970ヘルショル ム、アゲルン・アレー１番、マキシゲン・ アンパルトセルスカブ内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA30 CA02 DA06 DA12 HA17 4B064 AG06 CA19 CC24 CE06 CE07 CE14 DA01 4B065 AA26X AA80X AA93Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 BA01 BA22 BA23 BA34 CA53 NA03 NA06 ZA51 ZB02 ZB09 ZB35 4H045 AA10 BA10 BA53 BA57 CA40 DA11 EA20 FA74

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｉ）以下の群から選ばれる少なくとも１つの置換を有する点
    において配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF活
    性を有するポリペプチド： T1K、P2K、L3K、G4K、P5K、A6K、S7K、S8K、L9K、P
    10K、Q11K、S12K、F13K、L14K、L15K、E19K、Q20K、V21K、Q25K、G26K、D27K、A
    29K、A30K、E33K、A37K、T38K、Y39K、L41K、H43K、P44K、E45K、E46K、V48K、L
    49K、L50K、H52K、S53K、L54K、I56K、P57K、P60K、L61K、S62K、S63K、P65K、S
    66K、Q67K、A68K、L69K、Q70K、L71K、A72K、G73K、S76K、Q77K、L78K、S80K、F
    83K、Q86K、G87K、Q90K、E93K、G94K、S96K、P97K、E98K、L99K、G100K、P101K
    、T102K、D104K、T105K、Q107K、L108K、D109K、A111K、D112K、F113K、T115K、
    T116K、W118K、Q119K、Q120K、M121K、E122K、E123K、L124K、M126K、A127K、P1
    28K、A129K、L130K、Q131K、P132K、T133K、Q134K、G135K、A136K、M137K、P138
    K、A139K、A141K、S142K、A143K、F144K、Q145K、S155K、H156K、Q158K、S159K
    、L161K、E162K、V163K、S164K、Y165K、V167K、L168K、H170K、L171K、A172K、
    Q173K およびP174K；および ｉｉ）該ポリペプチドのリジン残基に結合している少なくとも１つの非ポリペ
    プチド部分、 を含有するポリペプチド結合体。
  2. 【請求項２】 配列番号１のアミノ酸残基：K16、K23、K34およびK40の少な
    くとも１つが欠失しているか、または別のアミノ酸残基と置換されている、請求
    項１記載の結合体。
  3. 【請求項３】 配列番号１のアミノ酸残基：K16、K23、K34およびK40の少な
    くとも１つがRまたはQ残基と置換されている、請求項２記載の結合体。
  4. 【請求項４】 以下の群から選ばれる少なくとも１つの置換を有するポリペ
    プチドである、請求項１−３までのいずれか記載の結合体： P5K、A6K、S7K、S8K、L9K、P44K、E45K、E46K、V48K、L49K、L50K、H52K、S53K
    、L54K、I56K、P57K、P60K、L61K、S62K、S63K、P65K、S66K、Q67K、A68K、L69K
    、Q70K、L71K、A72K、G73K、S76K、Q77K、L78K、S80K、F83K、Q86K、G87K、Q90K
    、E93K、G94K、S96K、P97K、E98K、L99K、P101K、D104K、T105K、Q107K、L108K
    、D109K、A111K、D112K、F113K、T115K、T116K、W118K、Q119K、Q120K、M121K、
    E122K、E123K、L124K、M126K、A127K、P128K、A129K、L130K、Q131K、P132K、T1
    33K、Q134K、G135K、A136K、M137K、P138K、A139K、A141K、S142K、A143K、F144
    K、Q145K、S155K、H156K、Q158K、S159K、L161K、E162K、V163K、S164K、Y165K
    、V167K、L168K、H170K、L171K、A172K、Q173K、およびP174K。
  5. 【請求項５】 Q70K、Q90K、T105K、Q120KおよびT133Kからなる群から選ば
    れる少なくとも１つの置換を有するポリペプチドである、請求項４記載の結合体
    。
  6. 【請求項６】 ｉ）以下の群から選ばれる少なくとも１つの置換を有する点
    において配列番号１に示すhG-CSFのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有す
    る、G-CSF活性を有するポリペプチド：T1C、P2C、L3C、G4C、P5C、A6C、S7C、S8
    C、L9C、P10C、Q11C、S12C、F13C、L14C、L15C、E19C、Q20C、V21C、R22C、Q25C
    、G26C、D27C、A29C、A30C、E33C、A37C、T38C、Y39C、L41C、H43C、P44C、E45C
    、E46C、V48C、L49C、L50C、H52C、S53C、L54C、I56C、P57C、P60C、L61C、S62C
    、S63C、P65C、S66C、Q67C、A68C、L69C、Q70C、L71C、A72C、G73C、S76C、Q77C
    、L78C、S80C、F83C、Q86C、G87C、Q90C、E93C、G94C、S96C、P97C、E98C、L99C
    、G100C、P101C、T102C、D104C、T105C、Q107C、L108C、D109C、A111C、D112C、
    F113C、T115C、T116C、W118C、Q119C、Q120C、M121C、E122C、E123C、L124C、M1
    26C、A127C、P128C、A129C、L130C、Q131C、P132C、T133C、Q134C、G135C、A136
    C、M137C、P138C、A139C、A141C、S142C、A143C、F144C、Q145C、R146C、R147C
    、S155C、H156C、Q158C、S159C、L161C、E162C、V163C、S164C、Y165C、R166C、
    V167C、L168C、R169C、H170C、L171C、A172C、Q173CおよびP174C；および ｉｉ）該ポリペプチドのシステイン残基に結合している少なくとも１つの非ポ
    リペプチド部分、 を含有する結合体。
  7. 【請求項７】 ｉ）以下の群から選ばれる少なくとも１つの置換を有する点
    において配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF活
    性を有するポリペプチド： T1D/E、P2D/E、L3D/E、G4D/E、P5D/E、A6D/E、S7D/
    E、S8D/E、L9D/E、P10D/E、Q11D/E、S12D/E、F13D/E、L14D/E、L15D/E、K16D/E
    、Q20D/E、V21D/E、R22D/E、K23D/E、Q25D/E、G26D/E、A29D/E、A30D/E、K34D/E
    、A37D/E、T38D/E、Y39D/E、K40D/E、L41D/E、H43D/E、P44D/E、V48D/E、L49D/E
    、L50D/E、H52D/E、S53D/E、L54D/E、I56D/E、P57D/E、P60D/E、L61D/E、S62D/E
    、S63D/E、P65D/E、S66D/E、Q67D/E、A68D/E、L69D/E、Q70D/E、L71D/E、A72D/E
    、G73D/E、S76D/E、Q77D/E、L78D/E、S80D/E、F83D/E、Q86D/E、G87D/E、Q90D/E
    、G94D/E、S96D/E、P97D/E、L99D/E、G100D/E、P101D/E、T102D/E、T105D/E、Q1
    07D/E、L108D/E、A111D/E、F113D/E、T115D/E、T116D/E、W118D/E、Q119D/E、Q1
    20D/E、M121D/E、L124D/E、M126D/E、A127D/E、P128D/E、A129D/E、L130D/E、Q1
    31D/E、P132D/E、T133D/E、Q134D/E、G135D/E、A136D/E、M137D/E、P138D/E、A1
    39D/E、A141D/E、S142D/E、A143D/E、F144D/E、Q145D/E、R146D/E、R147D/E、S1
    55D/E、H156D/E、Q158D/E、S159D/E、L161D/E、V163D/E、S164D/E、Y165D/E、R1
    66D/E、V167D/E、L168D/E、R169D/E、H170D/E、L171D/E、A172D/E、Q173D/E、お
    よびP174D/E；および ｉｉ）該ポリペプチドのアスパラギン酸またはグルタミン酸残基に結合してい
    る少なくとも１つの非ポリペプチド部分、 を含有する結合体。
  8. 【請求項８】 Q67D/E、Q70D/E、Q77D/E、Q86D/E、Q90D/E、Q120D/E、Q131D
    /E、Q134D/E、Q145D/EおよびQ173D/Eからなる群から選ばれる少なくとも１つの
    置換、および／またはD27N、D104N、D109N、D112N、E19Q、E33Q、E45Q、E46Q、E
    93Q、E98Q、E122Q、E123QおよびE163Qからなる群から選ばれる少なくとも１つの
    置換を有するポリペプチドである、請求項７記載の結合体。
  9. 【請求項９】 非ポリペプチド部分が天然および合成ホモ重合体およびヘテ
    ロ重合体からなる群から選ばれる、請求項１−８までのいずれか記載の結合体。
  10. 【請求項１０】 重合体が、線状または分枝状ポリエチレングリコール、ポ
    リビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸およびポリ（ビニルピロリドン）か
    らなる群から選ばれる合成ホモ重合体およびヘテロ重合体である、請求項９記載
    の結合体。
  11. 【請求項１１】 重合体が線状または分枝状ポリエチレングリコールである
    、請求項１０記載の結合体。
  12. 【請求項１２】 ポリエチレングリコールが分子量約1000-15,000 Daである
    、請求項１１記載の結合体。
  13. 【請求項１３】 ２−８個のポリエチレングリコール部分を含む、請求項１
    １または１２記載の結合体。
  14. 【請求項１４】 該ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列とは１−１
    ５アミノ酸残基が相違している、請求項１−１３のいずれか記載の結合体。
  15. 【請求項１５】 該ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列とは２−１
    ０アミノ酸残基が相違している、請求項１４記載の結合体。
  16. 【請求項１６】 該ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１−１
    ５のいずれか記載の結合体。
  17. 【請求項１７】 該ポリペプチドが少なくとも１つの非天然グリコシル化部
    位を有する、請求項１６記載の結合体。
  18. 【請求項１８】 少なくとも１つの非天然グリコシル化部位が、以下の群か
    ら選ばれる少なくとも１つの置換によってアミノ酸配列に導入されている点にお
    いて配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有する、G-CSF活性を
    有するグリコシル化ポリペプチドを含有する結合体： L3N+P5S/T、P5N、A6N、S
    8N+P10S/T、P10N、Q11N+F13S/T、S12N+L14S/T、F13N+L15S/T、L14N+K16S/T、K16
    N+L18S/T、E19N+V21S/T、Q20N+R22S/T、V21N+K23S/T、R22N+I24S/T、K23N+Q25S/
    T、Q25N+D27S/T、G26N+G28S/T、D27N+A29S/T、A29N+L31S/T、A30N+Q32S/T、E33N
    +L35S/T、A37N+Y39S/T、T38N+K40S/T、Y39N+L41S/T、P44N+E46S/T、E45N+L47S/T
    、E46N+V48S/T、V48N+L50S/T、L49N+G51S/T、L50N+H52S/T、H52N+L54S/T、S53N+
    G55S/T、P60N、L61N、S63N+P65S/T、P65N+Q67S/T、S66N+A68S/T、Q67N+L69S/T、
    A68N+Q70S/T、L69N+ L71S/T、Q70N+A72S/T、L71N+G73S/T、G73N+L75S/T、S76N+L
    78S/T、Q77N+H79S/T、L78N、S80N+L82S/T、F83N+Y85S/T、Q86N+L88S/T、G87N+L8
    9S/T、Q90N+L92S/T、E93N+I95S/T、P97N+L99S/T、L99N+P101S/T、P101N+L103S/T
    、T102N+D104S/T、D104N+L106S/T、T105N+Q107S/T、Q107N+D109S/T、L108N+V110
    S/T、D109N+A111S/T、A111N+F113S/T、D112N+A114S/T、F113N、T115N+I117S/T、
    T116N+W118S/T、W118N+Q120S/T、Q119N+M121S/T、 Q120N+E122S/T、M121N+E123S
    /T、E122N+L124S/T、E123N+G125S/T、 L124N+M126S/T、M126N+P128S/T、P128N+L
    130S/T、L130N+P132S/T、P132N+Q134S/T、T133N+G135S/T、Q134N+A136S/T、A136
    N+P138S/T、P138N+F140S/T、A139N+A141S/T、A141N+A143S/T、S142N+F144S/T、A
    143N+Q145S/T、F144N+R146S/T、Q145N+R147S/T、R146N+A148S/T、R147N+G149S/T
    、S155N+L157S/T、H156N+Q158S/T、S159N+L161S/T、L161N+V163S/T、E162N、V16
    3N+Y165S/T、S164N+R166S/T、Y165N+V167S/T、R166N+L168S/T、V167N+R169S/T、
    L168N+H170S/T、R169N+L171S/T、およびH170N+A172S/T。
  19. 【請求項１９】 P5N、A6N、P10N、P60N、L61N、L78N、F113NおよびE162Nか
    らなる群から、またはD27N+A29S、D27N+A29T、D104N+L106S、D104N+L106T、D109
    N+A111S、D109N+A111T、D112N+A114SおよびD112N+A114Tからなる群から、選ばれ
    る少なくとも１つの置換を有する、請求項１８記載の結合体。
  20. 【請求項２０】 ２つまたはそれ以上のグリコシル化部位が導入されている
    、請求項１８または１９記載の結合体。
  21. 【請求項２１】 該ポリペプチドのアミノ酸残基に結合している、N-または
    O-炭水化物部分とは異なる少なくとも１つの非ポリペプチド部分をさらに含有し
    ている、請求項１８−２０のいずれか記載の結合体。
  22. 【請求項２２】 単一のN末端結合20 kDa PEG部分を含有する、機能的なイ
    ンビボ半減期および／または血清半減期がrhG-CSFと比較して増大している、請
    求項１−２１のいずれか記載の結合体。
  23. 【請求項２３】 以下に示す(A)-(D)の少なくとも１つの基準を満たす、請
    求項１−２２のいずれか記載の結合体： (A) ラットへの100μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
    一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
    くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに白血球形成（細胞数／Ｌ
    血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約96時間に、白血球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を
    投与前の白血球レベル以上に増大させる； (B) ラットへの25μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
    一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
    くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに白血球形成（細胞数／Ｌ
    血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約72時間に、白血球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を
    投与前の白血球レベル以上に増大させる； (C) ラットへの100μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
    一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
    くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに好中球形成（細胞数／Ｌ
    血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約96時間に、好中球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を
    投与前の好中球レベル以上に増大させる； (D) ラットへの25μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
    一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
    くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに好中球形成（細胞数／Ｌ
    血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約72時間に、好中球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を
    投与前の好中球レベル以上に増大させる。
  24. 【請求項２４】 少なくとも１つのアミノ酸残基が配列番号１のアミノ酸配
    列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有し、該ポリペプチドの結合
    基と結合している少なくとも１つの非ポリペプチド部分を有する、G-CSF活性を
    有するポリペプチド結合体であって、単一のN末端結合20 kDa PEG部分を含有す
    る、機能的なインビボ半減期および／または血清半減期がrhG-CSFと比較して増
    大している該ポリペプチド結合体。
  25. 【請求項２５】 ２つまたはそれ以上の結合非ポリペプチド部分を含有する
    、請求項２４記載のポリペプチド。
  26. 【請求項２６】 少なくとも１つのアミノ酸残基が配列番号１のアミノ酸配
    列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有し、該ポリペプチドの結合
    基と結合している少なくとも１つの非ポリペプチド部分を有する、G-CSF活性を
    有するポリペプチド結合体であって、以下に示す(A)-(D)の少なくとも１つの基
    準を満たすことを特徴とする該ポリペプチド結合体： (A) ラットへの100μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
    一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
    くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに白血球形成（細胞数／Ｌ
    血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約96時間に、白血球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を
    投与前の白血球レベル以上に増大させる； (B) ラットへの25μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
    一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
    くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに白血球形成（細胞数／Ｌ
    血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約72時間に、白血球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を
    投与前の白血球レベル以上に増大させる； (C) ラットへの100μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
    一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
    くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに好中球形成（細胞数／Ｌ
    血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約96時間に、好中球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を
    投与前の好中球レベル以上に増大させる； (D) ラットへの25μg/kg体重（該結合体のポリペプチド部分の重量基準）での
    一回皮下投与後に、 ｉ）投与後の12時間に、非結合hG-CSFを100μg/kg体重で投与する場合と少な
    くともほぼ同じ速度および少なくともほぼ同じレベルに好中球形成（細胞数／Ｌ
    血液として測定）を増大させ、および ｉｉ）少なくとも約72時間に、好中球レベル（細胞数／Ｌ血液として測定）を
    投与前の好中球レベル以上に増大させる。
  27. 【請求項２７】 請求項１−８いずれかに規定するアミノ酸配列を有する、
    G-CSF活性を有するポリペプチド。
  28. 【請求項２８】 請求項２７記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列。
  29. 【請求項２９】 請求項２８記載のヌクレオチド配列を含有する発現ベクタ
    ー。
  30. 【請求項３０】 請求項２８記載のヌクレオチド配列または請求項２９記載
    の発現ベクターを含有する宿主細胞。
  31. 【請求項３１】 請求項１−２６いずれか記載のポリペプチド結合体を調製
    するための、請求項３０記載の宿主細胞をポリペプチド発現を誘導する条件下に
    培養し、得られたポリペプチドを回収する調製方法であって、ａ）該ポリペプチ
    ドが少なくとも１つのN-またはO-グリコシル化部位を含有し、かつ宿主細胞がイ
    ンビボ グリコシル化が可能な真核生物宿主細胞であり、および／またはｂ）該
    ポリペプチドを非ポリペプチド部分とインビトロ結合させる、該調製方法。
  32. 【請求項３２】 請求項１−２６記載の結合体および製薬的に許容される担
    体または賦形剤を含有する組成物。
  33. 【請求項３３】 請求項１−２６記載のポリペプチド結合体または請求項３
    ２記載の組成物における、医薬として使用。
  34. 【請求項３４】 放射線治療または化学療法に由来する障害などの全身造血
    性障害の処置、白血球減少症、AIDSまたは他の免疫不全症の処置、および細菌ま
    たは他の感染症の処置などの、疾患の処置のための医薬の製造における、請求項
    １−２６いずれか記載の結合体または請求項２７記載のポリペプチドの使用。
  35. 【請求項３５】 放射線治療または化学療法に由来する障害などの全身造血
    性障害を有する哺乳動物を処置、白血球減少症、AIDSまたは他の免疫不全症を処
    置、および細菌または他の感染症を処置するための方法であって、請求項１−２
    ６いずれか記載の結合体または請求項３２記載の組成物の有効量をそれを必要と
    しているほどに投与する方法。
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