JP2003090815A - 遺伝子の電気化学的検出方法と核酸チップ - Google Patents
遺伝子の電気化学的検出方法と核酸チップInfo
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- JP2003090815A JP2003090815A JP2001283412A JP2001283412A JP2003090815A JP 2003090815 A JP2003090815 A JP 2003090815A JP 2001283412 A JP2001283412 A JP 2001283412A JP 2001283412 A JP2001283412 A JP 2001283412A JP 2003090815 A JP2003090815 A JP 2003090815A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸の標識や修飾を必要とせず、簡便に
安価で相補的核酸塩基対を検出できる相補的核酸塩基対
の測定方法を提供する。 【解決手段】 相補的核酸塩基対を電気化学的に検出す
る方法であって、少なくとも、微小電極に１本鎖プロー
ブ核酸を固定化して得られる核酸固定化微小電極に１本
鎖ターゲット核酸を接触させる工程と、該核酸固定化微
小電極における酸化還元電位の変化を測定する工程を有
する遺伝子の電気化学的検出方法とする。
安価で相補的核酸塩基対を検出できる相補的核酸塩基対
の測定方法を提供する。 【解決手段】 相補的核酸塩基対を電気化学的に検出す
る方法であって、少なくとも、微小電極に１本鎖プロー
ブ核酸を固定化して得られる核酸固定化微小電極に１本
鎖ターゲット核酸を接触させる工程と、該核酸固定化微
小電極における酸化還元電位の変化を測定する工程を有
する遺伝子の電気化学的検出方法とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、相補的遺
伝子を電気化学的に検出する方法とそのための核酸チッ
プに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発
明は、１本鎖プローブ核酸を固定化した核酸固定化微小
電極における１本鎖ターゲット核酸とのハイブリダイゼ
ーションの有無を電気化学的に検出する方法と、そのた
めの核酸チップに関するものである。
伝子を電気化学的に検出する方法とそのための核酸チッ
プに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発
明は、１本鎖プローブ核酸を固定化した核酸固定化微小
電極における１本鎖ターゲット核酸とのハイブリダイゼ
ーションの有無を電気化学的に検出する方法と、そのた
めの核酸チップに関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】ＤＮＡ、酵素、抗体、ペプチ
ド等の生体分子が独自の特異的分子認識能を有している
ことはよく知られており、これら分子認識能のバイオセ
ンサーへの応用が盛んに研究、報告されている。
ド等の生体分子が独自の特異的分子認識能を有している
ことはよく知られており、これら分子認識能のバイオセ
ンサーへの応用が盛んに研究、報告されている。
【０００３】近年、ヒトゲノムをはじめとする生物の遺
伝子構造が次々と解明され、様々な遺伝的疾患やウィル
ス性疾患において遺伝子の変異が関与することが明らか
になってきている。そのため、ＤＮＡを生物素子として
用いるバイオセンサー、中でもＤＮＡセンサーが集積化
されたＤＮＡチップは多種類の遺伝子の配列や変異、あ
るいは機能を迅速に解明する手法として注目されてお
り、医学、分子生物学等の広い分野で基盤技術となるこ
とが期待される。
伝子構造が次々と解明され、様々な遺伝的疾患やウィル
ス性疾患において遺伝子の変異が関与することが明らか
になってきている。そのため、ＤＮＡを生物素子として
用いるバイオセンサー、中でもＤＮＡセンサーが集積化
されたＤＮＡチップは多種類の遺伝子の配列や変異、あ
るいは機能を迅速に解明する手法として注目されてお
り、医学、分子生物学等の広い分野で基盤技術となるこ
とが期待される。
【０００４】現在実用化されているＤＮＡチップとして
は、ＤＮＡ固定化担体としてニトロセルロース膜、シリ
コン基板、ガラス基板、高分子、電極などを用いた各種
のものがある。また、ＤＮＡの基板上への固定化方法
も、化学的結合法やＤＮＡが負電荷を帯びている性質を
用いて、特定位置に正電位をかけることで電極上にプロ
ーブＤＮＡを固定化する電気化学的固定化法が知られて
いる。
は、ＤＮＡ固定化担体としてニトロセルロース膜、シリ
コン基板、ガラス基板、高分子、電極などを用いた各種
のものがある。また、ＤＮＡの基板上への固定化方法
も、化学的結合法やＤＮＡが負電荷を帯びている性質を
用いて、特定位置に正電位をかけることで電極上にプロ
ーブＤＮＡを固定化する電気化学的固定化法が知られて
いる。
【０００５】このようなＤＮＡチップでは、一般に、配
列の異なる多数の１本鎖ＤＮＡが整列固定化されてい
る。これに蛍光標識した１本鎖ターゲットＤＮＡを反応
させれば、互いに相補的な遺伝子のみが２本鎖ＤＮＡを
形成するので、その部分の蛍光強度を測定することによ
り、遺伝子機能の解析や疾患に関与する遺伝子を検出で
きる。
列の異なる多数の１本鎖ＤＮＡが整列固定化されてい
る。これに蛍光標識した１本鎖ターゲットＤＮＡを反応
させれば、互いに相補的な遺伝子のみが２本鎖ＤＮＡを
形成するので、その部分の蛍光強度を測定することによ
り、遺伝子機能の解析や疾患に関与する遺伝子を検出で
きる。
【０００６】しかし、このような従来の蛍光検出型ＤＮ
Ａチップでは、あらかじめフルオレセイン、ローダミ
ン、Ｃｙ３、Ｃｙ５などの蛍光色素でターゲットＤＮＡ
を標識しておく必要があるため、作業性が煩雑となると
いう問題があった。また、ＤＮＡチップ上で発せられる
蛍光シグナルは、共焦点レーザー顕微鏡、蛍光スキャナ
ーなどを搭載した解析装置で検出、画像化、解析される
ため、大型で高価な設備を必要とするという問題もあっ
た。
Ａチップでは、あらかじめフルオレセイン、ローダミ
ン、Ｃｙ３、Ｃｙ５などの蛍光色素でターゲットＤＮＡ
を標識しておく必要があるため、作業性が煩雑となると
いう問題があった。また、ＤＮＡチップ上で発せられる
蛍光シグナルは、共焦点レーザー顕微鏡、蛍光スキャナ
ーなどを搭載した解析装置で検出、画像化、解析される
ため、大型で高価な設備を必要とするという問題もあっ
た。
【０００７】さらに、疾患易罹患性や薬剤反応性に関連
する遺伝子の探索における多型マーカーとして近年注目
されている一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出では、安定性
の微妙に異なる多種類のＤＮＡを、特定温度下、溶液中
で同時に測定することが必要であるが、従来の蛍光検出
型ＤＮＡチップは、乾燥下での測定を対象とするため、
このような測定が不可能であった。
する遺伝子の探索における多型マーカーとして近年注目
されている一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出では、安定性
の微妙に異なる多種類のＤＮＡを、特定温度下、溶液中
で同時に測定することが必要であるが、従来の蛍光検出
型ＤＮＡチップは、乾燥下での測定を対象とするため、
このような測定が不可能であった。
【０００８】これらの問題を解決するものとして、電気
化学的に遺伝子を検出する方法が研究されている。電気
化学的遺伝子検出方法は、非標識での遺伝子の検出を可
能とする、汎用の装置を利用できるため低価格が実現さ
れる、装置全体の簡略化や小型化が可能になる、などの
多くの利点が期待される。
化学的に遺伝子を検出する方法が研究されている。電気
化学的遺伝子検出方法は、非標識での遺伝子の検出を可
能とする、汎用の装置を利用できるため低価格が実現さ
れる、装置全体の簡略化や小型化が可能になる、などの
多くの利点が期待される。
【０００９】これまでに報告されている遺伝子の電気化
学的検出方法としては、例えば、金電極上にホスホチオ
レート基を介してビオチン化プローブ核酸を固定化し、
プローブと１本鎖ターゲット核酸を接触させることによ
りハイブリッドを形成させ、さらにビオチンと特異的に
相互作用するアビジンを結合した酵素を反応させてその
酵素反応に基づく電気信号から遺伝子を検出するものが
ある（Langmuir, 1999, 15, 3703）。しかし、このよう
な方法は、プローブ核酸の固定化、ハイブリダイゼーシ
ョン、タンパク質相互作用、酵素反応、生成物の電極上
への析出という多くの操作を必要とし、簡便とは言い難
かった。
学的検出方法としては、例えば、金電極上にホスホチオ
レート基を介してビオチン化プローブ核酸を固定化し、
プローブと１本鎖ターゲット核酸を接触させることによ
りハイブリッドを形成させ、さらにビオチンと特異的に
相互作用するアビジンを結合した酵素を反応させてその
酵素反応に基づく電気信号から遺伝子を検出するものが
ある（Langmuir, 1999, 15, 3703）。しかし、このよう
な方法は、プローブ核酸の固定化、ハイブリダイゼーシ
ョン、タンパク質相互作用、酵素反応、生成物の電極上
への析出という多くの操作を必要とし、簡便とは言い難
かった。
【００１０】また、金電極上にチオールアンカーを介し
て化学吸着させたプローブ核酸を用いてナフタレン−フ
ェロセン酸化還元インタカレーターによって遺伝子を検
出する方法が報告されている（Anal.Chem. 2000, 72, 1
334）。しかし、インタカレーターを電極活性プローブ
として用いる方法では、一般的に１本鎖ＤＮＡと２本鎖
ＤＮＡの識別は可能なものの、インタカレーターの結合
領域に配列依存性があるため、分析物に対応したインタ
カレーターを選択する必要があるという問題があった。
て化学吸着させたプローブ核酸を用いてナフタレン−フ
ェロセン酸化還元インタカレーターによって遺伝子を検
出する方法が報告されている（Anal.Chem. 2000, 72, 1
334）。しかし、インタカレーターを電極活性プローブ
として用いる方法では、一般的に１本鎖ＤＮＡと２本鎖
ＤＮＡの識別は可能なものの、インタカレーターの結合
領域に配列依存性があるため、分析物に対応したインタ
カレーターを選択する必要があるという問題があった。
【００１１】さらに、ガラス状カーボン電極上に導電性
酸化還元高分子膜を形成し、酵素（HRP）でラベルした
(dT)25-30または(dA)25-30を共有結合させ、相補的核酸
とのハイブリダイゼーションによって起こる酵素反応に
基づく電気信号を検出する方法（Anal.Chem. 1999, 71,
394）では、核酸を酵素でラベルする際に煩雑な操作を
必要とする上、過剰なラベル酵素を洗浄除去する必要が
あり、測定精度が必ずしも安定しないという問題があっ
た。
酸化還元高分子膜を形成し、酵素（HRP）でラベルした
(dT)25-30または(dA)25-30を共有結合させ、相補的核酸
とのハイブリダイゼーションによって起こる酵素反応に
基づく電気信号を検出する方法（Anal.Chem. 1999, 71,
394）では、核酸を酵素でラベルする際に煩雑な操作を
必要とする上、過剰なラベル酵素を洗浄除去する必要が
あり、測定精度が必ずしも安定しないという問題があっ
た。
【００１２】そして、以上のような従来の電気化学的検
出方法では、いずれの場合も、酸化・還元物質やインタ
カレーターを使用するため、煩雑な操作を要し、測定の
コストも高くなるという問題もあった。
出方法では、いずれの場合も、酸化・還元物質やインタ
カレーターを使用するため、煩雑な操作を要し、測定の
コストも高くなるという問題もあった。
【００１３】遺伝子の電気化学的検出方法として、indi
cator-freeな方法も報告されているが（Anal.Chem. 200
0, 72, 1334-1341）、これは、塩基配列にグアニン
（Ｇ）がなければならないなどの制限があり、汎用性が
小さかったのが実情である。
cator-freeな方法も報告されているが（Anal.Chem. 200
0, 72, 1334-1341）、これは、塩基配列にグアニン
（Ｇ）がなければならないなどの制限があり、汎用性が
小さかったのが実情である。
【００１４】そこで、この出願の発明は、以上のとおり
の事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点
を解消し、プローブ核酸やターゲット核酸の標識を必要
とせず、相補的核酸塩基対を簡便かつ高精度に検出でき
る遺伝子の検出方法と、そのための小型化が容易で低価
格な核酸チップを提供することを課題としている。
の事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点
を解消し、プローブ核酸やターゲット核酸の標識を必要
とせず、相補的核酸塩基対を簡便かつ高精度に検出でき
る遺伝子の検出方法と、そのための小型化が容易で低価
格な核酸チップを提供することを課題としている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、まず第１には、相補的核
酸塩基対を電気化学的に検出する方法であって、少なく
とも、微小電極に１本鎖プローブ核酸を固定化して得ら
れる核酸固定化微小電極に１本鎖ターゲット核酸を接触
させる工程と、該核酸固定化微小電極における酸化還元
電位の変化を測定する工程を有することを特徴とする遺
伝子の電気化学的検出方法を提供する。
の課題を解決するものとして、まず第１には、相補的核
酸塩基対を電気化学的に検出する方法であって、少なく
とも、微小電極に１本鎖プローブ核酸を固定化して得ら
れる核酸固定化微小電極に１本鎖ターゲット核酸を接触
させる工程と、該核酸固定化微小電極における酸化還元
電位の変化を測定する工程を有することを特徴とする遺
伝子の電気化学的検出方法を提供する。
【００１６】第２には、この出願の発明は、相補的核酸
塩基対を電気化学的に検出するためのチップであって、
基板上に、微小電極にチオール基を介して１本鎖プロー
ブ核酸が結合固定化された核酸固定化微小電極が設置さ
れていることを特徴とする核酸チップを提供する。
塩基対を電気化学的に検出するためのチップであって、
基板上に、微小電極にチオール基を介して１本鎖プロー
ブ核酸が結合固定化された核酸固定化微小電極が設置さ
れていることを特徴とする核酸チップを提供する。
【００１７】また、この出願の発明は、第３には、核酸
固定化微小電極が複数設置されている核酸チップを、第
４には、微小電極の面積が各々１ｍｍ2未満である核酸
チップを、そして、第５には、基板上に１本鎖ターゲッ
ト核酸および／または電解質溶液を核酸固定化微小電極
と接触させるためのマイクロウェルを有する核酸チップ
を提供する。
固定化微小電極が複数設置されている核酸チップを、第
４には、微小電極の面積が各々１ｍｍ2未満である核酸
チップを、そして、第５には、基板上に１本鎖ターゲッ
ト核酸および／または電解質溶液を核酸固定化微小電極
と接触させるためのマイクロウェルを有する核酸チップ
を提供する。
【００１８】この出願の発明は、さらに、第６には、相
補的核酸塩基対を電気化学的に検出できる装置であっ
て、少なくとも、前記いずれかの核酸チップと、電気化
学測定手段と、解析手段と、解析結果表示手段を有する
ことを特徴とする自動遺伝子診断装置をも提供する。
補的核酸塩基対を電気化学的に検出できる装置であっ
て、少なくとも、前記いずれかの核酸チップと、電気化
学測定手段と、解析手段と、解析結果表示手段を有する
ことを特徴とする自動遺伝子診断装置をも提供する。
【００１９】
【発明の実施の形態】発明者らは、鋭意研究を進めた結
果、核酸固定化微小電極上の１本鎖プローブ核酸と１本
鎖ターゲット核酸が相補性を示し、ハイブリッドを形成
するとき、酸化還元電位に明確な変化が見られることを
見出し、この出願の発明の遺伝子の電気化学的検出方法
に至った。
果、核酸固定化微小電極上の１本鎖プローブ核酸と１本
鎖ターゲット核酸が相補性を示し、ハイブリッドを形成
するとき、酸化還元電位に明確な変化が見られることを
見出し、この出願の発明の遺伝子の電気化学的検出方法
に至った。
【００２０】すなわち、この出願の発明の遺伝子の電気
化学的検出方法は、微小電極に１本鎖プローブ核酸を固
定化した核酸固定化微小電極と１本鎖ターゲット核酸を
接触させ、該核酸固定化微小電極における酸化還元電位
を測定するだけで、簡単に相補的核酸塩基対を検出でき
るというものである。この出願の発明の遺伝子の電気化
学的検出方法では、まず、核酸固定化微小電極の電気化
学測定を行い、その後１本鎖ターゲット核酸を該核酸固
定化微小電極に接触させ、同様に電気化学測定を行う。
このとき、核酸固定化微小電極上の１本鎖プローブ核酸
と１本鎖ターゲット核酸が相補性を有し、ハイブリッド
を形成していれば酸化還元電位に変化が現れる。しか
し、核酸固定化微小電極上の１本鎖プローブ核酸と１本
鎖ターゲット核酸がハイブリダイゼーションしない場合
には、酸化還元電位に変化は見られない。
化学的検出方法は、微小電極に１本鎖プローブ核酸を固
定化した核酸固定化微小電極と１本鎖ターゲット核酸を
接触させ、該核酸固定化微小電極における酸化還元電位
を測定するだけで、簡単に相補的核酸塩基対を検出でき
るというものである。この出願の発明の遺伝子の電気化
学的検出方法では、まず、核酸固定化微小電極の電気化
学測定を行い、その後１本鎖ターゲット核酸を該核酸固
定化微小電極に接触させ、同様に電気化学測定を行う。
このとき、核酸固定化微小電極上の１本鎖プローブ核酸
と１本鎖ターゲット核酸が相補性を有し、ハイブリッド
を形成していれば酸化還元電位に変化が現れる。しか
し、核酸固定化微小電極上の１本鎖プローブ核酸と１本
鎖ターゲット核酸がハイブリダイゼーションしない場合
には、酸化還元電位に変化は見られない。
【００２１】この出願の発明の遺伝子の電気化学的検出
方法では、以上のとおりに、少なくとも、（１）核酸固
定化微小電極と１本鎖ターゲット核酸を接触させる工程
と、（２）電気化学測定を行う工程を有していればよい
が、生化学実験操作において通常用いられる各種の工程
を含んでいてもよい。具体的には、１本鎖ターゲット核
酸を核酸固定化微小電極と接触させた後、一定温度でハ
イブリダイゼーション反応させる工程や、ハイブリッド
を形成せずに１本鎖プローブ核酸に物理吸着している１
本鎖ターゲット核酸を除去するための洗浄工程が好まし
く例示される。
方法では、以上のとおりに、少なくとも、（１）核酸固
定化微小電極と１本鎖ターゲット核酸を接触させる工程
と、（２）電気化学測定を行う工程を有していればよい
が、生化学実験操作において通常用いられる各種の工程
を含んでいてもよい。具体的には、１本鎖ターゲット核
酸を核酸固定化微小電極と接触させた後、一定温度でハ
イブリダイゼーション反応させる工程や、ハイブリッド
を形成せずに１本鎖プローブ核酸に物理吸着している１
本鎖ターゲット核酸を除去するための洗浄工程が好まし
く例示される。
【００２２】この出願の発明の遺伝子の電気化学的検出
方法において、上記（１）の核酸固定化微小電極と１本
鎖ターゲット核酸を接触させる方法としては、各種のも
のが考慮され、その詳細な条件等は限定されない。例え
ば、候補となる１本鎖ターゲット核酸を含有する溶液に
核酸固定化微小電極を浸漬させる方法、核酸固定化微小
電極表面に１本鎖ターゲット核酸を含有する溶液を滴
下、塗布する方法等が挙げられる。さらに、核酸固定化
微小電極を基板上に構築し、該基板上の核酸固定化微小
電極と接触する位置にマイクロウェルを設け、１本鎖タ
ーゲット核酸を含有する溶液を導入できるようにしても
よい。このとき使用される１本鎖ターゲット核酸を含有
する溶液には、ｐＨ調整剤（緩衝剤）や各種の塩類等が
含有されていてもよく、また、溶液の温度を制御してハ
イブリダイゼーション反応を起こさせてもよい。
方法において、上記（１）の核酸固定化微小電極と１本
鎖ターゲット核酸を接触させる方法としては、各種のも
のが考慮され、その詳細な条件等は限定されない。例え
ば、候補となる１本鎖ターゲット核酸を含有する溶液に
核酸固定化微小電極を浸漬させる方法、核酸固定化微小
電極表面に１本鎖ターゲット核酸を含有する溶液を滴
下、塗布する方法等が挙げられる。さらに、核酸固定化
微小電極を基板上に構築し、該基板上の核酸固定化微小
電極と接触する位置にマイクロウェルを設け、１本鎖タ
ーゲット核酸を含有する溶液を導入できるようにしても
よい。このとき使用される１本鎖ターゲット核酸を含有
する溶液には、ｐＨ調整剤（緩衝剤）や各種の塩類等が
含有されていてもよく、また、溶液の温度を制御してハ
イブリダイゼーション反応を起こさせてもよい。
【００２３】この出願の発明の遺伝子の電気化学的検出
方法では、従来の検出方法と異なり、溶液中での精度高
い相補的核酸塩基対の検出が可能である点が特徴的であ
る。したがって、前記（２）の電気化学測定としては、
電解質溶液中で行われる一般的な電気化学測定法を適用
できる。例えば、前記核酸固定化微小電極を作用電極と
し、対極や参照電極を同一の電解質溶液中に設置し、電
源や解析装置に接続する方法が挙げられる。具体的に
は、ポテンシオスタットやガルバノスタットを用いた電
気化学測定法が例示される。このような従来の電気化学
測定法では、電解質溶液中のｐＨや塩濃度、溶液温度等
の各種条件を適宜選択することができるため、この出願
の発明の遺伝子の電気化学的検出方法は、特殊な測定条
件を要する遺伝子の検出にも適用できる。
方法では、従来の検出方法と異なり、溶液中での精度高
い相補的核酸塩基対の検出が可能である点が特徴的であ
る。したがって、前記（２）の電気化学測定としては、
電解質溶液中で行われる一般的な電気化学測定法を適用
できる。例えば、前記核酸固定化微小電極を作用電極と
し、対極や参照電極を同一の電解質溶液中に設置し、電
源や解析装置に接続する方法が挙げられる。具体的に
は、ポテンシオスタットやガルバノスタットを用いた電
気化学測定法が例示される。このような従来の電気化学
測定法では、電解質溶液中のｐＨや塩濃度、溶液温度等
の各種条件を適宜選択することができるため、この出願
の発明の遺伝子の電気化学的検出方法は、特殊な測定条
件を要する遺伝子の検出にも適用できる。
【００２４】また、この出願の発明では、以上のとおり
の遺伝子の電気化学的検出方法のための核酸チップをも
提供する。このような核酸チップは、基板上に上記核酸
固定化微小電極を構築してなるものである。すなわち、
基板上に、微小電極を設置し、その表面に１本鎖プロー
ブ核酸を固定化させて得られる。
の遺伝子の電気化学的検出方法のための核酸チップをも
提供する。このような核酸チップは、基板上に上記核酸
固定化微小電極を構築してなるものである。すなわち、
基板上に、微小電極を設置し、その表面に１本鎖プロー
ブ核酸を固定化させて得られる。
【００２５】このとき、基板は、ガラス、シリコン、各
種プラスチック等から適宜選択できる。中でもガラス
は、各種の方法により微細加工できる上、安価なことか
ら好ましく用いられる。基板上に微小電極を構築する方
法としては、真空蒸着法や半導体微細加工技術を応用し
たフォトファブリケーション法が例示される。とくに微
細な電極や配線を作成し、１つの基板上に多くの微小電
極を設けるためには、フォトリソグラフィー技術、蒸着
技術、エッチング技術などを組み合わせたフォトファブ
リケーション法が好ましく適用される。
種プラスチック等から適宜選択できる。中でもガラス
は、各種の方法により微細加工できる上、安価なことか
ら好ましく用いられる。基板上に微小電極を構築する方
法としては、真空蒸着法や半導体微細加工技術を応用し
たフォトファブリケーション法が例示される。とくに微
細な電極や配線を作成し、１つの基板上に多くの微小電
極を設けるためには、フォトリソグラフィー技術、蒸着
技術、エッチング技術などを組み合わせたフォトファブ
リケーション法が好ましく適用される。
【００２６】具体的には、まず、真空蒸着やスパッタリ
ングなどの蒸着技術により基板上に電極材料となる金属
薄膜を形成させ、スピンコーターを用いて金属薄膜上に
感光性材料（フォトレジスト）を塗布する。使用される
フォトレジストは、露光によって材料が分解して現像液
に溶解するもの（ポジ型）であっても露光により重合し
て溶解しなくなるもの（ネガ型）であってもよい。次に
フォトレジスト膜の上に微細な電極や回路をデザインし
たフォトマスクを設置し、露光することによりパターン
を転写する。さらに、現像液に浸してレジストをパター
ニングし、エッチング液に浸して金属薄膜をエッチング
すれば、デザインした微小電極アレイが作製できる。
ングなどの蒸着技術により基板上に電極材料となる金属
薄膜を形成させ、スピンコーターを用いて金属薄膜上に
感光性材料（フォトレジスト）を塗布する。使用される
フォトレジストは、露光によって材料が分解して現像液
に溶解するもの（ポジ型）であっても露光により重合し
て溶解しなくなるもの（ネガ型）であってもよい。次に
フォトレジスト膜の上に微細な電極や回路をデザインし
たフォトマスクを設置し、露光することによりパターン
を転写する。さらに、現像液に浸してレジストをパター
ニングし、エッチング液に浸して金属薄膜をエッチング
すれば、デザインした微小電極アレイが作製できる。
【００２７】このようなフォトファブリケーション法
は、ＩＣやＬＳＩの製造技術として確立されている。し
たがって、この方法を用いれば、核酸チップの自動生
産、大量生産が容易となり、製造コストを低下すること
ができる。また、形成する金属薄膜の種類を変化するこ
とにより、電極材料や配線の材料を各種の材料から選択
できる。具体的には、金、銀、白金、Ａｌ、ガラス状カ
ーボンディスク、導電性高分子フィルム等が好ましく例
示される。なかでも、金は、扱い易く、ＤＮＡの固定化
が安定に行えるため、電極材料として好ましい。さら
に、フォトマスクのデザインを変えることにより、１つ
の基板上に設置される微小電極の数を必要に応じて設定
できる。例えば、後述の実施例では、26mm×50mmのガラ
ス基板上に３２０〜３６０個の微小電極を構築してい
る。
は、ＩＣやＬＳＩの製造技術として確立されている。し
たがって、この方法を用いれば、核酸チップの自動生
産、大量生産が容易となり、製造コストを低下すること
ができる。また、形成する金属薄膜の種類を変化するこ
とにより、電極材料や配線の材料を各種の材料から選択
できる。具体的には、金、銀、白金、Ａｌ、ガラス状カ
ーボンディスク、導電性高分子フィルム等が好ましく例
示される。なかでも、金は、扱い易く、ＤＮＡの固定化
が安定に行えるため、電極材料として好ましい。さら
に、フォトマスクのデザインを変えることにより、１つ
の基板上に設置される微小電極の数を必要に応じて設定
できる。例えば、後述の実施例では、26mm×50mmのガラ
ス基板上に３２０〜３６０個の微小電極を構築してい
る。
【００２８】この出願の発明の核酸チップは、以上のと
おりの方法により基板上に構築された微小電極上に１本
鎖プローブ核酸を固定化して得られる。このとき使用さ
れる１本鎖プローブ核酸は、１本鎖ＤＮＡに限定され
ず、ＲＮＡやＰＮＡ等であってもよい。例えば１本鎖タ
ーゲット核酸が相補性を示し、ハイブリダイゼーション
する遺伝子を調べたい場合には、候補となる核酸を１本
鎖プローブ核酸として微小電極上に固定化すればよい。
核酸チップ上の基板に複数の微小電極が構築されている
場合には、各電極に異なる１本鎖プローブ核酸を設置
し、各電極について酸化還元電位の変化を測定すれば、
簡便に、短時間で相補的核酸塩基対を検出することがで
きる。
おりの方法により基板上に構築された微小電極上に１本
鎖プローブ核酸を固定化して得られる。このとき使用さ
れる１本鎖プローブ核酸は、１本鎖ＤＮＡに限定され
ず、ＲＮＡやＰＮＡ等であってもよい。例えば１本鎖タ
ーゲット核酸が相補性を示し、ハイブリダイゼーション
する遺伝子を調べたい場合には、候補となる核酸を１本
鎖プローブ核酸として微小電極上に固定化すればよい。
核酸チップ上の基板に複数の微小電極が構築されている
場合には、各電極に異なる１本鎖プローブ核酸を設置
し、各電極について酸化還元電位の変化を測定すれば、
簡便に、短時間で相補的核酸塩基対を検出することがで
きる。
【００２９】この出願の発明の核酸チップにおいて、微
小電極に１本鎖プローブ核酸を固定化させる方法はどの
ようなものであってもよい。本願発明は、前記のとお
り、溶液中で相補的核酸塩基対を検出できるものである
ことから、電解液等の溶液中で一度固定化された１本鎖
プローブ核酸が遊離しない方法を選択することが必要で
ある。好ましくは、１本鎖プローブ核酸の末端にチオー
ル基を結合させ、微小電極に結合固定化させる方法（例
えばAnal.Chem. 2000, 72, 1334）が例示される。もち
ろん、これ以外の公知あるいは新規の電極材料への１本
鎖核酸の固定化方法を適用してもよい。
小電極に１本鎖プローブ核酸を固定化させる方法はどの
ようなものであってもよい。本願発明は、前記のとお
り、溶液中で相補的核酸塩基対を検出できるものである
ことから、電解液等の溶液中で一度固定化された１本鎖
プローブ核酸が遊離しない方法を選択することが必要で
ある。好ましくは、１本鎖プローブ核酸の末端にチオー
ル基を結合させ、微小電極に結合固定化させる方法（例
えばAnal.Chem. 2000, 72, 1334）が例示される。もち
ろん、これ以外の公知あるいは新規の電極材料への１本
鎖核酸の固定化方法を適用してもよい。
【００３０】以上のとおりのこの出願の発明の核酸チッ
プは、小型の基板上に多数の核酸固定化微小電極を有す
るものとすることができる。また、この出願の発明の遺
伝子の電気化学的検出方法は、従来法のように酵素反応
や酸化・還元物質、インタカレーター等を使用しないた
め、煩雑な操作を必要とせず、ポテンシオスタット等の
汎用の電気化学測定装置を用いて簡便で精度高い測定を
可能とするものである。後述の実施例からも明らかなよ
うに、本願発明の遺伝子の電気化学的検出方法では、〜
０．１ｆＭという検出範囲を有するため、微量（極低濃
度）の試料から遺伝子診断を行うことが可能となる。
プは、小型の基板上に多数の核酸固定化微小電極を有す
るものとすることができる。また、この出願の発明の遺
伝子の電気化学的検出方法は、従来法のように酵素反応
や酸化・還元物質、インタカレーター等を使用しないた
め、煩雑な操作を必要とせず、ポテンシオスタット等の
汎用の電気化学測定装置を用いて簡便で精度高い測定を
可能とするものである。後述の実施例からも明らかなよ
うに、本願発明の遺伝子の電気化学的検出方法では、〜
０．１ｆＭという検出範囲を有するため、微量（極低濃
度）の試料から遺伝子診断を行うことが可能となる。
【００３１】さらに、この出願の発明は、以上のとおり
の核酸チップを用いて遺伝子の電気化学的検出を行うた
めの装置をも提供する。このような自動遺伝子診断装置
は、電気化学測定手段と、解析手段と、解析結果表示手
段を有していればよく、例えば電源、発信機、解析用チ
ップ、液晶モニター、プリンター等から構成されるもの
が挙げられる。また、このような自動遺伝子診断装置
は、電源、発信機、解析装置等を簡略化した回路を構築
することにより小型化することができる。したがって、
近年医療現場での重要性が高まっているポイント・オブ
・ケア検査（ＰＯＣＴ）を可能とする携帯型自動遺伝子
診断装置としても期待される。
の核酸チップを用いて遺伝子の電気化学的検出を行うた
めの装置をも提供する。このような自動遺伝子診断装置
は、電気化学測定手段と、解析手段と、解析結果表示手
段を有していればよく、例えば電源、発信機、解析用チ
ップ、液晶モニター、プリンター等から構成されるもの
が挙げられる。また、このような自動遺伝子診断装置
は、電源、発信機、解析装置等を簡略化した回路を構築
することにより小型化することができる。したがって、
近年医療現場での重要性が高まっているポイント・オブ
・ケア検査（ＰＯＣＴ）を可能とする携帯型自動遺伝子
診断装置としても期待される。
【００３２】以下、添付した図面に沿って実施例を示
し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明す
る。もちろん、この発明は以下の例に限定されるもので
はなく、細部については様々な態様が可能であることは
言うまでもない。
し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明す
る。もちろん、この発明は以下の例に限定されるもので
はなく、細部については様々な態様が可能であることは
言うまでもない。
【００３３】
【実施例】〔実施例１〕 ＤＮＡチップの作成
（１）微小金電極アレイの作製
図１に微小電極アレイの作成工程の概要を示した。
【００３４】（ａ）スライドガラス（１００）（MATSUN
AMI社製、76 mm×27 mm、厚さ1.2〜1.5 mm）を適当な大
きさに切断して約26 mm×50mmとし、水洗した後、超純
水（Milli Q）中で30分間、電子工業用アセトン（関東
化学）で30分間、さらに超純水で30分間超音波洗浄し
た。
AMI社製、76 mm×27 mm、厚さ1.2〜1.5 mm）を適当な大
きさに切断して約26 mm×50mmとし、水洗した後、超純
水（Milli Q）中で30分間、電子工業用アセトン（関東
化学）で30分間、さらに超純水で30分間超音波洗浄し
た。
【００３５】（ｂ）ターボ式真空蒸着装置（Varian社
製、JTM200R）を用いて、約5×10-5 Torr以下の真空状
態で純度99.95%のＡｌ（ニラコ株式会社）を約200Å蒸
着し、続いて純度99.95%の金（ニラコ株式会社）を約20
00Å蒸着し、Ａｌ／Ａｕ薄膜（１１０）を形成した。
製、JTM200R）を用いて、約5×10-5 Torr以下の真空状
態で純度99.95%のＡｌ（ニラコ株式会社）を約200Å蒸
着し、続いて純度99.95%の金（ニラコ株式会社）を約20
00Å蒸着し、Ａｌ／Ａｕ薄膜（１１０）を形成した。
【００３６】（ｃ）基板上に、スピンコーター（初速50
0 rpm×3 sec、本速5500rpm×20 sec、slope 2 sec）で
ポジ型レジスト（S1818、Shipley）を均一に塗布し、レ
ジスト層（１１１）を形成した。
0 rpm×3 sec、本速5500rpm×20 sec、slope 2 sec）で
ポジ型レジスト（S1818、Shipley）を均一に塗布し、レ
ジスト層（１１１）を形成した。
【００３７】（ｄ）この基板を１１０℃で１分間加熱し
た後、予めAdobe Illustrator8でデザインし、フィルム
出力（山田製版）したフォトマスクを固定し、露光（２
５秒）して、現像液（MF-319、Shipley）×30 sec、純
水×30 secで現像した。
た後、予めAdobe Illustrator8でデザインし、フィルム
出力（山田製版）したフォトマスクを固定し、露光（２
５秒）して、現像液（MF-319、Shipley）×30 sec、純
水×30 secで現像した。
【００３８】（ｅ）KI（和光純薬工業）40g、Ｉ2（和光
純薬工業）10gを超純水400mlに溶解したもので金×1 mi
n、純水×30 secでエッチングした後、HNO3（和光純薬
工業）50ml、CH3COOH（和光純薬工業）200ml、H3PO
4（和光純薬工業）200mlを超純水50mlに溶解したもので
Ａｌ（４０℃×１０秒、純水×３０秒）をエッチングし
た。
純薬工業）10gを超純水400mlに溶解したもので金×1 mi
n、純水×30 secでエッチングした後、HNO3（和光純薬
工業）50ml、CH3COOH（和光純薬工業）200ml、H3PO
4（和光純薬工業）200mlを超純水50mlに溶解したもので
Ａｌ（４０℃×１０秒、純水×３０秒）をエッチングし
た。
【００３９】（ｆ）remover（1165、Shipley）６０℃×
１０秒、アセトン（関東化学）、エタノール（和光純薬
工業）の順でレジストの犠牲層をはがすことにより微小
電極アレイを作製した。
１０秒、アセトン（関東化学）、エタノール（和光純薬
工業）の順でレジストの犠牲層をはがすことにより微小
電極アレイを作製した。
【００４０】（ｇ）リード線部分を被覆するために再び
ポジ型レジスト（S1818、SHIPLEY）を塗布してレジスト
層（１１２）を形成した後、オーブンで加熱した後、
（ｈ）別のマスクパターンを用いて露光、現像し、微小
電極（１１）部分および外部接続電極（リードワイヤ）
（１２）部分を露出させた。
ポジ型レジスト（S1818、SHIPLEY）を塗布してレジスト
層（１１２）を形成した後、オーブンで加熱した後、
（ｈ）別のマスクパターンを用いて露光、現像し、微小
電極（１１）部分および外部接続電極（リードワイヤ）
（１２）部分を露出させた。
【００４１】得られた微小金電極アレイを図２に示し
た。
た。
【００４２】この微小金電極アレイには、１本鎖ターゲ
ットＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を行う際に
１本鎖ターゲットＤＮＡ含有溶液をマイクロピペットで
滴下するためのマイクロウェル（１３）を構築した。 （２）１本鎖プローブＤＮＡの固定化 50merのpoly(dA)（配列番号１）を１本鎖プローブＤＮ
Ａとした。
ットＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を行う際に
１本鎖ターゲットＤＮＡ含有溶液をマイクロピペットで
滴下するためのマイクロウェル（１３）を構築した。 （２）１本鎖プローブＤＮＡの固定化 50merのpoly(dA)（配列番号１）を１本鎖プローブＤＮ
Ａとした。
【００４３】一方、ターゲットＤＮＡとしては、50mer
のpoly(dT)（配列番号２）、50merのpoly(dG)（配列番
号３）、50merのpoly(dC)（配列番号４）、および配列
番号２のpoly(dT)における5'末端から１３番目〜１８番
目までの６個のＴをＡＡＣＣＧＧとしたミスマッチＤＮ
Ａ（配列番号５）を準備した。
のpoly(dT)（配列番号２）、50merのpoly(dG)（配列番
号３）、50merのpoly(dC)（配列番号４）、および配列
番号２のpoly(dT)における5'末端から１３番目〜１８番
目までの６個のＴをＡＡＣＣＧＧとしたミスマッチＤＮ
Ａ（配列番号５）を準備した。
【００４４】まず、配列番号１のオリゴヌクレオチドの
５’末端にチオール基を導入したもの（0.2μg逆相ＨＰ
ＬＣ精製したプローブＤＮＡから「日清紡研究開発セン
ター」にて合成）にTE buffer（10mM Tris-HCl (pH8.0)
and 1mM EDTA (pH8.0)、和光純薬工業（株）製）をチ
オール修飾１本鎖プローブＤＮＡとし、適当量加えて希
釈した。マイクロピペットを用いて、チオール修飾１本
鎖プローブＤＮＡ（50μＭ、0.5μl）溶液（100 mM KC
l）を微小金電極（１１）上にスポットし、５℃で２４
時間反応させ、１本鎖プローブＤＮＡを固定化した。
５’末端にチオール基を導入したもの（0.2μg逆相ＨＰ
ＬＣ精製したプローブＤＮＡから「日清紡研究開発セン
ター」にて合成）にTE buffer（10mM Tris-HCl (pH8.0)
and 1mM EDTA (pH8.0)、和光純薬工業（株）製）をチ
オール修飾１本鎖プローブＤＮＡとし、適当量加えて希
釈した。マイクロピペットを用いて、チオール修飾１本
鎖プローブＤＮＡ（50μＭ、0.5μl）溶液（100 mM KC
l）を微小金電極（１１）上にスポットし、５℃で２４
時間反応させ、１本鎖プローブＤＮＡを固定化した。
【００４５】固定化反応後、KCl buffer（100mM、和光
純薬工業（株）製）を用いて電極を洗浄し、微小金電極
（１１）上に結合固定化されていないプローブＤＮＡを
除去した。 〔実施例２〕 ＤＮＡチップを用いた電気化学測定 （１）ＤＮＡチップの酸化還元電位の確認 １本鎖プローブＤＮＡを固定化していない微小金電極ア
レイ（１）および配列番号１の１本鎖プローブＤＮＡを
固定化したＤＮＡチップ（１’）を各々２５℃のKCl溶
液（100mM、20μl）（２）に浸漬し、３電極法によるサ
イクリックボルタンメトリーを行った。
純薬工業（株）製）を用いて電極を洗浄し、微小金電極
（１１）上に結合固定化されていないプローブＤＮＡを
除去した。 〔実施例２〕 ＤＮＡチップを用いた電気化学測定 （１）ＤＮＡチップの酸化還元電位の確認 １本鎖プローブＤＮＡを固定化していない微小金電極ア
レイ（１）および配列番号１の１本鎖プローブＤＮＡを
固定化したＤＮＡチップ（１’）を各々２５℃のKCl溶
液（100mM、20μl）（２）に浸漬し、３電極法によるサ
イクリックボルタンメトリーを行った。
【００４６】図３に電気化学測定装置の概略を示した。
【００４７】参照電極（３）は銀とし、比較電極を用い
て対比して電位のずれが±1mV以内であることを確認し
た後用いた。対極（４）には白金線を用いた。
て対比して電位のずれが±1mV以内であることを確認し
た後用いた。対極（４）には白金線を用いた。
【００４８】測定は、ＤＮＡチップ（１’）からリード
ワイヤ（１２）を引き出し、ポテンシオスタット（５）
に接続して行った。測定は、掃引速度50mV/sで-400〜70
0mVの範囲で４回繰り返した。コンピュータ（６）で解
析し、得られたサイクリックボルタモグラムを図４に示
した。
ワイヤ（１２）を引き出し、ポテンシオスタット（５）
に接続して行った。測定は、掃引速度50mV/sで-400〜70
0mVの範囲で４回繰り返した。コンピュータ（６）で解
析し、得られたサイクリックボルタモグラムを図４に示
した。
【００４９】１本鎖プローブＤＮＡを固定化していない
微小金電極アレイ（１）では、金由来の酸化還元ピーク
（約-23μA）が得られた（図４ａ）。一方、プローブＤ
ＮＡを固定化したＤＮＡチップ（１’）では、金由来の
ピークはほとんど見られなかった（図４ｂ）。
微小金電極アレイ（１）では、金由来の酸化還元ピーク
（約-23μA）が得られた（図４ａ）。一方、プローブＤ
ＮＡを固定化したＤＮＡチップ（１’）では、金由来の
ピークはほとんど見られなかった（図４ｂ）。
【００５０】これより、１本鎖プローブＤＮＡの固定化
により微小金電極（１１）が絶縁されたことが確認され
た。 （２）ハイブリダイゼーション 実施例１で作成したＤＮＡチップに、ハイブリダイゼー
ションバッファー（100mM KCl and 5mM Tris-HCl (pH8.
0)、和光純薬工業（株）製）で調製した１本鎖ターゲッ
トＤＮＡ（配列番号２）（0.01aM〜50μM、0.5μl）を
マイクロピペットでスポットし、５℃で２４時間反応さ
せ、１本鎖ターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション
した。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーシ
ョンバッファーで微小金電極（１１）を洗浄して非特異
的に吸着しているＤＮＡを除去した。
により微小金電極（１１）が絶縁されたことが確認され
た。 （２）ハイブリダイゼーション 実施例１で作成したＤＮＡチップに、ハイブリダイゼー
ションバッファー（100mM KCl and 5mM Tris-HCl (pH8.
0)、和光純薬工業（株）製）で調製した１本鎖ターゲッ
トＤＮＡ（配列番号２）（0.01aM〜50μM、0.5μl）を
マイクロピペットでスポットし、５℃で２４時間反応さ
せ、１本鎖ターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション
した。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーシ
ョンバッファーで微小金電極（１１）を洗浄して非特異
的に吸着しているＤＮＡを除去した。
【００５１】得られたサイクリックボルタモグラムを図
４ｃに示した。
４ｃに示した。
【００５２】サイクリックボルタモグラムにおいて、金
由来の酸化還元ピークは完全に消失し、電流値も1/10程
度になった。これより、１本鎖プローブＤＮＡに１本鎖
ターゲットＤＮＡがハイブリダイゼーションし、微小金
電極（１１）上のＤＮＡの密度が高まり、微小金電極
（１１）が完全に絶縁されたことが示された。 〔比較例１〕実施例１で作成したＤＮＡチップ（１’）
に、実施例２と同様の方法でコントロールＤＮＡ（配列
番号３）を接触させ、反応させた。
由来の酸化還元ピークは完全に消失し、電流値も1/10程
度になった。これより、１本鎖プローブＤＮＡに１本鎖
ターゲットＤＮＡがハイブリダイゼーションし、微小金
電極（１１）上のＤＮＡの密度が高まり、微小金電極
（１１）が完全に絶縁されたことが示された。 〔比較例１〕実施例１で作成したＤＮＡチップ（１’）
に、実施例２と同様の方法でコントロールＤＮＡ（配列
番号３）を接触させ、反応させた。
【００５３】しかし、いずれの場合も酸化・還元電流−
電位曲線はＤＮＡチップ（１’）単独の酸化・還元電流
−電位曲線とほぼ同じであった（図４ｄ）。すなわち、
poly(dG)（配列番号３）がプローブＤＮＡであるpoly(d
A)にハイブリダイゼーションしないことが電気化学的に
確認された。
電位曲線はＤＮＡチップ（１’）単独の酸化・還元電流
−電位曲線とほぼ同じであった（図４ｄ）。すなわち、
poly(dG)（配列番号３）がプローブＤＮＡであるpoly(d
A)にハイブリダイゼーションしないことが電気化学的に
確認された。
【００５４】この操作を４回繰り返したところ、いずれ
の場合も再現性が確認された。
の場合も再現性が確認された。
【００５５】同様に、poly(dC)（配列番号４）やpoly(d
T)のミスマッチＤＮＡ（配列番号５）についても同様の
操作を行ったところ、poly(dA)とのハイブリダイゼーシ
ョンが起こらないことを電気化学的に確認できた。 〔実施例３〕 ターゲットＤＮＡの濃度測定 実施例１で作成されたpoly(dA)（配列番号１）をプロー
ブＤＮＡとして有するＤＮＡチップに対し、ターゲット
ＤＮＡ（配列番号２）の濃度を1nM〜25nMまで変え、酸
化・還元電流−電位曲線を得た。ターゲットＤＮＡの濃
度と酸化・還元ピークの関係を図５に示した。
T)のミスマッチＤＮＡ（配列番号５）についても同様の
操作を行ったところ、poly(dA)とのハイブリダイゼーシ
ョンが起こらないことを電気化学的に確認できた。 〔実施例３〕 ターゲットＤＮＡの濃度測定 実施例１で作成されたpoly(dA)（配列番号１）をプロー
ブＤＮＡとして有するＤＮＡチップに対し、ターゲット
ＤＮＡ（配列番号２）の濃度を1nM〜25nMまで変え、酸
化・還元電流−電位曲線を得た。ターゲットＤＮＡの濃
度と酸化・還元ピークの関係を図５に示した。
【００５６】0.1fM〜50μMまで直線的な関係が示された
こと、およびプローブＤＮＡのみの酸化還元ピークに外
挿した結果より、この出願の発明のＤＮＡチップを用い
ることにより、相補的核酸塩基対を、0.1fMという極微
量のターゲットＤＮＡから検出できることが示唆され
た。つまり、この発明の相補的核酸塩基対の電気化学的
測定方法は、従来法に比べて広い検出精度を有すること
が確認された。
こと、およびプローブＤＮＡのみの酸化還元ピークに外
挿した結果より、この出願の発明のＤＮＡチップを用い
ることにより、相補的核酸塩基対を、0.1fMという極微
量のターゲットＤＮＡから検出できることが示唆され
た。つまり、この発明の相補的核酸塩基対の電気化学的
測定方法は、従来法に比べて広い検出精度を有すること
が確認された。
【００５７】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、精度高く、簡便に相補的核酸塩基対を検出、定
量する方法とそのための核酸チップが提供される。
よって、精度高く、簡便に相補的核酸塩基対を検出、定
量する方法とそのための核酸チップが提供される。
【００５８】この発明の核酸チップは、プローブ核酸や
ターゲット核酸を標識する必要がなく、電気化学的にハ
イブリダイゼーションを検出できるため、測定には汎用
の装置を用いることができ、煩雑な操作や高価な試薬、
さらには設備等を必要としない。また、この核酸チップ
を用いることにより、遺伝子診断装置の小型化、携帯化
が容易となることから、遺伝子疾患やウィルス性疾患の
ポイント・オブ・ケア検査、あるいは早期診断に有用と
いえる。
ターゲット核酸を標識する必要がなく、電気化学的にハ
イブリダイゼーションを検出できるため、測定には汎用
の装置を用いることができ、煩雑な操作や高価な試薬、
さらには設備等を必要としない。また、この核酸チップ
を用いることにより、遺伝子診断装置の小型化、携帯化
が容易となることから、遺伝子疾患やウィルス性疾患の
ポイント・オブ・ケア検査、あるいは早期診断に有用と
いえる。
【００５９】
【配列表】
<110> 科学技術振興事業団（Japan Science and Technology Corporation）
<120> 遺伝子の電気化学的検出方法と核酸チップ
<130> NP01354-SH
<160> 5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> Synthesized Oligonucleotide
<400> 1
aaaaa aaaaa aaaaa aaaaa aaaaa aaaaa aaaaa aaaaa aaaaa aaaaa 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> Synthesized Oligonucleotide
<400> 2
ttttt ttttt ttttt ttttt ttttt ttttt ttttt ttttt ttttt ttttt 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> Synthesized Oligonucleotide
<400> 3
ggggg ggggg ggggg ggggg ggggg ggggg ggggg ggggg ggggg ggggg 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> Synthesized Oligonucleotide
<400> 4
ccccc ccccc ccccc ccccc ccccc ccccc ccccc ccccc ccccc ccccc 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> Synthesized Oligonucleotide
<400> 5
ttttt ttttt ttaac cggtt ttttt ttttt ttttt ttttt ttttt ttttt 50
【図１】この発明のＤＮＡチップの製造工程を例示した
概略模式図である。
概略模式図である。
【図２】この出願の発明の実施例により得られた微小金
電極アレイの写真を示した図である。
電極アレイの写真を示した図である。
【図３】この発明の実施例において相補的核酸塩基対の
電気化学的測定に用いられた装置の概略を示した模式図
である。
電気化学的測定に用いられた装置の概略を示した模式図
である。
【図４】この発明の実施例における電気化学測定より得
られたサイクリックボルタモグラムを示した図である。
（ａ：微小金電極アレイのみ、ｂ：１本鎖プローブ核酸
（poly(dA)）を固定化したＤＮＡチップ、ｃ：１本鎖タ
ーゲットＤＮＡ（poly(dT)）と反応後（ハイブリダイゼ
ーションあり）、ｄ：１本鎖ターゲットＤＮＡ（poly(d
G)）と反応後（ハイブリダイゼーションなし））
られたサイクリックボルタモグラムを示した図である。
（ａ：微小金電極アレイのみ、ｂ：１本鎖プローブ核酸
（poly(dA)）を固定化したＤＮＡチップ、ｃ：１本鎖タ
ーゲットＤＮＡ（poly(dT)）と反応後（ハイブリダイゼ
ーションあり）、ｄ：１本鎖ターゲットＤＮＡ（poly(d
G)）と反応後（ハイブリダイゼーションなし））
【図５】この発明のＤＮＡチップを用いてハイブリダイ
ゼーションを電気化学的に測定した際のターゲットＤＮ
Ａの濃度と得られる酸化・還元ピークの関係を示した図
である。
ゼーションを電気化学的に測定した際のターゲットＤＮ
Ａの濃度と得られる酸化・還元ピークの関係を示した図
である。
１ 微小金電極アレイ
１’ ＤＮＡチップ
１１ 微小金電極、作用電極
１２ リードワイヤ
１３ マイクロウェル
１００ ガラス基板
１１０ Ａｌ／Ａｕ薄膜
１１１ レジスト層
１１２ レジスト層
２ 電解質溶液（KCl）
３ 参照電極（Ａｇ）
４ 対極（Ｐｔ）
５ ポテンシオスタット
６ コンピュータ
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 27/48 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２
33/483 27/30 ３５１
33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ
37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｂ
(72)発明者 谷口 正輝
大阪府箕面市小野原東６丁目38−10 ルー
ブルハイツ111
Ｆターム(参考） 2G045 AA25 DA12 DA13 DA14 DA77
FB02 FB05 FB16 HA16
4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 HA11
HA12
4B029 AA07 FA02 FA10 FA15
4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR55
QS34 QS39 QX04 QX05
Claims (6)
- 【請求項１】 相補的核酸塩基対を電気化学的に検出す
る方法であって、少なくとも、微小電極に１本鎖プロー
ブ核酸を固定化して得られる核酸固定化微小電極に１本
鎖ターゲット核酸を接触させる工程と、該核酸固定化微
小電極における酸化還元電位の変化を測定する工程を有
することを特徴とする遺伝子の電気化学的検出方法。 - 【請求項２】 相補的核酸塩基対を電気化学的に検出す
るためのチップであって、基板上に、微小電極にチオー
ル基を介して１本鎖プローブ核酸が結合固定化された核
酸固定化微小電極が設置されていることを特徴とする核
酸チップ。 - 【請求項３】 核酸固定化微小電極が複数設置されてい
る請求項２の核酸チップ。 - 【請求項４】 核酸固定化微小電極は、各々の面積が１
ｍｍ2未満である請求項２または３のいずれかの核酸チ
ップ。 - 【請求項５】 基板上に、１本鎖ターゲット核酸および
／または電解質溶液を核酸固定化微小電極と接触させる
ためのマイクロウェルを有する請求項２ないし４のいず
れかの核酸チップ。 - 【請求項６】 請求項１の方法によって相補的核酸塩基
対を電気化学的に検出できる装置であって、少なくと
も、請求項２ないし５のいずれかの核酸チップと、電気
化学測定手段と、解析手段と、解析結果表示手段を有す
ることを特徴とする自動遺伝子診断装置。
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|---|---|---|---|
| JP2001283412A JP2003090815A (ja) | 2001-09-18 | 2001-09-18 | 遺伝子の電気化学的検出方法と核酸チップ |
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Publications (1)
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|---|---|
| JP2003090815A true JP2003090815A (ja) | 2003-03-28 |
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