JP2003047470A - 新規な抗体及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 未変性のノッチリガンド細胞外部分蛋白質を
特異的に認識する抗体を提供する。 【解決手段】未変性のノッチリガンド細胞外部分蛋白質
を特異的に認識する抗体によって未変性ノッチリガンド
細胞外蛋白質と変性ノッチリガンド細胞外蛋白質とを分
別する。生理活性がより期待される未変性ノッチリガン
ド蛋白質のみを精製でき、さらに生理活性を有するノッ
チリガンドのみ選択的に検出できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な抗体および
その使用方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ノッチ(Notch) はショウジョウバエで発
見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター型膜蛋
白質であり、ヒトを含めた哺乳類では４種のノッチ分子
(Notch-1〜4)が同定されている（Artavanis-Tsakonas e
t al., Science. 284: 770-6,1999.)。一方、このノッ
チを活性化するアゴニストであるリガンド分子として、
ショウジョウバエノッチリガンドであるショウジョウバ
エデルタ(Delta) およびショウジョウバエセレイト(Ser
rate) の２つが見いだされている。これらリガンド分子
はリセプターのノッチ同様、I 型の膜蛋白質である。こ
れらリガンド分子は、ヒトを含めた哺乳類において３種
のデルタ分子 (Dll1、Dll3、Dll4) と２つのセレイト
（ジャグド)(Jagged-1〜2)が同定され、報告されてい
る。本発明においては、これら５種の分子を総称して、
ノッチリガンドという。

【０００３】これらのヒト分子、すなわちヒトノッチリ
ガンドについては国際公開公報WO97/19172、WO98/0245
8、WO98/51799、日本特許公開平11-299493 にアミノ酸
配列、遺伝子配列、遺伝子クローニング手法、蛋白質の
発現方法、用途などが記載されている。これら以外に
も、国際公開公報WO96/27610、WO97/45143、WO98/58958
にはヒトジャグドー 1、WO96/27610にはヒトジャグドー
2 のアミノ酸配列と一部アミノ酸配列がオーバーラップ
するヒトジャグドー2 様分子、さらに国際公開公報WO97
/01571、WO2000/53753にはヒトデルター1 、国際公開公
報WO2000/47602、WO2001/12664にはヒトダルター3 、国
際公開公報WO98/45434、WO2000/06726、日本特許公開20
00-23674にはヒトデルター4 について記載されており、
ヒトを含む脊椎動物のノッチリガンドのアミノ酸配列が
開示されている。特に、ヒトジャグドー2 に関しては、
坂野、伊藤は国際公開公報WO98/02458において抗体の作
成及びその用途について記述している。

【０００４】国際公開公報WO98/02458によると、坂野、
伊藤は抗体としてはマウスモノクローナル抗体とウサギ
ポリクローナル抗体を通常の方法で作製した。これら抗
体は還元剤 2−メルカプトエタノール（以下、2-MEと記
す）により還元を受けた細胞外ヒトジャグドー2 ポリペ
プチド、すなわち変性を受けた細胞外ヒトジャグドー2
蛋白質を認識すると共に、還元剤2-MEによる還元を受け
ない細胞外ヒトジャグドー2 ポリペプチド、すなわち未
変性の細胞外ヒトジャグドー2 蛋白質を認識することが
ウエスタンブロット法により明らかにされている。ま
た、このモノクローナル抗体を用いることにより細胞外
ヒトジャグドー2 ポリペプチドがアフィニティークロマ
トグラフィー法にて精製できることが明らかにされてい
る。また、これらの用途として、ヒトジャグドー2 蛋白
質の精製に使用できること、細胞の分化異常に伴う疾
患、例えば悪性腫瘍など疾患の検査薬として使用できる
ことが記載されている。上記に示したその他のヒトノッ
チリガンドに関しても同様な機能を有する抗体であるこ
とが示されている。しかしながら、いずれも変性ならび
に未変性蛋白質を共に認識する抗体しか知られていな
い。つまり、上記のように通常の方法、すなわち一般的
なハイブリドーマ作製と一般的なスクリーニング方法で
抗体を作製した場合、上記のような性質の抗体が得られ
ることが理解される。

【０００５】一般に変性した蛋白質は元来その蛋白質が
有している活性を消失する場合が多い。たとえば酵素を
還元剤で処理すると酵素活性を消失することが多い。特
に、細胞外に分泌、もしくは細胞膜外に存在する蛋白質
は、システイン残基のようなＳＨ基を有するとそれ自身
もしくは他の蛋白質上にあるシステイン残基のＳＨ基と
ジスルフォニル結合によって共有結合し、その結果、そ
れら蛋白質の高次構造が保たれる。これら高次構造はそ
れらの蛋白質の性質を保つためには非常に重要である。

【０００６】ノッチ並びにノッチリガンドはその構造上
の特徴として、それらの細胞外部分においてシステイン
残基を極めて多く有し、特に６つのシステイン残基を一
つの構造体とするEpidermal Growth Factor(EGF)様配列
を繰り返し複数有する。このEGF 様配列はその一つのユ
ニット中に６つのシステイン残基により３対のジスルフ
ォニル結合を持ち、他の分子との結合や酵素活性を有す
るためにはカルシウムイオンを必要とすることを特徴と
する。また、リセプターであるノッチとノッチリガンド
の結合にはカルシウムイオンが必要であることが知られ
ている。したがって、これらの点から、このシステイン
間のジスルフォニル結合はノッチリガンド固有の活性に
とって必須であることが判る。

【０００７】しかしながら、上記抗体は未変性の活性を
有したノッチリガンドのみならず、還元剤処理された変
性ノッチリガンドをも同時に認識してしまう。すなわ
ち、活性を有したノッチリガンドを検出すると同時に、
元来の活性を有しないノッチリガンドを検出したり、活
性を有したノッチリガンドを精製すると同時に、元来の
活性を有さないノッチリガンドを分別することなく同時
に精製してしまう。従来の抗体にはこの様な問題点があ
った。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決するためになされたものであって、未変性のノッ
チリガンドを特異的に認識し得る抗体を作製し、これを
使用することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決する手段】本発明者らは、上記の抗体を作
製するために、上記に挙げた文献では試みられていない
モノクローナル抗体の作製方法を試み、鋭意工夫を重ね
て、この課題の解決に取り組んだ。すなわち、本発明者
らは、抗原としてヒトノッチリガンドのひとつ、ヒトジ
ャグドー2 細胞外ポリペプチドを免疫原とし、ラットの
足の裏に免疫し、所属リンパ節をとりだし、この細胞と
マウスミエローマ細胞との融合を行い、ヒトジャグドー
2 抗体産生ハイブリドーマを多数作製した。このように
して得られた多数のハイブリドーマクローンの中から、
目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、
マウス細胞株にヒトジャグドー２遺伝子を導入してヒト
ジャグドー２全長安定発現細胞株を作製し、この細胞株
を染色できる抗体を産生するハイブリドーマクローンを
フローサイトメーターにより検出して選択した。さら
に、このようにして選択されたハイブリドーマから、免
疫沈降法ではヒトジャグドー2 蛋白質を認識でき（未変
性蛋白を認識することの確認）、2-MEによる変性ヒトジ
ャグドー2 蛋白質を認識しない（変性蛋白を認識しない
ことの確認）性質を基に最終選択を行った。さらに、こ
のようにして選ばれた抗体を固定化した担体により未変
性蛋白質と変性蛋白質を分画できることを明らかにし
て、本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明は、未変性のノッチリガ
ンド蛋白質の細胞外部分を特異的に認識することを特徴
とする抗体に関する。本発明におけるノッチリガント蛋
白質には、ヒトノッチリガンド蛋白質がまた未変性のノ
ッチリガンド蛋白質にはヒトジャグドー2 蛋白質があ
る。本発明における未変性のノッチリガンド蛋白質の細
胞外部分を特異的に認識する抗体としては、そのモノク
ローナル抗体、特にラットに免疫して得られるモノクロ
ーナル抗体、あるいは受託番号 FERM BP-7600 のハイブ
リドーマTS-11 細胞により産生される抗体、あるいは未
変性のノッチリガンド蛋白質の細胞外部分が配列表配列
番号１に記載されるアミノ酸配列を有する抗体などがあ
る。

【００１１】また、本発明は、上記記載の抗体を用いる
疾患の検査方法、これらの抗体を用いてノッチリガンド
蛋白質を発現する細胞の分離または検出方法、これらの
抗体を用いる検査薬キット、この分離または検出原理を
利用した細胞分離キットまたは細胞分離装置、前記抗体
を固定化した担体並びにこの担体を用いたノッチリガン
ド蛋白質の精製及び製造方法に関する。本発明における
検査の対象となる疾患としては、細胞の分化異常に伴う
疾患が挙げられる。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おける、遺伝子操作に必要なcDNAの作製、ハイブリダイ
ゼーションによるスクリーニング、組換え DNAの作製、
DNAの塩基配列の決定、cDNAライブラリーの作製等の一
連の分子生物学的な実験、ならびに遺伝子導入による蛋
白質の発現、電気泳動法による蛋白質分子量の決定、ウ
ィエスタンブロット、免疫沈降法などの一連の蛋白質化
学的な実験は通常の実験書に記載の方法によって行うこ
とができる。前記の通常の実験書としては、たとえば、
Sambrookら著、 Molecular Cloning, A laborartory ma
nual, 3rd ed. 2001,Cold Spring Harbor Loboratory P
ressを挙げることができる。また、配列表において、配
列表配列番号１のアミノ酸配列は、本発明で使用したヒ
トジャグドー2 のシグナルペプチドを除いた細胞外ドメ
インの配列である。配列表配列番号２のアミノ酸配列
は、ヒトジャグドー2 の成熟型全長アミノ酸配列であ
る。配列表配列番号３の配列は本発明のヒトジャグドー
2 の全アミノ酸配列及びそれをコードしているcDNA配列
である。なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端
及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下 N末）及びカル
ボキシル基末端（以下 C末）であり、また塩基配列の左
端及び右端はそれぞれ5'末端及び3'末端である。

【００１３】本発明で使用したヒトジャグドー2 細胞外
部分ポリペプチドの作製並びに、ヒトジャグドー2 全長
発現ベクターで形質転換した細胞株の作製は、参考例に
記載した方法に従って行った。なお、これらの詳細につ
いては、坂野、伊藤の国際公開公報WO98/02458に記述さ
れている。また、本発明で使用したヒトジャグドー2の
全アミノ酸配列をコードするcDNAを含むベクターpUCSR-
2 を大腸菌 JM109に遺伝子導入した形質転換細胞は、E.
coli: JM109-pUCSR-2 として日本国つくば市東１丁目
１番地１ 中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに寄託されている。寄託日は平
成８年10月28日であり、受託番号はFERMBP-5727であ
る。

【００１４】抗体の作製は通常の実験書に記載の方法に
よって行うことができる。たとえば、その実験書として
はHarlowら著、Antibodies; A Laboratory Manual,198
8, Cold Spring Harbor Laboratory Press を挙げるこ
とができる。特に、本発明におけるラットモノクローナ
ル抗体作製手法はSadoらの論文（Kishino, Y. et al. C
ell Struct. Funct., 20: 151-156, 1994)もしくは佐渡
義一著「ラットリンパ節法実験現場プロトコル；ラット
リンパ節法によるモノクローナル抗体の作製」2000年、
重井医学研究所発行（〒701-0202岡山県山田2117）にそ
の実験手法の詳細が記述され、これを参考にすることに
より行うことができる。

【００１５】また、各種抗体の評価方法は通常の実験書
に記載の方法によって行うことができる。たとえば、そ
の実験書としてはHarlowら著、 Using Antibodies; A L
aboratory Manual,1999, Cold Spring Harbor Laborato
ry Pressを挙げることができる。

【００１６】本発明者らは参考例に示したごとく、精
製、単離されたヒトノッチリガンドであるヒトジャグド
ー2 ポリペプチドを作製した。すなわち、細胞外タンパ
ク質を発現する発現ベクターとして、配列表配列番号１
に記載のアミノ酸配列の１から1055のアミノ酸の C末側
に、8 アミノ酸、すなわち Asp Tyr Lys Asp Asp Asp A
sp Lysのアミノ酸配列（以下、FLAG配列という）（配列
表配列番号４）を持つポリペプチドを付加したキメラ蛋
白質をコードする DNAを発現ベクターpCDNA3 (インビト
ロジェン社) ヒトジャグド−2 の細胞外部分発現ベクタ
ーを作製し、CHO-K1細胞（大日本製薬株式会社より購入
可能：ATCC:CCL-61)に遺伝子導入し、ネオマイシン存在
下で安定発現細胞株の選択を行い、高発現細胞株のクロ
ーニング後、その細胞株上清を回収し、抗 FLAG 抗体固
定化カラムによるアフィニティークロマトグラフィー法
にてヒトジャグドー2 細胞外蛋白質を精製した。

【００１７】また、全長タンパク質を発現する発現ベク
ターとして、配列表配列番号２の１から1212のアミノ酸
の C末端側にFLAG配列を持つポリペプチドを付加したキ
メラタンパク質コードする DNAを発現ベクター pCDNA3
につなぎ、ヒトジャグド−2の全長発現ベクターを作製
した。この発現ベクターをマウス細胞株 BALB3T3 (理化
学研究所細胞開発銀行より分与可能。登録番号は RCB00
05。もしくは ATCC:CCL-163)に遺伝子導入を行い、ネオ
マイシンにて発現細胞を選択し、ヒトジャグドー2 を細
胞膜上に発現する安定発現細胞株を得た。

【００１８】参考例の方法で作製されたヒトジャグドー
2 細胞外蛋白質を免疫原として、実施例１に記載の方法
で、抗ヒトジャグドー2 ラットモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマクローン細胞株を多数作製をした。この
実施例の方法の詳細及びそれらの変法などのハイブリド
ーマ作製に関わる技術的な点は上記の成書「ラットリン
パ節法実験現場プロトコル；ラットリンパ節法によるモ
ノクローナル抗体の作製」に記述され、それらを参考に
して行うことができる。

【００１９】実施例２に示したように、この様にして作
製された複数のハイブリドーマ細胞の培養上清を参考例
で作製したヒトジャグドー2 を細胞膜上に発現する安定
発現細胞株と反応させ、フローサイトメーターにて該安
定発現細胞株に反応する細胞上清を選択した。すなわ
ち、このような作用を有する抗体を産生するハイブリド
ーマクローン細胞を選択した。フローサイトメーターの
手法については H.M.Shapiroによる Practical Flow Cy
tometory、3rded.、1995、Wiley-Liss,Inc. に詳細な記
述があり、これを参考にして行うことができる。

【００２０】実施例３に示したように、この様にして選
択されたハイブリドーマクローン細胞の中から、さらに
最終的に、1)免疫沈降法で抗原を認識する、2) 2-ME 添
加条件で変性した抗原を用いたドットブロット法では抗
原を認識しない、の２点を指標にしてこれらのハイブリ
ドーマのクローン細胞が上清に産生するモノクローナル
抗体を選択し、最終的にハイブリドーマクローン細胞株
TS-11を作製した。

【００２１】また、本発明の未変性ヒトジャグドー2 細
胞外部分を認識するラットモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマクローン細胞株 TS-11は、TS-11 として日本
国つくば市東１丁目１番地１ 中央第６に所在の独立行
政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託
されている。寄託日は平成13年５月23日であり、受託番
号は FERM BP-7600 である。

【００２２】このようにして作製されたハイブリドーマ
クローン細胞株から遺伝子クローニング法などにより分
離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現
させた遺伝子組換え体抗体によっても作製することがで
きる。このように作製された抗体は同様な抗原認識能を
有しているため、同じようにヒトジャグド−2 の精製な
らびに他の用途に使用できる。

【００２３】実施例４に示したように、このハイブリド
ーマクローン細胞 TS-11が産生するモノクローナル抗体
TS-11を固体化した担体を用いて、アフィニティーカラ
ムを作製した。このアフィニティーカラムは未変性型ヒ
トジャグドー2 のみ吸着できるよう、変性型ヒトジャグ
ドー2 細胞外蛋白質と未変性型ヒトジャグドー2 細胞外
蛋白質を分別できる。

【００２４】本発明の抗体は、この様なノッチリガンド
蛋白質の精製のみならず検出にも利用できる。元来、ノ
ッチリガンド分子は細胞表面上に膜蛋白として発現す
る。したがって、本発明の抗体が認識する抗原を検出す
ることにより、抗原であるノッチリガンド蛋白質を発現
する細胞を検出できる。この検出法としては、実施例２
に示したように、本発明の抗体を用いて、細胞を染色し
た後、フローサイトメーターにて染色細胞を検出する方
法、蛍光顕微鏡にて観察して検出する方法などに応用で
きる。一般に検査される細胞として末梢血球、骨髄の場
合にはフローサイトメーターがで適当であり、固形癌、
各種臓器組織の場合には蛍光顕微鏡が適当である。ま
た、疾患としては白血球、各種悪性腫瘍、良性腫瘍、遺
伝病などが挙げられる。したがって、本発明の抗体を用
いた細胞検査方法並びに細胞検査キットも本発明に含ま
れる。この目的の検査薬の構成の一例として、蛍光色素
ラベルされた本発明の精製抗体と、安定化剤（アルブミ
ンなど）、防腐剤（NaN３など)から構成される溶液を遮
光瓶にいれた商品が挙げられる。

【００２５】また、ノッチリガンドは、元来細胞膜蛋白
質であるが、自然に分泌型のリガンドとなることも知ら
れている。ノッチリガンドの一つデルター1 は、メタロ
プロテアーゼのひとつ、クズバニアン（Kzubanian)によ
り細胞膜外で切断され、分泌型となることが知られてい
る（Qi, H. et al., Science, 283: 91-4, 1999)。ま
た、血管内皮細胞からヒトジャグドー1 が遺伝子クロー
ニングされた際に、オルタネイティブスプライシングに
よる分泌型ジャグドー1 を発現するｍＲＮＡが見つかっ
ている（Zimrin, A.B. et al., J. Biol. Chem., 271:
32499-502, 1996)。 さらに、先天性遺伝子疾患である
アラジュール病（Alagille syndrome)ではノッチリガン
ドのひとつ、ジャグドー1 のコーディング流域にストッ
プコドンが入り、結果的に分泌型のジャグドー1 が作ら
れ、これが病気の原因ではないかと考えられている（Ar
tavanis-Tsakonas, S., Nat Genet. 16: 212-3, 199
7）。

【００２６】これらのことから、血液などの体液中には
細胞外部分のノッチリガンドが存在することが推察さ
れ、それらを測定することによって各種疾患を検査する
ことができる。特に、本発明の抗体は未変性型の蛋白質
のみを認識することから、機能を有した遊離型ノッチリ
ガンド蛋白質の測定に必須といえる。したがって、本発
明の抗体を用いたヒト体液中のノッチリガンド濃度の測
定方法、本発明の抗体を用いたノッチリガンド濃度の測
定方法に基づく検査薬ならびに検査薬キットも本発明の
なかに含まれる。測定方法としては、あらゆる免疫学的
な測定法が利用できる。たとえば、２種の抗体を用いた
サンドイッチ型酵素免疫測定法、ひとつの抗体と抗原を
用いた競合型免疫測定法などを挙げることができる。こ
れらの、抗体を用いた測定法については、石川榮治 著
による「超高感度酵素免疫測定法」、「酵素標識法」
（共に学会出版センター）などに記載されている。もち
ろん、本発明の抗体はここに示した以外のあらゆるこれ
らの抗体を用いた物質の測定法に利用できる。

【００２７】本発明の抗体の遺伝子配列を求めることに
より、ヒト化抗体、一本鎖抗体等を作製して、医薬品も
しくは体内検査薬として使用することも可能である。す
なわち、ヒト化抗体とすることにより、抗原性を減らし
て患者に直接投与することが可能となる。ヒト化抗体と
は抗体を構成するアミノ酸配列の定常的な部分、所謂コ
ンスタントリージョンをヒト遺伝子由来のそれに代え、
抗原性を低くしたものであり、Mountainらの総説（Moun
tain, A. et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:
1-142, 1992）に作製方法、用途などが詳しく記述され
ている。また、一本鎖抗体とは抗体の軽鎖、重鎖の抗原
認識部位をひとつのポリペプチドとして発現させたミニ
抗体であり、Hustonらの総説(Huston, J. S. et al., I
nt. Rev.Immunol., 10 :195-217, 1993) 、Birdらの総
説(Bird, R. E. et al., Trends.Biotechnol., 9:132-
7, 1991)に作製方法、用途などが詳しく記述されてい
る。

【００２８】医薬品用途としては、ノッチリセプタ−の
下流分子であるレポータージーンアッセイなどのスクリ
ーニングにてノッチリガンドによりノッチリセプターの
活性化を抑制する、所謂アンタゴニスト抗体、また、ノ
ッチリガンド同様にノッチリセプターの活性を引き起こ
すアゴニスト抗体であることが望ましく、これらの作製
はノッチリセプターのシグナル伝達を測定することによ
りスクリーニングできる。たとえば、その方法としては
TP-1プロモーター、Hes-1プロモーターを用いた、レポ
ータージーンアッセイなどが挙げられる(Shimizu, K. e
t al., Mol. Cell. Biol. 20:6913-22, 2000; Minoguch
i, S. et al., Mol. Cell. Biol., 17 :2679-87, 199
7)。

【００２９】これらヒト化抗体を医薬品、体内検査薬と
して用いるには、上記に示した形態を有する本発明の抗
体を適当な安定化剤、例えばヒト血清アルブミンなどと
共に凍結乾燥品を作製し、用時注射用蒸留水にて溶解も
しくは懸濁して使用し得る形状が望ましい。例えば0.1
から1000μg/mlの濃度に調整した注射剤、点滴剤として
提供することができる。医薬品、体内検査薬として対象
となる疾患としては、分化異常にともなう疾患、たとえ
ば悪性腫瘍、遺伝病などが挙げられる。また、組織再生
異常を伴う疾患、たとえば肝炎、肝硬変などの肝臓疾
患、動脈硬化などの血管疾患、皮膚潰瘍などの皮膚疾
患、潰瘍性大腸炎などの消化器疾患にも適応可能であ
る。また、体内検査薬として用いる場合には放射性同位
元素にて標識されることが望ましく、抗体の集積場所の
検出はシンチカメラを用いたシンチグラフィーによる体
内分布の検出が一般的な使用方法として挙げられる。一
方、医薬品として使用する場合は、疾患によって投薬量
は異なるが、1 mg/kg/日から 10g/kg/日の投薬が望まし
い。

【００３０】実施例においては、ヒトジャグドー2 のみ
を例示したが、これら実施例と引用文献を参考にすれ
ば、他のノッチリガンドに対する同様な機能を有するモ
ノクローナル抗体も作製できる。したがって、本発明に
は未変性のノッチリガンド蛋白質の細胞外部分を特異的
に認識することを特徴とする抗体すべてが含まれる。特
にヒト分子であるヒトノッチリガンドとは少なくとも現
在まで哺乳類で知られている次の５種類が知られてお
り、次の特許文献に免疫原の調製法が開示されており、
この方法に基づいて作製することができる。 デルター1(Dll1) ：国際公開公報WO97/19172 デルター3(Dll3) ：日本特許公開平11-299493 デルター4(Dll4) ：国際公開番号WO98/51799 ジャグドー1(Jagged-1) ：国際公開公報WO97/19172 ジャグドー2(Jagged-2) ：国際公開番号WO98/02458

【００３１】また、本実施例ではラットに対して免疫し
ているため、ラットに対する抗体の作製は難しい。した
がって、ラットのこれら分子に対する抗体を作製する場
合には免疫を行う動物をラット以外、たとえばマウスに
行うことが望ましい。

【００３２】本抗体で精製分離された未変性型ノッチリ
ガンド蛋白質は、全てが未変性型ノッチリガンド蛋白質
であるため、中に含まれるノッチリガンド蛋白質の全て
が細胞の分化抑制作用に対して有効な成分、すなわち活
性型蛋白質から構成されると期待できる。したがって、
より高比活性なノッチリガンド蛋白質を提供することが
可能である。ノッチリガンド蛋白質は多くの幹細胞、未
分化細胞の分化を抑制することが知られており、胚性幹
細胞、造血幹細胞などのあらゆる幹細胞の体外増幅、分
化制御に利用できる。このようにして作製された細胞を
患者に移植することにより、各種組織の再生を促す再生
医療に用いることができる。例えば、白血病などの根治
療法である造血幹細胞移植、パーキンソン病の治療方法
である神経幹細胞移植などが挙げられる。

【００３３】

【発明の実施の形態】以下に発明を実施する形態につい
て参考例及び実施例として示すが、必ずしもこれらに限
定されるものではない。

【参考例】ヒトジャグドー2 細胞外部分ポリペプチドの
作製並びに、ヒトジャグドー2 全長発現ベクターで形質
転換した細胞株の作製 本参考例の詳細は国際公開公報WO98/02458に記述されて
いる。また、本参考例で使用したヒトジャグドー2 の全
アミノ酸配列をコードするcDNAを含むベクターpUCSR-2
を大腸菌JM109 に遺伝子導入した形質転換細胞は、E.
coli :JM109-pUCSR-2 として日本国つくば市東１丁目１
番３号に所在の通商産業省独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託センターに寄託されている。寄託日
は平成８年10月28日であり、受託番号はFERM BP-5727で
ある。

【００３４】配列表配列番号２のヒトジャグドー2 の全
アミノ酸配列をコードするcDNAを含むベクターpUCSR-2
を用い、配列表配列番号１のアミノ酸配列の１から1055
のポリペプチドの C末端にFLAG配列をコードするcDNAを
付加したキメラタンパク質をコードするcDNAを、発現ベ
クター pCDNA3 につなぎ、発現ベクターｐJ2exFlagを作
製した。また、配列表配列番号２のヒトジャグドー2 の
全アミノ酸配列をコードするcDNAを含むベクター pUCSR
-2を用い、配列表配列番号２のアミノ酸配列の１から12
12のポリペプチドの C末端にFLAG配列をコードするcDNA
を付加したキメラタンパク質をコードするcDNAを、発現
ベクター pCDNA3 につなぎ、発現ベクター pJ2Flagを作
製した。なお、これらベクターはネオマイシン耐性遺伝
子を同時に発現するため、G418 (インビトロジェン社）
にて遺伝子導入細胞を選択することができる。

【００３５】発現ベクター pJ2exFlagは、 CHO-K1 細胞
（大日本製薬株式会社より購入可能：ATCC:CCL-61)に、
発現ベクター pJ2FlagはBALB3T3 細胞（理化学研究所細
胞開発銀行より分与可能。登録番号は RCB0005。もしく
はATCC:CCL-163) に各々エレクトロポレーション法にて
遺伝子導入し、G418存在下で培養し、限外希釈法にてク
ローニングをおこなった。これら細胞における、目的の
蛋白質発現確認を抗 Flag マウスモノクローナル抗体M2
(シグマ・アルドリッチ社製）にてウエスタンブロット
法にて行い、発現細胞を各々樹立した。したがって、発
現ベクターpJ2exFlag を遺伝子導入したCHO-K1細胞は細
胞外ヒトジャグドー2 Flag蛋白質発現CHO-K1細胞（以
下、J2ex/CHO細胞という）、発現ベクターpJ2Flag を遺
伝子導入したBALB3T3 細胞は全長ヒトジャグドー2Flag
蛋白発現BALB3T3 細胞（以下、J2/BALB 細胞という）で
ある。また、同時にpCDNA3ベクターのみ導入したBALB3T
3 細胞も同様に作製し、コントロール細胞（以下、Neo/
BALB細胞という）として以下の実施例で使用した。

【００３６】この様に作製されたJ2ex/CHO細胞の培養上
清から、抗 Flag 抗体M2結合セファロースビーズ（シグ
マ・アルドリッチ社製）にて作製したアフィニティーカ
ラムを用いて、最終精製細胞外ヒトジャグドー2 Flag蛋
白質を得た。また、得られた精製物が目的の分泌型ヒト
ジャグドー2 Flag蛋白質であることを、SDS-PAGE法、ウ
エスタンブロット法、Ｎ末端アミノ酸配列同定法にて確
認を行った。

【００３７】

【実施例１】抗原の免疫並びにハイブリドーマの作製 参考例のごとく作製した細胞外ヒトジャグドー2 Flag蛋
白質をPBS(-)に溶液置換を行い、蛋白質濃度が1mg/mlと
なるように調整した。免疫を行うラットはWKY/NCrjを用
いた。免疫原蛋白質とフロイント完全アジュバント(FC
A) をよく混ぜ合わせて完全なエマルジョンを形成させ
た後、ラットの後肢に１００μｌ注射を行った。

【００３８】その７〜10日間後、免疫を行ったラット後
肢側の膝窩リンパ節、鼠蹊リンパ節もしくは腸管リンパ
節を無菌的に取り出し、はさみ等で切り刻み、ステンレ
スメッシュで裏ごしした後、遠心分離操作を経て、最終
的にリンパ節由来リンパ球を分離した。この様に分離さ
れた細胞とミエローマ細胞マウスSP2 細胞（大日本製薬
より入手可能）を混合し、次の細胞融合ステップに用い
た。

【００３９】リンパ球、ミエローマ細胞混合液にD-MEM
培地（インビトロジェン社）を加え、遠心分離(1200rp
m、10分間）し、上清を吸引して細胞ペレットにし、タ
ッピングにて細胞をほぐした後、37℃に加温した50％ポ
リエチレングリコール溶液(5％DMSOを含むD-MEM 培地に
溶解したもの）を１分間かけてゆっくりと細胞に1ml 滴
下する。その後、２分間ゆっくりと振って混ぜ合わせた
後、37℃に加温した D-MEM培地を4.5ml を３分間かけて
ゆっくりと滴下し混ぜ合わせる。さらに4.5ml のD-MEM
培地を 2分間かけて加える。これを遠心分離（900rpm、
5 分間）して上清を除去する。この細胞ペレットに HAT
培地（10％牛胎児血清添加 GIT培地：和光純薬製にヒポ
キサンチン 100μM 、アミノプテリン 0.4μM 、チミジ
ン16μM 添加して作製）を36ml添加し、緩やかに懸濁さ
せる。最後にBM-CondimedH1(ロシュ・ダイアグノスティ
ック社）を4ml 加え、この液を96穴プレート４枚に各ウ
エル100μl づつ分注する。これをCO２ インキュベー
ターにて培養を行う。６日後、培地を新しい10％ BM-Co
ndimedH1を含む HAT培地に交換し、更に２日間培養を行
う。この様に96穴プレートに培養したハイブリドーマの
中から抗原を認識する抗体を産生している細胞を次の方
法で選択した。

【００４０】

【実施例２】ハイブリドーマのフローサイトメーターに
よる一次スクリーニング 実施例１にて作製した各ハイブリドーマの細胞上清を用
いて、参考例で作製したJ2/BALB 細胞への反応性を調べ
た。すなわち、前もって培養しておいたJ2/BALB 細胞を
セルスクレーパーではがし、ピペッティングにて細胞を
ばらばらにして、10⁵個づつ試験管に分けて入れてお
く。その細胞を、培地にて遠心分離して洗浄後、細胞ペ
レットとしたものに上記のハイブリドーマ培養上清を加
え、細胞をほぐして氷中で１時間置く。その後、5 ％牛
胎児血清を含むPBS(-)を用いて遠心分離して洗浄し、細
胞ペレットとしたものに、山羊抗ラットIgG 抗体フィコ
エリスリン(PE)標識抗体（サザンバイオテック社）を加
えて、30分間氷中で放置後、同様に洗浄し、フローサイ
トメーターによって抗体の結合の解析を行った。フロー
サイトメーターは FACS Caliber(BD社）を用いて測定し
た。このようにしてJ2/BALB 細胞に反応する抗体を産生
しているハイブリドーマを選び出した。

【００４１】

【実施例３】ハイブリドーマの免疫沈降法と変性条件下
ドットブロット法による二次スクリーニング 実施例２で選択されたハイブリドーマの培養上清を用い
て次の実験を行い、二次スクリーニングを行った。 1) 免疫沈降法による選択 ハイブリドーマ細胞培養上清を用いた免疫沈降法にて、
未変性のヒトノッチリガンド蛋白質の細胞外部分を認識
する抗体を産生しているハイブリドーマを以下のように
して選択した。10cm培養ディシュにて培養を行ったヒト
ジャグドー2 を高発現するJ2/BALB 細胞及びコントロー
ル細胞 Neo/BALB 細胞をPBS(-)10mlで洗浄し、セルスク
レイパー（コースター社製）にて細胞を剥がし、再度PB
S(-)を10ml加えて、1500rpm で５分間遠心分離し洗浄し
た。

【００４２】この細胞沈殿物をセルリシスバッファー
［50mM Hepes (pH7.5)、1 ％ Triton×100 、10％ グ
リセロール、4mM EDTA、50μg/ml Aprotinin、100 μM
Leupeptin 、25μM PepstatinA、1mM PMSF] 500μl に
懸濁し、氷中に20分間放置し、その後、15000rpmで20分
間遠心して上清を取り細胞抽出液を得た。

【００４３】こうして得られた細胞抽出液に対して、各
種ハイブリドーマ培養上清を加え、同時にProteinGセフ
ァロースゲル（アマシャムファルマシア社）を添加し
て、ゆっくりと撹拌して一晩 4℃にて反応させる。反応
後、このセファロースゲルを遠心分離にて洗浄し、その
沈殿物を用いて次の抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロ
ットにて、ヒトジャグドー2 蛋白質の検出を行った。

【００４４】SDS-PAGE用電気泳動槽及びSDS-PAGE用ポリ
アクリルアミドゲル (いずれも第一化学薬品社製)(グラ
ジエントゲル５〜15％）を用い、添付の取扱い説明書に
従ってSDS-PAGEをおこなった。サンプルは上記沈殿物に
対して2-MEを加えて５分間の沸騰水浴加熱処理により還
元処理を行った。サンプルバッファー、泳動バッファー
については添付の取扱い説明書に従って作製した。SDS-
PAGE終了後、アクリルアミドゲルをPVDFメンブランフィ
ルター (BioRad社製）にBioRad社製ミニトランスブロッ
トセルにより転写した。

【００４５】このように作製されたフィルターを４％ス
キムミルクを含むTBS-T [20mM Tris、137mM NaCl(pH7.
6)、0.1 ％ Tween20] に 4℃で一晩振盪してブロッキン
グした。ECL ウェスタンブロッティング検出システム
（アマシャムファルマシア社製）に添付の説明書に従
い、一次抗体としてマウスモノクローナル抗体 Anti-FL
AG M2(シグマ社製）、二次抗体としてペルオキシダーゼ
標識抗マウスIg羊抗体（マシャムファルマシア社製）を
反応させた。抗体の反応時間は各々室温で一時間反応さ
せ、各反応間はTBS-T にて10分間室温で振盪洗浄する操
作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィルターを
ECL ウエスタンブロッティング検出システムの反応液に
１分間浸し、ポリ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フ
ィルムに感光させた。

【００４６】その結果、もしはじめに反応させたハイブ
リドーマ培養上清中に未変性のヒトジャグドー2 蛋白質
の細胞外部分を認識する抗体が存在するならば、およそ
150Kダルトンのバンドが検出される。この様にして、免
疫沈降法によるハイブリドーマの選択をおこなった。

【００４７】2) 変性条件下ドットブロットによる選択 免疫原に用いた細胞外ヒトジャグドー2 Flag蛋白質を還
元処理して変性させ、それをハイブリドーマ培養上清中
の抗体が認識できないことを指標に以下のようにハイブ
リドーマの選択を行った。上記1)のSDS-PAGEバッファー
の2-MEを加えて５分間の沸騰水浴加熱処理により還元処
理を行った変性細胞外ヒトジャグドー2 Flag蛋白質とこ
の処理を行わなかった未変性細胞外ヒトジャグドー2 Fl
ag蛋白質を各々100ng/μl となるように調整し、ニトロ
セルロースメンブランフィルター（アマシャムファルマ
シア社製）に 1μl 滴下して、変性及び未変性蛋白質が
固定化されたフィルターを作製した。

【００４８】このように作製されたフィルターを 4％ス
キムミルクを含む TBS-Tに 4℃一晩振盪してブロッキン
グした。ECL ウェスタンブロッティング検出システムに
添付の説明書に従い、一次抗体としてハイブリドーマの
培養上清、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラッ
トIg羊抗体（ダコ社製）を反応させた。抗体の反応時間
は各々室温で一時間反応させ、各反応間はTBS-T にて10
分間室温で振盪洗浄する操作を３回ずつ繰り返した。最
後の洗浄後、フィルターをECL ウエスタンブロッティン
グ検出システムの反応液に１分間浸し、ポリ塩化ビニリ
デンラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。

【００４９】その結果、未変性蛋白を認識し、変性蛋白
質を認識しないハイブリドーマ培養上清を産生している
ハイブリドーマを選択した。この結果により、最終的に
目的のTS-11 ハイブリドーマが選択された。さらのこの
培養上清から定法に従ってモノクローナル抗体、すなわ
ちTS-11 抗体を精製した。

【００５０】

【実施例４】TS-11 抗体を用いたアフィニティーカラム
による未変性ヒトジャグドー2 細胞外蛋白質の精製 実施例３において最終的に樹立された抗未変性ヒトジャ
グドー2 細胞外蛋白質を特異的に認識するラットモノク
ローナル抗体TS-11を固定化したセファロースゲルを用
いたカラムにて未変性ヒトジャグドー2 蛋白質の精製を
行った。

【００５１】アフィニティーゲルの作製はアマシャムフ
ァルマシア社製 CNBr 活性化 Sepharose4Bにて添付の取
扱い説明書にしたがって行った。このゲルの 2mlを2cm
２×1cm のサイズのカラムを作製した。カラムは内径10
mmのディスポカラム（バイオラッド社製）を用い、上記
ゲルを 5ml充填した。

【００５２】このカラムに対して、参考例で作製したJ2
ex/CHO細胞の培養上清を流して吸着させた。吸着は培地
ボトル→カラム→ペリスターポンプ→培地ボトルの環流
式回路を組み立て、流速1ml/分で72時間循環させた。そ
の後、カラムをPBS(-)35mlで洗浄し、0.5M Tris-グリシ
ン(pH3.0) 50mlで溶出した。あらかじめ小チューブ（フ
ァルコン社製2063) に0.5M Tris-HCl(pH9.5)を 200μl
分注しておき、溶出液は 2mlずつ25画分をそのチューブ
に分取し、各々の画分を中和した。

【００５３】この様にして溶出した画分の各10μl は実
施例３に記載の還元処理を行い、5-15％濃度勾配ポリア
クリルアミドゲルによるSDS-PAGE電気泳動を行い、電気
泳動終了後、ワコー銀染キットII (和光純薬社製) を用
いて、添付の説明書に従って銀染色を行った。結果とし
て、目的の蛋白質であるヒトジャグドー2 細胞外蛋白質
が検出され、このTS-11 抗体を固定化したゲルが期待通
り精製に用いることを確認した。

【００５４】さらに、変性ヒトジャグドー2 細胞外蛋白
質が吸着しないことを確認するため、細胞培養上清中に
2-MEを添加して、変性をおこない同様に上記のカラムに
通して精製プロセスを行ったが、溶出画分には一切ヒト
ジャグドー2 細胞外蛋白質は検出されなかった。したが
って、このカラムには変性ヒトジャグドー2 細胞外蛋白
質は吸着しない。

【００５５】これらの検討から、本発明のTS-11 抗体は
未変性ヒトジャグドー2 細胞外蛋白質を特異的に精製で
きることがわかる。

【００５６】

【発明の効果】本発明の抗体は未変性のノッチリガンド
蛋白質の細胞外部分を特異的に認識することを特徴とす
る抗体であり、この抗体は、未変性のノッチリガンド蛋
白質の精製に用いることができる。また未変性のノッチ
リガンド蛋白質を測定することによって細胞の分化異常
に伴う疾患を検査することができる。

【００５７】

【配列表】 <110>Asahi Kasei Corporation <120>新規な抗体及びその用途 <130>Ｘ１３−６７１ <150> <151> <160>3 <210>1 <211>1055 <212>PRT <213>homo sapiens <400>1 Met Gly Tyr Phe Glu Leu Gln Leu Ser Ala Leu Arg Asn Val Asn Gly 1 5 10 15 Glu Leu Leu Ser Gly Ala Cys Cys Asp Gly Asp Gly Arg Thr Thr Arg 20 25 30 Ala Gly Gly Cys Gly His Asp Glu Cys Asp Thr Tyr Val Arg Val Cys 35 40 45 Leu Lys Glu Tyr Gln Ala Lys Val Thr Pro Thr Gly Pro Cys Ser Tyr 50 55 60 Gly His Gly Ala Thr Pro Val Leu Gly Gly Asn Ser Phe Tyr Leu Pro 65 70 75 80 Pro Ala Gly Ala Ala Gly Asp Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg Ala Gly 85 90 95 Gly Asp Gln Asp Pro Gly Leu Val Val Ile Pro Phe Gln Phe Ala Trp 100 105 110 Pro Arg Ser Phe Thr Leu Ile Val Glu Ala Trp Asp Trp Asp Asn Asp 115 120 125 Thr Thr Pro Asn Glu Glu Leu Leu Ile Glu Arg Val Ser His Ala Gly 130 135 140 Met Ile Asn Pro Glu Asp Arg Trp Lys Ser Leu His Phe Ser Gly His 145 150 155 160 Val Ala His Leu Glu Leu Gln Ile Arg Val Arg Cys Asp Glu Asn Tyr 165 170 175 Tyr Ser Ala Thr Cys Asn Lys Phe Cys Arg Pro Arg Asn Asp Phe Phe 180 185 190 Gly His Tyr Thr Cys Asp Gln Tyr Gly Asn Lys Ala Cys Met Asp Gly 195 200 205 Trp Met Gly Lys Glu Cys Lys Glu Ala Val Cys Lys Gln Gly Cys Asn 210 215 220 Leu Leu His Gly Gly Cys Thr Val Pro Gly Glu Cys Arg Cys Ser Tyr 225 230 235 240 Gly Trp Gln Gly Arg Phe Cys Asp Glu Cys Val Pro Tyr Pro Gly Cys 245 250 255 Val His Gly Ser Cys Val Glu Pro Trp Gln Cys Asn Cys Glu Thr Asn 260 265 270 Trp Gly Gly Leu Leu Cys Asp Lys Asp Leu Asn Tyr Cys Gly Ser His 275 280 285 His Pro Cys Thr Asn Gly Gly Thr Cys Ile Asn Ala Glu Pro Asp Gln 290 295 300 Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Gly Arg Asn Cys Glu Lys 305 310 315 320 Ala Glu His Ala Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys 325 330 335 His Glu Val Pro Ser Gly Phe Glu Cys His Cys Pro Ser Gly Trp Ser 340 345 350 Gly Pro Thr Cys Ala Leu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys 355 360 365 Ala Ala Gly Gly Thr Cys Val Asp Gln Val Asp Gly Phe Glu Cys Ile 370 375 380 Cys Pro Glu Gln Trp Val Gly Ala Thr Cys Gln Leu Asp Ala Asn Glu 385 390 395 400 Cys Glu Gly Lys Pro Cys Leu Asn Ala Phe Ser Cys Lys Asn Leu Ile 405 410 415 Gly Gly Tyr Tyr Cys Asp Cys Ile Pro Gly Trp Lys Gly Ile Asn Cys 420 425 430 His Ile Asn Val Asn Asp Cys Arg Gly Gln Cys Gln His Gly Gly Thr 435 440 445 Cys Lys Asp Leu Val Asn Gly Tyr Gln Cys Val Cys Pro Arg Gly Phe 450 455 460 Gly Gly Arg His Cys Glu Leu Glu Arg Asp Lys Cys Ala Ser Ser Pro 465 470 475 480 Cys His Ser Gly Gly Leu Cys Glu Asp Leu Ala Asp Gly Phe His Cys 485 490 495 His Cys Pro Gln Gly Phe Ser Gly Pro Leu Cys Glu Val Asp Val Asp 500 505 510 Leu Cys Glu Pro Ser Pro Cys Arg Asn Gly Ala Arg Cys Tyr Asn Leu 515 520 525 Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Cys Pro Asp Asp Phe Gly Gly Lys Asn 530 535 540 Cys Ser Val Pro Arg Glu Pro Cys Pro Gly Gly Ala Cys Arg Val Ile 545 550 555 560 Asp Gly Cys Gly Ser Asp Ala Gly Pro Gly Met Pro Gly Thr Ala Ala 565 570 575 Ser Gly Val Cys Gly Pro His Gly Arg Cys Val Ser Gln Pro Gly Gly 580 585 590 Asn Phe Ser Cys Ile Cys Asp Ser Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Cys His 595 600 605 Glu Asn Ile Asp Asp Cys Leu Gly Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Thr 610 615 620 Cys Ile Asp Glu Val Asp Ala Phe Arg Cys Phe Cys Pro Ser Gly Trp 625 630 635 640 Glu Gly Glu Leu Cys Asp Thr Asn Pro Asn Asp Cys Leu Pro Asp Pro 645 650 655 Cys His Ser Arg Gly Arg Cys Tyr Asp Leu Val Asn Asp Phe Tyr Cys 660 665 670 Ala Cys Asp Asp Gly Trp Lys Gly Lys Thr Cys His Ser Arg Glu Phe 675 680 685 Gln Cys Asp Ala Tyr Thr Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Tyr Asp Ser 690 695 700 Gly Asp Thr Phe Arg Cys Ala Cys Pro Pro Gly Trp Lys Gly Ser Thr 705 710 715 720 Cys Ala Val Ala Lys Asn Ser Ser Cys Leu Pro Asn Pro Cys Val Asn 725 730 735 Gly Gly Thr Cys Val Gly Ser Gly Ala Ser Phe Ser Cys Ile Cys Arg 740 745 750 Asp Gly Trp Glu Gly Arg Thr Cys Thr His Asn Thr Asn Asp Cys Asn 755 760 765 Pro Leu Pro Cys Tyr Asn Gly Gly Ile Cys Val Asp Gly Val Asn Trp 770 775 780 Phe Arg Cys Glu Cys Ala Pro Gly Phe Ala Gly Pro Asp Cys Arg Ile 785 790 795 800 Asn Ile Asp Glu Cys Gln Ser Ser Pro Cys Ala Tyr Gly Ala Thr Cys 805 810 815 Val Asp Glu Ile Asn Gly Tyr Arg Cys Ser Cys Pro Pro Gly Arg Ala 820 825 830 Gly Pro Arg Cys Gln Glu Val Ile Gly Phe Gly Arg Ser Cys Trp Ser 835 840 845 Arg Gly Thr Pro Phe Pro His Gly Ser Ser Trp Val Glu Asp Cys Asn 850 855 860 Ser Cys Arg Cys Leu Asp Gly Arg Arg Asp Cys Ser Lys Val Trp Cys 865 870 875 880 Gly Trp Lys Pro Cys Leu Leu Ala Gly Gln Pro Glu Ala Leu Ser Ala 885 890 895 Gln Cys Pro Leu Gly Gln Arg Cys Leu Glu Lys Ala Pro Gly Gln Cys 900 905 910 Leu Arg Pro Pro Cys Glu Ala Trp Gly Glu Cys Gly Ala Glu Glu Pro 915 920 925 Pro Ser Thr Pro Cys Leu Pro Arg Ser Gly His Leu Asp Asn Asn Cys 930 935 940 Ala Arg Leu Thr Leu His Phe Asn Arg Asp His Val Pro Gln Gly Thr 945 950 955 960 Thr Val Gly Ala Ile Cys Ser Gly Ile Arg Ser Leu Pro Ala Thr Arg 965 970 975 Ala Val Ala Arg Asp Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Asp Arg Ala Ser 980 985 990 Ser Gly Ala Ser Ala Val Glu Val Ala Val Ser Phe Ser Pro Ala Arg 995 1000 1005 Asp Leu Pro Asp Ser Ser Leu Ile Gln Gly Ala Ala His Ala Ile Val 1010 1015 1020 Ala Ala Ile Thr Gln Arg Gly Asn Ser Ser Leu Leu Leu Ala Val Thr 1025 1030 1035 1040 Glu Val Lys Val Glu Thr Val Val Thr Gly Gly Ser Ser Thr Gly 1045 1050 1055 <210>2 <211>1215 <212>PRT <213>homo sapiens <400>2 Met Gly Tyr Phe Glu Leu Gln Leu Ser Ala Leu Arg Asn Val Asn Gly 1 5 10 15 Glu Leu Leu Ser Gly Ala Cys Cys Asp Gly Asp Gly Arg Thr Thr Arg 20 25 30 Ala Gly Gly Cys Gly His Asp Glu Cys Asp Thr Tyr Val Arg Val Cys 35 40 45 Leu Lys Glu Tyr Gln Ala Lys Val Thr Pro Thr Gly Pro Cys Ser Tyr 50 55 60 Gly His Gly Ala Thr Pro Val Leu Gly Gly Asn Ser Phe Tyr Leu Pro 65 70 75 80 Pro Ala Gly Ala Ala Gly Asp Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg Ala Gly 85 90 95 Gly Asp Gln Asp Pro Gly Leu Val Val Ile Pro Phe Gln Phe Ala Trp 100 105 110 Pro Arg Ser Phe Thr Leu Ile Val Glu Ala Trp Asp Trp Asp Asn Asp 115 120 125 Thr Thr Pro Asn Glu Glu Leu Leu Ile Glu Arg Val Ser His Ala Gly 130 135 140 Met Ile Asn Pro Glu Asp Arg Trp Lys Ser Leu His Phe Ser Gly His 145 150 155 160 Val Ala His Leu Glu Leu Gln Ile Arg Val Arg Cys Asp Glu Asn Tyr 165 170 175 Tyr Ser Ala Thr Cys Asn Lys Phe Cys Arg Pro Arg Asn Asp Phe Phe 180 185 190 Gly His Tyr Thr Cys Asp Gln Tyr Gly Asn Lys Ala Cys Met Asp Gly 195 200 205 Trp Met Gly Lys Glu Cys Lys Glu Ala Val Cys Lys Gln Gly Cys Asn 210 215 220 Leu Leu His Gly Gly Cys Thr Val Pro Gly Glu Cys Arg Cys Ser Tyr 225 230 235 240 Gly Trp Gln Gly Arg Phe Cys Asp Glu Cys Val Pro Tyr Pro Gly Cys 245 250 255 Val His Gly Ser Cys Val Glu Pro Trp Gln Cys Asn Cys Glu Thr Asn 260 265 270 Trp Gly Gly Leu Leu Cys Asp Lys Asp Leu Asn Tyr Cys Gly Ser His 275 280 285 His Pro Cys Thr Asn Gly Gly Thr Cys Ile Asn Ala Glu Pro Asp Gln 290 295 300 Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Gly Arg Asn Cys Glu Lys 305 310 315 320 Ala Glu His Ala Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys 325 330 335 His Glu Val Pro Ser Gly Phe Glu Cys His Cys Pro Ser Gly Trp Ser 340 345 350 Gly Pro Thr Cys Ala Leu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys 355 360 365 Ala Ala Gly Gly Thr Cys Val Asp Gln Val Asp Gly Phe Glu Cys Ile 370 375 380 Cys Pro Glu Gln Trp Val Gly Ala Thr Cys Gln Leu Asp Ala Asn Glu 385 390 395 400 Cys Glu Gly Lys Pro Cys Leu Asn Ala Phe Ser Cys Lys Asn Leu Ile 405 410 415 Gly Gly Tyr Tyr Cys Asp Cys Ile Pro Gly Trp Lys Gly Ile Asn Cys 420 425 430 His Ile Asn Val Asn Asp Cys Arg Gly Gln Cys Gln His Gly Gly Thr 435 440 445 Cys Lys Asp Leu Val Asn Gly Tyr Gln Cys Val Cys Pro Arg Gly Phe 450 455 460 Gly Gly Arg His Cys Glu Leu Glu Arg Asp Lys Cys Ala Ser Ser Pro 465 470 475 480 Cys His Ser Gly Gly Leu Cys Glu Asp Leu Ala Asp Gly Phe His Cys 485 490 495 His Cys Pro Gln Gly Phe Ser Gly Pro Leu Cys Glu Val Asp Val Asp 500 505 510 Leu Cys Glu Pro Ser Pro Cys Arg Asn Gly Ala Arg Cys Tyr Asn Leu 515 520 525 Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Cys Pro Asp Asp Phe Gly Gly Lys Asn 530 535 540 Cys Ser Val Pro Arg Glu Pro Cys Pro Gly Gly Ala Cys Arg Val Ile 545 550 555 560 Asp Gly Cys Gly Ser Asp Ala Gly Pro Gly Met Pro Gly Thr Ala Ala 565 570 575 Ser Gly Val Cys Gly Pro His Gly Arg Cys Val Ser Gln Pro Gly Gly 580 585 590 Asn Phe Ser Cys Ile Cys Asp Ser Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Cys His 595 600 605 Glu Asn Ile Asp Asp Cys Leu Gly Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Thr 610 615 620 Cys Ile Asp Glu Val Asp Ala Phe Arg Cys Phe Cys Pro Ser Gly Trp 625 630 635 640 Glu Gly Glu Leu Cys Asp Thr Asn Pro Asn Asp Cys Leu Pro Asp Pro 645 650 655 Cys His Ser Arg Gly Arg Cys Tyr Asp Leu Val Asn Asp Phe Tyr Cys 660 665 670 Ala Cys Asp Asp Gly Trp Lys Gly Lys Thr Cys His Ser Arg Glu Phe 675 680 685 Gln Cys Asp Ala Tyr Thr Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Tyr Asp Ser 690 695 700 Gly Asp Thr Phe Arg Cys Ala Cys Pro Pro Gly Trp Lys Gly Ser Thr 705 710 715 720 Cys Ala Val Ala Lys Asn Ser Ser Cys Leu Pro Asn Pro Cys Val Asn 725 730 735 Gly Gly Thr Cys Val Gly Ser Gly Ala Ser Phe Ser Cys Ile Cys Arg 740 745 750 Asp Gly Trp Glu Gly Arg Thr Cys Thr His Asn Thr Asn Asp Cys Asn 755 760 765 Pro Leu Pro Cys Tyr Asn Gly Gly Ile Cys Val Asp Gly Val Asn Trp 770 775 780 Phe Arg Cys Glu Cys Ala Pro Gly Phe Ala Gly Pro Asp Cys Arg Ile 785 790 795 800 Asn Ile Asp Glu Cys Gln Ser Ser Pro Cys Ala Tyr Gly Ala Thr Cys 805 810 815 Val Asp Glu Ile Asn Gly Tyr Arg Cys Ser Cys Pro Pro Gly Arg Ala 820 825 830 Gly Pro Arg Cys Gln Glu Val Ile Gly Phe Gly Arg Ser Cys Trp Ser 835 840 845 Arg Gly Thr Pro Phe Pro His Gly Ser Ser Trp Val Glu Asp Cys Asn 850 855 860 Ser Cys Arg Cys Leu Asp Gly Arg Arg Asp Cys Ser Lys Val Trp Cys 865 870 875 880 Gly Trp Lys Pro Cys Leu Leu Ala Gly Gln Pro Glu Ala Leu Ser Ala 885 890 895 Gln Cys Pro Leu Gly Gln Arg Cys Leu Glu Lys Ala Pro Gly Gln Cys 900 905 910 Leu Arg Pro Pro Cys Glu Ala Trp Gly Glu Cys Gly Ala Glu Glu Pro 915 920 925 Pro Ser Thr Pro Cys Leu Pro Arg Ser Gly His Leu Asp Asn Asn Cys 930 935 940 Ala Arg Leu Thr Leu His Phe Asn Arg Asp His Val Pro Gln Gly Thr 945 950 955 960 Thr Val Gly Ala Ile Cys Ser Gly Ile Arg Ser Leu Pro Ala Thr Arg 965 970 975 Ala Val Ala Arg Asp Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Asp Arg Ala Ser 980 985 990 Ser Gly Ala Ser Ala Val Glu Val Ala Val Ser Phe Ser Pro Ala Arg 995 1000 1005 Asp Leu Pro Asp Ser Ser Leu Ile Gln Gly Ala Ala His Ala Ile Val 1010 1015 1020 Ala Ala Ile Thr Gln Arg Gly Asn Ser Ser Leu Leu Leu Ala Val Thr 1025 1030 1035 1040 Glu Val Lys Val Glu Thr Val Val Thr Gly Gly Ser Ser Thr Gly Leu 1045 1050 1055 Leu Val Pro Val Leu Cys Gly Ala Phe Ser Val Leu Trp Leu Ala Cys 1060 1065 1070 Val Val Leu Cys Val Trp Trp Thr Arg Lys Arg Arg Lys Glu Arg Glu 1075 1080 1085 Arg Ser Arg Leu Pro Arg Glu Glu Ser Ala Asn Asn Gln Trp Ala Pro 1090 1095 1100 Leu Asn Pro Ile Arg Asn Pro Ile Glu Arg Pro Gly Gly His Lys Asp 1105 1110 1115 1120 Val Leu Tyr Gln Cys Lys Asn Phe Thr Pro Pro Pro Arg Arg Ala Asp 1125 1130 1135 Glu Ala Leu Pro Gly Pro Ala Gly His Ala Ala Val Arg Glu Asp Glu 1140 1145 1150 Glu Asp Glu Asp Leu Gly Arg Gly Glu Glu Asp Ser Leu Glu Ala Glu 1155 1160 1165 Lys Phe Leu Ser His Lys Phe Thr Lys Asp Pro Gly Arg Ser Pro Gly 1170 1175 1180 Arg Pro Ala His Trp Ala Ser Gly Pro Lys Val Asp Asn Arg Ala Val 1185 1190 1195 1200 Arg Ser Ile Asn Glu Ala Arg Tyr Ala Gly Lys Glu 1205 1210 1212 <210>3 <211>3955 <212>DNA <213>homo sapiens <400>3 t cgcgggggca atg cgg gcg cag ggc cgg ggg cgc ctt ccc 41 Met Arg Ala Gln Gly Arg Gly Arg Leu Pro -26 -25 -20 cgg cgg ctg ctg ctg ctg ctg gcg ctc tgg gtg cag gcg gcg cgg ccc 89 Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Trp Val Gln Ala Ala Arg Pro -15 -10 -5 -1 atg ggc tat ttc gag ctg cag ctg agc gcg ctg cgg aac gtg aac ggg 137 Met Gly Tyr Phe Glu Leu Gln Leu Ser Ala Leu Arg Asn Val Asn Gly 1 5 10 15 gag ctg ctg agc ggc gcc tgc tgt gac ggc gac ggc cgg aca acg cgc 185 Glu Leu Leu Ser Gly Ala Cys Cys Asp Gly Asp Gly Arg Thr Thr Arg 20 25 30 gcg ggg ggc tgc ggc cac gac gag tgc gac acg tac gtg cgc gtg tgc 233 Ala Gly Gly Cys Gly His Asp Glu Cys Asp Thr Tyr Val Arg Val Cys 35 40 45 ctt aag gag tac cag gcc aag gtg acg ccc acg ggg ccc tgc agc tac 281 Leu Lys Glu Tyr Gln Ala Lys Val Thr Pro Thr Gly Pro Cys Ser Tyr 50 55 60 ggc cac ggc gcc acg ccc gtg ctg ggc ggc aac tcc ttc tac ctg ccg 329 Gly His Gly Ala Thr Pro Val Leu Gly Gly Asn Ser Phe Tyr Leu Pro 65 70 75 80 ccg gcg ggc gct gcg ggg gac cga gcg cgg gcg cgg gcc cgg gcc ggc 377 Pro Ala Gly Ala Ala Gly Asp Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg Ala Gly 85 90 95 ggc gac cag gac ccg ggc ctc gtc gtc atc ccc ttc cag ttc gcc tgg 425 Gly Asp Gln Asp Pro Gly Leu Val Val Ile Pro Phe Gln Phe Ala Trp 100 105 110 ccg cgc tcc ttt acc ctc atc gtg gag gcc tgg gac tgg gac aac gat 473 Pro Arg Ser Phe Thr Leu Ile Val Glu Ala Trp Asp Trp Asp Asn Asp 115 120 125 acc acc ccg aat gag gag ctg ctg atc gag cga gtg tcg cat gcc ggc 521 Thr Thr Pro Asn Glu Glu Leu Leu Ile Glu Arg Val Ser His Ala Gly 130 135 140 atg atc aac ccg gag gac cgc tgg aag agc ctg cac ttc agc ggc cac 569 Met Ile Asn Pro Glu Asp Arg Trp Lys Ser Leu His Phe Ser Gly His 145 150 155 160 gtg gcg cac ctg gag ctg cag atc cgc gtg cgc tgc gac gag aac tac 617 Val Ala His Leu Glu Leu Gln Ile Arg Val Arg Cys Asp Glu Asn Tyr 165 170 175 tac agc gcc act tgc aac aag ttc tgc cgg ccc cgc aac gac ttt ttc 665 Tyr Ser Ala Thr Cys Asn Lys Phe Cys Arg Pro Arg Asn Asp Phe Phe 180 185 190 ggc cac tac acc tgc gac cag tac ggc aac aag gcc tgc atg gac ggc 713 Gly His Tyr Thr Cys Asp Gln Tyr Gly Asn Lys Ala Cys Met Asp Gly 195 200 205 tgg atg ggc aag gag tgc aag gaa gct gtg tgt aaa caa ggg tgt aat 761 Trp Met Gly Lys Glu Cys Lys Glu Ala Val Cys Lys Gln Gly Cys Asn 210 215 220 ttg ctc cac ggg gga tgc acc gtg cct ggg gag tgc agg tgc agc tac 809 Leu Leu His Gly Gly Cys Thr Val Pro Gly Glu Cys Arg Cys Ser Tyr 225 230 235 240 ggc tgg caa ggg agg ttc tgc gat gag tgt gtc ccc tac ccc ggc tgc 857 Gly Trp Gln Gly Arg Phe Cys Asp Glu Cys Val Pro Tyr Pro Gly Cys 245 250 255 gtg cat ggc agt tgt gtg gag ccc tgg cag tgc aac tgt gag acc aac 905 Val His Gly Ser Cys Val Glu Pro Trp Gln Cys Asn Cys Glu Thr Asn 260 265 270 tgg ggc ggc ctg ctc tgt gac aaa gac ctg aac tac tgt ggc agc cac 953 Trp Gly Gly Leu Leu Cys Asp Lys Asp Leu Asn Tyr Cys Gly Ser His 275 280 285 cac ccc tgc acc aac gga ggc acg tgc atc aac gcc gag cct gac cag 1001 His Pro Cys Thr Asn Gly Gly Thr Cys Ile Asn Ala Glu Pro Asp Gln 290 295 300 tac cgc tgc acc tgc cct gac ggc tac tcg ggc agg aac tgt gag aag 1049 Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Gly Arg Asn Cys Glu Lys 305 310 315 320 gct gag cac gcc tgc acc tcc aac ccg tgt gcc aac ggg ggc tct tgc 1097 Ala Glu His Ala Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys 325 330 335 cat gag gtg ccg tcc ggc ttc gaa tgc cac tgc cca tcg ggc tgg agc 1145 His Glu Val Pro Ser Gly Phe Glu Cys His Cys Pro Ser Gly Trp Ser 340 345 350 ggg ccc acc tgt gcc ctt gac atc gat gag tgt gct tcg aac ccg tgt 1193 Gly Pro Thr Cys Ala Leu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys 355 360 365 gcg gcc ggt ggc acc tgt gtg gac cag gtg gac ggc ttt gag tgc atc 1241 Ala Ala Gly Gly Thr Cys Val Asp Gln Val Asp Gly Phe Glu Cys Ile 370 375 380 tgc ccc gag cag tgg gtg ggg gcc acc tgc cag ctg gac gcc aat gag 1289 Cys Pro Glu Gln Trp Val Gly Ala Thr Cys Gln Leu Asp Ala Asn Glu 385 390 395 400 tgt gaa ggg aag cca tgc ctt aac gct ttt tct tgc aaa aac ctg att 1337 Cys Glu Gly Lys Pro Cys Leu Asn Ala Phe Ser Cys Lys Asn Leu Ile 405 410 415 ggc ggc tat tac tgt gat tgc atc ccg ggc tgg aag ggc atc aac tgc 1385 Gly Gly Tyr Tyr Cys Asp Cys Ile Pro Gly Trp Lys Gly Ile Asn Cys 420 425 430 cat atc aac gtc aac gac tgt cgc ggg cag tgt cag cat ggg ggc acc 1433 His Ile Asn Val Asn Asp Cys Arg Gly Gln Cys Gln His Gly Gly Thr 435 440 445 tgc aag gac ctg gtg aac ggg tac cag tgt gtg tgc cca cgg ggc ttc 1481 Cys Lys Asp Leu Val Asn Gly Tyr Gln Cys Val Cys Pro Arg Gly Phe 450 455 460 gga ggc cgg cat tgc gag ctg gaa cga gac aag tgt gcc agc agc ccc 1529 Gly Gly Arg His Cys Glu Leu Glu Arg Asp Lys Cys Ala Ser Ser Pro 465 470 475 480 tgc cac agc ggc ggc ctc tgc gag gac ctg gcc gac ggc ttc cac tgc 1577 Cys His Ser Gly Gly Leu Cys Glu Asp Leu Ala Asp Gly Phe His Cys 485 490 495 cac tgc ccc cag ggc ttc tcc ggg cct ctc tgt gag gtg gat gtc gac 1625 His Cys Pro Gln Gly Phe Ser Gly Pro Leu Cys Glu Val Asp Val Asp 500 505 510 ctt tgt gag cca agc ccc tgc cgg aac ggc gct cgc tgc tat aac ctg 1673 Leu Cys Glu Pro Ser Pro Cys Arg Asn Gly Ala Arg Cys Tyr Asn Leu 515 520 525 gag ggt gac tat tac tgc gcc tgc cct gat gac ttt ggt ggc aag aac 1721 Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Cys Pro Asp Asp Phe Gly Gly Lys Asn 530 535 540 tgc tcc gtg ccc cgc gag ccg tgc cct ggc ggg gcc tgc aga gtg atc 1769 Cys Ser Val Pro Arg Glu Pro Cys Pro Gly Gly Ala Cys Arg Val Ile 545 550 555 560 gat ggc tgc ggg tca gac gcg ggg cct ggg atg cct ggc aca gca gcc 1817 Asp Gly Cys Gly Ser Asp Ala Gly Pro Gly Met Pro Gly Thr Ala Ala 565 570 575 tcc ggc gtg tgt ggc ccc cat gga cgc tgc gtc agc cag cca ggg ggc 1865 Ser Gly Val Cys Gly Pro His Gly Arg Cys Val Ser Gln Pro Gly Gly 580 585 590 aac ttt tcc tgc atc tgt gac agt ggc ttt act ggc acc tac tgc cat 1913 Asn Phe Ser Cys Ile Cys Asp Ser Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Cys His 595 600 605 gag aac att gac gac tgc ctg ggc cag ccc tgc cgc aat ggg ggc aca 1961 Glu Asn Ile Asp Asp Cys Leu Gly Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Thr 610 615 620 tgc atc gat gag gtg gac gcc ttc cgc tgc ttc tgc ccc agc ggc tgg 2009 Cys Ile Asp Glu Val Asp Ala Phe Arg Cys Phe Cys Pro Ser Gly Trp 625 630 635 640 gag ggc gag ctc tgc gac acc aat ccc aac gac tgc ctt ccc gat ccc 2057 Glu Gly Glu Leu Cys Asp Thr Asn Pro Asn Asp Cys Leu Pro Asp Pro 645 650 655 tgc cac agc cgc ggc cgc tgc tac gac ctg gtc aat gac ttc tac tgt 2105 Cys His Ser Arg Gly Arg Cys Tyr Asp Leu Val Asn Asp Phe Tyr Cys 660 665 670 gcg tgc gac gac ggc tgg aag ggc aag acc tgc cac tca cgc gag ttc 2153 Ala Cys Asp Asp Gly Trp Lys Gly Lys Thr Cys His Ser Arg Glu Phe 675 680 685 cag tgc gat gcc tac acc tgc agc aac ggt ggc acc tgc tac gac agc 2201 Gln Cys Asp Ala Tyr Thr Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Tyr Asp Ser 690 695 700 ggc gac acc ttc cgc tgc gcc tgc ccc ccc ggc tgg aag ggc agc acc 2249 Gly Asp Thr Phe Arg Cys Ala Cys Pro Pro Gly Trp Lys Gly Ser Thr 705 710 715 720 tgc gcc gtc gcc aag aac agc agc tgc ctg ccc aac ccc tgt gtg aat 2297 Cys Ala Val Ala Lys Asn Ser Ser Cys Leu Pro Asn Pro Cys Val Asn 725 730 735 ggt ggc acc tgc gtg ggc agc ggg gcc tcc ttc tcc tgc atc tgc cgg 2345 Gly Gly Thr Cys Val Gly Ser Gly Ala Ser Phe Ser Cys Ile Cys Arg 740 745 750 gac ggc tgg gag ggt cgt act tgc act cac aat acc aac gac tgc aac 2393 Asp Gly Trp Glu Gly Arg Thr Cys Thr His Asn Thr Asn Asp Cys Asn 755 760 765 cct ctg cct tgc tac aat ggt ggc atc tgt gtt gac ggc gtc aac tgg 2441 Pro Leu Pro Cys Tyr Asn Gly Gly Ile Cys Val Asp Gly Val Asn Trp 770 775 780 ttc cgc tgc gag tgt gca cct ggc ttc gcg ggg cct gac tgc cgc atc 2489 Phe Arg Cys Glu Cys Ala Pro Gly Phe Ala Gly Pro Asp Cys Arg Ile 785 790 795 800 aac atc gac gag tgc cag tcc tcg ccc tgt gcc tac ggg gcc acg tgt 2537 Asn Ile Asp Glu Cys Gln Ser Ser Pro Cys Ala Tyr Gly Ala Thr Cys 805 810 815 gtg gat gag atc aac ggg tat cgc tgt agc tgc cca ccc ggc cga gcc 2585 Val Asp Glu Ile Asn Gly Tyr Arg Cys Ser Cys Pro Pro Gly Arg Ala 820 825 830 ggc ccc cgg tgc cag gaa gtg atc ggg ttc ggg aga tcc tgc tgg tcc 2633 Gly Pro Arg Cys Gln Glu Val Ile Gly Phe Gly Arg Ser Cys Trp Ser 835 840 845 cgg ggc act ccg ttc cca cac gga agc tcc tgg gtg gaa gac tgc aac 2681 Arg Gly Thr Pro Phe Pro His Gly Ser Ser Trp Val Glu Asp Cys Asn 850 855 860 agc tgc cgc tgc ctg gat ggc cgc cgt gac tgc agc aag gtg tgg tgc 2729 Ser Cys Arg Cys Leu Asp Gly Arg Arg Asp Cys Ser Lys Val Trp Cys 865 870 875 880 gga tgg aag cct tgt ctg ctg gcc ggc cag ccc gag gcc ctg agc gcc 2777 Gly Trp Lys Pro Cys Leu Leu Ala Gly Gln Pro Glu Ala Leu Ser Ala 885 890 895 cag tgc cca ctg ggg caa agg tgc ctg gag aag gcc cca ggc cag tgt 2825 Gln Cys Pro Leu Gly Gln Arg Cys Leu Glu Lys Ala Pro Gly Gln Cys 900 905 910 ctg cga cca ccc tgt gag gcc tgg ggg gag tgc ggc gca gaa gag cca 2873 Leu Arg Pro Pro Cys Glu Ala Trp Gly Glu Cys Gly Ala Glu Glu Pro 915 920 925 ccg agc acc ccc tgc ctg cca cgc tcc ggc cac ctg gac aat aac tgt 2921 Pro Ser Thr Pro Cys Leu Pro Arg Ser Gly His Leu Asp Asn Asn Cys 930 935 940 gcc cgc ctc acc ttg cat ttc aac cgt gac cac gtg ccc cag ggc acc 2969 Ala Arg Leu Thr Leu His Phe Asn Arg Asp His Val Pro Gln Gly Thr 945 950 955 960 acg gtg ggc gcc att tgc tcc ggg atc cgc tcc ctg cca gcc aca agg 3017 Thr Val Gly Ala Ile Cys Ser Gly Ile Arg Ser Leu Pro Ala Thr Arg 965 970 975 gct gtg gca cgg gac cgc ctg ctg gtg ttg ctt tgc gac cgg gcg tcc 3065 Ala Val Ala Arg Asp Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Asp Arg Ala Ser 980 985 990 tcg ggg gcc agt gcc gtg gag gtg gcc gtg tcc ttc agc cct gcc agg 3113 Ser Gly Ala Ser Ala Val Glu Val Ala Val Ser Phe Ser Pro Ala Arg 995 1000 1005 gac ctg cct gac agc agc ctg atc cag ggc gcg gcc cac gcc atc gtg 3161 Asp Leu Pro Asp Ser Ser Leu Ile Gln Gly Ala Ala His Ala Ile Val 1010 1015 1020 gcc gcc atc acc cag cgg ggg aac agc tca ctg ctc ctg gct gtc acc 3209 Ala Ala Ile Thr Gln Arg Gly Asn Ser Ser Leu Leu Leu Ala Val Thr 1025 1030 1035 1040 gag gtc aag gtg gag acg gtt gtt acg ggc ggc tct tcc aca ggt ctg 3257 Glu Val Lys Val Glu Thr Val Val Thr Gly Gly Ser Ser Thr Gly Leu 1045 1050 1055 ctg gtg cct gtg ctg tgt ggt gcc ttc agc gtg ctg tgg ctg gcg tgc 3305 Leu Val Pro Val Leu Cys Gly Ala Phe Ser Val Leu Trp Leu Ala Cys 1060 1065 1070 gtg gtc ctg tgc gtg tgg tgg aca cgc aag cgc agg aaa gag cgg gag 3353 Val Val Leu Cys Val Trp Trp Thr Arg Lys Arg Arg Lys Glu Arg Glu 1075 1080 1085 agg agc cgg ctg ccg cgg gag gag agc gcc aac aac cag tgg gcc ccg 3401 Arg Ser Arg Leu Pro Arg Glu Glu Ser Ala Asn Asn Gln Trp Ala Pro 1090 1095 1100 ctc aac ccc atc cgc aac ccc atc gag cgg ccg ggg ggc cac aag gac 3449 Leu Asn Pro Ile Arg Asn Pro Ile Glu Arg Pro Gly Gly His Lys Asp 1105 1110 1115 1120 gtg ctc tac cag tgc aag aac ttc acg ccg ccg ccg cgc agg gcg gac 3497 Val Leu Tyr Gln Cys Lys Asn Phe Thr Pro Pro Pro Arg Arg Ala Asp 1125 1130 1135 gag gcg ctg ccc ggg ccg gcc ggc cac gcg gcc gtc agg gag gat gag 3545 Glu Ala Leu Pro Gly Pro Ala Gly His Ala Ala Val Arg Glu Asp Glu 1140 1145 1150 gag gac gag gat ctg ggc cgc ggt gag gag gac tcc ctg gag gcg gag 3593 Glu Asp Glu Asp Leu Gly Arg Gly Glu Glu Asp Ser Leu Glu Ala Glu 1155 1160 1165 aag ttc ctc tca cac aaa ttc acc aaa gat cct ggc cgc tcg ccg ggg 3641 Lys Phe Leu Ser His Lys Phe Thr Lys Asp Pro Gly Arg Ser Pro Gly 1170 1175 1180 agg ccg gcc cac tgg gcc tca ggc ccc aaa gtg gac aac cgc gcg gtc 3689 Arg Pro Ala His Trp Ala Ser Gly Pro Lys Val Asp Asn Arg Ala Val 1185 1190 1195 1200 agg agc atc aat gag gcc cgc tac gcc ggc aag gag 3725 Arg Ser Ile Asn Glu Ala Arg Tyr Ala Gly Lys Glu 1205 1210 1212 taggggcggc tgccagctgg gccgggaccc agggccctcg gtgggagcca tgccgtctgc 3785 cggacccgga ggccgaggcc atgtgcatag tttctttatt ttgtgtaaaa aaaccaccaa 3845 aaacaaaaac caaatgttta ttttctacgt ttctttaacc ttgtataaat tattcagtaa 3905 ctgtcaggct gaaaacaatg gagtattctc ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3955 <210>4 <211>8 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <223>FLAG sequence(peptide designed as a tag recognized by antibodies th at are commercially available) <400>4 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 Ｆ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｅ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 CA04 DA02 GA03 GA14 HA04 4B029 AA27 BB17 CC03 4B064 AG20 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 DA16 4B065 AA91X AA92X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 CA24 CA25 CA46 CA60 4H045 AA11 CA40 DA76 EA54 EA61 FA72

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 未変性のノッチリガンド蛋白質の細胞外
   部分を特異的に認識することを特徴とする抗体。
2. 【請求項２】 ノッチリガンド蛋白質がヒトノッチリガ
   ンド蛋白質である請求項１記載の抗体。
3. 【請求項３】 未変性のノッチリガンド蛋白質がヒトジ
   ャグドー2 蛋白質である請求項１記載の抗体。
4. 【請求項４】 抗体が、モノクローナル抗体である請求
   項１記載の抗体。
5. 【請求項５】 抗体が、ラットに免疫して得られるラッ
   トモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
6. 【請求項６】 受託番号FERM BP-7600のハイブリドーマ
   TS-11により産生される請求項１記載の抗体。
7. 【請求項７】 未変性のノッチリガンド蛋白質の細胞外
   部分が配列表配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペ
   プチドから構成される請求項１記載の抗体。
8. 【請求項８】 分離した体液、請求項１〜７のいずれか
   に記載の抗体を用いて反応させて活性を有するノッチリ
   ガンド蛋白質を検出することを特徴とする疾患の検査方
   法。
9. 【請求項９】 疾患が細胞の分化異常に伴う疾患である
   請求項８記載の検査方法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれかに記載される
    抗体を用いた活性を有するノッチリガンド蛋白質を細胞
    表面上に発現する細胞の分離または検出方法。
11. 【請求項１１】 少なくとも請求項１〜７のいずれかに
    記載される抗体を含有することを特徴とする検査薬キッ
    ト。
12. 【請求項１２】 少なくとも請求項１〜７のいずれかに
    記載される抗体を含有することを特徴とする細胞分離キ
    ットまたは細胞分離装置。
13. 【請求項１３】 請求項１〜７のいずれかに記載される
    抗体を固定化した担体。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の担体を用いること
    を特徴とする活性を有するノッチリガンド蛋白質の精製
    および製造方法。