JP2003321363A - 血管新生抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決課題】 下記の一般式（ａ）で表されるカルボリ
ン誘導体又は一般式（ｂ）で表されるカシノイド誘導体
を有効成分とする血管新生抑制剤及び抗腫瘍剤： 【化１】 〔Ｒ¹は無置換又は酸素原子；Ｒ²は水素原子、ヒドロキ
シ基、メトキシ基又は−ＯＧｌｃ；Ｙは水素原子又はメ
トキシ基；Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、同一又は異なっていて
もよい水素原子又はヒドロキシ基〕。 【効果】 咽頭癌、肺癌及び大腸癌等の固形癌を始めと
する悪性腫瘍、糖尿病性網膜症、リウマチ、乾癬等の炎
症性疾患等の血管新生に関与する各種疾患の予防及び／
又は治療剤として有用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タイ産植物エウリ
コマ・ハルマンディアナ（Eurycoma harmandiana）由来
成分を有効成分とする血管新生抑制剤及び抗腫瘍剤に関
する。

【０００２】

【従来の技術】血管新生は、発生、創傷治癒等において
重要な役割を果たす他、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、
網膜静脈閉鎖症、網膜動脈閉鎖症等の網膜疾患、新生血
管性緑内障、リュウマチ、リュウマチ性関節炎、乾癬等
の各種炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、固形腫瘍
（胃癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌等）の増殖・転移、心筋
梗塞等の病的状態にも関係することが知られている（非
特許文献１〜５参照）。近年、血管内皮細胞に特異的に
働き、血管新生を促進する因子であるＶＥＧＦ（Vascul
ar Endothelial Growth Factor）やアンジオポエチン等
のリガンド及びそのレセプター系が次々と見出され、血
管新生と当該疾病との関係がより明確にされている。従
って、血管新生を抑制することがこれらの疾病の治療及
び予防に繋がると考えられる。例えば、固形癌の増殖に
とっては、酸素や栄養を供給するための腫瘍血管新生が
必要であることから斯かる血管の新生を阻害して、固形
癌をいわゆる"兵糧攻め"の状態にすれば、結果として癌
の縮小が期待できる。また、糖尿病網膜症においては、
酸素不足により微小毛細血管の形成が促進され、やがて
これが破裂・出血してはん痕組織を形成し、ついには網
膜剥離に至ると考えられていることから、血管新生を抑
制することで網膜症の重篤化が抑制できる。

【０００３】一方、近年、疾患治療においては生命・生
存の質を重要視する傾向が全社会的に高まりつつあり、
例えば、従来の抗癌剤のように癌細胞のみならず体細胞
にも作用する殺細胞効果を有し重篤な副作用を引き起こ
す薬剤に変わる、安全性の高い薬剤が求められている。

【０００４】

【非特許文献１】Folkmanら, Nature, (1980) Vol. 28
8, 551-556

【非特許文献２】高木 均，細胞工学(2000), Vol 19,
No.8, 1160-1165

【非特許文献３】寺野 紘，細胞工学(1995), Vol 14,
No.4, 426-430

【非特許文献４】Richard D Connell, Exp.Opin. Ther.
Patents(2000), 10(6), 767-786

【非特許文献５】渋谷正史，蛋白質核酸酵素(2000), Vo
l 45, No.6, 1182-1187

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、有効性を保
ちつつ長期投与しても安全性の高い血管新生抑制剤、特
に固形癌、糖尿病性網膜症、各種炎症性疾患に有効な薬
剤を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、斯かる実
情に鑑み、血管新生抑制作用を有する物質を種々探索し
た結果、タイ産植物エウリコマ・ハルマンディアナ（Eu
rycoma harmandiana）に含まれる成分であるカルボリン
誘導体（ａ）及びカシノイド誘導体（ｂ）に優れた血管
新生抑制作用があり、抗腫瘍剤を始めとする血管新生に
関与する各種疾患の予防及び／又は治療剤として有用で
あることを見出し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち本発明は、下記の一般式（ａ）：

【０００８】

【化５】

【０００９】〔式中、Ｒ¹は無置換又は酸素原子を示
し、Ｒ²は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基又は−
ＯＧｌｃを示し、Ｙは水素原子又はメトキシ基示す。〕
で表されるカルボリン誘導体を有効成分とする血管新生
抑制剤及び抗腫瘍剤を提供するものである。

【００１０】また本発明は、下記の一般式（ｂ）：

【００１１】

【化６】

【００１２】〔式中、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、同一又は異
なっていてもよい水素原子又はヒドロキシ基を示す。〕
で表されるカシノイド誘導体を有効成分とする血管新生
抑制剤及び抗腫瘍剤を提供するものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明の一般式（ａ）のカルボリ
ン誘導体及び一般式（ｂ）のカシノイド誘導体は、何れ
もタイ原産のニガキ科（Simaroubaceae）植物であるエ
ウリコマ・ハルマンディアナ（Eurycoma harmandiana；
タイ名Ian-don）より単離された成分である（Phytochem
istry 56,(2001),383-386、Phytochemistry 57,(2001),
1205-1208）。斯かるエウリコマ・ハルマンディアナの
根は、タイにおいて催淫剤、腫瘍或いはマラリアの治療
薬として使用されているが、上記の成分に関する薬理学
的研究は未だなされていない。

【００１４】本発明の式（ａ）で表されるカルボリン誘
導体において、Ｒ¹で示される−ＯＧｌｃはＯ−グルコ
シドを意味し、好ましくはＯ−β−グルコピラノシドで
ある。

【００１５】また、本発明のカルボリン酸誘導体（ａ）
は、例えば塩酸、硫酸、硝酸等の強酸類等が付加して、
薬理学的に許容される塩を形成することができ、斯かる
塩もまた本発明に包含される。また、本発明のカシノイ
ド誘導体（ｂ）は、例えば酢酸、酪酸、プロピオン酸、
乳酸等の低級脂肪酸類が付加して、薬理学的に許容され
るアセテートを形成することができ、斯かるアセテート
もまた本発明に包含される。

【００１６】本発明のカルボリン誘導体（ａ）及びカシ
ノイド誘導体（ｂ）の好ましい具体例を以下に示す。

【００１７】

【化７】

【００１８】本発明のカルボリン誘導体（ａ）及びカシ
ノイド誘導体（ｂ）は、エウリコマ・ハルマンディアナ
等の植物より、抽出、分画、精製することにより得るこ
とができる（Phytochemistry 56,(2001),383-386、Phyt
ochemistry 57,(2001),1205-1208、A. D. Kinghorn et
al., J. Nat. Prod., 54(5), 1360-1367(1991).、K.Mit
sunaga et al., Phytochemistry, 35(3), 799-802(199
4).）。また、通常用いられる合成方法や半合成方法、
又は公知の合成方法の組み合わせによっても得ることが
できる。

【００１９】抽出法によるカルボリン誘導体（ａ）及び
カシノイド誘導体（ｂ）を取得する方法を以下に説明す
る。抽出は、特に限定されるものでなく、エウリコマ・
ハルマンディアナの根、材、枝、葉、又は種子を水、メ
タノール、エタノール等の低級アルコール又はアセトン
のような水溶性有機溶媒で、室温又は加熱する方法、水
とこれらの水溶性有機溶媒との混合物により抽出する方
法、更にクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エステル
類、トルエン、炭酸ガスによる超臨界流体等の疎水性有
機溶媒とメタノール等の水溶性有機溶媒の混合物により
抽出する方法が使用できるが、特に、根を裁断又は粉砕
し、水、メタノール、エタノール等の低級アルコール、
好ましくはエタノール、更に好ましくは９５％エタノー
ルで、約１２時間（３回）冷浸するのが好ましい。

【００２０】得られた抽出物を濃縮後、適当な有機溶
媒、例えばジクロロメタン、酢酸エチル、ｎ−ブタノー
ル等で分配した後、シリカゲル、化学結合シリカゲル、
アルミナ、セルロース類、ポーラスポリマーによるカラ
ムクロマト等を適宜組み合わせて用いて、分画・精製す
ることにより、カルボリン誘導体（ａ）及びカシノイド
誘導体（ｂ）を単離することができる（後記製造例１〜
８参照）。

【００２１】かくして得られる本発明のカルボリン誘導
体（ａ）及びカシノイド誘導体（ｂ）は、後記実施例に
示すように、血管内皮細胞増殖阻害活性及び血管細胞の
キャピラリーネットワーク形成阻害活性を有することか
ら血管新生抑制剤として有用であり、また腫瘍細胞に対
する細胞障害活性を有することから抗腫瘍剤としても有
用である。

【００２２】本発明の血管新生抑制剤及び抗腫瘍剤は、
効果を低減させない範囲内で、分散補助剤、賦形剤等の
通常製剤化に使用されるような担体と混合し、粉剤、液
剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシ
ル剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、リモナーデ剤
等の内服、又は注射剤等の剤形で使用することができ
る。

【００２３】このような担体としては、例えばマンニト
ール、乳糖、デキストラン等の水溶性の単糖類、オリゴ
糖類又は多糖類；例えばヒドロキシプロピルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセル
ロース等のゲル形成性又は水溶性のセルロース類；例え
ば結晶性セルロース、α―セルロース、架橋カルボキシ
メチルセルロースナトリウム及びそれらの誘導体等の水
吸収性でかつ水難溶性のセルロース類；例えばヒドロキ
シプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋澱粉、ア
ミロース、アミロペクチン、ペクチン及びそれらの誘導
体等の水吸収性でかつ水難溶性の多糖類；例えばアラビ
アガム、トラガントガム、グリコマンナン及びそれらの
誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性のガム類；例えばポ
リビニルピロリドン、架橋ポリアクリル酸及びその塩、
架橋ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタ
クリレート及びそれらの誘導体等の架橋ビニル重合体
類；リン脂質、コレステロール等のリポソーム等分子集
合体を形成する脂質類糖を挙げることができる。

【００２４】本発明の血管新生抑制剤又は抗腫瘍剤は、
カルボリン誘導体（ａ）又はカシノイド誘導体（ｂ）を
それぞれ単独で用いることもできるが、２種以上を組み
合わせて使用することもできる。

【００２５】本発明の血管新生抑制剤又は抗腫瘍剤の投
与量は、患者の症状等に合わせて適宜調製すれば良い
が、例えばカルボリン誘導体（ａ）又はカシノイド誘導
体（ｂ）として、０．０１〜２０００ｍｇ／日、好まし
くは０．１〜５００ｍｇ／日、特に０．５〜２００ｍｇ
／日投与するのが好ましい。

【００２６】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。 製造例１ エウリコーマ・ハルマンディアナ抽出物の製
造 乾燥したニガキ科エウリコーマ・ハルマンディアナ（Eu
rycoma harmandiana）の根７ｋｇを１８Ｌの９５％エタ
ノールで９０℃、３時間抽出した。室温に冷却し、ろ紙
でろ過した後、水流ポンプ減圧下、溶媒を留去し、２０
０ｇの抽出濃縮物を得た。

【００２７】製造例２ 化合物（ａ１）の製造

【００２８】

【化８】

【００２９】抽出物の濃縮物を、ジクロロメタン、酢酸
エチル、ｎ−ブタノール（各２Ｌ）の順に抽出し、濃縮
乾固し、ジクロロメタン画分、酢酸エチル画分、ブタノ
ール画分、残渣を得た。次に、ブタノール画分（４５
ｇ）を、ジビニルベンゼンとスチレンからなる共重合体
（ポーラスポリマー）を充填したカラムクロマトに付
し、水、メタノール、アセトンの順に溶出した。メタノ
ールで溶出した画分を、更にシリカゲルカラムクロマト
に付し、酢酸エチル−メタノール（９：１）の混合物及
び酢酸エチル−メタノール−水（４：１：０．１、７：
３：０．３又は６：４：１）の混合物を移動相に用いて
溶出し、９画分（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ及び
Ｉ）を得た。この内、画分Ｅ及びＦを、オクタデシルシ
リル化シリカゲルを充填剤に用いたカラムクロマトに付
し、７０−５０％含水メタノールで溶出し、化合物（ａ
１）を７５ｍｇ単離した。

【００３０】性状：黄色非晶系粉末 MS (HR-FAB-MS): m/z 399.1205 [M+H]⁺（C₂₀H₁₉N₂O₇ 39
9.1192）;¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ_ppm: 8.79 (1H, d, J=5Hz), 8.29
(1H, d, J=9Hz), 8.211 (1H, d, J=5Hz), 8.17 (1H, d,
J=2Hz), 8.12 (1H, d, J=10Hz), 7.30 (1H, dd, J=9,
2Hz), 6.97 (1H, d, J=10Hz), 5.45 (1H, d, J=3Hz),
5.03 (1H, dd, J=1, 3Hz), 4.57 (1H, t, J=3Hz), 4.08
(1H, q, J=3Hz), 3.72 (1H, m), 3.54 (1H, m), 3.4-
3.2 (m), 3.16 (1H, d, J=3Hz);¹³ C-NMR (DMSO-d₆) δ_ppm: 159.7, 158.8, 145.9, 139.
9, 139.8, 135.2, 131.7, 129.2, 128.1, 124.3, 118.
1, 116.4, 114.2, 104.4, 101.0, 77.2, 76,5,73.3, 6
9.5, 60.6

【００３１】製造例３ 化合物（ａ２）の製造

【００３２】

【化９】

【００３３】製造例２のジクロロメタン画分（９０ｇ）
を、シリカゲルを充填したカラムクロマトに付し、ジク
ロロメタン、ジクロロメタン−メタノールの混合物（１
９：１、９：１、４：１、３：２）、メタノールの順に
溶出し、６画分（Ｄ−１からＤ−６）を得た。このう
ち、画分Ｄ−２をシリカゲルクロマトで、ジクロロメタ
ンから５％メタノール含有ジクロロメタンの線形グラジ
ェントにより、溶出した。更に、オクタデシルシリル化
シリカゲルを用いた逆相クロマト（溶媒系：６０％〜０
％含水メタノール）で分画し、化合物（ａ２）３６７ｍ
ｇを得た。

【００３４】性状：黄色針状晶 MS (HR-MS): m/z 236.0590 [M]⁺（C₁₄H₈N₂O₂ 236.058
6）;¹ H-NMR (CDCl₃) δ_ppm: 8.76 (1H, d, J=5Hz), 8.17 (1
H, d, J=9Hz), 8.14 (1H, d, J=5Hz), 8.10 (1H, d, J=
10Hz), 8.00 (1H, d, J=3Hz), 7.00 (1H, dd,J= 9, 3H
z), 6.96 (1H, d, J=10Hz);¹³ C-NMR (CDCl₃) δ_ppm: 160.5, 158.9, 146.0, 140.5,
140.0, 135.60, 131.7, 129.9, 128.0, 124.7, 116.0,
115.6, 114.0, 103.0

【００３５】製造例４ 化合物（ａ３）の製造

【００３６】

【化１０】

【００３７】製造例３の画分Ｄ−２より、化合物（ａ
２）と同時に、別画分として化合物（ａ３）９００ｍｇ
を得た。

【００３８】性状：黄色結晶 Positive HR-FAB-MS: m/z 251.2660（C₁₅H₁₁N₂O₂ requi
res 251.2668）;¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ_ppm: 8.74 (1H, d, J=5Hz), 8.14
(1H, d, J=2Hz), 7.98(1H, d, J=10Hz), 7.89 (1H, d,
J=9Hz), 7.80 (1H, d, J=5Hz), 7.03 (1H, dd,J=9, 2H
z), 6.93 (1H, d, J=2Hz), 3.98 (1H, s);¹³ C-NMR (DMSO-d₆) δ_ppm: 162.5, 159.7, 146.0, 141.
2, 139.9, 135.6, 132.3, 130.4, 128.5, 123.3, 117.
2, 115.5, 114.2, 101.2, 56.0

【００３９】製造例５ 化合物（ａ４）の製造

【００４０】

【化１１】

【００４１】製造例３の画分Ｄ−２より、化合物（ａ
２）と同時に、別画分として化合物（ａ４）２８ｍｇを
得た。

【００４２】性状：淡黄色針状結晶 Positive HR-FAB-MS: m/z 221.0718（C₁₄H₉N₂O₂ requir
es 221.0714） ;¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ_ppm: 8.61 (1H, d, J=12Hz), 8.37
(1H, d, J=11Hz), 8.32 (1H, d, J=6 Hz), 7.96 (1H,
d, J=12 Hz), 7.78 (1H, d, J=6Hz), 7.42-7.72 (2H,
m), 6.92 (1H, d, J=11Hz);

【００４３】製造例６ 化合物（ａ５）の製造

【００４４】

【化１２】

【００４５】製造例２のジクロロメタン画分（９０ｇ）
を、シリカゲルを充填したカラムクロマトに対し、ジク
ロロメタン、ジクロロメタン−メタノールの混合物（１
９：１、９：１、４：１）の順に溶出し、６画分（Ｅ−
１からＥ−６）を得た。このうち、画分Ｅ−２をシリカ
ゲルクロマトで、ジクロロメタンから５％メタノール含
有ジクロロメタンの線形グラジェントにより溶出した。
更に、オクタデシルシリル化シリカゲルを用いた逆相ク
ロマトで分画し、化合物（ａ５）８．０ｍｇを得た。

【００４６】Positive HR-FAB-MS: m/z: 281.0931(C₁₆H
₁₃N₂O₃ requires 281.0926)¹³ C-NMR (CD₃Cl, 100MHz) 159.6, 152.3, 148.0, 145.
7, 139.6, 135.7, 134.6, 131.9, 130.6, 128.6, 116.
4, 115.1, 104.0, 100.3, 56.4, 54.6,

【００４７】製造例７ 化合物（ｂ１）の製造

【００４８】

【化１３】

【００４９】製造例２のブタノール画分を、同様に操作
し得られた画分Ｂをシリカゲルクロマトで、ジクロロメ
タン−５％メタノール含有ジクロロメタンの線形グラジ
ェントにより、溶出し、６画分に分画した（画分２−１
から２−６）。画分２−４をオクタデシルシリル化シリ
カゲルを充填剤に用いたカラムクロマトに付し、５０−
０％含水メタノールで溶出し、化合物（ｂ１）を２６８
ｍｇ得た。

【００５０】性状：無色非晶形 Negative HR-FAB-MS: m/z 377.1609(C₂₀H₂₅O₇ requires
377.1600);¹ H-NMR (C₅D₅N) δ_ppm: 6.08 (1H, br.s), 4.54 (1H, b
r.s), 4.35 (1H, s),4.11 (1H, d, J=9Hz), 3.95 (1H,
d, J=4Hz), 3.73 (1H, d, J=9Hz), 3.35 (1H,dd, J=19,
14Hz), 3.29 (1H, s), 3.00 (1H, br.d, J=12Hz), 2.8
6 (1H, dd, J=19, 5Hz), 2.42 (1H, m), 2.16 (1H, dt,
J=12Hz), 1.96 (1H, m), 1.71 (3H,s), 1.52 (3H, s),
1.09 (3H, d, J=7Hz);¹³ C-NMR (C₅D₅N) δ_ppm: 197.5, 170.5, 162.3, 126.1,
110.6, 84.4, 79.6,78.6, 71.4, 46.2, 45.4, 44.5, 4
2.7, 42.5, 31.6, 30.6, 26.1, 22.4, 13.3,10.3

【００５１】製造例８ 化合物（ｂ２）の製造

【００５２】

【化１４】

【００５３】製造例７の６画分（画分２−１から２−
６）のうち、画分２−６をシリカゲルカラムクロマトに
付し、酢酸エチル−メタノール混液（９：１）で溶出
し、化合物（ｂ２）を２４ｍｇ得た。

【００５４】性状：無色非晶形 Negative HR-FAB-MS: m/z 393.1557（C₂₀H₂₅O₇ require
s 377.1600）;¹ H-NMR (C₅D₅N) δ_ppm: 6.07 (1H, br.s), 5.44 (1H,
d, J=11Hz), 4.67 (1H,t, J=2Hz), 4.30 (1H, s), 4.11
(1H, d, J=9Hz), 4.08 (1H, d, J=2Hz), 3.85(1H, d,
J=9Hz), 3.29 (1H, s), 3.09 (1H, br.d, J=12Hz), 2.6
9 (1H, m), 2.33 (1H, dd, J=11, 6Hz), 2.15 (1H, dt,
J=15, 3Hz), 2.00 (1H, td, J=15, 2Hz), 1.71 (3H,
s), 1.70 (3H, d, J=7Hz), 1.55 (3H, s);¹³ C-NMR (C₅D₅N) δ_ppm: 197.4, 174.1, 162.5, 126.1,
110.8, 84.5, 80.4,78.2, 71.5, 49.6, 47.5, 45.8, 4
5.5, 42.3, 38.6, 33.0, 26.2, 22.3, 16.3,10.6

【００５５】製造例９ 化合物（ｂ３）の製造

【００５６】

【化１５】

【００５７】製造例２の酢酸エチル画分（２７．５ｇ）
をオクタデシルシリル化シリカゲルを充填剤に用いたカ
ラムクロマトに付し、７０−５０％含水メタノールで溶
出、更に６０％−０％含水メタノールで再精製し、化合
物（ｂ３）８４ｍｇを得た。

【００５８】性状：無色非晶形 Negative HR-FAB-MS: m/z 409.1501（C₂₀H₂₅O₉ require
s 409.1498）;¹ H-NMR (C₅D₅N) δ_ppm: 6.13 (1H, br.s), 5.62 (1H,
s), 4.64 (1H, d, J=9Hz), 4.39 (1H, s), 4.14 (1H,
d, J=4Hz), 4.12 (1H, d, J=3Hz), 4.04 (1H, d,J=9H
z), 3.51 (1H, s), 3.17 (1H, br.d, J=14Hz), 2.84 (1
H, m), 2.27 (1H,dd, J=14, 3Hz), 2.03 (1H, dt, J=1
4, 3Hz), 1.85 (3H, d, J=7Hz), 1.77 (3H,s ), 1.62 (3H, s);¹³C-NMR (C₅D₅N) δ_ppm: 197.5, 17
4.5, 162.7, 126.0, 110.3, 84.5, 79.6,76.5, 75.1, 7
1.8, 67.3, 52.7, 46.9, 45.6, 42.2, 25.7, 22.4, 14.
0, 10.6

【００５９】実施例１ 血管内皮細胞増殖阻害活性 試験試料としては、上記製造例で得られた化合物（ａ
１）〜（ａ５）並びに（ｂ１）〜（ｂ３）を使用した。
また、細胞としては人臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥ細
胞；大日本製薬（株）より購入）を用いた。

【００６０】１）細胞及び培養 ＨＵＶＥ細胞は、ＣＳ−Ｃ培地（Cell Systems Corpora
tion）で培養し、５％ＣＯ₂、３７℃の条件下にて１０
０ｍｍコラーゲンタイプＩコーティングディッシュ（岩
城硝子製）で培養した。実験に用いる際には、コンフル
エントに達する前にＰＢＳ（−）で洗浄し、トリプシン
処理し、１０００×ｇで８分間遠心したものを適当な濃
度の細胞懸濁液に希釈した。

【００６１】２）増殖阻害アッセイ ＨＵＶＥ細胞を５×１０³ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴と
なるように９６穴コラーゲンタイプＩコーティングプレ
ートに蒔き、５％ＣＯ₂、３７℃の条件下にて培養し
た。４時間後、被験物質を含むダルベッコ改変イーグル
培地を各穴へ５０μＬずつ添加し、４日間培養（５％Ｃ
Ｏ₂、３７℃）した。培養終了後、１０μＬのＷＳＴ−
８溶液（Tetra Color One Cell proliferation assay s
ystem，生化学工業製）を各穴へ添加した。そのまま２
時間培養（５％ＣＯ₂、３７℃）し、マイクロプレート
リーダー（SPECTRA MAX 250, Molecular Devices Ca, U
SA）にて４９０ｎｍの吸光度を測定した。コントロール
群（ＤＭＳＯのみ添加）の吸光度を１００％として、Ｄ
ＭＳＯに溶解した被験物質の５０％増殖阻害濃度（ＩＣ
₅₀）を求めた。得られた結果を表１に記載する。

【００６２】

【表１】

【００６３】表１に示したように、いずれの化合物もＨ
ＵＶＥＣの増殖を抑制し、特に化合物（ａ２）及び（ｂ
１）に高い効果が認められた。

【００６４】実施例２ 血管細胞のキャピラリーネット
ワーク形成阻害活性 試験試料としては、上記製造例で得られた化合物（ａ
１）〜（ａ３）並びに（ｂ１）〜（ｂ２）を使用した。
また、細胞としてはウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥ細
胞；大日本製薬（株）より購入）を用い、培養液として
は１０％ＦＣＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ：日水製薬（株））を用いた。

【００６５】１）細胞及び培養 ＢＡＥ細胞は、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質を含む
ダルベッコ改変イーグル培地（日水製薬製）で培養し
た。ＢＡＥ細胞を５％ＣＯ₂、３７℃の条件下にて１０
０ｍｍコラーゲンタイプＩコーティングディッシュで培
養し、実験に用いる際には、コンフルエントに達する前
にＰＢＳ（−）で洗浄し、トリプシン処理し、１０００
×ｇで８分間遠心したものを適当な濃度の細胞懸濁液に
希釈した。

【００６６】２）コラーゲンタイプＩゲル中におけるキ
ャピラリーネットワーク（管腔）形成 Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら（Montesano, R.et.al,J.Cell Bi
ol. 97 : 1648-1652,1983）による方法を部分的に改変
した。コラーゲンタイプＩ溶液は、成熟ラットの尾から
調製し、０．１％（ｖ／ｖ）酢酸溶液で希釈した。１０
倍濃度のＤＭＥＭ１容量、コラーゲンタイプＩ溶液４容
量及び１１．７６ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウム溶液
５容量を氷上で混和し、コラーゲン混液とした。氷冷コ
ラーゲン混液を９６穴培養プレートの各穴へ５０μＬず
つ分注し、３７℃でゲル化させた。ＢＡＥ細胞を各穴へ
約２×１０⁴個ずつ蒔き、ゲル表面にコンフルエントの
状態となるように１−２日間培養した。ゲル上の培地を
取り除き、新たに５０μＬの氷冷コラーゲン混液を添加
し、３７℃で２０分間放置してゲルを固化させた。ＤＭ
ＳＯに溶解した被験物質を含むダルベッコ改変イーグル
培地を各穴へ５０μＬずつ添加し、培養した。７２時間
後、顕微鏡下において、キャピラリーネットワーク（管
腔）の形成の様子を観察した。被験物質の効果判定基準
は、ネットワークが形成した場合を陰性（無効）、ネッ
トワークが全く形成されないか形成されても断片的であ
る場合を陽性（有効）、細胞傷害性のため見かけ上ネッ
トワークが全く形成されない場合を毒性とした。なお、
陽性の場合、被験物質の試験実施濃度範囲における有効
最低濃度を記載した。得られた結果を表２に記載する。

【００６７】

【表２】

【００６８】表２に示したように、各化合物にキャピラ
リーネットワーク形成阻害活性が認められた。

【００６９】実施例３ 腫瘍細胞に対する細胞障害活性 試験試料としては、上記製造例で得られた化合物（ａ
１）〜（ａ４）並びに（ｂ１）〜（ｂ３）を使用した。
また、腫瘍細胞としては、咽頭癌細胞（ＫＢ細胞；Amer
ican Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）より購
入）、肺癌細胞（Ａ５４９細胞；ＡＴＣＣより購入）、
大腸癌細胞（ＨＴ２９細胞；ＡＴＣＣより購入）を用い
た。Ａ５４９細胞とＨＴ２９細胞の場合には、実験０日
目に１０％熱非働化牛胎仔血清（ＦＣＳ）、１０ｍｇ／
ｍｌゲンタマイシン含有のＦ−１２培地（シグマ−アル
ドリッチ製）で調製した細胞浮遊液を９６ウェルプレー
トの１ウェルにつき２４０ｍｌずつ分注することによ
り、１ウェルあたりの細胞数が４×１０³ｃｅｌｌｓと
なるように播種した。ＫＢ細胞の場合には、実験０日目
に１０％ＦＣＳ含有のダルベッコ変法イーグル培地で調
製した細胞浮遊液を９６ウェルプレートの１ウェルにつ
き５０ｍｌずつ分注することにより、１ウェルあたりの
細胞数が２×１０³ｃｅｌｌｓとなるように播種した。
これらの細胞は、５％ＣＯ₂、３７℃の条件下で培養し
た。実験１日目に、段階希釈により一定濃度の試験試料
を含む培地を細胞培養系に添加した。実験３日目に試験
試料の細胞傷害活性を、Ａ５４９細胞とＨＴ２９細胞の
場合にはTetra Color One cell proliferation（生化学
工業製）を用いて、ＫＢ細胞の場合にはCellTiter 96^R
AQueous One Solution Cell Proliferation（プロメガ
製）を用いて測定した。今回用いた細胞傷害活性の測定
方法は、いずれも細胞内ミトコンドリアにおける脱水素
酵素の活性を合成発色基質（ＷＳＴ−８及びＭＴＳ）に
より分光光学的に検出、定量するもので、マイクロプレ
ート吸光光度計により波長４９０ｎｍにおける吸光度を
測定した。各種細胞を試験試料を含まない培地中で培養
したときの細胞数を１００％として、細胞数を５０％に
減少させたときの試験試料の濃度を求め、これをＩＣ₅₀
（ｍｇ／ｍｌ）とした。試験試料の活性の強弱はＩＣ₅₀
により評価した。得られた結果を表３に記載する。

【００７０】

【表３】

【００７１】表３に示したように、化合物（ｂ１）〜
（ｂ３）は、ＫＢ細胞、Ａ５４９細胞及びＨＴ２９細胞
いずれの細胞に対しても細胞障害活性が認められ、特に
化合物（ｂ１）に高い活性が認められた。また、化合物
（ａ２）はＫＢ細胞及びＡ５４９細胞に対して細胞障害
活性を示した。一方、化合物（ａ１）、（ａ３）及び
（ａ４）はＫＢ細胞に細胞障害活性を示し、選択性が高
いことがわかった。

【００７２】実施例４ 腫瘍細胞に対する細胞障害活性 試験試料としては、上記製造例で得られた化合物（ａ
１）を使用した。また、腫瘍細胞としては肺癌細胞（Ａ
５４９細胞；ＡＴＣＣより購入）を用いた。試験は実施
例３と同様に行い、実験開始５日目に試験試料の細胞障
害活性を測定し、試験試料の活性の強弱をＩＣ₅₀により
評価した。得られた結果を表４に記載する。

【００７３】

【表４】

【００７４】表４に示した通り、化合物（ａ１）は、Ａ
５４９細胞に対して細胞障害活性が認められた。

【００７５】

【発明の効果】カルボリン誘導体（ａ）及びカシノイド
誘導体（ｂ）に優れた血管新生抑制作用を有すると共に
抗腫瘍効果を有することから、咽頭癌、肺癌及び大腸癌
等の固形癌を始めとする悪性腫瘍、糖尿病性網膜症、リ
ウマチ、乾癬等の炎症性疾患等の血管新生に関与する各
種疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 35/00 35/00 // Ｃ０７Ｄ 471/16 Ｃ０７Ｄ 471/16 493/08 493/08 Ｂ (72)発明者 トリペッチ・カンチャナプーム 広島県広島市東区光が丘２番53号アジア文 化会館内 (72)発明者 橋本 秀介 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 相山 律男 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 松崎 健 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 Ｆターム(参考） 4C065 AA07 AA18 BB09 CC03 DD02 EE03 HH01 JJ01 KK01 LL04 PP01 4C071 AA03 AA08 BB01 BB07 CC12 EE05 FF17 HH05 HH09 KK17 LL01 4C086 AA01 AA02 CA01 CB09 MA01 MA04 NA14 ZA33 ZA36 ZB11 ZB26 4C088 AB12 AC11 BA32 BA33 CA08 NA14 ZA33 ZA36 ZB11 ZB26

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の一般式（ａ）： 【化１】 〔式中、Ｒ¹は無置換又は酸素原子を示し、Ｒ²は水素原
   子、ヒドロキシ基、メトキシ基又は−ＯＧｌｃを示し、
   Ｙは水素原子又はメトキシ基を示す。〕で表されるカル
   ボリン誘導体を有効成分とする血管新生抑制剤。
2. 【請求項２】 下記の一般式（ａ）： 【化２】 〔式中、Ｒ¹は無置換又は酸素原子を示し、Ｒ²は水素原
   子、ヒドロキシ基、メトキシ基又は−ＯＧｌｃを示し、
   Ｙは水素原子又はメトキシ基を示す。〕で表されるカル
   ボリン誘導体を有効成分とする抗腫瘍剤。
3. 【請求項３】 下記の一般式（ｂ）： 【化３】 〔式中、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、同一又は異なっていても
   よい水素原子又はヒドロキシ基を示す。〕で表されるカ
   シノイド誘導体を有効成分とする血管新生抑制剤。
4. 【請求項４】 下記の一般式（ｂ）： 【化４】 〔式中、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、同一又は異なっていても
   よい水素原子又はヒドロキシ基を示す。〕で表されるカ
   シノイド誘導体を有効成分とする抗腫瘍剤。