JP2003523735A - ヒトナチュラルキラー細胞によって媒介される天然細胞毒性に関連した新規トリガリングレセプターおよび同一の性質を有する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、全ての成熟ＮＫ細胞により選択的に発現され、活性化レセプターとして人間の天然細胞毒性に関連する、ＮＫｐ３０と呼称される新規化合物、ＮＫｐ３０構造体と結合する新規抗体、およびその製薬学的および医学的使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、全ての成熟ＮＫ細胞により選択的に発現され、活性化レセプターと
してヒトの天然細胞毒性に関する、ＮＫｐ３０と呼称される新規化合物、ＮＫｐ
３０構造体に結合する新規抗体、およびその薬剤および医薬品としての使用に関
する。

【０００２】 （発明の背景） ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、免疫監視により腫瘍細胞またはウイル
ス感染細胞を除去する効果的なエフェクターのメカニズムを提供する。ＮＫ細胞
のよく知られた特徴は、標的細胞を溶解し、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を不十分
にする能力である。この認識は、ＮＫ細胞により発現される様々な阻害レセプタ
ーの定義付けの基礎となっている。標的細胞上に発現したＭＨＣ−クラスＩ分子
と結合すると、これらのレセプターが細胞溶解機能をダウン−レギュレートする
阻害シグナルを発する。ヒトでは、ＨＬＡ−クラスＩ分子の認識は２種類のレセ
プターで媒介される：これらはリガンドがＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ対立遺伝
子、およびＨＬＡ−Ｅ分子を認識するレクチン−様ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプ
ター複合体の種々の群により表されるＫＩＲおよびＬＩＲ−１／ＩＬＴ−２タン
パク質の両方を含むＩｇスーパーファミリーに属する。これらの阻害レセプター
の発現は、ＮＫ細胞がＨＬＡ−欠乏細胞と正常細胞とをいかに区別できるかを説
明する。他方で、天然細胞毒性のトリガリングに応答可能なＮＫ細胞の活性化に
ついて記載した情報には限りがある。ごく最近、ＨＬＡ−クラスＩ欠乏標的細胞
の認識および殺傷を介してＮＫ細胞中で重要な役割を果たす、２種の別個のＮＫ
−特異的レセプターが同定された。これらのレセプターは、ＮＫｐ４６およびＮ
Ｋｐ４４と呼称され、Ｉｇスーパーファミリーに属する。特異的ｍＡｂによって
誘引されるこれらの架橋は、強いＮＫ細胞活性化を誘導し、その結果、細胞内Ｃ
ａ⁺⁺レベルが上昇し、細胞毒性が引き起こされ、リンホカインが放出される。重
要であるのは、ｍＡｂ−媒介性のＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４のマスキ
ングが、全てではないがほとんどの標的細胞に対するＮＫ細胞毒性を阻害するこ
とである。このことは、天然細胞毒性においてＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４が中
心的役割を果たすことが明らかにされている反面、他のレセプターが存在するこ
とを意味している。

【０００３】 （発明の概要） 本発明の課題は、標的細胞の認識および殺傷に関する、ＮＫ細胞中に含まれる
新規トリガリングレセプターを同定することである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから約３
０ｋＤであるこの新規レセプターはＮＫｐ３０と呼称され、単一のＶ−タイプド
メイン、膜貫通部位での荷電残基、および細胞質尾中のＩＴＡＭモチーフの不在
により特徴付けられるＩｇスーパーファミリーの一員である。ＥＭＢＬ／Ｇｅｎ
ｂａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースを検索すると、クローン化ＮＫｐ３０ｃＤＮＡ
が、以前に同定された任意選択的なスプライシング形の１Ｃ７遺伝子（寄託番号
ＡＦ０３１１３８で入手可能）と一致することが分かった。しかし、これまで、
特異的モノクローナル抗体がないので、１Ｃ７遺伝子の推定生成物の機能も表面
分布も確認できなかった。ＮＫｐ３０はヒト成熟ＮＫ細胞の表面上に選択的に発
現し、細胞活性化時にチロシンホスホリル化されるＣＤ３ζシグナル伝達ペプチ
ドに関連する。ＮＫｐ３０は、多くの標的細胞に対するＮＫ−媒介細胞毒性誘導
時にＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４といっしょに働くことができ、したが
って標的細胞（例えばＭＥＬ１５タイプのヒトメラノーマ）の殺傷時の主要トリ
ガリングレセプターである。

【０００４】 本発明の別の課題は、ＮＫｐ３０構造体と選択的に結合する抗体を提供するこ
とである。抗体−媒介性のＮＫｐ３０の架橋はＮＫ細胞の活性化を強力に誘導す
るのに対し、抗体−媒介性ＮＫｐ３０マスキングはＮＫの天然細胞毒性を阻害す
る。以下の「実施例」の項目のＡＺ２０に参照されるようなモノクローナル抗体
を生じるハイブリドーマは２０００年１１月８日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．へ寄託され
ている（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ；２５、ｒｕｅ
ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ；Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ
１５；Ｆｒａｎｃｅ）。

【０００５】 本発明はしたがって、ＮＫ細胞のポジティブ精製およびＮＫ細胞の天然細胞毒
性の制御に有用なツールを提供する。本発明のツールは、特に同種異系の移植片
／宿主反応または外科移植／宿主反応の制御（移植または外科移植の改善、移植
片対宿主ＧｖＨだけでなく移植片対腫瘍ＧｖＴまたは移植片対白血球ＧｖＬ）、
および腫瘍細胞、微生物−感染またはウイルス感染細胞等の異常細胞の増殖の制
御に役立つ。

【０００６】 （発明の詳細な説明） 本発明は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、その
任意の免疫原性フラグメントのアミノ酸配列、および配列番号：７配列から成る
群より選択されるアミノ酸配列に対して、全長が少なくとも８０％相同な少なく
とも１種のアミノ酸配列を含有する、任意の単離された化合物に関する。

【０００７】 これらの化合物のうち、前記群から選択されるアミノ酸配列に対して、全長が
少なくとも９０％相同な少なくとも１種のアミノ酸配列を有する化合物が有利で
あり、中でも少なくとも９５％の前記相同性を有するものが特に有利である。さ
らに、少なくとも９７％の前記相同性を有するものがより有利であり、中でも少
なくとも９８％および９９％の前記相同性を有するものが非常に有利であり、特
に少なくとも９９％の前記相同性を有するものが好ましい。

【０００８】 「相同性」は、従来技術において公知であるように、２種類以上のポリペプチ
ド配列、または場合により２種類以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、
配列を比較することにより判断される。従来技術において「相同性」は、ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列相関の度合いをも意味し、この際、
このような一連の配列間の一致により判断される。「相同性」は、公知の方法に
よって簡単に算出でき、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ ＵｎｖｅｒｓＩｔ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８に記載される方法も含むがこれに
限定はしない。相同性を決定する方法は、試験配列間で最大の一致を与えるよう
に設定される。さらに、相同性を決定する方法は、公共使用可能なコンピュータ
ープログラム、例えばＧＣＧプログラムパッケージのＧＡＰプログラム（Ｄｅｖ
ｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０
３〜４１０（１９９０））、およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉ
ｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５；２４４４〜
２４４８（１９８８））で体系化される。

【０００９】 配列番号：２は、ヒトＮＫｐ３０ １９０ａａポリペプチド（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより約３０ｋＤ）に関し、これはＮＫ細胞、特に成熟ＮＫ細胞により選択的
に発現され、配列番号：４はヒトＮＫｐ３０レセプターの細胞外領域に関し、配
列番号：５はヒトＮＫｐ３０レセプターの膜貫通領域に関し、配列番号：６はヒ
トＮＫｐ３０レセプターの細胞質尾に関し、配列番号：７は配列番号：２由来の
１５ａａ免疫原性ペプチドに関する。本発明はまた前記ポリペプチドのバリアン
ト、すなわち保存アミノ酸置換によるものとは異なり、残基が同様の特性を有す
る別のもので置換されているポリペプチドをも含有する。このような置換で典型
的なのは、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸
性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；塩基性残基Ｌｙｓおよび
Ａｒｇ間；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間である。より一般的に保存バ
リアントは、ＮＫ細胞によりレセプターの適当な位置に発現される場合、レセプ
ターのトリガリングとしてなお機能できる。これらの化合物をここでは「本発明
のａａ化合物」と称す。

【００１０】 本発明は以下のものを含有する単離された化合物も提供する： 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、その任意の免疫
原性フラグメントのアミノ酸配列、配列番号：７配列から成る群より選択される
アミノ酸配列に対して、全長の少なくとも８０％相同である少なくとも１種のア
ミノ酸配列（有利に、この少なくとも１種のアミノ酸配列は、群から選択される
アミノ酸配列に対して、全長が１００％相同である）、さらに 少なくとも１つのＣＤ３ζ鎖を含有する。

【００１１】 「免疫原性フラグメント」は、ここで免疫応答を引き出すこのとできる任意の
ポリペプチドまたはペプチドフラグメントを意味し、免疫応答とは例えば（ｉ）
前記フラグメントと結合する抗体および／または膜レセプターおよびその突然変
異体を含む、前記フラグメントを含有するＮＫｐ３０分子の任意の形と結合する
抗体の生成、（ｉｉ）Ｔ−細胞が、任意のＭＨＣ分子と前記フラグメントに由来
するペプチドとを含む二分子複合体と反応することによるＴ−細胞応答の刺激、
（ｉｉｉ）ほ乳類イムノグロブリンをコードする遺伝子を発現したバクテリオフ
ァージまたはバクテリアのような形質移入媒体の結合等である。さらに、免疫原
性フラグメントは、先に定義したような免疫応答を引き出すことのできる任意の
構造体をも意味し、例えば共有結合によりキャリアータンパク質へ結合した前記
ペプチドフラグメント、そのａａ配列中で前記ペプチドフラグメントを含有する
キメラ組み換えポリペプチド構造体、特に配列が前記フラグメントをコードする
タンパク質を含む、ｃＤＮＡで形質移入された細胞が含まれる。

【００１２】 本発明はまた、配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：
１３ポリヌクレオチド配列、および普遍的な遺伝子暗号をコードしかつその重複
性を考慮したポリヌクレオチド配列、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：
５、配列番号：６の配列、配列番号：２、配列番号：５および配列番号：６配列
の任意の免疫原性フラグメントのアミノ酸配列、および配列番号：１７配列から
成る群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して、全長が少なくとも８０％
相同である少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含有する、任意の単離され
た化合物に関する。これらの化合物のうち、前記群より選択されたポリヌクレオ
チド配列に対して全長が少なくとも９０％相同なものが好ましく、前記相同性が
少なくとも９５％のものが特に好ましい。さらに、前記相同性が少なくとも９７
％のものがより好ましく、中でも前記相同性が少なくとも９８％および少なくと
も９９％のものが特に好ましく、さらに前記相同性が少なくとも９９％のものが
非常に好ましい。好ましい形態は、配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：
１２、配列番号：１３のＤＮＡによってコードされた成熟ポリペプチドと同様の
生物学的機能または活性を十分に保持したポリペプチドをコードする少なくとも
１種のポリヌクレオチド配列を含有する、単離された化合物である。本発明の好
ましい形態は、ストリンジェントな条件下に前記の単離された化合物とハイブリ
ダイズする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有する化合物である。このよ
うなハイブリダイズするヌクレオチドには、特に、配列番号：１、配列番号：１
０、配列番号：１２、配列番号：１３のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレ
オチドの群が含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特別
な例は、以下のものを含有する溶液中の４２℃での一晩のインキュベーション：
５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン
酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および変性し、切断したサケの
精子ＤＮＡ２０マイクログラム／ｍｌ、その後のハイブリダイゼーション支持体
の０．１×ＳＳＣ中の約６５℃での洗浄である。ハイブリダイゼーションと洗浄
の条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ
ｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）
の特に１１章に例示されている。液体ハイブリダイゼーションも本発明のポリヌ
クレオチド配列に使用してよい。本発明はまた、人だけでなくほ乳類の任意の種
、特にサル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギで発現するＮＫｐ３０バリア
ントを包含する。実際このようなバリアントは、種間で高く保存されて現れる。
本発明は、Ａ等の非荷電残基でＲ残基が置換されている膜貫通ドメインの部分的
突然変異などの、ＮＫｐ３０非機能性突然変異も包括する。これらの化合物をこ
こで「本発明のｐｌｎ化合物」と称する。

【００１３】 配列番号：１はヒトＮＫｐ３０ｃＤＮＡ（約１ｋｂのｍＲＮＡ）に関し、配列
番号：１０は４２１ｂｐのＮＫｐ３０ｃＤＮＡプローブ（配列番号：１の位置５
７〜位置４７７）に関し、配列番号：１２は６０６ｂｐのＮＫｐ３０ｃＤＮＡ増
幅生成物（配列番号：１の位置５７〜位置６６２）に関し、配列番号：１３は配
列番号：１の位置６４〜位置６３６の配列をコードするＮＫｐ３０に関する。こ
こでポリヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、
ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡを含む任意のポリヌクレオチド素
質に相当するものを意味する。本発明は、前記ポリヌクレオチド生成物から成る
群より選択される少なくとも１種の単離された化合物を有する形質移入ベクター
、およびこのような単離された化合物の少なくとも１種でまたは前記ベクターの
少なくとも１種で形質移入された細胞をも提供する。

【００１４】 本発明は、（配列番号：８；配列番号：９）対、（配列番号：８；配列番号：
１１）対、配列番号：１０ポリヌクレオチド、配列番号：１２ポリヌクレオチド
から成る群より選択されるポリヌクレオチド化合物にも関する。このような化合
物は特にサンプル中でのＮＫｐ３０検出に有用である。（配列番号：８；配列番
号：９）および（配列番号：８；配列番号：１１）等の対は、例えば上向および
下向ＰＣＲプライマー対として使用できる。配列番号：１０および配列番号：１
２ポリヌクレオチド等のポリヌクレオチドは、ＮＫｐ３０プローブとして使用で
きる。配列番号：１０配列は、配列番号：１プローブに由来する４２１ｂｐのｃ
ＤＮＡに相当する（配列番号：１の位置５７〜位置４７７）；これを例えば、生
物学的サンプル中でＮＫｐ３０遺伝子を同定および単離するためのＮＫｐ３０プ
ローブとして使用してよい。さらにこのＮＫｐ３０遺伝子はほ乳動物種間で高く
保存されて発現する。配列番号：１２は配列番号：１に由来する６０６ｂｐのｃ
ＤＮＡに相当する（配列番号：１の位置５７〜位置６６２）；これは配列番号：
８および配列番号：１１プライマー対を用いたＰＣＲ増幅を介して得られる生成
物に相当する。

【００１５】 別の態様として、本発明は本発明の単離されたａａ化合物（すなわちアミノ酸
配列を含有するとして定義された本発明の任意の化合物、すなわち請求項１で定
義したもの−）の少なくとも１種でほ乳動物を免疫化し（ここで少なくとも１種
のａａ化合物は任意選択的に免疫原性エンハンサーと結合する）、これにより形
成された抗血清を回収することにより得られるような抗血清タイプの組成物を提
供する。

【００１６】 本発明はまた、 抗体−抗原タイプの少なくとも１種の本発明の単離されたａａ化合物の反応中
で確認できる、単離された化合物（ここで「本発明の単離された抗体−抗原タイ
プ化合物」と称す）、および 単離された抗体、および本発明のａａ化合物の少なくとも１種に直接対する単
離されたモノクローナル抗体 を提供する。

【００１７】 本発明はさらに、本発明のａａ化合物の少なくとも１種に直接対しかつＴ細胞
表面分子だけでなく任意のＢ細胞表面分子にも結合しない、任意の単離された抗
体に関する。好ましい抗体は単球、顆粒球に結合せず、好ましくはＮＫ細胞以外
の末梢血液由来の有核細胞と結合しない。最も好ましい単離された抗体は、任意
のＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４の細胞外部だけでなく、任意の別のＮＫ細胞の細
胞外部にも結合しない。

【００１８】 このような結合反応は、ここで、抗体−抗原タイプ認識反応等に好適な実験条
件下での抗体−抗原タイプの反応中に見出される結合反応を意味する。例えば末
梢血液由来の白血球懸濁液を抗体と接触させ、それにより形成される免疫複合体
を検出することにより、例えば蛍光ラベルを施した二次抗−イムノグロブリン試
薬と接触させ、Ｂｅｃｋｍａｎ−ＣｏｕｌｔｅｒＸＬ等のフローサイトメーター
を用いて抗体と結合した細胞を計数同定することにより、このような結合反応を
達成できる。この実験で種々の白血球サブセットの同定は、様々な細胞サブセッ
トの大きさおよび光学特性に基づく。また、前記したような抗体との接触後に、
同一の白血球懸濁液を、Ｔ細胞に特異的に結合するＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１のよ
うな白血球サブセットへ特異的に結合する蛍光色素−結合抗体と接触させてよく
、これにより目的の抗体と結合した白血球サブセットの表現型決定を行うことが
できる。前記した幾つかの２重標識実験を、サブセット−特異的抗体パネルを使
用して実施し、目的の抗体の細胞反応性を明確に描写できるようにする。

【００１９】 本発明の好ましい抗体は、（ｉ）ＭＨＣクラスＩネガティブ標的、腫瘍細胞、
ウイルス感染細胞、同種異系細胞に対する天然細胞毒性、（ｉｉ）抗体−被覆標
的細胞に対する細胞毒性、（ｉｉｉ）細胞質内Ｃａ²⁺濃度の増加、（ｉｖ）ＺＡ
Ｐ７０、Ｓｙｋ、ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ホスホリパーゼＣ−
ガンマ酵素、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ等の細胞質アダプター
／エフェクター分子のチロシンホスホリル化の誘導、（ｖ）レセプター関連形質
導入鎖ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２またはＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマのホスホ
リル化、（ｖｉ）インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子、ＩＬ５、ＩＬ１０、
ケモカイン（例えばＭＩＰ−１アルファ）、ＴＧＦベータ等のサイトカイン分泌
、（ｖｉｉ）ＮＫ細胞表面分子、例えばＣＤ６９およびＰＥＮ５それぞれのアッ
プレギュレーションまたはダウンレギュレーションから推定されるように、ＮＫ
細胞活性化を統計的に顕著に増加させる（ｐ＜０．０５）。

【００２０】 本発明の好ましい単離された抗体の例には、本発明の単離されたａａ化合物の
少なくとも１種に直接対し、かつ標的細胞の存在下に１：１の割合で存在するＮ
Ｋ細胞によって引き起こされる天然細胞毒性を少なくとも約４倍、好ましくは少
なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約６倍に増加させることが可能な単
離された抗体が含まれる。

【００２１】 本発明の最も好ましい単離された抗体は、本発明の単離されたａａ化合物の少
なくとも１種と直接対し、任意のＴまたはＢ細胞表面分子とは結合せず、標的細
胞の存在下に１：１の割合で存在するＮＫ細胞により引き起こされる天然細胞毒
性を少なくとも約４倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくと
も約６倍に増加させることができる。

【００２２】 本発明の最も好ましい単離された抗体には、モノクローナル抗体が含まれる。
このようなモノクローナル抗体の幾つかの例は、以下の「実施例」の項目に記載
されている（例えばＡＺ２Ｏ；Ａ７６；Ｚ２５モノクローナル抗体参照）。本発
明のＡＺ２Ｏモノクローナル抗体を生じるハイブリドーマは、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．
へ２０００年１１月８日付けで寄託されている（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ；Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ；２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕ
ｘ；Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５；Ｆｒａｎｃｅ）：Ｃ．Ｎ
．Ｃ．Ｍ．寄託番号はＩ−２５７６である。本発明はしたがって、ハイブリドー
マＩ−２５７６により製造される単離されたモノクローナル抗体に関する。

【００２３】 本発明の任意の単離された抗体は、視覚化の目的で適当な任意の標識と結合し
てよい。このような標識には、例えば蛍光標識、放射線標識、酵素標識が含まれ
る。

【００２４】 本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を生じる任意のハイブリドーマに
関する。

【００２５】 本発明のモノクローナル抗体は、連続した細胞系の培養により抗体分子を製造
するための任意の技術を利用して製造できる。これらの技術には、Ｋｏｈｌｅｒ
ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎオリジナルの技術、Ｎａｔｕｒｅ、２６５：４９５
〜４９７（１９７５）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌに記載される変法、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３：１８９９（１９８９）が含まれるが、これに限定す
るものではなく、その内容は参照することによりここに組み込まれたものとする
。免疫原として、本発明の任意のａａ化合物が適当である。

【００２６】 ＮＫｐ３０に対する抗体を製造するハイブリドーマ細胞をスクリーニングする
ために使用できるスクリーニング法には（１）固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ
）、（２）免疫沈降法または（３）蛍光表示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析が含ま
れるが、これに限定するものではない。当業者は、抗−ＮＫｐ３０モノクローナ
ル抗体をスクリーニングするために使用できる多くの様々なＥＬＩＳＡ法を想定
できる。

【００２７】 最初のスクリーニングは、そのＮＫ細胞に対するがＴ細胞および単球に対しな
い反応性に関してフローサイトメトリーによりハイブリドーマ上清をスクリーニ
ングすることにより、実施されるのが好ましい。ハイブリドーマの別の特徴付け
を、実施例に詳細する間接免疫蛍光アッセイおよびフローサイトメトリーにより
リンパ系および非−リンパ系細胞の精製集団を試験することにより実施できる。
ＮＫｐ３０エピトープを認識するモノクローナル抗体は、細胞の少なくとも約７
０〜９０％、例えば約８０％の高率でＮＫ細胞上に存在するエピトープと反応す
るが、ＣＤ３⁺Ｔ細胞またはＣＤ２０⁺Ｂ細胞とは十分に反応しない。好ましい形
態において、抗体は単球、顆粒球、血小板および赤血球と非反応性である。

【００２８】 当業者に公知の競合アッセイでこのような抗体と競合するモノクローナル抗体
は、基本的に同一のエピトープを認識するようである。

【００２９】 所望のハイブリドーマを選択、クローン化して得られた抗体は、２種類の主要
な方法のうちの１種で製造されてよい。最も純度の高いモノクローナル抗体は、
所望のハイブリドーマを好ましい培地中で適した時間長さｉｎ ｖｉｔｒｏ培養
することにより製造され、その後、沈殿物の所望の抗体を回収した。時間長さお
よび培地は公知であるか容易に決定できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、本質的に
単一特異性モノクローナル抗体を生成し、実質的に他種抗−ヒトイムノグロブリ
ンを含まない。しかし、生成される抗体の量がわずか約５０μｇ／ｍｌであるの
で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法ではある目的に対して十分量または十分濃度の抗体が製
造されない。

【００３０】 より多くの量のモノクローナル抗体を製造するために、所望のハイブリドーマ
をマウス等の動物へ接種してよい。

【００３１】 好ましくは、マウスはモノクローナル抗体酸性ハイブリドーマが獲られた株と
同系または半同系である。ハイブリドーマの接種は、適当なインキュベーション
時間後に抗体産生腫瘍の形成を誘導し、その結果、所望の抗体が宿主動物の腹水
中に高濃度で得られる（約５〜２０ｍｇ／ｍｌ）。

【００３２】 抗体分子は公知技術、例えば免疫吸収またはイムノアフィニティークロマトグ
ラフィー、高速液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法、またはそれ
らの組合せにより精製できる。

【００３３】 これらのプロトコールに続き、この技術分野の当業者は、本発明のモノクロナ
ール抗体を産生するハイブリドーマ、特にＮＫｐ３０に特異性を示すモノクロー
ナル抗体を容易に単離できる。このようなハイブリドーマの例は、以下の「実施
例」に記載され、記載のＡＺ２Ｏモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は２０００年１１月８日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄
託番号：Ｉ−２５７６）。したがって、本発明はこのような任意のハイブリドー
マ、およびその上清から得られる任意のモノクローナル抗体を包括すると考えら
れる。特に本発明は、所望の抗−ＮＫｐ３０特性を示す任意のモノクローナル抗
体、および特に以下による任意のモノクローナル抗体を包括する： （ｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、その任意
の免疫原性フラグメントのアミノ酸配列、配列番号：１７配列から成る群より選
択されるアミノ酸配列に対して、全長が少なくとも８０％相同である少なくとも
１種のアミノ案配列を有するａａ化合物に対して動物を免疫化し、 （ｉｉ）該動物の脾臓細胞からハイブリドーマを産生し、培養上清中にモノク
ローナル抗体を生成するために培養し、 （ｉｉｉ）免疫原としてステップ（ｉ）で使用したａａ化合物に結合する抗体
の存在を調べるために上清を測定し、 （ｉｖ）所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択およびクローニングし、 （ｖ）前記クローンの上清からモノクローナル抗体を回収する。

【００３４】 この方法の後、特に配列番号：１７を免疫原としてステップ（ｉ）で使用した
場合、所望のハイブリドーマ数種を非常に高い見込みで連続して製造することが
できる。クローン化されたハイブリドーマは、所望のように、例えばＮＫ細胞以
外の末梢血液由来の任意の細胞と結合せず、かつ／または標的細胞の存在下に１
：１の割合で存在するＮＫ細胞によって引き起こされる天然細胞毒性を少なくと
も５倍増加させることを含む、任意の所望の特性に応じて、さらにスクリーニン
グされかつ選択される。

【００３５】 別の態様において、本発明は本発明の単離された抗体およびモノクローナル抗
体から成る群より選択される任意の抗体の、単離された免疫反応性フラグメント
に関する。このようなフラグメントには、特に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および
ＣＤＲ抗体フラグメントが含まれる。当業者は、特にヒトへ投与する目的で、所
望に応じてそれらから本発明のヒトに使用可能な抗体を誘導できることを認識し
ている。「抗体の免疫−反応フラグメント」とは、ここで特に抗原結合部位を有
する任意の抗体フラグメントを意味する。したがってこのようなフラグメントに
は、当業者が公知のように、ペプシンまたはパパイン等のタンパク分解酵素によ
り前記抗体を酵素切断することによって得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントお
よびヒンジ領域に位置するスルフヒドリル基の還元によりそこから誘導されるＦ
ａｂフラグメントが含まれる。免疫反応性フラグメントは、その配列が目的の抗
体のＣＤＲ領域を含有する組み換え単鎖または二本鎖ポリペプチドを含んでいて
よい。単離されたＣＤＲ領域自体も本発明の単離された免疫反応性フラグメント
の定義の範疇であると考えられる。

【００３６】 別の態様において、本発明は本発明の単離された抗体または免疫反応性フラグ
メントを少なくとも１種結合させた任意の固体支持体に関する。前記結合が成さ
れた任意の固体支持体が適当である。特に適当な固体支持体には、Ｄｙｎａｌ
ａ．ｓ．のＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）等の親和性マトリク
スとして使用できる常磁性マイクロスフェアー、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅ
ｃ ＧｍｂＨ（Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の微小なＭＡＣＳマイクロ
ビーズ、ＵＳ５７６３１９４に記載される中空繊維のアレーから成る半透膜物質
、ＵＳ５５７６１８５に記載される沈降による分離を可能にする緻密粒子が含ま
れる。

【００３７】 本発明の固体支持体の有利な形態では、前記支持体上にさらに結合された抗−
ＮＫｐ４６および／または抗−ＮＫｐ４４抗体、またはその免疫原性フラグメン
トまたは誘導体の支持体上での存在を含む。以下に詳細するように、本発明のＮ
Ｋｐ３０レセプターは実際にＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４レセプターと
相加的にまたは相乗的に組み合わせることができる。

【００３８】 別の態様では、本発明は本発明の抗血清−タイプの組成物、本発明の単離され
た抗体−抗原タイプ化合物、本発明の抗体およびモノクローナル抗体から成る群
より選択される少なくとも１種の物質でほ乳動物を免疫化し（ここで少なくとも
１種の物質は免疫原性エンハンサーと任意に結合してよい）、こうして得られた
抗−抗血清を回収することにより取得されるような抗−抗血清タイプの任意の組
成物に関する。本発明はまた、抗体−抗原タイプの反応で本発明のａａ化合物の
少なくとも１種を認識できる、単離された抗−抗体およびモノクローナル抗−抗
体、および同一のものを含有する医薬品組成物に関する。

【００３９】 本発明の生成物は、様々に使用できる。有利な使用用途にはその医薬品として
の使用が含まれる。ＮＫｐ３０は全てのＮＫ細胞により選択的に発現され、いず
れもＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＦＬＴ−３リガンド、ＳＣＦ等の１種
、２種または多種サイトカインの存在下に新に単離培養され、したがってＮＫ細
胞同定のための至適マーカーを意味する。本発明は、特に、当業者が生物学的サ
ンプル中のＮＫ細胞の存在を検出および／または定量化するための方法を実施で
きるようにし、該方法は、前記サンプル中に存在するＮＫｐ３０分子の検出およ
び／または定量化から成る。本発明の方法は、特に、以下の工程を含む： −生物学的なサンプルを、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された
抗体−抗原タイプ化合物、本発明の単離された抗体、単離された免疫−反応性フ
ラグメント、固体支持体、および本発明のハイブリドーマから成る群より選択さ
れる少なくとも１種の物質と接触させ、 −これにより形成される免疫複合体を検出および／または定量化する または 生物学的サンプルを、本発明の単離されたポリヌクレオチド化合物、本発明の
単離されたポリヌクレオチド対、本発明の配列番号：１０および／または配列番
号：１２を含有する単離されたポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドハイブリ
ダイゼーション生成物の形成に適した条件下に接触させ、 これにより形成されるハイブリダイゼーション生成物を検出および／または定
量化する。

【００４０】 本発明はまた、当業者が生物学的サンプルからＮＫ細胞を選択的に除去する方
法を実施できるようにし、該方法は、ＮＫｐ３０⁺である細胞の選択的除去から
成る。このような方法は特に以下の工程を含む： −生物学的サンプルを、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された
抗体−抗原タイプ化合物、本発明の単離された抗体、単離された免疫反応性フラ
グメント、固体支持体、および本発明のハイブリドーマから成る群より選択され
る少なくとも１種の物質と、免疫複合体形成に好適な接触下に接触させ、 −これにより形成される免疫複合体（ポジティブ細胞）を、このような複合体
有さないもの（ネガティブ細胞）から除去する。

【００４１】 本発明はまた、当業者が生物学的サンプルからＮＫ細胞の陽性かつ選択的精製
方法を実施できるようにし、該方法は、ＮＫｐ３０⁺であるこのような細胞のポ
ジティブかつ選択的精製から成る。このような方法は特に以下の工程を含む： 生物学的サンプルを、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗
体−抗原タイプ化合物、本発明の単離された抗体、単離された免疫−反応性フラ
グメント、固体支持体、および本発明のハイブリドーマを、免疫複合体形成に好
適な接触条件下に接触させ、 その上に免疫複合体を形成した細胞を除去する。

【００４２】 細胞回収の便利な方法は当業者に公知である。このような方法は特に以下を含
む：（ｉ）細胞とポジティブ細胞に免疫複合体を形成させる物質との結合を機械
的に切断する、（ｉｉ）ポジティブ細胞に免疫複合体を形成させる物質を酵素攻
撃する（例えばＵＳ５０８１０３０に記載されるようなパパインによる攻撃）、
または（ｉｉｉ）免疫複合体と、ポジティブ細胞と結合するために免疫複合体中
に含有される抗体と競合できる過剰量の可溶性分子とを接触させ、その結果免疫
複合体が中断され、例えばＵＳ５９６８７５３にＣＤ３４⁺細胞の回収について
例示される。

【００４３】 本発明はまた、前記の少なくとも１種の（各）物質を含有する生物学的サンプ
ルからＮＫ細胞を検出、定量化、除去および／またはポジティブ精製するための
任意のキットに関し、前記物質はコンテナー中に封入される。

【００４４】 本発明の方法を実施するために、適当な生物学的サンプルは、末梢血液、血漿
、骨髄穿刺液、リンパ系組織、ならびに血球分離、血漿分離および、滑液、脳脊
髄液、気管支肺胞液および腹膜液等の合集液から単離された細胞を含む。

【００４５】 特に有利な態様において、本発明はＮＫ細胞の細胞毒性を刺激する方法に関し
、該方法は以下から成る： 前記ＮＫ細胞を、生理学的条件下（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）
に、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合
物、単離された抗体、固体支持体、および本発明のハイブリドーマから成る群よ
り選択される少なくとも１種の生成物と接触させる。

【００４６】 前記接触は、前記ＮＫ細胞上でＮＫｐ３０が架橋できるように実施される（配
列番号：２、配列番号：４、配列番号：５およびその保存バリアントに対して、
配列全長の少なくとも８０％相同なａａ配列を含有する、前記ＮＫ細胞の表面で
の、化合物の架橋）。好ましい架橋形態には、前記ＮＫ細胞を生理学的条件下に
、少なくとも１種の選択された物質（例えば抗ＮＫｐ３０抗体）を飽和濃度の前
記物質を用いて固定化した少なくとも１種の固体支持体と接触させることが含ま
れる。ＮＫｐ３０レセプター架橋には実際、ＮＫ細胞活性化刺激が含まれる。刺
激を優先するネットＮＫ細胞活性化制御平衡の獲得が求められる場合、当業者は
明らかに優先してＮＫｐ３０架橋条件を選択するであろう。このような条件には
特に、自然に架橋する化合物の使用が含まれる。前記群に列挙される生成物は、
そのような化合物、またはその可能な構築体の例に相当する。このような条件に
はまた、適当な量、特に前記制御がＮＫ細胞の細胞毒性刺激を優先してより強く
平衡化する適当な密度での（例えば飽和濃度）、このような架橋化合物の使用が
含まれる。刺激を、記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実
施してよい。

【００４７】 本発明の刺激法は、有利にＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５のようなインタ
ーロイキン中でのＮＫ細胞インキュベーションの通常のステップを必要としない
。これらのステップはしかしもちろん排除されない：当業者は、本発明の方法に
これらの通常のステップを付け加えるかを選択できる。

【００４８】 本発明はまた、ＮＫ細胞の細胞毒性を刺激するためのキットに関し、該キット
は前記生成物の少なくとも１種をコンテナー中に封入して含有する。

【００４９】 検出、定量化、除去、完全精製、および／またはＮＫ細胞の細胞毒性刺激のた
めに、本発明の前記方法はさらに、前記生物学的サンプル、または前記ＮＫ細胞
を、抗−ＮＫｐ４６または抗−ＮＫ４４抗体と接触させることを含んでよく；前
記キットはさらに抗−ＮＫｐ４６または抗−ＮＫｐ４４抗体を含有してよい。本
発明はしたがって、前記群から選択される少なくとも１種の生成物を含有するＮ
Ｋ細胞の細胞毒性を刺激するための任意のキットに関し、ここで前記少なくとも
１種の生成物はコンテナー中に封入されている。このようなキットはさらに抗−
ＮＫｐ４６抗体および抗−ＮＫｐ４４抗体から成る群より選択される１種または
数種の抗体を含有してよい。

【００５０】 有利には本発明の精製法をＮＫ細胞活性化と同時に実施でき、逆も可能である
。本発明の実施形態である、同時のＮＫ細胞ポジティブ精製およびＮＫ細胞細胞
毒性刺激は、生物学的サンプル、特にヒトに由来のサンプルに適用する場合、す
なわち治療後に人患者へ再投与する場合に興味深い。

【００５１】 また、本発明はＮＫ細胞の細胞毒性を阻害する方法をも提供し、該方法は、生
理学的条件下に前記ＮＫ細胞を少なくとも１種の化合物と接触させることから成
る： （ａ）例えばＮＫｐ３０結合部位をマスキングすることにより、前記ＮＫ細胞
上に発現するＮＫｐ３０レセプターへのＮＫｐ３０の天然リガンドの結合を阻害
できる化合物、および／または前記ＮＫ細胞により発現されるＮＫｐ３０レセプ
ターの架橋を阻害できる化合物、および／または （ｂ）前記ＮＫ細胞により発現されるＮＫｐ３０分子、その形質移入エレメン
ト、特にＣＤ３ζ鎖間の相互反応を阻害する化合物。この方法は望みに応じてｉ
ｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。

【００５２】 （ａ）の化合物は特に、本発明の免疫−反応性フラグメントを含有する（例え
ばＦａｂ；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）。種々のイソタイプの好適なＮＫｐ３
０モノクローナル抗体（ＩｇＭおよび好ましくはＩｇＧ）、またはその免疫反応
性の１価または２価フラグメントを、ＮＫ細胞上に発現するＮＫｐ３０をマスク
するための各分離定数の１０倍を越える飽和濃度で使用できる。

【００５３】 （ｂ）の化合物は特に、ＮＫｐ３０膜貫通荷電アミノ酸（配列番号：１の位置
１４３のアミノ酸Ｒ）と前記形質導入エレメント間の相互作用を阻害できる化合
物である。このような（ｂ）化合物は、特に、生理学的条件下にＮＫｐ３０膜貫
通領域（配列番号：１の位置１３８〜１５７）へ結合できる脂溶性分子に相当す
るので、前記膜貫通アミノ酸（位置１４３のＲ）の機能（ＣＤ３ζへの結合）を
阻害または遮断できる。ここで生理学的条件とは、ｉｎ ｖｉｖｏ条件、または
ｉｎ ｖｉｖｏ条件に類似したｉｎ ｖｉｔｒｏ条件を意味する。本発明はまた
、前記生成物の少なくとも１種、例えば本発明の免疫−反応性フラグメントを含
有する、ＮＫ細胞の細胞毒性を阻害するための任意のキットに関する。

【００５４】 ＮＫ細胞を生物学的サンプルから検出／定量化／選択／除去／ポジティブかつ
選択的な精製するための、ならびにＮＫ細胞の細胞毒性を刺激するための方法は
、さらに、前記サンプルまたは各ＮＫ細胞と、前記条件下に、ＮＫｐ３０以外の
ＮＫレセプターの活性を刺激できかつＮＫｐ３０に加えてまたは相乗的に機能す
る化合物、例えばＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４レセプターと接触させる
ことを含む。刺激は、例えば前記条件下に別のＮＫレセプター、特にＮＫｐ４６
および／またはＮＫｐ４４を架橋できる化合物を使用することにより達成できる
。

【００５５】 もちろんその逆を、本発明のＮＫ細胞の細胞毒性を阻害する方法に適用する、
例えば本発明の阻害法はさらに、例えばリガンド結合阻害および／または形質移
入／エフェクターエレメント結合阻害により、前記の別のＮＫレセプターの活性
を阻害出来る化合物の使用を含む。

【００５６】 本発明の非常に有用な態様は、移植される細胞、移植される組織、移植される
器官および宿主有機体から成る群より選択される有機体と、本発明の抗血清−タ
イプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物、単離された抗体、固
体支持体、本発明のハイブリドーマ、本発明の精製法で得られるＮＫ細胞、本発
明の刺激法で得られるＮＫ細胞から成る群より選択される少なくとも１種の生成
物とを接触させることを含む、新規移植法に相当する。ここで「移植」とは「外
科移植」をも包括する。前記宿主有機体は人間を含む任意のほ乳動物であってよ
い。

【００５７】 この新規移植法は特に同種異系移植に有用であり、例えば骨髄／幹移植に利用
できる。特にＧｖＨ阻害、またはＧｖＴおよび特にＧｖＬ刺激に有利である。本
発明の新規移植法の本質は、前記移植片から精製されかつ本発明の方法およびキ
ットにより活性化されるＮＫ細胞を患者に提供することである。これは特にＭＨ
Ｃ−一致または−不一致造血系移植（骨髄／末梢幹細胞）へ利用される。この活
性化された同種異系ＮＫ細胞は、特に移植片の注入に近い時間帯で：同時に、お
よび約２日後で、例えば移植される患者に静脈投与されてよい。活性化されたＮ
Ｋ細胞の量および患者への投与頻度は病状に依存する。

【００５８】 本発明の新規移植法はまた、抗−腫瘍および／または抗−感染治療、予防また
は軽減に特に関連がある。この場合、固形または液体腫瘍またはウイルスやその
他の微生物感染症を患う患者の、本発明の方法およびキットで精製かつ活性化さ
れた自己ＮＫ細胞は、前記ＮＫ細胞を前記腫瘍および／または感染症の原因に対
して反応性の飽和濃度のｍＡｂの存在下にインキュベートすることにより、特に
腫瘍および／または感染症に対して「武装」することができる。精製し、活性化
され、かつ「武装」した本発明のＮＫ細胞を、次に、患者へ静脈投与してよい。
「武装」ＮＫ細胞の量および患者への投与頻度は病状に依存する。

【００５９】 本発明の新規移植法は、したがって、ＮＫｐ３０トリガリングを介したＮＫ細
胞活性化に基づく、新規のＮＫ細胞をベースとする免疫療法を構築する。本発明
の方法は、さらに、ＮＫｐ３０と相加的にまたは相乗的に機能できる別のレセプ
ター、例えばＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４のＮＫｐ４６および／または
ＮＫｐ４４による架橋化合物の同時活性化も含んでいてよい。

【００６０】 本発明はしたがって、以下から成る群より選択される少なくとも１種の生成物
を含有する任意の医薬品組成物をも包括する： 本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗体−抗原タイプ化合物
、単離された抗体、固体支持体、本発明のハイブリドーマ、本発明の精製法によ
り得られる単離されたＮＫ細胞（および特に本発明の精製法により移植ドナーか
ら精製された、単離されたＮＫ細胞）、本発明の刺激法により得られるＮＫ細胞
（本発明の刺激法により細胞毒性を刺激した、単離されたＮＫ細胞）を、製薬学
的に利用可能な賦形剤といっしょに含有する。

【００６１】 前記の単離されたＮＫ細胞は、ヒト、特に移植ドナーから集められるか（医薬
品組成物が移植片をもらう宿主有機体へ投与されることを意図する場合）、また
は特にメラノーマ等の腫瘍を有する患者から集められる（医薬品組成物を抗−腫
瘍剤として患者へ投与することを意図する場合）。本発明のこのような医薬品組
成物は、有利に、さらに抗−ＮＫｐ４６および／または抗−ＮＫｐ４４抗体、ま
たはその免疫原性フラグメントまたは誘導体を含有する。本発明の医薬品組成物
は薬剤として使用できる。製薬学的に利用可能な種々の賦形剤は当業者に入手可
能であり；主にガレヌス製剤形および所望の投与経路に応じて、適当な１種を選
択する。ここで「医薬品組成物」とは錠剤、粉末、ペースト、パッチ、顆粒、微
粒子、ナノ粒子、コロイド溶液、水溶液、注射用液、スプレー、リポソーム等の
任意のガレヌス製剤形を意味する。Ｉｎ ｖｉｖｏ治療形式における投与経路に
は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下投与、鼻腔内経路および外科的経
路が含まれる。ガレヌス製剤形は徐放形および／または制限放出形であってもよ
い。

【００６２】 前記の少なくとも１種の生成物を適当に配合し、前記組成物を投与される患者
にとって認容性かつ効果的にする。このような適当な配合は当業者に公知である
；患者が人間である場合、これらには、前記生成物の人体に適用可能なものまた
はキメラ類似体である。またこれには、溶解度および／または化学的および／ま
たはガレヌス製剤特性が所望の投与経路および目的の効果レベルに適応した、製
薬学的に使用可能な賦形剤が含まれる。このような賦形剤には、例えば生理食塩
水またはデキストロース溶液が含まれる。本発明の組成物はさらに任意のバッフ
ァー、および／または任意の安定化剤を含有してよく、当業者は場合に応じて適
切なものを見出す。

【００６３】 前記した少なくとも１種の生成物の有効量は、使用する特定の生成物、患者の
付加的なまたは相乗的な治療薬（例えば抗−ＮＫｐ４６および／または抗−ＮＫ
ｐ４４抗体、またはそのフラグメントあるいは誘導体）の存在および性質、患者
の病状に相関する。有効量は典型的に体重１ｋｇに対して１ｎｇ〜１００ｍｇの
範囲である。

【００６４】 このような医薬品組成物は例えば、移植／外科移植の改善、抗−腫瘍的予防、
軽減、治療、例えばメラノーマ、肝癌、肺の腺癌の予防、軽減、治療、抗−微生
物的予防、軽減、治療、例えば抗−ウイルス的予防、軽減、治療を意図できる。
ここで「軽減」とは、患者の健康を向上させることに相当する任意の生物学的結
果を意味する；これは特に異常細胞の増殖を任意に遅延させることを含む。

【００６５】 有利な態様において、本発明の医薬品組成物は標的のＮＫ細胞毒性を容認する
。このような組成物は、本発明の抗血清−タイプ組成物、本発明の単離された抗
体−抗原タイプ化合物、単離された抗体、固体支持体、本発明のハイブリドーマ
、本発明の精製法により得られる単離されたＮＫ細胞、本発明の刺激法により得
られる単離されたＮＫ細胞から選択される少なくとも１種の生成物（前記生成物
は生理学的条件下に所望の標的と結合できる物質と直接または間接的に結合して
いる）を、製薬学的に使用可能な賦形剤といっしょに含有する。

【００６６】 前記標的物質の例には、抗−腫瘍抗体、抗−微生物抗体、抗−ウイルス抗体、
および同等の機能を有するものが含まれる。標的であるＮＫ細胞毒性のためのこ
のような医薬品組成物はより有利に、抗−腫瘍的予防、軽減、治療を意図し（メ
ラノーマ、肝癌または肺の腺癌）、抗微生物的予防、軽減、治療を意図する。

【００６７】 本発明はまた、ＮＫｐ３０天然リガンドを同定する方法を提供する。この方法
は、抗体、抗体フラグメント、またはＮＫ細胞上の本発明の固体支持体の使用を
含む。本発明はしたがって、ＮＫｐ３０天然リガンドの類似体および／または拮
抗体のための、化学的および／または生物学的ライブラリーのスクリーニングが
可能である。

【００６８】 本発明の抗体、抗体フラグメント、または固体支持体も、ＮＫ−感受性標的細
胞により発現される表面ＮＫｐ３０リガンドのレベルの評価、および測定レベル
の標準生理学的レベルに対する比較を可能にする。この評価は、腫瘍細胞および
／または微生物感染細胞の診断、および適切な予防、軽減、治療ツールの指定を
特に意図する。本発明の抗体、抗体フラグメント、または固体支持体は、したが
って、腫瘍または感染症の診断のための試薬として使用できる。

【００６９】 本発明の特徴を以下の実施例により詳細する。これらの実施例は例証を目的と
するだけであって本発明の概要を制限するものではない。当業者が意図する種々
の形態も本発明に包含される。

【００７０】 これらの実施例において、図１Ａ〜９Ｂを参照する（１９枚の図面シート）。

【００７１】 実施例１：ＮＫｐ３０の同定および分子特徴付け 材料および方法 モノクローナル抗体（ｍＡｂ） 以下のｍＡｂを実験室で製造した：ＪＴ３Ａ（ＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ３）、Ｂ
ＡＢ２８１（Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ
．Ｓａｎｓｅｖｅｒｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、
Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９７．ｐ４６、ａ ｎ
ｏｖｅｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕ
ｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｈｉｃｈ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌ ａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９〜１１３６）およ
びＫＬ２４７（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗−ＮＫｐ４６）、Ｚ２３１（
Ｖｉｔａｌｅ．Ｍ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｌ．Ｓａｎｓｅ
ｖｅｒｉｎｏ、Ｒ．Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ、Ｒ．Ｍａｒｃｅｎａｒｏ、Ｒ．Ａｕ
ｇｕｇｌｉａｒｏ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９
８．ＮＫｐ４４、ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｍ
ｏｌｅｃｕｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｉｎｖｏ
ｌｖｅｄ ｉｎ ｎｏｎ−ＭＨＣ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌ
ｌ ｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５〜２０７２）およびＫ
Ｓ３８（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗−ＮＫｐ４４）、ＫＤ１およびｃ１
２７（それぞれＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１、抗−ＣＤ１６）、ｃ２１８およびＧ
ＰＲ１６５（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ５６）、Ａ６−１３
６（ＩｇＭ、抗−ＨＬＡクラスＩ）（Ｃｉｃｃｏｎｅ Ｅ．、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、
Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ｌ．Ｎａｎｎｉ、Ｃ．Ｄｉ Ｄｏｎａｔｏ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉ
ｎｏ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｏ．Ｖｉａｌｅ、Ａ．Ａｍｏｒｏｓｏ、Ａ．Ｍｏｒ
ｅｔｔａ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９４．Ｓｅｌｆ Ｃｌａｓｓ Ｉ
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ
ｌｙｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｎａｔｕｒａ
ｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：１００３
〜１００６）、ＧＬ１８３（ＩｇＧ１，抗−ｐ５８．２）（Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ
．、Ｇ．Ｔａｍｂｕｓｓｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｇ．Ｔｒｉｐｏｄｉ、Ａ．Ｍ
ｅｒｌｉ、Ｅ．Ｃｉｃｃｏｎｅ、Ｇ．Ｐａｎｔａｌｅｏ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅ
ｔｔａ．１９９０．Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３−ＣＤ１６
＋ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｔ
ｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：６９５〜７１４）、Ｅ
Ｂ６（ＩｇＧ１、抗−ｐ５８．１）（Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎ
ｏ、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、Ｇ．Ｔｒｉｐｏｄｉ、Ｇ．Ｔａｍｂｕｓｓｉ、Ｏ．Ｖｉａ
ｌｅ、Ａ．Ｍ．Ｏｒｅｎｇｏ、Ｍ．Ｂａｒｂａｒｅｓｉ、Ａ．Ｍｅｒｌｉ、Ｅ．
Ｃｉｃｃｏｎｅ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９０．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３−ＣＤ
１６＋ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌ
ｏｎａｌｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｒｆａｃ
ｅ ｍｏｒｅｃｕｌｅｓ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｂｓ
ｅｔ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＮＫ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ａｂｉｌｉ
ｔｙ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ ｒ
ｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１５８９〜１５９８）、
Ｚ１９９（ＩｇＧ２ｂ、抗−ＮＫＧ２Ａ）（Ｓｉｖｏｒｉ Ｓ．、Ｍ．Ｖｉｔａ
ｌｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｅ．Ｍａｒｃｅｎａｒｏ、Ｌ．Ｓａｎｓｅｖｅｒｉ
ｎｏ、Ｓ．Ｐａｒｏｌｉｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔ
ａ、１９９６．ＣＤ９４ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋ
ｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔ ＨＬＡ−ＣＬＡＳＳ−Ｉ ａｌｌｅｌｅｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆｏｒｍ ｏｆ ＣＤ
９４ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２４８７〜２４９２）
。Ｄ１．１２（ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂおよびＨＰ２．６（ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂを、
それぞれ抗−ＨＬＡ−ＤＲおよび抗−ＣＤ４として使用した。

【００７２】 新規ｍＡｂは、一般的に、ＮＫクローン（ＥＣ１およびＳＡ２６０、それぞれ
Ａ７６およびＺ２５ｍＡｂに対する）またはポリクローナルＮＫ細胞群（ＡＺ２
０ｍＡｂに対する）のいずれかの活性化（ＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋）
ＮＫ細胞で５週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫化することにより、最初に誘導さ
れた。種々の細胞融合の後、ＦｃγＲ＋Ｐ８１５標的細胞に対する転嫁殺傷アッ
セイで溶解を誘導する能力によって、ｍＡｂを選択した。適当なｍＡｂには、（
ｉ）ＭＨＣクラスＩネガティブ標的、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、同種異系細
胞に対する天然細胞毒性、（ｉｉ）抗体−被覆標的細胞に対する細胞毒性、（ｉ
ｉｉ）細胞質内Ｃａ²⁺濃度の増加、（ｉｖ）ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＬＡＴ、ＳＬ
Ｐ７６、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ホスホリパーゼＣ−ガンマ酵素、ホスファチジル−
イノシトール３−キナーゼ等の細胞質内アダプター／エフェクター分子のチロシ
ンホスホリル化の誘導、（ｖ）レセプター−関連形質移入鎖ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ
１２またはＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマのホスホリル化、（ｖｉ）インター
フェロンガンマ、腫瘍壊死因子、ＩＬ５、ＩＬ１０、ケモカイン（ＭＩＰ−１ア
ルファ）、ＴＧＦベータ等のサイトカイン分泌、（ｖｉｉ）ＣＤ６９およびＰＥ
Ｎ５等のＮＫ表面分子の、それぞれアップレギュレーションまたはダウンレギュ
レーションにより推定されるＮＫ細胞活性化を統計的に顕著に増加（ｐ＜０．０
５）させるｍＡｂが含まれる。好ましいｍＡｂは、例えば前記ｍＡｂの不在下に
エフェクターＮＫ細胞が起こす塩基性標的細胞の溶解と比較して、エフェクター
：標的（Ｅ／Ｔ）比１：１で、標的細胞の溶解を少なくとも約５倍に増加させる
。したがって３種類のｍＡｂが選択された：Ａ７６；Ｚ２５；ＡＺ２０。ハイブ
リドーマ産生ＡＺ２０は、２０００年１１月８日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．へ寄託され
た（Ｉ−２５７６）。

【００７３】 末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の精製およびポリクローナルまたはクローナルＮ
Ｋ細胞群の生成 末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）は、フィコールハイパーク勾配およびプラスチッ
ク付着細胞の除去により健康なドナーから誘導された。多くのＮＫ細胞を得るた
めに、ＰＢＬを抗−ＣＤ３（ＪＴ３Ａ）、抗−ＣＤ４（ＨＰ２．６）および抗−
ＨＬＡ−ＤＲ（Ｄ１．１２）ｍＡＢと（４℃で３０分）、さらにヤギ抗−マウス
被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）と（４℃で３
０分）インキュベートし、イムノマグネティック除去した（Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．、
Ｌ．Ａｃｃａｍｅ、Ｌ．Ｐａｒｅｔｉ、Ａ．Ｍａｚｚｏｃｃｈｉ、Ａ．Ｍｏｒｅ
ｔｔａ、Ｇ．Ｐａｒｍｉａｎｉ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｔｈ
ｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃ
ｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｐｏ
ｓｉｔｉｖｅ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ＨＬＡ
ｃｌａｓｓ Ｉ ａｌｌｅｌｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２３８
４〜２３９４；Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、
Ｌ．Ｓａｎｓｅｖｅｒｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ
、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９７．ｐ４６、ａ
ｎｏｖｅｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓ
ｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｈｉｃｈ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｓｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９〜１１３６；Ｖ
ｉｔａｌｅ，Ｍ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｌ．Ｓａｎｓｅｖ
ｅｒｉｎｏ、Ｒ．Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ、Ｒ．Ｍａｒｃｅｎａｒｏ、Ｒ．Ａｕｇ
ｕｇｌｉａｒｏ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８
．ＮＫｐ４４、ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏ
ｌｅｃｕｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｉｎｖｏｌ
ｖｅｄ ｉｎ ｎｏｎ−ＭＨＣ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ
ｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５〜２０７２）。ＣＤ３^-
４^-ＤＲ^-細胞は、細胞溶解アッセイに使用されるかまたは１００Ｕ／ｍｌ ｒＩ
Ｌ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌ
ｅ、ＵＳＡ）および１．５ｎｇ／ｍｌ ＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｔｄ．Ｐａｉｓ
ｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｐｏｌｙ
ｃｌｏｎａｌ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｒ，ａｆｔｅｒ
ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）、ＮＫ細胞クローン（Ｍｏｒｅｔｔａ，
Ａ．１９８５．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｈｅｎｏｔｙ
ｐｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄ
ｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５１：１４８〜１５５）の存在下に、照射供給細胞上で培養される。

【００７４】 蛍光フローサイトメトリー分析 細胞を適当なｍＡｂとＰＥ−またはＦＩＴＣ−結合イソタイプ−特異的ヤギ抗
−マウス２次試薬で染色した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）。サンプルを１色−ま
たは２色細胞蛍光分析（ＦＡＣＳｃａｎ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
＆ Ｃｏ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により、以前に記載されるよう
にして（例えばＭｏｒｅｔｔａ Ａ．、Ｇ．Ｔａｍｂｕｓｓｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉ
ｎｏ、Ｇ．Ｔｒｉｐｏｄｉ、Ａ．Ｍｅｒｌｉ、Ｅ．Ｃｉｃｃｏｎｅ、Ｇ．Ｐａｎ
ｔａｌｅｏ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９０．Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｒ
ｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏ
ｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３−ＣＤ１６＋ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌ
ｌｓ．Ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１７１：６９５〜７１４）分析した。

【００７５】 細胞系および細胞溶解アッセイ 使用されるＦｃγＲ−ネガティブ標的は以下のものである：ＭＥＬ１５（ＭＥ
Ｌ１５３９２、ヒトメラノーマ）（Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．、Ｌ．Ａｃｃａｍｅ、Ｌ．
Ｐａｒｅｔｉ、Ａ．Ｍａｚｚｏｃｃｈｉ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｇ．Ｐａｒｍｉ
ａｎｉ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂ
ｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅ
ｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｌａ
ｎｏｍａｓ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓ
ｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｌｌ
ｅｌｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２３８４〜２３９４）；Ｍ１４
（ヒトメラノーマ）（Ｐｅｓｓｉｎｏ，Ａ．、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔ
ｉｎｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、
Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｍｏｒｅｃｕ
ｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＮＫｐ４６：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ
ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎ
ｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏ
ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３〜９６０）；ＳＭＭＣ
（ヒト肝癌）（Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｅ
．Ｍａｒｃｅｎａｒｏ、Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、Ｌ．Ｍｏ
ｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９９．ＮＫｐ４６ ｉｓ ｔｈ
ｅ ｍａｊｏｒ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ
ｉｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｆｒｅｓ
ｈ ｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃ
ｅｌｌｓ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｎ
ｓｉｔｙ ｏｆ ＮＫｐ４６ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉ
ｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ，ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｏｒ
ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２９：１６５６〜１６６６）；Ａ５４９（ヒト肺の腺癌；ＡＴＣＣ番号ＣＣ
Ｌ−１８５．１）；ＦＯ−１および１１７４ｍｅｌ（ヒトメラノーマ）；ＡＵＭ
Ａ（ヒトメラノーマ）。

【００７６】 使用されるＦｃγＲ−ポジティブ標的はＰ８１５（マウスの肥満細胞腫）であ
った。正常標的細胞として使用されるＰＨＡ−Ｂｌａｓｔｓは、ＰＢＬをＰＨＡ
（Ｇｉｂｃｏ）１．５ｎｇ／ｍｌと培養することにより得られた。

【００７７】 細胞を、前記されるような４−ｈ⁵¹Ｃｒ放出アッセイにより、種々のｍＡｂの
不在または存在下に、細胞溶解活性を試験した（Ｍｏｒｅｔｔａ Ａ．、Ｃ．Ｂ
ｏｔｔｉｎｏ、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、Ｇ．Ｔｒｉｐｏｄｉ、Ｇ．Ｔａｍｂｕｓｓｉ、
Ｏ．Ｖｉａｌｅ、Ａ．Ｍ．Ｏｒｅｎｇｏ、Ｍ．Ｂａｒｂａｒｅｓｉ、Ａ．Ｍｅｒ
ｌｉ、Ｅ．Ｃｉｃｃｏｎｅ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９０．Ｉｄｅｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｃ
Ｄ３−ＣＤ１６＋ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｃｌｏｎａｌｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓ
ｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｒｕｌｅｓ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｓｕｂｓｅｔ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＮＫ ｃｌｏｎｅｓ ｎａｄ
ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｌｌｏａｎｔｉ
ｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｅｓｐ．Ｍｅｄ．１７２：１５８９〜１
５９８；Ｓｉｖｏｒｉ，Ｓ．、Ｄ．Ｐｅｎｄｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｅ．Ｍａ
ｒｃｅｎａｒｏ、Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔ
ｔａ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９９．ＮＫｐ４６ ｉｓ ｔｈｅ ｍ
ａｊｙｏ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ
ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ｏ
ｒ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ
ｓ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｎｓｉｔ
ｙ ｏｆ ＮＫｐ４６ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
ａｇａｉｎｓｔ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ，ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｏｒ ｘｅｎ
ｏｇｅｎｅｉｃ ｔｅｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２
９：１６５６〜１６６６）。種々のｍＡｂの濃度はマスキング実験のために１０
μｇ／ｍｌであり、転嫁殺傷実験のために０．５μｇ／ｍｌである。Ｅ／Ｔ比は
本文中に示される。適当なｍＡｂには、その不在下に観察される細胞溶解活性を
顕著に増加させるｍＡｂが含まれる。顕著な増加の適当な例には、前記ｍＡｂの
不在下での細胞溶解活性と比較した場合の、前記ｍＡｂの存在下のエフェクター
：標的比１：１での細胞溶解活性を少なくとも約５倍増加させることが含まれる
。

【００７８】 細胞内遊離カルシウム［Ｃａ⁺⁺］ｉ増加の測定 ［Ｃａ⁺⁺］ｉの測定を前記のようにして実施した（Ｐｏｇｇｉ Ａ．、Ｒ．Ｐ
ａｒｄｉ、Ｎ．Ｐｅｌｌａ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｍ．Ｖｉ
ｔａｌｅ、Ｖ．Ｒｅｖｅｌｌｏ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔ
ｔａ．１９９３．ＣＤ４５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ＬＦＡ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅ
ｒ ｃｅｌｌｓ．Ａｎｔｉ−ＣＤ４５ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｖｉａ ＬＦＡ１ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２３：２４４５〜２４６３）。Ｆｕｒａ−２−ラベルＮＫ細胞を飽
和量の抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ（ＡＺ２０）または培地単独と４℃で３０分インキ
ュベートした。親和精製したヤギ抗−マウス抗血清（ＧＡＭ）（ＩＣＮ Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌｓ、Ａｕｒｏｒａ、Ｏｈｉｏ）２０μｇ／ｍｌを含むキュベット
中へ添加することにより、このレセプターの架橋が起こる。

【００７９】 ＮＫｐ３０分子の生物学的特徴付け 内在性ＮＫ細胞膜タンパク質（Ｂｏｒｄｉｅｒ，Ｃ．１９８１．Ｐｈａｓｅ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ ｉｎ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２５６：１６０４〜１６０６）を以下のようにして調製した：２５
×１０⁶個の細胞を、ＴＸバッファー中（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー
、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）で、４℃で３
０分溶解し、遠心分離した（５’、１０，０００ＲＰＭ）。上清を３７℃で１０
分放置し、遠心分離し、下層をＴＸバッファー中に１：２で再懸濁し、溶解液を
透明にするために４℃で１０分放置した。その後、懸濁液を３７℃で１０分放置
し、遠心分離し、下層をＥＢ（０．０６２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％
グリセロール、２．３％ ＳＤＳ）中に１：３で再懸濁した。サンプルを不連続
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃ
ｏｒｐ．Ｂｅｄｆｏｒｍ、ＭＡ）へ移行させ、ＡＺ２０ｍＡｂ、次いでウサギ抗
−マウスＨＲＰＯ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＮＫｐ３０−特
異的抗血清、さらにロバ抗−ウサギＨＲＰＯ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎ
ｇａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で調査した。Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を検出のため
に使用した。

【００８０】 ＮＫｐ３０ポリクローナル抗血清 ２．５ｋｇのＨＹ／Ｃｒ雄ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、ＫＬＨ
と結合した（Ｐｅｎｄｅ Ｄ．、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、Ｃ．Ｃａｎｔｏｎｉ、
Ｓ．Ｖｅｒｄｉａｎｉ、Ｍ．Ｆａｌｃｏ、Ｃ．ＤｉＤｏｎａｔｏ、Ｌ．Ａｃｃａ
ｍｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ
、１９９６．Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＨＬＡ．Ａ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ；ａ ｎｏ
ｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５８／ｐ７０ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ
ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ａ １４０ｋＤ
ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｍｅｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
４：５０５〜５１８）１５ａａペプチドＷＶＳＱＰＰＥＩＲＴＬＥＧＳＣ（配列
番号：７：ＮＫｐ３０タンパク質配列配列番号：２中のアミノ酸位置２０〜位置
３３由来、加えてＫＬＨへ結合するためのＣアミノ酸）１００μｇ／１００μｌ
で免疫化した。最初に１００μｌの完全フロイントアジュバントで、それ以外は
全て１００μｌの不完全フロイントアジュバントで、４週間処理を行った。最後
の処理から１週間後に、血液１０ｍｌを採り、免疫化したペプチドおよび無関係
なペプチドに対するＥＬＩＳＡにより、血清を試験し力価測定した。

【００８１】 ＮＫｐ３０シグナル伝達複合体の分析 ＮＫ細胞（１０⁸）をナトリウムペルバナデート１００μＭで刺激するかまた
は刺激せず（Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、
Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｓ
．Ｐａｒｏｌｉｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｒ．
Ｂｉａｓｓｏｎｉ、１９９９．ＮＫｐ４４、ａ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂ
ｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌ
ｌｓ，ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏ
ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７
８７〜７９６）、１％ジギトニン溶解物をＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ−ｃｏｕｐｌｅｄ ＫＤ１（抗−ＣＤ１６）ｍＡｂで５回前処理した。次に
溶解物をＳｅｐｈａｒｏｓｅ−ＣＮＢｒ−結合Ｚ２３１およびＢＡＢ２８１ｍＡ
ｂまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ｃｏｕｐｌｅｄ ＮＫｐ３
０−特異的ウサギ抗血清およびウサギ免疫前血清で免疫沈降させた。サンプルを
還元条件下に（５％、２Ｍｅ）１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、Ｉｍｍｏｂｉ
ｌｏｎ Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ移行し、抗−ホスホチロシンｍＡｂ（ＰＹ
２０−ＨＲＰＯ、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅ
ｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）または抗−ＣＤ３ζｍＡｂ（２Ｈ２、Ｉｍｍｕｎｏｔｅ
ｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、次いでウサギ抗−マウスＨＲＰＯ
（ＤＡＫＯ）で調査した。Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＫＥＮ）を検出のために使用した。

【００８２】 ＣＯＳ−７細胞中でのｃＤＮＡ発現によるライブラリースクリーニング ２人の健康なドナーから前記のようにして得たＩＬ−２−活性化ポリクローナ
ルＮＫ細胞から抽出したＲＮＡを使用して、発現ｃＤＮＡライブラリーをＶＲ１
０１２プラスミド中で（Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．、ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）調
製した（Ｐｅｓｓｉｎｏ，Ａ．、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．
Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｒ．Ｂｉａｓ
ｓｏｎｉ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ｏｆ ＮＫｐ４６：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ
ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ
ｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉ
ｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３〜９６０、Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．、
Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ、Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇ
ｌｉａｒｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｓ．Ｐａｒｏｌｉｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔ
ｔａ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ．１９９９．ＮＫｐ
４４、ａ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ
ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ
Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ，ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍ
ｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌ
ｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７８７〜７９６）。

【００８３】 ライブラリースクリーニング法は記載の通りである（Ｐｅｓｓｉｎｏ，Ａ．、
Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、Ｌ．Ｍｏｒ
ｅｌｌｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、ａｎｄ Ａ．Ｍｏｒｅ
ｔｔａ．１９９８．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＮＫｐ４６：
ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ
ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
８：９５３〜９６０、Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ｍ．Ｖｉｔ
ａｌｅ、Ａ．Ｐｅｓｓｉｎｏ、Ｒ．Ａｕｇｕｇｌｉａｒｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉ
ｎａ、Ｓ．Ｐａｒｏｌｉｎｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａｎ
ｄ Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ．１９９９．ＮＫｐ４４、ａ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓ
ｉｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ
ｃｅｌｌｓ，ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕ
ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９
：７８７〜７９６、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ，Ｒ．Ｈ．、Ｍ．Ｇｅｒｒｅｔｓｅｎ
、Ｅ．Ｍ．Ｃ．Ｋｎｉｐｐｅｌｓ、Ｍ．ｖａｎ Ｄｉｊｋ、Ｈ．ｖａｎ Ｅｓｓ
ｅｎ、Ｄ．Ｏ．Ｗｅｇｈｕｉｓ、Ｒ．Ｊ．Ｓｉｎｋｅ、Ｇ．Ｂ．Ｓｎｏｗ、ａｎ
ｄ Ｇ．Ａ．Ｍ．Ｓ．ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ．１９９５．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ
Ｅ４８ ａｎｔｉｇｅｎ，Ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｈｅ
ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙ−６ ａｎｔｉｇｅｎ ＴｈＢ，ｉｓ ａ ＧＰＩ−ａｎ
ｃｈｏｒｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ
ｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２９：１６７７〜１６８９）。手短に言えば、ｃＤＮ
ＡライブラリーをＣＯＳ−７細胞へ一時的に形質移入し、ポジティブプールの選
択を、特異的抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂＡ７６を使用した免疫細胞化学染色およびｓ
ｉｂ−選択により実施した。

【００８４】 ＤＮＡシークエンシング ＤＮＡシークエンシングを、ｄ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔおよび３７７ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉ
ｔｙ、ＣＡ）を用いて実施した。

【００８５】 一時的移入 ＣＯＳ−７細胞（５×１０⁵／プレート）を、ＶＲ１０１２−ＮＫ−Ａ１（ク
ローン５Ｃ）またはベクター単独を用いて、記載のようなＤＥＡＥ−デキストラ
ンまたはエレクトロポレーション法により形質移入した（Ｐｅｎｄｅ Ｄ．、Ｒ
．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、Ｃ．Ｃａｎｔｏｎｉ、Ｓ．Ｖｅｒｄｉａｎｉ、Ｍ．Ｆａｌ
ｃｏ、Ｃ．ＤｉＤｏｎａｔｏ、Ｌ．Ａｃｃａｍｅ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍ
ｏｒｅｔｔａ、ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９６．Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａ
ｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ
ＨＬＡ．Ａ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈ
ｅ ｐ５８／ｐ７０ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ
ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｉｓ ｅ
ｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ａ １４０ ｋＤ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋ
ｅｄ ｄｉｍｅｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：５０５〜５１８）。４８時間
後、形質移入細胞を細胞蛍光分析のために使用した。

【００８６】 ノーザンブロッティングによるＮＫｐ３０転写発現の分析 造血器起源の様々な細胞系でのＮＫｐ３０転写発現を分析するために、ＲＮＡ
を未変性アガロースゲル電気泳動により大きさで細分し、プラスに荷電したナイ
ロン膜上（ＮＥＮ）に移行した。特に、ＣｓＣｌ勾配を用いて調製した全ＲＮＡ
１０μｇまたはＯｌｉｇｏｄＴ磁気ビーズ分離（Ｄｙｎａｌ）を用いて調製した
ポリＡ⁺ＲＮＡ２μｇを、各レーンに負荷した。非常にストリンジェントな条件
下に、記載のようにしてノーザンブロッティングを実施した（Ｂｉａｓｓｏｎｉ
，Ｒ．、Ｓ．Ｆｅｒｒｉｎｉ、Ｉ．Ｐｒｉｇｉｏｎｅ、Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ、ａ
ｎｄ Ｅ．Ｏ．Ｌｏｎｇ．１９８８．ＣＤ３−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｙｍｐｈｏ
ｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅ
ｓｓ ｔｈｅ ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ−ｇｅｎｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
０：１６８５〜１６８９）。各プライマー２５ｐｍｏｌを用いてＰＣＲ増幅を３
０サイクル実施し（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒）、次い
で７２℃で７分インキュベートすることにより、ＮＫｐ３０の４２１ｂｐ ｃＤ
ＮＡプローブ（配列番号：１０）を得た。プライマーの配列は以下の通りである
：ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＧＣ
ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＴＴ Ｇ（ＮＫｐ３０上向、配列番号：８）およ
びＧＡＣ ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＣＣ
ＣＴＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＴ Ｇ（ＮＫｐ３０下向；配列番号：９）。ｃ
ＤＮＡフラグメント配列番号：１０はランダムプライミングにより³²Ｐ−標識さ
れた（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｊ．Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ．１９８２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。

【００８７】 ＮＫｐ３０ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅 ポリクローナルＮＫおよびＴ細胞群およびクローンならびに種々の造血細胞系
由来のＲＮＡｚｏｌ（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を
用いて抽出した全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライミングを使用して逆転写した。Ｎ
Ｋｐ３０のｃＤＮＡ増幅のために使用したプライマー（６０６ｂｐ；配列番号：
１２）は以下の通りである：５’ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＴ Ｔ
ＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＴＴ Ｇ（ＮＫｐ
３０上流；配列番号：８）および５’ＧＡＴ ＴＴＡ ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＣＴ
ＴＴＴ ＧＡＡ Ｇ（リバースプライマー；配列番号：１１）。各プライマー
２５ｐｍｏｌで３０サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０
秒）、次いで７２℃で７分のインキュベーションにより、増幅を実施した。増幅
産物をＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ，ＣＡ）によりｐＣＲ２．１中でサブクローニングし、次いで配列決定し
た。

【００８８】 Ｚｏｏ−ブロット分析 ＮＫｐ３０遺伝子の種間保存（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｎｓｅｒｖ
ａｔｉｏｎ）の分析を、Ｚｏｏ−ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ、ＣＡ）により実施した。サザンブロッティングは、ヒト、アカゲザル、Ｓ
Ｄラット、ＢＡＬＢ／ｃマウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅイースト菌由来のゲノムＤＮＡを含有す
る。ハイブリダイゼーションプローブは、ノーザンブロッティングのハイブリダ
イゼーションに使用したのと同一の４２１ｂｐのｃＤＮＡフラグメントであった
（配列番号：１０）。記載のようにして、あまりストリンジェントでない条件で
洗浄を実施した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｊ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。

【００８９】 結果 新規ＮＫ−特異的トリガリング表面分子の同定 マウスをＣＤ３^-、１６⁺、５６⁺ＮＫ細胞クローンまたは集群で免疫化した。
エフェクター細胞としてポリクローナルＮＫ細胞群またはクローンを用いた転嫁
殺傷アッセイ中で、そのＦｃγＲ＋Ｐ８１５標的細胞の溶解を誘導する能力に応
じて、様々な融合体由来のモノクローナル抗体を最初に選択した。３種類のｍＡ
ｂ、Ａ７６、ＡＺ２０およびＺ２５（全てＩｇＧ１イソタイプ）が選択され、こ
れらは、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４を含む公知のトリガリングＮＫ
レセプターに特異的な他のｍＡｂで導かれるのと同様の強い細胞溶解活性を誘導
する（図１Ａ）（Ｅ：Ｔ＝１：１で、ｍＡｂの不在下に観察される細胞溶解活性
の５倍以上の細胞溶解活性増加）。図１Ｂにおいて、様々な量のＡＺ２０ｍＡｂ
で誘導されるＮＫ細胞の細胞毒性を、抗−ＣＤ１６または抗−ＣＤ５６ｍＡｂに
相当するイソタイプの場合と比較する。ＡＺ２０ｍＡｂに対する細胞溶解応答は
、抗−ＣＤ１６ｍＡｂにより誘導されるものと類似するが、抗−ＣＤ５６ｍＡｂ
では効果が見られない。さらに、図１Ｃに示すように、ＡＺ２０ｍＡｂで刺激し
た後に、代表的なクローン３Ｍ１６中で、顕著な細胞内［Ｃａ⁺⁺］の増加が認め
られた。特に、この抗体で誘導される［Ｃａ⁺⁺］ｉの増大は、活性化レセプター
を効果的に架橋するヤギ抗−マウス２次試薬の存在下にのみ誘起される。

【００９０】 Ａ７６、ＡＺ２０およびＺ２５ｍＡｂにより認識できる分子の細胞表面分布の
分析を間接的免疫蛍光法およびＦＡＣＳ分析で実施したところ、異なるドナー由
来の種々の活性化されたポリクローナルまたはクローナルＮＫ細胞群により反応
性が見出された（下記参照）。これらには稀少なＣＤ１６−ネガティブＮＫ細胞
クローンも含まれる。これとは異なり、ＰＨＡ−誘導ポリクローナルＴ細胞群ま
たはＴＣＲα／βおよびγ／δＴ細胞クローン（異なるドナー由来）ではｍＡｂ
の反応性は検出されなかった。ＥＢＶ−誘導Ｂ細胞系、単球およびＤＣ系ならび
にＨＬ６０、Ｕ９３７、Ｅｏ／Ａ３、ＴＨＰ−１、Ｄａｕｄｉ、Ｊｕｒｋａｔ、
ＩＧＲＯＶおよび標的細胞として使用される様々な腫瘍細胞系の全種類を含む種
々の造血および非−造血腫瘍細胞系でも反応性は検出されなかった。

【００９１】 近年、数人のドナー由来のポリクローナルＮＫ細胞群がＮＫｐ４６分子の蛍光
強度の複峰性分布（ＮＫｐ４６^brightおよびＮＫｐ４６^dull）により特徴付けら
れ、これらの個人に由来するＮＫクローンが安定なＮＫｐ４６^brightおよびＮＫ
ｐ４６^dull表現型を発現することが見出された。重要なのは、ＮＫ感受性の標的
細胞に対するＮＫ細胞クローンの細胞溶解活性がそのＮＫｐ４６表現型に強く相
関することである。異なるパターンのＮＫｐ４６発現を示す個人に由来するポリ
クローナルＮＫ細胞群およびＮＫ細胞クローン上の新規ｍＡｂの反応性を分析し
た。図２Ａに示すように、代表的ドナーＡＭに由来するポリクローナルＮＫ細胞
群は、ＡＺ２０または抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂで染色すると均質的にブライトな表
現型を示す。これと異なり、ドナーＣＢに由来するポリクローナルＮＫ細胞では
、同一のｍＡｂで染色した結果、蛍光は複峰性の分布を示した。特に、ＣＢドナ
ーでは、同一の蛍光強度パターンが、新に精製したＮＫ細胞中でも検出された（
図２Ａ）。さらに、ドナーＣＢ由来の幾つかのクローンの分析で、ＮＫｐ４６^{br ight} クローンは一貫してＡＺ２０^brightであり、これに対してＮＫｐ４６^dullク
ローンは常にＡＺ２０^dull表現型を示すことが明かとなった（図２Ｂ）。

【００９２】 新たに単離されたリンパ球中での新規ｍＡｂの反応性のパターンを決定するた
めに、異なる個人に由来するＰＢＬを有益なｍＡｂを使用して二重蛍光分析する
ことにより評価した。代表的ドナーを図３Ａに示す：ＡＺ２０ｍＡｂにより認識
される表面分子は選択的にＣＤ５６⁺細胞上で発現した。さらに多くのＡＺ２０⁺ 細胞はＣＤ１６分子を同時発現した。これと異なり、ＡＺ２０ｍＡｂはＣＤ３⁺
Ｔリンパ球またはＨＬＡ−ＤＲ⁺Ｂリンパ球を染色しなかった。このドナー中で
検出されるＣＤ５６⁺ＡＺ２０^-細胞群も表面ＣＤ３分子を発現することが見出さ
れた。したがって、新たに誘導されたリンパ球でも、ＡＺ２０ｍＡｂの反応性は
抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂの反応性とオーバーラップする。ＮＫｐ４６およびＡＺ２
０ｍＡｂ−反応性分子の表面発現の直接比較分析を図３Ａに示す。２種類の分子
が同一の細胞サブセットにより明らかに同時発現した。しかし、ＡＺ２０および
抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂにより染色された細胞中で対角分布は検出できず、これに
対して、細胞を異なるイソタイプの２種類の抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂで同時に染色
した場合にこの種の蛍光分布が起きた。

【００９３】 特に、ＡＺ２０ｍＡｂに関して記載されたのと同一の結果がＡ７６およびＺ２
５ｍＡｂで得られた。これらのデータは、新規ｍＡｂで認識される分子がＮＫｐ
４６とは異なることを示唆した。この可能性を直接評価するために、ＮＫｐ４６
ｃＤＮＡで一時的に形質移入したＣＯＳ−７細胞を、そのＡＺ２０、Ａ７６およ
びＺ２５ｍＡｂとの反応性について分析した。種々の抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂと反
応させる間、細胞形質移入体はＡＺ２０、Ａ７６およびＺ２５ｍＡｂにより染色
されなかった。Ａ７６、ＡＺ２０およびＺ２５ｍＡｂはしたがって全ての成熟ヒ
トＮＫ細胞を規定するが、ＮＫｐ４６とは異なる新規表面分子に特異的であるこ
とが分かる。

【００９４】 ＡＺ２０、Ａ７６およびＺ２５ｍＡｂにより認識される表面分子の生物学的特
徴付けを分析するために、ＮＫ群を¹²⁵Ｉまたはビオチンで表面標識し、１種の
または別のｍＡｂで免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。このような条件
下に、特異的バンドは検出されなかった。したがって、内在性膜タンパク質をＮ
Ｋ細胞から調製し、さらにウェスタンブロッティングで種々のｍＡｂの可能な反
応性を分析した。図３Ｂに示すように、ＡＺ２０ｍＡｂは特異的に〜３０ｋＤの
分子と反応し、以後ＮＫｐ３０と名付けた。同一の条件下に、Ａ７６およびＺ２
５ｍＡｂの双方はより低い反応性を示した。

【００９５】 ＮＫｐ３０の架橋は、新たに誘導されたＮＫ細胞中でも細胞溶解活性を誘導す
る ＮＫｐ３０分子が新たなＮＫ細胞上に発現したので、これが細胞の細胞溶解活
性を誘起できるかどうかを分析した。図４Ａに示すように、ＡＺ２０、Ａ７６お
よびＺ２５ｍＡｂはＰ８１５標的細胞に対する細胞溶解活性を著しく増加させ、
これに対して抗−ＣＤ５６ｍＡｂに相当するイソタイプは効果を示さなかった。
このトリガリング効果は抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂで得られる効果に匹敵した。さら
に、この実験で、ＡＺ２０Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの使用は、細胞溶解活性
のトリガリングを誘導せず、このことはｍＡｂ−依存性ＮＫｐ３０刺激が、標的
細胞上でＦｃγＲにより媒介される効率的な架橋を必要とすることを示している
。

【００９６】 正常または腫瘍細胞に対する天然細胞毒性の誘導へのＮＫｐ３０の関与 先のデータは、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ４４のｍＡｂ−媒介性のマスキングが
活性化ＮＫ細胞による非ＭＨＣ−制限腫瘍細胞溶解を阻害することを示した。さ
らに、ＮＫｐ４６のマスキングはまた、新たに単離された末梢血液ＮＫ細胞によ
り媒介される天然細胞毒性を阻害した。ＮＫｐ３０のマスキングが新たに誘導さ
れたＮＫ細胞またはＮＫクローンにより媒介される、ＦｃγＲ−ネガティブ腫瘍
標的細胞のパネルに対する細胞溶解活性に影響を及ぼすことが出来るかどうかを
調べた。図４Ｂに示すように、抗−ＣＤ５６ｍＡｂに相当するイソタイプではな
くて、抗ＮＫｐ３０ｍＡｂが、ＨＬＡクラスＩネガティブ１１７４ｍｅｌ、ＡＵ
ＭＡおよびＦＯ−１メラノーマ細胞系に対する、新たなＮＫ細胞によって媒介さ
れる天然細胞毒性を阻害した。抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂを抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂと
組み合わせて使用した場合に付加的なより優れた阻害効果が認められた。ＮＫｐ
３０およびＮＫｐ４６はしたがって、新たなＮＫ細胞の天然細胞毒性をトリガリ
ングする際に相互に依存して働くレセプターである。

【００９７】 これらのデータから、活性化ＮＫ細胞により殺傷される腫瘍細胞上のＮＫｐ３
０のｍＡｂ−媒介性のマスキングの効果をさらに分析した。図５は、２種のメラ
ノーマ（ＭＥＬ１５およびＭ１４）、肝癌（ＳＭＭＣ）および肺の腺癌（Ａ５４
９）を含む種々の腫瘍標的に対する細胞溶解アッセイで分析された３種類の代表
的ＮＫ細胞クローンを示す。これまでの研究で、Ｍ１４メラノーマに対する細胞
溶解活性が、ＮＫｐ４６^bright表現型を示すＮＫクローンに限定されかつＮＫｐ
４６レセプターのｍＡｂ−媒介性のマスキングにより阻害できることを示した。
これに対してＮＫｐ４６^brightクローンはＭＥＬ１５をも殺傷するが、ＮＫｐ４
６またはＮＫｐ４４のマスキングはその細胞溶解活性をそれほど阻害しなかった
。前記のように、ＮＫｐ３０はＮＫｐ４６^brightクローン中で明かに発現する；
したがってＮＫｐ３０がＭＥＬ１５標的細胞の殺傷に重要な役割を果たしている
かもしれないと考えられる。実際、図５に示すように、抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂは
ＭＥＬ１５細胞のＮＫ−媒介性の溶解を明かに阻害した（＞５０％の阻害）。抗
−ＮＫｐ４６ｍＡｂは僅かな効果を示すが、抗−ＣＤ５６ｍＡｂに相当するイソ
タイプでは効果を示さなかった。これとは異なり、Ｍ１４メラノーマは抗−ＮＫ
ｐ４６ｍＡｂにより阻害されるが、抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂは実際には効果がなか
った。したがって、ＮＫｐ４６がＭ１４の溶解に関する腫瘍レセプターとして現
れるのに対して、ＮＫｐ３０はＭＥＬ１５の殺傷に中心的役割を果たす。

【００９８】 ＳＭＭＣおよびＡ５４９等の別の腫瘍標的細胞に対する細胞溶解アッセイに関
する同一ＮＫクローンの分析（図５）は、細胞毒性誘導に対してＮＫｐ４６とＮ
Ｋｐ３０とが同等に寄与することを明かにした。実際、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ
３０単独のｍＡｂ−媒介性マスキングではある程度の阻害効果しか起こらないの
に対して、２分子を同時にマスキングすると顕著に阻害された。これらの結果は
、２種類のレセプターが特定の標的細胞に対する細胞毒性の誘導に相乗効果を持
って影響を及ぼすことを示している。更なる分析により、ＮＫｐ３０が、ＮＫ−
媒介性細胞毒性の誘導において、ＮＫｐ４６だけでなくＮＫｐ４４とも相加効果
的または相乗効果的に働くことが分かった。図６Ａは、代表的ＮＫクローンであ
るＭＩＬ６９のＦＯ−１またはＡ５４９腫瘍細胞に対する細胞溶解活性を示して
いる。標的細胞の溶解はＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６レセプターの
ｍＡｂ−媒介性マスキングにより部分的にのみ阻害された。しかし、２種類のレ
セプターを組み合わせてマスキングするとより高い効果が得られ、３種類のレセ
プターを同時にマスキングすると最大の阻害が得られた。抗−ＣＤ５６ｍＡｂに
相当するイソタイプは、単独でまたは他のｍＡｂと組み合わせて使用しても、阻
害効果を示さなかった。ＮＫｐ３０単独または他のレセプターを組み合わせた場
合の役割を、正常標的細胞源としてＰＨＡ−誘導Ｔ細胞芽細胞を使用した細胞溶
解アッセイにおいて分析した。この実験で、ＮＫ細胞クローンによる自己細胞の
溶解は、標的細胞上のＨＬＡクラスＩ分子のｍＡｂ−媒介性マスキングでＮＫ細
胞上に発現したＨＬＡクラスＩ特異的阻害レセプターとの相互作用を混乱させる
ことにより達成される。これらの実験条件でも、１種類のレセプターのｍＡｂ−
媒介性マスキングでは細胞毒性に対して部分的な効果しか得られなかった（図６
Ｂ）。これに対して、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４レセプターの同
時のマスキングは標的細胞の溶解を顕著に抑制した（または実際に阻止した）（
代表的クローンＭＸ３６１またはＰ９参照）。

【００９９】 これらのデータは、これらのレセプターによって認識されるリガンドが腫瘍だ
けでなく正常細胞中でも発現することを意味している。

【０１００】 最後に、マウスの標的細胞の認識におけるＮＫｐ３０の可能な関与について分
析した。ＮＫｐ３０のｍＡｂ−媒介性マスキングはＢＷ１５０２およびＹＡＣ−
１のマウス胸腺腫瘍細胞のいずれの溶解にも効果を示さなかった。

【０１０１】 前記のデータを考え合わせると、主要レセプターであるＮＫｐ３０の機能が、
正常標的細胞および多くのしかし全てではない腫瘍細胞に対するＮＫ媒介性細胞
毒性に関与することを示している。さらに、ＮＫｐ３０はＮＫｐ４６およびＮＫ
ｐ４４と協力して働いてもよく、これは多くの場合、分析される標的細胞による
特異的なリガンドの発現に応じてなされると考えられる。

【０１０２】 ＮＫｐ３０分子をコードするｃＤＮＡの分子クローニング ＮＫｐ３０分子をコードするｃＤＮＡを同定するために、ヒトポリクローナル
ＮＫ抗体のｍＲＮＡからｃＤＮＡ発現ライブラリーを精製した（Ｐａｓｓｉｎｏ
ｍ Ａ．、Ｓ．Ｓｉｖｏｒｉ、Ｃ．Ｂｏｔｔｉｎｏ、Ａ．Ｍａｌａｓｐｉｎａ、
Ｌ．Ｍｏｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｒ．Ｂｉａｓｓｏｎｉ、ａｎｄ Ａ
．Ｍｏｒｅｔｔａ．１９９８．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｎ
Ｋｐ４６：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏ
ｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒｉｇｇｅ
ｒｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１８８：９５３〜９６０）。種々のｃＤＮＡライブラリープールで形質移
入したＣＯＳ−７細胞を免疫細胞化学的な検出法によりＡ７６ｍＡｂで染色した
。５７３ｂｐの単一の読みとり枠（ＯＲＦ）（配列配列番号：１３をコードする
）を含む６７４ｂｐのｃＤＮＡ（ＮＫｐ３０クローン５Ｃ、配列番号：１）を単
離した。クローン５ＣｃＤＮＡ構築体によるＣＯＳ−７細胞の形質移入の結果、
細胞蛍光分析により推定されるように、抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂではなく全ての種
類の抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ（図７Ａ）により認識される分子が表面発現した。図
７Ｂに示すように、推定１９０アミノ酸ペプチド（配列番号：２）をコードする
クローン５ＣＯＲＦは、免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｉｇ−ＳＦ）に属
し、１８アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：３）およびＶ−タイプのＩｇ
−様ドメインを形成する１２０アミノ酸の細胞外領域（配列番号：４）により特
徴付けられる。細胞外部には２つの潜在的なＮ−結合グリコシル化部位とＯ−結
合グリコシル化のための非共通配列が含まれる。疎水性アミノ酸に富む領域な潜
在的にタンパク質−タンパク質相互作用に関連し、膜貫通領域でＩｇＶ−様ドメ
インと結合する。１９アミノ酸膜貫通領域（配列番号：５）は＋に荷電したアミ
ノ酸、Ａｒｇを含有し、３３アミノ酸細胞質部（配列番号：６）は典型的なＩＴ
ＡＭ共通配列に欠けている。膜貫通ドメイン中の荷電アミノ酸の存在は、ＮＫ細
胞上に発現する別のトリガリングレセプターに共通の特徴である。これらの荷電
残基は、通常、シグナリングポリペプチドを含むＩＴＡＭとの関連性が考えられ
る。

【０１０３】 ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベース検索は、クローン５ＣｃＤＮＡ（配列
番号：１）がこれまでに規定された別の１Ｃ７遺伝子のスプライシング形（寄託
番号ＡＦ０３１１３８）に７６．８％相同であることを明らかにした。この遺伝
子は、ヒトクロモソーム６上、ＭＨＣ遺伝子複合体のＴＮＦクラスター中にマッ
プしている（Ｎａｌａｂｏｌｕ，Ｓ．Ｒ．、Ｈ．Ｓｈｕｋｌａ、Ｇ．Ｎａｌｌｕ
ｒ、Ｓ．Ｐａｒｉｍｏｏ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ．１９９６．Ｇｅ
ｎｅｓ ｉｎ ａ ２２０−ｋｂ ｒｅｇｉｏｎ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｔｈｅ
ＴＮＦ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３１
：２１５〜２２）。とはいえしかし、１Ｃ７遺伝子の推定生成物の機能も表面分
布も特定できず；１Ｃ７に特異的なｍＡｂを入手できなかった。さらに１Ｃ７転
写産物は、種々の組織および細胞系のノーザンブロッティングでは明らかにでき
なかった。これに対して、ＲＴ−ＰＣＲにより１Ｃ７転写産物を脾臓（しかしそ
れ以外の組織からではない）または特定のリンパまたは骨髄細胞系から単離され
たＲＮＡにより増幅できた。これらのデータは、１Ｃ７転写産物がそれほど重要
でなく、細胞種の狭い範囲でのみ十分なレベルで発現できることを示唆した。ノ
ーザンブロッティングによるＮＫｐ３０発現の最近の分析は、ポリクローナルＮ
Ｋ細胞群およびＮＫＬおよびＮＫ３．３を含むＮＫ細胞系中の約１ｋｂのｍＲＮ
Ａを明かにした。これとは異なり、抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂによる反応性の欠如に
密接して、ヒト単球またはＵ９３７、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ６０およびＬＣＬ７２
１．２２１細胞を含む種々のヒストタイプの細胞中でＮＫｐ３０ｍＲＮＡは検出
できなかった（図８Ａ）。ノーザンブロッティングではｍＲＮＡを発現しない（
および抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ表面染色にネガティブである）このような細胞系は
、ＲＴ−ＰＣＲ技術によって分析した場合に転写産物を検出できる。この発見は
、ＮＫｐ３０転写産物の低いレベルがＮＫｐ３０表面発現を欠如させる結果を招
くことを示唆する。さらに、人間の様々な組織のノーザンブロッティング分析に
より、脾臓でのみＮＫｐ３０転写産物の選択的発現が認められた。これらのデー
タは全て、ＮＫｐ３０発現がかなりＮＫ−特異的であるという事実に一致する。

【０１０４】 最後に、ヒトＮＫｐ３０ｃＤＮＡプローブを、サル、ラット、マウス、犬、ウ
シおよびウサギのゲノムＤＮＡでハイブリダイズした。このデータは、ＮＫｐ３
０をコードする遺伝子が異なる種に高く保存されているという事実を支持するも
のである（図８Ｂ）。

【０１０５】 ＮＫｐ３０複合体の生化学的特徴付け Ｎ−末端ＮＫｐ３０ペプチドでウサギを免疫化して、ＮＫｐ３０−特異的抗血
清を生成した。図９Ａに示すように、ウェスタンブロッティングで見られる抗血
清分子は、ＡＺ２０ｍＡｂにより先に検出されたものと同一である。ＡＺ２０ｍ
Ａｂと異なり、ポリクローナルＮＫ細胞群由来の抗血清免疫沈降ＮＫｐ３０分子
をビオチンでラベルした。したがって、ナトリウムペルバナデートで処理したま
たは処理していないポリクローナルＮＫ細胞群を、ＮＫｐ３０−特異的抗血清で
免疫沈降させ、抗−ホスホチロシンｍＡｂで調べた。ウサギ免疫グロブリンのＣ
Ｄ１６分子への非特異的な結合を回避するために、細胞溶解物を抗−ＣＤ１６ｍ
Ａｂで徹底的に前処理した。さらに、全ての実験で、ウサギ免疫前血清をネガテ
ィブコントロールとして使用した。これらの実験で、ＮＫｐ３０レセプターのチ
ロシンホスホリル化は検出されなかった。これに対してＮＫｐ３０レセプターは
、ナトリウムペルバナデート処理時にチロシンホスホリル化される分子に関与し
（図９Ｂ）、ＮＫｐ４６−関連ＣＤ３ζ鎖と一緒に移動する。ＮＫｐ３０−関連
分子とＣＤ３ζポリペプチド間の同一性は、その抗−ＣＤ３ζｍＡｂによる反応
性で直接実証された（図９Ｂ）。

【０１０６】 したがって、ＣＤ１６およびＮＫｐ４６を含む他のＮＫトリガリングレセプタ
ーに類似したＮＫｐ３０は、ＩＴＡＭ−含有ＣＤ３ζポリペプチドと共同して活
性化シグナルを伝達できる。これらのデータは、ＮＫｐ３０細胞質尾中のＩＴＡ
Ｍの欠如およびその膜貫通部位中の荷電残基の存在と一致している。

【０１０７】 議論 この研究では、特異的ｍＡｂの生成により、休止および活性化ヒトＮＫ細胞の
いずれの天然細胞毒性で重要な役割を果たす新規トリガリングレセプターである
ＮＫｐ３０を同定しかつ特徴付けた。ＮＫｐ４６に類似して、ＮＫｐ３０は、新
たに単離されたおよびＩＬ−２中で培養した両方の全てのＮＫ細胞により選択的
に発現し、したがってＮＫ細胞同定のための至適マーカーである。Ｉｇスーパー
ファミリーに属するにもかかわらず、ＮＫｐ３０はこれまでに同定されたＮＫレ
セプターと任意に十分な相同性を示さない。多くの点で、ＮＫｐ３０はＮＫｐ４
６と類似している。実際それらの（稀少なＣＤ１６−細胞を含む）全てのＮＫ細
胞上での同等の発現、両方の分子におけるそれらの類似した機能的特性と合わせ
た表面発現の高密度または低密度発現パターンの存在は、新規ｍＡｂによって認
識される表面分子がＮＫｐ４６と同一であるかまたは非常に類似していることを
想起させた。しかし、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６は異なる分子量を示し、機能
的には天然細胞毒性の誘導では相補的役割を果たす。さらに、分子クローニング
により、ＮＫｐ３０がＮＫｐ４６と非常に制限された相同性を有するタンパク質
であり、２種類の分子はたった１３％の同一性と１５％の類似性を示し、異なる
クロモソーム上に位置する遺伝子でコードされていることが明らかとなった。

【０１０８】 天然細胞毒性および腫瘍細胞溶解においてＮＫ細胞トリガリングに応答するレ
セプターはこれまで定義されないままであった。得られたデータが、天然細胞毒
性に関する種々のトリガリングＮＫレセプターの存在の仮説に一致した。ここで
、最近ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４が同定され、この２種類のレセプターは種々
の腫瘍標的の認識および溶解に関連する。いずれもＩｇスーパーファミリーに属
するが、あまり同一性はない。これらは、ＮＫ細胞活性化時にチロシンホスホリ
ル化される、異なるシグナル形質移入ポリペプチドに関連する（それぞれ、ＣＤ
３ζ／ＦｃεＲＩγおよびＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２）。ＮＫｐ４６およびＮＫｐ
４４は、ヒトＮＫ細胞による腫瘍細胞溶解の過程で共に働くことが見出された。
しかし、特定の標的細胞の溶解はほとんどＮＫｐ４６−および／またはＮＫｐ４
４−依存性ではなく、というのも、これらの分子をｍＡｂ−媒介性マスキングし
ても細胞毒性は十分に阻止されないからである。さらに、明らかにＮＫｐ４６−
および／またはＮＫｐ４４−依存性であっても、他の腫瘍細胞系に対する細胞溶
解活性はいずれの分子をｍＡｂ−媒介性マスキングしても阻止できず、このこと
はＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と共に働く別のレセプターの存在を再び示唆する
。実際ここで、ＮＫｐ３０が種々の標的細胞に対する細胞毒性の誘導に、ＮＫｐ
４６およびＮＫｐ４４と共に働くレセプターであることが示される。おそらく、
より重要なのは、ＮＫｐ３０が、溶解がほぼＮＫｐ４６／ＮＫｐ４４−非依存的
な特定の腫瘍標的細胞（例えばＭＥＬ１５タイプのメラノーマ）のＮＫ−媒介性
の殺傷誘導における主要なレセプターであることである。ＮＫｐ４６と非常に類
似したＮＫｐ３０も、ＮＫ細胞活性化および新たなＮＫ細胞による標的細胞殺傷
に関連する。

【０１０９】 先に論じたように、ＮＫｐ３０の表面発現はＮＫｐ４６のそれと同等である。
実際、ＮＫｐ４６^dullまたはＮＫｐ４６^bright表現型を示すＮＫ細胞は、ＮＫｐ
３０^dullまたはＮＫｐ３０^bright蛍光によっても特徴付けられた。ＮＫｐ４６^{du ll} 表現型が一貫して少ない量のＮＫｐ４４を発現することによりＮＫ細胞クロー
ンが特徴付けられることは前に述べた。ＮＫ細胞が異なるトリガリングレセプタ
ー同等の密度で発現するという発見は、異なる「自然（天然）」細胞溶解活性を
示す別のＮＫ細胞サブセットの存在を説明するものである。例えば、かなりＮＫ
ｐ４６−非依存性であるにもかかわらず、ある標的細胞（例えばＭＥＬ１５）に
対する細胞溶解活性が、何故、ＮＫｐ４６^bright表現型を発現するＮＫクローン
に実質的に限定されるのかを理解するのは困難であった。現在は、ＮＫｐ４６^{br ight} 細胞のみが高濃度でＮＫｐ３０レセプターを発現するという発見により、こ
れらの結果を説明できる。したがって、ＮＫｐ４６^dullおよびＮＫｐ４６^bright 細胞の細胞用か活性における最大の相違点に関する先の証拠は、現在、異なるＮ
Ｋｐ３０表現型を示すＮＫ細胞にも当てはめることができる。この主張の通り、
ＮＫｐ３０^dullＮＫ細胞クローンの細胞溶解活性は、ＮＫｐ３０^brightクローン
のそれと比較して著しく低下した。

【０１１０】 ＮＫｐ４６と類似したＮＫｐ３０は、レセプター複合体を介したシグナリング
に大きく関連すると思われるＣＤ３ζに関係を有する。しかしＣＤ３ζは、少な
くともＣＯＳ−７細胞中では、いずれのレセプターの表面発現にも必須ではない
。分子クローニングにより、ＮＫｐ３０が、ヒトクロモソーム６上、ＨＬＡクラ
スＩＩＩ領域中に予めマップされた遺伝子である、ヒト１Ｃ７の生成物であるこ
とが明らかとなった（Ｎａｌａｂｏｌｕ，Ｓ．Ｒ．、Ｈ．ＳＨｕｋｌａ、Ｇ．Ｎ
ａｌｌｕｒ、Ｓ．Ｐａｒｉｍｏｏ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ．１９９
６．Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ａ ２２０−ｋｂ ｒｅｇｉｏｎ ｓｐａｎｎｉｎｇ
ｔｈｅ ＴＮＦ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ．Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ ３１：２１５〜２２：Ｎｅｖｉｌｌｅ、Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｃａｍｐ
ｂｅｌｌ．１９９９．Ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｇ ｓｕｐ
ｅｒｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ａ Ｖ−ＡＴＰａｓｅ Ｇ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｒ
ｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｎｏ
ｖｅｌ ｇｅｎｅｓ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ＴＮＦ ｌｏｃｕｓ ｉｎ
ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：４７４５〜４７５
４）。

【０１１１】 しかし、１Ｃ７遺伝子の推定生成物の機能も細胞分布も知られておらず、その
天然細胞毒性における役割についての記載もない。さらに、ノーザンブロッティ
ング分析では検出できないので、１Ｃ７転写産物発現の分析はＲＴ−ＰＣＲに限
られた。特異的ｍＡｂが欠如しているために、転写産物と表面産物間で相関関係
をうち立てられなかったことも強調すべきである。本発明において、３種類の異
なるｍＡｂで染色することにより測定したＮＫｐ３０の表面発現と、ノーザンブ
ロッティングにより評価されたｍＲＮＡ発現との間の明らかな相関関係を示す。
逆に、ＲＴ−ＰＣＲによる１Ｃ７転写産物の検出から１Ｃ７／ＮＫｐ３０分子の
表面発現は予測できない。

【０１１２】 最後に、ＮＫｐ３０分子は、非−ＨＬＡリガンドを認識する際にＮＫ細胞トリ
ガリングに関与するレセプターの新規ファミリー（天然細胞毒性レセプター（Ｎ
ＣＲ））の３番目のメンバーである。これらのレセプターは、ＮＫ細胞による標
的細胞溶解の誘導において、相補的に出現する。各レセプターの相対的な寄与は
、標的細胞上の特異的リガンドの発現／密度に反映されると考えられる。この主
張の通り、ＣＤ１６もまた天然細胞毒性に関連していることが近年明らかとなり
、このことから、Ｆｃ結合およびＡＤＣＣに加えて、ＣＤ１６がＮＫ細胞機能の
制御に働いていることが示唆される。ＣＤ１６および異なるＮＣＲの他に、ＮＫ
細胞トリガリングを媒介できる幾つかの別の表面分子が人間および齧歯類で同定
された。これらには、ＣＤ２、ＣＤ６９、ＣＤ２８、２Ｂ４およびＮＫＲ−Ｐ１
が含まれる。しかし、多くの場合、これらの活性化構造体はＮＫ−制限されない
ので、天然細胞毒性でのそれらの実際の役割をさらに明確にする必要がある。

【０１１３】 最後に、種々のＮＣＲの同定が、ＮＫ細胞の生理学に関する我々の理解の先に
ある主要ステップを構成するにもかかわらず、標的細胞上のＮＣＲ天然リガンド
の性質および分布の両方をさらに明らかに決定する必要がある。入手したデータ
に基づいて、ＮＫ−特異的トリガリングレセプターにより特異的に認識されるリ
ガンド分子の（腫瘍細胞における）ダウンレギュレーションから成る、腫瘍回避
の新規メカニズムを予測することができる。したがって、このようなリガンドの
同定は、正常細胞対腫瘍細胞でのそれらの分布を分析することを可能にし、かつ
リガンド発現と種々の腫瘍細胞によるＮＫ−媒介性溶解への感受性との間に相関
関係が存在するかを定義することが可能になる。

【０１１４】 実施例２：抗−ＮＫｐ３０抗体の製造 前記実施例１に詳細したようにしてＮＫｐ３０タンパク質配列配列番号：２が
得られれば、抗−ＮＫｐ３０抗体は常用の抗体生成法により製造できる。これら
の方法には、マウスまたはラット等の動物を、ここで定義したＮＫｐ３０免疫原
性フラグメントで免疫化することが含まれる。反復して免疫化を実施できる。抗
体応答は、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリー等の種々の技術でモニターで
き、免疫化した動物の血清中の、免疫原に結合した免疫グロブリンの存在が実証
される。顕著な抗体応答が検出される場合、動物は犠牲となり、ケラーミルステ
イン法（Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ、Ｎａ
ｔｕｒｅ １９７５、２５６：４９５〜４９７；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、１９８８、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖ
ｉｄ Ｌａｎｅ，Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）または免疫脾臓細胞を回収しかつそれをハイブリドーマ細胞系へ融合
する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８８９）
等の常用の方法に記載されるようにしてモノクローナル抗体が生成される。

【０１１５】 抗体で染色された細胞サブセットを、前記したフローサイトメトリーにより図
式化し、生物学的サンプル中でＮＫ細胞を選択的に認識する所望の能力を有する
抗体を同定する。得られたモノクローナル抗体の刺激能をさらに特徴付けるため
に、実施例１に記載したように、以下の任意の項目をバイオアッセイに利用でき
る：（ｉ）ＭＨＣクラスＩネガティブ標的、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、同種
異系細胞に対する天然細胞毒性の誘導、（ｉｉ）抗体−被覆標的細胞に対する細
胞毒性の刺激、（ｉｉｉ）細胞質内Ｃａ²⁺濃度の増加、（ｉｖ）ＺＡＰ７０、Ｓ
ｙｋ、ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ホスホリパーゼＣ−ガンマ酵素
、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ等の細胞質アダプター／エフェク
ター分子のチロシンホスホリル化の誘導、（ｖ）レセプター関連形質導入鎖ＫＡ
ＲＡＰ／ＤＡＰ１２またはＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマのホスホリル化、（
ｖｉ）インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子、ＩＬ５、ＩＬ１０、ケモカイン
（例えばＭＩＰ−１アルファ）、ＴＧＦベータ等のサイトカイン分泌、（ｖｉｉ
）ＮＫ細胞表面分子、例えばＣＤ６９およびＰＥＮ５それぞれのアップレギュレ
ーションまたはダウンレギュレーション。

【０１１６】 ＮＫｐ３０免疫原性フラグメントと結合でき、その表面にオリゴマー形で免疫
グロブリンフラグメントのレパートリーを発現するファージライブラリーを特異
的にスクリーニングできる抗体を製造するために、別の方法を利用できる。この
スクリーニングは、固層上で組み換えＮＫｐ３０分子をパニングし、ファージ件
濁液をこの被覆表面と接触させ、維持された結合ファージを洗浄し、これらのフ
ァージを複製し、その表面により少ない免疫フラグメントを発現するファージ構
築体でこのスクリーニング法を数回反復し、免疫原性分子に最も高い親和性を示
すフラグメントを選択することにより、実施できる。最終的に得られたフラグメ
ントを、生物学的サンプル中のＮＫ細胞を選択的に染色する能力および前記した
ような任意の機能性アッセイで任意に刺激した抗体と競合する能力について試験
してよい。

【０１１７】 実施例３：ＮＫ細胞の精製および活性化 抗−ＮＫｐ３０抗体等の抗−ＮＫｐ３０反応体は有利に、血漿交換法または細
胞交換法で回収したサンプル等の複合体生物学的サンプルからのＮＫ細胞精製に
適したＮＫ細胞特異性を示す。当業者は種々の細胞精製形態を決定できる。

【０１１８】 例えば、抗−ＮＫｐ３０抗体ＮＫｐ３０は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ
ｇｍｂｈ（Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）の極微小ＭＡＣＳマイクロビーズへ共
有結合できる。次いで、細胞交換法またはドナーの末梢血液サンプルの傾瀉によ
り得られるドナー血液由来の百万〜十億個の細胞の件濁液を磁気ビーズと接触さ
せ、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＭＡＣＳセルソーター等の磁気分離装置へ導入した。ま
た、抗−ＮＫｐ３０抗体はＤｙｎａｌ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）のＤｙｎａｂ
ｅａｄｓ（登録商標）粒子へ結合できる。ドナー細胞の件濁液をビーズとインキ
ュベートし、Ｂａｘｔｅｒ社製Ｉｓｏｌｅｘ装置の磁場へ置き、ＮＫｐ３０抗原
と競合して細胞の放出を可能にするペプチド分子とインキュベートすることによ
り回復させる。

【０１１９】 精製直後ポジティブ細胞を適当な等張媒質中で回復し、１０万〜１億個の用量
で患者に与えることができる。この細胞を精製ステップの後、臨床使用の前に凍
結させることも可能である。自家移植法では、ＮＫ細胞を患者自身の血液から取
得する。この場合、抗−腫瘍治療は、精製ＮＫ細胞をさらに、腫瘍により発現し
た抗原（例えばＢ細胞リンパ腫ではＣＤ２０）と結合した抗体とインキュベート
し、処理細胞を抗−腫瘍抗体といっしょに患者へ再度与えることにより、実施さ
れる。また、骨髄外科移植等の同種異系外科移植で見られるＧｖＨＤ（移植物対
宿主疾患）を回避するための方法では、ＮＫ細胞をドナー血液から精製し、受容
者へ再−導入できる。

【０１２０】 ＮＫ細胞のポジティブ精製物をベースとするＮＫｐ３０は実際、特定の状況下
に、同時にＮＫ細胞を活性化できるという利点を有する。これらの状況には特に
、ある密度での抗−ＮＫｐ３０反応物の使用および／またはＮＫ細胞上でＮＫｐ
３０分子の架橋を可能にする天然物の使用が含まれる。典型的に、このようなマ
トリクスは飽和量の抗−ＮＫｐ３０抗体で被覆された固層、例えば中空繊維、デ
キストラン粒子または磁気粒子を含む。

【０１２１】 本発明の同時精製−活性化法により、ＮＫ細胞のために常用されるインキュベ
ーションステップ（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのｉｎｔｅｒ
ｌｅｕｋｉｎｅの存在下に精製ＮＫ細胞をインキュベートする）は、もう必須の
ステップではない。このような常用のステップはしかしながら任意に実施できる
と理解すべきである：当業者はこのような常用のステップを、例えば最適化の目
的で、本発明の方法に付け加えることを選択できる。

【０１２２】 略号：ＮＫ、ナチュラルキラー、ＫＩＲ、キラー阻害レセプター、ＮＣＲ、天
然細胞毒性レセプター、ＩＴＡＭ、免疫レセプターのチロシンを基礎とする活性
化モチーフ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、Ｉｇ−ＳＦ、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＲＴ−ＰＣＲ
、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応、ＯＲＦ、読みとり枠、ｍＡｂ、モノクロ
ーナル抗体。

【０１２３】 本明細書において、参考文献は、免疫学、細胞生物学、分子生物学および薬理
学の当業者に公知の様々な方法論を提示している。参考文献が提示した方法論等
に記載される出版物および他の材料は、参照によりここにその全てを包括して組
み込んだものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 本発明の３種の新規ｍＡｂで誘導されるＮＫ−媒介性細胞溶解活性（抗−ＮＫ
ｐ３０ｍＡｂ）のトリガリングを示す図である。図１Ａにおいて、ｃ１２７（抗
−ＣＤ１６）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６）、Ｚ２３１（抗−ＮＫｐ４４）
、ＡＺ２０、Ａ７６、Ｚ２５（抗−ＮＫｐ３０ｍＡｂ）およびｃ２１８（抗−Ｃ
Ｄ５６）ｍＡｂの不在または存在下に、ＦｃγＲ−ポジティブＰ８１５標的細胞
系に対する転嫁殺傷アッセイで、細胞溶解活性について代表的なポリクローナル
ＮＫ細胞群を分析した（％特異的⁵¹Ｃｒ放出）。使用したＥ／Ｔ（エフェクター
対標的）比は１：１であった。

【図１Ｂ】 本発明の３種の新規ｍＡｂで誘導されるＮＫ−媒介性細胞溶解活性（抗−ＮＫ
ｐ３０ｍＡｂ）のトリガリングを示す図である。図１Ｂにおいて、段階的な量の
ＡＺ２０（黒四角）、ｃ１２７（抗−ＣＤ１６）（白三角）またはｃ１２８（抗
−ＣＤ５６）（白丸）ｍＡｂの存在下に、Ｐ８１５標的細胞（Ｅ／Ｔ比１：１）
に対する転嫁殺傷アッセイで、代表的ＮＫクローン３Ｍ１６を分析した（％特異
的⁵¹Ｃｒ放出）。使用した全てのｍＡｂはＩｇＧ１イソタイプであった。

【図１Ｃ】 本発明の３種の新規ｍＡｂで誘導されるＮＫ−媒介性細胞溶解活性（抗−ＮＫ
ｐ３０ｍＡｂ）のトリガリングを示す図である。図１Ｃにおいて、ＡＺ２０ｍＡ
ｂの存在下でヤギ抗−マウス２次試薬（ＧＡＭ）を用いて、［Ｃａ⁺⁺］ｉ誘発（
秒時間の関数としての［Ｃａ⁺⁺］ｉｎＭ）について、クローン３Ｍ１６を分析し
た。ネガティブコントロールはＧＡＭ単独で処理した細胞である。

【図２Ａ】 休止または活性化、ポリクローナルまたはクローナル、ＮＫ細胞の細胞蛍光分
析を示す図である。図２Ａにおいて、ドナーＡＭおよびＣＭ由来のポリクローナ
ルＮＫ細胞群（上側および中程の水平なグラフ線）、ドナーＣＢ由来の新しく単
離されたＮＫ細胞（下側の水平なグラフ線）を、ｃ２１８（抗−ＣＤ５６；２つ
目の垂直柱）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６；３つ目の垂直グラフ柱）または
ＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０；最後の垂直グラフ柱）ｍＡｂとＰＥ−結合ヤギ抗−
マウスＩｇＧ１とを使用して、免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析により分析した。コ
ントロール（最初の垂直グラフ柱）は第２の試薬だけを用いてインキュベートし
た細胞である。

【図２Ｂ】 休止または活性化、ポリクローナルまたはクローナル、ＮＫ細胞の細胞蛍光分
析を示す図である。図２Ｂにおいて、ドナーＣＢ由来のＮＫ細胞クローンを、Ｂ
ＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６；垂直な中程のグラフ柱）またはＡＺ２０（抗−Ｎ
Ｋｐ３０；垂直な右側のグラフ柱）ｍＡｂとＰＥ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ１
とを用いて、免疫蛍光およびＦＡＣＳにより分析した（コントロールは、垂直な
左側のグラフ柱である）。

【図３Ａ】 末梢血液リンパ球中でのＮＫｐ３０の発現パターンとウェスタンブロッティン
グ分析を示す図である。図３Ａにおいて、各ドナーから新に単離した末梢血液リ
ンパ球を、ＧＰＲ１６５（ＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ５６）、ＫＤ１（ＩｇＧ２ａ、
抗−ＣＤ１６）、ＪＴ３Ａ（ＩｇＧ２ａ、抗−ＣＤ３）、Ｄ１−１２（ＩｇＧ２
ａ、抗−ＨＬＡ−ＤＲ）、ＫＬ２４７（ＩｇＭ、抗−ＮＫｐ４６）ｍＡｂと組み
合わせたＡＺ２０ｍＡｂとイソタイプ−特異的ＦＩＴＣまたはＰＥ−結合ヤギ抗
−マウス２次試薬を用いて（上側の左および右、中程の左および右、ならびに下
側の左のグラフ）、二色免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析により分析した。異なるイ
ソタイプの２種類の抗−ＮＫｐ４６ｍＡｂを用いた二重免疫蛍光（ＫＬ２４７、
ＩｇＭ対ＢＡＢ２８１、ＩｇＧ１）も示す（下側の右）。輪郭プロットを、それ
ぞれ非染色細胞（下側左）、赤色蛍光のみでの細胞（上側左）、赤色および緑色
蛍光での細胞（上側右）および緑色蛍光のみでの細胞（下側右）の四分区画に分
割した。

【図３Ｂ】 末梢血液リンパ球中でのＮＫｐ３０の発現パターンとウェスタンブロッティン
グ分析を示す図である。図３Ｂにおいて、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫、ネ
ガティブコントロール）由来のおよびポリクローナルＮＫ細胞群由来の内在性膜
タンパク質を、非−還元条件下にＡＺ２０ｍＡｂをプローブとして１１％のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析した。分子量マーカ（ｋＤａ）を左に示す。

【図４Ａ】 ＮＫｐ３０が新たなＮＫ細胞中でレセプター活性化に働き、その天然細胞毒性
に関連することを示す図である。図４Ａにおいて、各ドナーから新に単離された
末梢血液ＮＫリンパ球を、ｃ１２７（抗−ＣＤ１６）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫ
ｐ４６）、ＡＺ２０、Ａ７６、Ｚ２５およびｃ２１８（抗−ＣＤ５６）ｍＡｂの
不在または存在下に、ＦｃγＲ−ポジティブＰ８１５標的細胞系に対する転嫁殺
傷アッセイで、細胞溶解活性について分析した（％特異的⁵¹Ｃｒ放出）。使用し
たＥ／Ｔ比は２０：１であった。

【図４Ｂ】 ＮＫｐ３０が新たなＮＫ細胞中でレセプター活性化に働き、その天然細胞毒性
に関連することを示す図である。図４Ｂにおいて、新に単離した末梢血液ＮＫ細
胞を、規定分子に対するｍＡｂの不在または存在下に（ｃ２１８（抗−ＣＤ５６
）、ＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６）ｍＡｂを使
用した）、規定のＦｃγＲ−ネガティブ／ＨＬＡクラスＩ−ネガティブメラノー
マ細胞系に対する細胞溶解活性について分析した。Ｅ／Ｔ比は２０：１であった
。

【図５】 ＮＫ細胞クローンによって媒介される腫瘍細胞溶解における、ＮＫｐ３０およ
びＮＫｐ４６の関与を示す図である。３種のＮＫ細胞クローンを、ＡＺ２０（抗
−ＮＫｐ３０；黒色バー）、ＢＡＢ２８１（抗−ＮＫｐ４６；ストライプバー）
あるいはＡＺ２０とＢＡＢ２８１の両方（点画バー）ｍＡｂの不在（白色バー）
または存在下に、ＭＥＬ１５、Ｍ１４、ＳＭＭＣおよびＡ５４９ＦｃγＲ−ネガ
ティブ標的細胞系に対する細胞溶解活性について分析した。Ｅ／Ｔ比は４：１で
あった。

【図６Ａ】 ＮＫｐ３０が、腫瘍または正常自己標的細胞に対するＮＫ−媒介性細胞毒性の
誘導において、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と共同で機能することを示す図であ
る。図６Ａにおいて、代表的ＮＫクローンＭＩＬ６９を、規定分子に対するｍＡ
ｂの不在または存在下に、ＦＯ−１またはＡ５４９ＦｃγＲ−ネガティブ標的細
胞系に対する細胞溶解活性について分析した（％特異的⁵¹Ｃｒ放出）。以下のｍ
Ａｂを使用した：ＫＬ２４７（抗−ＮＫｐ４６）、ＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０）
、ＫＳ３８（抗−ＮＫｐ４４）。Ｅ／Ｔ比は２：１（ＦＯ−１）および３：１（
Ａ５４９）であった。

【図６Ｂ】 ＮＫｐ３０が、腫瘍または正常自己標的細胞に対するＮＫ−媒介性細胞毒性の
誘導において、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と共同で機能することを示す図であ
る。図６Ｂにおいて、２種類のＮＫ細胞クローン（ＭＸ３６１およびＰ９）を、
規定分子に対するｍＡｂの不在（白色バー）または存在（黒色バー）下に、自己
ＰＨＡ Ｂｌａｓｔに対する細胞溶解活性について分析した（％特異的⁵¹Ｃｒ放
出）。使用したｍＡｂはＡ６−１３６（抗−ＨＬＡクラスＩ）、ＫＬ２４７（抗
−ＮＫｐ４６）、ＫＳ３８（抗−ＮＫｐ４４）、ＡＺ２０（抗−ＮＫｐ３０）で
あった。Ｅ／Ｔ比は１０：１であった。

【図７Ａ】 ＣＯＳ−７細胞形質導入物で発現したＮＫｐ３０分子の細胞蛍光分析、ＮＫｐ
３０のアミノ酸配列（配列番号：２）および疎水性プロットを示す図である。図
７Ａにおいて、クローン５ＣｃＤＮＡ構築対で形質導入したＣＯＳ−７細胞を、
抗−ＮＫｐ３０（左から右へ：Ａ７６、ＡＺ２０、Ｚ２５）または抗−ＮＫｐ４
６（ＢＡＢ２８１）ｍＡｂとＰＥ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ１とで染色し、フ
ローサイトメトリーで分析した。白色プロファイルは第２試薬のみでインキュベ
ートした細胞である（すなわちネガティブコントロール）。

【図７Ｂ】 ＣＯＳ−７細胞形質導入物で発現したＮＫｐ３０分子の細胞蛍光分析、ＮＫｐ
３０のアミノ酸配列（配列番号：２）および疎水性プロットを示す図である。図
７Ｂにおいて、シグナルペプチド（配列番号：３）を小文字で示し、膜貫通領域
（配列番号：５）に下線を引く。ＮＫｐ３０細胞外領域配列（配列番号：４）は
シグナルペプチドと膜貫通領域の間の配列に相当する。ＮＫｐ３０細胞内領域配
列（配列番号：６）は膜貫通配列（Ｃ−末端）の後ろの配列に相当する。Ｉｇ−
様の折り畳中に存在するシステインを丸で囲み、推定Ｎ−グリコシル化部位を四
角で囲む。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットを下方に示す。Ｇｅｎ
ｅＷｏｒｋｓ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｓｕｉｔｅｓ、ＮｅｔＯＧｌｙｃ２．０（
ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ）および
ＰＳＯＲＴ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｅｒｓ（ｗｗｗ．ｐｓｏｒｔ．ｎ
ｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ：８８００／）を使用してＤＮＡおよびタンパク質配列を分
析した。

【図７Ｃ】 ＣＯＳ−７細胞形質導入物で発現したＮＫｐ３０分子の細胞蛍光分析、ＮＫｐ
３０のアミノ酸配列（配列番号：２）および疎水性プロットを示す図である。図
７ＣにＮＫｐ３０ｃＤＮＡ配列を示す（配列番号：１）。ＮＫｐ３０コード配列
は位置６４〜位置６３６である（配列番号：１３）。ＮＫｐ３０のための４２１
ｂｐのｃＤＮＡプローブ（配列番号：１０）は配列番号：１の位置５７〜位置４
７７の配列に相当する。ｐＣＲ２．１中でのクローニングのためにＮＫｐ３０か
ら増幅された６０６ｂｐのｃＤＮＡ（配列番号：１２）は配列番号：１の位置５
７〜位置６６２の配列に相当する。

【図８Ａ】 ＮＫｐ３０転写発現のノーザンブロッティング分析およびＺｏｏ−ブロット分
析を示す図である。図８Ａにおいて、全ＲＮＡを起源の異なる細胞から単離した
。レーン１および２：ポリクローナルＮＫ細胞群；レーン３：ブランク；レーン
４：ＮＫ細胞系（ＮＫＬ）；レーン５：ＮＫ細胞系（ＮＫ３．３）；レーン６：
ヒト単球；レーン７：細網肉腫細胞系（Ｕ９３７）；レーン８：Ｔリンパ腫細胞
系（Ｊｕｒｋａｔ）；レーン９：急性前骨髄球性白血病細胞系（ＨＬ６０）；レ
ーン１０：ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系（ＬＣＬ７２１．２２１）。各ＲＮＡ調製
物１０μｇ（レーン１および２のポリクローナルＮＫ細胞群からポリＡ⁺ＲＮＡ
２μｇ）を４２１ｂｐのＮＫｐ３０ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。
２８Ｓおよび１８ＳリボゾームＲＮＡサブユニットの位置を左に示す。

【図８Ｂ】 ＮＫｐ３０転写発現のノーザンブロッティング分析およびＺｏｏ−ブロット分
析を示す図である。図８Ｂにおいて、ヒト、アカゲザル、ＳＤラット、ＢＡＬＢ
／ｃマウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅイースト菌由来のゲノムＤＮＡを、それほどストリンジ
ェントでない条件下に、４２１ｂｐのＮＫｐ３０ｃＤＮＡプローブとハイブリダ
イズさせることから成る、サザンブロットを示す図である。

【図９Ａ】 特異的抗血清を使用することによりＮＫｐ３０レセプター複合体の生物学的分
析を示す図である。図９Ａにおいて、Ｄａｕｄｉ由来の（ネガティブコントロー
ル）およびポリクローナルＮＫ細胞群由来の内在性膜タンパク質を、非−還元条
件下にＮＫｐ３０−特異的ウサギ抗血清（Ｉ）をプローブとして１１％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析した。分子量マーカー（ｋＤａ）を左に示す。

【図９Ｂ】 特異的抗血清を使用することによりＮＫｐ３０レセプター複合体の生物学的分
析を示す図である。図９Ｂにおいて、ナトリウムペルバナデートで処理していな
い（−）または処理した（＋）ポリクローナルＮＫ細胞群に由来する１％ジギト
ニン細胞溶解物を、Ｚ２３１ｍＡｂ（抗−ＮＫｐ４４）、ＢＡＢ２８１ｍＡｂ（
抗−ＮＫｐ４６）、ＮＫｐ３０−特異的ウサギ抗血清（Ｉ）および前−免疫ウサ
ギ血清（ｐＩ）で免疫沈降させた。還元条件下に抗−ホスホチロシン（抗−ＰＴ
ｙｒ）または抗−ＣＤ３ζ（抗−ζ）ｍＡｂをプローブとして、サンプルを１５
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｉｇ軽鎖（Ｉｇ（Ｌ））、Ｔｙｒ−ホスホリル
化ＣＤ３ζ（Ｐ−ζ）、Ｔｙｒ−ホスホリル化ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２（Ｐ−Ｋ
ＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２）およびＣＤ３ζの非ホスホリル化形を矢印で示す。分子
量マーカー（ｋＤａ）を右に示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 11/00 ４Ｃ０８７ 11/00 17/00 ４Ｈ０４５ 17/00 31/00 31/00 31/12 31/12 35/00 35/00 37/02 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/735 Ｃ０７Ｋ 14/735 16/28 16/28 16/46 16/46 17/00 17/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｅ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 モレッタ、 アレッサンドロ イタリア国 イ−16133 ジェノヴァ ヴ ィア ニッツァ 18／８ (72)発明者 ボッティーノ、 クリスティーナ イタリア国 イ−16133 ジェノヴァ ヴ ィア ニッツァ 18／８ (72)発明者 ブラッソーニ、ロベルト イタリア国 イ−16133 ジェノヴァ ヴ ィア トレ ピーニ 43／５ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA41 BA63 CA04 CA09 DA03 EA04 GA05 GA11 GA18 HA03 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ42 QR32 QR38 QR48 QR55 QR82 QS20 QS25 QS34 QS39 QX02 4B064 AG20 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 4B065 AA91X AA92X AA93X AA93Y AB01 AB04 AC14 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 4C085 AA12 AA13 AA14 BB11 BB31 CC02 CC03 CC04 CC05 CC22 CC23 EE01 4C087 AA01 AA02 BB34 BB64 CA04 CA21 DA28 MA16 NA05 NA14 ZA59 ZA75 ZA89 ZB07 ZB26 ZB32 ZB33 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA50 DA76 DA86 EA22 FA72 FA74

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６
   、その任意の免疫原性フラグメントのアミノ酸配列、および配列番号：７配列か
   ら成る群より選択されるアミノ酸配列に対して、全長が少なくとも８０％相同な
   少なくとも１種のアミノ酸配列を含有することを特徴とする、単離された化合物
   。
2. 【請求項２】 さらに１つのＣＤ３ζ鎖を含有することを特徴とする、請求
   項１に記載の単離された化合物。
3. 【請求項３】 配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号
   ：１３ポリヌクレオチド配列、ならびに普遍的な遺伝子暗号に従い、かつその冗
   長性を含めて、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６配列
   、および配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６の任意の免
   疫原性フラグメントのアミノ酸配列、さらに配列番号：７アミノ酸配列をエンコ
   ードするポリヌクレオチド配列から成る群より選択されるポリヌクレオチド配列
   に対して、全長が少なくとも８０％相同な少なくとも１種のポリヌクレオチド配
   列を含有することを特徴とする、単離された化合物。
4. 【請求項４】 （配列番号：８；配列番号：９）対、（配列番号：８；配列
   番号：１１）対、配列番号：１０ポリヌクレオチド、配列番号：１２ポリヌクレ
   オチドから選択されることを特徴とする、ポリヌクレオチド化合物。
5. 【請求項５】 任意選択的に免疫原性エンハンサーと組み合わせた少なくと
   も１種の化合物である、請求項１に記載の少なくとも１種の単離された化合物で
   哺乳動物を免疫化し、こうして形成された抗血清を回収することにより得られる
   ことを特徴とする、抗血清タイプの組成物。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の少なくとも１種の単離された化合物に直接
   対することを特徴とする、単離された抗体。
7. 【請求項７】 任意のＴ細胞表面分子だけでなく任意のＢ細胞表面分子に結
   合しないことを特徴とする、請求項６に記載の単離された抗体。
8. 【請求項８】 標的細胞の存在下に１：１の割合で存在するＮＫ細胞によっ
   て引き起こされる天然細胞毒性の少なくとも５倍の増加を誘導できることを特徴
   とする、請求項６または７に記載の単離された抗体。
9. 【請求項９】 モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項６から
   ８までのいずれか一項に記載の単離された抗体。
10. 【請求項１０】 ハイブリドーマＩ−２５７６（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉｎｓｔ
    ｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、パリ、フランス）から製造されることを特徴とする
    、単離されたモノクローナル抗体。
11. 【請求項１１】 請求項６から１０までのいずれか一項に記載の抗体の単離
    された免疫−反応性フラグメント。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のフラグメントを含有することを特徴と
    する、人体に適応させた抗体。
13. 【請求項１３】 請求項６から１０、１２のいずれか一項に記載の少なくと
    も１つの単離された抗体と結合していることを特徴とする、固体支持体。
14. 【請求項１４】 請求項６から１０までのいずれか一項に記載のモノクロー
    ナル抗体を製造することを特徴とする、ハイブリドーマ。
15. 【請求項１５】 ハイブリドーマＩ−２５７６（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉｎｓｔ
    ｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、パリ、フランス）。
16. 【請求項１６】 生物学的サンプル中のＮＫ細胞の存在を検出かつ／または
    定量化する方法において、該方法が、 −請求項５に記載の抗血清−タイプの組成物、請求項６から１０、１２に記載
    の単離された抗体、請求項１１に記載の単離された免疫−反応性フラグメント、
    請求項１３に記載の固体支持体、請求項１４または１５に記載のハイブリドーマ
    から成る群より選択される少なくとも１種の物質と生物学的サンプルとを接触さ
    せ、 −これにより形成された免疫複合体を検出しかつ／または定量化する ことを含むことを特徴とする、生物学的サンプル中のＮＫ細胞の存在を検出し
    かつ／または定量化する方法。
17. 【請求項１７】 生物学的サンプル中のＮＫ細胞の存在を検出しかつ／また
    は定量化する方法において、該方法が、 請求項３に記載の単離された化合物、請求項４に記載のポリヌクレオチド化合
    物から成る群より選択される少なくとも１種の生成物と生物学的サンプルとを、
    ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション生成物の形成に適した条件下に接触さ
    せ、 これにより形成されたハイブリダイゼーション生成物を検出しかつ／または定
    量化する ことを含むことを特徴とする、生物学的サンプル中のＮＫ細胞の存在を検出か
    つ／または定量化する方法。
18. 【請求項１８】 請求項５に記載の抗血清−タイプの組成物、請求項６から
    １０、１２に記載の単離された抗体、請求項１１に記載の単離された免疫−反応
    性フラグメント、請求項１３に記載の固体支持体、請求項１４または１５に記載
    のハイブリドーマ、請求項３に記載の単離された化合物、請求項４に記載のポリ
    ヌクレオチド化合物から成る群より選択される少なくとも１種を、コンテナー中
    に封入して含有することを特徴とする、生物学的サンプルからＮＫ細胞を検出し
    かつ／または定量化するためのキット。
19. 【請求項１９】 生物学的サンプルからＮＫ細胞を選択的に除去するための
    方法において、該方法が、 請求項５に記載の抗血清−タイプの組成物、請求項６から１０、１２に記載の
    単離された抗体、請求項１１に記載の単離された免疫−反応性フラグメント、請
    求項１３に記載の固体支持体、請求項１４または１５に記載のハイブリドーマか
    ら成る群より選択される少なくとも１種の物質と生物学的サンプルとを接触させ
    、 これにより形成される免疫複合体を除去する ことを含むことを特徴とする、生物学的サンプルからＮＫ細胞を選択的に除去
    するための方法。
20. 【請求項２０】 生物学的サンプルからＮＫ細胞をポジティブかつ選択的に
    精製するための方法において、該方法が、 請求項５に記載の抗血清／タイプの組成物、請求項６から１０、１２に記載の
    単離された抗体、請求項１１に記載の単離された免疫−反応性フラグメント、請
    求項１３に記載の固体支持体、請求項１４または１５に記載のハイブリドーマか
    ら成る群より選択される少なくとも１種の物質と生物学的サンプルとを接触させ
    、 これにより形成される免疫複合体から細胞を回復する ことを含むことを特徴とする、生物学的サンプルからＮＫ細胞をポジティブか
    つ選択的に精製するための方法。
21. 【請求項２１】 請求項５に記載の抗血清−タイプの組成物、請求項６から
    １０、１２に記載の単離された抗体、請求項１１に記載の単離された免疫−反応
    性フラグメント、請求項１３に記載の固体支持体、請求項１４または１５に記載
    のハイブリドーマから成る群より選択される少なくとも１種を、コンテナー中に
    封入して含有することを特徴とする、生物学的サンプルからＮＫ細胞を除去しか
    つ／またはポジティブに精製するためのキット。
22. 【請求項２２】 ＮＫ細胞の細胞毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激するための
    方法において、該方法が、 生理学的条件下にｉｎ ｖｉｔｒｏで、請求項５に記載の抗血清−タイプの組
    成物、請求項６から１０、１２に記載の単離された抗体、請求項１３に記載の固
    体支持体、請求項１４または１５に記載のハイブリドーマから成る群より選択さ
    れる少なくとも１種の生成物と前記ＮＫ細胞とを接触させる ことを含むことを特徴とする、ＮＫ細胞の細胞毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激
    するための方法。
23. 【請求項２３】 請求項５に記載の抗血清−タイプの組成物、請求項６から
    １０、１２に記載の単離された抗体、請求項１３に記載の固体支持体、請求項１
    ４または１５に記載のハイブリドーマから成る群より選択される少なくとも１種
    の生成物を、コンテナー中に封入して含有することを特徴とする、ＮＫ細胞の細
    胞毒性を刺激するためのキット。
24. 【請求項２４】 抗−ＮＫｐ４６抗体および抗−ＮＫｐ４４抗体から成る群
    より選択される抗体をさらに含有することを特徴とする、請求項１８、２１、２
    ３のいずれか一項に記載のキット。
25. 【請求項２５】 移植の改善、ＧｖＨの阻害、ＧｖＴおよび特にＧｖＬの刺
    激を意図することを特徴とする、請求項１８、２１、２３、２４のいずれか一項
    に記載のキット。
26. 【請求項２６】 生理学的条件下にｉｎ ｖｉｔｒｏで、請求項６から１０
    までのいずれか一項に記載の抗体のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂フラグメントと
    ＮＫ細胞とを接触させることを含むことを特徴とする、ＮＫ細胞の細胞毒性のｉ
    ｎ ｖｉｔｒｏ阻害のための方法。
27. 【請求項２７】 請求項６から１０までのいずれか一項に記載の抗体のＦａ
    ｂまたはＦ（ａｂ’）₂フラグメントを含有することを特徴とする、ＮＫ細胞の
    細胞毒性を阻害するためのキット。
28. 【請求項２８】 請求項５に記載の抗血清−タイプの組成物、請求項６から
    １０、１２に記載の単離された抗体、請求項１３に記載の固体支持体、請求項１
    ４または１５に記載のハイブリドーマ、請求項２０に記載の精製法により得られ
    る単離されたＮＫ細胞、請求項２２に記載の刺激法により得られる単離されたＮ
    Ｋ細胞から成る群より選択される少なくとも１種の生成物を、製薬学的に使用可
    能な賦形剤といっしょに含有することを特徴とする、医薬品組成物。
29. 【請求項２９】 前記の選択された少なくとも１種の生成物が直接または間
    接的に抗−腫瘍抗体、抗−微生物抗体または抗−ウイルス抗体と結合することを
    特徴とする、請求項２８に記載の医薬品組成物。
30. 【請求項３０】 前記の単離されたＮＫ細胞を、人間、特に移植ドナー、ま
    たはメラノーマ等の腫瘍を患っている患者から回収することを特徴とする、請求
    項２８または２９に記載の医薬品組成物。
31. 【請求項３１】 抗−ＮＫｐ４６抗体および抗−ＮＫｐ４４抗体から成る群
    より選択される抗体をさらに含有することを特徴とする、請求項２８から３０ま
    でのいずれか一項に記載の医薬品組成物。
32. 【請求項３２】 薬剤としての、請求項２８から３１までのいずれか一項に
    記載の医薬品組成物の使用。
33. 【請求項３３】 移植の強化、ＧｖＨの阻害、ＧｖＴおよび特にＧｖＬの刺
    激、および／または固形または液性腫瘍および／または微生物感染、特にウイル
    ス感染の予防、軽減および／または治療のための薬剤としての、請求項２８から
    ３１までのいずれか一項に記載の医薬品組成物の使用。
34. 【請求項３４】 抗−メラノーマ、抗−肝癌、抗−肺の腺癌の薬剤としての
    、請求項２８から３１までのいずれか一項に記載の医薬品組成物の使用。