JP2003265196A - ムコ多糖症のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ムコ多糖症の高精度、簡便、効率的かつ安価
なスクリーニング方法等を提供する。 【解決手段】 下記ステップ（１）及び（２）を含む、
ムコ多糖症のスクリーニング方法。 （１）「被験者から採取された尿にグリコサミノグリカ
ン（ＧＡＧ）特異的分解酵素を作用させて得られる溶
液」と「ＧＡＧに反応して特定波長における吸光度が変
化する色素」とを接触させて得られる尿検体ついて、当
該特定波長における吸光度を測定するステップ。 （２）ステップ（１）の測定結果を用いて、ＧＡＧ特異
的分解酵素によって分解されたＧＡＧ量を算出し、これ
が規定範囲内にある尿検体を特定するステップ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ムコ多糖症のスク
リーニング方法及びスクリーニングキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】以下、本発明に最も近い技術等について
説明する。

【０００３】Clinica Chimica Acta, vol.264, p245-25
0(1997)には、尿中のグリコサミノグリカン（以下、Ｇ
ＡＧという）を1,9-ジメチルメチレンブルー（以下、ジ
メチルメチレンブルーを「ＤＭＭＢ」という）を用いて
測定し、ムコ多糖症のスクリーニングを行う方法が記載
されている。またこの色素は、一般的な紙オムツに含ま
れるアクリル酸ポリマーにも反応し、偽陽性を呈する旨
が記載されている。

【０００４】また、Chimica et Biophysica Acta, vol.
883, p173-177(1986)には、1,9-ＤＭＭＢの吸収波長は
ＧＡＧに反応していない状態では595nmであるのに対
し、ＧＡＧに反応すると525nmに変化する旨が記載され
ている。

【０００５】また特開平４−１３５４９６号公報には、
ＧＡＧ特異的分解酵素によってＧＡＧを二糖に分解し、
当該二糖の組成を高速液体クロマトグラフィー（以下、
ＨＰＬＣという）で分析することによってＧＡＧを分析
する方法が記載されている。

【０００６】しかし、これらいずれの文献にも、本発明
のスクリーニング方法及びキットに関して記載も示唆も
ない。

【０００７】ムコ多糖症(mucopolysaccharidoses)は、
ＧＡＧの分解代謝に関係する酵素の障害(活性低下)によ
って起こる一連の遺伝病の総称である。障害される酵素
の種類に応じて特異的なＧＡＧが組織中に蓄積し、尿中
に分泌されることが知られている。ムコ多糖症の臨床症
状は多様だが、多くは、粗な顔貌、多発性骨異常や内臓
腫大を伴う。また聴力低下、心血管障害や精神発達の遅
れを伴う場合もある。

【０００８】ムコ多糖症は通常、出生時には症状がな
く、乳幼児期や小児期における身長の発達の低さ、骨の
異常な発育、毛深さ等の症状によって明らかとなる。ま
た、出生時においては正常でも、数年にわたって次第に
精神発達の遅れを来す場合もある。したがって、未だ症
状が現れない出生後の早期にムコ多糖症の診断がなされ
れば、早期に酵素補充療法や遺伝子治療等を実施でき、
精神発達の遅れ等をくい止めることができる可能性があ
る。従って、全ての新生児についてムコ多糖症の診断が
行われることが最も望ましい。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかし我が国における
新生児数は年間１００万人を超える一方、ムコ多糖症の
発生頻度は４万〜５万人に１人と極めて低く、しかも診
断は酵素欠損や酵素異常を調べるという煩雑かつ高価な
ものであることから、その診断の前段階として、精度の
高いスクリーニング法が求められている。特に、新生児
の尿を必要時に必要量を直接採取することは困難である
から紙オムツ等から搾取する方法が簡便である反面、汎
用の色素はＧＡＧのみならず紙オムツの成分にも反応し
て偽陽性を呈することから、かかる要因を排除する必要
がある。

【００１０】そしてこのような問題を解決し、ムコ多糖
症の患者を漏れなく（偽陰性患者をも漏らすことな
く）、精度良く（偽陽性患者を可及的排除し）、簡便、
効率的かつ安価にスクリーニングできる方法が提供でき
れば、全新生児についてムコ多糖症の可能性を検知する
ことが可能となり、ムコ多糖症患者について漏れなく、
的確な確定診断を経て早期に治療することが可能とな
る。

【００１１】のみならず、偽陽性患者が無用な診断を受
ける頻度も減少し、医療現場における負担も減少するこ
とから、その分、質の高い確定診断や治療が期待でき
る。すなわち本発明は、ムコ多糖症についての高精度、
簡便、効率的かつ安価なスクリーニング方法及びキット
を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＧＡＧ特異的分解酵
素と汎用の色素とを適宜組み合わせるステップを設ける
ことにより、高精度、簡便、効率的かつ安価なムコ多糖
症のスクリーニングが可能であることを見いだし、本発
明を完成するに至った。

【００１３】すなわち本発明は、下記ステップ（１）及
び（２）を少なくとも含む、ムコ多糖症のスクリーニン
グ方法（以下、「本発明方法１」という）を提供する。 （１）「被験者から採取された尿にＧＡＧを特異的に分
解する酵素を作用させて得られる溶液」と「ＧＡＧに反
応して特定波長における吸光度が変化する色素」とを接
触させて得られる尿検体ついて、当該特定波長における
吸光度を測定するステップ。 （２）ステップ（１）で測定された結果を用いて、ＧＡ
Ｇを特異的に分解する酵素によって分解されたＧＡＧ量
を算出し、これが規定範囲内にある尿検体を特定するス
テップ。

【００１４】本発明方法１における「被験者から採取さ
れた尿」は、下記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）を少なくと
も含むステップを経て特定された尿検体に対応する被験
者から採取されたものが好ましい。 （Ａ）被験者の尿と、「ＧＡＧに反応して特定波長にお
ける吸光度が変化する色素」とを接触させて得られる尿
検体について、当該特定波長における吸光度を測定する
ステップ。 （Ｂ）（Ａ）で測定された結果を用いて、「ＧＡＧに反
応して特定波長における吸光度が変化する色素」に反応
した物質量を算出し、これが基準範囲外にある尿検体を
特定するステップ。また本発明は、下記ステップ（３）
を少なくとも含む、ムコ多糖症のスクリーニング方法
（以下、「本発明方法２」という）を提供する。 （３）本発明方法１に記載のステップ（２）によって特
定された尿検体に対応する被験者から採取された尿中の
ＧＡＧ組成を分析するステップ。

【００１５】また本発明は、下記ステップ（４）を少な
くとも含む、ムコ多糖症のスクリーニング方法（以下、
「本発明方法３」という）を提供する。 （４）本発明方法２のステップ（３）によって分析され
たＧＡＧ組成と、ムコ多糖症とを関連づけるステップ。

【００１６】これらの本発明方法に使用するＧＡＧに反
応して特定波長における吸光度が変化する色素は、ＤＭ
ＭＢであることが好ましい。同様に「ＧＡＧを特異的に
分解する酵素」は、コンドロイチナーゼ、ケラタナーゼ
及びヘパリチナーゼから選ばれる１又は２以上の酵素で
あることが好ましい。また、本発明方法２におけるＧＡ
Ｇ組成の分析は、ＧＡＧを特異的に分解する酵素を作用
させてＧＡＧを二糖に分解し、当該二糖の組成を分析す
ることにより行われることが好ましい。なお、以下、単
に「本発明方法」といった場合には、本発明方法１〜３
のいずれかを指す概念として理解されたい。

【００１７】また本発明は、下記構成成分（ａ）及び
（ｂ）を少なくとも含む、ムコ多糖症のスクリーニング
キット（以下、「本発明キット」という）を提供する。 （ａ）ＧＡＧに反応して特定波長における吸光度が変化
する色素 （ｂ）ＧＡＧを特異的に分解する酵素 本発明キットを構成する「ＧＡＧに反応して特定波長に
おける吸光度が変化する色素」は、ＤＭＭＢであること
が好ましい。同様に「ＧＡＧを特異的に分解する酵素」
は、コンドロイチナーゼ、ケラタナーゼ及びヘパリチナ
ーゼから選ばれる１又は２以上の酵素であることが好ま
しい。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。 ＜１＞本発明方法１ 本発明方法１は、下記ステップ（１）及び（２）を少な
くとも含む、ムコ多糖症のスクリーニング方法である。 （１）「被験者から採取された尿にＧＡＧを特異的に分
解する酵素を作用させて得られる溶液」と「ＧＡＧに反
応して特定波長における吸光度が変化する色素」とを接
触させて得られる尿検体ついて、当該特定波長における
吸光度を測定するステップ。 （２）ステップ（１）で測定された結果を用いて、ＧＡ
Ｇを特異的に分解する酵素によって分解されたＧＡＧ量
を算出し、これが規定範囲内にある尿検体を特定するス
テップ。

【００１９】ここで「被験者から採取された尿」は、下
記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むステップ
を経て特定された尿検体に対応する被験者から採取され
たものが好ましい。 （Ａ）被験者の尿と、「ＧＡＧに反応して特定波長にお
ける吸光度が変化する色素」とを接触させて得られる尿
検体について、当該特定波長における吸光度を測定する
ステップ。 （Ｂ）（Ａ）で測定された結果を用いて、「ＧＡＧに反
応して特定波長における吸光度が変化する色素」に反応
した物質量を算出し、これが基準範囲外にある尿検体を
特定するステップ。

【００２０】本発明方法１の前段階で好ましく行われる
「上記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むステ
ップ」は、非常に多数の被験者の尿から、ムコ多糖症の
可能性がある者を漏れなく、簡便、効率的かつ安価にス
クリーニングするステップであり、いわゆる第一次スク
リーニングともいえる。

【００２１】上記ステップ（Ａ）及び後述するステップ
（１）に付される尿の採取方法等は特に限定されない。
例えば、被験者の排尿時に直接採取してもよく、オムツ
（ＧＡＧを含有しない限り、その材質は問わない）等か
ら搾取してもよい。本発明方法は、排尿のコントロール
が特に困難な新生児において好ましく用いられるため、
オムツ等から尿を採取できるという点で極めて簡便であ
る。

【００２２】上記ステップ（Ａ）に付される尿は、採取
後間もないものを用いてもよく、本発明方法によって得
られるスクリーニング結果に影響を及ぼさない限りにお
いて、保管したものを用いてもよい。例えば、保管中に
生じる尿中のＧＡＧの不溶化や分解等はスクリーニング
結果に影響を及ぼすが、アジ化ナトリウム等の保存剤に
よって影響を防止したり、Tween 20等の界面活性剤やグ
アニジン塩酸等の変性剤によって影響を除去することが
できる。

【００２３】また、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、亜鉛イオン、コバルトイオン等は、上記ステップ
（１）においてＧＡＧを特異的に分解する酵素の作用を
阻害することでスクリーニング結果に影響を及ぼすこと
から、このような物質を含有する安定化剤等を添加しな
いようにすることが好ましい。

【００２４】また、上記ステップ（Ａ）で用いる色素に
近い吸収ピークを有する物質もスクリーニング結果に影
響を及ぼすことから、このような物質も添加しないこと
が好ましい。

【００２５】上記ステップ（Ａ）で用いる「ＧＡＧに反
応して特定波長における吸光度が変化する色素」は、Ｇ
ＡＧと反応することによって当該色素の特定波長におけ
る吸収が検知可能な程度に変化する色素であり、かつ、
尿に可溶性のものである限りにおいて、特に限定されな
い。ここで「吸光度の変化」とは、「吸光度の増加」と
「吸光度の減少」のいずれをも含む概念であるが、「吸
光度の増加」であることが好ましい。また「検知可能な
程度の変化」は、分析機器等によって検知可能な程度の
変化であれば足りる。

【００２６】ただし、尿自体が有する色素の吸収ピーク
の波長に近い色素は、尿の色素の影響を受けやすいこと
から避けることが好ましい。ここで用いることができる
色素としては、アルシアンブルー、ステインズオール、
キュプロメロニックブルー等が例示される。なお、「Ｇ
ＡＧに反応して特定波長における吸光度が変化する色
素」には、ＧＡＧと反応することによってある１つの波
長における吸光度のみが変化する色素のみならず、複数
の波長における吸光度が変化する色素も包含される。

【００２７】後者のような色素としては、例えば、ＧＡ
Ｇと反応することによってある波長における吸光度が増
加するとともに、他の波長における吸光度が減少するよ
うな色素が例示され、かつ好ましい。その中でも、ＧＡ
Ｇと反応することによって「ＧＡＧに反応した当該色素
が呈する吸収ピークの波長における吸光度」が増加する
とともに「未反応の当該色素が呈する吸収ピークの波長
における吸光度」が減少する色素が好ましい。このよう
な色素を用いると、色素との接触の後に、「ＧＡＧに反
応した当該色素が呈する吸収ピークの波長における吸光
度」と「未反応の当該色素が呈する吸収ピークの波長に
おける吸光度」のいずれか一方のみを測定することもで
き、その両方を測定することもできる。そしてこれら両
方を測定すれば、ＧＡＧとの反応をより高感度に検出す
ることができることから好ましい。

【００２８】このような色素を用いる場合には、ある
「波長」と他の「波長」との差（例えば、ＧＡＧとの反
応前後での吸収ピークの波長の変化）が極端に小さいも
のは避けることが好ましい。具体的には、両波長の差
（例えば、反応前後の吸収ピークの波長の変化）が３０
ｎｍ以上あるような色素を用いることが好ましく、５０
ｎｍ以上あるような色素を用いることがより好ましい。
このような色素としてはＤＭＭＢ等が例示される。特に
1,9-ＤＭＭＢは、汎用されておりかつ安価である点でも
好ましい。

【００２９】このような色素における、ある波長（例え
ば、ＧＡＧに反応した当該色素が呈する吸収ピークの波
長）や他の波長（例えば、未反応の当該色素が呈する吸
収ピークの波長）は、ＧＡＧに反応して特定波長におけ
る吸光度が変化する色素の種類に応じて異なるものであ
り、その値は既に知られているか、あるいは当業者が適
宜決定することができる。

【００３０】例えば、色素が1,9-ＤＭＭＢである場合、
「ＧＡＧに反応した当該色素が呈する吸収ピークの波
長」は５２０〜５３０ｎｍの範囲であり、「未反応の当
該色素が呈する吸収ピークの波長」は５８５〜５９５ｎ
ｍの範囲である。

【００３１】このような色素を用いると、ＧＡＧと反応
することによって「ＧＡＧに反応した当該色素が呈する
吸収ピークの波長における吸光度」が増加する一方で
「未反応の当該色素が呈する吸収ピークの波長における
吸光度」が減少することから、感度の良い結果が得られ
る。

【００３２】上記ステップ（Ａ）において、尿と色素と
を「接触」させる方法は、尿中の成分と色素分子とが接
触でき、かつ、接触後の色素分子が尿中に溶解した状態
で存在するような方法である限りにおいて特に限定され
ない。例えば、尿や溶液に色素を添加することによって
接触させても良く、色素に尿や溶液を添加することによ
って接触させても良く、また、両者を同時に添加するこ
とにより接触させても良い。

【００３３】また、色素を吸着させた濾紙等と尿とを接
触させ、濾紙等の色調変化を調べる方法等を採用しても
よい。なお、溶液と色素との接触時の温度は４℃〜４０
℃程度であればよく、１５℃〜３０℃程度が好ましく、
２５℃程度が特に好ましい。また一般に、ＧＡＧに反応
した色素の吸光度変化は速やかに生じるが、その後徐々
に変化してしまうため、色素との接触後３０分以内、好
ましくは１０分以内、最も好ましくは５分以内に吸光度
を測定することが望ましい。特定波長における吸光度を
測定する方法も特に限定されず、通常の吸光光度計等を
用いて測定することができる。

【００３４】上記ステップ（Ｂ）は、（Ａ）で測定され
た結果を用いて、「ＧＡＧに反応して特定波長における
吸光度が変化する色素」に反応した物質量（以下、単に
「色素に反応した物質量」ともいう）を算出し、これが
基準範囲外にある尿検体を特定するステップである。
（Ａ）で測定された結果（吸光度の実測値）を用いて
「色素に反応した物質量」を算出する方法も特に限定さ
れない。「色素に反応した物質量」は、「濃度の値」と
して算出してもよく、「吸光度の値」として算出しても
よい。また色素として、ＧＡＧと反応することによって
ある波長における吸光度が増加するとともに他の波長に
おける吸光度が減少するような色素を用いた場合には、
「色素に反応した物質量」を「ある波長における吸光度
と他の波長における吸光度との比の値」として算出して
もよい。

【００３５】例えば「色素に反応した物質量」を「濃度
の値」として算出する場合には、既知濃度のＧＡＧ標準
液を用いて、色素と接触させた後の「吸光度の値」（又
はある波長における吸光度と他の波長における吸光度と
の比の値）とＧＡＧ濃度との関係について予め検量線や
関係式等を作成しておき、未知濃度の検体についての測
定結果をその検量線や関係式等を用いてＧＡＧ濃度に変
換することで求めることができる。また、尿検体中に含
まれるクレアチニンなどの他の成分の濃度を基準に補正
をしても良く、かつ好ましい。

【００３６】なお、上記ステップ（Ｂ）における「基準
範囲」とは、「ＧＡＧに反応して特定波長における吸光
度が変化する色素」に反応した物質量（尿中における）
が健常であると認められる範囲を意味し、次のスクリー
ニングステップに進めることとするか否かを決する基準
となるものである。

【００３７】前記のように算出した「色素に反応した物
質量」が、この基準範囲（健常の範囲）外にある尿検体
については、ムコ多糖症の可能性があるといえることか
ら、これを特定する必要がある。そしてここで特定され
た尿検体は、次のステップ（ステップ（１））に進める
必要がある。

【００３８】この「基準範囲」は、予め複数(なるべく
多く)の健常人の尿検体について「色素に反応した物質
量」を求め、その値が分布する範囲として設定すること
ができる。目安としては、０〜２０μg/mg Cre (Creは
クレアチニンを意味する)程度が例示される。

【００３９】また本発明方法１の前段階で好ましく行わ
れる「上記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む
ステップ」は、これ以外のステップをさらに含んでいて
もよい。例えば、上記ステップ（Ａ）の前に被験者の尿
をプロテアーゼ、タンパク質沈殿剤、脱塩カラム等を用
いて前処理する工程を追加してもよい。

【００４０】例えば「ＧＡＧに反応して特定波長におけ
る吸光度が変化する色素」を用いる場合、上記ステップ
（Ａ）及び（Ｂ）を以下の通り行うことができる。な
お、カッコ内は当該色素として1,9-ＤＭＭＢを用いた場
合を示す。

【００４１】ステップ（Ａ）：被検者の尿と、「ＧＡＧ
に反応して特定波長における吸光度が変化する色素」
（1,9-ＤＭＭＢ）とを接触させて得られる尿検体につい
て、「ＧＡＧに反応した当該色素が呈する吸収ピークの
波長」（５３０ｎｍ）と「未反応の当該色素が呈する吸
収ピークの波長」（５９０ｎｍ）とを測定する。

【００４２】ステップ（Ｂ）：ステップ（Ａ）で測定さ
れた結果を用いて、「ＧＡＧと当該色素とが反応するこ
とによってＧＡＧに反応した当該色素が呈する吸収ピー
クの波長における吸光度」（５３０ｎｍ）と「未反応の
当該色素が呈する吸収ピークの波長における吸光度」
（５９０ｎｍ）の両者の比を算出する。これにより、色
素と反応することによる前者の増加分と後者の減少分を
感度良く検知することができ、ＧＡＧを含有する可能性
がある尿検体を漏れなくスクリーニングすることができ
る。比の算出方法は特に限定されないが、「ＧＡＧと当
該色素とが反応することによってＧＡＧに反応した当該
色素が呈する吸収ピークの波長における吸光度」／「未
反応の当該色素が呈する吸収ピークの波長における吸光
度」(530nm/590nm)とすると、この値が大きいほど、色
素に反応する物質が多く尿検体に含まれていることにな
る。また、この分子と分母を逆にすれば(590nm/530n
m)、この値が小さいほど、色素に反応する物質が多く尿
検体に含まれていることになる。このような比の値（あ
る波長における吸光度と他の波長における吸光度との比
の値）をそのまま「色素に反応した物質量」としてもよ
い。あるいは、既知濃度のＧＡＧ標準液を用いて「色素
と接触させた後のある波長における吸光度（５３０ｎ
ｍ）と、他の波長における吸光度（５９０ｎｍ）との比
の値」とＧＡＧ濃度との関係について予め作成しておい
た検量線や関係式等を用いて、色素に反応した物質量を
「濃度」として求めてもよい。また、尿検体中に含まれ
るクレアチニンなどの他の成分の濃度を基準に補正をし
ても良く、かつ好ましい。

【００４３】ステップ（１）は、「被験者から採取され
た尿にＧＡＧを特異的に分解する酵素を作用させて得ら
れる溶液」と「ＧＡＧに反応して特定波長における吸光
度が変化する色素」とを接触させて得られる尿検体つい
て、当該特定波長における吸光度を測定するステップで
ある。「被験者から採取された尿」は、前記ステップ
（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むステップを経て特定
された尿検体に対応する被験者から採取されたものが好
ましい。

【００４４】ステップ（Ａ）では「被験者の尿」を色素
と接触させるが、ステップ（１）では「被験者から採取
された尿にＧＡＧを特異的に分解する酵素を作用させて
得られる溶液」を色素と接触させる点で異なっている。

【００４５】「ＧＡＧを特異的に分解する酵素」（以
下、ＧＡＧ特異的分解酵素という）は、ＧＡＧに作用す
ることにより「ＧＡＧに反応して特定波長における吸光
度が変化する色素」に対する反応性を消失させる程度に
までＧＡＧを分解する酵素である限りにおいて特に限定
されない。このような酵素としては、コンドロイチナー
ゼ、ケラタナーゼ及びヘパリチナーゼから選ばれる１又
は２以上の酵素が例示され、かつ好ましい。具体的に
は、分解するＧＡＧの種類によって下記が例示される。

【００４６】コンドロイチン硫酸（以下、ＣＳとい
う）：コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼ
ＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣＩ デルマタン硫酸（以下、ＤＳという）：コンドロイチナ
ーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＢ ケラタン硫酸（以下、ＫＳという）：ケラタナーゼ、ケ
ラタナーゼII、 ヘパラン硫酸（以下、ＨＳという）：ヘパリチナーゼ
I、ヘパリチナーゼII、 尿中のＧＡＧの完全な分解を期するため、これらのＧＡ
Ｇ特異的分解酵素を併用することが好ましい。

【００４７】ＧＡＧ特異的分解酵素を作用させる方法
は、尿中のＧＡＧ分子と酵素分子とが接触して酵素反応
が生ずる限りにおいて特に限定されない。例えば、酵素
溶液と尿とを溶液中で接触させてもよく、酵素を適当な
固相(ビーズ、膜等)に結合させた固定化酵素と尿とを接
触させてもよい。好ましいのは前者である。

【００４８】ＧＡＧ特異的分解酵素を作用させる条件
は、用いる酵素に応じて当業者が適宜決定することがで
きる。例えば、以下の酵素の至適温度及び至適ｐＨは概
ね以下の通りである。

【００４９】コンドロイチナーゼＡＢＣ：至適温度 ３
７℃、至適ｐＨ ８．０ コンドロイチナーゼＡＣII：至適温度 ３７℃、至適ｐ
Ｈ ６．０ ケラタナーゼII：至適温度 ３７℃、至適ｐＨ ６．０ ヘパリチナーゼI：至適温度 ３７℃、至適ｐＨ ７．０ ヘパリチナーゼII：至適温度 ３７℃、至適ｐＨ ７．０ これら酵素を併用して同時に反応させる場合は、ｐＨ
５．５〜８．０程度、温度２５〜３７℃の条件下で、１
〜２時間程度反応させることが好ましい。

【００５０】「被験者から採取された尿」に上記の「Ｇ
ＡＧ特異的分解酵素」を上記の方法・条件で作用させる
と、当該尿中にＧＡＧが含まれている場合には、当該Ｇ
ＡＧが酵素によって分解される。もし尿中に、ＧＡＧ以
外の物質であって、「ＧＡＧに反応して特定波長におけ
る吸光度が変化する色素」に非特異的に反応してしまう
物質が含まれている場合には、当該物質は酵素によって
分解されずに尿中にそのまま残存する。

【００５１】そして、酵素反応後の溶液を「ＧＡＧに反
応して特定波長における吸光度が変化する色素」と接触
させ反応させると、尿中のＧＡＧが含まれていたサンプ
ルは、当該ＧＡＧが酵素によって分解されているので色
素に反応せず、吸光度は変化しない。一方、尿中に、Ｇ
ＡＧ以外の物質であって「ＧＡＧに反応して特定波長に
おける吸光度が変化する色素」に非特異的に反応してし
まう物質が含まれていたサンプルは、当該物質は酵素に
よって分解されずに残存しているので、「ＧＡＧに反応
して特定波長における吸光度が変化する色素」に反応し
て吸光度が変化することになる。

【００５２】ステップ（２）は、ステップ（１）で測定
された結果を用いて、ＧＡＧ特異的分解酵素によって分
解されたＧＡＧ量を算出し、これが規定範囲内にある尿
検体を特定するステップである。

【００５３】ここでいう「ＧＡＧ量」は、「濃度の値」
として算出してもよく、「吸光度の値」として算出して
もよい。また色素として、ＧＡＧと反応することによっ
てある波長における吸光度が増加するとともに他の波長
における吸光度が減少するような色素を用いた場合に
は、「ＧＡＧ量」を「ある波長における吸光度と他の波
長における吸光度との比の値」として算出してもよい。
この点を含めた「ＧＡＧ量」の算出に関しては、特筆し
ない限り、前記のステップ（Ｂ）における「色素に反応
した物質量」の算出に関する説明と同様である。

【００５４】ステップ（１）において、酵素反応後の溶
液を「ＧＡＧに反応して特定波長における吸光度が変化
する色素」と接触させ反応させた場合に、酵素反応前の
尿にＧＡＧ以外の物質であって「当該色素に非特異的に
反応してしまう物質」（非特異的反応物質）が含まれて
いる場合には非特異的反応物質の量に応じて色素の吸光
度は変化するが、ＧＡＧのみが含まれている場合には色
素の吸光度は変化しない。

【００５５】よって、酵素反応後の溶液を「ＧＡＧに反
応して特定波長における吸光度が変化する色素」と接触
させた場合の吸光度の変化は、当該色素に非特異的に反
応してしまう物質の量を反映することとなる。

【００５６】尿中には、ＧＡＧと、ＧＡＧ以外の物質で
あって「ＧＡＧに反応して特定波長における吸光度が変
化する色素」に非特異的に反応してしまう物質との両者
が含まれている可能性もある。よってステップ（１）に
おいては「ＧＡＧ特異的分解酵素を作用させるサンプ
ル」と「当該酵素を作用させないサンプル」とを設け、
ステップ（２）においてはＧＡＧ特異的分解酵素を作用
させないサンプルにおける値と作用させたサンプルにお
ける値との差又は比を求めることによって「ＧＡＧ量」
を算出することが望ましい。

【００５７】ＧＡＧ特異的分解酵素を作用させないサン
プルにおける値と作用させたサンプルにおける値との
「差」は、そのまま「ＧＡＧ量」示すことになる。した
がって、この差の絶対値が大きいということはＧＡＧ量
が多いということを意味し、この差が実質的にないとい
うことは、ＧＡＧは実質的に存在しない（「ＧＡＧに反
応して特定波長における吸光度が変化する色素」に非特
異的に反応してしまう物質のみが含まれている）ことを
意味することとなる。

【００５８】また、これら両者の比（例えば、「ＧＡＧ
特異的分解酵素を作用させたサンプルにおける値」／
「ＧＡＧ特異的分解酵素を作用させないサンプルにおけ
る値」は、「ＧＡＧに反応して特定波長における吸光度
が変化する色素」に非特異的に反応してしまう物質の量
の含有割合を示すことになる。したがって、この比が１
００％に近いということは当該物質の含有割合が高い
（ＧＡＧの含有割合は０に近い）ということを意味し、
この比が０％に近いということは、当該物質の含有割合
が０に近い（ＧＡＧが含有されている）ことを意味する
こととなる。よってこの比をＸ％とすると、１００−Ｘ
(％)が「ＧＡＧ量」(ＧＡＧの含有割合)を示すことにな
る。

【００５９】このように評価することで、ＧＡＧ以外の
物質であって「ＧＡＧに反応して特定波長における吸光
度が変化する色素」に非特異的に反応してしまう物質に
よる影響（偽陽性）を排除し、ＧＡＧ量を正確に測定す
ることができる。

【００６０】ステップ（２）における「規定範囲」と
は、ムコ多糖症の可能性があると疑われる程度の尿中の
ＧＡＧ量の範囲を意味し、次のスクリーニングステップ
に進めることとするか否かを決する基準となるものであ
る。

【００６１】前記のように、算出した「ＧＡＧ量」がこ
の規定範囲内にある尿検体については、ムコ多糖症の可
能性があると疑われる程度のＧＡＧ量が尿中に含まれて
いる可能性が高いことから、これを特定する必要があ
る。そして、この「規定範囲」内にある尿検体を特定す
ることによって「規定範囲」外にある尿検体を排除する
ことができる。すなわち、「ＧＡＧに反応して特定波長
における吸光度が変化する色素」に非特異的に反応して
しまう物質を含有する尿検体（偽陽性を示す尿検体）が
排除されることとなる。この意味で、ここでいう「規定
範囲」は、真の陽性例を特定するための範囲であるとい
える。

【００６２】この「規定範囲」は、予め複数(なるべく
多く)のムコ多糖症患者の尿検体についてＧＡＧ量を求
め、その値が分布する範囲として設定することができ
る。「ＧＡＧ特異的分解酵素を作用させたサンプルにお
ける測定値と、作用させなかったサンプルにおける測定
値との比」としてＧＡＧ量（ＧＡＧの含有割合）を示し
た場合、その「規定範囲」の目安は４０〜１００％程度
が例示される。

【００６３】本発明方法１すなわち「上記ステップ
（１）及び（２）を少なくとも含む、ムコ多糖症のスク
リーニング方法」は、これ以外のステップをさらに含ん
でいてもよい。例えば、上記ステップ（１）の前に、前
記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むステップ
や、被験者の尿を前処理する工程を追加したりしてもよ
い。

【００６４】ステップ（２）における測定値がこの規定
範囲内にあるサンプルについてはムコ多糖症の可能性が
あるといえることから、次のステップ（本発明方法２に
おけるステップ（３））に進める必要がある。

【００６５】＜２＞本発明方法２ 本発明方法２は、下記ステップ（３）を少なくとも含
む、ムコ多糖症のスクリーニング方法である。 （３）本発明方法１のステップ（２）によって特定され
た尿検体に対応する被験者から採取された尿中のＧＡＧ
組成を分析するステップ。

【００６６】尿中のＧＡＧ組成の分析方法は、尿中に含
まれているＧＡＧの種類を分析できる方法である限りに
おいて特に限定されない。尿中のＧＡＧ組成の分析方法
としては、例えば以下のようなものが挙げられる。 i)特定種類のＧＡＧに特異的な分解酵素を尿中のＧＡＧ
に作用させ、これによって生ずる複数種の分解産物(二
糖)のイオン交換カラムからの溶出時間の差異を、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析する
方法（二糖分析）。 ii)ＧＡＧの種類(電荷)による移動度の差異を、電気泳
動を用いて分析する方法。 iii)特定種類のＧＡＧに特異的に結合する抗体を用いて
ＥＬＩＳＡで分析する方法。 iv)特定種類のＧＡＧに特異的な分解酵素を尿中のＧＡ
Ｇに作用させ、ＧＡＧの分解の有無及び程度を、ＧＡＧ
に反応する色素を用いて分析する方法。

【００６７】これらのなかでも、微量のＧＡＧを高感度
かつ高精度に分析できるという観点から二糖分析が好ま
しい。すなわち、ＧＡＧ特異的分解酵素を作用させてＧ
ＡＧを二糖に分解し、当該二糖の組成を分析することに
より行われることが好ましい。二糖分析は、特開平４−
１３５４９６号公報に記載の方法で行うことができる。

【００６８】＜３＞本発明方法３ 本発明方法３は、下記ステップ（４）を少なくとも含
む、ムコ多糖症のスクリーニング方法である。 （４）本発明方法２のステップ（３）によって分析され
たＧＡＧ組成と、ムコ多糖症とを関連づけるステップ。

【００６９】ムコ多糖症の種類と、これに対応して尿中
に排出されるＧＡＧとの関係は以下の表１の通りである
ことが知られている。

【００７０】

【表１】

【００７１】本発明方法２のステップ（３）によって分
析されたＧＡＧ組成と、ムコ多糖症との関連づけは、こ
の表にしたがって行うことができる。

【００７２】まず、分析されたＧＡＧ組成が上記のよう
なＧＡＧを含む組成となっていた場合には、何らかのム
コ多糖症である、又は、その可能性が高い、と関連づけ
ることができる。

【００７３】そして、例えば分析されたＧＡＧ組成が、
ＤＳおよびＨＳを含む組成となっていた場合には、Ｉ
型、II型又はVII型のムコ多糖症である、又は、その可
能性が高い、と関連づけることができる。また、例えば
分析されたＧＡＧ組成が、ＨＳのみを含む組成となって
いた場合には、III型のムコ多糖症である、又は、その
可能性が高い、と関連づけることができる。以下同様に
表１に基づいて関連づけることができる。

【００７４】本発明方法１〜３は、それぞれ別個の者に
よって実施することができる。例えば、本発明方法１を
医療現場（病院や医院等）で実施し、その結果に基づい
て本発明方法２を業者（検査センター等）で実施し、そ
の結果に基づいて本発明方法３はさらに別の業者で実施
するということも可能である。もちろん、本発明方法１
〜３の全てを１人の者が実施することもできる。また、
本発明方法１及び２は医療現場で実施し、本発明方法３
は業者が実施するという形態も可能であり、同様に本発
明方法１は医療現場で実施し、本発明方法２及び３は業
者で実施するということも可能である。

【００７５】＜４＞本発明キット 本発明キットは、下記構成成分（ａ）及び（ｂ）を少な
くとも含む、ムコ多糖症のスクリーニングキットであ
る。 （ａ）ＧＡＧに反応して特定波長における吸光度が変化
する色素 （ｂ）ＧＡＧ特異的分解酵素

【００７６】本発明キットは、上記（ａ）及び（ｂ）を
少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに、
尿を希釈するための希釈液、尿の前処理液、保存液、安
定化液、二糖分析用陰イオン交換体、二糖分析用の二糖
の標準物質、検量線作成の標準となる既知濃度のグリコ
サミノグリカン標準品、マイクロタイタープレート等を
構成成分として加えることができる。

【００７７】ＧＡＧに反応して特定波長における吸光度
が変化する色素としては、本発明方法と同様にＤＭＭＢ
が好ましい。またＧＡＧ特異的分解酵素についても、本
発明方法と同様にコンドロイチナーゼ、ケラタナーゼ及
びヘパリチナーゼから選ばれる１又は２以上の酵素であ
ることが好ましい。

【００７８】これらの構成成分は、それぞれ別体の容器
に収容しておき、使用時に本発明測定方法に従って使え
るキットとして保存しておくことができる。本発明キッ
トを用いたムコ多糖症のスクリーニングは、前記＜１＞
〜＜３＞の本発明方法に従って行うことができる。

【００７９】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

【実施例１】本発明方法１（ステップ（１）及び
（２））の前段階であるステップ（Ａ）及び（Ｂ）に関
し、ヒトの尿を用いて「ＧＡＧに反応して特定波長にお
ける吸光度が変化する色素」によるスクリーニングが可
能か否かを調べるため、以下の実験を行った。

【００８０】(1)検量線の作成 各種ＧＡＧ（ＨＳ(ブタ肺由来)、ＣＳ−Ａ(ウシ気管由
来)、ＣＳ−Ｃ(サメ軟骨由来)又はＤＳ(ブタ肺由来)；
いずれも生化学工業株式会社製）の標準液（濃度：1、
2、3、4、6、8、12、及び16μg/mL）に、反応用緩衝液
（2.88M グアニジン塩酸 - 0.05％ Tween20 - 50mM 酢
酸ナトリウム緩衝液）50μLを添加し、次いで、ＤＭＭ
Ｂ色素溶液（15mg/L ＤＭＭＢ - 75mM ギ酸ナトリウム
緩衝液 (pH6.8)） 400μLを添加して攪拌し、波長530nm
及び590nmにおける吸光度を吸光光度計で測定して両者
の比（OD530nm/OD590nm）を求めた。ＧＡＧ濃度と OD53
0nm/OD590nmとの関係（検量線）を図１に示す。なお、
図１中の丸印はＨＳを、三角印はＣＳ−Ａを、菱形印は
ＣＳ−Ｃを、四角印はＤＳをそれぞれ示す。

【００８１】この結果、ＨＳはＣＳやＤＳに比して反応
性が若干低いが、ＧＡＧの種類によってＤＭＭＢの反応
性は大きく異ならないことが示された。

【００８２】(2)尿中のＧＡＧの測定 何らかの疾患が疑われる患者１６人と健常者９人から採
取した尿を用いて、以下の方法で尿中のＧＡＧを測定し
た。

【００８３】1) 尿100μL に生理食塩水を加えて４倍に
希釈する。 2) 反応用緩衝液（2.88M グアニジン塩酸 - 0.075％ Tw
een20 - 150mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH6.8)）50μL
をマイクロチューブに添加する。 3) 2)で調製したマイクロチューブに、1)で調製した尿
検体を添加する。 4) 3)で調製した尿検体に、ＤＭＭＢ色素溶液（15mg/L
ＤＭＭＢ - 75mM ギ酸ナトリウム緩衝液 (pH6.8)） 400
μLを添加して攪拌する。 5) 波長530nm及び590nmにおける吸光度を吸光光度計で
測定し、両者の比（OD530nm/OD590nm）を求める。 6) 前記(1)で作成した検量線を用いて、各検体中のＧＡ
Ｇ濃度を算出する。

【００８４】測定の結果を表２に示す。また、同一の尿
サンプルを用いて、日を改めて全く同じ方法で測定した
結果を表３に示す。なお、表中の「n.d.」は検出されな
かったことを示す。また「ＭＳＤ」はマルチプルスルフ
ァターゼ欠損症を意味する。

【００８５】

【表２】

【００８６】

【表３】

【００８７】表２及び表３から明らかな通り、これら２
回の測定間でＧＡＧの測定値がよく一致していることか
ら、この方法は非常に再現性が高い方法であるといえ
る。また、健常者の尿中ＧＡＧ量は９〜16μg/mg Cre程
度（平均：12〜13μg/mg Cre）だったのに対し、いずれ
のムコ多糖症患者もこれよりはるかに高い値を示した。
以上の結果から、健常者の尿中ＧＡＧ量の範囲（基準範
囲）から外れる尿検体を選択することにより、ムコ多糖
症を漏れなく、しかも安価に選別できることが示され
た。

【００８８】

【実施例２】本発明方法１（ステップ（１）及び
（２））に関し、ヒトの尿を用いて、ＧＡＧ特異的分解
酵素とＧＡＧに反応して特定波長における吸光度が変化
する色素を用いたスクリーニングが可能か否か調べるた
め、以下の実験を行った。 (1)ＧＡＧの添加試験 まず、健常者の尿にＧＡＧを添加したものを検体として
ＧＡＧの測定を行った。添加したＧＡＧは以下の通りで
ある。ＨＳ(フ゛タ大動脈由来)、ＣＳ−Ｃ(サメ軟骨由来)
またはＫＳ(ウシ角膜由来)（いずれも生化学工業株式会
社製）。

【００８９】またＧＡＧ特異的分解酵素（いずれも生化
学工業株式会社製）は、尿100μLに対してそれぞれ以下
の量で用いた。ＨＳに対して、2.5 mUのヘパリチナーゼ
I及びIIの混合溶液(100μL)。ＣＳに対して、80 mUのコ
ンドロイチナーゼＡＢＣ及び16 mUのコンドロイチナー
ゼＡＣII(100μL)。ＫＳに対して、1 mUのケラタナーゼ
II(100μL)。

【００９０】酵素処理及びＧＡＧの測定は、以下の通り
行った。 1) 尿90μLに上記いずれかのＧＡＧの200μg/ml溶液ま
たは0.9％ NaClを10μL添加する。 2) 1)で調製した溶液に、前記量のＧＡＧ特異的分解酵
素または100mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を100μL
添加する。 3) 37℃で２時間反応させる。 4) 0.9％ NaClを200μｌ添加して攪拌する。 5) ＤＭＭＢを用いて測定する。具体的には以下の通り
である。 5-1)上記4)で調製した溶液、およびＧＡＧの標準液（対
応するＧＡＧで調製）を マイクロチューブに分取す
る。 5-2) これに反応用緩衝液を50μL添加する。 5-3) ＤＭＭＢ色素溶液400μLを添加して攪拌する。 5-4) 5-3)で調製した溶液の300μLを、９６穴のマイク
ロタイタープレート(商品名：Maxisorp、NUNC社製)のウ
ェルに移す。 5-5) 前記と同様に波長530nm及び590nmにおける吸光度
を測定し、両者の比（OD530nm/OD590nm）を求める。

【００９１】この試験を実施した結果、ＨＳを添加した
尿にヘパリチナーゼI及びIIを作用させたものでは、添
加したＨＳの測定値（OD530nm/OD590nm）の６３〜９８
％が酵素処理によって減少した。また、ＣＳ−Ｃを添加
した尿にコンドロイチナーゼＡＢＣ及びコンドロイチナ
ーゼＡＣIIを作用させたものでは、添加したＣＳ−Ｃの
測定値（OD530nm/OD590nm）の９９〜１００％が酵素処
理によって減少した。また、ＫＳを添加した尿にケラタ
ナーゼIIを作用させたものでは、添加したＫＳの測定値
（OD530nm/OD590nm）の６３〜１００％が酵素処理によ
って減少した。

【００９２】この結果から、ＧＡＧの添加に伴う測定値
（OD530nm/OD590nm）の増加分は、各々の分解酵素によ
り少なくとも６３％以上低下した（酵素処理前に対する
酵素処理後の比(残存率)が３７％未満）。この結果か
ら、前記のステップ（Ａ）及びステップ（Ｂ）において
色素との反応による測定値の増加が認められた場合にお
いて、それが尿中のＧＡＧの増加によるものであるなら
ば、このステップ（１）における測定値はステップ
（Ａ）の測定値に比して低下することが明らかとなっ
た。

【００９３】(2)実際の検体を用いた試験 ムコ多糖症患者計９人から採取した尿を用いてＧＡＧを
測定した。また尿100μLに対して、以下のＧＡＧ特異的
分解酵素混合溶液を用いた。

【００９４】2.5 mUのヘパリチナーゼI及びIIの混合
物、80 mUのコンドロイチナーゼＡＢＣ、16 mUのコンド
ロイチナーゼＡＣIIおよび1 mUのケラタナーゼIIを含有
し、100mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で全量を100μ
Lとした混合溶液。

【００９５】酵素処理及びＧＡＧの測定は、以下の通り
行った。 1) 尿90μLに、上記のＧＡＧ特異的分解酵素混合溶液ま
たは100mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を300μL添加
する。 2) 37℃で２時間反応させる。 3) 0.9％ NaClを100μL添加して攪拌する。 4) ＤＭＭＢを用いて測定する。具体的には上記(1)と同
様である。 この試験の結果を、残存率（酵素処理前の測定値に対す
る酵素処理後の測定値の比）と併せて表４に示す。

【００９６】

【表４】

【００９７】表４より、少なくとも酵素処理前後の測定
値の差に相当する量は、ＧＡＧに相当するものであると
いえる。これらの結果から、本発明方法１（ステップ
（１）及び（２））においては、尿中に存在するＧＡＧ
以外の物質であってＧＡＧに反応して特定波長における
吸光度が変化する色素に非特異的に反応してしまう物質
による影響（偽陽性による影響）を排除することがで
き、精度良く効率的にムコ多糖症を選別できることが示
された。

【００９８】

【実施例３】本発明方法２（ステップ（３））及び本発
明方法３（ステップ（４））に関し、１６人（患者又は
健常者）から採取した尿を用い、その中のＧＡＧ組成を
二糖分析できるか否かを確認するために、以下の実験を
行った。 (1)前処理 尿１ｍＬを陰イオン交換カラム（Ｑ−セファロースカラ
ム；ファルマシア製）にアプライし、尿中のＧＡＧを吸
着させた。次いでカラムを50mM Tris-HCl緩衝液（pH8.
6）で洗浄し、4M NaClで溶出する画分を採取して、これ
をPD-10（ゲルろ過カラム；ファルマシア製）で脱塩
し、遠心エバポレーターで濃縮した。この濃縮物を水
0.2mLに溶解して試料液とした。 (2) コンドロイチナーゼＡＢＣを用いたＣＳの分析 試料液40μLに、水70μL、100mM Tris-HCl緩衝液（pH8.
0）40μL、及びコンドロイチナーゼＡＢＣ（100mU）を
加えて全量を200μLとし、37℃で２時間酵素反応させた
後、生成した二糖を陰イオン交換カラムを用いたＨＰＬ
Ｃで分析した。ＨＰＬＣの条件等は以下の通りである。

【００９９】カラム：ＹＭＣゲルＰＡ１２０ Ｓ−５
（アミノプロピル基結合シリカゲル；株式会社ワイエム
シィ） 溶離液：0〜200mMの硫酸ナトリウム溶液の直線濃度勾配 温度：25℃ 流速：0.5mL/分 検出：蛍光検出計 (3) コンドロイチナーゼＡＣ−IIを用いたＣＳの分析
（ＤＳの分析） 試料液40μLに、水70μL、100mM 酢酸ナトリウム（pH8.
0）40μL、及びコンドロイチナーゼＡＣ−II（100mU）
を加えて全量を200μLとし、37℃で２時間酵素反応させ
た後、生成した二糖を陰イオン交換カラムを用いたＨＰ
ＬＣで分析した。ＨＰＬＣの条件等は「(2) コンドロイ
チナーゼＡＢＣを用いたＣＳの分析」と同様である。
「(2) コンドロイチナーゼＡＢＣを用いたＣＳの分析」
で求めたＣＳの総量（ＣＳとＤＳの両方が含まれる）か
らここで求めたＣＳの総量を差し引くことにより、ＤＳ
の量を算出した。 (4)ＨＳの分析 試料液100μLに、100mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）50μL、10mM酢酸カルシウム50μL、ヘパリチナーゼ
Ｉ（2.5mU）及びヘパリチナーゼII（2.5mU）を加えて全
量を210μLとし、37℃で4時間反応させた後、生成した
二糖を陰イオン交換カラムを用いたＨＰＬＣで分析し
た。ＨＰＬＣの条件等は、カラムとしてＹＭＣゲルＩＥ
Ｓ（ポリエチレンイミン；株式会社ワイエムシィ）を用
いた以外は「(2)コンドロイチナーゼＡＢＣを用いたＣ
Ｓの分析」と同様である。 (5)クレアチニンの測定 分析によって得られた二糖の量をクレアチニン量で補正
するために、市販のキット(クレアチニンテストワコ
ー；和光純薬)を用いて尿中のクレアチニン濃度を測定
した。

【０１００】１６人（患者又は健常者）から採取した尿
についての分析結果を表５に示す。

【０１０１】なお表５中における「ＣＳ」はコンドロイ
チン硫酸の量を、「ＤＳ」はデルマタン硫酸の量を、
「ＨＳ」はヘパラン硫酸の量をそれぞれ意味する。また
「ＭＳＤ」は、マルチプルスルファターゼ欠損症を意味
する。

【０１０２】

【表５】

【０１０３】表５から、Hurler症候群患者とHunter症候
群患者の尿中のＤＳ及びＨＳの量は健常者とはかけ離れ
て高値であった。この結果から、二糖分析はムコ多糖症
のスクリーニングステップとして利用可能であることが
確認され、また、これによる分析結果をムコ多糖症と関
連づけることが可能であることが示された。

【０１０４】

【実施例４】 本発明キットの作製 以下の構成からなる本発明キットを作製した。 １．ＤＭＭＢ色素溶液（15mg/L ＤＭＭＢ - 75mM ギ酸
ナトリウム緩衝液 (pH6.8) １本 ２．ヘパリチナーゼI及びII（0.1U）、コンドロイチナ
ーゼＡＢＣ（U）、コンドロイチナーゼＡＣII（U）及び
ケラタナーゼII（0.1U）を含有する混合物 １本 ３．尿の希釈バッファー（0.9% NaCl） １本 ４．反応用緩衝液 （2.88M グアニジン塩酸 - 0.075％
Tween20 - 150mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH6.8)） １
本 ５．マイクロタイタープレート １枚

【０１０５】

【発明の効果】本発明方法は、ムコ多糖症の患者を漏れ
なく、精度良く、簡便、効率的かつ安価にスクリーニン
グできる方法であり、極めて実用性が高い方法である。
これにより全新生児についてムコ多糖症の可能性が検知
できれば、未だムコ多糖症の症状が現れない出生後の早
期の段階で酵素補充療法や遺伝子治療等を実施でき、精
神発達の遅れ等をくい止めることができる可能性が高く
なる。

【０１０６】また本発明キットは、本発明方法をさらに
簡便・迅速化するものであることから、極めて有用であ
る。

【０１０７】なお本発明は、ムコ多糖症のスクリーニン
グのみならず、状態の把握、治療方針の決定、治療効果
の確認、医薬品開発の評価等へも応用することができ、
極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＧＡＧ濃度と OD530nm/OD590nmとの関係（検
量線）を示す図である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記ステップ（１）及び（２）を少なく
   とも含む、ムコ多糖症のスクリーニング方法。 （１）「被験者から採取された尿にグリコサミノグリカ
   ンを特異的に分解する酵素を作用させて得られる溶液」
   と「グリコサミノグリカンに反応して特定波長における
   吸光度が変化する色素」とを接触させて得られる尿検体
   ついて、当該特定波長における吸光度を測定するステッ
   プ。 （２）ステップ（１）で測定された結果を用いて、グリ
   コサミノグリカンを特異的に分解する酵素によって分解
   されたグリコサミノグリカン量を算出し、これが規定範
   囲内にある尿検体を特定するステップ。
2. 【請求項２】 被験者から採取された尿が、下記ステッ
   プ（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含むステップを経て特
   定された尿検体に対応する被験者から採取されたもので
   ある、請求項１に記載のスクリーニング方法。 （Ａ）被験者の尿と、「グリコサミノグリカンに反応し
   て特定波長における吸光度が変化する色素」とを接触さ
   せて得られる尿検体について、当該特定波長における吸
   光度を測定するステップ。 （Ｂ）（Ａ）で測定された結果を用いて、「グリコサミ
   ノグリカンに反応して特定波長における吸光度が変化す
   る色素」に反応した物質量を算出し、これが基準範囲外
   にある尿検体を特定するステップ。
3. 【請求項３】 下記ステップ（３）を少なくとも含む、
   ムコ多糖症のスクリーニング方法。 （３）請求項１に記載のステップ（２）によって特定さ
   れた尿検体に対応する被験者から採取された尿中のグリ
   コサミノグリカン組成を分析するステップ。
4. 【請求項４】 下記ステップ（４）を少なくとも含む、
   ムコ多糖症のスクリーニング方法。 （４）請求項３に記載のステップ（３）によって分析さ
   れたグリコサミノグリカン組成と、ムコ多糖症とを関連
   づけるステップ。
5. 【請求項５】 グリコサミノグリカンに反応して特定波
   長における吸光度が変化する色素が、ジメチルメチレン
   ブルーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のス
   クリーニング方法。
6. 【請求項６】 グリコサミノグリカンを特異的に分解す
   る酵素が、コンドロイチナーゼ、ケラタナーゼ及びヘパ
   リチナーゼから選ばれる１又は２以上の酵素である、請
   求項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方
   法。
7. 【請求項７】 グリコサミノグリカン組成の分析が、グ
   リコサミノグリカンを特異的に分解する酵素を作用させ
   てグリコサミノグリカンを二糖に分解し、当該二糖の組
   成を分析することにより行われることを特徴とする、請
   求項３〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方
   法。
8. 【請求項８】 下記構成成分（ａ）及び（ｂ）を少なく
   とも含む、ムコ多糖症のスクリーニングキット。 （ａ）グリコサミノグリカンに反応して特定波長におけ
   る吸光度が変化する色素（ｂ）グリコサミノグリカンを
   特異的に分解する酵素
9. 【請求項９】 グリコサミノグリカンに反応して特定波
   長における吸光度が変化する色素が、ジメチルメチレン
   ブルーである、請求項８に記載のスクリーニングキッ
   ト。
10. 【請求項１０】 グリコサミノグリカンを特異的に分解
    する酵素が、コンドロイチナーゼ、ケラタナーゼ及びヘ
    パリチナーゼから選ばれる１又は２以上の酵素である、
    請求項８又は９に記載のスクリーニングキット。