ES2327606T3 - Conjugados de g-csf. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que muestra actividad del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), que comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la secuencia de aminoácidos de hG-CSF que aparece en SEQ ID NO:1 en hasta 15 restos, y que comprende las sustituciones K16R, K34R, K40R y T105K con relación a SEQ ID NO:1.
Description
Conjugados de G-CSF.
La presente invención se refiere a nuevos
polipéptidos que muestran actividad de factor estimulante de
colonias de granulocitos (G-CSF), a conjugados
entre un polipéptido que muestra actividad G-CSF y
resto no polipeptídico, a procedimientos para preparar estos
polipéptidos o conjugados, y al uso de estos polipéptidos o
conjugados en terapias, en particular para el tratamiento de la
leucopenia.
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El proceso mediante el cual los glóbulos blancos
sanguíneos crecen, se dividen y se diferencian en la médula ósea se
denomina hematopoyesis (Dexter y Spoonces, Ann. Rev. Cell. Biol.,
3:423, 1987). Cada uno de los tipos de células sanguíneas surge a
partir de células precursoras pluripotenciales. Existen en general
tres clases de células sanguíneas producidas in vivo:
glóbulos rojos sanguíneos (eritrocitos), plaquetas y glóbulos
blancos sanguíneos (leucocitos), estando la mayoría de los últimos
implicados en la defensa inmunológica del hospedante. La
proliferación y la diferenciación de células precursoras
hematopoyéticas son reguladas por una familia de citoquinas,
incluyendo los factores estimulantes de colonias (CSF), como
G-CSF e interleuquinas (Arai et al., Ann.
Rev. Biochem., 59:783-836, 1990). El principal
efecto biológico del G-CSF in vivo es
estimular el crecimiento y el desarrollo de ciertos glóbulos blancos
sanguíneos conocidos como granulocitos neutrofílicos o neutrófilos
(Welte et al., PNAS-USA,
82:1526-1530, 1985; Souza et al., Science,
232:61-65, 1986). Cuando se liberan hacia la
corriente sanguínea, los granulocitos neutrofílicos actúan para
luchar contra una infección bacteriana.
La secuencia de aminoácidos del
G-CSF humano (hG-CSF) ha sido
indicada por Nagata et al., Nature
319:415-418, 1986. El hG-CSF es una
proteína monomérica que dimeriza el receptor de
G-CSF mediante la formación de un complejo 2:2 de 2
moléculas de G-CSF y 2 receptores (Horan et
al. (1996), Biochemistry,
35(15):4886-4896). Aritomi et al.,
Nature 401:713-717, 1999, han descrito la estructura
de rayos X de un complejo entre el hG-CSF y los
dominios BN-BC del receptor de
G-CSF. Identificaron los siguiente restos de
hG-CSF como parte de las interfases de unión al
receptor: G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, L15, K16, E19, Q20,
L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123, y L124. Se ha
indicado la expresión de rhG-CSF en Escherichia
coli, Saccharomyces cerevisiae y células de mamífero (Souza
et al., Science 232:61-65, 1986; Nagata et
al., Nature, 319:415-418, 1986; Robinson y
Wittrup, Biotechnol. Prog., 11:171-177, 1985).
El G-CSF humano recombinante
(rhG-CSF) en general se utiliza para tratar diversas
formas de leucopenia. Por tanto, están disponibles preparaciones
comerciales del rhG-CSF con los nombres de
filgrastim (Gran® y Neupogen®), lenograstim (Neutrogin® y
Granocyte®) y nartograstim (Neu-up®). Gran® y
Neupogen® no están glicosilados y se producen en células de E.
coli recombinantes. Neutrogin® y Granocyte® están glicosilados y
se producen en células CHO, y Neu-up® no está
glicosilado y tiene cinco aminoácidos sustituidos en la región
N-terminal del rhG-CSF intacto
producido en células de E. coli recombinantes.
Se han indicado unos pocos variantes modificados
con proteínas del hG-CSF (documentos US 5.581.476,
US 5.214.132, US 5.362.853, US 4.904.584, y
Riedhaar-Olson et al., Biochemistry, 35:
9034-9041, 1996). Se ha sugerido la modificación
del hG-CSF y otros polipéptidos para introducir al
menos otra cadena de carbohidrato, comparado con el polipéptido
nativo (documento US 5.218.092). Se ha indicado que la secuencia de
aminoácidos del polipéptido puede modificarse mediante sustitución
de aminoácidos, deleción de aminoácidos o inserción de aminoácidos,
de forma que se logra la adición de otra cadena de carbohidrato.
Además, se han indicado modificaciones poliméricas del
hG-CSF nativo, incluyendo la unión de grupos PEG
(Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and
Function, 17:157-160, 1992; documentos US
5.824.778, US 5.824.784, WO 96/11953, WO 95/21629, WO 94/20069).
Bowen et al., Experimental Hematology, 27
(1999), 425-432 describen un estudio de la relación
entre la masa molecular y la duración de la actividad de una
muteína de G-CSF conjugada con PEG. Se sugirió una
aparente correlación inversa entre el peso molecular de los restos
PEG conjugados con la proteína y la actividad in vitro, en
que las actividades in vitro aumentan según aumenta el peso
molecular. Se especula que una menor afinidad de los conjugados
actúa para aumentar la semivida, porque la endocitosis mediada por
receptores es un importante mecanismo que regula los niveles de los
factores del crecimiento hematopoyéticos.
El rhG-CSF disponible en el
mercado tiene un efecto farmacológico a corto plazo y a menudo debe
administrarse más de una vez diaria para la duración del estado
leucopénico. Una molécula con una mayor semivida en circulación
disminuiría el número de administraciones necesarias para aliviar la
leucopenia y para prevenir las infecciones consiguientes. Otro
problema con los productos de rG-CSF actualmente
disponibles es la aparición de dolor óseo dependiente de la dosis.
Puesto que los pacientes experimentan el dolor óseo como una efecto
secundario significativo del tratamiento con
rG-CSF, sería deseable proporcionar un producto de
rG-CSF que no provoque dolor óseo, mediante un
producto que no tenga inherentemente este efecto o que sea eficaz en
una dosis lo suficientemente pequeña como para no provocar dolor
óseo. Por tanto, existe una necesidad clara de mejores moléculas de
tipo G-CSF recombinante.
Con respecto a la semivida, una manera de
aumentar la semivida en la circulación de una proteína es asegurarse
de que se reduce la eliminación de la proteína, en particular
mediante eliminación renal y eliminación mediada por receptores.
Esto puede lograrse mediante la conjugación de la proteína a un
resto químico que sea capaz de aumentar el tamaño aparente,
reduciendo, con ello, la eliminación renal y aumentando la semivida
in vivo. Además, la unión de un resto químico a la proteína
puede bloquear con eficacia las enzimas proteolíticas del contacto
físico con la proteína, evitando, con ello, la degradación mediante
proteolisis no específica. El polietilenglicol (PEG) es uno de
estos restos químicos que se ha empleado para la preparación de
productos proteicos terapéuticos. Una molécula de
G-CSF modificada con un único grupo PEG unido a
través del N-terminal, denominada SD/01, en la
actualidad está sometida a ensayos clínicos. Aunque esta molécula de
G-CSF PEGilada ha demostrado una mayor semivida,
comparada con la G-CSF no PEGilada, tiene una baja
actividad y, por tanto, debe administrarse en dosis algo elevadas.
Como resultado, esta molécula no soluciona el problema del dolor
óseo mencionado anteriormente. Además, todavía hay espacio
suficiente para la mejora de moléculas de G-CSF
conocidas en términos de su semivida.
Por tanto, es necesario proporcionar nuevas
moléculas que muestren actividad G-CSF que sean
útiles para el tratamiento de la leucopenia, y que sean mejores en
términos de una mayor semivida y que tengan menos efectos
secundarios. La presente invención se refiere a estas moléculas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a un
polipéptido que muestra actividad G-CSF, que
comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la
secuencia de aminoácidos de hG-CSF que aparece en
SEQ ID NO:1 en hasta 15 restos, y que comprende las sustituciones
K16R, K34R, K40R y T105K con relación a SEQ ID NO:1.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
conjugado polipeptídico que muestra actividad G-CSF,
que comprende: i) un polipéptido que muestra actividad
G-CSF según la invención, y ii) al menos un resto no
polipeptídico unido a un resto lisina del polipéptido.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
procedimiento para producir un conjugado polipeptídico según la
invención, que comprende cultivar una célula hospedante que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido
bajo condiciones que conducen a la expresión del polipéptido, y
recuperar el polipéptido, en el que a) el polipéptido comprende al
menos un sitio de N- u O-glicosilación, y la célula
hospedante es una célula hospedante eucariota capaz de realizar la
glicosilación in vivo, y/o b) el polipéptido se somete a
conjugación con un resto no polipeptídico in vitro.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición que comprende un polipéptido o un conjugado
polipeptídico según la invención, y un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido o un conjugado polipeptídico según la invención, para
su uso como producto farmacéutico.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido o un conjugado polipeptídico según la invención, para
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos
hematopoyéticos generales.
Otras características de la invención se definen
en las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente memoria descriptiva se refiere a
conjugados específicos que comprenden un polipéptido que muestra
actividad G-CSF y un resto no polipeptídico, a
procedimientos para su preparación y a su uso en el tratamiento
médico y en la preparación de productos farmacéuticos. Por
consiguiente, en un primer aspecto, la memoria descriptiva se
refiere a diversos conjugados específicos que comprenden un
polipéptido que muestra actividad G-CSF y que tiene
una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la secuencia de
aminoácidos conocida del G-CSF humano, que aparece
en SEQ ID NO:1, en al menos un resto aminoácido alterado
especificado que comprende un grupo de unión para un resto no
polipeptídico, y que tiene al menos un resto no polipeptídico unido
al grupo de unión del polipéptido. El conjugado de la presente
memoria descriptiva tiene una o más propiedades mejoradas,
comparado con el rhG-CSF disponible en el mercado,
incluyendo una mayor semivida funcional in vivo, una mayor
semivida en suero, unos menores efectos secundarios, una menor
inmunogenicidad y/o una mayor biodisponibilidad. Por consiguiente,
el tratamiento médico con un conjugado descrito en la presente
ofrece una serie de ventajas frente a los compuestos de
G-CSF disponibles en la actualidad.
En otro aspecto, la memoria descriptiva se
refiere a polipéptidos que muestran actividad G-CSF
y que forman parte de un conjugado descrito en la presente. Los
polipéptidos descritos en la presente se contemplan como útiles
para fines terapéuticos, de diagnóstico u otros fines, pero son
particularmente interesantes como productos intermedios para la
preparación de un conjugado descrito en la presente.
\newpage
En otro aspecto, la memoria descriptiva se
refiere a un conjugado polipeptídico que comprende un polipéptido
que muestra actividad G-CSF, que comprende una
secuencia de aminoácidos que se diferencia de la secuencia de
aminoácidos de hG-CSF (con la secuencia de
aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:1) en al menos un resto
aminoácido seleccionado de un resto aminoácido introducido o
eliminado que comprende un grupo de unión para un resto no
polipeptídico, y un número suficiente o tipos de restos no
polipeptídicos para proporcionar al conjugado una mayor semivida,
comparado con productos de G-CSF recombinantes
conocidos.
En otros aspectos, la memoria descriptiva se
refiere a procedimientos para preparar un conjugado descrito en la
presente, incluyendo secuencias de nucleótidos que codifican un
polipéptido descrito en la presente, a vectores de expresión que
comprenden dichas secuencias de nucleótidos, y a células hospedantes
que comprenden dichas secuencias de nucleótidos o vectores de
expresión.
En aspectos finales, la memoria descriptiva se
refiere a una composición que comprende un conjugado o un
polipéptido descrito en la presente, a un procedimiento para
preparar una composición farmacéutica, al uso de un conjugado o una
composición descritos en la presente como producto farmacéutico, y a
un procedimiento para tratar un mamífero con dicha composición. En
particular, el polipéptido, el conjugado o la composición descritos
en la presente pueden utilizarse para prevenir la infección en
pacientes con cáncer que están sometidos a ciertos tipos de terapia
de radiación, quimioterapia, y transplantes de médula ósea, para
movilizar a células progenitoras para su recolección en sangre
periférica para transplantes de células progenitoras, para el
tratamiento de la leucopenia relativa o crónica grave,
independientemente de su causa, y para apoyar el tratamiento de
pacientes con leucopenia mieloide aguda. Además, el polipéptido, el
conjugado o la composición descritos en la presente pueden
utilizarse para el tratamiento del SIDA u otras enfermedades de
inmunodeficiencia, así como infecciones bacterianas.
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de la presente memoria
descriptiva se aplican las siguientes definiciones:
El término "conjugado" pretende indicar una
molécula heterogénea formada por una unión covalente de uno o más
polipéptidos, de forma típica un único polipéptido, a uno o más
restos no polipeptídicos, como moléculas poliméricas, compuestos
lipófilos, restos carbohidratos u agentes derivatizantes orgánicos.
La expresión unión covalente significa que el polipéptido y el
resto no polipeptídico están directamente unidos covalentemente
entre sí, o están indirectamente unidos covalentemente entre sí a
través de un resto o restos intermedios, como un puente, un
espaciador o un resto o restos conectores. Preferiblemente, el
conjugado es soluble a concentraciones y condiciones pertinentes,
es decir, es soluble en fluidos fisiológicos, como la sangre. La
expresión "polipéptido no conjugado" puede utilizarse acerca
de la parte polipeptídica del conjugado.
El término "polipéptido" puede utilizarse
de modo intercambiable en la presente con el término
"proteína".
La "molécula polimérica" es una molécula
formada por el enlace covalente de dos o más monómeros, en la que
ninguno de los monómeros es un resto aminoácido, excepto cuando el
polímero es la albúmina humana u otra proteína plasmática
abundante. El término "polímero" puede utilizarse de modo
intercambiable con la expresión "molécula polimérica". El
término pretende abarcar las moléculas de carbohidratos aunque
normalmente el término no pretende abarcar el tipo de molécula de
carbohidrato que se une al polipéptido mediante N- u
O-glicosilación in vivo (como se describirá
más a fondo a continuación), puesto que dicha molécula se denomina
en la presente un "resto oligosacárido". Excepto cuando el
número de molécula o moléculas poliméricas se indique expresamente,
todas las referencias a "un polímero", "una molécula
polimérica", "el polímero" o "la molécula polimérica"
contenidos en un polipéptido descrito en la presente, o utilizados
de otra forma en la presente memoria descriptiva, hacen referencia
a una o más moléculas poliméricas.
La expresión "grupo de unión" pretende
indicar un grupo de resto aminoácido del polipéptido que es capaz de
acoplarse con el resto no polipeptídico pertinente. Por ejemplo,
para la conjugación del polímero, en particular a PEG, un grupo de
unión que se emplea con frecuencia es el grupo
\varepsilon-amino de la lisina o el grupo amino
N-terminal. Otros grupos de unión de polímeros
incluyen un grupo ácido carboxílico libre (por ejemplo, el del
resto aminoácido C-terminal o el de un resto ácido
aspártico o ácido glutámico), grupos carbonilo activados de forma
adecuada, restos carbohidrato oxidados, y grupos mercapto. Los
grupos de unión útiles y sus restos no peptídicos correspondientes
quedan patentes en la siguiente tabla.
Para la N-glicosilación in
vivo, la expresión "grupo de unión" se emplea de una manera
no convencional para indicar los restos aminoácidos que constituyen
un sitio de N-glicosilación (con la secuencia
N-X'-S/TC-X'', en
la que X' es cualquier resto aminoácido excepto prolina, X'' es
cualquier resto aminoácido que puede o no ser idéntico a X' y que
preferiblemente es diferente de prolina, N es asparagina, y S/T/C es
serina, treonina o cisteína, preferiblemente serina o treonina, y
lo más preferiblemente treonina). Aunque el resto asparagina del
sitio de N-glicosilación es donde se une el resto
oligosacárido durante la glicosilación, esta unión no puede
lograrse a menos que los otros restos aminoácidos del sitio de
N-glicosilación estén presentes. Por consiguiente,
cuando el resto no peptídico es un resto oligosacárido y la
conjugación se consigue mediante N-glicosilación,
la expresión "resto aminoácido que comprende un grupo de unión
para el resto no peptídico", según se emplea en conexión con
alteraciones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de
interés, debe entenderse que significa que uno o más restos
aminoácidos que constituyen un sitio de
N-glicosilación deben alterarse de manera que se
introduce un sitio de N-glicosilación funcional en
la secuencia de aminoácidos o se elimina de dicha secuencia.
En la presente solicitud, los nombres de los
aminoácidos y los nombres de los átomos (por ejemplo, CA, CB, NZ,
N, O, C, etc.) se emplean según se define en la base de datos
Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org), que se basa en la
nomenclatura de la IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino
Acids and Peptides (residue names, atom names, etc.), Eur. J.
Biochem., 138, 9-37 (1984), junto con sus
correcciones en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)). La expresión
"resto aminoácido" principalmente pretende indicar un resto
aminoácido contenido en el grupo que consiste en los 20 aminoácidos
naturales, es decir, restos alanina (Ala o A), cisteína (Cys o C),
ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), fenilalanina
(Phe o F), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile
o I), lisina (Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o M),
asparagina (Asn o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o
Q),
arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptófano (Trp o W), y tirosina (Tyr o Y).
arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptófano (Trp o W), y tirosina (Tyr o Y).
La terminología utilizada para identificar
posiciones/sustituciones de aminoácidos se ilustra como sigue: F13
indica que el número de posición 13 está ocupado por un resto
fenilalanina en la secuencia de aminoácidos de referencia, F13K
indica que el resto fenilalanina de la posición 13 ha sido
sustituido por un resto lisina. A menos que se indique lo
contrario, la numeración de los restos aminoácidos en la presente se
realiza con relación a la secuencia de aminoácidos del
hG-CSF que aparece en SEQ ID NO:1. Las sustituciones
alternativas se indican con un "/", por ejemplo Q67D/E
significa una secuencia de aminoácidos en que la glutamina en la
posición 67 está sustituida por ácido aspártico o ácido glutámico.
Las sustituciones múltiples se indican con "+", por ejemplo,
S53N+G55S/T significa una secuencia de aminoácidos que comprende una
sustitución del resto serina en la posición 53 por un resto
asparagina y una sustitución del resto glicina en la posición 55
por un resto serina o treonina.
La expresión "secuencia de nucleótidos"
pretende indicar un tramo consecutivo de dos o más moléculas
nucleotídicas. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen
genómico, ADNc, ARN, semisintético o sintético, o cualquier
combinación de éstos.
La expresión "reacción en cadena de
polimerasa" o "PCR" se refiere, en general, a un
procedimiento para la amplificación de una secuencia de nucleótidos
deseada in vitro, según se describe, por ejemplo, en el
documento US 4.683.195. En general, el procedimiento de PCR implica
ciclos repetidos de síntesis por extensión con cebadores,
utilizando cebadores oligonucleotídicos capaces de hibridarse
preferentemente con un ácido nucleico molde.
"Célula", "célula hospedante",
"línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de modo
intercambiable en la presente y debe entenderse que todos estos
términos y expresiones incluyen la progenie resultante del
crecimiento o el cultivo de una célula. "Transformación" y
"transfección" se emplean de forma intercambiable para
referirse al proceso de introducir ADN en una célula.
"Unido operablemente" se refiere a la unión
covalente de dos o más secuencias de nucleótidos mediante
acoplamiento enzimático o de otra forma, en una configuración en
relación entre sí de modo que la función normal de las secuencias
pueda realizarse. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que
codifica una presecuencia o secuencia conductora secretora está
unida operablemente a una secuencia de nucleótidos para un
polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la
secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido
operablemente a una secuencia codificadora si afecta a la
transcripción de la secuencia; un sitio de unión a ribosomas está
unido operablemente a una secuencia codificadora si está colocado de
forma que facilite la traducción. En general, "unido
operablemente" significa que las secuencias de nucleótidos que se
unen están contiguas y, en el caso de una secuencia conductora
secretora, contiguas y en fase de lectura. La unión se realiza
mediante acoplamiento en sitios de restricción convenientes. Si
estos sitios no existen entonces se emplean adaptadores o
conectores oligonucleotídicos sintéticos, junto con procedimientos
de ADN recombinante convencionales.
El término "introducir" se refiere a la
introducción de un resto aminoácido que comprende un grupo de unión
para un resto no polipeptídico, en particular mediante la
sustitución de un resto aminoácido existente o, como alternativa,
mediante la inserción de otro resto aminoácido. El término
"eliminar" se refiere a la eliminación de un resto aminoácido
que comprende un grupo de unión para un resto no polipeptídico, en
particular mediante la sustitución del resto aminoácido que se va a
eliminar por otro resto aminoácido o, como alternativa, mediante la
deleción (sin sustitución) del resto aminoácido que se va a
eliminar.
Cuando las sustituciones se realizan con
relación al polipéptido de origen, son preferiblemente
"sustituciones conservativas", en otras palabras,
sustituciones realizadas dentro de grupos de aminoácidos con
características similares, por ejemplo, aminoácidos pequeños,
aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos,
aminoácidos hidrófobos y aminoácidos aromáticos.
Las sustituciones preferidas pueden elegirse, en
particular, entre los grupos de sustitución conservativa listados
en la tabla a continuación.
Grupos de sustitución conservativa:
El término "inmunogenicidad", tal como se
emplea en conexión a una sustancia dada, pretende indicar la
capacidad de la sustancia para inducir una respuesta del sistema
inmunológico. La respuesta inmunológica puede ser una respuesta
mediada por células o anticuerpos (véase, por ejemplo, Roitt:
Essential Immunology (8ª edición, Blackwell) para una definición
más a fondo de inmunogenicidad). Normalmente, una reactividad de
anticuerpos reducida indica una inmunogenicidad reducida. La
inmunogenicidad reducida puede determinarse mediante el uso de
cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo
in vivo o in vitro.
La expresión "semivida funcional in
vivo" se emplea con su significado normal, es decir, el
tiempo en que 50% de la actividad biológica del polipéptido o
conjugado aún está presente en el cuerpo/órgano diana, o el tiempo
en que la actividad del polipéptido o conjugado es 50% de su valor
inicial. Como alternativa para determinar la semivida funcional
in vivo puede determinarse la "semivida en suero", es
decir, el tiempo en que 50% de las moléculas de polipéptido o
conjugado circulan en el plasma o la corriente sanguínea antes de
ser eliminadas. Las expresiones alternativas a la semivida en suero
incluyen "semivida plasmática", "semivida en
circulación", "eliminación del suero", "eliminación del
plasma" y "semivida de eliminación". El polipéptido o
conjugado se elimina mediante la acción de uno o más de sistemas
reticuloendoteliales (RES), riñón, bazo o hígado, mediante
degradación mediada por receptores, o mediante proteolisis
específica o no específica, en particular mediante la acción de la
eliminación mediada por receptores y la eliminación renal.
Normalmente, la eliminación depende del tamaño (con relación al
límite de exclusión para la filtración glomerular), la carga, las
cadenas de carbohidratos unidas, y la presencia de receptores
celulares para la proteína. La funcionalidad que se va a retener
normalmente se selecciona de la actividad proliferativa o de unión
al receptor. La semivida funcional in vivo y la semivida en
suero pueden ser determinadas mediante cualquier procedimiento
conocido en la técnica, como se analiza más a fondo en la sección
de materiales y procedimientos que aparece a continuación.
El término "mayor", cuando se usa acerca de
la semivida funcional in vivo o la semivida en suero, se
emplea para indicar que la semivida pertinente del conjugado o
polipéptido aumenta de una manera estadísticamente significativa
con relación a la de una molécula de referencia, como un
hG-CSF no conjugado (por ejemplo, Neupogen®), según
se determina bajo condiciones comparables. Por ejemplo, la semivida
pertinente puede aumentar en al menos aproximadamente 25%, como en
al menos aproximadamente 50%, por ejemplo, en al menos
aproximadamente 100%, 200%, 500% o 1000%.
La expresión "eliminación renal" se emplea
con su significado normal para indicar cualquier eliminación que
tenga lugar por los riñones, por ejemplo, mediante filtración
glomerular, excreción tubular o eliminación tubular. La eliminación
renal depende de las características físicas del conjugado,
incluyendo el tamaño (diámetro), la simetría, la forma/rigidez y la
carga. Una eliminación renal reducida puede establecerse mediante
cualquier ensayo adecuado, por ejemplo un ensayo in vivo
establecido. De forma típica, la eliminación renal se determina
mediante la administración de un conjugado polipeptídico marcado
(por ejemplo, marcado de forma radiactiva o fluorescente) al
paciente y midiendo la actividad del marcador en orina recogida del
paciente. Una eliminación renal reducida se determina con relación
al correspondiente polipéptido de referencia, por ejemplo, el
correspondiente polipéptido no conjugado, un polipéptido de tipo
salvaje correspondiente no conjugado u otros polipéptidos
conjugados (como un polipéptido conjugado que no se ajuste a la
memoria descriptiva), bajo condiciones comparables.
Preferiblemente, la velocidad de eliminación renal del conjugado se
reduce en al menos 50%, preferiblemente al menos 75%, y lo más
preferiblemente en al menos 90%, comparado con el polipéptido de
referencia pertinente.
En general, la activación del receptor se acopla
a la eliminación mediada por receptores (RMC), de forma que la
unión de un polipéptido a su receptor sin activación no conduce a la
RMC, mientras que la activación del receptor conduce a la RMC. La
eliminación es debida a la internalización del polipéptido unido al
receptor con la posterior degradación lisosómica. Una RMC reducida
puede lograrse diseñando el conjugado de forma que sea capaz de
unirse y activar a un número suficiente de receptores para obtener
una respuesta biológica in vivo óptima y para evitar la
activación de más receptores que los requeridos para obtener dicha
respuesta. Esto puede reflejarse en una reducida bioactividad in
vitro y/o una mayor constante de disociación.
De forma típica, una bioactividad in
vitro reducida refleja una eficacia/eficiencia reducida y/o una
potencia reducida, y puede determinarse mediante cualquier
procedimiento adecuado para determinar cualquiera de estas
propiedades. Por ejemplo, la bioactividad in vitro puede
determinarse en un ensayo basado en la luciferasa (véase Materiales
y procedimientos). La bioactividad in vitro del conjugado
puede reducirse en al menos 30%, como en al menos 50%, 60% o 75%,
por ejemplo, en al menos 90%, comparado con la bioactividad in
vitro de un correspondiente polipéptido de referencia,
determinada bajo condiciones comparables. Expresado de forma
diferente, el conjugado puede tener una bioactividad in vitro
que sea tan pequeña como de aproximadamente 1%, de forma típica al
menos de aproximadamente 2%, como al menos de aproximadamente 5%, de
la del correspondiente polipéptido no conjugado o del
correspondiente polipéptido de tipo salvaje. Por ejemplo, la
bioactividad in vitro puede estar en el intervalo de
aproximadamente 1-50% de la del polipéptido de
referencia, como de aproximadamente 2-40%, por
ejemplo, de aproximadamente 5-25%, determinada bajo
condiciones comparables. En los casos en que se desee una
bioactividad in vitro reducida para reducir la eliminación
mediada por receptores, será evidente que, no obstante, debe
mantenerse la suficiente bioactividad como para obtener la
activición de los receptores deseada.
Preferiblemente, el aumento de la constante de
disociación entre el conjugado polipeptídico y su receptor es de
una magnitud que produce que el conjugado polipeptídico se libere de
su receptor antes de que se produzca cualquier internalizacion
sustancial del complejo de receptor-ligando. La
afinidad de unión del receptor-polipéptido
(incluyendo la constante de disociación) puede determinarse como se
describe en la sección de Materiales y procedimientos de la
presente. La RMC in vitro puede determinarse mediante el
marcaje (por ejemplo, marcaje radiactivo o fluorescente) del
conjugado polipeptídico, la estimulación de células que comprenden
el receptor para el polipéptido, el lavado de las células, y la
medición de la actividad del marcador. Como alternativa, el
conjugado puede exponerse a células que expresen el receptor
pertinente. Después de un tiempo de incubación apropiado, el
sobrenadante se retira y se traslada a un pocillo que contenga
células similares. La respuesta biológica de estas células al
sobrenadante se determina con relación a un polipéptido no conjugado
o a otro polipéptido de referencia, y ésta es una medida del grado
de la RMC reducida.
Normalmente la bioactividad in vitro
reducida del conjugado se obtiene como consecuencia de su
modificación por un resto no polipeptídico. Sin embargo, para
reducir aún más la bioactividad in vitro o por otras
razones, puede ser interesante modificar la parte polipeptídica del
conjugado aún más. Por ejemplo, en una realización, al menos un
resto aminoácido localizado en el sitio de unión al receptor del
polipéptido, o cerca de éste, puede sustituirse por otro resto
aminoácido, comparado con el correspondiente polipéptido de tipo
salvaje, para obtener una reducida bioactividad in vitro. El
resto aminoácido que se va a introducir mediante sustitución puede
ser cualquier resto aminoácido capaz de reducir la bioactividad
in vitro del conjugado. De manera conveniente, el resto
aminoácido introducido comprende un grupo de unión para el resto no
polipeptídico como se define en la presente. En particular, cuando
el resto no polipeptídico es una molécula polimérica, como PEG, el
resto aminoácido que se va a introducir puede ser un resto
lisina.
La expresión "que muestra actividad
G-CSF" pretende indicar que el polipéptido o
conjugado tiene una o más de las funciones del
G-CSF nativo, en particular el
hG-CSF con la secuencia de aminoácidos que aparece
en SEQ ID NO:1, incluyendo la capacidad de unirse a un receptor
G-CSF (Fukunaga et al., J. Biol. Chem.,
265:14008, 1990). La actividad G-CSF se ensaya
convenientemente utilizando el ensayo primario descrito en la
sección de materiales y procedimientos que aparece a continuación.
El polipéptido "que muestra" actividad G-CSF se
considera que tiene esta actividad cuando muestra una función
mensurable, por ejemplo, una actividad proliferativa o una
actividad de unión al receptor mensurables (por ejemplo, según se
determina mediante el ensayo primario descrito en la sección de
materiales y procedimientos). El polipéptido que muestra actividad
G-CSF también puede denominarse en la presente
"molécula de G-CSF".
La expresión "G-CSF de
origen" o "polipéptido de origen" pretende indicar la
molécula que se va a modificar según la presente memoria
descriptiva. El G-CSF de origen es normalmente
hG-CSF o su variante. Un "variante" es un
polipéptido que se diferencia en uno o más restos aminoácidos del
polipéptido de origen, normalmente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14 ó 15 restos aminoácidos. Los ejemplos de
rhG-CSF incluyen filgrastim (Gran® y Neupogen®),
lenograstim (Neutrogin® y Granocyte®) y nartograstim
(Neu-up®).
Como se indicó anteriormente, en un primer
aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un polipéptido que
muestra actividad G-CSF, que comprende una secuencia
de aminoácidos que se diferencia de la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO:1 en al menos un resto aminoácido seleccionado de restos
aminoácidos introducidos o eliminados especificados que comprenden
un grupo de unión para un resto no polipeptídico, y al menos un
resto no polipeptídico unido a un grupo de unión del polipéptido.
Los restos aminoácidos para ser introducidos y/o eliminados se
describen con más detalle en las siguientes secciones. Se entenderá
que el conjugado en sí mismo también muestra actividad
G-CSF.
Mediante la eliminación y/o la introducción de
un resto aminoácido que comprenda un grupo de unión para el resto
no polipéptidico es posible adaptar específicamente el polipéptido
para que la molécula sea más susceptible a la conjugación con el
resto no polipéptidico elegido, para optimizar el patrón de
conjugación (por ejemplo, para asegurar una distribución óptima de
los restos no polipeptídicos sobre la superficie de la molécula de
G-CSF y para asegurarse de que sólo los grupos de
unión previstos para ser conjugados estén presentes en la molécula)
y, con ello, obtener una nueva molécula de conjugado que tiene
actividad G-CSF y además una o más propiedades
mejoradas comparada con las moléculas de G-CSF
disponibles en la actualidad.
Aunque el polipéptido puede ser de cualquier
origen, en particular de origen mamífero, se prefiere en la presente
que sea de origen humano.
En realizaciones preferidas de la presente
memoria descriptiva, más de un resto aminoácido del polipéptido con
actividad G-CSF se altera, por ejemplo la alteración
incluye la eliminación, así como la introducción de restos
aminoácidos que comprenden un grupo de unión para el resto no
polipeptídico elegido.
Además de las alteraciones de aminoácidos
descritas en la presente dirigidas a la eliminación y/o la
introducción de sitios de unión para el resto no polipeptídico, se
entenderá que la secuencia de aminoácidos del polipéptido, según se
describe en la presente, puede contener, si se desea, otras
alteraciones no necesariamente relacionadas con la introducción o
la eliminación de sitios de unión, es decir, otras sustituciones,
inserciones o deleciones. Éstas pueden incluir, por ejemplo, el
truncamiento del N- y/o C-terminal por uno o más
restos aminoácidos, o la adición de uno o más restos extra en el N-
y/o C-terminal, por ejemplo, la adición de un resto
metionina al N-terminal.
El conjugado, según se describe en la presente,
tiene una o más de las siguientes propiedades mejoradas, comparado
con hG-CSF, en particular comparado con
rhG-CSF (por ejemplo, filgrastim, lenograstim o
nartograstim) o con variantes de hG-CSF conocidos:
mayor semivida funcional in vivo, mayor semivida en suero,
menor eliminación renal, menor eliminación mediada por receptores,
menores efectos secundarios, como dolor óseo, y menor
inmunogenicidad.
Debe entenderse que el resto aminoácido que
comprende un grupo de unión para un resto no polipeptídico, tanto
si se va a eliminar como si se va a introducir, se seleccionará
basándose en la naturaleza del resto no polipeptídico elegido y, en
la mayoría de los casos, basándose en el procedimiento mediante el
cual se consigue la conjugación entre el polipéptido y el resto no
polipeptídico. Por ejemplo, cuando el resto no polipeptídico es una
molécula polimérica, como una molécula derivada de polietilenglicol
o poli(óxido de alquileno), los restos aminoácidos que comprenden
un grupo de unión pueden seleccionarse del grupo que consiste en
lisina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, histidina y
arginina. Cuando quiere lograrse la conjugación con un resto lisina,
una molécula activada adecuada es, por ejemplo,
mPEG-SPA de Shearwater Polymers, Inc.,
oxocarboniloxi-N-dicarboximida-PEG
(documento US 5.122.614), o PEG disponible en PolyMASC
Pharmaceuticals plc. El primero de estos se ilustrará más a fondo a
continuación.
Para evitar demasiadas alteraciones en la
estructura y la función de la molécula de G-CSF de
origen, el número total de restos aminoácidos que se van a alterar
según la presente memoria descriptiva, por ejemplo según se
describe en las posteriores secciones de la presente (comparado con
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1) no será, de forma
típica, mayor que 15. El número exacto de restos aminoácidos y el
tipo de restos aminoácidos para ser introducidos o eliminados
depende, en particular, de la naturaleza y grado de conjugación
deseados (por ejemplo, la identidad del resto no polipeptídico,
cuántos restos no polipeptídicos resulta deseable o posible
conjugar al polipéptido, si se desea la conjugación o si debe
evitarse, etc.). Preferiblemente, la parte polipeptídica del
conjugado, según se describe en la presente, o el polipéptido, según
se describe en la presente, comprende una secuencia de aminoácidos
que se diferencia en 1-15 restos aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:1, de forma típica
en 2-10 restos aminoácidos, por ejemplo en
3-8 restos aminoácidos, como en 4-6
restos aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos que aparece en
SEQ ID NO:1. Por tanto, normalmente la parte polipeptídica del
conjugado o del polipéptido, según se describe en la presente,
comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la
secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:1 en 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 restos aminoácidos.
La parte polipeptídica del conjugado tendrá, de
forma típica, una secuencia de aminoácidos con al menos
aproximadamente 80% de coincidencia con SEQ ID NO:1,
preferiblemente al menos aproximadamente 90%, como de al menos
aproximadamente 95%. La homología/coincidencia de la secuencia de
aminoácidos se determina de forma conveniente a partir de
secuencias alineadas utilizando, por ejemplo, el programa ClusaIW,
versión 1.8, junio 1999, utilizando los parámetros por defecto
(Thompson et al., 1994, ClustalW: Improving the sensitivity
of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position-specific gap penalties and
weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22:
4673-4680) o de las familias de PFAM de la base de
datos versión 4.0 (http://pfam.wustl.edu/) (Nucleic Acids Res.,
1999, 1 de enero, 27(1):260-262) mediante el
uso de GENEDOC versión 2.5 (Nicholas, K.B., Nicholas H.B. Jr., y
Deerfield, D.W.II., 1997, GeneDoc: Analysis and Visualization of
Genetic Variation, EMBNEW.NEWS, 4:14; Nicholas, K.B. y Nicholas
H.B. Jr., 1997, GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic
Variation).
En una realización preferida, una diferencia
entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de
aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:1 es que al menos y, más a
menudo, por ejemplo 1-15 restos aminoácidos que
comprenden un grupo de unión para el resto no polipeptídico se ha
introducido, preferiblemente mediante sustitución, en la secuencia
de aminoácidos. Con ello, la parte polipeptídica tiene un contenido
alterado en los restos aminoácidos específicos a los cuales se une
el resto no polipeptídico elegido, con lo que se logra un
conjugación más eficaz, específica y/o extensa. Por ejemplo, cuando
el número total de restos aminoácidos que comprenden un grupo de
unión para el resto no polipeptídico elegido se altera hasta un
nivel optimizado, la eliminación del conjugado se reduce
significativamente, de forma típica, debido a la forma, tamaño y/o
carga alterados de la molécula conseguida mediante la conjugación.
Además, cuando aumenta el número total de restos aminoácidos que
comprenden un grupo de unión para el resto no polipeptídico elegido,
una mayor proporción de la molécula polipeptídica es escondida por
los restos no polipeptídicos elegidos, lo cual conduce a una menor
respuesta inmunológica.
La expresión "una diferencia", tal como se
emplea en la presente solicitud, pretende que puedan estar presentes
otras diferencias. Por consiguiente, además de las diferencias en
aminoácidos especificadas, pueden mutarse otros restos aminoácidos
distintos de los especificados.
En otra realización preferida, una diferencia
entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de
aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:1 es que al menos uno, y
preferiblemente más, por ejemplo 1-15 restos
aminoácidos que comprenden un grupo de unión para el resto no
polipeptídico se ha eliminado o se han eliminado, preferiblemente
mediante sustitución, de la secuencia de aminoácidos. Mediante la
eliminación de uno o más restos aminoácidos que comprenden un grupo
de unión para el resto no polipeptídico elegido es posible evitar
la conjugación con el resto no polipeptídico en partes del
polipéptido en que dicha conjugación no es ventajosa, por ejemplo
en restos aminoácidos localizados en un sitio funcional del
polipéptido, o cerca de éste (puesto que la conjugación en este
sitio puede producir la inactivación o una actividad
G-CSF reducida del conjugado resultante debido a un
reconocimiento defectuoso del receptor). En el presente contexto, la
expresión "sitio funcional" pretende indicar uno o más restos
aminoácidos que es o son esenciales o que están implicados de otra
forma en la función o la actuación del hG-CSF. Estos
restos aminoácidos son una parte del sitio funcional. El sitio
funcional puede determinarse mediante procedimientos conocidos en la
técnica y se identifica preferiblemente mediante el análisis de una
estructura del polipéptido complejada con un receptor pertinente,
como el receptor de hG-CSF (véase, Aritomi et
al., Nature, 401:7173-717, 1999).
En otra realización preferida, la secuencia de
aminoácidos del polipéptido se diferencia de la secuencia de
aminoácido que aparece en SEQ ID NO:1 porque a) al menos un resto
aminoácido especificado que comprende un grupo de unión para el
resto no polipeptídico y que está presente en la secuencia de
aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:1 se ha eliminado,
preferiblemente mediante sustitución, y b) menos un resto aminoácido
especificado que comprende un grupo de unión para el resto no
polipeptídico se ha introducido en la secuencia de aminoácidos,
preferiblemente mediante sustitución, siendo los restos aminoácidos
especificados cualquiera de los descritos en las posteriores
secciones de la presente. Esta realización se considera de
particular interés porque es posible diseñar específicamente el
polipéptido para obtener una conjugación óptima al resto no
polipeptídico elegido. Por ejemplo, mediante la introducción y
eliminación de restos aminoácidos seleccionados, como se describe
en las siguientes secciones, es posible asegurar una distribución
óptima de grupos de unión para el resto no polipeptídico elegido,
que produce un conjugado en que los restos no polipeptídicos están
colocados de tal forma que a) ocultan de forma eficaz los epitopos
y otras partes superficiales del polipéptido, y b) aseguran un
radio de Stokes óptimo del conjugado, sin provocar demasiadas
alteraciones estructurales y, así, perjudicar la función del
polipéptido.
El conjugado, según se describe en la presente,
comprende, en general, un número y tipos suficientes de restos no
polipeptídicos para proporcionar el conjugado con una mayor semivida
funcional in vivo y/o semivida en suero, comparado con
hG-CSF, por ejemplo filgrastim, lenograstim o
nartograstim, y preferiblemente comparado con
hG-CSF que comprende un único resto PEG de 20 kDa
unido a través del N-terminal. La mayor semivida
funcional in vivo se determina de forma conveniente como se
describe en la sección de materiales y procedimientos en la
presente.
El conjugado, según se describe en la presente,
puede comprender al menos un grupo de unión conjugable y no
conjugado para el resto no polipeptídico. En el presente contexto,
la expresión "grupo de unión conjugable" pretende indicar un
grupo de unión que está colocado en una posición del polipéptido en
que resulta accesible para la conjugación y que, excepto por
precauciones especiales, se conjuga con el resto no polipeptídico
pertinente cuando se somete a conjugación. Por ejemplo, este grupo
de unión puede ser parte de un resto aminoácido implicado o
esencial de otra manera para que el polipéptido ejerza su actividad.
Una manera conveniente de evitar la conjugación de un grupo de
unión que, de otra manera, es conjugable, consiste en ocultar el
grupo de unión mediante una molécula auxiliar, por ejemplo como se
describe en la sección titulada "Bloqueo del grupo de unión
funcional". Se entenderá que el número de grupos de unión
conjugables y no conjugados depende del polipéptido de
G-CSF específico y de la colocación de los grupos de
unión conjugables. Por ejemplo, el conjugado polipeptídico
comprende uno o dos grupos de unión conjugables y no conjugados, y
al menos uno y preferiblemente dos o más grupos de unión
conjugados.
En un aspecto, la memoria descriptiva se refiere
a un conjugado polipeptídico que comprende:
i) un polipéptido que muestra actividad
G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos
que se diferencia de la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ
ID NO:1 en al menos una sustitución seleccionada del grupo que
consiste en T1K, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, P10K, Q11K,
S12K, F13K, L14K, L15K, E19K, Q20K, V21K, Q25K, G26K, D27K, A29K,
A30K, E33K, A37K, T38K, Y39K, L41K, H43K, P44K, E45K, E46K, V48K,
L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K, L61K, S62K, S63K,
P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K,
L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K,
L99K, G100K, P101K, T102K, D104K, T105K, Q107K, L108K, D109K,
A111K, D112K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, Q120K, M121K,
E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131K,
P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141K,
S142K, A143K, F144K, Q145K, S155K, H156K, Q158K, S159K, L161K,
E162K, V163K, S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K,
Q173K y P174K, y
ii) al menos un resto no polipéptidico unido a
un resto lisina del polipéptido.
El hG-CSF contiene cuatro restos
lisina, de los cuales K16 está localizado en el dominio de unión al
receptor y los otros están localizados en las posiciones 23, 34 y
40, respectivamente, todos relativamente cerca del dominio de unión
al receptor. Para evitar la conjugación de uno o más de estos restos
lisina (puesto que esto puede inactivar o reducir gravemente la
actividad del conjugado resultante), puede resultar deseable
eliminar al menos un resto lisina, por ejemplo, dos, tres o todos
estos restos. Por consiguiente, en otro aspecto, más preferido, la
memoria descriptiva se refiere a un conjugado polipeptídico como se
definió anteriormente, en el que al menos uno de los restos
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en K16, K23, K34 y
K40 ha sido delecionado o sustituido por otro resto aminoácido.
Preferiblemente, al menos K16 ha sido sustituido por otro resto
aminoácido.
Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos
preferidas incluyen una o más de Q70K, Q90K, T105K, Q120K y T133K,
tal como dos, tres o cuatro de estas sustituciones, por ejemplo:
Q70K+Q90K, Q70K+T105K, Q70K+120K, Q70K+T133K, Q90K+T105K,
Q90K+Q120K, Q90K+T133K, T105K+Q120K, T105K+T133K,
Q120K+T133K,
Q70K+Q90K+T105K, Q70K+Q90K+Q120K, Q70K+Q90K+T133K, Q70K+T105K+T120K, Q70K+T105K+
T133K, Q70K+Q120K+T133K, Q09K+T105K+Q120K, Q90K+T105K+T133K, Q90K+Q120K+T133K, T105K+
T120K+T133K, Q90K+T105K+Q120K+T133K, Q70K+T105K+Q120K+T133K, Q70K+Q90K+Q120K+T133K,
Q70K+Q90K+T105K+T133K o Q70K+Q90K+T105K+Q120K.
Q70K+Q90K+T105K, Q70K+Q90K+Q120K, Q70K+Q90K+T133K, Q70K+T105K+T120K, Q70K+T105K+
T133K, Q70K+Q120K+T133K, Q09K+T105K+Q120K, Q90K+T105K+T133K, Q90K+Q120K+T133K, T105K+
T120K+T133K, Q90K+T105K+Q120K+T133K, Q70K+T105K+Q120K+T133K, Q70K+Q90K+Q120K+T133K,
Q70K+Q90K+T105K+T133K o Q70K+Q90K+T105K+Q120K.
El polipéptido del conjugado según el segundo
aspecto descrito en la presente sección (es decir, al menos una
lisina introducida y una eliminada) comprende preferiblemente al
menos una, tal como una, dos, tres o cuatro, de las sustituciones
seleccionadas del grupo que consiste en K16R, K16Q, K23R, K23Q,
K34R, K34Q, K40R y K40Q, más preferiblemente al menos una de las
sustituciones K16R y K23R, por lo cual puede evitarse la conjugación
de estos restos. Preferiblemente, el polipéptido comprende al menos
una sustitución seleccionada del grupo que consiste en K16R+K23R,
K16R+K34R, K16R+K40R, K23R+K34R, K23R+K40R, K34R+K40R,
K16R+K23R+K34R, K16R+K23R+K40R, K23R+K34R+K40R, K16R+K34R+K40R y
K16R+K23R+K34R+K40R. Es probable que estas sustituciones produzcan
la menor diferencia estructural comparada con el polipéptido de
origen o nativo.
Además de las sustituciones listadas
anteriormente, el conjugado polipeptídico descrito en la presente
también puede incluir una o más sustituciones seleccionadas de
R22K, R146K, R147K, R166K y R169K.
Aunque el resto no polipeptídico del conjugado
según este aspecto de la memoria descriptiva puede ser cualquier
molécula que, cuando se emplea el procedimiento de conjugación dado
tiene a la lisina como un grupo de unión, tal como un resto
carbohidrato, se prefiere que el resto no polipeptídico sea una
molécula polimérica. La molécula polimérica puede ser cualquiera de
las moléculas mencionadas en la sección titulada "Conjugación a
una molécula polimérica", pero se selecciona preferiblemente del
grupo que consiste en polietilenglicol lineal o ramificado u otro
poli(óxido de alquileno). Las moléculas poliméricas preferidas son,
por ejemplo, mPEG-SPA de Shearwater Polymers, Inc.,
u
oxicarbonil-oxi-N-dicarboxiimida-PEG
(documento US 5.122.614).
Se entenderá que cualquiera de los cambios en
los aminoácidos, en particular las sustituciones, especificados en
esta sección puede combinarse con cualquiera de los cambios en los
aminoácidos, preferiblemente las sustituciones, especificados en
las otras secciones de la presente que describen modificaciones de
aminoácidos específicas, incluyendo la introducción y/o la
eliminación de sitios de glicosilación.
En un aspecto, la memoria descriptiva se refiere
a un conjugado que comprende:
i) un polipéptido que muestra actividad
G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos
que se diferencia de la secuencia de aminoácidos de
hG-CSF que aparece en SEQ ID NO:1 en al menos una
sustitución seleccionada del grupo que consiste en T1C, P2C, L3C,
G4C, P5C, A6C, S7C, S8C, L9C, P10C, Q11C, S12C, F13C, L14C, L15C,
E19C, Q20C, V21C, R22C, Q25C, G26C, D27C, A29C, A30C, E33C, A37C,
T38C, Y39C, L41C, H43C, P44C, E45C, E46C, V48C, L49C, L50C, H52C,
S53C, L54C, I56C, P57C, P60C, L61C, S62C, S63C, P65C, S66C, Q67C,
A68C, L69C, Q70C, L71C, A72C, G73C, S76C, Q77C, L78C, S80C, F83C,
Q86C, G87C, Q90C, E93C, G94C, S96C, P97C, E98C, L99C, G100C, P101C,
T102C, D104C, T105C, Q107C, L108C, D109C, A111C, D112C, F113C,
T115C, T116C, W118C, Q119C, Q120C, M121C, E122C, E123C, L124C,
M126C, A127C, P128C, A129C, L130C, Q131C, P132C, T133C, Q134C,
G135C, A136C, M137C, P138C, A139C, A141C, S142C, A143C, F144C,
Q145C, R146C, R147C, S155C, H156C, Q158C, S159C, L161C, E162C,
V163C, S164C, Y165C, R166C, V167C, L168C, R169C, H170C, L171C,
A172C, Q173C y P174C, y
ii) al menos un resto no polipéptidico unido a
un resto cisteína del polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
El dominio de unión al receptor de
hG-CSF contiene un resto cisteína en la posición 17
que no forma parte de una cistina y que puede eliminarse, de forma
ventajosa, para evitar la conjugación del resto no polipeptídico a
dicha cisteína. Por consiguiente, en otro aspecto más preferido, la
memoria descriptiva se refiere a un conjugado que comprende:
i) un polipéptido que muestra actividad
G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos
que se diferencia de la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ
ID NO:1 en al menos una sustitución seleccionada del grupo que
consiste en T1C, P2C, L3C, G4C, P5C, A6C, S7C, S8C, L9C, P10C, Q11C,
S12C, F13C, L14C, L15C, E19C, Q20C, V21C, R22C, Q25C, G26C, D27C,
A29C, A30C, E33C, A37C, T38C, Y39C, L41C, H43C, P44C, E45C, E46C,
V48C, L49C, L50C, H52C, S53C, L54C, 156C, P57C, P60C, L61C, S62C,
S63C, P65C, S66C, Q67C, A68C, L69C, Q70C, L71C, A72C, G73C, S76C,
Q77C, L78C, S80C, F83C, Q86C, G87C, Q90C, E93C, G94C, S96C, P97C,
E98C, L99C, G100C, P101C, T102C, D104C, T105C, Q107C, L108C, D109C,
A111C, D112C, F113C, T115C, T116C, W118C, Q119C, Q120C, M121C,
E122C, E123C, L124C, M126C, A127C, P128C, A129C, L130C, Q131C,
P132C, T133C, Q134C, G135C, A136C, M137C, P138C, A139C, A141C,
S142C, A143C, F144C, Q145C, R146C, R147C, S155C, H156C, Q158C,
S159C, L161C, E162C, V163C, S164C, Y165C, R166C, V167C, L168C,
R169C, H170C, L171C, A172C, Q173C y P174C, en combinación con la
eliminación de C17, preferiblemente la sustitución de C17 por
cualquier otro resto aminoácido, por ejemplo por un resto serina,
y
ii) un resto no polipéptidico que tiene un resto
cisteína como grupo de unión.
Las sustituciones preferidas según este aspecto
de la memoria descriptiva son sustituciones de arginina por
cisteína, por ejemplo una o más de R146C, R147C, R166C y R169C.
Se entenderá que cualquiera de las
modificaciones de aminoácidos, en particular las sustituciones,
especificadas en esta sección puede combinarse con cualquiera de
los cambios en los aminoácidos, en particular las sustituciones,
especificados en las otras secciones de la presente que describen
modificaciones de aminoácidos específicas, incluyendo la
introducción y/o eliminación de sitios de glicosilación.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la memoria descriptiva se
refiere a un conjugado que comprende:
i) un polipéptido que muestra actividad
G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos
que se diferencia de la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ
ID NO:1 en al menos una sustitución seleccionada del grupo que
consiste en T1D, P2D, L3D, G4D, P5D, A6D, S7D, S8D, L9D, P10D, Q11D,
S12D, F13D, L14D, L15D, K16D, Q20D, V21D, R22D, K23D, Q25D, G26D,
A29D, A30D, K34D, A37D, T38D, Y39D, K40D, L41D, H43D, P44D, V48D,
L49D, L50D, H52D, S53D, L54D, 156D, P57D, P60D, L61D, S62D, S63D,
P65D, S66D, Q67D, A68D, L69D, Q70D, L71D, A72D, G73D, S76D, Q77D,
L78D, S80D, F83D, Q86D, G87D, Q90D, G94D, S96D, P97D, L99D, G100D,
P101D, T102D, T105D, Q107D, L108D, A111D, F113D, T115D, T116D,
W118D, Q119D, Q120D, M121D, L124D, M126D, A127D, P128D, A129D,
L130D, Q131D, P132D, T133D, Q134D, G135D, A136D, M137D, P138D,
A139D, A141D, S142D, A143D, F144D, Q145D, R146D, R147D, S155D,
H156D, Q158D, S159D, L161D, V163D, S164D, Y165D, R166D, V167D,
L168D, R169D, H170D, L171D, A172D, Q173D y P174D; o al menos una
sustitución seleccionada del grupo que consiste en T1E, P2E, L3E,
G4E, P5E, A6E, S7E, S8E, L9E, P10E, Q11E, S12E, F13E, L14E, L15E,
K16E, Q20E, V21E, R22E, K23E, Q25E, G26E, A29E, A30E, K34E, A37E,
T38E, Y39E, K40E, L41E, H43E, P44E, V48E, L49E, L50E, H52E, S53E,
L54E, I56E, P57E, P60E, L61E, S62E, S63E, P65E, S66E, Q67E, A68E,
L69E, Q70E, L71E, A72E, G73E, S76E, Q77E, L78E, S80E, F83E, Q86E,
G87E, Q90E, G94E, S96E, P97E, L99E, G100E, P101E, T102E, T105E,
Q107E, L108E, A111E, F113E, T115E, T116E, W118E, Q119E, Q120E,
M121E, L124E, M126E, A127E, P128E, A129E, L130E, Q131E, P132E,
T133E, Q134E, G135E, A136E, M137E, P138E, A139E, A141E, S142E,
A143E, F144E, Q145E, R146E, R147E, S155E, H156E, Q158E, S159E,
L161E, V163E, S164E, Y165E, R166E, V167E, L168E, R169E, H170E,
L171E, A172E, Q173E y P174E; y
ii) un resto no polipéptidico que tiene un resto
ácido aspártico o ácido glutámico como grupo de unión.
Los ejemplos de sustituciones preferidas según
este aspecto de la memoria descriptiva incluyen Q67D/E, Q70D/E,
Q77D/E, Q86DB, Q90D/E, Q120D/E, Q131D/E, Q134D/E, Q145D/E y
Q173D/E.
Además de las sustituciones listadas
anteriormente, el polipéptido del conjugado según uno cualquiera de
los aspectos anteriores puede comprender la eliminación,
preferiblemente la sustitución, de al menos uno de los restos
aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en D27, D104, D109,
D112, E19, E33, E45, E46, E93, E98, E122, E123, y E163. La
sustitución puede ser por cualquier otro resto aminoácido, en
particular por un resto asparagina o glutamina, por lo cual puede
evitarse la conjugación de estos restos. En particular, el
polipéptido puede comprender al menos una de las siguientes
sustituciones: D27N, D104N, D109N, D112N, E19Q, E33Q, E45Q, E46Q,
E93Q, E98Q, E122Q, E123Q y E163Q. Preferiblemente, la sustitución
del aminoácido en una o más de las anteriores posiciones puede
combinarse con al menos una de las siguientes sustituciones: D109N,
D112N, E19Q, E122Q y E123Q. Es probable que la sustitución por
cualquiera de estos restos aminoácidos produzcan la menor
diferencia estructural.
Aunque el resto no polipeptídico del conjugado
según este aspecto de la memoria descriptiva, que tiene un grupo
ácido como grupo de unión, puede ser cualquier resto no
polipeptídico con esta propiedad, se prefiere en la presente que el
resto no polipeptídico sea una molécula polimérica o un agente
derivatizante orgánico, en particular una molécula polimérica, y el
conjugado se prepara, por ejemplo, como se describe en Sakane y
Pardridge, Pharmaceutical Research, vol. 14, nº 8, 1997, pp.
1085-1091.
Se entenderá que cualquiera de los cambios en
los aminoácidos, en particular las sustituciones, especificados en
esta sección puede combinarse con cualquiera de los cambios en los
aminoácidos, en particular las sustituciones, especificados en las
otras secciones de la presente que describen cambios en los
aminoácidos específicos, incluyendo la introducción y/o la
eliminación de sitios de glicosilación.
Además de los restos no polipeptídicos
especificados anteriormente, por ejemplo en las secciones tituladas
"Conjugado de la memoria descriptiva...", el conjugado de la
memoria descriptiva puede contener otros restos carbohidrato como
consecuencia de la expresión del polipéptido en una célula
hospedante glicosilante y de lograrse la glicosilación en sitios de
glicosilación o introduciendo un sitio o sitios de
glicosilación.
En otro aspecto, la memoria descriptiva se
refiere a un conjugado que comprende un polipéptido glicosilado que
muestra actividad G-CSF, que comprende una secuencia
de aminoácidos que se diferencia de la secuencia de aminoácidos que
aparece en SEQ ID NO:1 en al menos un sitio de glicosilación no
natural que se ha introducido en la secuencia de aminoácidos
mediante al menos una sustitución seleccionada del grupo que
consiste en L3N+P5S/T, P5N, A6N, S8N+P10S/T, P10N, Q11N+F13S/T,
S12N+L14S/T, F13N+L15S/T, L14N+K16S/T, K16N+L18S/T, E19N+V21S/T,
Q20N+R22S/T, V21N+K23S/T, R22N+I24S/T, K23N+Q25S/T, Q25N+D27S/T,
G26N+G28S/T, D27N+A29S/T,
A29N+L31S/T, A30N+Q32S/T, E33N+L35S/T, A37N+Y39S/T, T38N+K40S/T, Y39N+L41S/T, P44N+E46S/T,
E45N+L47S/T, E46N+V48S/T, V48N+L50S/T, L49N+G51S/T, L50N+H52S/T, H52N+L54S/T, S53N+G55S/T,
P60N, L61N, S63N+P65S/T, P65N+Q67S/T, S66N+A68S/T, Q67N+L69S/T, A68N+Q70S/T, L69N+ L71S/T, Q70N+
A72S/T, L71N+G73S/T, G73N+L75S/T, S76N+L78S/T, Q77N+H79S/T, L78N, S80N+L82S/T, F83N+Y85S/T,
Q86N+L88S/T, G87N+L89Sfr, Q90N+L92S/T, E93N+195S/T, P97N+L99S/T, L99N+P101S/T, P101N+L103S/T,
T102N+D104S/T, D104N+L106S/T, T105N+Q107S/T, Q107N+D109S/T, L108N+V110S/T, D109N+A111S/T,
A111N+F113S/T, D112N+A114S/T, F113N, T115N+I117S/T, T116N+W118S/T, W118N+Q120S1T, Q119N+
M121S/T, Q120N+E122S/T, M121N+E123S/T, E122N+L124S/T, E123N+G125S/T, L124N+M126S/T, M126N+
P128S/T, P128N+L130S/T, L130N+P132S/T, P132N+Q134S/T, T133N+G135S/T, Q134N+A136S/T, A136N+
P138S/T, P138N+F140S/T, A139N+A141S/T, A141N+A143S/T, S142N+F144S/T, A143N+Q145S/T, F144N+
R146S/T, Q145N+R147S/T, R146N+A148S/T, R147N+G149S/T, S155N+L157S/T, H156N+Q158S/T, S159N+
L161S/T, L161N+V163S/T, E162N, V163N+Y165S/T, S164N+R166S/T, Y165N+V167S/T, R166N+L168S/T,
V167N+R169S/T, L168N+H170S/T, R169N+L171S/T y H170N+A172S/T, en las que S/T indica un resto S o T, prefe-
riblemente un resto T.
A29N+L31S/T, A30N+Q32S/T, E33N+L35S/T, A37N+Y39S/T, T38N+K40S/T, Y39N+L41S/T, P44N+E46S/T,
E45N+L47S/T, E46N+V48S/T, V48N+L50S/T, L49N+G51S/T, L50N+H52S/T, H52N+L54S/T, S53N+G55S/T,
P60N, L61N, S63N+P65S/T, P65N+Q67S/T, S66N+A68S/T, Q67N+L69S/T, A68N+Q70S/T, L69N+ L71S/T, Q70N+
A72S/T, L71N+G73S/T, G73N+L75S/T, S76N+L78S/T, Q77N+H79S/T, L78N, S80N+L82S/T, F83N+Y85S/T,
Q86N+L88S/T, G87N+L89Sfr, Q90N+L92S/T, E93N+195S/T, P97N+L99S/T, L99N+P101S/T, P101N+L103S/T,
T102N+D104S/T, D104N+L106S/T, T105N+Q107S/T, Q107N+D109S/T, L108N+V110S/T, D109N+A111S/T,
A111N+F113S/T, D112N+A114S/T, F113N, T115N+I117S/T, T116N+W118S/T, W118N+Q120S1T, Q119N+
M121S/T, Q120N+E122S/T, M121N+E123S/T, E122N+L124S/T, E123N+G125S/T, L124N+M126S/T, M126N+
P128S/T, P128N+L130S/T, L130N+P132S/T, P132N+Q134S/T, T133N+G135S/T, Q134N+A136S/T, A136N+
P138S/T, P138N+F140S/T, A139N+A141S/T, A141N+A143S/T, S142N+F144S/T, A143N+Q145S/T, F144N+
R146S/T, Q145N+R147S/T, R146N+A148S/T, R147N+G149S/T, S155N+L157S/T, H156N+Q158S/T, S159N+
L161S/T, L161N+V163S/T, E162N, V163N+Y165S/T, S164N+R166S/T, Y165N+V167S/T, R166N+L168S/T,
V167N+R169S/T, L168N+H170S/T, R169N+L171S/T y H170N+A172S/T, en las que S/T indica un resto S o T, prefe-
riblemente un resto T.
Se entenderá que para preparar un conjugado
según este aspecto, el polipéptido debe expresarse en una célula
hospedante glicosilante capaz de unir restos oligosácarido en el
sitio o sitios de glicosilación o, como alternativa, someterse a
una glicosilación in vitro. Se indican ejemplos de células
hospedantes glicosilantes en la sección que aparece a continuación
titulada "Acoplamiento con un resto oligosacárido".
Como alternativa, el conjugado según este
aspecto comprende un polipéptido que muestra actividad
G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos
que se diferencia de la que aparece en SEQ ID NO:1 en al menos una
sustitución seleccionada del grupo que consiste en P5N, A6N, P10N,
P60N, L61N, L78N, F113N y E162N, en particular del grupo que
consiste en P5N, A6N, P10N, P60N, L61N, F113N y E162N, tal como del
grupo que consiste en P60N, L61N, P113N y E162N.
Como alternativa, el conjugado según este
aspecto comprende un polipéptido que muestra actividad
G-CSF, que comprende una secuencia de aminoácidos
que se diferencia de la que aparece en SEQ ID NO:1 en al menos una
sustitución seleccionada del grupo que consiste en D27N+A29S,
D27N+A29T, D104N+L106S, D104N+L106T, D109N+A111S, D109N+A211T,
D112N+A114S y D112N+A114T, más preferiblemente del grupo que
consiste en D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S, D104N+L106T,
D112N+A114S y D112N+A114T, tal como del grupo que consiste en
D27N+A29S, D27N+A29T, D104N+L106S y D104N+L106T.
Además de una molécula de carbohidrato, el
conjugado según el aspecto de la memoria descriptiva descrito en la
presente sección puede contener otros restos no polipeptídicos, en
particular una molécula polimérica, según se describe en la
presente, conjugados con uno o más grupos de unión presentes en la
parte polipeptídica del conjugado.
Se entenderá que cualquiera de los cambios en
los aminoácidos, en particular las sustituciones, especificados en
esta sección puede combinarse con cualquiera de los cambios en los
aminoácidos, en particular las sustituciones, especificados en las
otras secciones de la presente que describen cambios en los
aminoácidos específicos.
En otra realización, la parte polipeptídica del
conjugado polipeptídico de la memoria descriptiva puede estar en
forma de un variante circularmente permutado de una secuencia
polipeptídica descrita de otra manera en la presente. En este
polipéptido circularmente permutado, el N-terminal y
el C-terminal originales se unen entre sí
directamente mediante un enlace peptídico o indirectamente a través
de un conector peptídico, mientras que se forman nuevos N- y
C-terminales entre dos restos aminoácidos adyacentes
que originariamente estaban unidos por un enlace peptídico. Puesto
que el N-terminal y el C-terminal
originales normalmente estarían colocados a cierta distancia entre
sí, se unirán, de forma típica, mediante un conector peptídico que
tenga una longitud y una composición adecuadas, de forma que la
estructura y la actividad del conjugado no sean afectadas de manera
adversa. Es evidente que los nuevos N-terminal y
C-terminal no deben formarse entre una pareja de
restos aminoácidos en donde esto suponga una interferencia con la
actividad del polipéptido. Se describen agonistas del receptor de
G-CSF circularmente permutados en el documento US
6.100.070, al cual se hace referencia para conseguir más
información acerca de la selección de conectores peptídicos y de la
localización de nuevos N-terminal y
C-terminal, así como de procedimientos para producir
estos variantes.
En otra realización, el conjugado polipeptídico
de la memoria descriptiva puede caracterizarse como un conjugado
que muestra actividad G-CSF y que comprende un
polipéptido con una secuencia de aminoácidos que se diferencia en
al menos un resto aminoácido de la secuencia de aminoácidos que
aparece en SEQ ID NO:1, y que tiene al menos un resto no
polipeptídico unido a un grupo de unión del polipéptido, cumpliendo
el conjugado polipeptídico al menos uno de los siguientes criterios
(A)-(D):
\vskip1.000000\baselineskip
(A) después de una administración subcutánea de
100 microgramos por kg de peso corporal a ratas (basándose en el
peso de la parte polipeptidica del conjugado), éste:
i) aumenta la formación de leucocitos con al
menos aproximadamente la misma velocidad y al menos aproximadamente
el mismo nivel (medido como número de células por litro de sangre)
que la administración de 100 microgramos de hG-CSF
no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas
después de la administración, y
ii) aumenta el nivel de leucocitos (medido como
número de células por litro de sangre) por encima del nivel de
leucocitos antes de la administración durante un periodo de al menos
96 horas, preferiblemente al menos aproximadamente 120 horas;
\vskip1.000000\baselineskip
(B) después de una administración subcutánea de
25 microgramos por kg de peso corporal a ratas (basándose en el
peso de la parte polipeptidica del conjugado), éste:
i) aumenta la formación de leucocitos con al
menos aproximadamente la misma velocidad y al menos aproximadamente
el mismo nivel (medido como número de células por litro de sangre)
que la administración de 100 microgramos de hG-CSF
no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas
después de la administración, y
ii) aumenta el nivel de leucocitos (medido como
número de células por litro de sangre) por encima del nivel de
leucocitos antes de la administración durante un periodo de al menos
72 horas, preferiblemente durante al menos aproximadamente 96
horas, más preferiblemente al menos 120 horas;
\vskip1.000000\baselineskip
(C) después de una administración subcutánea de
100 microgramos por kg de peso corporal a ratas (basándose en el
peso de la parte polipeptidica del conjugado), éste:
i) aumenta la formación de neutrófilos con al
menos aproximadamente la misma velocidad y al menos aproximadamente
el mismo nivel (medido como número de células por litro de sangre)
que la administración de 100 microgramos de hG-CSF
no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas
después de la administración, y
ii) aumenta el nivel de neutrófilos (medido como
número de células por litro de sangre) por encima del nivel de
neutrófilos antes de la administración durante un periodo de al
menos 98 horas, preferiblemente al menos aproximadamente 120
horas;
\vskip1.000000\baselineskip
(D) después de una administración subcutánea de
25 microgramos por kg de peso corporal a ratas (basándose en el
peso de la parte polipeptidica del conjugado), éste:
i) aumenta la formación de neutrófilos con al
menos aproximadamente la misma velocidad y al menos aproximadamente
el mismo nivel (medido como número de células por litro de sangre)
que la administración de 100 microgramos de hG-CSF
no conjugado por kg de peso corporal durante un periodo de 12 horas
después de la administración, y
ii) aumenta el nivel de neutrófilos (medido como
número de células por litro de sangre) por encima del nivel de
neutrófilos antes de la administración durante un periodo de al
menos 72 horas, preferiblemente al menos aproximadamente 96 horas,
más preferiblemente al menos aproximadamente 120 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se indicó anteriormente, el resto no
polipeptídico del conjugado de la memoria descriptiva se selecciona
preferiblemente del grupo que consiste en una molécula polimérica,
un compuesto lipófilo, un resto carbohidrato (por ejemplo mediante
una glicosilación in vivo) y un agente derivatizante
orgánico. Todos estos agentes pueden conferir propiedades deseables
a la parte polipeptídica del conjugado, en particular una mayor
semivida funcional in vivo y/o una mayor semivida en suero.
La parte polipeptídica del conjugado normalmente se conjuga sólo a
un tipo de resto no polipeptídico, pero también puede conjugarse a
dos o más tipos diferentes de restos no polipeptídicos, por ejemplo
a una molécula polimérica y un resto oligosacárido, a un grupo
lipófilo y un resto oligosacárido, a un agente derivatizante
orgánico y un resto oligosacárido, a un grupo lipófilo y a una
molécula polimérica, etc. La conjugación de dos o más restos no
polipeptídicos diferentes puede realizarse de forma simultánea o
secuencial.
En las siguientes secciones "Conjugación con
un compuesto lipófilo", "Conjugación con una molécula
polimérica", "Conjugación con un resto oligosacárido" y
"Conjugación con un agente derivatizante orgánico" se describe
la conjugación con tipos específicos de restos no polipeptídicos. En
general, un conjugado polipeptídico según la memoria descriptiva
puede producirse cultivando una célula hospedante apropiada bajo
condiciones que conducen a la expresión del polipéptido, y
recuperando el polipéptido, en el que a) el polipéptido comprende al
menos un sitio de N- u O-glicosilación, y la célula
hospedante es una célula hospedante eucariota capaz de realizar la
glicosilación in vivo, y/o b) el polipéptido se somete a
conjugación con un resto no polipeptídico in vitro.
El polipéptido y el compuesto lipófilo pueden
conjugarse entre sí, directamente o mediante el uso de un conector.
El compuesto lipófilo puede ser un compuesto natural, como un ácido
graso saturado o insaturado, una dicetona de ácido graso, un
terpeno, una prostaglandina, una vitamina, un carotenoide o un
esteroide, o un compuesto sintético, como un ácido carbónico, un
alcohol, una amina y un ácido sulfónico con uno o más alquilos,
arilos, alquenilos u otros compuestos de insaturación múltiple. La
conjugación entre el polipéptido y el compuesto lipófilo,
opcionalmente a través de un conector, puede realizarse según
procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se
describe en Bodanszky, en Peptide Synthesis, John Wiley, Nueva York,
1976, y en el documento WO 96/12505.
La molécula polimérica que se va a acoplar al
polipéptido puede ser cualquier molécula polimérica adecuada, como
un homopolímero o un heteropolímero natural o sintético, de forma
típica con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente
300-100.000 Da, como de aproximadamente
500-20.000 Da, más preferiblemente en el intervalo
de aproximadamente 1.000-15.000 Da, aún más
preferiblemente en el intervalo de aproximadamente
2.000-12.000 Da, como de aproximadamente
3.000-10.000. Cuando se emplea acerca de las
moléculas poliméricas de la presente, el término
"aproximadamente" indica un peso molecular medio aproximado y
refleja el hecho de que normalmente existirá una cierta
distribución de peso molecular en una preparación polimérica
dada.
Los ejemplos de homopolímeros incluyen un poliol
(es decir, poli-OH), una poliamina (es decir,
poli-NH_{2}) y un ácido policarboxílico (es
decir, poli-COOH). Un heteropolímero es un polímero
que comprende diferentes grupos de acoplamiento, como un grupo
hidroxilo y un grupo amina.
Los ejemplos de moléculas poliméricas adecuadas
incluyen moléculas poliméricas seleccionadas del grupo que consiste
en poli(óxido de alquileno) (PAO), incluyendo polialquilenglicol
(PAG), como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG)
lineal o ramificado, poli(alcohol vinílico) (PVA),
policarboxilato, polivinilpirrolidona,
polietileno-co-anhídrido del ácido
maleico, poliestireno-co-anhídrido
del ácido maleico, dextrano, incluyendo carboximetildextrano o
cualquier otro biopolímero adecuado para reducir la inmunogenicidad
y/o aumentar la semivida funcional in vivo y/o la semivida
en suero. Otro ejemplo de una molécula polimérica es la albúmina
humana u otra proteína plasmática abundante. En general, los
polímeros derivados de polialquilenglicol son biocompatibles, no
tóxicos, no antigénicos, no inmunogénicos, tienen diversas
solubilidades en agua, y los organismos vivos pueden excretarlos
con facilidad.
El PEG es la molécula polimérica preferida,
puesto que tiene sólo un pocos grupos reactivos capaces de
entrecruzarse comparado con polisacáridos como el dextrano. En
particular, el PEG monofuncional, por ejemplo metoxipolietilenglicol
(mPEG), resulta interesante puesto que su química de acoplamiento
es relativamente sencilla (sólo un grupo reactivo está disponible
para la conjugación con grupos de unión sobre el polipéptido). Por
consiguiente, el riesgo de entrecruzamiento se elimina, los
conjugados polipeptídicos resultantes resultantes son más
homogéneos, y la reacción de la moléculas poliméricos con el
polipéptido es más fácil de controlar.
Para llevar a cabo la unión covalente de la
molécula o moléculas poliméricas al polipéptido, los grupos
terminales hidroxilo de la molécula polimérica se proporcionan en
forma activada, es decir, con grupos funcionales reactivos. Las
moléculas poliméricas activadas adecuadas están disponibles en el
mercado, por ejemplo, en Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL,
EEUU, o en PolyMASC Pharmaceuticals, plc, Reino Unido. Como
alternativa, las moléculas poliméricas pueden activarse mediante
procedimientos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo,
según se describe en el documento WO 90/13540. Los ejemplos
específicos de moléculas poliméricas lineales o ramificados
activados para su uso en la presente invención se describen en los
catálogos de Shearwater Polymers, Inc., de 1997 y de 2000
(Functionalized Biocompatible Polymers for Research and
pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, incorporado a
la presente como referencia). Los ejemplos específicos de polímeros
de PEG activados incluyen los siguientes PEG lineales:
NHS-PEG (por ejemplo, SPA-PEG,
SSPA-PEG, SBA-PEG,
SS-PEG, SSA-PEG,
SC-PEG, SG-PEG, y
SCM-PEG, y NOR-PEG),
BTC-PEG, EPOX-PEG,
NCO-PEG, NPC-PEG,
CDI-PEG, ALD-PEG,
TRES-PEG, VS-PEG,
IODO-PEG, y MAL-PEG, y PEG
ramificados, como PEG2-NHS, y los descritos en los
documentos US 5.932.462 y US 5.643.575. Además, las siguientes
publicaciones describen moléculas poliméricas y/o químicas de
PEGilación útiles: US 5.824.778, US 5.476.653, WO 97/32607, EP
229.108, EP 402.378, US 4.902.502, US 5.281.698, US 5.122.614, US
5.219.564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO
94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO
95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO
99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO
95/06058, EP 439.508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP
921.131, US 5.736.625, WO 98/05363, EP 809.996, US 5.629.384, WO
96/41813, WO 96/07670, US 5.473.034, US 5.516.673, EP 605.963, US
5.382.657, EP 510.356, EP 400.472, EP 183.503 y EP 154.316.
La conjugación del polipéptido y las moléculas
poliméricas activadas se realiza mediante el uso de cualquier
procedimiento convencional, por ejemplo según se describe en las
siguientes referencias bibliográficas (que también describen
procedimientos adecuados para la activación de moléculas
poliméricas): R.F. Taylor (1991), "Protein immobilisation.
Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong
(1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking",
CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al. (1993),
"Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press,
N.Y.). Los expertos en la técnica serán conscientes de que el
procedimiento de activación y/o la química de conjugación que se
vayan a utilizar dependen del grupo o grupos de unión del
polipéptido (cuyos ejemplos se ofrecieron anteriormente), así como
de los grupos funcionales del polímero (por ejemplo, si son amina,
hidroxilo, carboxilo, aldehído, sulfhidrilo, succinimidilo,
maleimida, vinilsufona o haloacetato). La PEGilación puede
dirigirse hacia la conjugación con todos los grupos de unión
disponibles sobre el polipéptido (es decir, los grupos de unión que
están expuestos sobre la superficie del polipéptido) o puede
dirigirse hacia uno o más grupos de unión específicos, por ejemplo
el grupo amino N-terminal (documento US 5.985.265).
Además, la conjugación puede lograrse en una etapa o de una manera
discontinua (por ejemplo, como se describe en el documento WO
99/55377).
Se entenderá que la PEGilación se diseña para
producir la molécula óptima con respecto al número de moléculas de
PEG unidas, el tamaño y la forma de estas moléculas (por ejemplo, si
son lineales o ramificadas), y según dónde se van a unir estas
moléculas en el polipéptido. El peso molecular del polímero que se
va a utilizar se elegirá tomando en consideración el efecto deseado
que se va a lograr. Por ejemplo, si el objetivo principal de la
conjugación es lograr un conjugado que tenga un alto peso molecular
y mayor tamaño (por ejemplo, para reducir la eliminación renal), se
puede elegir conjugar una o unas pocas moléculas poliméricas de alto
peso molecular o una serie de moléculas poliméricas con un peso
molecular más pequeño para obtener el efecto deseado. Sin embargo,
preferiblemente se utilizarán varias moléculas poliméricas con un
peso molecular más pequeño. Cuando se desee un alto grado de
ocultamiento de epitopos, esto puede obtenerse mediante el uso de un
número suficientemente alto de moléculas poliméricas de bajo peso
molecular (por ejemplo, con un peso molecular de aproximadamente
5.000 Da) para ocultar de manera eficaz todos o la mayor parte de
los epitopos del polipéptido. Por ejemplo, pueden utilizarse
2-8, tal como 3-6, de estos
polímeros. Tal como ilustran los ejemplos a continuación, puede
resultar ventajoso tener un gran número de moléculas poliméricas con
un menor peso molecular (por ejemplo, 4-6 con un PM
de 5000), comparado con un número más pequeño de moléculas
poliméricas con un mayor peso molecular (por ejemplo,
1-3 con un PM de 12.000-20.000) en
términos de mejorar la semivida funcional in vivo del
conjugado polipeptídico, incluso cuando el peso molecular total de
las moléculas poliméricas unidas en los dos casos sea el mismo. Se
cree que la presente de un número mayor de moléculas poliméricas más
pequeñas proporciona al polipéptido un diámetro o un tamaño
aparente mayores que, por ejemplo, una única molécula polimérica
pero más grande, al menos cuando las moléculas poliméricas se
distribuyen de una manera relativamente uniforme sobre la
superficie del polipéptido.
Aunque no se prefiere la conjugación de sólo una
única molécula polimérica a un único grupo de unión sobre la
proteína, en el caso de que sólo se una una molécula polimérica, en
general resultará ventajoso que la molécula polimérica, que puede
ser lineal o ramificada, tenga un peso molecular relativamente alto,
por ejemplo aproximadamente 20 kDa.
Normalmente, la conjugación del polímero se
realiza bajo condiciones dirigidas a hacer reaccionar la mayor
cantidad posible de grupos de unión al polímero disponibles con las
moléculas poliméricas. Esto se logra mediante un exceso molar
adecuado del polímero con relación al polipéptido. Las proporciones
molares típicas de las moléculas poliméricas activadas al
polipéptido son de hasta aproximadamente 1000-1,
como de hasta aproximadamente 200-1 o hasta
aproximadamente 100-1. Sin embargo, en algunos casos
la proporción puede ser algo menor, como de hasta aproximadamente
50-1, 10-1 ó
5-1.
\newpage
También se contempla, según la memoria
descriptiva, acoplar las moléculas poliméricas al polipéptido a
través de un conector. Los conectores adecuadas son muy conocidos
por los expertos en la técnica. Un ejemplo preferido es el cloruro
cianúrico (Abuchowski et al. (1977), J. Biol. Chem., 252,
3578-3581; documento US 4.179.337; Shafer et
al. (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. ed., 24,
375-378).
Después de la activación, se bloquean las
moléculas poliméricas activadas residuales según procedimientos
conocidos en la técnica, por ejemplo mediante la adición de una
amina primaria a la mezcla de reacción, y las moléculas poliméricas
inactivadas resultantes se eliminan mediante un procedimiento
adecuado (véase Materiales y procedimientos).
En una realización preferida, el conjugado
polipeptídico de la memoria descriptiva comprende una molécula de
PEG unida a algunos, a la mayoría o preferiblemente a
sustancialmente todos los restos lisina en el polipéptido
disponibles para la PEGilación, en particular una molécula de PEG
lineal o ramificada, por ejemplo con un peso molecular de
aproximadamente 1-15 kDa, de forma típica de
aproximadamente 2-12 kDa, como de aproximadamente
3-10 kDa, por ejemplo de aproximadamente 5 ó 6
kDa.
Se entenderá que dependiendo de las
circunstancias, por ejemplo la secuencia de aminoácidos del
polipéptido, la naturaleza del compuesto de PEG activado que se
está utilizando y las condiciones de PEGilación específicas,
incluyendo la proporción molar del PEG al polipéptido, pueden
obtenerse grados variados de PEGilación, obteniéndose un mayor
grado de PEGilación en general con una mayor proporción de PEG al
polipéptido. Los polipéptidos PEGilados que se producen como
resultado de cualquier proceso de PEGilación dado, sin embargo,
normalmente comprenden una distribución estocástica de conjugados
polipeptídicos que tienen grados ligeramente diferentes de
PEGilación.
En otra realización, el conjugado polipeptídico
de la memoria descriptiva puede comprender una molécula de PEG
unida a los restos lisina en el polipéptido disponibles para la
PEGilación, y además del resto aminoácido
N-terminal del polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
La conjugación con un resto oligosacárido puede
tener lugar in vivo o in vitro. Para lograr la
glicosilación in vivo de una molécula de
G-CSF que comprenda uno o más sitios de
glicosilación, la secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido debe insertarse en un hospedante de expresión eucariota
glicosilante. La célula hospedante de expresión puede seleccionarse
de células fúngicas (hongos filamentosos o levaduras), células de
insecto o animales, o células de plantas transgénicas. En una
realización, la célula hospedante es una célula de mamífero, como
una célula CHO, BHK o HEK, por ejemplo células HEK 293, o un célula
de insecto, como una célula SF9, o una célula de levadura, por
ejemplo S. cerevisiae o Pichia pastoris, o cualquiera
de las células hospedantes mencionadas a continuación. El
acoplamiento covalente in vitro de glicósidos (como el
dextrano) a restos aminoácidos del polipéptido también puede
utilizarse, por ejemplo, como se describe en el documento WO
87/05330, y en Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., po.
259-306, 1981.
El acoplamiento in vitro de los restos
oligosacáridos o PEG a restos Gln unidos a proteínas y péptidos
puede realizarse mediante transglutaminasas (TGasa). Las
transglutaminasas catalizan la transferencia de grupos amina
donantes a restos Gln unidos a proteínas y péptidos en una reacción
denominada de entrecruzamiento. Los grupos amina donantes pueden
estar unidos a proteínas o a péptidos, por ejemplo como el grupo
\varepsilon-amino en los restos Lys o pueden ser
parte de una molécula orgánica pequeña o grande. Un ejemplo de una
molécula orgánica pequeña que actúa como donante de amino en el
entrecruzamiento catalizado por TGasas es la putrescina
(1,4-diaminobutano). Un ejemplo de una molécula
orgánica mayor que actúa como donante de amino en el
entrecruzamiento catalizado por TGasas es un PEG que contiene amina
(Sato et al., Biochemistry, 35,
13072-13080).
Las TGasas son, en general, enzimas muy
específicas, y no todos los restos Gln expuestos sobre la superficie
de una proteína son accesibles al entrecruzamiento con sustancias
que contienen amino catalizado por TGasas. Por el contrario, sólo
unos pocos restos Gln actúan de modo natural como sustratos para
TGasas, pero los parámetros exactos que gobiernan cuáles son los
restos Gln que son buenos sustratos para TGasas siguen siendo
desconocidos. Por tanto, para hacer que una proteína sea
susceptible a reacciones de entrecruzamiento catalizadas por TGasas
a menudo supone un prerrequisito añadir, en posiciones convenientes,
tramos de secuencias de aminoácidos conocidos por funcionar muy
bien como sustrato de TGasas. Se sabe que varias secuencias de
aminoácidos son sustratos de TGasas o contienen excelentes
sustratos de TGasas naturales, por ejemplo la sustancia P, la
elafina, el fibrinógeno, la fibronectina, el inhibidor de
\alpha_{2}-plasmina, las
\alpha-caseínas y la
\beta-caseínas.
\vskip1.000000\baselineskip
La modificación covalente del polipéptido que
muestra actividad G-CSF puede realizarse haciendo
reaccionar uno o más grupos de unión del polipéptido con un agente
derivatizante orgánico. Los agentes derivatizantes y los
procedimientos adecuados son muy conocidos en la técnica. Por
ejemplo, los restos cisteinilo, de forma más habitual, se hacen
reaccionar con \alpha-haloacetatos (y las
correspondientes aminas), como ácido cloroacético o cloroacetamida,
para producir derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los
restos cisteinilo tambíen se derivatizan mediante una reacción con
bromotrifluoroacetona, ácido
\alpha-bromo-\beta-(4-imidozoil)propiónico,
fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas,
disulfuro de
3-nitro-2-piridilo,
disulfuro de metil-2-piridilo,
p-cloromercuribenzoato,
2-cloromercuri-4-nitrofenol,
o
cloro-7-nitrobencen-2-oxa-1,3-diazol.
Los restos histidilo se derivatizan mediante una reacción con
dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente
es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo.
También resulta útil el bromuro de
para-bromofenacilo. La reacción se realiza
preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0. Los restos
lisinilo y amino terminales se hacen reaccionar con anhídrido
succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La
derivatización con estos agentes tiene el efecto de revertir la
carga de los restos lisinilo. Otros reactivos adecuados para
derivatizar los restos que contienen \alpha-amino
incluyen iminoésteres, como picolinimidato de metilo, fosfato de
piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido
trinitrobencensulfónico, O-metilisourea,
2,4-pentadiona y una reacción catalizada por
transaminasas con glioxilato. Los restos arginilo se modifican
mediante una reacción con uno o varios reactivos convencionales,
entre ellos el fenilglioxal, 2,3-butandiona,
1,2-ciclohexandiona, y ninhidrina. La
derivatización de los restos arginina requiere que la reacción se
realice en condiciones alcalinas, debido al alto pKa del grupo
funcional guanidina.
Además, estos reactivos pueden hacerse
reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo guanidino
de la arginina. Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o
glutamilo) se modifican de manera selectiva mediante una reacción
con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), en
que R y R' son diferentes grupos alquilo, como
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-3-etil)carbodiimida
o
1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilfenil)carbodiimida.
Además, los restos aspartilo y glutamilo se convierten en restos
asparaginilo y glutaminilo mediante una reacción con iones
amonio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha indicado que una conjugación excesiva de
polímeros puede conducir a una pérdida de actividad del polipéptido
al cual está conjugado el polímero. Este problema puede eliminarse,
por ejemplo, mediante la eliminación de los grupos de unión
localizados en el sitio funcional o bloqueando el sitio funcional
antes de la conjugación, de forma que el sitio funcional esté
bloqueado durante la conjugación. Esta última estrategia constituye
otra realización de la invención (la primera estrategia se ha
ejemplificado anteriormente, por ejemplo, mediante la eliminación
de restos lisina, que pueden estar localizados cerca del sitio
funcional). De manera más específica, según la segunda estrategia,
la conjugación entre el polipéptido y el resto no polipeptídico se
realiza bajo condiciones en que el sitio funcional del polipéptido
está bloqueado por una molécula auxiliar capaz de unirse al sitio
funcional del polipéptido.
Preferiblemente, la molécula auxiliar es una que
reconozca específicamente un sitio funcional del polipéptido, como
un receptor, en particular el receptor de G-CSF o
una parte del receptor de G-CSF.
Como alternativa, la molécula auxiliar puede ser
un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal que reconozca
el polipéptido que muestra actividad G-CSF. En
particular, la molécula auxiliar puede ser un anticuerpo monoclonal
neutralizante.
El polipéptido se deja interaccionar con la
molécula auxiliar antes de realizar la conjugación. Esto asegura
que el sitio funcional del polipéptido se oculta o se protege y, en
consecuencia, no resulta disponible para la derivatización por el
resto no polipeptídico, como un polímero. Tras su elución de la
molécula auxiliar, el conjugado entre el resto no polipeptídico y
el polipéptido puede recuperarse con al menos un sitio funcional
parcialmente conservado.
La posterior conjugación del polipéptido que
tiene un sitio funcional bloqueado con un polímero, un compuesto
lipófilo, un resto oligosacárido, un agente derivatizante orgánico o
cualquier otro compuesto se realiza de la forma normal, por
ejemplo, como se describe en las secciones tituladas "Conjugación
con...".
Independientemente de la naturaleza de la
molécula auxiliar que se va a emplear para ocultar el sitio
funcional del polipéptido de la conjugación, resulta deseable que
la molécula auxiliar esté exenta o comprenda sólo unos pocos grupos
de unión para el resto no polipeptídico elegido en una parte o en
partes de la molécula en que la conjugación a dichos grupos
dificulte la desorción del polipéptido conjugado de la molécula
auxiliar. Por este medio, puede obtenerse una conjugación selectiva
a grupos de unión presentes en partes no ocultas del polipéptido y
es posible reutilizar la molécula auxiliar para ciclos repetidos de
conjugación. Por ejemplo, si el resto no polipeptídico es una
molécula polimérica como PEG, que tiene el grupo
épsilon-amino de una lisina o un resto aminoácido
N-terminal como grupo de unión, resulta deseable que
la molécula auxiliar esté sustancialmente exenta de grupos
épsilon-amino conjugables, preferiblemente exenta de
cualquier grupo épsilon-amino. Por consiguiente, en
una realización preferida, la molécula auxiliar es una proteína o un
péptido capaz de unirse al sitio funcional del polipéptido, estando
dicha proteína o péptido exentos de cualquier grupo de unión
conjugable para el resto no polipeptídico elegido.
De particular interés con respecto a la
realización de la presente memoria descriptiva en la que los
conjugados polipeptídicos se preparan a partir de una población
diversificada de secuencias de nucleótidos que codifican un
polipéptido de interés, el bloqueo del grupo funcional se realiza en
placas de microvaloración antes de la conjugación, por ejemplo
colocando el variante del polipéptido expresado en una placa de
microvaloración que contenga un grupo de bloqueo inmovilizado, como
un receptor, un anticuerpo o similares.
En otra realización, la molécula auxiliar
primero se une covalentemente a una fase sólida, tal como materiales
de carga de columnas, por ejemplo Sephadex o esferas de agarosa, o
una superficie, por ejemplo un recipiente de reacción. Después el
polipéptido se carga sobre el material de columna que porta la
molécula auxiliar y la conjugación se realiza según los
procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe
en las secciones anteriores tituladas "Conjugación con...".
Este procedimiento permite separar el conjugado polipeptídico de la
molécula auxiliar mediante elución. El conjugado polipeptídico se
eluye mediante técnicas convencionales bajo condiciones
físico-químicas que no conduzcan a una degración
sustancial del conjugado polipeptídico. La fase fluida que contiene
el conjugado polipeptídico se separa de la fase sólida a la cual
permanece covalentemente unida la molécula auxiliar. La separación
puede lograrse de otras formas: por ejemplo, la molécula auxiliar
puede derivatizarse con una segunda molécula (por ejemplo biotina)
que puede ser reconocida por un ligante específico (por ejemplo
estreptavidina). El ligante específico puede estar unido a la fase
sólida, permitiendo, con ello, la separación del conjugado
polipeptídico del complejo de molécula
auxiliar-segunda molécula haciéndose pasar a través
de una segunda columna en fase sólida de molécula auxiliar que
retendrá, tras la posterior elución, el complejo de molécula
auxiliar-segunda molécula pero no el conjugado
polipeptídico. El conjugado polipeptídico puede liberarse de la
molécula auxiliar de cualquier manera adecuada. La desprotección
puede lograrse proporcionando condiciones en que la molécula
auxiliar se disocie del sitio funcional del G-CSF al
cual está unido. Por ejemplo, puede disociarse un complejo entre un
anticuerpo al cual el polímero está conjugado y un anticuerpo
anti-idiotipo ajustando el pH a un pH ácido o
alcalino.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización alternativa, el polipéptido
se expresa como una proteína de fusión con un marcador, es decir,
una secuencia de aminoácidos o un tramo peptídico formado, de forma
típica, por 1-30, tal como 1-20
restos aminoácidos. Además de permitir una purificación rápida y
fácil, el marcador es una herramienta conveniente para lograr la
conjugación entre el polipéptido marcado y el resto no
polipeptídico. En particular, el marcador puede utilizarse para
lograr la conjugación en placas de microvaloración u otros
vehículos, como esferas paramagnéticas, sobre los cuales puede
inmovilizarse el polipéptido marcado a través del marcador. La
conjugación al polipéptido marcado, por ejemplo en placas de
microvaloración, tiene la ventaja de que el polipéptido marcado
puede inmovilizarse en las placas de microvaloración directamente
desde el caldo de cultivo (en principio sin más purificación) y
someterse a la conjugación. Con ello, el número total de etapas del
proceso (desde la expresión a la conjugación) puede reducirse.
Además, el marcador puede actuar como molécula espaciadora,
asegurando una mejor accesibilidad al polipéptido inmovilizado que
se va a conjugar. La conjugación que emplea una polipéptido marcado
puede realizarse con cualquiera de los restos no polipeptídicos
descritos en la presente, por ejemplo con una molécula polimérica,
como
PEG.
PEG.
La identidad del marcador específico que se va a
utilizar no es crítica, con la condición de que el marcador sea
capaz de ser expresado con el polipéptido y que sea capaz de ser
inmovilizado sobre una superficie o un material vehículo
apropiados. Una serie de marcadores adecuados se encuentran
disponibles en el mercado, por ejemplo en Unizyme Laboratories,
Dinamarca. Por ejemplo, el marcador puede consistir en cualquiera de
las siguientes secuencias:
\vskip1.000000\baselineskip
His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln
\vskip1.000000\baselineskip
o cualquiera de los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
EQKLI SEEDL (un marcador
C-terminal descrito en Mol. Cell. Biol.,
5:3610-3616, 1985)
DYKDDDDK (un marcador C- o
N-terminal)
YPYDVPDYA
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos contra los anteriores marcadores
están disponibles en el mercado, por ejemplo en ADI, Aves Lab and
Research Diagnostics.
Un procedimiento conveniente para utilizar un
polipéptido marcado para la PEGilación se ofrece en la sección de
materiales y procedimientos que aparece a continuación. La posterior
escisión del marcador de polipéptido puede lograrse mediante el uso
de enzimas disponibles en el mercado.
El polipéptido de la presente memoria
descriptiva o la parte polipeptídica de un conjugado de la memoria
descriptiva, opcionalmente en forma glicosilada, puede producirse
mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Estos
procedimientos incluyen construir una secuencia de nucleótidos que
codifique el polipéptido y expresar la secuencia en un hospedante
transformado o transfectado adecuado. Sin embargo, los polipéptidos
de la memoria descriptiva pueden producirse, aunque con menos
eficacia, mediante síntesis química o mediante una combinación de
síntesis química o una combinación de síntesis química y tecnología
de ADN recombinante.
Una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido o la parte polipeptídica de un conjugado de la memoria
descriptiva puede construirse aislando o sintetizando una secuencia
de nucleótidos que codifica el G-CSF de origen, tal
como hG-CSF con la secuencia de aminoácidos que
aparece en SEQ ID NO:1, y después cambiando la secuencia de
nucleótidos para lograr la introducción (es decir, la inserción o la
sustitución) o la deleción (es decir, la eliminación o la
sustitución) del resto o restos aminoácidos pertinentes.
La secuencia de nucleótidos se modifica de forma
conveniente mediante mutagénesis dirigida específica de sitio,
según los procedimientos convencionales. Como alternativa, la
secuencia de nucleótidos se prepara mediante síntesis química, por
ejemplo, utilizando un sintetizador de oligonucleótidos, en que los
oligonucleótidos se diseñan basándose en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido deseado, y preferiblemente seleccionando
aquellos codones preferidos por la célula hospedante en que se va a
producir el polipéptido recombinante. Por ejemplo, pueden
sintetizarse varios oligonucleótidos pequeños que codifican
porciones del polipéptido deseado y montarse mediante PCR,
acoplamiento o reacción en cadena de acoplamiento (LCR) (Barany,
PNAS, 88:189-193, 1991). Los oligonucleótidos
individuales contendrán, de forma típica, proyecciones 5' o 3' para
el montaje complementario.
Están disponibles otros procedimientos de
modificación de secuencias de nucleótidos alternativos para producir
variantes de polipéptidos para una selección de alta capacidad de
procesamiento, por ejemplo procedimientos que implican un
entrecruzamiento homólogo, como los descritos en el documento US
5.093.257, y procedimientos que implican la selección aleatoria de
genes, es decir, la recombinación entre dos o más secuencias de
nucleótidos homólogas que produce nuevas secuencias de nucleótidos
que tienen una serie de alteraciones nucleotídicas comparadas con
las secuencias de nucleótidos de partida. La selección aleatoria de
genes (también conocida como selección aleatoria de ADN) implica
uno o más ciclos de fragmentación y reacoplamiento aleatorios de
secuencias de nucleótidos, seguido de una selección para seleccionar
las secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos con
propiedades deseadas. Para que se produzca una selección aleatoria
de ácidos nucleicos basada en la homología, las partes pertinentes
de las secuencias de nucleótidos son preferiblemente al menos 50%
idénticas, como al menos 60% idénticas, más preferiblemente al menos
70% idénticas, como al menos 80% idénticas. La recombinación puede
realizarse in vitro o in vivo.
Los ejemplos de procedimientos de selección
aleatoria de genes in vitro se describen en Stemmer et
al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, pp.
10747-10751; Stemmer (1994), Nature, vol. 370, pp.
389-391; Smith (1994), Nature, vol. 370, pp.
324-325; Zhao et al., Nat. Biotechnol., marzo
de 1998, 16(3):258-261; Zhao H. y Arnold,
F.B., Nucleic Acids Research, 1997, vol. 25, nº 6, pp.
1307-1308; Shao et al., Nucleic Acids
Research, 1998, 15 de enero, 26(2), pp.
681-683; y el documento WO 95/17413. Un ejemplo de
un procedimiento de selección aleatoria de genes in vivo se
describe en el documento WO 97/07205. Otras técnicas para la
mutagénesis de secuencias de ácidos nucleicos mediante recombinación
in vitro o in vivo se describen, por ejemplo, en los
documentos WO 97/20078 y US 5.837.458. Los ejemplos de técnicas de
selección aleatoria de genes específicas incluyen la "selección
aleatoria de genes de familias", la "selección aleatoria de
genes sintética" y la "selección aleatoria de genes in
silico". La selección aleatoria de genes de familias implica
someter a una familia de genes homólogos procedentes de diferentes
especies a uno o más ciclos de selección aleatoria de genes y la
posterior selección. Las técnicas de selección aleatoria de genes de
familias se describen, por ejem, en Crameri et al. (1998),
Nature, vol. 391, pp. 288-291; Christians et
al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, pp.
259-264; Chang et al. (1999), Nature
Biotechnology, vol. 17, pp. 793-797; y Ness et
al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17,
893-896. La selección aleatoria de genes sintética
implica proporcionar bancos de oligonucleótidos sintéticos
solapantes basados, por ejemplo, en el alineamiento de las
secuencias de genes homólogos de interés. Los oligonucleótidos
generados de forma sintética se recombinan y las secuencias de
ácidos nucleicos recombinantes resultantes se seleccionan y, si se
desea, se emplean para posteriores ciclos de selección aleatoria de
genes. Las técnicas de selección aleatoria de genes sintéticas se
describen en el documento WO 00/42561. La selección aleatoria de
genes in silico se refiere a una procedimiento de selección
aleatoria de ADN que se realiza o se forma un modelo utilizando un
sistema informático, evitando con ello parcial o totalmente la
necesidad de manipular físicamente ácidos nucleicos. Las técnicas
para la selección aleatoria de genes in silico se describen
en el documento WO 00/42560.
Cuando se han emsamblado (mediante síntesis,
mutagénesis dirigida específica de sitio u otro procedimiento), la
secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido se inserta en
un vector recombinante y se une operablemente a las secuencias
control necesarias para la expresión del G-CSF en la
célula hospedante transformada deseada.
Por supuesto, debe entenderse que no todos los
vectores y secuencias de control de la expresión funcionan
igualmente bien para expresar la secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido descrito en la presente. Tampoco todos los
hospedantes funcionan igual de bien con el mismo sistema de
expresión. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden hacer una
selección entre estos vectores, secuencias de control de la
expresión y hospedantes sin experimentación indebida. Por ejemplo,
cuando se va a seleccionar un vector, debe considerarse el
hospedante porque el vector debe replicarse en él o ser capaz de
integrarlo en el cromosoma. También debe considerarse el número de
copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias,
y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector,
como los marcadores de antibióticos. Cuando se va a seleccionar una
secuencia de control de la expresión también debe considerarse una
diversidad de factores. Éstos incluyen, por ejemplo, la fuerza
relativa de la secuencia, su controlabilidad y su compatibilidad con
las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido, en
particular con respecto a las estructuras secundarias potenciales.
Los hospedantes deben seleccionarse considerando su compatibilidad
con el vector elegido, la toxicidad del producto codificado por la
secuencia de nucleótidos, sus características de secreción, su
capacidad para plegar correctamente el polipéptido, sus
requerimientos de fermentación o cultivo, y la facilidad de
purificación de los productos codificados por la secuencia de
nucleótidos.
El vector recombinante puede ser un vector de
replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una
entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Como alternativa,
el vector será aquel que, cuando se introduce en una célula
hospedante, se integra en el genoma de la célula hospedante y se
replica junto con el o los cromosomas en que se ha integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión en que la secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido de la invención está unida operablemente a otros
segmentos requeridos para la transcripción de la secuencia de
nucleótidos. El vector se deriva, de forma típica, de ADN plasmídico
o vírico. Una serie de vectores de expresión adecuados para la
expresión en las células hospedantes mencionadas en la presente
están disponibles en el mercado o se describen en la bibliografía.
Los vectores de expresión útiles para los hospedantes eucariotas
incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control
de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y
citomegalovirus. Los vectores específicos son, por ejemplo,
pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU) y pCIneo
(Stratagene, La Jolla, CA, EEUU). Los vectores de expresión útiles
para células de levadura incluyen el plásmido 2\mu y sus
derivados, el vector POT1 (documento US 4.931.373), el vector
pJSO37 descrito en Okkels, Ann. New York Acad. Sci., 782,
202-207, 1996, y pPICZ A, B o C (Invitrogen). Los
vectores útiles para células de insecto incluyen pVL941, pBG311
(Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for
Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In
Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-698 (1986),
pBluebac 4.5 y pMelbac (ambos disponibles en Invitrogen). Los
vectores de expresión útiles para hospedantes bacterianos incluyen
plásmidos bacterianos conocidos, como los plásmidos procedentes de
E. coli, incluyendo pBR322, pET3a y pET12a (ambos de Novagen
Inc., WI, EEUU), plásmidos con una gama de hospedantes más amplia,
como RP4, ADN de fagos, por ejemplo los numerosos derivados del fago
lambda, por ejemplo NM989, y otros fagos de ADN, como M13 y los
fagos de ADN monocatenario filamentosos.
Otros vectores que pueden utilizarse en esta
invención incluyen aquellos que permiten que la secuencia de
nucleótidos que codifica el polipéptido pueda amplificarse en número
de copias. Estos vectores amplificables son muy conocidos en la
técnica. Incluyen, por ejemplo, vectores capaces de ser amplificados
mediante amplificación de DHFR (véase, por ejemplo, Kaufman,
patente de EEUU nº 4.470.461, Kaufman y Sharp, "Construction Of A
Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals
Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp.
1304-1319 (1982)) y la amplificación de glutamina
sintetasa ("GS") (véanse, por ejemplo, los documentos US
5.122.464 y EP 338.841).
El vector recombinante puede comprender también
una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la
célula hospedante en cuestión. Un ejemplo de dicha secuencia (cuando
la célula hospedante es una célula de mamífero) es el origen de la
replicación de SV40. Cuando la célula hospedante es una célula de
levadura, las secuencias adecuadas que permiten replicarse al
vector son el origen de la replicación REP 1-3 y los
genes de replicación del plásmido 2\mu de levaduras.
El vector también puede comprender un marcador
seleccionable, por ejemplo un gen cuyo producto complementa un
defecto en la célula hospedante, como el gen que codifica la
dihidrofolato reductasa (DHFR) o el gen TPI de
Schizosaccharomyces pombe (descrito por P.R. Russell, Gene,
40, 1985, pp. 125-130), o uno que confiera
resistencia a un fármaco, por ejemplo ampicilina, kanamicina,
tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato.
Para Saccharomyces cerevisiae, los marcadores seleccionables
incluyen ura3 y leu2. Para hongos filamentosos, los
marcadores seleccionables incluyen amdS, pyrG, arcB, niaD y
sC.
La expresión "secuencias de control" en la
presente incluye todos los componentes que son necesarios o
ventajosos para la expresión del polipéptido descrito en la
presente. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para
la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Estas
secuencias de control incluyen, pero no se limitan a una secuencia
conductora, una secuencia de poliadenilacion, una secuencia de
propéptido, un promotor, un potenciador o una secuencia activadora
cadena arriba, una secuencia de péptido señal, y un terminador de
la transcripción. Como mínimo las secuencias de control incluyen un
promotor.
Puede emplearse una amplia variedad de
secuencias de control de la expresión en la presente memoria
descriptiva. Estas secuencias de control de la expresión útiles
incluyen las secuencias de control de la expresión asociadas con
genes estructurales de los vectores de expresión extraños, así como
cualquier secuencia conocida que controle la expresión de genes de
células procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas
combinaciones de éstas.
Los ejemplos de secuencias de control adecuadas
para dirigir la transcripción en células de mamífero incluyen los
promotores temprano y tardío de SV40 y adenovirus, por ejemplo el
promotor tardío principal 2 de adenovirus, el promotor de
MT-1 (gen de metalotioneína), el promotor del gen
inmediato-temprano del citomegalovirus humano
(CMV), el promotor del factor de alargamiento 1\alpha humano
(EF-1\alpha), el promotor de la proteína 70 de
choque térmico mínimo de Drosophila, el promotor del virus
del sarcoma de Rous (RSV), el promotor de la ubiquitina C humano
(UbC), el terminador de la hormona del crecimiento humana, las
señales de poliadenilación de la región E1b de SV40 o adenovirus, y
la secuencia consenso de Kozak (Kozak, M., J. Mol. Biol., 1987, 20
de agosto, 196(4):947-950).
Para mejorar la expresión en células de mamífero
puede insertarse un intrón sintético en la región 5' no traducida
de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Un
ejemplo de un intrón sintético es el intrón sintético del plásmido
pCI-Neo (disponible en Promega Corporation, WI,
EEUU).
Los ejemplos de secuencias de control adecuadas
para dirigir la transcripción en células de insecto incluyen el
promotor de polihedrina, el promotor de P10, el promotor de la
proteína básica del virus de la polihedrosis Autographa
californica, el promotor del gen
inmediato-temprano 1 de baculovirus, el promotor del
gen retrasado-temprano 39K de baculovirus, y la
secuencia de poliadenilación de SV40. Los ejemplos de secuencias de
control adecuadas para su uso en células hospedantes de levadura
incluyen los promotores del sistema de
\alpha-apareamiento de levaduras, el promotor de
la triosa fosfato isomerasa de levaduras (TPI), promotores de genes
glicolíticos o genes de alcohol deshidrogenasa de levaduras, el
promotor ADH2-4c, y el promotor GAL inducible. Los
ejemplos de secuencias de control adecuadas para su uso en células
hospedantes de hongos filamentosis incluyen el promotor y
terminador de ADH3, un promotor derivado de los genes que codifican
la proteasa alcalina o la amilasa triosa fosfato isomerasa TAKA de
Aspergillus oryzae, una \alpha-amilasa de
A. niger, glucoamilasa de A. niger o A.
nidulans, acetamidasa de A. nidulans, lipasa o proteinasa
aspártica de Rhizomucor miehei, el terminador de TPI1 y el
terminador de ADH3. Los ejemplos de secuencias de control adecuadas
para su uso en células hospedantes bacterianas incluyen promotores
del sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o
TRC, y las regiones promotoras principales del fago
lambda.
La presencia o ausencia de un péptido señal
dependerá, por ejemplo, de la célula hospedante de expresión
utilizada para la producción del polipéptido que se va a expresar
(si es un polipéptido intracelular o extracelular), y si resulta
deseable obtener secreción. Para un uso en hongos filamentosos, el
péptido señal puede derivarse de modo conveniente de un gen que
codifique una amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp. un
gen que codifique una lipasa o proteasa de Rhizomucor
miehei, o un lipasa de Humicola lanuginosa. El péptido
señal se deriva preferiblemente de un gen que codifica la amilasa
TAKA de A. oryzae, una \alpha-amilasa
neutra de A. niger, una amilasa estable frente a ácidos de
A. niger, o glucoamilasa de A. niger. Para un uso en
células de insecto, el péptido señal puede derivarse de forma
conveniente de un gen de insecto (cf. documento WO 90/05783), como
el precursor de la hormona adipocinética de Lepidopteran manduca
sexta (cf. documento US 5.023.328), la melitina de la abeja
(Invitrogen), la ecdiesteroide UDPglucosiltransferasa (egt) (Murphy
et al., Protein Expression and Purification, 4,
349-357 (1993)) o la lipasa pancreática humana (hpl)
(Methods in Enzymology, 284, pp. 262-272, 1997). Un
péptido señal preferido para su uso en células de mamífero es el
del hG-CSF o el péptido señal de la cadena ligera
kappa de Ig murina (Coloma, M. (1992), J. Imm. Methods,
152:89-104). Para un uso en células de levadura, se
ha descubierto que los péptidos señal adecuados son el péptido
señal del factor \alpha de S. cerevisiae (cf. documento US
4.870.008), un péptido señal de carboxipeptidasa modificada (cf.
L.A. Valls et al., Cell, 48, 1987, pp.
887-897), el péptido señal BAR1 de levaduras (cf.
documento WO 87/02670), el péptido señal de la aspártico proteasa 3
de levaduras (YAP3) (cf. M. Egel-Mitani et
al., Yeast, 6, 1990, pp. 127-137), y la
secuencia conductora sintética de TA57 (documento WO 98/32867). Para
un uso en células de E. coli, se ha descubierto que un
péptido señal adecuado es el péptido señal ompA.
La secuencia de nucleótidos de la memoria
descriptiva que codifica un polipéptido que muestra actividad
G-CSF, preparado mediante mutagénesis dirigida
específica de sitio, síntesis, PCR u otros procedimientos, puede
incluir también opcionalmente una secuencia de nucleótidos que
codifica un péptido señal. El péptido señal está presente cuando el
polipéptido va a ser segregado desde las células en que se expresa.
Este péptido señal, si está presente, debe ser reconocido por la
célula elegida para la expresión del polipéptido. El péptido señal
puede ser homólogo (por ejemplo, el que está asociado normalmente
con hG-CSF) o heterólogo (es decir, se origina de
otra fuente distinta de hG-CSF) con el polipéptido,
o puede ser homólogo o heterólogo con la célula hospedante, es
decir, es un péptido señal que normalmente se expresa desde la
célula hospedante o que normalmente no se expresa desde la célula
hospedante. Por consiguiente, el péptido señal puede ser procariota,
por ejemplo derivado de una bacteria, como E. coli, o
eucariota, por ejemplo derivado de un mamífero, o de una célula de
insecto o levadura.
Puede utilizarse cualquier hospedante adecuado
para producir el polipéptido o la parte polipeptídica del conjugado
de la memoria descriptiva, incluyendo células o líneas celulares
bacterianas, fúngicas (incluyendo levaduras), vegetales, de
insecto, de mamífero u otras células o líneas celulares animales
apropiadas, así como animales o plantas transgénicas. Los ejemplos
de células hospedantes bacterianas incluyen bacterias
gram-positivas, como cepas de Bacillus, por
ejemplo B. brevis o B. subtilis, Pseudomonas o
Streptomyces, o bacterias gram-negativas,
como cepas de E. coli. La introducción de un vector en una
célula hospedante bacteriana puede realizarse, por ejemplo,
mediante transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang
y Cohen, 1979, Molecular General Genetics, 168:
111-115), utilizando células competentes (véase, por
ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology,
81:823-829, o Dubnau y
Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular
Biology, 56:209-221), electroporación (véase, por
ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques,
6:742-751), o conjugación (véase, por ejemplo,
Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology, 169:
5771-5278). Los ejemplos de células hospedantes de
hongos filamentosos adecuados incluyen cepas de Aspergillus,
por ejemplo A. oryzae, A. niger, o A. nidulans,
Fusarium o Trichoderma. Las células fúngicas pueden
transformarse mediante un proceso que implica la formación de
protoplastos, la transformación de los protoplastos, y la
regeneración de la pared celular de una manera conocida per
se. Los procedimientos adecuados para la transformación de
células hospedantes de Aspergillus se describen en los
documentos EP 238.023 y US 5.679.543. Los procedimientos adecuados
para transformar especies de Fusarium se describen en
Malardier et al., 1989, Gene, 78:147-156, y
el documento WO 96/00787. Los ejemplos de células hospedantes de
levaduras adecuadas incluyen cepas de Saccharomyces, por
ejemplo S. cerevisiae, Schizosaccharomyces,
Klyveromyces, Pichia, como P. pastoris o P.
methanolica, Hansenula, como H. polymorpha o
Yarrowia. Las levaduras pueden transformarse utilizando los
procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y
Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular
Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, pp.
182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et
al., 1983, Journal of Bacteriology, 153:163; Hinnen et
al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
75:1920; y como se describe por Clontech Laboratories, Inc, Palo
Alto, CA, EEUU (en el protocolo del producto para el kit de sistema
de transformación de levaduras Yeastmaker^{TM}). Los ejemplos de
células hospedantes de insecto apropiadas incluyen una línea
celular de Lepidoptora, como Spodoptera frugiperda
(Sf9 o Sf21) o células de Trichoplusioa ni (High Five)
(documento US 5.077.214). La transformación de células de insecto y
la producción de polipéptidos heterólogos en su interior puede
realizarse como describe Invitrogen. Los ejemplos de células
hospedantes de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares de
ovario de hámster chino (CHO), (por ejemplo, CHO-K1;
ATCC CCL-61), líneas celulares de mono verde (COS)
(por ejemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC
CRL-1651)); células de ratón (por ejemplo, NS/O),
líneas celulares de riñón de cría de hámster (BHK) (por ejemplo,
ATCC CRL-1632 o ATCC CCL-10), y
células humanas (por ejemplo, HEK 293 (ATCC
CRL-1573)), así como células vegetales en cultivo
de tejidos. Otras líneas celulares adecuadas son conocidas en la
técnica y están disponibles en depósitos públicos como la American
Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Los procedimientos
para introducir ADN exógeno en células hospedantes de mamífero
incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio, la
electroporación, la transfección mediada por
DEAE-dextrano, la transfercción mediada por
liposomas, los vectores víricos, y el procedimiento de transfección
descrito por Life Technologies Ltd, Paisley, Reino Unido,
utilizando Lipofectamin 2000. Estos procedimientos son muy conocidos
en la técnica y son descritos, por ejemplo, por Ausbel et
al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, Nueva York, EEUU. El cultivo de células de
mamífero se realiza según procedimientos establecidos, por ejemplo,
como se descibe en Animal Cell Biotechnology, Methods and
Protocols, editado por Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc.,
Totowa, Nueva Jersey, EEUU, y Harrison, M.A. y Rae, I.F., General
Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).
En los procedimientos de producción de la
presente memoria descriptiva, las células se cultivan en un medio
nutriente adecuado para la producción del polipéptido utilizando
procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células
pueden cultivarse mediante un cultivo en matraz de agitación, una
fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo las
fermentaciones continua, discontinua, semidiscontinua o en estado
sólido) en el laboratorio o en fermentadores industriales,
realizado en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que
el polipéptido se exprese y/o se aisle. El cultivo tiene lugar en un
medio nutriente adecuado que comprenda fuentes de carbono y de
nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos
en la técnica. Los medios adecuados están disponibles en
suministradores comerciales o pueden prepararse según composiciones
publicadas (por ejemplo, en los catálogos de la American Type
Culture Collection). Si el polipéptido se segrega hacia el medio
nutriente, el polipéptido puede recuperarse directamente del medio.
Si el polipéptido no se segrega, puede recuperarse a partir de
lisados celulares.
El polipéptido resultante puede recuperarse
mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el
polipéptido puede recuperarse a partir del medio nutriente mediante
procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a
centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización,
evaporación o precipitación.
Los polipéptidos pueden purificarse mediante una
diversidad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen,
pero no se limitan a cromatografía (por ejemplo, de intercambio
iónico, de afinidad, hidrófoba, de cromatoenfoque y de exclusión
molecular), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque
isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo
precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE, o
extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson
y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989). Los
procedimientos específicos para purificar polipéptidos que muestran
actividad G-CSF son descritos por D. Metcalf y N.A.
Nicola en The hemopoietic colony-stimulating
factors, p. 50-51, Cambridge University Press
(1995), por C.S. Bae et al., Appl. Microbiol. Biotechnol,
52:338-344 (1999), y en el documento US
4.810.643.
En otro aspecto, la presente memoria descriptiva
comprende una composición que comprende un polipéptido o conjugado
según se describe en la presente, y al menos un vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable.
El polipéptido, el conjugado o la composición
farmacéutica según la memoria descriptiva puede utilizarse para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades,
en particular para la prevención de las infecciones en pacientes
con cáncer que están sometidos a ciertos tipos de quimioterapias,
terapias de radiación y transplantes de médula ósea, la
movilización de células progenitoras para su recolección en sangre
periférica para el transplante de células progenitoras, el
tratamiento de la leucopenia relativa o crónica grave, el
tratamiento de pacientes con leucemia mieloide aguda, el tratamiento
del SIDA u otras enfermedades de inmunodeficiencia, y para la
terapia antifúngica. en particular para el tratamiento de la
candidiasis sistémica o invasiva.
En otro aspecto, el polipéptido, el conjugado o
la composición farmacéutica según la memoria descriptiva se emplea
en un procedimiento para tratar un mamífero que tenga un trastorno
hematopoyético general, incluyendo los que surgen de terapias de
radiación o de quimioterapias, en particular la leucopenia, SIDA u
otras enfermedades de inmunodeficiencia, que comprende administrar
a un mamífero que lo necesite dicho polipéptido, conjugado o
composición farmacéutica.
Los polipéptidos y los conjugados de la memoria
descriptiva se administrarán a los pacientes a una dosis
"terapéuticamente eficaz", es decir, una dosis que es
suficiente para producir los efectos deseados con relación al
trastorno para el cual se administra. La dosis exacta dependerá del
trastorno que se va a tratar, y puede ser determinada por los
expertos en la técnica utilizando técnicas conocidas. Los
polipéptidos o los conjugados de la invención pueden administrarse,
por ejemplo, a una dosis similar a la empleada en una terapia con
rhG-CSF, como Neupogen®. Se contempla que una dosis
adecuada de un conjugado de la invención esté en el intervalo de
aproximadamente 5-300 microgramos/kg de peso
corporal (basándose en el peso de la parte proteica del conjugado),
por ejemplo, 10-200 microgramos/kg, tal como
25-100 microgramos/kg. Será evidente para los
expertos en la técnica que una cantidad eficaz de un polipéptido,
un conjugado o una composición de la invención depende, entre otros,
de la enfermedad, la dosis, el programa de administración, si el
polipéptido, el conjugado o la composición se administran solos o
junto con otros agentes terapéuticos, la semivida en suero de las
composiciones, la salud general del paciente, y la frecuencia de
administración. Preferiblemente, el polipéptido, el conjugado, la
preparación o la composición de la memoria descriptiva se administra
a una dosis eficaz, en particular a una dosis que sea suficiente
para normalizar el número de leucocitos, en particular de
neutrófilos, en el paciente en cuestión. La normalización del
número de leucocitos puede determinarse simplemente contando el
número de leucocitos a intervalos regulares según la práctica
establecida.
El polipéptido o el conjugado de la memoria
descriptiva se administra preferiblemente en una composición que
incluya uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente
aceptables. El polipéptido o el conjugado puede formularse en
composiciones farmacéuticas de una manera conocida per se en
la técnica para dar como resultado un producto farmacéutico de
polipéptido que sea suficientemente estable para su almacenamiento y
que sea adecuado para la administración a seres humanos o animales.
La composición farmacéutica puede formularse en una diversidad de
formas, incluyendo como un líquido o un gel, o puede liofilizarse, o
puede formularse en cualquier otra forma adecuada. La forma
preferida dependerá de la indicación concreta que se esté tratando y
será evidente para los expertos en la técnica.
Por consiguiente, esta memoria descriptiva
proporciona composiciones y procedimientos para tratar diversas
formas de leucopenia. En particular, el polipéptido, el conjugado o
la composición puede utilizarse para prevenir las infecciones en
pacientes con cáncer que están sometidos a ciertos tipos de terapias
de radiación, quimioterapias y transplantes de médula ósea, para
movilizar células progenitoras para su recolección en sangre
periférica para transplantes de células progenitoras, para el
tratamiento de la leucopenia relativa o crónica grave, y para
apoyar el tratamiento de pacientes con leucemia mieloide aguda.
Además, el polipéptido, el conjugado o la composición puede
utilizarse para el tratamiento del SIDA u otras enfermedades de
inmunodeficiencia, y para la terapia antifúngica, en particular
para el tratamiento de la candidiasis sistémica o invasiva, y para
el tratamiento de infecciones bacterianas.
El polipéptido o el conjugado de la memoria
descriptiva puede utilizarse "como está" y/o en su forma
salina. Las sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a sales
con metales alcalinos o metales alcalinotérreos, como sodio,
potasio, calcio y magnesio, así como, por ejemplo, sales de cinc.
Estas sales o complejos pueden estar presentes como una estructura
cristalina y/o amorfa.
"Farmacéuticamente aceptable" significa un
vehículo o excipiente que, en las dosificaciones y las
concentraciones empleadas, no provoca ningún efecto adverso a los
pacientes a quienes se administra. Estos vehículos y excipientes
farmacéuticamente aceptables son muy conocidos en la técnica (véase,
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A. R. Gennaro,
ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation
Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard,
eds., Taylor & Francis [2000]; y Handbook of Pharmaceutical
Excipients, 3ª, A. Kibbe, ed., Pharmaceutical Press [2000]).
La composición farmacéutica de la memoria
descriptiva puede administrase sola o junto con otros agentes
terapéuticos. Estos agentes pueden incorporarse como parte de la
misma composición farmacéutica o pueden administrarse por separado
del polipéptido o del conjugado de la memoria descriptiva, al mismo
tiempo o de acuerdo con otro programa de tratamiento. Además, el
polipéptido, el conjugado o la composición farmacéutica de la
memoria descriptiva puede utilizarse como adyuvante para otras
terapias.
Un "paciente" para los fines de la presente
memoria descriptiva incluye seres humanos y otros mamíferos. Por
tanto, los procedimientos son aplicables a aplicaciones de terapias
humanas y veterinarias.
La administración de las formulaciones de la
presente memoria descriptiva pueden realizarse de una diversidad de
maneras, incluyendo, pero sin limitarse a por vía oral, subcutánea,
intravenosa, intracerebral, intranasal, transdérmica,
intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal,
intraocular o de cualquier otra manera aceptable. Las formulaciones
pueden administrarse de forma continua mediante infusión, aunque una
inyección en embolada es aceptable, utilizando técnicas muy
conocidas en la técnica.
Un ejemplo de una composición farmacéutica es
una disolución diseñada para la administración parenteral. Aunque
en muchos casos las formulaciones en disolución farmacéuticas se
proporcionan en forma líquida, apropiada para un uso inmediato,
estas formulaciones parenterales también pueden proporcionarse en
forma congelada o liofilizada. En el primer caso, la composición
debe descongelarse antes de su uso. La última forma a menudo se
utiliza para potenciar la estabilidad del compuesto activo contenido
en la composición bajo una amplia variedad de condiciones de
almacenamiento puesto que, como reconocen los expertos en la
técnica, las preparaciones liofilizadas son en general más estables
que sus homólogas líquidas. Estas preparaciones liofilizadas se
reconstituyen antes de su uso mediante la adición de uno o más
diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados, como agua
estéril para inyección o disolución salina fisiológica estéril.
En el caso de los productos parenterales, se
preparan para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o
disoluciones acuosas mezclando, según sea apropiado, el polipéptido
con el grado deseado de pureza con uno o más vehículos, excipientes
o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que se emplean de
forma típica en la técnica (todos los cuales se denominan
"excipientes"), por ejemplo agentes tamponantes, agentes
estabilizantes, conservantes, isotónicos, detergentes no iónicos,
antioxidantes y/u otro aditivos variados.
Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH
en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas.
Están presentes, de forma típica, a una concentración que varía de
aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los agentes
tamponantes adecuados para su uso con la presente invención incluyen
ácidos orgánicos e inorgánicos y sus sales, como tampones citrato
(por de una mezcla de citrato de monosodio-citrato
de disodio, una mezcla de ácido cítrico-citrato de
trisodio, una mezcla de ácido cítrico-citrato de
monosodio, etc.), tampones succinato (por ejemplo, una mezcla de
ácido succínico-succinato de monosodio, una mezcla
de ácido succínico-hidróxido de sodio, una mezcla
de ácido succínico-succinato de disodio, etc.),
tampones tartrato (por ejemplo, una mezcla de ácido
tartárico-tartrato de sodio, una mezcla de ácido
tartárico-tartrato de potasio, una mezcla de ácido
tartárico-hidróxido de sodio, etc.), tampones
fumarato (por ejemplo, una mezcla de ácido
fumárico-fumarato de monosodio, una mezcla de ácido
fumárico-fumarato de disodio, una mezcla de fumarato
de monosodio-fumarato de disodio, etc.), tampones
gluconato (por ejemplo, una mezcla de ácido
glucónico-gliconato de sodio, una mezcla de ácido
glucónico-hidróxido de sodio, una mezcla de ácido
glucónico-gliconato de potasio, etc.), tampones
oxalato (por ejemplo, una mezcla de ácido
oxálico-oxalato de sodio, una mezcla de ácido
oxálico-hidróxido de sodio, una mezcla de ácido
oxálico-oxalato de potasio, etc.), tampones lactato
(por ejemplo, una mezcla de ácido láctico-lactato
de sodio, una mezcla de ácido láctico-hidróxido de
sodio, una mezcla de ácido láctico-lactato de
potasio, etc.) y tampones acetato (por ejemplo, una mezcla de ácido
acético-acetato de sodio, una mezcla de ácido
acético-hidróxido de sodio, etc.). Otras
posibilidades son tampones fosfatos, tampones histidina y sales de
trimetilamina, como Tris.
Se añaden conservantes para retrasar el
crecimiento microbiano y se añaden, de forma típica, en cantidades
de aproximadamente 0,2%-1% (p/v). Los conservantes adecuados para su
uso con la presente memoria descriptiva incluyen fenol, alcohol
bencílico, meta-cresol, metilparabeno,
propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de
benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro o yoduro de benzalconio),
cloruro de hexametonio, alquilparabenos como metil- o
propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y
3-pentanol.
Se añaden isotónicos para asegurar la
isotonicidad de las composiciones líquidas e incluyen alcoholes de
azúcares polihidroxílicos, preferiblemente alcoholes de azúcares
trihidroxílicos o superiores, como glicerina, eritritol, arabitol,
xilitol, sorbitol y manitol. Los alcoholes polihidroxílicos pueden
estar presentes en una cantidad entre 0,1% y 25% en peso, de forma
típica de 1% a 5%, tomando en consideración las cantidad relativas
de los otros ingredientes.
Los estabilizantes se refieren a una amplia
categoría de excipientes que pueden variar en función desde un
agente de relleno hasta un aditivo que solubilice el agente
terapéutico o que ayude a prevenir la desnaturalización o la
adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos
pueden ser alcoholes de azúcares polihidroxílicos (enumerados
previamente); aminoácidos, como arginina, lisina, glicina,
glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina,
L-leucina, 2-fenilalanina, ácido
glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de
azúcares, como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol,
xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares,
incluyendo ciclitoles, como inositol; polietilenglicol; polímeros de
aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, como urea,
glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol,
\alpha-monotioglicerol y tiosulfato de sodio;
polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 restos);
proteína, como albúmina de suero humana, albúmina de suero bovina,
gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como
polivinilpirrolidona; monosacáridos, como xilosa, manosa, fructosa
y glucosa; disacáridos, como lactosa, maltosa y sacarosa;
trisacáridos, como rafinosa, y polisacáridos, como dextrano. Los
estabilizantes están presentes, de forma típica, en el intervalo de
0,1 a 10.000 partes en peso basándose en el peso de la proteína
activa.
Pueden estar presentes tensioactivos no iónicos
o detergentes (también denominados "agentes humectantes") para
ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger
el polipéptido terapéutico frente a la agregación inducida por la
agitación, que también permiten que la formulación se exponga a un
estrés de cizallamiento superficial sin provocar la
desnaturalización del polipéptido. Los tensioactivos no iónicos
adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184,
188, etc.), polioles Pluronic®, polioxietileno sorbitán monoéteres
(Tween®-20, Tween®-80, etc.).
Otros excipientes variados incluyen agentes de
relleno o cargas (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por
ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico,
metionina, vitamina E) y codisolventes.
El ingrediente activo también puede estar
atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas
de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo
microcápsulas de hidroximetilcelulosa, gelatina o
poli(metacrilato de metilo), en sistemas de administración de
fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de
albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en
macroemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences, supra.
Las formulaciones parenterales para ser
utilizadas para la administración in vivo deben ser
estériles. Esto se logra con facilidad, por ejemplo, mediante una
filtración a través de membranas de filtración estériles.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos adecuados de preparaciones de
liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros
hidrófobos sólidos que contengan el polipéptido o el conjugado,
teniendo las matrices una forma adecuada, como una película o
microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida
incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o
poli(alcohol vinílico)), polilactidas, copolímeros de ácido
L-glutámico y L-glutamato de etilo,
acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido
láctico-ácido glicólico degradables, como la tecnología ProLease® o
Lupron Depot® (microesferas inyectables compuestas de copolímeros
de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Aunque los polímeros como el acetato de etilenvinilo y ácido
láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante
largos periodos, como de hasta 100 días o más, ciertos hidrogeles
liberan las proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando
los polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un
largo tiempo pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de
la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida
en la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad.
Pueden diseñarse estrategias razonables para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre
que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces
S-S intermoleculares a través de intercambios
tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse
modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando a partir de
disoluciones ácidas, controlando el contenido en humedad,
utilizando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de
matrices poliméricas específicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las formulaciones adecuadas para su uso con un
nebulizador, a chorro o ultrasónico, comprenden, de forma típica,
el polipéptido o el conjugado disuelto en agua a una concentración,
por ejemplo, de aproximadamente 0,01 a 25 mg de conjugado por ml de
disolución, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 10 mg/ml. La
formulación también puede incluir un tampón y un azúcar sencillo
(por ejemplo, para la estabilización de las proteínas y la
regulación de la presión osmótica) y/o albúmina de suero humana con
una concentración que varía de 0,1 a 10 mg/ml. Los ejemplos de
tampones que pueden utilizarse son acetato de sodio, citrato y
glicina. Preferiblemente, el tampón tendrá una composición y una
molaridad adecuadas para ajustar la disolución a un pH en el
intervalo de 3 a 9. En general, unas molaridades del tampón de 1 mM
a 50 mM son adecuadas para este fin. Los ejemplos de azúcares que
pueden utilizarse son lactosa, maltosa, manitol, sorbitol, trehalosa
y xilosa, normalmente en unas cantidades que varían del 1% al 4% en
peso de la formulación.
La formulación en nebulizador también puede
contener un tensioactivo para reducir o prevenir la agregación,
inducida por superficies, de la proteína provocada por la
atomización de la disolución cuando se forma el aerosol. Pueden
emplearse diversos tensioactivos convencionales, como alcoholes y
ésteres de ácidos grasos de polioxietileno, y ésteres de ácidos
grasos de polioxietilensorbitán. Las cantidades variarán, en
general, entre 0,001% y 4% en peso de la formulación. Un
tensioactivo especialmente preferido para los fines de esta memoria
descriptiva es el monooleato de polioxietilensorbitán.
Se describen formulaciones específicas y
procedimientos para generar dispersiones adecuadas de partículas
líquidas de la invención en los documentos WO 94/20069, US
5.915.378, US 5.960.792, US 5.957.124, US 5.934.272, US 5.915.378,
US 5.855.564, US 5.826.570 y US 5.522.385.
Las formulaciones para su uso con un dispositivo
inhalador dosimétrico comprenderán, en general, un polvo finamente
dividido. Este polvo puede producirse mediante liofilización y
después trituración de una formulación del conjugado líquida y
también pueden contener un estabilizante, como albúmina de suero
humana (HSA). De forma típica, se añade más del 0,5% (p/p) de HSA.
Además pueden añadirse uno o más azúcares o alcoholes de azúcares a
la preparación si es necesario. Los ejemplos incluyen lactosa,
maltosa, manitol, sorbitol, sorbitosa, trehalosa, xilitol y xilosa.
La cantidad añadida a la formulación puede variar de aproximadamente
0,01 al 200% (p/p), preferiblemente de aproximadamente 1% al 50%
del conjugado presente. Estas formulaciones entonces se liofilizan
y se trituran hasta el tamaño de partícula deseado.
Las partículas con un tamaño apropiado entonces
se suspenden en un propelente con la ayuda de un tensioactivo. El
propelente puede ser cualquier material convencional empleado para
este fin, como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono,
un hidrofluorocarbono o un hidrocarbono, incluyendo
triclorofluorometano, diclorodifluorometano,
diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano
o sus combinaciones. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato
de sorbitán y lecitina de soja. El ácido oleicto también puede ser
útil como tensioactivo. Esta mezcla entonces se carga en el
dispositivo de administración. Un ejemplo de un inhalador
dosimétrico disponible en el mercado adecuado para su uso en la
presente invención es el inhalador dosimétrico Ventolin, fabricado
por Glaxo, Inc., Research Triangle Park, N.C.
Las formulaciones para inhaladores de polvos
comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el
conjugado y también pueden incluir un agente de relleno, como
lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol, en cantidades que faciliten
la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo del 50% al
90% en peso de la formulación. Las partículas del polvo tendrán
unas propiedades aerodinámicas en el pulmón que se corresponden con
partículas con una densidad de aproximadamente 1 g/cm^{2}, con un
diámetro medio menor que 10 micrómetros, preferiblemente entre 0,5
y 5 micrómetros, lo más preferiblemente entre 1,5 y 3,5 micrómetros.
Un ejemplo de un inhalador de polvos adecuado para su uso según las
indicaciones de la presente es el inhalador de polvos Spinhaler,
fabricado por Fisons Corp., Bedford, Mass.
Los polvos para estos dispositivos pueden
generarse y/o administrarse mediante los procedimientos descritos
en los documentos US 5.997.848, US 5.993.783, US 5.985.248, US
5.976.574, US 5.922.354, US 5.785.049 y US 5.654.007.
Los dispositivos mecánicos diseñados para la
administración pulmonar de productos terapéuticos incluyen, pero no
se limitan a nebulizadores, inhaladores dosimétricos e inhaladores
de polvos, todos los cuales son familiares para los expertos en la
técnica. Los ejemplos específicos de dispositivos disponibles en el
mercado adecuados para la práctica de esta invención son el
nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis,
Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical
Products, Englewood, Colorado; el inhalador dosimétrico Ventolin,
fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del
Norte; el inhalador de polvos Spinhaler, fabricado por Fisons
Corp., Bedford, Massachusetts; el dispositivo de "nube
permanente" de Inhale Therapeutic Systems, Inc., San Carlos,
California; el inhalador AIR, fabricado por Alkermes, Cambridge,
Massachusetts; y el sistema de administración de fármacos pulmonar
AERx, fabricado por Aradigm Corporation, Hayward, California.
También se contempla el uso de una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido de la memoria descriptiva
en aplicaciones de terapia génica. En particular, puede resultar
interesante utilizar una secuencia de nucleótidos que codifique un
polipéptido como se describe en la sección titulada "Conjugado de
la memoria descriptiva, en el que el resto no polipeptídico es un
resto carbohidrato". Por tanto, la glicosilación de los
polipéptidos se logra durante el desarrollo de la terapia génica,
es decir, después de la expresión de la secuencia de nucleótidos en
el cuerpo humano.
Las aplicaciones de terapia génica contempladas
incluyen el tratamiento de aquellas enfermedades en que se espere
que el polipéptido proporcione una terapia eficaz. Éstas incluyen el
tratamiento de diversas formas de leucopenia, en particular la
prevención de infecciones en pacientes con cáncer que están
sometidos a ciertos tipos de quimioterapia y transplantes de médula
ósea, la movilización de células progenitoras para su recolección
en sangre periférica para el transplante de células progenitoras, el
tratamiento de la leucopenia relativa o crónica grave, el
tratamiento de pacientes con leucemia mieloide aguda, y el
tratamiento del SIDA u otras enfermedades de inmunodeficiencia.
La administración local de G-CSF
utilizando terapia génica puede proporcionar el agente terapéutico
al área diana mientras que se evitan los problemas de toxicidad
potenciales asociados con la administración no específica.
Se contemplan metodologías de terapia génica
in vitro e in vivo.
Se conocen varios procedimientos para transferir
genes potencialmente terapéuticos a poblaciones celulares
definidas. Para otras referencias, véase, por ejemplo, Mulligan,
"The Basic Science Of Gene Therapy", Science, 260, pp.
926-31 (1993). Estos procedimientos incluyen:
\vskip1.000000\baselineskip
- la transferencia de genes directa, por ejemplo
como se describe en Wolff et al., "Direct Gene transfer
Into Mouse Muscle In vivo", Science, 247, pp.
1465-68 (1990);
- la transferencia de ADN mediada por liposomas,
por ejemplo como se describe en Caplen et al.,
"Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the
Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis", Nature Med.,
3, pp. 39-46 (1995); Crystal, "The Gene As A
Drug", Nature Med., 1, pp. 15-17 (1995); Gao y
Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient
Transfection of Mammalian Cells", Biochem. Biophys. Res. Comm.,
179, pp. 280-185 (1991);
- la transferencia de ADN mediada por
retrovirus, por ejemplo como se describe en Kay et al.,
"In vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained Partial
Correction In Factor IX-Deficient Dogs", Science,
262, pp. 117-119 (1993); Anderson, "Human Gene
Therapy", Science, 256, pp 808-813 (1992);
- la transferencia de ADN mediada por virus de
ADN; estos virus de ADN incluyen adenoviruses (preferiblemente
vectores basados en Ad-2 o Ad-5),
herpesvirus (preferiblemente vectores basados en el virus del herpes
simplex), y parvovirus (preferiblemente vectores basados en
parvovirus "defectuosos" o no autónomos, más preferiblemente
virus adenoasociados, lo más preferiblemente vectores basados en
AAV-2); véase, por ejemplo, Ali et al.,
"The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy", Gene
Therapy, 1, pp. 367-384 (1994); documentos US
4.797.368 y US 5.139.941.
Los aspectos de los siguientes ejemplos que no
se refieren específicamente a la invención reivindicada se incluyen
sólo como comparación e ilustración.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Las semividas in vivo de
rhG-CSF (Neupogen®) y hG-CSF K16R
K34R K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG
5000.
Figura 2: Las actividades biológicas in
vivo de rhG-CSF (Neupogen®),
hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K conjugado con
SPA-PEG 5000, y hG-CSF K16R K34R
K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con SPA-PEG 5000.
Figura 3: Las actividades biológicas in
vivo de rhG-CSF (Neupogen®), y
hG-CSF K16R K34R K40R conjugado con
SPA-PEG 12000, y diferentes dosis de
hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K conjugado con
SPA-PEG 5000.
\vskip1.000000\baselineskip
El listado de secuencias adjunto contiene las
siguientes secuencias:
SEQ ID NO:1: La secuencia de aminoácidos del
G-CSF humano.
SEQ ID NO:2: Una secuencia de ADN sintética que
codifica el G-CSF humano, con la utilización de
codones optimizada para la expresión en E. coli.
SEQ ID NO:3: La secuencia de aminoácidos de la
secuencia señal OmpA.
SEQ ID NO:4: Una secuencia de ADN sintética que
codifica la secuencia señal OmpA.
SEQ ID NO:5: Un marcador de histidina
sintético.
SEQ ID NO:6: Una secuencia de ADN sintética que
codifica el marcador de histidina de SEQ ID NO:5.
SEQ ID NO:7: La secuencia de aminoácidos de un
péptido señal de G-CSF humano.
SEQ ID NO:8: Una secuencia de ADN sintética que
codifica el G-CSF humano, que incluye el péptido
señal de SEQ ID NO:7, con la utilización de codones optimizada para
la expresión en células CHO.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ensamblaje tridimensional de 10 estructuras
determinado mediante espectroscopía de RMN (Zink et al.
(1994), Biochemistry, 33:8453-8463) está disponible
en el banco de datos de proteínas Protein Data Bank (PDB)
(www.rcsb.org/pdb/). Esta información puede introducirse en el programa informático Access (B. Lee y F.M. Richards, J. Mol. Biol., 55: 379-400 (1971)) versión 2 (© 1983 Yale University) y emplearse para computar la superficie específica accesible (SEA) de los átomos individuales en la estructura. Este procedimiento utiliza, de forma típica, una sonda con un tamaño de 1,4 \ring{A} y define la Superficie Específica Accesible (SEA) como el área formada por el centro de la sonda. Antes de este cálculo todas las moléculas de agua y todos los átomos de hidrógeno deben eliminarse del conjunto de coordenadas, así como otros átomos que no estén directamente relacionados con la proteína.
(www.rcsb.org/pdb/). Esta información puede introducirse en el programa informático Access (B. Lee y F.M. Richards, J. Mol. Biol., 55: 379-400 (1971)) versión 2 (© 1983 Yale University) y emplearse para computar la superficie específica accesible (SEA) de los átomos individuales en la estructura. Este procedimiento utiliza, de forma típica, una sonda con un tamaño de 1,4 \ring{A} y define la Superficie Específica Accesible (SEA) como el área formada por el centro de la sonda. Antes de este cálculo todas las moléculas de agua y todos los átomos de hidrógeno deben eliminarse del conjunto de coordenadas, así como otros átomos que no estén directamente relacionados con la proteína.
La SEA fraccional de los átomos de la cadena
lateral se computa mediante la división de la suma de la SEA de los
átomos en la cadena lateral con un valor que representa la SEA de
los átomos de la cadena lateral del resto tipo en un tripéptido
ALA-x-ALA extendido. Véase Hubbard,
Campbell y Thornton (1991), J. Mol. Biol., 220,
507-530. Para este ejemplo, el átomo CA se considera
parte de la cadena lateral de los restos glicina, pero no en el
resto de los restos. Los valores en la siguiente tabla se emplean
como patrones de 100% SEA para la cadena lateral:
Los restos no detectados en la estructura se
definen como que tienen 100% de exposición puesto que se cree que
residen en regiones flexibles.
\vskip1.000000\baselineskip
La distancia entre los átomos se determina con
más facilidad utilizando un programa informático gráfico molecular,
por ejemplo InsightII® v. 98.0, MSI INC.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se explicó anteriormente, los restos
aminoácidos que se van a modificar según la presente memoria
descriptiva son preferiblemente aquellos cuyas cadenas laterales
están expuestas sobre la superficie, en particular aquellos con más
de aproximadamente 25% de la cadena lateral expuesta sobre la
superficie de la molécula, y más preferiblemente aquellos con más
de aproximadamente 50% de la cadena lateral expuesta. Otra
consideración es que los restos localizados en las interfases del
receptor preferiblemente se excluyen para evitar o, al menos,
minimizar la posible interferencia con la activación o la unión al
receptor. Otra consideración es que los restos que están a menos de
10 \ring{A} de la Lys más cercana (Glu, Asp) CB-CB
(CA para Gly) también deben ser excluidos. Por último, las
posiciones preferidas para la modificación son, en particular,
aquellas que tienen un resto hidrófilo y/o cargado, es decir, Asp,
Asn, Glu, Gln, Arg, His, Tyr, Ser y Thr, siendo especialmente
preferidas las posiciones que tienen un resto arginina.
\vskip1.000000\baselineskip
La información a continuación ilustra los
factores que generalmente deben tomarse en consideración cuando se
identifican restos aminoácidos para ser modificados según la
presente memoria descriptiva.
Se han indicado estructuras tridimensionales
para el G-CSF humano mediante cristalografía de
rayos X (Hill et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:
5167-5171) y mediante espectroscopía de RMN (Zink
et al. (1994), Biochemistry, 33: 8453-8463).
Como se mencionó anteriormente, Aritomi et al. (Nature,
401:713-717, 1999) han identificado los siguientes
restos de hG-CSF como parte de las interfases de
unión al receptor: G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, L15, K16,
E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123, y L124.
Por tanto, aunque es posible modificar estos restos, se prefiere
que estos restos se excluyan de la modificación.
Empleando las 10 estructuras de RMN de
G-CSF identificadas por Zink et al. (1994)
como estructuras de entrada, seguido de una computación de la SEA
media de la cadena lateral, los siguientes restos se han
identificado como que tienen más de 25% SEA: M0, T1, P2, L3, G4,
P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, F13, L14, L15, K16, C17, E19,
Q20, V21, R22, K23, Q25, G26, D27, A29, A30, E33, K34, C36, A37,
T38, Y39, K40, L41, H43, P44, E45, E46, V48, L49, L50, H52, S53,
L54,156, P57, P60, L61, S62, S63, P65, S66, Q67, A68, L69, Q70, L71,
A72, G73, C74, S76, Q77, L78, S80, F83, Q86, G87, Q90, E93, G94,
S96, P97, E98, L99, G100, P101, T102, D104, T105, Q107, L108, D109,
A111, D112, F113, T115, T116, W118, Q119, Q120, M121, E122, E123,
L124, M126, A127, P128, A129, L130, Q131, P132, T133, Q134, G135,
A136, M137, P138, A139, A141, S142, A143, F144, Q145, R146, R147,
S155, H156, Q158, S159, L161, E162, V163, S164, Y165, R166, V167,
L168, R169, H170, L171, A172, Q173, P174.
De forma similar, los siguientes restos tienen
más de 50% SEA: M0, T1, P2, L3, G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11,
S12, F13, L14, L15, K16, C17, E19, Q20, R22, K23, G26, D27, A30,
E33, K34, T38, K40, L41, H43, P44, E45, E46, L49, L50, S53, P57,
P60, L61, S62, S63, P65, S66, Q67, A68, L69, Q70, L71, A72, G73,
S80, F83, Q90, G94, P97, E98, P101, D104, T105, L108, D112, F113,
T115, T116, Q119, Q120, E122, E123, L124, M126, P128, A129, L130,
Q131, P132, T133, Q134, G135, A136, A139, A141, S142, A143, F144,
R147, S155, S159, E162, R166, V167, R169, H170, L171, A172, Q173,
P174.
El programa informático gráfico molecular
InsightII® v. 98.0 se utilizó para determinar los restos que tienen
su átomo CB (CA en el caso de la glicina) a una distancia de más de
15 \ring{A} desde el grupo amina más cercado, definidos como los
átomos NZ de la lisina y el átomo N del resto
N-terminal T1. La siguiente lista incluye los
restos que cumplen este criterio en al menos una de las 10
estructuras de RMN: G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, L14, L15,
L18, V21, R22, Q25, G26, D27, G28, A29, Q32, L35, C36, T38, Y39,
C42, H43, P44, E45, E46, L47, V48, L49, L50, G51, H52, S53, L54,
G55, I56, P57, W58, A59, P60, L61, S62, S63, C64, P65, S66, Q67,
A68, L69, Q70, L71, A72, G73, C74, L75, S76, Q77, L78, H79, S80,
G81, L82, F83, L84, Y85, Q86, G87, L88, L89, Q90, A91, L92, E93,
G94, I95, S96, P97, E98, L99, G100, P101, T102, L103, D104, T105,
L106, Q107, L108, D109, V110, A111, D112, F113, A114, T115,
T116,1117, W118, Q119, Q120, M121, E122, E123, L124, G125, M126,
A127, P128, A129, L130, Q131, P132, T133, Q134, G135, A136, M137,
P138, A139, F140, A141, S142, A143, F144, Q145, R146, R147, A148,
G149, G150, V151, L152, V153, A154, S155, H156, L157, Q158, S159,
F160, L161, E162, V163, S164, Y165, R166, V167, L168, R169, H170,
L171, A172, Q173, P174.
El programa InsightII® v. 98.0 se empleó de
forma similar para determinar los restos que tienen su átomo CB
(átomo CA en el caso de la glicina) a una distancia de más de 10
\ring{A} desde el grupo ácido más cercado, definidos como los
átomos CG del ácido aspártico, los átomos CD del ácido glutámico, y
el átomo C del resto C-terminal P174. La siguiente
lista incluye los restos que cumplen este criterio en al menos una
de las 10 estructuras de RMN: M0, T1, P2, L3, G4, P5, A6, S7, S8,
L9, P10, Q11, S12, F13, L14, T38, Y39, K40, L41, C42, L50, G51,
H52, S53, L54, G55, I56, P57, W58, A59, P60, L61, S62, S63, C64,
P65, S66, Q67, A68, L69, Q70, L71, A72, G73, C74, L75, S76, Q77,
L78, H79, S80, G81, L82, F83, L84, Y85, Q86, G87, L88, I117, M126,
A127, P128, A129, L130, Q131, P132, T133, Q134, G135, A136, M137,
P138, A139, F140, A141, S142, A143, F144, Q145, R146, R147, A148,
G149, G150, V151, L152, V153, A154, S155, H156, L157, V167, L168,
R169, H170, L171.
Combinando y comparando las anteriores listas es
posible seleccionar restos aminoácidos individuales para su
modificación para confeccionar una lista que contenga un número
limitado de restos aminoácidos cuya modificación en un polipéptido
de G-CSF dado es probable que de como resultado unas
propiedades deseadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El G-CSF humano y sus variantes
se PEGilan a una concentración de 250 \mug/ml en fosfato de sodio
50 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5. El exceso molar de PEG es de 100 veces
con respecto a los sitios de PEGilación sobre la proteína. La
mezcla de reacción se coloca en un termomezclador durante 30 minutos
a 37ºC a 1200 rpm. Después de 30 minutos se obtiene la extinción de
la reacción añadiendo un exceso molar de glicina.
Se aplica una cromatografía de intercambio
catiónico para eliminar el exceso de PEG, glicina y otros
subproductos de la mezcla de reacción. La mezcla de reacción de
PEGilación se diluye con citrato de sodio 20 mM, pH 2,5, hasta que
la fuerza iónica es menor que 7 mS/cm. El pH se ajusta a 2,5
utilizando HCl 5 N. La mezcla se aplica a una columna
SP-Sepharose FF equilibrada con citrato de sodio 20
mM, pH 2,5. El material no unido se lava de la columna utilizando 4
volúmenes de columna del tampón de equilibrio. La proteína PEGilada
se eluye en tres volúmenes de columna añadiendo citrato de sodio 20
mM, cloruro de sodio 750 mM. El G-CSF PEGilado puro
se concentra y se realiza un intercambio de tampón utilizando
dispositivos de concentración VivaSpin, con una exclusión de peso
molecular (epm): 10 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un polipéptido que muestra actividad
G-CSF se expresa con un marcador adecuado, por
ejemplo cualquiera de los marcadores ejemplificados en la
descripción general anterior, y el caldo de cultivo se traslada a
uno o más pocillos de una placa de microvaloración capaz de
inmovilizar el polipéptido marcado. Cuando el marcador es
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln,
puede utilizarse una placa de microvaloración de níquel-ácido
nitrilotriacético (Ni-NTA) HisSorb, disponible en el
mercado en QIAGEN.
Después de la inmovilización del polipéptido
marcado sobre la placa de microvaloración, los pocillos se lavan en
un tampón adecuado para la unión y la posterior PEGilación, seguido
de una incubación de los pocillos con el PEG activado elegido. Como
ejemplo, se utiliza M-SPA-5000 de
Shearwater Polymers. La proporción molar del PEG activado al
polipéptido debe ser optimizada pero, de forma típica, será mayor
que 10:1, por ejemplo hasta aproximadamente 100:1 o mayor. Después
de un tiempo de reacción adecuado a temperatura ambiente, de forma
típica aproximadamente 1 hora, la reacción se detiene mediante la
retirada de la disolución de PEG activado. La proteína conjugada se
eluye de la placa mediante incubación con un tampón adecuado. Los
tampones de elución adecuados pueden contener imidazol, un exceso
de NTA u otro compuesto quelante. La proteína conjugada se ensaya
para la actividad biológica y la inmunogenicidad según sea
apropiado. El marcador puede escindirse opcionalmente utilizando un
procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, utilizando
diaminopeptidasa, el Gln en la posición 1 puede convertirse en
piroglutamilo con GCT (glutamil ciclotransferasa) y, por último,
escindirse con PGAP (piroglutamil aminopeptidasa), produciendo la
proteína sin marcar. El proceso implica varias etapas de
cromatografía de afinidad de quelado metálico. Como alternativa, el
polipéptido marcado puede conjugarse.
Para optimizar la PEGilación del
hG-CSF de una manera que excluya la PEGilación de
las lisinas implicadas en el reconocimiento del receptor se ha
desarrollado el siguiente procedimiento.
Se obtiene un hG-CSF purificado
como se describe en el ejemplo 3. Un complejo homodimérico que
consiste en un polipéptido de hG-CSF y el dominio
soluble del receptor de G-CSF con una estequiometría
de 2:2 se forma en un tampón de disolución salina tamponada con
fosfato (PBS) a pH 7. La concentración del polipéptido de
hG-CSF es de aproximadamente 20 \mug/ml o 1
\muM, y el receptor está presente en una concentración
equimolar.
Se añade
M-SPA-5000 de Shearwater Polymers,
Inc. a tres niveles de concentración diferentes, que corresponden a
un exceso 5, 20 y 100 molar del polipéptido de
hG-CSF. El tiempo de reacción es de 30 min a
temperatura ambiente. Después de los 30 min del periodo de
reacción, el pH de la mezcla de reacción se ajusta a pH 2,0 y la
mezcla de reacción se aplica a una columna Vydac C18 y se eluye con
un gradiente de acetonitrilo esencialmente como se describe (Utsumi
et al., J. Biochem., vol. 101, 1199-1208
(1987)). Como alternativa, puede utilizarse un gradiente de
isopropanol.
Las fracciones se analizan utilizando el ensayo
de selección primaria descrito en la presente, y el polipéptido de
hG-CSF PEGilado activo obtenido mediante este
procedimiento se almacena a -80ºC en PBS, pH 7, que contiene
albúmina de suero human (HSA) 1 mg/ml.
El peso molecular del hG-CSF
conjugado o no conjugado o sus variantes se determina mediante
SDS-PAGE, filtración en gel, espectrometría de
masas de desorción de láser asistida por matriz, o centrifugación de
equilibrio.
La concentración de un polipéptido puede medirse
utilizando mediciones de densidad óptica a 280 nm, un ensayo de
inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA)
u otra técnica de inmunodetección bien conocida en la técnica.
Además, la concentración de polipéptido en una muestra puede medirse
con el instrumento Biacore® utilizando un chip Biacore® revestido
con un anticuerpo específico para el polipéptido.
Este anticuerpo puede acoplarse covalentemente
al chip Biacore® mediante diversas químicas. Como alternativa, el
anticuerpo puede unirse no covalentemente, por ejemplo mediante un
anticuerpo específico para la porción Fc del anticuerpo
anti-polipéptido. El anticuerpo específico de Fc en
primer lugar se acopla covalentemente al chip. El anticuerpo
anti-polipéptido entonces se hace fluir sobre el
chip y es unido por el primer anticuerpo de una manera directa.
Además, pueden inmovilizarse anticuerpos biotinilados utilizando una
superficie revestida de estreptavidina (por ejemplo, Biacore Sensor
Chip SA®) (Real-Time Analysis of Biomolecular
Interactions, Nagata y Handa (eds.), 2000, Springer Verlag, Tokio;
Biacore 2000 Instrument Handbook, 1999, Biacore AB).
Cuando una muestra se hace fluir sobre el chip,
el polipéptido se une al anticuerpo revestido y puede medirse el
aumento en la masa. Utilizando una preparación del polipéptido a una
concentración conocida puede establecerse una curva patrón y
posteriormente puede determinarse la concentración del polipéptido
en la muestra. Después de cada inyección de muestra, el chip sensor
se regenera mediante un eluyente adecuado (por ejemplo, un tampón a
pH bajo) que elimina el analito unido.
En general, los anticuerpos aplicados serán
anticuerpos monoclonales generados contra el polipépido de tipo
salvaje. La introducción de mutaciones u otras manipulaciones del
polipéptido de tipo salvaje (más glicosilaciones o conjugaciones de
polímeros) puede alterar el reconocimiento por dichos anticuerpos.
Además, estas manipulaciones que producen un mayor peso molecular
del polipétido darán como resultado un aumento en la señal de
resonancia de plasmón. Por consiguiente, es necesario establecer
una curva patrón para cada molécula que se vaya a ensayar.
La proliferación de la línea célular murina
NFS-60 (obtenida del Dr. J. Ihle, St. Jude
Children's Research Hospital, Tennessee, EEUU) depende de la
presencia del G-CSF activo en el medio de
crecimiento. Por tanto, la actividad biológica in vitro del
hG-CSF y sus variantes puede determinarse midiendo
el número de células NFS-60 en división después de
la adición de una muestra de G-CSF al medio de
crecimiento, seguido de una incubación a través de un periodo de
tiempo fijado.
Las células NFS-60 se mantienen
en medio DME de Iscove que contiene FBS (suero bovino fetal) al 10%
en p/p, penicilina/estreptamicina al 1% en p/p, 10 \mug por litro
de hG-CSF y Glutamax 2 mM. Antes de la adición de
la muestra, las células se lavan dos veces en medio de crecimiento
sin hG-CSF y se diluyen hasta una concentración de
2,2 x 10^{5} células por ml. Se añaden 100 \mul de la suspensión
celular a cada pocillo de una placa de microvaloración de 96
pocillos (Corning).
Las muestras que contienen el
G-CSF conjugado o no conjugado o sus variantes se
diluyen hasta unas concentraciones de entre 1,1 x 10^{-6} M y 1,1
x 10^{-13} M en el medio de crecimiento. Se añaden 10 \mul de
cada muestra a 3 pocillos que contienen células
NFS-60. Un control que consiste en 10 \mul de
medio de crecimiento de mamífero se añade a 8 pocillos en cada
placa de microvaloración. Las células se incuban durante 48 horas
(37ºC, 5% de CO_{2}) y se cuantifica el número de células en
división en cada pocillo utilizando el agente de proliferación de
células WST-1 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania). Se añaden 0,01 ml de WST-1 a los
pocillos, seguido de una incubación durante 150 min a 37ºC en una
atmósfera de aire con 5% de CO_{2}. La ruptura de la sal de
tetrazolio WST-1 por deshidrogenasas mitocondriales
en células viables da como resultado la formación de formazán que
se cuantifica midiendo la absorbancia a 450 nm. Con ello se
cuantifica el número de células viables en cada pocillo.
Basándose en estas mediciones se calculan las
curvas de dosis-respuesta para cada molécula de
G-CSF conjugada y no conjugada o sus variantes,
tras lo cual el valor de EC50 para cada molécula puede determinarse.
Este valor es igual a la cantidad de proteína de
G-CSF activa que es necesaria para obtener 50% de la
máxima actividad de proliferación del G-CSF humano
no conjugado. Por tanto, el valor de EC50 es una medida directa de
la actividad in vitro de la proteína dada.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular hematopoyética murina BaF3 se
transfecta con un plásmido que porta el receptor de
G-CSF humano y el promotor del regulador de la
transcripción, fos, en frente del gen indicador de
luciferasa. Tras la estimulación de dicha línea celular con una
muestra de G-CSF, una serie de reacciones
intracelulares conducen a la estimulación de la expresión de
fos y, por consiguiente, a la expresión de luciferasa. Esta
estimulación puede controlarse con el sistema de ensayo de
luciferasa Steady-Glo^{TM} (Promega, nº de
catálogo E2510), con lo que puede cuantificarse la actividad in
vitro de la muestra de G-CSF.
Se mantienen células
BaF3/hGCSF-R/pfos-lux a 37ºC en una
atmósfera humidificada con 5% de CO_{2} en medio de cultivo
completo (RPMI-1640/HEPES (Gibco/BRL, nº de catálogo
22400)), FBS al 10% (HyClone, caracterizado), 1x
penicilina/estreptomicina (Gibco/BRL, nº de catálogo
15140-122), 1x L-glutamina
(Gibco/BRL, nº de catálogo 25030-081), medio
condicionado WEHI-3 al 0,1% (fuente de
muIL-3), y se hacen crecer hasta una densidad de 5
x 10^{5} células/ml (confluentes). Las células se resiembran a
aproximadamente 2 x 10^{4} células/ml cada 2-3
días.
Un día antes del ensayo, las células en fase
logarítmica se resuspenden a 2 x 10^{5} células/ml en medio de
privación (DMEM/F-12 (Gibco/BRL, nº de catálogo
11039)), BSA al 1% (Sigma, nº de catálogo A3675), 1x
penicilina/estreptomicina (Gibco/BRL, nº de catálogo
15140-122), 1x L-glutamina
(Gibco/BRL, nº de catálogo 25030-081), medio
condicionado WEHI-3 al 0,1%) y se privaron de
nutrientes durante 20 horas. Las células se lavaron dos veces con
PBS y se ensayaron para la viabilidad utilizando tinción de
viabilidad con azul de tripano. Las células se resuspenden en medio
de ensayo (RPMI-1640 (exento de rojo fenol,
Gibco/BRL, nº de catálogo 11835), HEPES 25 mM, BSA al 1% (Sigma, nº
de catálogo A3675), 1x penicilina/estreptomicina (Gibco/BRL, nº de
catálogo 15140-122), 1x L-glutamina
(Gibco/BRL, nº de catálogo 25030-081) a 4 x 10^{6}
células/ml, y se introdujeron partes alícuotas de 50 \mul en cada
pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos
(codificación). Las muestras que contienen el G-CSF
conjugado o no conjugado o sus variantes se diluyen a
concentraciones de entre 1,1 x 10^{-7} M y 1,1 x 10^{-12} M en
el medio de ensayo. Se añaden 50 \mul de cada muestra a 3 pocillos
que contienen células
BaF3/hGCSF-R/pfos-lux. Se añade un
control negativo que consiste en 50 \mul de medio a 8 pocillos en
cada placa de microvaloración. Las placas se mezclan suavemente y se
incuban durante 2 horas a 37ºC. La actividad luciferasa se mide
siguiendo el protocolo de Promega Steady-Glo^{TM}
(sistema de ensayo de luciferasa Promega
Steady-Glo^{TM}, nº de catálogo E2510). Se añaden
100 \mul de sustrato por pocillo mediante un mezclado suave. Se
mide la luminiscencia en un luminómetro TopCount (Packard) en el
modo SPC (recuento de fotón único).
Basándose en estas mediciones se calculan las
curvas de dosis-respuesta para cada molécula de
G-CSF conjugada y no conjugada o sus variantes,
tras lo cual el valor de EC50 para cada molécula puede
determinarse.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudia la unión del rhG-CSF
o sus variantes al receptor de hG-CSF utilizando
ensayos de unión convencionales. Los receptores pueden ser dominios
del receptor extracelulares purificados, receptores unidos a
membranas plasmáticas celulares purificadas, o células completas
(siendo la fuente celular líneas celulares que expresan
inherentemente receptores de G-CSF (por ejemplo,
NFS-60) o células transfectadas con ADNc que
codifique los receptores). La capacidad del rhG-CSF
o sus variantes para competir por los sitios de unión con el
G-CSF nativo se analiza mediante una incubación con
un análogo de G-CSF marcado, por ejemplo
hG-CSF biotinilado o hG-CSF
radioyodado. Un ejemplo de este ensayo se describe en Yamasaki et
al. (Drugs. Exptl. Clin. Res., 24:191-196
(1988)).
Los dominios extracelulares del receptor de
hG-CSF pueden acoplarse opcionalmente a Fc e
inmovilizarse en placas de 96 pocillos. Posteriormente se añade el
rhG-CSF o sus variantes y su unión se detecta
utilizando anticuerpos anti-hG-CSF
específicos o hG-CSF biotinilado o radioyodado.
Un aspecto importante de la memoria descriptiva
es la mayor semivida biológica que se obtiene mediante la
construcción de un hG-CSF con o sin conjugación del
polipéptido con el resto polimérico. La rápida disminución de las
concentraciones de hG-CSF en suero ha hecho
importante evaluar las respuestas biológicas al tratamiento con
hG-CSF conjugado y no conjugado y sus variantes.
Preferiblemente, el hG-CSF conjugado y no conjugado
y sus variantes de la presente memoria descriptiva tienen una
semivida en suero prolongada después de la administración
intravenosa, haciendo posible medirla, por ejemplo mediante un
procedimiento ELISA o mediante un ensayo de selección primaria. Las
mediciones de la semivida biológica in vivo se realizaron
como se describe a continuación.
Se emplearon ratas macho Sprague Dawley (7
semanas de edad). En el día de la administración se midió el peso
de los animales (280-310 gramos por animal). Se
inyectaron por vía intravenosa 100 \mug por kg de peso corporal
de las muestras de hG-CSF conjugado y no conjugado
en la vena de la cola de tres ratas. En el minuto 1, a los 30
minutos, y a la 1, 2, 4, 6 y 24 horas después de la inyección se
extrajeron 500 \mul de sangre de los ojos de cada rata bajo
anestesia con CO_{2}. Las muestras de sangre se almacenan a
temperatura ambiente durante una hora y media, seguido por el
aislamiento del suero mediante centrifugación (4ºC, 18000 x g
durante 5 minutos). Las muestras de suero se almacenaron a -80ºC
hasta el día del análisis. La cantidad de G-CSF
activo en las muestras de suero se cuantificó mediante los ensayos
de actividad in vitro de G-CSF (véanse los
ensayos primarios 1 y 2), después de descongelar las muestras en
hielo.
Otro ejemplos de un ensayo para la medición de
la semivida in vivo del G-CSF o sus variantes
se describe en el documento US 5.824.778.
Se utiliza la medición de los efectos biológicos
in vivo del hG-CSF en ratas Sprague Dawley
SPF (adquiridas en M & B A/S, Dinamarca) para evaluar la
eficacia biológica del G-CSF conjugado y no
conjugado y sus variantes.
En el día de su llegada las ratas se asignan
aleatoriamente a grupos de 6. Los animales se aclimatan durante un
periodo de 7 días, en que los individuos en malas condiciones o con
pesos extremos se rechazan. El intervalo de peso de las ratas al
comienzo del periodo de aclimatación es de 250-270
g.
En el día de la administración las ratas se
dejan en ayunas durante 16 horas, seguido de la inyección subcutánea
de 100 \mug por kg de peso corporal de hG-CSF o
su variante. Cada muestra de hG-CSF se inyecta en un
grupo de 6 ratas aleatorizadas. Se extraen muestras de sangre
estabilizada con 300 \mul de EDTA de la vena de la cola de las
ratas antes de la dosificación y a las 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96,
120 y 144 horas después de la dosificación. Las muestras de sangre
se analizan para los siguientes parámetros hematológicos:
hemoglobina, recuento de glóbulos rojos, hematocrito, volumen
celular medio, concentración de hemoglobina celular media,
hemoglobina celular media, recuento de glóbulos blancos, recuento de
leucocitos diferencial (neutrófilos, linfocitos, eosinófilos,
basófilos, monocitos). Basándose en estas mediciones se evalúa la
eficacia biológica del hG-CSF conjugado y no
conjugado y sus variantes.
Otros ejemplos de ensayos para la medición de la
actividad biológica in vivo del hG-CSF o sus
variantes se describen en los documentos US 5.681.720, US
5.795.968, US 5.824.778, US 5.985.265, y en Bowen et al.,
Experimental Hematology, 27:425-432 (1999).
Puede medirse la fuerza de la unión entre un
receptor y un ligando utilizando un ensayo de inmunoadsorción
ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) u otra técnica
de inmunodetección bien conocida en la técnica. La interacción de
unión entre el ligando y el receptor también puede medirse con el
instrumento Biacore®, que utiliza la detección de resonancia de
plasmón (Zhou et al., Biochemistry, 1993, 32,
8193-8198; Faegerstram y O'Shannessy, 1993, en
Handbook of Affinity Chromatography, 229-252, Marcel
Dekker, Inc., NY).
La tecnología Biacore® permite unir el receptor
a una superficie de oro y hacer fluir el ligando sobre ella. La
detección de resonancia de plasmón ofrece una cuantificación directa
de la cantidad de masa unida a la superficie a tiempo real. Esta
técnica produce las constantes de afinidad y de disociación y, por
tanto, puede determinarse directamente una constante de disociación
y una constante de afinidad del
ligando-receptor.
La inmunogenicidad reducida de un conjugado de
la memoria descriptiva puede determinarse utilizando un
procedimiento ELISA que mida la inmunorreactividad del conjugado
con relación a una molécula o preparación de referencia. La
molécula o preparación de referencia normalmente es una preparación
de G-CSF humano recombinante, como Neupogen® u otra
preparación de G-CSF humano recombinante, por
ejemplo una molécula de rhG-CSF PEGilada en el
N-terminal, como se describe en el documento US
5.824.784. El procedimiento ELISA se basa en anticuerpos
procedentes de pacientes tratados con una de estas preparaciones de
G-CSF recombinante. Se considera que la
inmunogenicidad se ha reducido cuando el conjugado de la invención
tiene una respuesta estadísticamente significativa menor en el
ensayo que la molécula o preparación de referencia.
La neutralización de los conjugados de
hG-CSF por un suero
anti-G-CSF se analiza utilizando el
bioensayo de G-CSF descrito anteriormente.
Se emplea suero procedente de pacientes tratados
con la molécula de referencia de G-CSF o procedente
de animales inmunizados. El suero se añade a una concentración
fijada (dilución 1:20-1:500 (suero pt) o
20-1000 ng/ml (suero animal)) o en diluciones en
serie en cinco veces del suero comenzando en 1:20 (suero pt) o 1000
ng/ml (suero animal). El conjugado de hG-CSF se
añade en diluciones en siete veces comenzando en 10 mM o a una
concentración fijada (1-100 pM) en un volumen total
de 80 \mul de medio DMEM + FCS al 10%. El suero se incuba durante
1 hora a 37ºC con el conjugado de hG-CSF.
Las muestras (0,01 ml) entonces se trasladan a
placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contienen células
NFS-60 en 0,1 ml de medio DMEM. Los cultivos se
incuban durante 48 horas a 37ºC en una atmósfera de aire con 5% de
CO_{2}. Se añaden 0,01 ml de WST-1 (agente de
proliferación celular WST-1, Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemania) al cultivo y se incuba durante 150 min a 37ºC
en una atmósfera de aire con 5% de CO_{2}. La ruptura de la sal
de tetrazolio WST-1 por deshidrogenasas
mitocondriales en células viables da como resultado la formación de
formazán que se cuantifica midiendo la absorbancia a 450 nm.
Cuando las muestras del conjugado de
hG-CSF se valoran en presencia de una cantidad
fijada de suero, el efecto neutralizante se define como la cantidad
de veces de inhibición (PI) cuantificada como EC50 (con suero)/EC50
(sin suero). La reducción de la neutralización con anticuerpos de
las proteínas variantes de G-CSF se define
como:
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes fragmentos de ADN se sintetizaron
siguiendo el procedimiento general descrito en Stemmer et
al. (1995), Gene, 164, pp. 49-53:
- fragmento 1, que consiste en un sitio de
digestion Bam HI, una secuencia que codifica el péptido señal
YAP3 (documento WO 98/32867), una secuencia que codifica la
secuencia conductora TA57 (documento WO 98/32867), una secuencia
que codifica un sitio de reconocimiento de proteasa KEX2 (AAAAGA),
una secuencia que codifica hG-CSF con su
utilización de codones optimizada para la expresión en E.
coli, (SEQ ID NO:2) y un sitio de digestión Xba I.
- fragmento 2, que consiste en un sitio de
digestión Bam HI, una secuencia que codifica el péptido señal
YAP3 (documento WO 98/32867), una secuencia que codifica la
secuencia conductora TA57 (documento WO 98/32867), una secuencia
que codifica un marcador de histidina (SEQ ID NO:5), una secuencia
que codifica un sitio de reconocimiento de proteasa KEX2 (AAAAGA),
una secuencia que codifica hG-CSF con su utilización
de codones optimizada para la expresión en E. coli, (SEQ ID
NO:2) y un sitio de digestión Xba I.
- fragmento 3, que consiste en un sitio de
digestión Nde I, una secuencia que codifica el péptido señal
OmpA (SEQ ID NO:3), una secuencia que codifica
hG-CSF con su utilización de codones optimizada para
la expresión en E. coli, (SEQ ID NO:2) y un sitio de
digestión Bam HI.
- fragmento 4, que consiste en un sitio de
digestión Bam HI, la secuencia consenso Kozak (Kozak, M., J.
Mol. Biol., 1987, 20 de agosto,
196(4):947-950), una secuencia que codifica
el péptido señal de hG-CSF (SEQ ID NO:7) y
hG-CSF con su utilización de codones optimizada para
la expresión en células CHO (SEQ ID NO:8) y un sitio de digestión
Xba I.
Los fragmentos de ADN 1 y 2 se insertaron en los
sitios de digestión Bam HI y Xba I en el plásmido
pJSO37 (Okkels, Ann. New York Acad. Sci.,
782:202-207, 1996) utilizando técnicas de ADN
convencionales. Esto produjo los plásmidos
pG-CSFcerevisiae y
pHISG-CSFcerevisiae.
El fragmento de ADN 3 se insertó en los sitios
de digestión Nde I y Bam HI en el plásmido pET12a
(Invitrogen) utilizando técnicas de ADN convencionales. Esto
produjo el plasmido pG-CSFcoli.
El fragmento de ADN 4 se insertó en los sitios
de digestión Bam HI y Xba I en el plásmido pcDNA3.1(+)
(Invitrogen) utilizando técnicas de ADN convencionales. Esto
produjo el plásmido pG-CSFCHO.
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación de Saccharomyces
cerevisiae YNG318 (disponible en la American Type Culture
Collection, VA, EEUU, como ATCC 208973) con el plásmido
pG-CSFcerevisiae o
pHISG-CSFcerevisiae, el aislamiento de los
transformantes que contenían cualquiera de los dos plásmidos, y la
posterior expresión extracelular de hG-CSF con y
sin el marcador HIS, respectivamente, se realizó utilizando técnicas
convencionales descritas en la bibliografía. La transformación de
E. coli BL21 (DE3) (Novagen, nº de catálogo
69387-3) con pG-CSFcoli, el
aislamiento de los transformantes que contenían el plásmido, y la
posterior expresión de hG-CSF en el sobrenadante y
en el periplasma de la célula se realizó como se describe en el
manual del sistema pET (8ª edición) de Novagen.
La expresión de hG-CSF por S.
cerevisiae y E. coli se verificó mediante un análisis de
la transferencia Western utilizando el kit de tinción de IgG de
conejo ImmunoPure Ultra-Sensitive ABC (Pierce) y un
anticuerpo policlonal contra hG-CSF (Pepro Tech EC
Ltd.). Se observó que la proteína tenía el tamaño correcto.
Los niveles de expresión de
hG-CSF con y sin el marcador de histidina
N-terminal en S. cerevisiae y E. coli
se cuantificaron utilizando un kit de ELISA específico para
G-CSF disponible en el mercado (Quantikine Human
G-CSF Immunoassay, R&D Systems, nº de catálogo
DCS50). Los valores medidos se listan a continuación:
La purificación del hG-CSF se
realizó como sigue.
Las células se retiraron mediante
centrifugación. El sobrenadante sin células entonces se esteriliza
mediante filtración a través de un filtro de 0,22 \mum. El
sobrenadante esterilizado mediante filtración se diluye en 5 veces
en acetato de sodio 10 mM, pH 4,5. El pH se ajusta mediante la
adición de 10 ml de ácido acético concentrado por 5 litros de
sobrenadante diluido. La fuerza iónica debe ser menor que 8 mS/cm
antes de la aplicación a la columna de intercambio catiónico.
El sobrenadante diluido se carga con un caudal
lineal de 90 cm/h sobre una columna de SP-Sepharose
FF (Pharmacia) equilibrada con acetato de sodio 50 mM, pH 4,5,
hasta que el efluyente de la columna alcanza una UV estable y una
línea de base de conductividad. Para eliminar el material no unido,
la columna se lava utilizando el tampón de equilibrio hasta que el
efluyente de la columna alcanza un nivel estable con respecto a la
absorbancia de UV y la conductividad. La proteína de
G-CSF unido se eluye de la columna utilizando un
gradiente lineal; 30 volúmenes de columna; tampón B al
0-80% (NaAc 50 mM, pH 4,5, NaCl 750 mM) con un
caudal de 45 cm/h. Basándose en una electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida, las fracciones que contenían
G-CSF se reúnen. Se añade cloruro de sodio hasta
que la fuerza iónica de la disolución es mayor que 80 mS/cm.
La disolución de proteína se aplica a una
columna Phenyl Toyo Pearl 650S equilibrada con NaAc 50 mM, pH 4,5,
NaCl 750 mM. El material no unido se lava de la columna utilizando
el tampón de equilibrio. La elución del G-CSF se
realiza aplicando un gradiente discontinuo de agua MilliQ. Las
fracciones que contenían el G-CSF se reúnen.
Utilizando esta estrategia de procesamiento corriente abajo en dos
etapas puede obtenerse más G-CSF más del 90% puro.
La proteína purificada entonces se cuantifica utilizando mediciones
espectrofotométricas a 280 nm y/o mediante análisis de
aminoácidos.
Las fracciones que contienen
G-CSF se reúnen. Se realiza un intercambio de tampón
y una concentración utilizando concentradores VivaSpin (epm: 5
kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
El G-CSF purificado y
concentrado se analizó mediante SDS-PAGE. Una única
banca con un peso molecular aparente de aproximadamente 17 kDa
resultó dominante.
Se obtiene una estimación de la concentración de
G-CSF mediante procedimientos espectrofotométricos.
Midiendo la absorbancia a 280 nM y utilizando un coeficiente de
extinción teórico de 0,83 puede calcularse la concentración de
proteínas.
Puede obtenerse una determinación de las
proteínas más precisa mediante el análisis de los aminoácidos. Un
análisis de aminoácidos realizado con un G-CSF
purificado reveló que la composición de aminoácidos determinada
experimentalmente está de acuerdo con la composición de aminoácidos
esperada basada en la secuencia de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplea una espectrometría
MALDI-TOF para evaluar el número de grupos PEG
unidos a G-CSF de ts PEGilado y para seleccionar
variantes de G-CSF PEGilados.
El G-CSF de ts contiene 5 aminas
primarias que son los sitios de unión esperados para
SPA-PEG (el grupo amino N-terminal
y el grupo \varepsilon-amino sobre K16, K23, K34 y
K40). Tras la PEGilación del G-CSF de ts con
SPA-PEG 5000, una espectrometría de masas
MALDI-TOF muestra la presencia de especies de
G-CSF de ts con, principalmente, 4, 5 y 6 grupos
PEG unidos. Además también se observó claramente
G-CSF de ts con 7 grupos PEG unidos, aunque en
cantidades pequeñas.
El variante de G-CSF que tiene
las sustituciones K16R, K34R, K40R, Q70K, Q90K, y Q120K también
contiene 5 aminas primarias (el grupo amino
N-terminal y el grupo
\varepsilon-amino sobre K23, K70, K90 y K120).
Tras la PEGilación de este variante de G-CSF con
SPA-PEG 5000, una espectrometría de masas
MALDI-TOF muestra la presencia de especies del
variante de G-CSF con, principalmente, 4, 5 y 6
grupos PEG unidos. Además también se observó claramente un variante
de G-CSF con 7 grupos PEG unidos, aunque en
cantidades pequeñas.
El variante de G-CSF que tiene
las sustituciones K16R, K34R, y K40R contiene 2 aminas primarias (el
grupo amino N-terminal y el grupo
\varepsilon-amino sobre K23). Tras la PEGilación
de este variante de G-CSF con
SPA-PEG 12000, una espectrometría de masas
MALDI-TOF muestra la presencia de especies del
variante de G-CSF con, principalmente, 2 y 3 grupos
PEG unidos. Además también se observó claramente un variante de
G-CSF con 4 grupos PEG unidos, aunque en cantidades
pequeñas.
Estas observaciones evidentemente demuestran
que, además de los restos aminoácidos que contienen amina, otros
restos aminoácidos a veces se PEGilan bajo las condiciones de
PEGilación utilizadas. También demuestra que tiene importancia para
la PEGilación dónde se introducen los grupos amina. Esto también se
ha observado utilizando un análisis de SDS-PAGE del
G-CSF de ts y de los variantes de
G-CSF.
Como se describe en el ejemplo 11, se ha
demostrado que la histidina 170 está completamente PEGilada cuando
se utiliza la química de SPA-PEG. Además, K23 y S159
están parcialmente PEGiladas. Esto explica la presencia de
1-2 sitios extra de PEGilación, ademas de las amina
primarias en hG-CSF y en los variantes que se han
fabricado.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cartografiar los sitios de unión
adicionales para SPA-PEG en G-CSF y
en los variantes de G-CSF se utilizó la siguiente
estrategia.
Un variante de G-CSF con un
número bajo de grupos amina se eligió para reducir el número de
sitios de PEGilación esperados hasta un mínimo. El variante de
G-CSF elegido tenía las sustituciones K16R, K34R,
K40R y H170Q. Además del grupo \varepsilon-amino
sobre K23 que los datos previos habían demostrado que no estaba
PEGilado en gran medida, este variante sólo contiene una amina
primaria en el N-terminal. Por tanto, la PEGilación
de fondo sobre los grupos amina se reduce significativamente en este
variante de G-CSF. El variante de
G-CSF se PEGiló utilizando SPA-PEG
5000. Tras la PEGilación, el variante de G-CSF se
desnaturalizó, se redujeron los enlaces disulfuro, se alquilaron
los grupos tiol resultantes, y la proteína alquilada y PEGilada se
degradó con proteasa específica del ácido glutámico. Por último,
los péptido resultantes se separaron mediante una HPLC en fase
inversa.
En paralelo, la versión no PEGilada del variante
de G-CSF con las sustituciones K16R, K34R, y K40R se
trató de forma idéntica para crear un cromatograma de HPLC de
referencia.
La comparación de los cromatogramas de HPLC de
la degradación del variante G-CSF PEGilado y del
variante de G-CSF no PEGilado entonces deberían
revelar cuáles son los péptidos que desaparecen tras la PEGilación.
La identificación de estos péptidos mediante secuenciación de
aminoácidos N-terminal del péptido procedente del
variante de G-CSF no PEGilado entonces apunta
indirectamente a las posiciones que están PEGiladas.
En principio, habría sido preferible utilizar la
versión no PEGilada del variante de G-CSF que tiene
todas las sustituciones K16R, K34R, K40R y H170Q, para para todos
los fines prácticos, esto no importa.
De forma más específica, aproximadamente 1 mg
del variante de G-CSF PEGilado que tiene las
sustituciones K16R, K34R, K40R y H170Q, y aproximadamente 500
\mug del variante de G-CSF no PEGilado que tiene
las sustituciones K16R, K34R, y K40R se secaron en un concentrado
SpeedVac. Las dos muestras se disolvieron cada una en 400 \mul de
guanidinio 6 M, Tris-HCl 0,3 M, pH 8,3, y se
desnaturalizaron durante la noche a 37ºC. Tras la desnaturalizacón,
los enlaces disulfuro en las proteínas se redujeron mediante la
adición de 50 \mul de DTT 0,1 M en guanidinio 6 M,
Tris-HCl 0,3 M, pH 8,3. Después de 2 h de incubación
a temperatura ambiente, los grupos tiol presentes se alquilaron
mediante la adición de 50 \mul de yodoacetamida 0,6 M en
guanidinio 6 M, Tris-HCl 0,3 M, pH 8,3. La
alquilación se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente
antes de que las proteínas reducidas y alquiladas se sometiesen a
un intercambio de tampón en NH_{4}HCO_{3} 50 mM utilizando
columnas NAP5. Los volúmenes de las muestras se redujeron hasta
aproximadamente 200 \mul en un concentrador SpeedVac antes de la
adición de 20 \mug y 10 \mug de proteasa específica del ácido
glutámico, respectivamente. Las degradaciones con la proteasa
específica del ácido glutámico se realizaron durante 16 h a 37ºC.
Los péptidos resultantes se separaron mediante una HPLC en fase
inversa, empleando una columna Phenomenex Júpiter C_{18} (0,2 x 5
cm), eluyendo con un gradiente lineal de acetonitrilo en TFA acuoso
al 0,1%. Las fracciones recogidas se analizaron mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF y posteriormente
los péptidos seleccionados se sometieron a un análisis de la
secuencia de aminoácidos N-terminal.
La comparación de los cromatogramas de HPCL de
la degradación del variante de G-CSF PEGilado y del
variante de G-CSF no PEGilado reveló que sólo dos
fracciones desaparecen tras la PEGilación. El ánalisis de la
secuencia de aminoácidos N-terminal de las dos
fracciones procedentes del variante de G-CSF no
PEGilado demostró que ambos péptidos se derivan del
N-terminal de G-CSF. Un péptido
consistía en 1-11 restos aminoácidos generados por
una ruptura inesperada tras Gln11. El otro péptido consistía en
1-19 restos aminoácidos generados por una ruptura
esperada tras Glu19.
Se esperaba que el péptido
N-terminal de G-CSF se identificaría
utilizando esta estrategia, puesto que el grupo amino
N-terminal se PEGila con facilidad. Sin embargo,
ninguno de los sitios de unión adicionales para
SPA-PEG 5000 se identificó utilizando esta
estrategia.
Una alternativa a la identificación indirecta de
sitios de unión de PEG 5000 es la identificación directa de los
sitios de unión en péptidos PEGilados. Sin embargo, las fracciones
que contenían los péptidos PEGilados en la separación por HPLC del
variante de G-CSF PEGilado degradado no se separaron
bien entre sí ni de varias fracciones que contenían péptidos no
PEGilados. Por tanto, el análisis de la secuencia de aminoácidos
N-terminal de estas fracciones no produjo ningún
dato útil, excepto por una indicación de que K23 podría esetar
parcialmente PEGilado.
Para solucionar estos problemas se fabricaron
dos conjuntos de péptidos PEGilados a partir de las fracciones
procedentes de la primera separación con HPLC. Estos dos conjuntos
se secaron en un concentrador SpeedVac, se disolvieron en 20 \mul
de NH_{4}HCO_{3} 50 mM recién preparado y después se degradaron
con 1 \mug de quimotripsina. Los péptidos resultantes se
separaron mediante una HPLC en fase inversa, empleando Phenomenex
Júpiter C_{18} (0,2 x 5 cm), eluyendo con un gradiente lineal de
acetonitrilo en TFA acuoso al 0,1%. Las fracciones recogidas se
analizaron mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF y posteriormente los péptidos
seleccionados se sometieron a un análisis de la secuencia de
aminoácidos N-terminal.
\global\parskip0.880000\baselineskip
A partir de las determinaciones de la secuencia
de aminoácidos N-terminal se pudo determinar que
K23, así como S159, estaban parcialmente PEGilados. No fue posible
determinar el grado exacto de PEGilación en estas dos posiciones,
pero la PEGilación sólo es parcial, porque los péptidos en que K23 y
S159 están sin modificar pudieron identificarse y secuenciarse a
partir de la separación con HPLC inicial.
Una observación coherente cuando se analizan
G-CSF de ts y variantes de G-CSF
purificados mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF es la presencia de otro componente con una
masa aproximadamente 324 Da mayor que la masa de la molécula de
G-CSF analizada. Como el componente de menor masa
molecular invariablemente tiene la masa de la molécula de
G-CSF, y debido a que las moléculas de
G-CSF tienen la secuencia de aminoácidos
N-terminal correcta, se concluyó que el otro
componente es una molécula de G-CSF modificada que
porta dos restos hexosa. En muchos casos, la molécula de
G-CSF no modificada produce la señal más intensa
pero en algunos casos la intensidad de la señal para la molécula de
G-CSF modificada es la más intensa.
Durante el análisis de los péptidos generados
con el objetivo de identificar los sitios de PEGilación adicionales,
en cada degradación se identificaron dos péptidos de interés para
identificar el sitio de glicosilación.
En ambas separaciones con HPLC, los dos péptidos
eluyeron cerca uno del otro y la espectrometría de masas
MALDI-TOFF muestra una diferencia de masas entre los
dos péptidos de aproximadamente 324 Da. Los datos de la
espectrometría de masas indican que el péptido abarca los restos
aminoácidos 124-162. El análisis de la secuencia de
aminoácidos N-terminal de los cuatro péptidos
demuestra que esta asignación es correcta y que Thr133 es el único
sitio de modificación. En los péptidos con la masa del péptido no
modificado, Thr133 se observa claramente en la secuencia, mientras
que no puede asignarse ningún resto aminoácido a la posición 133 en
los péptidos con una masa adicional de 324 Da. Puesto que todos los
demás restos aminoácidos pudieron asignarse en la secuencia, se
concluyó que Thr133 es el único sitio de modificación. Se había
indicado previamente que este sitio de glicosilacón se había
utilizado
en G-CSF recombinante expresado en células CHO, aunque el glicano es diferente del acoplado por las levaduras.
en G-CSF recombinante expresado en células CHO, aunque el glicano es diferente del acoplado por las levaduras.
El G-CSF de ts no glicosilado se
separó del G-CSF de ts glicosilado empleando HPLC en
fase inversa utilizando una columna Vydac C_{18} (0,21 x 5 cm)
eluyendo isocráticamente con acetonitrilo al 51% en TFA al 0,1%,
como una fracción que, según muestra una espectrometría de masas
MALDI-TOFF, sólo contiene la forma no glicosilada
del G-CSF de ts.
La separación de moléculas de
G-CSF unidas covalentemente a 4, 5 ó 6 grupos PEG se
obtuvo como sigue. Una proteína PEGilada en citrato de sodio 20 mM,
pH 2,5, se aplicó a una columna de SP-Sepharose FF
equilibrada con citrato de sodio 20 mM, pH 2.5. El material no
unido se lavó de la columna. La elución se realizó utilizando un
gradiente de pH. El G-CSF PEGilado comenzó a eluir
de la columna a aproximadamente pH 3,8 y continuó eluyendo en las
fracciones que abarcan un intervalo de pH de 3,8 a 4.5.
Las fracciones se sometieron a
SDS-PAGE y a análisis espectrométricos de masas.
Estos análisis indican que el G-CSF con el grado
más alto de PEGilación está localizado en las "fracciones de pH
bajo". El G-CSF PEGilado que tiene el grado más
bajo de PEGilación se eluye en las "fracciones de pH alto".
El análisis de aminoácidos realizado con
G-CSF PEGilado mostró una buena coherencia entre el
coeficiente de extinción determinado de forma teórica y de forma
experimental.
Se introdujeron sustituciones específicas de los
aminoácidos existentes en hG-CSF por otros restos
aminoácidos, por ejemplo, las sustituciones específicas analizadas
anteriormente en la descripción general, utilizando técnicas de ADN
convencionales conocidas en la técnica. Los nuevos variantes de
G-CSF se fabricaron utilizando el plásmido
pG-CSFcerevisiae que contenía el gen, que codifica
el hG-CSF sin el marcador HIS, como molde de ADN en
las reacción de PCR. Los variantes se expresaron en S.
cerevisiae y se purificaron como se describe en el ejemplo 3.
Algunos de los variantes de G-CSF construidos se
listan a continuación (véase el ejemplo 9 y 10).
El G-CSF humano y sus variantes
se unieron covalentemente a SPA-PEG 5000,
SPA-PEG 12000 y SPA-PEG 20000
(Shearwater) como se describió anteriormente ("PEGilacón del
hG-CSF y sus variantes en disolución"). Las
actividades in vitro de los conjugados se listan en el
ejemplo 12.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El SPA-PEG puede unirse a otros
restos aminoácidos diferentes de la lisina en G-CSF.
Para determinar si el SPA-PEG se une a histidinas,
serinas, treoninas y argininas, se fabricaron variantes en que estos
aminoácidos se sustituyeron por lisina, alanina o glutamina. Los
variantes se expresaron en S. cerevisiae, se purificaron y
se PEGilaron, seguido de un análisis del número de moléculas de
SPA-PEG unidas en SDS-PAGE. Una
reducción en el número de moléculas de SPA-PEG
unidas después de la sustitución de un aminoácido dado por glutamina
o alanina indica, en gran medida, que este aminoácido es PEGilado
por SPA-PEG, y esta observación también se ve
apoyada porque no cambia el grado de PEGilación después de la
sustitución del aminoácido por lisina. Los variantes analizados se
listan a
continuación:
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos demuestran que, además del
N-terminal, K16, K34 y K40, SPA-PEG
también se une covalentemente a H170. Además, los datos demuestran
que sólo 10% de los restos aminoácidos K23 disponibles están
PEGilados y que aproximadamente 10% de S159 está PEGilado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las actividades biológicas in vitro del
hG-CSF conjugado y no conjugado y sus variantes se
midieron como se describió anteriormente en "Ensayo primario 2 -
Ensayo de la actividad G-CSF in vitro".
Los valores de EC50 medidos para cada variante con y sin
conjugación de SPA-PEG 5000 a los sitios de
PEGilación disponibles se listan a continuación. Los valores se
normalizaron con respecto al valor de EC50 del
hG-CSF no conjugado (Neupogen®). Este valor se
midió simultáneamente con los variantes cada vez bajo condiciones de
ensayo idénticas. El valor de EC50 del hGCF en el ensayo descrito
es de 30 pM.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos demuestran que la sustitución de K23
por arginina no aumenta la actividad de la proteína conjugada. Esto
es debido al hecho de que sólo 10% de K23 está PEGilado, mientras
que el variante K23R conjugado tiene esencialmente el mismo número
de grupos PEG unido a él y tiene la misma localización de los sitios
de PEGilación que hG-CSF. La eliminación del resto
de lisinas en las posiciones K16, K34 y K40 produjo un variante de
G-CSF con actividad significativa después de la
PEGilación. La conjugación de SPA-PEG 5000 con este
variante no disminuye la actividad significativamente cuando se
compara con el variante no conjugado. Por tanto, la PEGilación del
N-terminal y H170 con SPA-PEG 5000
no disminuye la actividad de hG-CSP. Se decidió
utilizar hG-CSF K16R K34R K40R como esqueleto para
la inserción de nuevos sitios de PEGilación. Se introdujeron 21
nuevos sitios de PEGilación entre los restos E45 y H159 en este
esqueleto. Estos restos se distribuyeron a través de partes del
hG-CSF que no interaccionan con el receptor de
G-CSF. La introducción de nuevos sitios de
PEGilación en las posiciones Q70, Q90, T105, Q120, T133 y S142
produjo variantes de hG-CSF que mantuvieron una
cantidad significativa de actividad después de la PEGilación por
SPA-PEG 5000. Por tanto, estos nuevos sitios de
PEGilación se combinaron en variantes de hG-CSF que
tenían 2 ó 3 nuevos sitios de PEGilación. Los más activos de estos
variantes después de la PEGilación con SPA-PEG 5000
fueron hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K y
hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K.
Además, SPA-PEG 5000,
SPA-PEG 12000 y SPA-PEG 20000 se
unieron a hG-CSF K16R K34R K40R. Los valores de EC50
in vitro fueron 35%, 10% y 1%, respectivamente, del
hG-CSF no conjugado (Neupogen®).
\vskip1.000000\baselineskip
La semivida in vivo del
hG-CSF no conjugado (Neupogen®) y
SPA-PEG 5000 conjugado con hG-CSF
K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K se midió como se describió
anteriormente ("Medición de la semivida in vivo del
rhG-CSF conjugado y no conjugado y sus
variantes"). Los resultados se muestran en la figura 1. Se
determinó que la semivida in vivo de Neupogen® y
SPA-PEG 5000 conjugado con hG-CSF
K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K era de 2,01 horas y 12,15 horas,
respectivamente. Por tanto, la introducción de nuevos sitios de
PEGilación en hG-CSF y la conjugación de
SPA-PEG 5000 con ellos produjo un aumento
significativo de la semivida in vivo. En un experimento
anterior, la semivida in vivo de Neupogen® se comparó con
hG-CSF con una molécula de PEG conjugada en el
N-terminal más grande (10 kDa). En este caso, se
determinó que la semivida in vivo era de 1,75 horas y 7,01
horas, respectivamente. Por tanto, SPA-PEG 5000
conjugado con hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K
tiene una semivida significativamente más larga que Neupogen® y que
hG-CSF con una molécula de PEG conjugada en el
N-terminal de 10 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las actividades biológicas in vivo del
hG-CSF no conjugado (Neupogen®),
SPA-PEG 5000 conjugado con hG-CSF
K16R K34R K40R Q70K Q120K, y SPA-PEG 5000 conjugado
con hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K se
midieron como se describió anteriormente ("Medición de la
semivida in vivo del rhG-CSF conjugado y no
conjugado y sus variantes"). Los resultados se muestran en la
figura 2. No se detectó actividad de Neupogen® a las 48 horas
después de la inyección de 100 \mug por kg de peso corporal a t =
0 horas. Pudo detectarse actividad de SPA-PEG 5000
conjugado con hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K hasta
72 horas después de la inyección inicial, mientras que
SPA-PEG 5000 conjugado con hG-CSF
K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K permaneció activo in vivo
hasta 96 horas después de la inyección inicial. Por tanto, se
demostró que ambos variantes del conjugado tenían una actividad
biológica in vivo más larga que Neupogen®, y que
SPA-PEG 5000 conjugado con hG-CSF
K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K permanecía activo durante un tiempo
dos veces más largo in vivo que Neupogen®.
Además, se midieron las actividad biológicas
in vivo de Neupogen®, SPA-PEG 12000 conjugado
con hG-CSF K16R K34R K40R y diferentes dosis de
SPA-PEG 5000 conjugado con hG-CSF
K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K. Los resultados se muestran en la
figura 3. Como se observó anteriormente, no se detectó actividad de
Neupogen® a las 48 horas después de la inyección inicial de 100
\mug por kg de peso corporal. La administración de 5 \mug por
kg de peso corporal de SPA-PEG 5000 conjugado con
hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K dio como
resultado una actividad biológica in vivo ligeramente más
larga que Neupogen®, mientras que la administración de 25 \mug
por kg de peso corporal y 100 \mug por kg de peso corporal de este
compuesto dio como resultado una actividad hG-CSF
hasta 72 y 96 horas, respectivamente, después de la inyección
inicial. El SPA-PEG 12000 conjugado con
hG-CSF K16R K34R K40R permaneció activo in
vivo hasta 72 horas después de la administración de 100 \mug
por kg de peso corporal. Como se describe en el ejemplo 5, el
SPA-PEG 12000 conjugado con hG-CSF
K16R K34R K40R tiene 2 ó 3 grupos SPA-PEG 12000
unido, mientras que el SPA-PEG 5000 conugado con
hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K tiene 5 ó 6
grupos SPA-PEG 5000 unidos. Por tanto, los pesos
moleculares de los dos compuestos son de 42-54 kDa
y 43-48 kDa, respectivamente. La actividad biológica
in vivo más larga de SPA-PEG 5000 conjugado
con hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K, cuando se
compara con SPA-PEG 12000 conjugado con
hG-CSF K16R K34R K40R con esencialmente el mismo
peso molecular, demuestra que la distribución de las moléculas de
PEG unidas es importante para la duración de la actividad biológica
in vivo.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Maxygen ApS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Conjugados de
G-CSF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 8wo02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2000 00024
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-01-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2000 00341
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
02-03-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2000 00943
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
16-06-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 525
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaaacacc aacaccaaca tcaacatcaa catcaacatc aacag
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 615
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Un polipéptido que muestra actividad del
factor estimulante de colonias de granulocitos
(G-CSF), que comprende una secuencia de aminoácidos
que se diferencia de la secuencia de aminoácidos de
hG-CSF que aparece en SEQ ID NO:1 en hasta 15
restos, y que comprende las sustituciones K16R, K34R, K40R y T105K
con relación a SEQ ID NO:1.
2. Un conjugado polipeptídico que muestra
actividad G-CSF, que comprende:
i) un polipéptido que muestra actividad
G-CSF según la reivindicación 1, y
ii) al menos un resto no polipeptídico unido a
un resto lisina del polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El polipéptido de la reivindicación 1 o el
conjugado de la reivindicación 2, en los que el polipéptido
comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo que
consiste en Q70K, Q90K, Q120K y T133K.
4. El conjugado de la reivindicación 2 ó 3, en
el que el resto no polipeptídico se selecciona del grupo que
consiste en homopolímeros y heteropolímeros naturales y
sintéticos.
5. El conjugado de la reivindicación 4, en el
que el polímero es un homopolímero o heteropolímero sintético
seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol lineal o
ramificado, poli(alcohol vinílico) (PVA), ácidos
policarboxílicos y polivinilpirrolidona.
6. El conjugado de la reivindicación 5, en el
que el polímero es un polietilenglicol lineal o ramificado.
7. El conjugado de la reivindicación 6, en el
que el polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente
1.000-15.000 Da.
8. El conjugado de la reivindicación 5 ó 6, que
comprende 2-8 restos polietilenglicol.
9. El polipéptido o el conjugado de una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que el
polipéptido se diferencia en hasta 10 restos aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:1.
10. El polipéptido o el conjugado de una
cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en los que
el polipéptido está glicosilado.
11. El polipéptido o el conjugado de la
reivindicación 10, en los que el polipéptido comprende al menos un
sitio de glicosilación no natural.
12. El polipéptido o el conjugado de una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que el
polipéptido incluye un resto metionina
N-terminal.
13. El conjugado de una cualquiera de las
reivindicaciones 2-12, que tiene una mayor semivida
funcional in vivo y/o semivida en suero comparado con el
G-CSF humano recombinante (rhG-CSF)
que comprende un único resto PEG de 20 kDa unido en el
N-terminal.
14. Un procedimiento para producir un conjugado
polipeptídico según una cualquiera de las reivindicaciones
2-13, que comprende cultivar una célula hospedante
que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido bajo condiciones que conducen a la expresión del
polipéptido, y recuperar el polipéptido, en el que a) el
polipéptido comprende al menos un sitio de N- u
O-glicosilación, y la célula hospedante es una
célula hospedante eucariota capaz de realizar la glicosilación in
vivo, y/o b) el polipéptido se somete a conjugación con un
resto no polipeptídico
in vitro.
in vitro.
15. Una composición que comprende un polipéptido
o un conjugado polipeptídico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, y un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
16. Un polipéptido o un conjugado polipeptídico
según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, o
una composición según la reivindicación 15, para su uso como
producto farmacéutico.
17. El polipéptido o el conjugado polipeptídico
de la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de
trastornos hematopoyéticos generales.
18. El polipéptido o el conjugado polipeptídico
de la reivindicación 17, en el que el trastorno hematopoyético es
un trastorno que surge de una terapia de radiación o de una
quimioterapia, leucopenia, SIDA u otra enfermedad de
inmunodeficiencia, o una infección bacteriana u otra infección.
19. El uso de un polipéptido o el conjugado
polipeptídico según una cualquiera de las reivindicaciones
1-13, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de trastornos hematopoyéticos generales.
20. El uso de la reivindicación 19, en el que el
trastorno hematopoyético es un trastorno que surge de una terapia
de radiación o de una quimioterapia, leucopenia, SIDA u otra
enfermedad de inmunodeficiencia, o una infección bacteriana u otra
infección.
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