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JP2002522750A - シトクロムｐ４５０媒介反応における有機化合物の反応性のモデル化 - Google Patents

シトクロムｐ４５０媒介反応における有機化合物の反応性のモデル化

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Publication number
JP2002522750A
JP2002522750A JP2000563827A JP2000563827A JP2002522750A JP 2002522750 A JP2002522750 A JP 2002522750A JP 2000563827 A JP2000563827 A JP 2000563827A JP 2000563827 A JP2000563827 A JP 2000563827A JP 2002522750 A JP2002522750 A JP 2002522750A
Authority
JP
Japan
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reaction
substrate
enzyme
metabolism
cyp
Prior art date
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Application number
JP2000563827A
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English (en)
Inventor
コーゼクワ・ケネス・アール．
ジョンズ・ジェフリィ・ピー．
ヒギンズ・リーアン
Original Assignee
ユニバーシティ・オブ・ピッツバーグ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ユニバーシティ・オブ・ピッツバーグ filed Critical ユニバーシティ・オブ・ピッツバーグ
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】 本発明は、新薬の設計、及びその代謝及び毒物学的プロフィールの予測における計算その他の経験的データの使用に関する。計算その他の情報は、特に薬品の代謝に関与するＣＹＰ系酵素等のモノオキシゲナーゼ酵素に関して、薬品の代謝及び毒物学を更に理解するために使用される。本発明の実施により導かれる情報は、薬品のクリアランス又は半減期と、その代謝によって生じる副産物の性質及び毒性とを決定するのに有効である。本発明はこれまでにない強力な薬品設計の新しいアプローチを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願：本願は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書
の一部とする１９９８年８月５日出願の米国暫定特許出願第６０／０９５，４６
０号に拠る優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新薬の設計、及びそれに関する代謝の特徴の予測における計算及び
実験データの使用に関する。計算その他の情報は、特に、薬品代謝に関与するシ
トクロムＰ４５０系等のモノオキシゲナーゼ酵素に関連する薬品代謝及び毒物学
を更に理解するために使用される。本発明の実施によって得られる情報は、薬品
のクリアランス又は半減期と、薬品の相互作用の傾向と、その代謝によって生じ
る副産物の性質及び毒性とを予測するのに有効である。本発明は、これまでにな
い強力な薬品設計の新しいアプローチを提供する。
【０００３】
【従来の技術】
薬品発見の発見段階の有効性を改善する機会は、製薬業界において広く認識さ
れている。組み合わせ化学及び並行合成法、ゲノム学、ロボット工学、小型化、
高スループットスクリーニング、及び情報技術は、共に潜在的な新しいリード化
合物の激増を刺激してきた。しかしながら、化合物を「候補」から「リード」へ
移行させるために利用できる専門知識及びリソースは限られている。この原因は
、部分的には、リード最適化プロセスの後半段階に取り組む新しい技術の発展の
ペースが、合成及びスクリーニングのために開発された組み合わせ技術と一致し
ていないためである。その結果、リード最適化で始まり、臨床開発候補の選択ま
で続く薬品発見プロセスにはボトルネックが存在する。
【０００４】 リード開発分野における主な考慮事項は、化合物の代謝の結果である。合成
化合物のスクリーニングへの依存を最小にする代わりに、代謝の特徴を予測する
ために分子の定量化可能な化学又は生化学特性を利用する設計アプローチによっ
て、こうしたリード物質の発見を加速できれば、製薬業界にとっては大きな価値
がある。予測モデルは、リード最適化のボトルネック軽減の他、後の更にコスト
のかかる薬品発見／開発プロセスの段階に進むための、単に適当ではなく最適な
吸収、分布、代謝、及び排出／薬物動態学（ＡＤＭＥ／ＰＫ）プロフィールを有
する薬品候補の設計及び選択の促進を助けることができる。このようにして選択
された化合物は、大きな開発の成功の可能性を有するだけでなく、最終的には、
より優れた医薬品につながる。
【０００５】 最適化された薬品化合物の設計に関連して、特に重要な一分野には、モノオキ
シゲナーゼ、混合機能オキシゲナーゼ、又は別名シトクロムＰ４５０として知ら
れる酵素のクラスが関係する。これらの酵素は、肝臓に豊富に存在しており、非
常に広範な基質化合物に作用し、これは酵素に関して非常に珍しい特性である。
これらの酵素は、酸素分子と反応し、酸素原子の一つを還元して水にし、他の原
子は基質有機化合物に挿入する、この代謝反応は、ヒドロキシル化反応とも呼ば
れる。
【０００６】 シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素は、７００以上の個別のアイソフォームを
含むヘム含有酵素のスーパーファミリを含み、植物、バクテリア、哺乳類の種に
存在する（ネルソン他（１９９６）、薬理遺伝学６（Pharmacogenetics 6）、１
乃至４２）。これらの酵素は主にモノオキシゲナーゼと同じ機能をする（ウィス
ロッキ他（１９８０）、酵素による解毒の原理（Enzymatic Basis of Detoxific
ation）（ジャコビ、Ｗ．Ｂ．編）１３５乃至８２ページ、アカデミック、ニュ
ーヨーク）。哺乳類において、これらは特定の内因性及び外因性化合物の代謝を
司る（ゴンザレス、Ｆ．Ｊ．（１９９２）最新薬理学（Trends Pharmacol.）、
第13節、３４６乃至５２）。哺乳類ＣＹＰによる脂肪族ヒドロキシル化の触媒サ
イクルについて、ここで簡単に説明し、図１に示す。基質結合は、ヘム鉄の平衡
を低スピンから高スピン状態に変化させる（ステップ１）。この変化は、鉄の還
元電位を低下させ、別の酵素、シトクロムＰ４５０還元酵素を介したＮＡＤＰＨ
からの電子移動を促進する（ステップ２）。酸素分子が結合し、一電子が還元さ
れ、鉄は二価鉄から三価鉄の状態に変化する（ステップ３及び４）。酸素の第二
の電子の還元が起こり、ペルオキシ基の中間体が生成される（ステップ５）。ペ
ロキシル基種が異方性分解を起こし、ヒドロキシルアニオンとして酸素の一原子
が離れ、他方は鉄と配位結合する反応性酸素種を形成する（ステップ６）。酸素
は基質に移動し（ステップ７及び８）、生成物は酵素から解離する（ステップ９
）。このサイクルの最初の３ステップは、分光学的に特徴付けられる。このサイ
クルの次の３ステップは急速に発生し、測定が困難であることが証明されている
。酸素移動のステップ（図１のステップ７及び８として示す）に関しては、少な
くとも二つのメカニズムが提示されており、以下で簡単に説明する。
【０００７】 酸素移動の共通メカニズムは非協奏的反応である。このコンテキストにおいて
、非協奏的とは、二つの個別のステップが存在し、各ステップが独自の遷移状態
を有することを意味する。ステップ７（図１）は、反応性酸素による基質からの
水素原子の分離であるという証拠があり、これは炭素ベースの基及び鉄結合ヒド
ロキシル基を生み出す（ホワイト他（１９８０）、生化学年間評論49（Ann. Rev
. of Biochem. 49）、３１５乃至５６）。次のステップ（図１のステップ８）は
、二つの基種の急速な再結合である「酸素リバウンド」ステップである。様々な
ＣＹＰ媒介反応における同位体効果の規模（グローブス他（１９７８）、生化学
及び生物物理学研究通信８１（Biochemical & Biophysical Research Communica
tions 81）、１５４乃至６０。エルメランド他（１９７７）、生化学生物物理学
研究通信（Biochem. Biophys Res. Commun. 76）、５４１乃至９）、立体選択性
の損失（グローブス他、同書。ホワイト他（１９８６）、米国化学学会ジャーナ
ル１０８（J. Am. Chem. Soc. 108）、６０２４乃至３１）、及び第一のステッ
プの基に似た生成物の転位の証拠（グローブス他（１９８４）、米国化学学会ジ
ャーナル１０６（J. Am. Chem. Soc. 106）、２１７７乃至８１）は、酸素リバ
ウンドメカニズムの場合をサポートする。
【０００８】 ＣＹＰに最適な基質は、ステロイドと、プロスタグランジンと、脂肪酸と、外
因性の薬品、殺虫剤、及び多くの発癌性物質を含むその他の毒性環境汚染物質と
を含む。ヒドロキシル化反応は、例えば、処理する薬品の不活性化につながる異
質の基質の代謝における最初のステップとなる場合が多い。薬品の作用のメカニ
ズム及び毒物学的特徴に応じて、体内に入った後の分解を加速又は遅延させるこ
とが望ましい場合がある。加えて、他の考えられる薬品は、毒性が強すぎて処理
できない可能性があるが、適切な構造修正が、例えば、異なる毒性の弱い代謝物
へ分解される構造につながる可能性もある。
【０００９】 例えば、ベンジル位置のフェニルアセトニトリル（図２、矢印参照）の代謝は
、毒性代謝シアン化物の発生を引き起こし、芳香族酸化は毒性の弱い生成物につ
ながる（シルバ他（１９８２）、薬品代謝の性質１０（Drug Metab. Dispos. 10
）、４９５乃至８）。ＣＹＰ及びエポキシドヒドロラーゼによるベンゾ（１２）
ピレンの代謝（フランキッティ他（１９９５）、薬品化学ジャーナル３８（J. M
ed. Chem. 38）、３８２９乃至３７）により、極めて発癌性の高い化合物７（Ｒ
），８（Ｓ）ジヒドロジオール９（Ｓ），１０（Ｒ）エポキシドを含む、いくつ
かの代謝物が生じる。これらは位置選択性及び立体選択性が毒性の重要な決定要
素である例である。加えて、単一のＣＹＰアイソフォームによる複数の薬品の代
謝における違い、及び薬品による個々のＣＹＰアイソフォームの誘導又は抑制に
よって、潜在的な薬品の相互作用が発生する可能性がある。それぞれに含まれる
多形性酵素発現は珍しいパターンの薬品代謝を引き起こす場合があり、これは不
要な副作用につながる可能性がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
前記の通り、ランダムに変更した構造のテストへの依存を最小にする薬品設計
のために現在利用可能な方法を強化する大きな必要性が存在する。しかしながら
、基礎研究のエリアにおいて進歩があったとしても、現時点では、予測代謝の分
野は業界において広がっていない。酵素反応の主な二つの決定要素は、酵素及び
基質の立体及び電子特性である。ＣＹＰによって代謝される小規模な化合物のい
くつかのクラスに関する相対的な反応速度及び同位体効果プロフィールの予測を
成功させるために、計算的（グローガン他、（１９９２）、毒物学の化学研究５
（Cem. Res. Toxicol. 5）、５４８乃至５２。コルゼクワ他（１９９０）、米国
化学学会ジャーナル１１２（J. Am. Chem. Soc. 112）、７０４２乃至６。イン
他（１９９５）、米国科学アカデミ会報９２（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92
）、１１０７６−８０）及び化学的（カーキ他（１９９５）、米国化学学会ジャ
ーナル１１７（J. Am. Chem. Soc. 117）、３６５７乃至６４。マンチェスタ他
（１９９７）、米国化学学会ジャーナル１１９（J. Am. Chem. Soc. 119）、５
０６９乃至７０）アプローチを使用する様々な電子モデルが開発されている。化
合物の小さなサイズは、代謝の結果に対する立体の寄与を減少させるか、若しく
はほぼ排除する。
【００１１】 場合によっては、立体要素がＣＹＰ基質の相互作用の主な決定要素となる（ジ
ョーンズ他（１９９５）生化学３４（Biochemistry 34）、６９５６乃至６１）
。計算的方法は、分子力学及び分子モデリングを含み、現在、基質と酵素との間
の相互作用を探るのに利用されている（ジョーンズ他（１９９３）、米国化学学
会ジャーナル１１５（J. Am. Chem. Soc. 1195、３８１乃至７）。こうした方法
は、ＣＹＰタンパク質の結晶構造に頼っているが、四つの（可溶性の）バクテリ
アＣＹＰアイソフォームに関しては、僅かな結晶構造しか存在しない（ラビチャ
ンドラン他（１９９３）、サイエンス２６１（Science 261）、７３１乃至６。
プーロス他（１９８７）、分子生物学ジャーナル１９５（Journal of Molecular
Biology 195）、６８７乃至７００。ヘイズマン他（１９９４）、分子生物学ジ
ャーナル２３６（Journal of Molecular Biology 236）、１１６９乃至８５。カ
ップ・ビッカリ他（１９９５）、構造生物学２（Structural Biology 2）、１４
４−５３）。（膜結合の）哺乳類のアイソフォームの結晶構造は利用できない。
バクテリア及び哺乳類のＣＹＰには配列相同性は少ないが、現在のデータは、あ
る程度の三次構造が維持されていることを示している（コルゼクワ他（１９９３
）、薬理遺伝学３（Pharmacogenetics 3）、１乃至１８）。バクテリアのアイソ
フォームをテンプレートとして、相同モデリング手法を使用して、哺乳類のアイ
ソフォームの構造モデルを生成する（ヘイズマン他（１９９５）、構造３（Stru
cture 3）、４１乃至６２）。この構造モデルでは、哺乳類のＣＹＰの活性部位
近くにある残基を発見できることが証明されている（スクラーズ他（１９９５）
、生化学３４（Biochemistry 34）、１４３１２乃至２２）。この結果により、
部位に向けた突然変異生成の研究が開始され、活性部位の構造の詳細に関する新
たな情報が提供された（コバヤシ他（１９９８）、生化学３７（Biochemistry 3
7）、６６７９乃至８８）。この追加情報は次に、相同モデルを精緻なものにす
るのに使用された。哺乳類のＣＹＰ媒介反応の結果の予測に関して、構造及び電
子情報を結合するモデルを発見する課題が残っている。
【００１２】 本発明は、改善された治癒効果又は毒物学的プロフィールを有する有望な治癒
効果のある化合物を特定するために、他の実験的なデータと共に、計算的モデル
を使用することに向けられている。ＣＹＰ酵素は、二つの理由から、電子ベース
又は量子力学的予測計算モデルの開発にとって扱いやすい。１）酵素と基質との
相互作用の弱さから、多くのアイソフォームが示す基質の特異性が低い。２）酵
素族の触媒ステップが、酸素分子の異方性分解であると考えられる（図１のステ
ップ６）。したがって、酵素の結合部位との弱い相互作用を有する基質に関して
、活性酸素の電子的特徴と単一分子の様々な官能基の固有の反応性が、代謝の相
対的な速度を決定する可能性がある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、薬品の反応性の統一モデルを決定するために計算デー
タ及び実験データを結合できるシステムを提供する。したがって、この方法は、
薬品代謝の速度及び位置特異性を予測する計算モデルを提供する。このアプロー
チを、ＣＹＰ等のモノオキシゲナーゼ酵素との相互作用の結果である特性を参考
に説明するが、一般的な原則は、広範なコンテキストに応用できると理解される
。
【００１４】 本発明は、実験データ、及び量子力学的（電子配置を含む）データを使用して
、酵素との相互作用による様々な基質の予測された反応性と、代謝物及び前駆体
とをパラメータ化する方法に関連する。この方法は、広い基質特異性（又は低い
基質選択性）を有する酵素に最適である。こうした酵素の例には、モノオキシゲ
ナーゼ、グルコロニルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼが
含まれる。
【００１５】 パラメータ化が望ましい標本物質には、様々な薬品化合物又は薬学的な活性剤
及び（摂取又は吸入によって）生体に導入される任意の分子が含まれる。こうし
た導入の後、これらの物質には、モノオキシゲナーゼシトクロムＰ４５０（ＣＹ
Ｐ）を含む様々な酵素との反応が起きる可能性がある。ＣＹＰタイプの酵素との
基質反応は、例えば、結果として生じる水素原子の分離、芳香族酸化、及びカル
ボニル基又はヘテロ原子での代謝を含む。
【００１６】 したがって、本発明の一態様は、毒性代謝物につながる非悪性代謝又は生物活
性、半減期、及び服用量に関する利点を提供する薬品における構造的特徴を特定
するための様々な潜在的酵素反応の位置選択性及び基盤となる化学反応の分析に
関与する。驚くべきことに、以下で説明する通り、基盤となる化学反応の位置選
択性は、こうした判断において最も重要である場合が多い。
【００１７】 非触媒反応において、反応の位置選択性は、関与する分子の様々な位置の反応
に関するエネルギの違いを反映する。しかしながら、酵素触媒反応においては、
基質化合物は、非常に特定的な形で酵素と結合する場合が多く、これにより位置
選択性が変化する。基質に固有の反応性の違いを、酵素が強制する立体相互作用
によるものから分離するのは一般に非常に困難である。言い換えれば、酵素によ
る代謝時のターゲット化合物における構造的変化の影響を予測することは、その
代謝の分子メカニズムが、代謝する酵素及び化合物自体による影響の本質的な組
み合わせに関与することを考えると、一般に困難である。
【００１８】 しかしながら、本発明の実施によれば、様々な化合物（潜在的な薬品物質を含
む）の代謝について、広範な基質特異性を有する酵素による最適化された代謝に
関する大量の予測情報が、実際に、反応物の基盤となる電子構造の位置選択性か
ら直接得られると判断される。これにおいて、この情報は酵素の参照を必要とせ
ずに得ることができる。これは、新たに設計される治療薬における最適化された
構造的特徴の計算的分析を大きく促進する。
【００１９】 理論について限定されることなく、ＣＹＰ等の特定の酵素は、他の場合では容
易に代謝又は解毒されない広範な物質を代謝するように進化してきた。その結果
、広範な反応を提供するために、特定の物質に関する通常の酵素の高い選択性、
及び酵素の活性部位で通常見られる立体的要件は小さくなり、したがって、代謝
された物質の電子配置を参照するだけで得られる計算的情報の価値は大幅に高め
られる。
【００２０】 前記のコンセプトは、ここでは主に人間の薬品及びＣＹＰに関して説明されて
いるが、本発明の方法は、工業又は農業用化学物質等の設計に関して、広範な基
質特異性を有する任意の酵素に適用可能であり、この場合の関心は、最適な服用
又は薬効ではなく、望 ましくない代謝を避けることが求められる人体と接触する可能性のある物質（殺
虫剤又は薬剤）の代謝（生体活性又は不活性化）を避けることに向けられる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
前記のように、本発明は、広範な基質特異性を有する酵素による化合物の代謝
に関する電子的傾向を決定する方法に向けられている。こうした方法は、実験デ
ータ、及び量子力学的（電子配置を含む）データを使用して、こうした酵素との
反応時の様々な基質の予測される反応性をパラメータ化する。こうした反応は、
電子的要素に加えて立体的要素が含まれる場合があり、又は立体によって発生す
る場合もあるが、本発明の方法は様々な基質の酵素代謝を決定する手段を提供す
る。
【００２２】 本発明の一形態において、こうした方法は以下のステップを含む。
【００２３】 ａ）前記酵素を参照せずに、前記酵素によって媒介される任意の（複数の）反
応による代謝変換に向けた前記化合物内の各官能基の位置特異的な反応性を決定
する。
【００２４】 ｂ）量子化学記述子に対する媒介反応についての活性化エネルギに関する一つ
以上の式を導く。
【００２５】 ｃ）前記一つ以上の式から、各反応の活性化エネルギを予測することで、前記
化合物の代謝を決定する。
【００２６】 前記決定された電子的傾向は、前記反応の電子的構成要素を提供する。これに
より、この方法は、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｃ、Ｃ＝Ｃ、Ｃ≡Ｃ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ−Ｎ、Ｃ＝Ｎ
、−Ｓ−、−Ｎ−、−Ｎ＝、−ＣＨＯ、−ＯＨ、及び−ＣＯＨ等の官能基の位置
特異的な反応性と、各酵素媒介反応に関する活性化エネルギを量子化学記述子に
関連させる式とを組み合わせて使用して、様々な化合物の代謝を決定する。各酵
素媒介反応の活性化エネルギは更に、前記化合物の反応の熱に関連する場合があ
る。式を導く一手段は、半経験的方法の使用による。
【００２７】 この式は、半経験的方法の使用による活性化エネルギの誤りを修正するための
実験結果のパラメータ化によって精緻なものにできる。こうした実験的パラメー
タ化は、前記（複数の）反応の同位体効果プロフィールを決定することで酵素の
活性部位における相対的な基質の回転速度を特定することにより達成できる。
【００２８】 この式は、活性化エネルギにおける誤りを修正するために高レベル量子化学パ
ラメータを計算することによっても精緻なものにできる。高レベル量子化学パラ
メータの使用は、前記の実験的パラメータ化と組み合わせて使用可能であり、前
記一つ以上の式における量子化学活性化エネルギ（ＡＭ１）及び又はスピンの悪
影響を修正するための非経験的方法の使用を含む。
【００２９】 こうした方法によって、化合物の代謝によって以下の一つ以上が生じるかどう
かを決定できる。
【００３０】 （１）毒性代謝物の過度な集中の生成。
【００３１】 （２）薬品として有効な物質の過度な代謝速度。
【００３２】 （３）薬品として有効な物質の不適切な代謝速度。
【００３３】 （４）薬品以外として有効な物質の毒性代謝物への過度な代謝速度。
【００３４】 本発明の方法は、広範な特異性を有する任意の酵素に応用できるが、以下の説
明は、代表例として、モノオキシゲナーゼ、ＣＹＰの使用に基づいている。その
ため、説明する主な酵素媒介反応は、水素原子分離及び酸素添加に関連する。こ
れらの反応は、ヒドロキシル化及び芳香族酸化を含む。明らかに、グルコロニル
又はグルタチオントランスフェラーゼといった他の低基質選択性酵素の使用では
、他の化学反応に重点が置かれる。
【００３５】 本質的に、任意の新しい疎水性薬品又は生体異物は、シトクロムＰ４５０（Ｃ
ＹＰ）系にとって基質の役割を果たす。そのため、こうした酵素、特に人間のＣ
ＹＰ酵素によって媒介される反応の予測モデルは、極めて有効なツールである。
基質の一定のＣＹＰ媒介酸化の速度が予測できれば、多数の特性が予測可能であ
り、これには薬品のクリアランス、生体異物の毒性、及び一定の基質から生じる
様々な代謝物の量が含まれる。こうした予測は、薬品設計、薬品代謝、及び毒物
学において有効である。
【００３６】 特定のＣＹＰ酵素の特性から、これらは、その反応性のモデル化に使用する理
論的計算にとって最適である。第一に、この酵素の原則的な触媒ステップは、活
性酸素種の生成に関与する。このステップを開始する可能性を除けば、基質は直
接には関与しない。活性酸素種の生成後、基質は「化学物質同様」と思われる形
で反応し、反応の広範な位置選択性のみが酵素によって影響を受ける。第二に、
多くのＣＹＰ触媒反応は、活性酸素が基の特性を有すると考えられるため、酸化
の最初のステップ中、大きな電荷の生成が関与する可能性が低い。加えて、ＣＹ
Ｐ活性部位は、極性環境よりも疎水性が強く、気相の計算において優れた推量が
できる。
【００３７】 本発明に関して、以下の参考文献は、参考としてここにすべてを明確に取り入
れており、これらは本開示の一部をなす。Ｊ・ゴーガン他、毒物学の化学研究（
Cem. Res. Toxicol.）、Ｖｏｌ．５、Ｎｏ．４、５４８乃至５５２ページ、１９
９２年。Ｈ・イン他、米国科学アカデミ会報（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、
Ｖｏｌ．９２、Ｎｏ．５、１１０７６乃至１１０８０ページ、１９９５年。Ｊ・
ジョーンズ他、「Ｐ４５０スーパーファミリが媒介する反応の速度及び位置特異
性の予測（Predicting the Rates and Regiospecificity of Reactions Mediate
d by the P450 Superfamily）」、酵素学の方法（Methods in Enzymology）内、
Ｖｏｌ．２７２、３２６乃至３３５ページ、１９９６年。Ｋ・コルゼクワ他、ア
メリカ化学学会ジャーナル（J. Am. Chem. Soc.）、Ｖｏｌ．１１２、７０４２
乃至７０４６ページ、１９９０年。
【００３８】 本発明の薬品代謝の予測モデルは、量子化学の方法の応用に基づいている。こ
れらは、半経験的（電子的）方法及びガウスに基づく非経験的方法を含む。これ
らの方法は当業者に知られている（リコウィッツ他、計算的化学の調査ＩＩ（Re
views in Computational Chemistry II）、ＶＣＨパブリッシャーズ、１９９１
年、３１３乃至３１５ページを参照）。第一の推量として、空間内の原子の配向
によって、分子の電子構造が決定される。安定した分子のジオメトリは、最低の
エネルギの電子配置を提供する原子配置に関連する。反応は、反応物から生成物
への原子配列の変化を通じて発生する。反応の位置に従って、反応物のジオメト
リ（安定した低エネルギ配置）から遷移状態のジオメトリ（不安定な高エネルギ
配置）に向けてエネルギが増加し、その後、再び減少し、生成物が生成される。
【００３９】 量子化学的手法では、原子の配向に関連する電子配置及びエネルギをモデル化
する。概算のジオメトリは、原子の位置に関するエネルギを最小化することで安
定した形状に最適化できる。反応は、反応物ジオメトリを生成物ジオメトリに転
換し、一つの自由度を除き、すべてを最小化することでモデル化できる。
【００４０】 したがって、量子化学方法の「中心」は、一定の原子配置に関する電子構造の
計算に使用する方法である。分子の電子配置は、分子軌道を形成するために原子
軌道を組み合わせることで得られる。電子の波動関数の式は今世紀の初めから存
在するが、これらは解法としては扱いにくい。そのため、この式の解法において
は、異なる推量が使用される。
【００４１】 電子構造計算の複雑な部分は、多重中心電子反発期間に関連している。半経験
的（電子的）方法では、生成のジオメトリ及び熱を複製するために最適化された
関数によって、こうした期間を推量する。結果として生じる電子配置及びエネル
ギは、半経験的方法の最初のパラメータ化に依存する。対照的に、非経験的方法
では、実験的データを使用しない。代わりに、こうした計算では、統合が容易な
ガウス関数の組み合わせによって原子軌道を推量する。多くのガウス関数を使用
すれば（大きな基準設定）、電子の表現がより正確になる。更に、エネルギが小
さければ、より優れた計算となる。
【００４２】 別の重要な概念として、励起状態の電子配置で混合することにより、低いエネ
ルギが得られる。これは電子の相関関係によるもので、電子が互いに離れる傾向
にあるためである。このエネルギの増加はほとんどの分子にとって重要ではない
が、基、励起状態、及び遷移状態等の不安定な形状にとっては重要である。正確
な非経験的計算では、相関関係を含める追加の作業が必要になる。
【００４３】 半経験的計算は迅速であり、非常に大きな分子のモデル化が可能である。大き
な基準設定及び相関補正のある非経験的計算は、主に相関補正のため非常に時間
がかかる。計算は現在、約１０の重（非水素）原子に限られている。
【００４４】 本発明では、密度関数理論に基づく追加の非経験的方法も使用される。こうし
た方法は波動関数計算に相関関数を含む。こうした計算は、相関補正計算よりも
遙かに早いが、相関関数の正確な形態は含まれない。そのため、こうした関数は
パラメータ化され、半経験的計算と同じ欠陥のいくつかが生じ、つまり、低いエ
ネルギが必ずしも優れた計算を意味するとは限らない。こうした計算は基底状態
（つまり反応物及び生成物）に関して優れていると思われ、修正によって遷移状
態の計算にも適用できる。
【００４５】 本発明は、半経験的計算（ＡＭ１）を使用して、薬品代謝の予測モデルを構築
する。こうしたモデルは、小さな有機酸素基との基質の反応によって決定される
代謝の電子的傾向に基づく。半経験的計算の速度は、本質的に、任意の薬品分子
のモデル化を可能にする。相関する（ＭＰ２）非経験的方法及び密度関数方法は
、半経験的な結果を検証及び補正するために使用できる更に意味のあるエネルギ
を提供するのに使用される。
【００４６】 前記に基づき、本発明は、多数の小さな基及び基質間の反応に基づくＣＹＰ媒
介水素原子分離及び芳香族酸化反応のモデルに向けられている。使用される基は
、ｐ−ニトロソフェノキシル基（ＰＮＲ）、ｔ−ブトキシ基、メトキシ基、ＨＳ
Ｏ基、及びＦＯ基である。他の基も、水素原子分離及び芳香族酸化反応その他の
Ｐ４５０媒介反応に関する追加モデルを生成するために使用できる。
【００４７】 ＰＮＲモデルの制限 私たちが以前に発表したモデルでは、ＣＹＰ媒介水素原子分離のモデルとして
、水素分離におけるｐ−ニトロソフェノキシラジカルを使用している。このモデ
ルを使用し、小さな疎水性化合物のいくつかのクラスにおける反応の相対速度を
正確に予測できる。例えば、このモデルでは、ニトリルの毒性（ＬＤ50）、置換
されたトルエン及びアロアルカンのin vitro代謝の速度、及びハロゲン化された
炭化水素麻酔薬のin vitro代謝の速度を予測できた。このモデルは、計算データ
のみに基づいている。一種類の反応のみが関与するため、パラメータの絶対値に
関係なく相対速度間の関係が維持されることになり、絶対速度を生成する線形モ
デルのパラメータ化は必要ない。
【００４８】 ＰＮＲモデルはＣＹＰ反応（水素原子分離）の１クラスを予測するのに有効だ
が、ＣＹＰ酵素の完全な予測モデルでは他の反応タイプも含める必要がある。こ
れには、芳香族酸化、オレフィン酸化、カルボニル代謝、Ｎ−酸化、及びＳ−酸
化が含まれる。以前に発表したＰＮＲモデルの欠陥は、他の反応をモデル化した
時に明らかになる。こうした問題は次のようにまとめられる。
【００４９】 １）計算方法内の体系的誤差が異なる反応タイプで一致しない場合がある。体
系的誤差の差異が予測される理由は次のとおりである。
【００５０】 ａ）体系的誤差はポテンシャルエネルギ表面の性質に依存する。例えば、絶対
的な活性化エネルギはＡＭ１形式内で非常に過大評価される。計算の値は、相対
的な活性化エネルギを提供する能力によるものである。
【００５１】 ｂ）エントロピ条件は一連の関連する反応の中で相殺されることが予想される
が、異なる反応を考慮する時には相殺されない。
【００５２】 ２）基追加反応は、大きなスピン汚染を有する。これはＵＨＦ（無制限ハート
リ−フォック）法の欠陥であり、オープンシェルシステムの波動関数は、高いス
ピン状態の波動関数によって汚染される。これは計算の相対エネルギ特性に更な
る不確実性を与える。遷移状態は約２．１の＜Ｓ2＞値を有し、四面体中間体は
約１．１の＜Ｓ2＞値を有する。純粋なダブレットは０．７５の＜Ｓ2＞値を有し
、これは高いスピン状態による大きな汚染を示す。置換ベンゼンの場合のように
、スピン汚染の量が一定の状態を維持する場合、このエラーも一定である可能性
が高く、問題にはならない。しかしながら、多環式芳香族炭化水素の計算は、基
の接合の範囲に応じてスピン汚染の度合いを示し、つまり、スピン汚染の度合い
はサイズと一致しない。したがって、異なる基質はスピン汚染による異なる誤差
を有する。
【００５３】 ３）ニトロソフェノキシラジカルの芳香族炭素への追加は遷移状態を通じてス
ムーズに進展し、四面体中間体につながるが、四面体中間体の電子状態は規制状
態ではない。したがって、反応物から生成物、及び生成物から反応物への反応は
、二つの異なるポテンシャルエネルギ表面で発生する。任意の遷移状態の研究を
複雑にするのに加え、遷移状態は必ずしも生成物と反応物との間の中間体ではな
いため、任意のブレンステッド相関の値も不確かである。
【００５４】 したがって、更に包括的なＣＹＰ酵素の予測モデルを策定するために全く異な
るアプローチを使用する必要がある。本発明では、実験データ及び追加の量子化
学方法を使用して、水素原子分離、芳香族酸化、及びカルボニル化合物の代謝を
含む、いくつかのタイプのＣＹＰ媒介酸化反応を予測するモデルをパラメータ化
する方法を説明する。このモデルでは、ニトロフェノキシ基といったモデル酸素
基の遷移状態の計算を必要としない。代わりに、このモデルは、酵素反応の実験
的位置選択性を使用してパラメータ化される。モデル策定のための追加データ入
力は、化学系の反応速度、及びアルコキシ基を使用した非経験的量子化学計算に
よって提供される。
【００５５】 酵素系によるパラメータ化： 以下の例で説明する多数のＣＹＰ特性に基づいて、基盤となる反応物の電子構
造から予測情報を導くことの妥当性を実証する。この特性は、動力学同位体効果
（ＫＩＥ）による活性ＣＹＰ酸素が多数のＣＹＰアイソフォームにおいて等しい
ことの実証と、分子内及び分子間ＫＩＥ、及びモデル基質での競合ＣＹＰ媒介反
応からの生成物の割合による、急速な基質の回転が位置選択性の予測に電子要素
のみの使用を可能にすることの指摘とを含む。後者のポイントは、予測モデルを
導くモデルデータの取得においてＣＹＰ酵素に位置するモデル基の使用を可能に
するため、特に重要である。
【００５６】 これらの結果により、水素原子分離及び芳香族酸化のモデルは、量子化学法の
応用によって導かれる。
【００５７】 しかしながら、半経験的（電子的）方法の使用は、不正確な絶対活性化エネル
ギ（ＡＭ１）障壁を生み出すため、この方法は異なる反応メカニズムのエネルギ
特性の比較には不適切となる。しかしながら、計算の計算コストを最小にするた
めに、これらの方法に基づくモデルを使用するのが好ましい。単一の化合物から
の代謝の比率を計算し、他の反応メカニズムを含めるために、ＡＭ１障壁は実験
データとの相関によって補正する必要がある。実験データは、基質において代謝
の位置の間での急速交換が起きている時の代謝物比率から得られる。この急速交
換は、急速平衡とも呼ばれ、ＣＹＰ媒介反応における急速な基質の回転を反映し
、ＫＩＥの調査によって決定できる。
【００５８】 水素原子分離： 前記に基づき、本発明のＣＹＰによる水素原子分離の最初のモデルは、基質と
基生成物の量子化学記述子からの半経験的量子化学的活性化エネルギ（ＡＭ１）
に基づいて公式化される。これは下の式１の方程式で表現可能であり、これによ
り活性化エネルギ（ΔＨact）を、水素原子分離反応に関するそれぞれの反応の
熱（ΔＨR）及び結果として生じる基のイオン化ポテンシャル（ＩＰrad）に関連
づける。これにより、基底状態特性の急速な計算によるＡＭ１活性化エネルギの
予測が可能になる。
【００５９】
【数１】
【００６０】 この式は、独立して使用した時、ＡＭ１活性化エネルギを再現できるが、ＡＭ
１形式はこうした障壁を過大評価することが知られている。したがって、前記の
ように、実験データをこの式に相関させ、過大評価を補正できる。これは、この
ＡＭ１活性化エネルギの関数を含むパラメータに関する実験データの回帰による
相関によって可能になる。過大評価された障壁は、回帰式の比例定数によって補
正される。回帰による相関に基づく改善は、回帰に使用する実験データ点の数に
応じて変化する。そのため、式の精度は、増加する実験データの量に基づく回帰
による補正により、繰り返し改善できる。
【００６１】 式１の回帰及びその後の補正用のデータを準備するために、代謝位置の間での
急速平衡を起こす５種類の表示の基質が使用される。基質の実験的位置選択性に
よって計算された活性化エネルギの差異、及びＡＭ１活性化エンタルピの差異を
、表１に示す。実験データの回帰は、ＡＭ１活性化エネルギに関して０．７５±
０．２０の勾配補正を与える。
【００６２】
【表１】
【００６３】 ＡＭ１活性化エネルギを補正する別のソースは、高レベル非経験的計算であり
、これは実験的補正と組み合わせることができる。前記のように、ＣＹＰ媒介水
素原子分離反応のモデルとしてｔ−ブトキシ及びメトキシ基を使用できる。表２
は、メトキシ基媒介水素原子分離に関する非経験的ＭＰ２／６３１１＋Ｇ*活性
エネルギを、ｐ−ニトロソフェノキシル基でのＡＭ１結果と比較して示している
。ＭＰ２及び６３１１＋Ｇ*は当技術において知られている非経験的量子科学形
式である。
【００６４】
【表２】
【００６５】 このデータの回帰により、ｒ2＝０．９５で式２が導かれる。
【００６６】
【数２】
【００６７】 勾配補正０．８２は、前記の実験的補正０．７５と同様である。切片補正−６
．１１は、相対的な自由エネルギの差異が計算される時に相殺されるため、本質
的には表面上のものである。実験的補正０．７５及び切片補正−６．１１を式１
の補正として使用すると、水素分子分離に関する実験的に補正された式（式３）
が導かれる。
【００６８】
【数３】
【００６９】 この式は、表１の実験的データと最も調和する反応のＡＭ１熱及びイオン化ポ
テンシャルを提供する。更に、計算されたＭＰ２／６３１１＋Ｇ*活性化エネル
ギと一致する絶対値を導く。
【００７０】 前記を考慮すると、ＣＹＰによる関係する一定の化合物における水素原子分離
の電子的傾向の予測は、後者から前者を減じることで反応熱を求められる基及び
基質の生成熱と、基のイオン化ポテンシャルとを単純に計算することで実行でき
る。Ｐ４５０部位で急速に回転する基質に関して、このモデルは位置選択性を予
測する。立体効果が関与する場合、このモデルは反応の電子構成要素を予測する
。
【００７１】 この水素原子分離を予測する方法の妥当性は、ＣＹＰ３Ａ４酵素に関して観察
される。この酵素は広範な基質特異性と、ほとんどの基質に関する明らかに最低
限の立体的相互作用とを有する。ＣＹＰ３Ａ４基質の代表リストを表３に示す。
【００７２】
【表３】
【００７３】 この表において、このモデルは１５基質中１２の一次代謝を正確に予測した。
これはこれらの基質の酸化が電子的に制御されていることを意味する。非活性化
位置において代謝される化合物は、立体的制御になる可能性が高い。
【００７４】 芳香族酸化 芳香族酸化は、基追加メカニズムを通じて発生すると思われる。残念なことに
、ｐ−ニトロソフェノキシル基の芳香族炭素への追加は遷移状態を通じてスムー
ズに進み、四面体中間体となり、この中間体の電子状態は基底状態ではない。し
たがって、反応物から生成物、及び生成物から反応物への反応は、二つの異なる
ポテンシャルエネルギ表面で発生する。遷移状態の研究を複雑にするのに加え、
遷移状態は必ずしも生成物と反応物との間の中間体ではないため、置換ベンゼン
に追加する任意のブレンステッド相関の値も不確かである。
【００７５】 したがって、ｐ−ニトロソフェノキシル基のみでは、他のＣＹＰ媒介酸化に関
する万能のモデルとして機能しないと思われる。ＰＮＲモデルによる量子化学モ
デルの策定における難点は、１）ＡＭ１計算に関連する不正確なエネルギ、２）
無制限ハートリ−フォック（ＵＨＦ）計算に関するスピン汚染、及び３）ｐ−ニ
トロソフェノキシル基モデルに関する表面交差としてまとめることができる。こ
れらの問題は、１）実験的パラメータ化の使用、２）実験的パラメータ化を導く
高レベル非経験的計算の使用、及び３）モデル酸化剤としてのメトキシ基の使用
によって解決される。
【００７６】 実験的パラメータ化を使用することの妥当性を以下によって提示し、これによ
りＣＹＰ媒介芳香族酸化を起こす基質で考えられる急速な回転と、ＣＹＰ媒介芳
香族酸化反応をモデル化するために基を使用することの妥当性とを示す。
【００７７】 ＡＭ１計算に関連するエネルギの不正確さの問題に取り組むために、ｐ−ニト
ロソフェノキシル基以外の小さな酸素基をＡＭ１形式内でテストする。ＨＳＯ及
びＦＯ基は、ＡＭ１形式を使用して芳香族化合物にスムーズに追加されることが
分かった。以前使用したｐ−ニトロソフェノキシル基とは対照的に、ＨＳＯ及び
ＦＯ基は単一ポテンシャルエネルギ表面上にとどまる。どちらの基も、置換ベン
ゼンに追加する、優れた修正ブレンステッド補正を提供し、ＨＳＯではＲ2値が
０．９８、ＦＯでは０．９９である。メタ及びパラ位置の両方でのこうした優れ
た補正は、多様な電子特性を説明するためにモデルを策定できることを示す。こ
のデータは更に、活性化エネルギが単純に反応の熱の関数であり、共鳴に関して
補正する必要がないことを示す。
【００７８】 ＵＨＦ計算に関する反応位置に伴う大量のスピン汚染の問題は、更に難しい問
題である。これはＵＨＦ方法の欠陥を反映し、オープンシェルシステムの波動関
数は、高いスピン状態の波動関数に汚染される。これにより、計算の相対的エネ
ルギに不確実性が追加される。遷移状態は約１．２の＜Ｓ2＞値を有し、四面体
中間体は約１．１の＜Ｓ2＞値を有する。純粋なダブレットは０．７５の＜Ｓ2＞
値を有し、これは高いスピン状態による大きな汚染を示す。置換ベンゼンの場合
のように、スピン汚染の量が一定の状態を維持する場合、この誤差も一定である
可能性が高く、問題にはならない。しかしながら、多環式芳香族炭化水素の計算
は、基の接合の範囲に応じてスピン汚染の度合いを示し、つまり、スピン汚染の
度合いはサイズと一致しない。したがって、スピン汚染の補正が必要である。
【００７９】 スピン汚染を補正する一手段では、非経験的計算を利用する。ＭＰ２、ＭＰ４
、及び密度関数の非経験的計算を使用して、基底状態の基質、及び可能かつ必要
である時には、遷移状態を取得する。妥当な精度のエネルギ特性を取得するには
、少なくとも６−３１Ｇ*原則設定によるＭＰ２レベルの理論が必要である。Ｍ
Ｐ４、６−３１Ｇ*、及びＤＦＴは、当技術で知られている非経験的量子化学形
式である。この原則設定を使用することで、水素原子はｔｅｒｔ−ブトキシ及び
メトキシ基を使用して一連の基質から分離される。メトキシ基は芳香族系にスム
ーズに追加される。ＭＰ２計算は投射後、最低のスピン汚染を有する。
【００８０】 メトキシ基の計算に関する修正ブレンステッド補正を図３に示す。類似する結
果は、ｔｅｒｔ−ブトキシ基の計算に関しても得られる。メトキシ基が使用され
るのは、ｔｅｒｔ−ブトキシ基よりも遙かに小さいからである。分子内の非水素
原子数の上限は約１０であるため、メトキシ基を使用した場合、更に多くの反応
がモデル化できる。実験的なＯＨ結合解離エネルギがほぼ同一であるため、これ
ら二つの分子のエネルギ特性は類似する可能性が高い。半経験的ＰＮＲモデルと
同じく、妥当な修正ブレンステッド補正は、メトキシ基（Ｒ2＝０．９１）及び
ｔｅｒｔ−ブトキシ基（Ｒ2＝０．９２）の両方に関して得られる。したがって
、メトキシ基の計算（６−３１Ｇ*／ＭＰ２）は、Ｐ４５０酸化の妥当なモデル
を提供できる。こうした結果は、計算モデルのパラメータ化を導くために、アル
コキシ基の非経験的計算を使用できることを示している。
【００８１】 スピン汚染を補正する別の方法では、密度関数計算を利用する。こうした方法
は、非常に僅かなスピン汚染による相関結果を提供可能な素早い高レベルの非経
験的方法である。遷移状態の計算における値は不確実だが、優れた非汚染基底状
態のエネルギを提供可能である。例えば、七つの炭素水素結合の結合解離エネル
ギは、スピン投射ＭＰ２結合解離エネルギ（Ｒ2＝０．９３）と比例することが
分かり、ｔｅｒｔ−ブトキシ基分離速度とＤＦＴ計算との間の優れた補正が得ら
れた（以下を参照）。ＤＦＴ計算はスピン汚染を有しない。
【００８２】 したがって、このアプローチでは、反応熱におけるスピン汚染を補正するため
に密度関数の非経験的方法を使用する。こうした補正された反応熱は、その後、
芳香族酸化の活性化エネルギを予測するために使用できる。図４は、芳香族環へ
のメトキシ基の追加に関する、密度関数（Ｂ３ＬＹＰ）と反応のＡＭ１熱との間
の相関を示す。適合のためのパラメータは式４によって得られ、ここで値ΔＳ2
はＡＭ１計算におけるＵＨＦスピン汚染の補正である。
【００８３】
【数４】
【００８４】 水素原子分離及び芳香族酸化に関する正確な統合モデルの作成には、酸化反応
と水素原子分離反応との競合を考慮する必要がある。これらの競合する反応の間
の関係は、式５及び６によって表現可能であり、ａは芳香族酸化の切片補正であ
り、ｂは芳香族酸化の勾配項であり、ａ（１−ｙ）の項は、（式５のように）切
片補正が必要ない時はｙ＝１、（式６のように）切片補正が必要である時はｙ＝
０で使用される。これらの方程式により、水素分離比率の有無に関係なく、芳香
族酸化を含むデータセットを同時に解くことができる。
【００８５】
【数５】
【００８６】
【数６】
【００８７】 これらの方程式は表４のデータによって解くことが可能であり、多数の基質に
よる芳香族酸化反応に関する実験データを提供する。
【００８８】
【表４】
【００８９】 解において、表４のデータはａ＝１１．７２及びｂ＝０．２８のパラメータを
導く。補正した水素分離の基準で芳香族酸化に関して解くことで式７が生じる。
【００９０】
【数７】
【００９１】 式７及び４の統合により式８が生じ、これはＡＭ１パラメータにより芳香族酸
化を予測する。
【００９２】
【数８】
【００９３】 前に提示した水素分離の方程式と同じく、上の方程式の精度は、量が増加する
実験データを使用することで、繰り返し改善できる。
【００９４】 前記及び水素原子分離の状況との類似を考慮すると、関係する一定の化合物の
ＣＹＰによる芳香族酸化の予測は、反応のＡＭ１熱を計算し、結果として生じる
基のスピン汚染を測定することで実行できる。上の式８は、反応の活性化エネル
ギを予測するために使用される。この活性化エネルギは、式３で計算した水素分
離反応と直接比較することができる。図５は、前記の方法が水素分離及び芳香族
酸化の両方を予測する能力を示している。実験及び予測データの両方から得られ
たエネルギの差異は、この予測モデルの一貫性を実証する。
【００９５】 これらの式は、純粋なＡＭ１量子化学計算から導かれたモデルを補正し、実験
データとの一致性を向上させる。追加実験データの可用性は、各方程式の係数を
更に精緻化する手段を提供する。
【００９６】 他のＣＹＰ媒介反応： ＣＹＰは、水素原子分離及び芳香族酸化以外の追加反応を媒介できる。こうし
た反応は、オレフィン酸化、カルボニル代謝、Ｎ−酸化、及びＳ−酸化を含む。
こうした反応の予測モデルの形成は、水素原子分離及び芳香族酸化に関して上で
提示したものと同じ方法で実施できる。核反応のメカニズムは、上で提示したよ
うに、最初にモデル化され、その後実験により個別にパラメータ化される。
【００９７】 例えば、カルボニル代謝は、水素原子分離に基づく可能性が高い。そのため、
関係する化合物のカルボニル代謝が可能な急速に回転する基質は、半経験的（電
子的）方法でモデル化され、その後、非経験的方法によってパラメータ化される
。同様に、Ｎ−及びＳ−酸化はおそらく酸素の追加によって進行し、これも酸素
の追加を起こす急速に回転する基質によってモデル化される。こうした基質は、
半経験的及び非経験的方法の両方によって、実験的パラメータ化に使用される。
【００９８】 本発明はＣＹＰ酵素全般に関して説明しており、開示する説明のすべてが人間
のＣＹＰ酵素に応用できることは明らかであり、その一部としてはＣＹＰ２Ｅ１
、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ１Ａ１、
ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ｂ１、及びＣＹＰ２Ａ
６が含まれる。 以下の例は、本発明の裏付け及び例示を意図するものであり、制限を意図するも
のではない。
【００９９】 例１、一般的な計算方法： 本発明の実施において使用する量子化学計算の実行においては、市販又はパブ
リックドメインの様々なソフトウェアパッケージが有効である。
【０１００】 非経験的及び半経験的計算の両方は、米国ペンシルバニア州１５１０６、カー
ネギ、カーネギオフィスパーク、ビルディング６、スイート２３０のガウシアン
社から入手可能なＧａｕｓｓｉａｎ９４又はＧａｕｓｓｉａｎ９８を使用して実
行可能である。半経験的及び密度関数計算は、米国カリフォルニア州サンディエ
ゴ、スクラントンロード９６８５のモルキュラ・シミュレーションズ社が提供す
るソフトウェアＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩの中から実行可能である。半経験的計算は
、米国インディアナ州ブルーミントン、クリエイティブアーツビルディングのイ
ンディアナ大学、量子化学プログラム交換所から入手可能なＭＯＰＡＣの市販及
びパブリックドメインバージョンを使用しても実行できる。
【０１０１】 例２、ＣＹＰ酵素の活性酸素のエネルギ特性における類似性： ＣＹＰ酵素族の異種性のため、各ＣＹＰに関して、任意の一定の反応における
エネルギ特性が類似することを確認する必要がある。これを確認する一手段では
、多数のＣＹＰ酵素の同位体効果プロフィール（ＩＥＰ）を比較し、それぞれの
活性酸素がエネルギ特性的に等しいことを検証する。ＣＹＰ媒介反応においては
、化合物の物理特性と活性酸素種の性質とが、固有の同位体効果の規模を決定す
る。ＩＥＰは、複数のＣＹＰを使用した、固有同位体効果に最も近い、構造的に
関連する一連の化合物の同位体効果の測定を含む。固有動力学同位体効果（ＫＩ
Ｅ）が利用できる時、異なる系又は異なる同位体の間でのＩＥＰにおける比較可
能な傾向は同様のメカニズムをサポートする（カーキ他（１９９５）、アメリカ
化学学会ジャーナル（J. Am. Chem. Soc）、１１７、３６５７乃至６４。マンチ
ェスタ他（１９９７）、アメリカ化学学会ジャーナル（J. Am. Chem. Soc）、１
１９、５０６９乃至７０。ハームス他（１９８２）、生化学２１（Biochemistry
21）、５０１６乃至１４２８）。
【０１０２】 同位体効果は同位体置換によってもたらされる反応速度の変化である。これは
通常、機械論的な情報を伴う。本発明は、炭素水素（Ｃ−Ｈ）結合を含むＣＹＰ
基質の代謝、及び炭素−ジュウテリウム（Ｃ−Ｄ）結合を含む基質の代謝に関す
る、相対的反応速度及び酵素反応動力学定数の比較に基づいている。一次同位体
効果は、同位体原子との結合が分解した時に測定される速度の変化を指す。二次
同位体効果は、同位体原子との結合が分解しない時に測定される速度変化を指す
。
【０１０３】 ジュウテリウム同位体効果は、水素（Ｈ）とジュウテリウム（Ｄ）との間の質
量の差によって発生する。Ｃ−Ｈ及びＣ−Ｄ結合のストレッチングの振動数（ｖ
）は、それぞれ約９及び６．３（×１０13ｓ-1）である（アイザックス，Ｎ．Ｓ
．（１９８７）物理有機化学（Physical Organic Chemistry）、ジョン・ワイリ
＆サンズ、ニューヨーク）。振動エネルギが０Ｋを維持する結合のゼロポイント
エネルギは、Ｖ（振動量子数）＝０の時、ＥV＝１／２ｈｖで定義され、ここで
ｈ＝プランク定数である。Ｃ−Ｄ結合のゼロポイントエネルギは、Ｃ−Ｈ結合よ
りも低い。ゼロポイントエネルギにおける同位体の差異は、Ｖが増加するにつれ
減少し、遷移状態において結合の解離が発生する頃にゼロに近づく。したがって
、Ｃ−Ｄ結合を分解するにはＣ−Ｈ結合よりも多くのエネルギを要する。
【０１０４】 酵素反応動力学の研究から機械論的情報を得るためには、分子内ＫＩＥが使用
される。このタイプの実験設計は、すべての酵素には使用できないが、マスキン
グの電位が減少するため、固有同位体効果に近い推量を提供するのに使用できる
場合は適当である。固有同位体効果は、化合物の最大同位体効果であり、Ｃ−Ｄ
及びＣ−Ｈ結合の固有の物理特性のみに依存する（ノースロップ，Ｄ．Ｂ．（１
９７５）、生化学１４（Biochemistry 14）、２６４４乃至５１）。同位体の影
響を受けるステップの前に発生する酵素触媒サイクルの速度制限ステップは、同
位体置換に関連する実際の（又は固有の）速度差を減らす又はマスキングする効
果を有する可能性がある。
【０１０５】 ここでの分子内同位体実験において、基質は、少なくとも二つの対象部位を含
み、すべてではないが少なくとも一つの部位が同位体の標識を有するものが選択
される。基質の単一の濃縮物が酵素と共にインキュベーションされ、生成物の同
位体混合物における未標識化合物に対する標識化合物の割合（又は生成物の形成
に対応する割合）がＫＩＥの計算に使用される。
【０１０６】 体系１は分子内同位体効果を簡略化したメカニズムを示す。
【０１０７】
【数９】
【０１０８】
【数１０】
【０１０９】 割合定数ｋ1及びｋ2は、酵素と結合及び分離する基質を表す（図１の触媒サイク
ルのステップ１参照）。割合定数ｋ3は、酸素活性化まで又はこれを含む、基質
結合後に発生するステップを表す不可逆ステップとして示される（図１、触媒サ
イクルのステップ２乃至６）。酵素と基質との間の「活性複合体」は、酸素活性
化の結果として形成される（ＥＳ*）。活性部位の基質に関して二つの配向の可
能性が存在する（図１、触媒サイクルのステップ６と７との間に発生）。この配
向は、Ｈ又はＤと活性酸素との近接性において異なる。位置の間での交換は、ス
テップｋ4、ｋ4’、ｋ5、及びｋ5’によって表され、フォームＲ−ＣＨ2Ｄの基
質に関するメチル基周囲の回転を象徴する。生成物の終結はｋ9によって表され
る（図１の触媒サイクルのステップ９）。
【０１１０】 観察された同位体効果は、実験的に測定されたＰDに対するＰHの比率で、式９
によって表される。ＥＳ*種の濃度は、式１０を導く割合定数によって表現でき
る。固有同位体効果、ｋ7H／ｋ7D、及びｋ4に対するｋ7Hの比率は観察された同
位体効果を決定する。式１０は、ｋ4の増加の規模として、観察されたＫＩＥが
固有ＫＩＥに近づくことを明らかにする。メチル基周囲の回転は高速であること
が知られているため、ｋ4はｋ7Hに比べ大きく、観察された分子内ＫＩＥは固有
ＫＩＥの厳密な見積となる。
【０１１１】 ＣＹＰ内の酸化鉄種［ＦｅＯ］+3によって実行される水素原子分離ステップの
「生成物」は、ベンジル化炭素基として考えられ、水素原子分離ステップの反応
位置の評価を可能にする。ハモンドの公理（ハモンド，Ｇ．Ｓ．（１９５５）、
アメリカ化学学会ジャーナル７７（J. Am. Chem. Soc. 77）、３３４乃至４０）
によれば、高い放熱反応では、生成物に似た遷移状態を有することが予想され、
吸熱反応は生成物に更に類似する遷移状態を有する。置換体が多くの電子を取り
去るにつれ、ベンジル基は安定性を失う。その結果、反応の放熱性は低くなり（
吸熱性が高まり）、固有同位体効果の規模が増加する。
【０１１２】 三中心遷移複合体及び同位体効果の規模の説明に関するマレンダとウェストハ
イマの理論（マレンダ，Ｌ．（１９６０）、反応速度に関する同位体効果（Isot
ope Effect on Reaction Rates）、ロナルドプレス、ニューヨーク。ウェストハ
イマ，Ｆ．Ｈ．（１９６１）、化学評論６１（Chem. Rev. 61）、２６５乃至７
３。クレスゲ，Ａ．Ｊ．（１９７７）、酵素触媒反応に関する同位体効果（Isot
ope Effects on Enzyme-Catalyzed Reactions）（クレランド他編）内、３７乃
至６３ページ、ユニバーサルパークプレス、ボルチモア）は、ＩＥＰの機械論的
解釈に使用できる。この理論の主な概念では、対称ストレッチング振動は同位体
依存ゼロポイントエネルギを遷移状態に供給可能であり、これは基底状態分子の
同位体依存ゼロポイントエネルギをオフセットできる。対称遷移状態において、
二つの部分結合の力定数は等しく、中央原子は定常である。そのため、ＨとＤと
の置き換えは移動質量を変化させず、ｖHはｖDと同じになる。遷移状態における
同位体依存ゼロポイントエネルギの差異は、等温線（対称）反応に関して最小と
なり、最大の同位体効果につながる。ｆ1≠ｆ2、ｖH≠ｖDの時（つまり、非対称
遷移状態において）、同位体効果は、対称反応のＫＩＥよりも小さくなる（クレ
スゲ、同書。クレランド，Ｗ．Ｗ．（１９８２）、方法酵素分子学８７（Method
s Enzymol. 87）、６２５乃至４１）。
【０１１３】 オクタンのＣＹＰ媒介一次ＫＩＥは、水素原子分離に関する可能最大値に近い
ため、対称遷移状態及び等温線反応が推量される。したがって、オクタンと比較
して増加する吸熱反応は徐々に小さくなる固有ＫＩＥを生じ、増加する放熱反応
は徐々に小さくなる固有ＫＩＥを生じる。遷移状態における水素移動の範囲の関
数としてのＫＩＥのプロットは放物線となる。
【０１１４】 ＩＥＰは、構造的に関連する一連の化合物を使用した体系（例えば化学的又は
酵素的）における同位体効果の測定を含む。同位体効果の傾向は反応のエネルギ
特性に関する追加情報を提供し、二体系間における偶然の一致の可能性を低くす
るため、二つの反応のメカニズムが類似するかどうかを判定するために、ＩＥＰ
は単一の測定に優先する（カーキ他（１９９５）、生体異物２５（Xenobiotica
25）、７１１乃至２４）。固有ＫＩＥが利用できる時、異なる体系間で比較可能
なＫＩＥの傾向は類似するメカニズムを意味し、異なる傾向は類似しないメカニ
ズムを示す。前記のように、最大同位体効果は対称反応位置を有する反応によっ
て観察される。非対称反応位置を有するメカニズムは小さな同位体効果を生み出
す。この情報から、何らかの体系的な（例えば、化学的又は物理的な）形で異な
る一連の化合物に関して測定される固有ＫＩＥは、同位体の影響を受けるステッ
プのエネルギ特性の敏感なプローブの役割を果たせると推測できる。
【０１１５】 複数のＣＹＰアイソフォームのＩＥＰは、複数のＣＹＰの活性酸素が維持され
るという仮説をテストするために測定される。発現ＣＹＰ、１Ａ２、２Ｂ１、２
Ｅ１、及び２Ｃ９とＰ４５０ｃａｍを使用した、６種類のパラ置換トルエン（ｐ
−Ｘ−Ｐｈ−ＣＨ2Ｄ：Ｘ＝ＯＣＨ3、ＣＨ2Ｄ、Ｈ、ＣＬ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｐｈ＝
フェニル）の分子内同位体効果を表５に示す。これらの実験は、発現ＣＹＰ３Ａ
４でも実施されたが、生成物形成が低すぎるため、正確な測定はできなかった。
同じ炭素原子に結合する水素及びジュウテリウムを含む基質で測定した同位体効
果は、固有同位体効果の厳密な測定を可能にする（分子内同位体効果に関する前
の記述を参照）。表５は、各アイソフォームに関して、トルエンのＩＥＰが特に
一致していることを示しており、値の範囲は４乃至１１であり、同位体効果の規
模は同じランクの水準を有する。加えて、各基質に関して、５種類すべてのＣＹ
ＰのＫＩＥが厳密な一致を示しており、これは活性酸素種を維持する性質を実証
している。図６のデータは、複数のＣＹＰにおける各基質の分子内同位体効果の
厳密な一致を表しており、これは活性酸素種を維持する性質を実証している。
【０１１６】
【表５】
【０１１７】 各結果は３種類の判定の平均であり、括弧内の数字は中間同位体効果値の最後
の有意数における標準偏差を示す。aｐ−キシレン−α−2Ｈ1−α’−2Ｈ1が基
質として使用された。b生成物形成の水準が低いため判定されない。
【０１１８】 このＩＥＰは、４種類の哺乳類のＣＹＰアイソフォーム及び１種類のバクテリ
アのアイソフォームにおけるベンジル位置での脂肪族ヒドロキシル化に関する共
通反応メカニズムの証拠を提供する。一連のＩＥＰにＰ４５０を含めたことは、
クラスＩＩ Ｐ４５０以外のＰ４５０に対する、この応用の第一の拡張である。
Ｐ４５０ｃａｍはクラスＩに属し、二つの電子移動パートナと相互作用するＰ４
５０を含む。クラスＩＩに属するものは、還元パートナとして一つのタンパク質
しか持たない点において異なっている（ピーターソン他（１９９５）、シトクロ
ムＰ４５０：構造、メカニズム、及び生化学（Cytochrome P450:Structure, Mec
hanism, and Biochemistry）（オーティス・デ・モンテラノ，Ｐ．Ｒ．編）内、
１５１乃至８０ページ、プレナムプレス、ニューヨーク）。Ｐ４５０ｃａｍのＫ
ＩＥプロフィールが、クラスＩＩに属するＣＹＰと違わないという発見は、水素
原子分離のメカニズムが、活性酸素種の不可逆形成の前に発生するステップから
独立していることを示すため、重要である。
【０１１９】 こうした結果は、ＣＹＰによって代謝される化合物の異なるグループに関する
文献における他のＩＥＰデータと一致する。一連のＮ，Ｎ−ジメチルアニリンの
同位体効果は、哺乳類のＣＹＰ２Ｂ１（精製）、４Ｂ１、及び１Ａ２（発現）、
ラットの肝臓ミクロソーム、及び精製バクテリアＣＹＰ１０２を使用して測定さ
れ、これは二種類の化学体系におけるＫＩＥと比較される（カーキ他（１９９５
）、アメリカ化学学会ジャーナル１１７（J. Am. Chem. Soc. 117）、３６５７
乃至６４１６）。すべてのＰ４５０及びｔｅｒｔ−ブトキシル基系に関する実質
的に同一のＩＥＰは、Ｎ−脱アルキル化の類似するメカニズム、つまり最初の水
素原子分離に関する強力な証拠を提供する。更に、このメカニズムはテストした
すべてのＣＹＰ内で維持され、これには哺乳類及びバクテリアのクラスＩＩ Ｐ
４５０のメンバが含まれる。様々なＣＹＰ及びいくつかの小さな分子のｔｅｒｔ
−ブトキシ基に関する同位体効果プロフィールも、ＣＹＰに関する（最初の）水
素原子分離のメカニズムをサポートする（マンチェスタ他（１９９７）アメリカ
化学学会ジャーナル１１９（J. Am. Chem. Soc. 119）、５０６９乃至７０）。
哺乳類及びバクテリアのアイソフォームに関する、こうした豊富な量のデータは
、複数のＣＹＰの共通メカニズムを強力にサポートする。
【０１２０】 テストしたトルエン以外の基質に関するすべての同位体効果値の比較により、
平均が０．０５の有意水準で統計的に互いに異なることが明らかになった。これ
は、標準偏差が方法の精度を反映し、体系的及び目前の誤差を考慮に入れないと
言う事実によって最も上手く説明できる。フォームＲ−ＣＨ2Ｄの基質による分
子内同位体効果実験の設計は、特に非常に正確なデータに役立つ。分子内ＫＩＥ
の規模は、基質の濃度に依存せず、その結果の計算には内部標準を必要としない
。
【０１２１】 これに関して、ＩＥＰは啓発的である。２Ｂ１はｐ−ＯＣＨ3の最小ＫＩＥを
示すが、他の基質に関する高い平均の一つを与える。実際、図６から明らかなよ
うに、他の酵素より高い又は低いＩＥＰを常に与えるアイソフォームはない。
【０１２２】 したがって、テストしたＣＹＰ酵素に関して、活性酸素種のエネルギ特性は同
じだと思われる。
【０１２３】 この例において、すべての溶媒はＪ・Ｔ・バーカ社（ニュージャージ州フィリ
プスバーグ）から購入した。化学物質は以下の例外を除きアルドリッチ・ケミカ
ル社（ウィスコンシン州ミルウォーキ）から購入した。ＭＴＢＳＴＦＡ（＋１％
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン）はレジス・テクノロジーズ社（イリノ
イ州モートングローブ）から、第一及び第二リン酸カリウム及び硫酸マグネシウ
ムはＥＭサイエンス（ドイツ、ダルムシュタット、Ｅ・メルクの団体）から購入
した。ｐ−クロロトルエン、ｐ−メチルアニソール、及びｐ−キシレンは、使用
前に蒸留により精製した。ｐ−ブロモトルエンはエタノールから結晶化され、ｐ
−トルニトリルはベンゼン、石油エーテルから結晶化された。すべての細胞培養
法にはギブコＢＲＬ製品（メリーランド州ゲイザースバーグ）が使用された。生
化学物質はシグマ（ミズーリ州セントルイス）から、ｐ−キシレン−α，α，α
，α’，α’，α’，―ｄ6（ＧＣによる純度９９．８％）はアルドリッチ・ケ
ミカル・カンパニから購入した。
【０１２４】 置換トルエン−α−2Ｍ1及び−α−2Ｈ1−α’−2Ｈ1。ｐ−ブロモトルエン、
ｐ−クロロトルエン、ｐ−メチルアニソール、及びトルエンのモノジュウテリウ
ム化した類似体は、トリジュウテリム化合物に関して上で説明した同じ手順に従
って、対応する非ジュウテリウム化ベンジルアルコールのメシレーションによっ
て合成し、ｐ−キシレン−α−2Ｈ1−α’−2Ｈ1は、他の反応物に対するベンゼ
ンジメタノールの分子比率が１：２である点を除き、ベンゼンジメタノールから
同じ方法で合成した。
【０１２５】 ｐ−トルニトリル−α−2Ｈ1に関して、ベンジルアルコールは、水素化ホウ素
ナトリウムを使用したｐ−シアノベンザルデヒドの還元によって最初に合成した
。この手順に関しては、水素化ホウ素ナトリウム（０．０５ｍｏｌ）を約１００
ｍＬのエタノールと混合し、Ｎ2の下で攪拌した。アルデヒド（０．０２５ｍｏ
ｌ）は少量のエタノールで溶解し、ＮａＢＨ4溶液に滴下し加えた。反応は、Ｔ
ＬＣ（シリカゲル：５０％酢酸エチル、５０％ヘキサン）によってモニタされる
。約１．５時間後、混合物を濾過し、溶媒を蒸発させる。残った油は水と混合し
、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出する。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて白い固体
を作り、これをヘキサンによって再結晶化させて、ＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳによっ
て純度を評価する。
【０１２６】 ＨｅｐＧ２−発現ＣＹＰの作成。個々のＣＹＰアイソフォーム（１Ａ２、２Ｂ
１、２Ｅ１、２Ｃ９）は、前に説明したＨｅｐＧ２ワクシニア発現系を使用して
取得する（ゴンザレス他（１９９１）方法酵素分子学２０６（Methods Enzymol.
206）、８５乃至９２）。簡単に言うと、単一のＣＹＰを暗号化するｃＤＮＡを
含む組み換えワクシニアウィルスを人間のＴＫ-１４３（人間のエンブリオブラ
スト）細胞で増殖させ、肝臓ガンＨｅｐＧ２細胞の集密フラスコに感染させる（
アメリカンタイプカルチャコレクション、メリーランド州ロックビル）。各アイ
ソフォームに関して、細胞は５０のフラスコからこすり取り、プールし、１−ｍ
Ｌアリコートに分割し、−７８℃で保管した。未処理細胞ライセートからのミク
ロソームは、以下の手順により、使用直前に取得した。アリコートを解凍し、１
ｍＬの５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．４と混合し、ブランソン・ソニファ・モ
デル４５０で超音波処理し、定温（４℃）のベックマンＴＬ−１００超遠心分離
器により３０００００ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを２ｍＬのＫＰｉ緩衝
液ｐＨ７．４で元に戻し、プールし、定温室において均質化する。ウシの血清ア
ルブミンを標準としたブラッドフォードの分析では（ブラッドフォード，Ｍ．Ｍ
．（１９７６）分析生化学７２（Anal. Biochem. 72）、２４８乃至５４）最終
的な酵素−緩衝液混合物の合計タンパク質濃度は、通常３乃至４ｍｇ ｍＬ-1だ
った。発現系を使用して入手される通常の低レベルのＰ４５０は、オムラ及びサ
トウの方法によるＣＯ差スペクトルでは検出できない（オムラ他（１９６４）生
物化学ジャーナル２３９（J. Biol. Chem. 239）、２３７０乃至８）。
【０１２７】 シトクロムＰ４５０ｃａｍ、プチダレドキシン、及びプチダレドキシン還元酵
素。Ｐ４５０ｃａｍ、Ｐｄ、及びＰｄＲに関する発現プラスミドの構築、更にタ
ンパク質発現及び精製については前に説明した（シモジ他（１９９８）、生化学
３７（Biochemistry 37）、８８４８乃至５２）。 インキュベーション条件及び生成物の分離。ＨｅｐＧ２発現ＣＹＰを使用するイ
ンキュベーションはすべて、３７℃の振動ウォーターバスにおいて２０分間実行
し、以下を含む。アイソフォームに応じて３００乃至４００μｇのタンパク質懸
濁、１０ｍＭグルコース−６−リン酸、１ｍＭ ＮＡＤＰ+、及び１Ｕグルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素をＮＡＤＰＨ生成系として、更に総体積５ｍＬの５０
ｍＭ ＫＰｉ緩衝液内の１４００Ｕカタラーゼ、Ｐｈ７．４、２ｍＭ ＭｇＣｌ 2 。Ｐ４５０ｃａｍに関して、分析は、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液内の１−ｍＬ反
応混合物、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＫＣｌ、１．５μＭ Ｐ４５０ｃａｍ、３
μＭ Ｐｄ、１．５μＭ ＰｄＲ、及び０．３ｍＭ ＮＡＤＨにおいて、２０分
間、３７℃で実行された。反応は、５０μＬ又は１０μＬ（Ｐ４５０ｃａｍ）の
基質溶液をＣＨ3ＣＮに追加することで開始され、３ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2の追加に
より終結させ、該当する場合は１０μＬのＣＨ３ＣＮにおける内部標準を追加す
る（下記参照）。標本はＣＨ2Ｃｌ2により３度抽出し、有機断片をプールし、無
水ＭｇＳＯ4により乾燥させ、Ｎ2の流れで緩やかに濃縮し、約１００μＬの体積
にする。３００μＬ（ＨｅｐＧ２−発現ＣＹＰ）又は１００μＬ（Ｐ４５０ｃａ
ｍ）のＣＨ2ＣＮで元に戻した後、５０μＬのＭＴＢＳＴＦＡで標本を誘導体化
し、１％ｔ−ＢＤＭＣＳを７０℃で一晩加熱する。
【０１２８】 モノジュウテリウム化トルエン及びｐ−キシレン−α−2Ｈ1−α’−2Ｈ1によ
る酵素のインキュベーションは、単一基質濃縮物０．２５ｍＭにより三重で行わ
れる。トルエン−α−2Ｈ1の制御は、誘導試薬に由来する生成物と同じ保持時間
で小さなピークを示し、これは定量化され、観察されたアルコール生成物の量か
ら減じられる。置換トルエンの代謝に関する動力学パラメータは、生成ベンジル
アルコールのＭ−（ジメチルシリル）誘導体のＧＣ−ＭＳ分析によって決定され
る（下記参照）。ジュウテリウム化及び非ジュウテリウム化生成物の混合物を使
用した制御実験は、生成物のワークアップに関する同位体効果が存在しないこと
を示す。
【０１２９】 ＧＣ−ＭＳによる生成物分析。すべての標本は、ＨＰ（カリフォルニア州パロ
アルト）ＧＣ−ＭＳ５８９０／５９７２システムで分析され、これはＨＰ７６７
３Ａ自動インジェクタを装備する。ＨＰ−１キャピラリカラム（２５ｍ、０．２
−ｍｍ ＩＤ、フィルムの厚さ０．５−μｍ）がすべての基質からの生成物分析
に使用されるが、ただしトルエン及びｐ−キシレンはＨＰＷａｘキャピラリカラ
ム（３０ｍ、０．２５−ｍｍ ＩＤ、フィルムの厚さ０．５−μｍ）が使用され
る。ＨＰ−１カラムに関して、インジェクタ及び検出器の温度はどちらも２５０
℃に設定し、ＨＰＷａｘカラムに関して、インジェクタ及び検出器の温度はそれ
ぞれ２３０℃及び２４０℃にする。すべての標本は、スプリットレスモードで注
入する。ＨＰ−１カラムのオーブン条件は０．５分間５０℃、１０℃／分で２５
０℃まで、及び２５０℃で２分だが、ただしｐ−トルニトリルを基質として使用
する時は異なり、この場合は１５℃／分を使用する。ＨＰＷａｘカラムに関して
、オーブン条件は、０．５分間５０℃、１０℃／分で２４０℃まで、及び２４０
℃で３分である。ＭＳは、イオン化電圧−７０ｅＶ及び休止時間２０−ｍｓで操
作される。誘導ベンジルアルコールの本来の標準の走査を使用して、ピーク保持
時間を判定し、酵素のインキュベーションで形成された生成物を検証する。生成
物及び内部標準のＭ−（ジメチルシリル）イオンの選択イオン記録を使用して、
代謝量を決定する。プロチウム及びジュウテリウム生成物の比率は、ブラウマン
の最小二乗法アプローチにより、イオンオーバラップ及びジュウテリウム取り込
みのパーセントに関して補正される（コルゼクワ他（１９９０）、生体臨床医学
及び環境的質量分析１９（Biomed. & Environ. Mass Spectram.19）、２１１乃
至７）。基質のジュウテリウム取り込みは、ＨＰ−１カラムが付いたＨＰ ＧＣ
−ＭＳ５８９０／５９７０システムで、前記と同じ操作条件を使用して測定され
るが、ただしＭＳイオン化電圧は−１０．０ｅＶに調整される。
【０１３０】 データ分析。動力学表現はプログラムＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（イリノイ州チ
ャンペイン）を使用して解決される。
【０１３１】 例３、線形自由エネルギ関係（ＬＦＥＲ）電子モデルはＣＹＰモデルを説明で
きる： 活性酸素が複数のＣＹＰアイソフォームにおいて非常に類似することを考慮す
ると、（対応する）複数のＣＹＰ酵素を説明するために、単一の電子モデルを使
用できる。考えられるモデルの一つは線形自由エネルギ関係（ＬＦＥＲ）の使用
であり、これは化学及び酵素学において、反応の遷移状態における電子特性の予
測ツール及びプローブとして利用されている。以下では、ＣＹＰによる代謝の相
対速度を予測し、ＣＹＰ反応の物理特性を評価するためにＬＦＥＲを使用できる
という仮説をテストする。
【０１３２】 ＣＹＰに関して報告されているＬＦＥＲは比較的少数である。触媒サイクルの
速度制限ステップが基質酸化のステップより前に発生する事実を考えると、これ
は意外ではない（ホワイト他（１９８０）、生化学年間批評４９（Ann. Rev. of
Biochem. 49）、３１５乃至５６。タイソン他（１９７２）、生物学化学ジャー
ナル２４７（J. Biol. Chem. 247）、５７７７乃至８４）。ハメットσ又は酸化
還元ポテンシャルによるＶMAX及びＫCATの優れた相関は、一連のパラ−置換Ｎ，
Ｎ−ジメチルアニリン（バーカ他（１９８５）、アメリカ化学学会ジャーナル１
０７（J. Am. Chem. Soc. 107）、２５４９乃至５１。マクドナルド他（１９８
９）生化学２８（Biochemistry 28）、２０７１乃至７）、パラ−置換硫化物（
ワタナベ他（１９８０）、四面体の報告２１（Tetrahedron Lett. 21）、３６８
５乃至８）に関して見つかっている。こうしたデータは、基質のヘテロ原子の一
対からＣＹＰの活性酸素への電子移動のメカニズムの裏付けに使用されてきた。
同様に、一連のパラ−置換トルエンに関して、疎水性及び電子的要素がＫCAT値
の優れた記述子となることも分かっている（ホワイト他（１９８６）構造生化学
生物物理学２４６（Arch. Biochem. Biopys. 246）、１９乃至３２）。
【０１３３】 ＬＦＥＲ相関率及び平衡定数。自由エネルギの項は、平衡定数（Ｋ）及び速度
（ｋ）が自由エネルギ（ΔＧ＝−２．３０３ＲＴ ｌｏｇＫ及びΔＧ±＝−２．
３０３ＲＴ ｌｏｇ（ｋｈ／ｋＴ））と関係する事実から発生する。ＬＦＥＲは
、反応の活性に関する置換体又は溶媒の効果を観察するために使用できる。摂動
の度合い及びタイプは、化学反応に関する機械論的情報を提供できる。関係する
反応の速度は、経験的に決定された定数と比較される場合が多い。最も広く使用
される経験的定数は、ハメット定数である。ハメット定数σ+ paraは、置換体が
パラ位置で与える電子摂動の相対的度合いを示す物理パラメータである。ハメッ
ト定数σ+ paraは、式１１によって定義され、ここでＫXはパラ−置換ｔｅｒｔ−
クミルクロライドの酸性度定数であり、ＫHはｔｅｒｔ−クミルクロライドの酸
性度定数である（９０％アセトン−Ｈ2Ｏ内）。
【０１３４】
【数１１】
【０１３５】 ＣＹＰが類似する化学メカニズムで作用するというコンセプトを裏付ける前記
のデータ（例２）を考慮すると、次に取り組む問題は、置換トルエンの相対反応
速度を予測するためにＬＦＥＲが使用できるかどうかである。しかしながら、生
成物形成の相対速度が酵素サイクルの一ステップによってマスクされる場合、Ｌ
ＦＥＲは慎重に解釈しなくてはいけない。動力学情報は推定できるが、相対反応
速度がマスクされる場合、機械論的情報はできない。したがって、ＬＦＥＲ分析
に関して選択した基質によりマスキングが発生するかどうかを評価することが重
要である。
【０１３６】 動力学研究に選択される第一のアイソフォームは、小さな疎水性分子の低Ｋｍ
アイソフォームであることから、ＣＹＰ２Ｅ１である（グエンゲリッチ他（１９
９１）、化学研究毒物学４（Chem. Res. Toxicol. 4）、１６８乃至７９）。ベ
ンジルのヒドロキシル化に関する安定状態の反応動力学定数Ｖmax及びＫmは、発
現ＣＹＰ２Ｅ１を使用して５種類のパラ−置換トルエン（ｐ−Ｘ−Ｐｈ−ＣＨ3
、Ｘ＝ＯＣＨ3、ＣＨ3、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｐｈ＝フェニル）に関して決定され
、典型的なミカエリス−メントン行動を示す（表６）。パラ置換体の選択により
、ベンジル基での電子摂動の範囲を考慮可能であり、これにより、ハメット定数
σ+ paraを使用したＬＦＥＲが最初に研究された（ハンス他（１９７９）、化学
及び生物学における相関分析に関する置換定数（Substituent Constants for Co
rrelation Analysis in Chemistry and Biology）、ジョン・ワイリ・アンド・
サンズ、ニューヨーク）。ハメット定数は、他の場合においても示され、置換ト
ルエンからの水素原子分離の速度との優れた相関を行う（キム他（１９８５）、
四面体の報告２６（Tetrahedron Lett. 26）、８９１乃至４。サクライ他（１９
６７）、アメリカ化学学会ジャーナル８９（J. Am. Chem. Soc. 89）、４５８乃
至６０。ヘバーガ，Ｋ．（１９９４）、物理有機化学ジャーナル７（J. Phys. O
rg. Chem. 7）、２４４乃至５０）。
【０１３７】
【表６】
【０１３８】 aＶmax及びＶ／Ｋは非線形回帰によって決定される。b単位はＭｍｉｎ-1。c表
示した定数の標準誤差。d単位はｍｉｎ-1。e反応動力学データに適合する非線形
回帰の相関係数。f反応動力学定数Ｖmax及びＶ／Ｋの決定に使用したポイント数
。ｐ−キシレンを除き、非ジュウテリウム化又は（ベンジル位置での）トリジュ
ウテリウム化基質によって実験が行われた。gｐ−キシレンのジュウテリウム化
類似体としてｐ−キシレン−α，α，α，α’，α’，α’，―ｄ6が使用され
た。
【０１３９】 不十分な相関のみが、Ｖmax対σ+ p（ＬｏｇＶmax＝０．１１σ+ p＋１．７３；
ｒ2＝０．５８８）及び他の物理定数（データ表示なし）のプロットにおいて発
見され、Ｖ／Ｋ及び様々なパラメータとの不十分な相関が発見された。Ｖmax及
びσ+ pの不十分な相関に加え、勾配は正となり、負の勾配が生じた様々な酸素基
を使用したトルエンからのＨ−原子分離速度からは予測されなかった（キム他、
同書。ヘバーガ他、同書）。正の勾配は、電子退出置換によって遷移状態が安定
したことを示す。これは通常、遷移状態が負の電荷にあることを意味すると解釈
される。
【０１４０】 不十分な相関の説明には三種類の可能性が考えられる。１）電子パラメータが
ＣＹＰ２Ｅ１基質の反応性を決定しない、２）反応動力学定数（Ｖmax及びＶ／
Ｋ）がマスク又は部分的にマスクされる、及び３）遷移状態が負に荷電している
。最初の二つの可能性は、適切な方法論で分析可能であり、結果については以下
で述べる。
【０１４１】 ＫＤＩＥによる基質の電子パラメータの相関。最初に、ＣＹＰ基質の電子的要
素が、酸化ステップに観察可能な任意の影響を与えているかどうかの問題につい
て検討する。上の表５に示した６種類のトルエンに関する分子内ＫＩＥの自然対
数は、各ｐ−置換体のσ+ pの関数としてプロットされる。置換体及び対応するσ + p 値は（それぞれ）、ＯＣＨ3及び−０．７８、ＣＨ3及び０．３１、Ｈ及び０、
Ｃｌ及び０．１１、Ｂｒ及び０．１５、ＣＮ及び０．６６である（ハンス他、同
書）。この一連の置換トルエンにおいて、ベンジル化炭素と分離可能水素との間
の力定数は各置換体で異なり、σ+ pの関数として変化することが提示された。（
前記の）Ｖmax対σ+ pの不十分な相関プロットにおけるデータは、この考え方を
裏付ける。（前記表５に示す６種類のトルエン対各ｐ−置換体のσ+ pの）ＫＩＥ
プロットは、前記例２で説明した放物曲線の上昇勾配に存在する値を実証する。
遷移状態は電子的効果に敏感であり、電子供与置換体は遷移状態を安定させると
結論される。
【０１４２】 ＫＩＥ及び線形自由エネルギ関係。ＬＦＥＲが求められる時、次の問題に限定
的に答える実験を実施するべきである。関係する化学ステップではない触媒サイ
クルにおける速度決定ステップによって、生成物形成の速度はマスクされるか（
世生物形成は制限されるか）？ 幸いにも、酵素系におけるマスキングを調査す
る革新的な方法がクレランド及びノースロップによって開発されている（ノース
ロップ（１９７５）及びクレランド，Ｗ．Ｗ．（１９７５）、生化学１４（Bioc
hemistry 14）、３２２０乃至４）。このアプローチにより、酵素パラメータＶm ax 及びＶ／Ｋに関して、ＫＩＥが測定される。Ｖmax及びＶ／Ｋに関する同位体
効果は、それぞれ、低及び高基質濃度の制限条件による生成物形成の速度に関す
る同位体効果の表現である。
【０１４３】 ここで報告されるのは、指定されたDＶ及びD（Ｖ／Ｋ）であるＶmax及びＶ／
Ｋに関するジュウテリウム同位体効果である。DＶ及びD（Ｖ／Ｋ）両方の表現は
、同位体に影響を受けるステップの速度定数を含むが、以下の点において異なっ
ている。DＶのみが酵素からの生成物の解離に関する速度定数を含み、D（Ｖ／Ｋ
）のみが自由基質及び酵素の結合、及び第一のＥＳ複合体から自由基質及び酵素
への解離に関する速度定数を含む。こうしたステップ及びその他と同位体の影響
を受けるステップとの相対的な規模は、固有ＫＩＥ（結合分離ステップのみに関
連するＫＩＥ、つまりｋH／ｋD）がDＶ又はD（Ｖ／Ｋ）において表現される度合
いを決定する。したがって、DＶ及びD（Ｖ／Ｋ）同位体効果と固有ＫＩＥとの比
較は、生成物形成の相対速度のマスキングに関与するステップが存在する場合、
これに関する情報を提供できる。こうしたタイプの研究は、機械論的な結論を得
るためにＬＦＥＲが使用可能かどうかを明らかにできる。一連の化合物に関して
、速度と記述子との間に線形関係が確認できたとしても、相対速度がマスクされ
ていないことを意味するわけではないことに注意すべきである。
【０１４４】 分子内ＫＩＥは、Ｖmax及びσ+ pの不十分な相関の原因が、触媒サイクルにお
ける他の何らかの（遅い）ステップによるＶmaxのマスキングによるものかどう
かを調査するのに使用される。ほとんどの酵素媒介反応は複数のステップを含み
、反応速度のマスキングが発生するのはまれではない。ＣＹＰ反応に関して、一
般に、速度制限ステップはＰ４５０還元酵素からｐ４５０への第二の電子の移動
であり、生成物形成の前に発生するステップであることが認められる。その結果
、実験的に測定した反応動力学定数は、代替位置への分枝が、調査する反応動力
学定数の固有値をマスクしない十分な速度ではない限り、遅い電子移動ステップ
の存在により、部分的にマスクされる可能性がある。要するに、酵素速度の測定
から得られる情報は、速度が関係する（複数の）反応ステップに関するものでは
ない場合、機械論的に意味がない。
【０１４５】 表６のＶmax値がマスクされているかどうかを確認するために、分子内同位体
効果を測定し、表５の対応する分子内ＫＩＥと比較する。競合しない分子内の設
計の同位体効果実験は、二つの反応動力学定数Ｖmax及びＶ／Ｋを評価するため
に実行される。表７は、表５及び６に示したｐ−置換トルエンのうち４種類で、
Ｖmax及びＶ／Ｋの両方において観察されたＫＩＥが１乃至３の範囲にあり、２
Ｅ１における対応するトルエンの分子内ＫＩＥが４乃至８の範囲にあることを示
している。分子間ＫＩＥは分子内ＫＩＥより小さいため、DＶ及びD（Ｖ／Ｋ）の
両方がマスクされていると結論できる。DＶp1＝D（Ｖ／Ｋ）P1値がほぼ同一であ
る事実は、触媒作用に対する外的な拘束が小さい事実を裏付ける（体系３及び対
応する説明を参照）。
【０１４６】
【表７】
【０１４７】 a±記号の後の数字は誤差範囲である。b分子間競合値は平均±標準偏差として
表現される。分子間設計の実験で使用した基質類似体は、cｄ0及びｄ3、又はdｄ 0 及びｄ6のいずれかである。（複数の）ベンジル位置のみがジュウテリウム化さ
れる。e決定されない。
【０１４８】 分子間同位体効果は、固有同位体効果が観察されないため、通常は意味のある
機械論的情報を提供しないが、動力学メカニズムに関する情報を提供できる。例
えば、このタイプの実験は慣習的に、結合分離ステップが速度を制限するかどう
かを判定するために使用される。分子間非競合ＫＩＥ実験は、プロトン付加及び
同位体標識基質、例えばＲ1−ＣＨ3及びＲ1−ＣＤ3を使用したＶmax及びＶ／Ｋ
の独立した決定を含む。ＫＩＥの計算に関して、非標識基質に関する反応動力学
定数（Ｖmax又はＶ／Ｋ）は、標識基質に関する対応する定数によって区分され
る。
【０１４９】 体系２は、分子間非競合ＫＩＥを説明する、考えられる動力学メカニズムを示し
ており、式１２及び１３は、この体系に関して得られるDＶ及びD（Ｖ／Ｋ）の表
現である。基質（ＳH又はＳD）は酵素（Ｅ）と可逆的に結合し、対応するＥＳ複
合体（ＥＳH又はＥＳD）を形成する（下に書かれた「Ｈ」又は「Ｄ」は、それぞ
れ、水素又はジュウテリウムの分離の経路における化合物又は複合体の関与を示
す）。
【０１５０】
【数１２】
【０１５１】
【数１３】
【０１５２】 それぞれＥＳH又はＥＳDからの「活性」複合体ＥＳH*又はＥＳD*の形成は、こ
こでは、同位体に影響を与えるステップの前に発生する不可逆ステップとして表
されている。この不可逆ステップは、ＣＹＰの動力学メカニズムの理解と一致す
る。これは以下を含むステップの集合の動力学的表示である。第一の電子還元（
Ｆｅ3＋→Ｆｅ2＋）、酸素結合及び還元、酸素の第二の電子還元、及び不可逆と
思われる仮定ステップであるペロキシアニオンの異方性分解。生成物は同位体の
影響を受けるステップで形成され、酵素−生成物複合体（ＥＰH又はＥＰD）を生
成し、その後、対応する生成物の酵素からの分離が起こる。速度定数ｋ1、ｋ2、
ｋ3、及びｋ7は、それぞれ一つ以上のステップを実際に表し、追加ステップを含
めることでＫＩＥの複雑性は増加するが、この分析は変更されない。ほとんどの
酵素において特徴的な代替生成物形成の経路が存在しない時、DＶの値は、ｋ5H
に対するｋ3及びｋ7の相対的な規模に依存する。速度定数ｋ3及びｋ7がｋ5Hに対
して低下すると、DＶがマスクされる（式１２参照）。動力学メカニズムによる
非競合ＫＩＥのD（Ｖ／Ｋ）は体系２に示しており、これはＥＳH*又は対応する
ＥＳD*位置からの分枝経路を有しておらず、完全にマスクされている（式１３）
。
【０１５３】 D（Ｖ／Ｋ）は体系２では完全にマスクされているが、分枝経路はDＶ及びD（
Ｖ／Ｋ）の両方がマスクされない可能性を有している。これは体系３を使用して
例示されており、ジュウテリウム化又は非ジュウテリウム化のいずれかによる、
１種類の基質からの２種類の生成物の形成を表している。代替の同位体の影響を
受けないステップ、ｋ9での代謝は、同位体の影響を受けるステップ、ｋ9と競合
する。速度定数ｋ1とｋ2は酵素と結合し分離する基質を表す。速度定数ｋ3は、
酸素活性化まで又はこれを含む、基質結合後に発生するステップを表す不可逆ス
テップとして示される。こうしたステップは、相対位置１及び２の酵素と基質と
の間の「活性複合体」（ＥＳ１*及びＥＳ２*）の形成につながる。活性酸素は十
分に安定しており、酵素の活性部位における基質の翻訳及びコンホメーションの
変化を可能にする。
【０１５４】
【数１４】
【０１５５】
【数１５】
【０１５６】 結果として、ＥＳ１*とＥＳ２*との間で平衡が確立される可能性がある（ｋ5
とｋ6参照）。これはＫＩＥをマスクしないための鍵である。代謝の部位におい
て、ジュウテリウムが水素に置換される時、生成物形成の速度定数は減少する。
これはｋ7D＜ｋ7Hとして表現可能であり、ここでｋ7Dは基質のジュウテリウム位
置での酸化に関する速度定数を表し、ｋ7Hは基質の非ジュウテリウム化類似体の
同じ位置での酸化に関する速度定数を表す。ジュウテリウム置換は、ＥＳ１D*が
他の複合体、例えばＥＳ２D*と平衡ではない限り、ＥＳ１H*の濃度と比較して、
ＥＳ１D*の濃度を増加させる。代替経路が存在しない場合、［ＥＳ１D*］＞［Ｅ
Ｓ１H*］であり、同位体効果はマスクされる。
【０１５７】 第二の生成物（Ｐ２）の形成による基質の代替の非標識位置での酸化はＫＩＥ
をマスクできる。これは、［ＥＳ１D*］＝［ＥＳ１H*］を可能にする、ＥＳ２D* 方向への「過剰」ＥＳ１D*の再方向付けによって達成され、これは最大又はマス
クされない同位体効果の表現に必要である。慣例によれば、触媒に対する低い前
進内部拘束を有する基質は、ＥＳ１からＥＳ２に向けて分枝し（体系３）、拘束
期間の規模に応じて、DＶ及びD（Ｖ／Ｋ）の同位体効果はマスクされない。D（
Ｖ／Ｋ）がマスクされない範囲は、ｋ7Hに対するｋ5及びｋ9の相対値によって決
まる（式１４）。基質の回転及び分枝の速度がＰ１形成と相対的に増加すると、
マスクされない速度も増加する。体系３のDＶに関するＫＩＥの表現は非常に複
雑だが（表示なし）、以下の二つの仮定により式１５に簡略化できる。酸素の還
元が速度を制限していると仮定し（前記の説明参照）、更に（ｉ）活性部位にお
ける基質の回転（ｋ3＜＜ｋ5、ｋ6）、及び（ｉｉ）生成物形成の速度ｋ7及びｋ 9 より大幅に小さいと仮定する場合、DＶP1の表現は式１５に簡略化される。触媒
への外部逆拘束が小さい場合（ｋ11、ｋ13＞＞ｋ3）、つまり、生成物の放出が
速度を制限しない場合、式１５は式１４（DＶP1＝D（Ｖ／Ｋ）P1）に縮小される
。
【０１５８】 ＣＹＰは酸化酵素として機能する可能性を有し、これにより分子酸素では４電
子の還元が起こり、２分子の水の全体的な形成が発生する。第二の水分子の形成
は、体系３のＥＳ複合体から続く分枝点として働き、基質の酸化を妨げる。結果
として、水への分枝が生成物形成に比べて速い場合、ＫＩＥ（又は生成物形成の
速度）はマスクされなくなる可能性がある。
【０１５９】 代替生成物への分枝がない分子間非競合ＫＩＥに関する速度の式１２及び１３
（体系２参照）は、こうした結果を解釈するのに使用できる。ｋ3及び又はｋ7に
対するｋ5Hの相対比率が増加すると、DＶのマスキングの度合いは増加する。活
性酸素種の形成といった、同位体の影響を受けるステップに先行する不可逆ステ
ップは、十分に遅い場合、DＶをマスクできる。加えて、生成物放出といった、
生成物形成に続く不可逆ステップは、その規模に応じて、同じ効果を生みだす。
活性複合体ＥＳH*又はＥＳD*からの分枝のない非競合体系に関して、D（Ｖ／Ｋ
）は１に等しくなる。観察されるD（Ｖ／Ｋ）ＫＩＥは１より大きいため、代替
経路への分枝（体系２には表示なし）は、観察される部分的にマスクされない値
１．２乃至２．７を説明できる（式１３及び関連する説明参照）。
【０１６０】 基質の代替酸化部位への分枝、又は水の形成に続く経路を通じた分枝は、様々
な化合物に関する同位体効果をマスクしないことが示された。この研究で使用さ
れる基質のほとんどでは、水への分枝がD（Ｖ／Ｋ）を僅かにマスクしない役割
を果たす可能性がある。ベンジル基ヒドロキシル化は、ＣＹＰのソースに応じて
、トルエンの酸化全体の７０％以上、及びｐ−キシレン代謝の９５％までの原因
となる。環ヒドロキシル化は、ベンジル基ヒドロキシル化に比べ、ｐ−ブロモト
ルエン、ｐ−クロロトルエン、及びｐ−トルニトリルに関して、エネルギ特性的
に好ましくない。このような場合、基質の代替位置での代謝はベンジル基での代
謝に比べて遅いため、同位体効果が完全にマスクされないことは不可能である。
表７のデータは、少なくともｐ−メチルアニソール及びｐ−クロロトルエンに関
して、ベンジル位置での分子間同位体効果が僅かにマスクされないことを示して
いる。可能性の高い解釈の一つとして、水への少量の分枝は、こうしたマスクさ
れない状態によるものである。更に、D（Ｖ／Ｋ）及びDＶ同位体効果はほとんど
同一であるため、マスキングは触媒に対する高い内部拘束によるものである必要
がある。触媒への内部及び外部拘束の区別についてはノースロップが説明してい
る（方法酵素学（Method. Enzymol. 87）、６０７乃至２５、１９８２）。
【０１６１】 分子間非競合ＫＩＥデータを確認するために、ＣＹＰ２Ｅ１を使用し、同じ基
質に関して分子間競合D（Ｖ／Ｋ）を測定する（表７）。分子間競合設計の同位
体効果は、各基質（ジュウテリウム化及び非ジュウテリウム化）の一つの濃度の
みが使用されるため、非競合設計の実験に比べ実行するのが簡単である。このタ
イプの実験において、両方の基質は、単一の（通常等しい）濃度で同じインキュ
ベーション混合物に追加され、ジュウテリウム化と非ジュウテリウム化との間の
競合が確立する。この設計の実験により、Ｖ／Ｋの同位体効果のみが測定される
。
【０１６２】 ４種類の置換トルエンに関して、競合により決定されたD（Ｖ／Ｋ）の結果は
、表７に記載されている。４乃至７の範囲である同じ基質に関する分子内ＫＩＥ
の値と比較する時、１．２乃至３．２の値はＫＩＥがマスクされることを示す。
ｐ−キシレン及びｐ−メチルアニソールに関して、競合及び非競合により決定さ
れたD（Ｖ／Ｋ）ＫＩＥは同じである。競合及び非競合実験により決定されたｐ
−ブロモトルエンのＫＩＥは、それぞれ１．５乃至２．１であり、ｐ−クロロト
ルエンに関する値は１．６及び３．２である。ｐ−ブロモトルエン及びｐ−クロ
ロトルエンに関するD（Ｖ／Ｋ）の相違は、２種類の実験の体系を定義する反応
動力学定数に関して解釈できる。競合設計の実験のみにおいて、一つ（以上）の
ＥＳ複合体からのジュウテリウム化及び非ジュウテリウム化基質両方の分離に関
するステップは、こうしたステップの他のステップに対する速度定数の規模に応
じて、ＫＩＥをマスクしない（少なくとも部分的にマスクしない）可能性がある
。トルエンに関するD（Ｖ／Ｋ）の差異が基質に依存する理由は、この時点では
分からないが、両タイプの実験においてＫＩＥがマスクされるのは確かである。
【０１６３】 競合ＫＩＥ実験は、D（Ｖ／Ｋ）のマスキングが他のＣＹＰにおいて発生する
かどうかを検討するために、発現２Ｂ１及び１Ａ２を使用して、ｐ−クロロトル
エンに関して実行された（表７）。Ｖ／Ｋ同位体効果は、分子間ＫＩＥの８．１
（２Ｂ１）及び７．１（１Ａ２）と比較して、３．１（２Ｂ１）及び２．５（１
Ａ２）だった。この結果は、（ｐ−クロロトルエンに関して）３種類すべてのア
イソフォームにおいて、同じ度合いのマスキングが発生することを意味する。
【０１６４】 ＣＹＰとの多数のＬＦＥＲが文献で発見できる。バーカ他（米国科学アカデミ
会報８０（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80）、６６８０乃至４、１９８３）は
、芳香族ヒドロキシル化に関するＶmaxとσ+との線形相関を発見し、小数の置換
モノハロベンゼンに関して、最初の電子移動メカニズムをベンゼン環から直接論
じた。ＣＹＰ媒介Ｎ−脱アルキル化の速度は、グエンゲリッチ他（生物化学ジャ
ーナル２７１（J. Biol. Chem. 271）、２７３２１乃至９、１９９６）によるマ
ーカスリ論に従い、酸化−還元ポテンシャルと相関する。ＣＹＰによるＳ−酸素
添加の速度は、ハメットσ＋と相関しており、筆者は遷移状態における発生正電
荷を主張した（ワタナベ他（１９８０）、四面体の報告２１（Tetrahedron Lett
. 21）、３６８５乃至８）。ホワイト及びマッカーシは、一連の置換トルエンと
のＬＦＥＲを発見した（構造生化学生物物理学２４６（Arch. Biochem. Biopys.
246）、１９乃至３２、１９８６）。電子パラメータのハメットシグマ、及び親
油性パラメータの両方は、それらのデータと上手く相関する。しかしながら、デ
ィノセンゾ他（アメリカ化学学会ジャーナル１１５（J. Am. Chem. Soc. 115）
、７１１１乃至６、１９９３）による置換Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンに関する同
位体効果は、同位体効果がマスクされていることを示すため、速度はマスクされ
る。ＬＦＥＲ及びＫＩＥデータも、速度及び同位体効果がＣＹＰ反応に関してマ
スクされることを裏付ける。加えて、ホワイト及びマッカーシによって測定され
たトルエンの同位体効果は２であり、速度がマスクされていることを示している
（構造生化学生物物理学２４６（Arch. Biochem. Biopys. 246）、１９乃至３２
、１９８６）。結論として、この化学ステップは、一連の置換トルエンのベンジ
ル基ヒドロキシル化に関してマスクされることが示された。これは、現在までに
ＣＹＰに関して行われたすべてのＬＦＥＲに当てはまる可能性が高い。
【０１６５】 この例において、化学物質及び試薬は、例２で説明したように入手した。化合
物の合成。パラ−置換ベンジル−α−2Ｈ2アルコール。メチル４−ブロモベンゾ
アート、メチル４−クロロベンゾアート、メチル４−シアノベンゾアート、メチ
ル４−メチルベンゾアート、及びメチル４−メトキシベンゾアートは、以下の手
順による対応するパラ−置換ベンジルアルコールの合成の開始物質として使用さ
れた。重水素化アルミニウムリチウム（１．２ｍｏｌ）をいずれかで懸濁し、Ｎ 2 の下でアイスバスにより０℃に冷却する。置換ベンゾアート（１ｍｏｌ）を少
量のいずれかで溶解し、温度を０℃に維持している間にＬＡＤ懸濁液に滴下し追
加する。追加後、混合物を更に１時間０℃で又はＴＬＣ（シリカゲル：８０％ヘ
キサン、２０％酢酸エチル）によって完全に攪拌する。未反応のＬＡＤが分解さ
れ、混合物を濾過し、ＭｇＳＯ4によって乾燥させ、蒸発させて完全な乾燥状態
にする。未精製の生成物を再結晶化及び又は蒸留によって精製し、純度はＮＭＲ
及びＧＳ−ＭＳによって評価する。ＮＭＲ及びＧＳ−ＭＳデータは、市販の化合
物と一致する。
【０１６６】 パラ−置換トルエン−α，α，α−2Ｈ3。ｐ−ブロモトルエン、ｐ−クロロト
ルエン、及びｐ−メチルアニソールは、以下の手順により、対応するｐ−置換ベ
ンジル−ｄ2アルコールから合成された。メタンスルホニルクロリド（０．１１
ｍｏｌ）を少量のＣＨ2Ｃｌ2で溶解し、アイス−アセトンバス内で−７８℃に冷
却されたＣＨ2Ｃｌ2内のｐ−置換ベンジル−ｄ2アルコール（０．１０ｍｏｌ）
及びトリエチルアミン（０．１５ｍｏｌ）溶液に滴下し追加する。この反応は、
−７８℃で更に３０分間攪拌される。通常、メシレートは不安定であるため、分
離されず、この手順は、氷水の追加、層の分離、ＣＨ2Ｃｌ2による水性層の抽出
へと続く。有機層を結合し、飽和重炭酸ナトリウムにより洗浄し、ＭｇＳＯ4に
よって乾燥させ、低圧下で溶媒を除去する。残った油は、いずれかにおいて元に
戻し、ベンゾアートの還元に関して説明したものと同じ手順を使用してＬＡＤに
より還元する。生成物はクロマトグラフィ（シリカゲル：１００％ＣＨ2Ｃｌ2）
により精製し、Kugelrohrを使用して真空化で蒸留し、必要な時は、中性アルミ
ナカラム及び１００％ヘキサンにより再度精製し、任意の残留ベンジルアルコー
ルを除去する。任意の残留ベンジルアルコールは、下記のように、ＧＣ−ＭＳを
使用した選択イオンモニタリングにより検出する。
【０１６７】 ＨｅｐＧ２−発現ＣＹＰの作成。例２を参照されたい。 インキュベーション条件及び生成物の分離。例２と以下の通り。３ｍｌのＣＨ2
Ｃｌ2の追加によるインキュベーション終了後、該当する場合は、（１０μＬの
ＣＨ3ＣＮにおいて）１０ｎｍｏｌの適切な内部標準を追加する（下記参照）。
【０１６８】 Ｄ0及びＤ3基質のＶmax及びＫmの決定は、０．５乃至１００μＭの範囲の６種
類の基質濃度、及び内部標準としての１０ｎｍｏｌの適切なパラ−置換ベンジル
アルコールにより、少なくとも６種類の標本を使用して実行される。Ｄ0基質か
らの生成物形成は、ベンジル基炭素でジュウテリウム化された対応するパラ−置
換ベンジルアルコールを内部標準として測定され、Ｄ3基質に関しては、内部標
準は対応する非ジュウテリウム化ベンジルアルコールである。競合実験は、Ｄ0
及びＤ3基質の混合物により、それぞれ０．２５ｍＭの最終濃度において、三重
で実行される。データ分析。例２を参照されたい。
【０１６９】 例４、ＣＹＰ媒介水素原子分離反応における高速基質回転： 非触媒反応の位置選択性は基質分子における様々な位置の酸化のエネルギに関
する差異を反映するが、酵素触媒反応では、基質分子は特定の形式で酵素と結合
可能であり、非触媒反応よりも高いエネルギ経路を選ぶために反応の位置選択性
にバイアスをかける。基質に固有の反応性の差異を、酵素が強制する立体的相互
作用から分離することは、困難な問題である。固有の反応性の差異は量子化学に
よって検討する必要があり、立体要素は分子力学／動力学によって検討する必要
があるため、この問題はＣＹＰ等の酵素系に関する計算モデルを策定する時には
特に重要となる。この例では、同位体効果及び反応の位置選択性の組み合わせを
使用して、固有反応性の差異がＣＹＰ立体相互作用と関係しないかどうかを判定
する方法を説明する。
【０１７０】 位置選択性を司る要素を決定する方法の策定及びテストには、一連の小さな基
質が使用される。基質ｏ−及びｐ−メチルアニソール及びα−クロロメチル−ｐ
−キシレン（図７）は、比較的小さく、ほとんどのＣＹＰアイソフォームに関し
て酵素の活性部位が強制する立体的制約から自由になれる。複数のアイソフォー
ムにおいて位置選択性及びＫＩＥデータを比較することで、図７に示す基質で見
られる官能基に関する反応性の順位が確立する。
【０１７１】 このように処理を確立し、異なるエネルギスケールを有する計算及び実験デー
タを統合し、反応性の統一モデルを提供できる。このアプローチにより、薬品代
謝反応の位置選択性及び速度を予測することが可能になる。この手法から策定で
きる計算方法により、水素原子分離に関して確立された計算方法を芳香族酸化そ
の他の機械論的に別個のＣＹＰ媒介反応に拡張することが可能になる。更に、こ
の方法により、薬品代謝に関与する他の反応に関する計算及び実験モデルを取り
入れることが可能になる。このアプローチは、新薬の代謝特性の評価、及び優れ
た代謝特性を有する有望な化合物の再設計を支援する。
【０１７２】 この例における体系及び対応する論理は、ＣＹＰ媒介酵素反応の立体要素から
電子要素を分離するのを可能にする公式化された方法に関する基本概念を提供す
る。図８は、１種類の基質からＣＹＰの媒介により形成可能な２種類の生成物を
表している。矢印の後部近くの官能基での酸化は、対応する矢印の頭部近くにあ
る生成物の形成につながる。目的は以下の問題に答えることである。観察された
生成物の速度は、二つの官能基の間に存在する固有の電子的相違のみを反映する
か、若しくはタンパク質は、生成比率が電子及び酵素ベースの立体要素の両方を
反映するように、基質との相互作用又は基質の制約を行うか？ 体系４は、１種類の基質からの２種類の基質の形成に関する動力学モデルを表
している。各ステップの詳細及び用語については例３で説明している。様々な基
質及び多数のＣＹＰアイソフォームを使用した同位体効果の実験から、活性酸素
の寿命は、活性酸素種の形成後、ある程度の基質の再配向又は移動を可能にする
と推測される。したがって、ＥＳ１*及びＥＳ２*は、ｋ6及びｋ6’＞ゼロの場合
、相互に交換できる。加えて、複合体ＥＳ１*及びＥＳ２*の間には平衡が存在可
能であり、これは式（ｋ5／ｋ6）（ｋ5’／ｋ6’）によって定義される。
【０１７３】
【数１６】
【０１７４】
【数１７】
【０１７５】 式１６は、観察された生成物比率（（［Ｐ１］／［Ｐ２］）observed）と生成
物形成の相対速度に関する固有比率、ｋ7／ｋ9との関係を示す（固有比率ｋ7／
ｋ9は、タンパク質が存在しない状態で、仮定の［Ｆｅｏ］+3種と基質との間に
化学反応が発生した場合に観察される比率にたとえることができる）。観察され
た生成物比率の値は、生成物形成の相対速度に関する固有比率及び［ＥＳ１*］
／［ＥＳ２*］によって変化する。式１６は、ＥＳ１*及びＥＳ２*の安定状態の
濃度について解く（及びＫｅｑ＝１と仮定する）ことで式１７に再編成できる。
観察された生成物比率に代謝の速度における固有の差異を正確に反映させるため
には、二つの基準を満足させる必要がある。基準１）ＥＳ１*及びＥＳ２*複合体
は、生成物形成に関して、素早く相互に交換可能である必要があり、つまり式１
７においてｋ6＞＞ｋ7である。基準２）ＥＳ１*及びＥＳ２*の相互交換に関する
平衡定数Ｋｅｑは１に等しい必要があり、つまり［ＥＳ１*］／［ＥＳ２*］＝１
、又はｋ5＝ｋ5及びｋ6’＝ｋ6’である。
【０１７６】 基準１は、ＫＩＥにより回転速度を評価することで求められる。第一に、同位
体により置換され、他の代謝部位が少なくとも一つ存在する代謝の部位を一つ有
する一連の基質を使用して、分子間競合同位体効果が測定される。体系５は、二
つの酸化部位を有する基質に関する分子間競合ＫＩＥを説明するメカニズムを示
す。各ステップの詳細及び用語については例３で説明している。体系５において
、Ｓ１は非ジュウテリウム化基質を表し、Ｓ２はジュウテリウム化基質を表す。
酸化は、同位体標識位置（ＥＳ１H*に関してステップｋ7H、ＥＳ２D*に関してス
テップｋ7D）、又は代替の未標識部位（ＥＳ１ALT*に関してステップｋ11、ＥＳ
２ALT*に関してステップｋ11、このステップの化学反応が同位体の影響を受けに
くいと仮定）のいずれかで不可逆的に発生する。
【０１７７】
【数１８】
【０１７８】 式１８は、ｋ5’＞０であり、ＥＳ１*及びＥＳ２*の両方の対に関してＫeq＝
１と仮定した時、体系５に関する観察された結合した分子間競合ＫＩＥを説明す
る動力学表現である。ステップｋ5’は、代替ＥＳ複合体形成につながるステッ
プである。この結合した分子間競合ＫＩＥは、代替の同位体の影響を受けにくい
生成物形成（［Ｐ１ALT］／［Ｐ２ALT］）に関するＫＩＥに対する同位体の影響
を受ける位置での生成物形成（［Ｐ１］／［Ｐ２］）に関するＫＩＥの比率であ
る。式１８は、ｋ6＞＞ｋ7Hの時、結合した分子間競合ＫＩＥがこの化合物に関
する固有ＫＩＥ（ｋ7H／ｋ7D）に等しいことを示している。
【０１７９】 式１８は更に、代替生成物形成が同位体効果及びＣＹＰ反応の相対反応速度を
どのようにマスクしないかを説明している。第二の水分子の形成は、代替生成物
の役割を果たすことが可能であるため、同位体効果をマスクしない。基質のジュ
ウテリウム化の後で水の形成が増加すれば、二つのＥＳ*配向の間での交換が急
速ではなくても、大きな分子間同位体効果が観察できる。急速な交換は、ジュウ
テリウム化及びプロチウム化基質からの全体的な生成物形成を独立して比較する
ことで確認できる。マスクされない度合いは、分子内及び分子間ＫＩＥの値を比
較することで求められる（以下で説明）。
【０１８０】 次に、分子内同位体効果を測定し、これは少なくとも二つの対称部位を含み、
少なくとも１部位（ただしすべての部位ではない）に同位体の標識があるように
基質を選択した時、固有同位体効果（ｋH／ｋD）の非常に厳密な推定の役割を果
たす。このタイプの基質に関する式の例はＲ−ＣＨ2Ｄである。分子内同位体効
果と結合分子間同位体効果の比較により、式１８のｋ7H／ｋ6の規模の評価が可
能になる。分子間ＫＩＥの値＝分子内ＫＩＥの値であり、生成物形成の合計が基
質のジュウテリウム化によって減少しない場合、ｋ6＞＞ｋ7Hであり、基質が酵
素の活性部位において急速な回転を起こしていると結論できる。結合した同位体
効果及び固有同位体効果が等しくない場合、立体的相互作用が回転を妨げ、位置
選択性に影響を与えている可能性がある。
【０１８１】 基準２を評価するために、複数のＣＹＰアイソフォームのＫeqを比較する。こ
の位置選択性の結果の評価では、二つの「活性」複合体（体系４の［ＥＳ１*］
及び［ＥＳ２*］）に関する平衡定数Ｋeqが１に等しいかどうかを評価する。酵
素によって強制された好適な結合モードは、活性部位の基質における２種類（以
上）の配向の一つに関して存在する可能性がある。好適な結合モードが存在する
場合、活性複合体の濃度は等しくない。式１７の［ＥＳ１*］／［ＥＳ２*］が１
ではない場合、観察された位置選択性が、二つの位置での代謝速度における固有
の違い（ｋ7／ｋ9）と等しくなる可能性はない。この概念は、これら２種類の複
合体の平衡が高速である場合、カーティン−ハメットの原則に違反すると思われ
る。カーティン−ハメットの原則では、基底状態のコンホメーションが高速な平
衡にある場合、基底状態のエネルギではなく、二つの反応経路における遷移状態
のエネルギのみの差異が、より急速に形成される生成物を決定するとしている。
しかしながら、基底状態における不十分な結合は遷移状態での不十分な結合につ
ながり、結果として生じた生成物比率には立体的な影響が加わると仮定される。
したがって、Ｋeq＝１の酵素−基質補体のみが、優れた反応データを提供する。
Ｋeq＝１かどうかを評価する間接的な方法では、個々のアイソフォームの数を比
較し、位置選択性が一定かどうかをテストする。
【０１８２】 要するに、二つの代謝可能位置を有する基質の結合した分子間競合ＫＩＥが、
その化合物の分子内ＫＩＥに等しい場合、水の形成が分子間同位体効果をマスク
しないことの原因とならない限り、動力学的に区別可能な複合体から２種類の生
成物が形成される。位置選択性が複数のアイソフォームに関して同じであれば、
Ｋeq＝１である強力な証拠が存在する。したがって、多数のアイソフォームに関
する位置選択性の結果は、動力学的に区別可能な「活性」複合体に関してＫeq＝
１であり、水の形成が生成物形成よりも速くない限り、二つの官能基に関する反
応性における固有の差異の尺度を提供する。あるアイソフォームが、多数のアイ
ソフォームと比較して逸脱した位置選択性結果を示す場合、酵素−基質相互作用
が逸脱したアイソフォームの位置選択性に影響を与えた可能性が強く、Ｋeq≠１
となる。
【０１８３】 オルト−及びパラ−メチルアニソールの位置選択性。ＣＹＰによるｏ−及びｐ
−メチルアニソール（ｏ−及びｐ−ＭＡ）のベンジル基ヒドロキシル化（ＢｚＨ
）により、それぞれｏ−及びｐ−メトキシベンジルアルコールが生じる。ｏ−及
びｐ−ＭＡのｏ−脱アルキル化（ＯＤＡｌｋ）により、それぞれｏ−及びｐ−ク
レゾールが生じる（図９）。オルト異性体の代謝も、芳香族ヒドロキシル化から
４−メトキシ−３−メチルフェノール（４Ｍ３ＭＰｈ）を生じる。位置選択性は
、ｄ０−ｐ−ＭＡに関して、発現ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ
９、２Ｅ１、及び４Ｂ１を使用して測定し、この結果はＣＹＰ媒介ＢｚＨのＯＤ
Ａｌｋに対する比率として表８に示している。テストしたすべてのアイソフォー
ムに関して、ＯＤＡｌｋよりもＢｚＨが選ばれた。位置選択性の範囲は１．３乃
至２．０であり、これは０．５乃至１．８ｋｃａｌ／ｍｏｌの活性化範囲（ΔΔ
Ｇ±）の自由エネルギに対応している。
【０１８４】
【表８】
【０１８５】 それぞれの結果は、３、４、５、又は６回の個別の判定における平均であり、
括弧内の数字は値の最後の有意数における標準偏差（ＳＤ）又は誤差範囲（ＰＥ
）を示す。a位置選択性はＯＤＡｌｋに対するＢｚＨの比率である。bＮｄは決定
されない。cＮｃは分子間ＫＩＥが分子内ＫＩＥより小さいため計算されない。d 平均の計算に使用した値の数。eＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、及び２Ｅ１か
らの結果が平均の計算に使用された。f平均の計算にすべての分子内ＫＩＥ値が
使用された。
【０１８６】 ｏ−ＭＡに関する位置選択性の範囲は、ＢｚＨ：ＯＤＡｌｋとして表現される
時、ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｃ９、及び２Ｅ１に関して１．２乃至３（ΔΔＧ ± ０．１乃至０．６５）であり、２Ｂ６及び４Ｂ１に関して、位置選択性はそれ
ぞれ０．５２及び０．７である（表９）。位置選択性の範囲は、芳香族ヒドロキ
シル化（Ａｒｏｍ）に対するＢｚＨの比率として表現される時、アイソフォーム
１Ａ２、２Ｂ１、及び２Ｅ１に関して０．３乃至０．６（ΔΔＧ±−０．７乃至
０．３）であり、アイソフォーム２Ｂ６、２Ｃ９、及び４Ｂ１に関して１．６乃
至２２ ２Ｅ１（ΔΔＧ±０．３乃至２）である。アイソフォーム２Ｃ８は３種
類の位置すべてでほぼ同じ量の生成物を形成した。環ヒドロキシル化生成物は、
２Ｂ６及び４Ｂ１を除くすべてのアイソフォームで、生成物合計の約３０乃至６
０％を占め、２Ｂ６及び４Ｂ１ではそれぞれ１５％及び２％のフェノール生成物
が生じた（表９）。
【０１８７】
【表９】
【０１８８】 オルト−及びパラ−メチルアニソールに関する同位体効果。分子間競合ＫＩＥ
を測定するために、等しい濃度のｐ−ＭＡ及びｐ−ＭＡ−α−2Ｈ3をＣＹＰ１Ａ
２、２Ｂ１、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｅ１、及び４Ｂ１によりインキュベーションし
た。同一の実験をオルト異性体に関して実行した。ｏ−及びｐ−ＭＡが２Ｃ８に
とって不十分な基質である可能性が強いため、２Ｃ８による生成物形成は非常に
遅く、したがって、２Ｃ８に関する同位体効果は正確に測定できなかった。ｐ−
ＭＡに関して、結合した競合ＫＩＥは、ｐ−クレゾール形成の同位体効果によっ
てｐ−メトキシベンジルアルコール形成の同位体効果を割ることで計算された。
結合ＫＩＥは、アイソフォーム１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、及び２Ｅ１では５．９
乃至６．８の範囲で、平均は６±１である（表８）。この値は、ＣＹＰ２Ｃ９及
び４Ｂ１に関しては、それぞれ２．６乃至１．４である。ｏ−ＭＡに関しては、
結合ＫＩＥは、各アイソフォームについて、ｐ−クレゾール形成及び芳香族ヒド
ロキシル化の同位体効果の積によってｐ−メトキシベンジルアルコール形成の同
位体効果を割ることで計算された。この値は９乃至１４の範囲で、平均は１１±
３である（表１０）。
【０１８９】 分子内ＫＩＥは、ｏ−及びｐ−ＭＡに関して、それぞれｏ−及びｐ−メチルア
ニソール−α−2Ｈ1を使用して、ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｅ
１、及び４Ｂ１により測定された。ｐ−ＭＡに関する平均ＫＩＥは４．４±０．
３で、値の範囲は３．６９乃至６．０８である（表８）。ｏ−ＭＡに関する平均
は６．２±０．６で、値の範囲は５．７乃至６．９である（表９）。
【０１９０】
【表１０】
【０１９１】 それぞれの結果は、３、４、５、又は６回の個別の判定における平均であり、
括弧内の数字は値の最後の有意数における標準偏差（ＳＤ）又は誤差範囲（ＰＥ
）を示す。aＮｄは決定されない。b平均の計算に使用した値の数。eＣＹＰ１Ａ
２、２Ｂ１、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｅ１、及び４Ｂ１からの結果が平均の計算に使
用された。
【０１９２】 一次（Ｐ）及び二次（Ｓ）ＫＩＥは、ｏ−及びｐ−ＭＡに関して、式１９乃至
２２により、ハンズリク他（アメリカ化学学会ジャーナル１０７（J. Am. Chem.
Soc. 107）、７１６４乃至７、１９８５）の方法で計算された。ここで、ｄ１
／ｄ０は、（ジュウテリウム化される水素の相対数に関する統計的補正前の）ｏ
−又はｐ−メチルアニソール−α−2Ｈ1を基質として使用して観察された分子内
ＫＩＥに等しく、ｄ０／ｄ３は観察された分子間結合ＫＩＥである。
【０１９３】
【数１９】
【０１９４】 ｄ１基質を使用して測定された分子内ＫＩＥでは、マスキングが存在しないと
仮定される。ｄ３基質を使用して測定された分子間ＫＩＥでは、この値が分子内
ＫＩＥ値よりも大きい時、マスキングが存在しないため、Ｐ及びＳは、この基準
を満たすアイソフォームに関してのみ計算される。ｐ−ＭＡに関しては、ＣＹＰ
１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、及び２Ｅ１について、Ｐの範囲は４．３乃至５．０で
、平均は５±１であり、Ｓの範囲は１．０８乃至１．２２で、平均は１．１５±
０．２２である。ｏ−ＭＡに関しては、ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、２Ｅ１
、及び４Ｂ１について、Ｐの範囲は６．７乃至８．９で、平均は８±３であり、
Ｓの範囲は１．１５乃至１．２９で、平均は１．２±０．４である。
【０１９５】 ｄ０及びｄ３基質による生成物形成の合計。生成物形成の合計は、両基質の分
枝の量を評価するために、ｏ−及びｐ−ＭＡ−α−1Ｈ3及び−α−2Ｈ3に関して
独立して測定された。表１１のデータは、ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、２Ｅ
１、及び４Ｂ１に関するｐ−ＭＡ−ｄ０及びｄ３の代謝から形成されたｐ−ＭＢ
Ａ及びｐ−クレゾールと、２Ｃ８に関するｐ−ＭＡ−ｄ０からの生成物との量を
示し、ｎｍｏｌで表している。同様の実験におけるｏ−ＭＡの代謝により、ｏ−
ＭＢＡと、ｏ−クレゾールと、４−メトキシ−３−メチルフェノールとして確認
されたフェノール生成物とが生じる（表１２）。すべての酵素及び両方の異性体
基質に関して、ｄ３基質から形成されたアルコールの平均量は、ｄ０基質から形
成された量より少なく、この差異は０．０５有意水準で統計的に有意である。ｏ
−及びｐ−ＭＡに関して、ｄ３基質から形成されるクレゾールの平均量は、ｏ−
ＭＡが２Ｃ９によって代謝される時を除き、ｄ０基質から形成される量よりも統
計的に大きい（α＝０．０５）。ｏ−ＭＡ−ｄ０から形成される４Ｍ３ＭＰｈの
平均量は、アイソフォーム１Ａ２、２Ｂ１、及び２Ｃ９によりｏ−ＭＡ−ｄ３か
ら形成される量と統計的に異なる（α＝０．０５）。ＣＹＰ２Ｂ６、２Ｅ１、又
は４Ｂ１に関しては、統計的な違いは観察されなかった（α＝０．０５）。
【０１９６】
【表１１】
【０１９７】 それぞれの結果は、３、４、又５回の個別の判定における平均であり、括弧内
の数字は値の最後の有意数における標準偏差（ＳＤ）を示す。aＴＰはｎｍｏｌ
ｅ ｐ−ＭＢＡ＋ｎｍｏｌｅ ｐ−ＣＲである。bＮｄは、生成物形成の水準が
低いため決定されない。*Ｄ３基質と比較したＤ０基質の代謝から形成された生
成物の量の間に統計的な意義があることを示す（α＝０．０５）。
【０１９８】 合計生成物（ＴＰ）形成は、ｏ−及びｐ−ＭＡに関して、生成物の個別の量の
合計として、表１１及び１２に示している。ｄ０及びｄ３ｐ−ＭＡからのＴＰ形
成の量は、ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｃ９、及び４Ｂ１に関して、０．０５の有
意水準で統計的に異なっており、２Ｂ６及び２Ｅ１に関して、統計的に異なって
いない。ｄ０及びｄ３ｏ−ＭＡからのＴＰの統計的比較（α＝０．０５）は、Ｃ
ＹＰ２Ｂ１、２Ｃ９、及び２Ｅ１に関して差異を示し、１Ａ２、２Ｂ６、及び４
Ｂ１に関して差異はなかった。
【０１９９】 α−クロロメチル−ｐ−キシレンの位置選択性。ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６
、２Ｃ９、２Ｅ１、及び４Ｂ１によるα−クロロメチル−ｐ−キシレン（α−Ｃ
ｌＭｐＸ）の代謝では、α−クロロメチル−ｐ−ベンジルアルコール及びｐ−ト
ルアルデヒドが生じる（図１０）。ＣＹＰ２Ｃ８に関しては、形成されたｐ−ト
ルアルデヒドの水準が低すぎるため正確に測定できなかった。位置選択性の結果
は、α−ＣｌＭｐＸを基質として使用したベンジル基の位置での代謝に対するα
−クロロメチル基での代謝の比率として表１３に記載している。位置選択性の範
囲は、１Ａ２、２Ｂ１、及び２Ｅ１に関して１．８乃至５．４であり、これは０
．３乃至１ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲の活性化の自由エネルギにおける相違（ΔΔ
Ｇ±）に対応しており、４Ｂ１、２Ｃ９、及び２Ｂ６に関しては、位置選択性の
範囲は０．０３５乃至０．７６である。
【０２００】
【表１２】
【０２０１】 それぞれの結果は、３、４、又５回の個別の判定における平均であり、括弧内
の数字は値の最後の有意数における標準偏差（ＳＤ）を示す。aＴＰはｎｍｏｌ
ｅ ｐ−ＭＢＡ＋ｎｍｏｌｅ ｐ−ＣＲである。bＮｄは、生成物形成の水準が
低いため決定されない。*Ｄ３基質と比較したＤ０基質の代謝から形成された生
成物の量の間に統計的な意義があることを示す（α＝０．０５）。
【０２０２】 α−クロロメチル−ｐ−キシレンに関する同位体効果。結合した分子間競合ＫＩ
Ｅは、α−ＣｌＭｐＸに関して、ｄ０及びｄ３基質における等しい濃度を使用し
て測定される。この結合したＫＩＥは、α−クロロメチル−ｐ−ベンジルアルコ
ールの形成に関する同位体効果をｐ−トルアルデヒドの形成に関する同位体効果
で割ったものである。
【０２０３】 結合したＫＩＥの範囲は、アイソフォーム１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、２Ｅ１、
及び４Ｂ１では５．５乃至８．８である。２Ｃ８及び２Ｃ９によって形成される
ｐ−トルアルデヒドの量は非常に低く、分子間競合ＫＩＥでは測定できなかった
。
【０２０４】
【表１３】
【０２０５】 それぞれの結果は、３又は６回の個別の判定における平均であり、括弧内の数
字は値の最後の有意数における標準偏差（ＳＤ）又は誤差範囲（ＰＥ）を示す。 a 位置選択性は、ｄ０−α−クロロメチル−ｐ−キシレンを基質として使用した
ベンジル基の位置での代謝に対するα−クロロメチル基での代謝の比率である。 b Ｎｄは決定されない。cＮｃは分子間ＫＩＥが分子内ＫＩＥより小さいため計算
されない。d平均の計算に使用した値の数。eＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、及び２Ｂ６
からの結果が平均の計算に使用された。
【０２０６】 分子内同位体効果は、７種類のアイソフォームに関して、α−クロロメチル−
ｐ−キシレン−α’−2Ｈ1によって測定した。この範囲は６．０乃至８．７で、
平均は７±２である。一次及び二次同位体効果からの個別の貢献度は、分子間同
位体効果がマスクされないアイソフォームであるため、１Ａ２、２Ｂ１、及び２
Ｂ６に関して計算される。平均一次同位体効果は７±２で、平均二次同位体効果
は１．０±１である。
【０２０７】 Ｄ０及びＤ３基質による合計生成物形成。ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、２
Ｃ９、２Ｅ１、及び４Ｂ１によるα−ＣｌＭｐＸ−α’−1Ｈ3及びα−ＣｌＭｐ
Ｘ−α’−2Ｈ3の独立したインキュベーション後、α−クロロメチル−ｐ−ベン
ジル−アルコール、ｐ−トルアルデヒド、及びｐ−トルイル酸の量を測定し、合
計生成物形成を計算した。ｐ−トルアルデヒドは、３種類のアイソフォーム１Ａ
２、２Ｂ１、及び２Ｅ１により更に代謝し、少量のｐ−トルイル酸を形成した。
形成されたｐ−トルイル酸の量及び形成された合計生成物のパーセンテージは、
１Ａ２に関して１．３±０．４ｎｍｏｌ（３％）、２Ｂ１に関して０．７±０．
２（３％）、及び２Ｅ１に関して２．８±０．２（１０％）だった。６種類すべ
てのアイソフォームに関して、スチューデントのｔ−テストを使用し、０．０５
の有意水準で評価した時、−ＣＨ３基でのジュウテリウムによる水素の完全な置
換によりベンジル基ヒドロキシル化の減少が発生した。
【０２０８】
【表１４】
【０２０９】 それぞれの結果は、３５回のいずれかの個別の判定における平均であり、括弧
内の数字は値の最後の有意数における標準偏差（ＳＤ）又は誤差範囲（ＰＥ）を
示す。aα−クロロメチル−ｐ−ベンジルアルコール。bｐ−トルアルデヒド。c
ｐ−トルアルデヒドの代謝から形成されたｐ−トルイル酸。ｐ−トルイル酸の形
成は、ＣＹＰ２Ｂ６、２Ｃ９、及び４Ｂ１では検出できなかった。dＴＰ、生成
物の合計量は、この表の個々の生成物の量を加えることで計算された。eｎｄは
生成物形成の水準が低いため決定されない。*スチューデントのｔ−テストを使
用し、０．０５の有意水準である時、Ｄ３基質と比較したＤ０基質の代謝から形
成された生成物の量の間に統計的な意義があることを示す。
【０２１０】 ＣＹＰ２Ｂ１、２Ｂ６、及び２Ｃ９に関して、代替生成物形成はジュウテリウ
ム置換により増加し、１Ａ２及び２Ｅ１に関して、−ＣＤ3基質による代替生成
物形成の量は、−ＣＨ3基質による代替生成物形成と比べ有意の違いはない（Ｐ
＝０．０５）。基質がジュウテリウム化された時、４Ｂ１による代替生成物形成
の量は、小さいが統計的に意味のある減少を示す（α＝０．０５）。
【０２１１】 議論： 酵素の構成の構造的／立体的影響は通常、生成物形成の速度、位置選択性、及
び立体特異性の決定において重要な役割を果たす。多数のＣＹＰアイソフォーム
を考慮する時、活性部位周囲の構造的な可変性による生成物形成の速度、位置選
択性、及び立体選択性における大きな可変性の余地が存在することが容易に想像
される。これは多くの事例において事実である（オーティス・ド・モンテラノ，
Ｐ．Ｒ．（１９９５）、シトクロムＰ４５０の構造、メカニズム、及び生化学（
Cytochrome P450 structure, mechanism, and biochemistry）、第２版、プレナ
ムプレス、ニューヨーク）。一方、多数のアイソフォームに関して位置選択性を
測定し、その結果がすべての酵素に関して同じであることが分かった場合、位置
選択性は主に電子的要素によって制御されており、立体構成要素は少ない可能性
がある。立体構成要素が少なければ、Ｋeq＝１であることが相対的に確かになる
。
【０２１２】 小さな基質は、大きな基質に比べ、酵素との僅かな立体相互作用を有する可能
性が高い。単一の基質に関する位置選択性の結果は、立体要素が小さい又は欠如
している時、多数のＣＹＰアイソフォームと一致する可能性が高い。この記述は
、複数のＣＹＰに関して保存される活性酸素について論じた同位体効果の研究に
よって裏付けられる。加えて、ほとんどのＰ４５０の活性部位における相対的に
疎水性の性質は、小さな基質と酵素との強力な電子的相互作用の可能性を低くす
る。
【０２１３】 図１１に示した化合物の代謝に関する文献における証拠は、小さな基質に関し
て、様々なＣＹＰで立体要素が無視できる又は欠如しているという主張を裏付け
るのに使用できる。ＣＹＰ２Ｅ１による小さなハロゲン化アルカンのグループの
代謝は、純粋な電子的要素によって（実験的及び計算的に）説明される（イン他
（１９９５）、米国科学アカデミ会報９２（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92）
、１１０７６−８０））。ライア他は、同位体効果を使用して、ｏ−及びｐ−キ
シレンは四つのソースからのＣＹＰの活性部位において急速な回転を起こすが、
立体的制約は、大きな４，４’−ジメチルビフェニル分子が活性部位で自由に移
動するのを妨げることを示した（タサニーヤクル他（１９９６）J. Pharmacol.
Exp. Ther. 276、１０１乃至８）。最後に、ジョーンズ他は、大きな分子ベンゾ
（１２）ピレンと、おそらくはＩ−ヘリックスによる１５種類のＣＹＰの活性部
位での制約が、化合物の立体選択的活性を決定すると結論した（生化学３４（Bi
ochemistry 34）、６９５６乃至６１、１９９５）。本発明における小さな基質
の慎重な選択により、テストした基質に活性部位の制約を強制したのがどのアイ
ソフォームであるかを決定できる。
【０２１４】 前記の複数のＣＹＰにおける一連の同位体効果実験に基づいたｏ−及びｐ−Ｍ
Ａ及びα−クロロメチル−ｐ−キシレン代謝の位置選択性について、次に説明す
る。
【０２１５】 ｐ−メチルアニソール： ＣＹＰの活性部位において基質の急速な回転が発生するかどうかを評価するこ
とに向けた第一のステップは、分子間及び分子内ＫＩＥの比較である。アイソフ
ォーム１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、及び２Ｅ１に関して、ｐ−ＭＡの分子間ＫＩＥ
は、分子内ＫＩＥ値から計算される一次ＫＩＥより大きい。分子間ＫＩＥが対応
するＰ値よりも大きいという事実は、分子間同位体効果が一次及び二つの二次同
位体効果の組み合わせであるため、予想できないものである。相乗平均の規則で
は、一定の反応中心部での同位体効果は独立した乗法によるものであり、データ
はこの規則と一致している。したがって、分子間及び分子内ＫＩＥは、こうした
アイソフォームに関して等しい。
【０２１６】 Ｄ0及びＤ3基質に関する合計生成物形成の量の比較は、分枝経路での基質のジ
ュウテリウム化の効果を評価するのに使用される。ベンジル基位置での基質のジ
ュウテリウム化により、ｐ−ＭＢＡの量は減少し、ｐ−クレゾールの量は増加し
ており、テストしたすべてのアイソフォームに関して、この変化は０．０５有意
水準で統計的に有意である（表１１）。１Ａ２及び２Ｂ１によるＤ0及びＤ3基質
に関する合計生成物形成は、統計的に異なっている（α＝０．０５）。合計生成
物形成における小さな差異は、水への分枝が発生したという事実によって最も上
手く説明できる。ＥＳ複合体の間で急速な回転が発生した場合、第二の代替生成
物の形成のみが、反応性の差異をマスクしない役割を果たす。
【０２１７】 多数の結果は、ＣＹＰの活性部位における一部の基質の急速な回転の概念、及
びジュウテリウム化により全体的な生成物形成が変化しないことを支持している
。リンゼイ・スミス他は、アニソールによる実験を実行した（化学学会パーキン
ス報告書ジャーナルＩＩ（Journal of the Chemical Society Perkins Transact
ions II）、６２１乃至８、１９８３）。分子内同位体効果を決定してはいない
が、彼らはメチル基のジュウテリウム化によりアニソールのパラヒドロキシル化
への大きな分枝が生じることを発見した。これにより、７の分子間同位体効果が
生じた。これは、これらの研究者が観察した比率が芳香族及び脱メチル化経路の
反応性における固有の差異を反映する可能性を示している。リンゼイ・スミス他
は、Ｄ0及びＤ3基質に関する全体的な代謝回転における意味のある変化を観察し
ていない。したがって、すべての分枝により、代替生成物、４−メトキシフェノ
ールが生じ、水の形成は大きな同位体効果の原因にはならない。アニソールｐ−
ヒドロキシル化及び脱メチル化に関するエネルギの相対的な差異は、生成物比率
から０．６ｋｃａｌ／ｍｏｌと計算できる。
【０２１８】 代替位置への効率的な分枝のもう一つの例は、ＣＹＰ１Ａ２による７−エトキ
シクマリンの代謝である。メチレン基位置にあるエトキシ基のジュウテリウム化
により、脱エチル化経路が減少し、芳香族ヒドロキシル化が増加し、全体的な生
成物形成又はＮＡＤＰＨ消費は変化しない。２経路の間でのエネルギの差異は、
約１．８ｋｃａｌ／ｍｏｌと決定され、Ｏ−脱エチル化が有利な経路となる。１
Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、及び２Ｅ１に関する前記データは、活性部位で基質の急
速な回転が発生し、分子間ＫＩＥがマスクされない点において、文献に見られる
こうしたデータと一致している。
【０２１９】 このデータは基準１及び２に関して評価される。分子間ＫＩＥ＞一次ＫＩＥで
あり、合計生成物形成には基質のジュウテリウム化によって意味のある変化が生
じないため、ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、及び２Ｅ１の活性部位における基
質の回転は急速であると結論される。アイソフォーム１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、
及び２Ｅ１に関する位置選択性の値は類似しており、Ｋeq＝１を示す。このデー
タを合わせると、観察された位置選択性は酵素の活性部位からの立体的制約に影
響されておらず、ベンジル基ヒドロキシル化はＯ−脱アルキル化に比べ、０．５
乃至１．８ｋｃａｌ／ｍｏｌだけエネルギ特性的に有利であることを示す。
【０２２０】 ＣＹＰ２Ｃ９によるｐ−ＭＡのベンジル基ヒドロキシル化に関する分子間及び
一次ＫＩＥは等しくない。この観察結果の最も可能性の高い解釈は、代替生成物
につながる代謝の分枝の量が非常に低いことで、これはＢｚＨ：ＯＤＡｌｋにつ
いて観察された位置選択性が２０：１と極めて高いことが示している。
【０２２１】 この位置選択性は、ＫＩＥ及び位置選択性の差異をマスクすることが可能な高
いｋ7H／ｋ5比率（式１８参照）を意味する。
【０２２２】 ＣＹＰ４Ｂ１によるｐ−ＭＡのベンジル基ヒドロキシル化に関する分子間及び
分子内ＫＩＥは等しくない。４Ｂ１に関しては、ＢｚＨ：ＯＤＡｌｋとして表現
される位置選択性が非常に低く１．３であるため、分枝の量が同位体効果をマス
クしないのに不十分である可能性は低く、実際、４Ｂ１は、テストした一連のア
イソフォームの中で、ＢｚＨに対するＯＤＡｌｋの量が最も高い。等しくない同
位体効果の理由は、活性部位における基質の遅い回転、又は（急速な存在の有無
に関係なく）Ｋeq≠１とする酵素からの立体的影響のいずれかによって説明でき
る。
【０２２３】 ｏ−メチルアニソール： ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｅ１、及び４Ｂ１によるｏ−ＭＡ
に関する分子間及び分子内ＫＩＥは等しく、これは酵素の活性部位における基質
の急速な回転を裏付ける。１Ａ２、２Ｂ１、２Ｃ９、及び２Ｅ１に関して、Ｂｚ
Ｈ：ＯＤＡｌｋとして表現される位置選択性の範囲は１．２乃至２．９だが、２
Ｂ６の位置選択性は０．５２、４Ｂ１では０．７であり、これは明らかに外れ値
である。ＢｚＨ：Ａｒｏｍとして表現される時、１Ａ２、２Ｂ１、及び２Ｅ１の
位置選択性は一致しており（範囲は０．３乃至０．６）、２Ｂ６の値は２であり
、４Ｂ１では２２である。２Ｃ９の値は大きな標準誤差を有し、他のアイソフォ
ームとの関係において正確に評価できない。この結果は、１Ａ２、２Ｂ１、及び
２Ｅ１によるｏ−ＭＡに関してはＫｅｑ＝１であるが、２Ｂ６及び４Ｂ１では異
なることを示している。したがって、酵素の活性部位によるｏ−ＭＡでの立体的
制約は、１Ａ２、２Ｂ１、及び２Ｅ１では明らかに欠如しており、反応性の順位
は芳香族ヒドロキシル化＞ベンジル基ヒドロキシル化＞Ｏ−脱アルキル化となる
。このデータは、ベンジル基ヒドロキシル化がＯ−脱アルキル化よりもエネルギ
特性的に有利である点に関して、ｐ−ＭＡとＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、及
び２Ｅ１とに関するデータと一致する。
【０２２４】 分枝の比率がオルト異性体によるベンジル基位置での代謝に比べて増加する時
、２Ｃ９に関する分子間及び分子内ＫＩＥはマスクされず、位置選択性の結果は
、ＯＤＡｌｋよりもＢｚＨが好ましいという点において、他のアイソフォームに
関するデータの大部分と一致する。基質のジュウテリウム化は、代替生成物ｏ−
クレゾールにおける意味のある増加にはつながらず、ｄ０基質に関する４Ｍ３Ｍ
Ｐｈの平均量は ２で、ｄ３基質に関しては１．８であり、これは小規模又は無
視可能な変化である。ｏ−ＭＡ−ｄ３に関する合計生成物形成は、ｄ０基質の値
の約半分である。水への分枝は、ｏ−ＭＡ及び２Ｃ９に関する分子間ＫＩＥをマ
スクしないことの原因となる可能性がある。
【０２２５】 ４Ｂ１によるｏ−ＭＡに関するデータの調査は興味深い結果を示す。分子間同
位体効果はマスクされず、ｄ０及びｄ３基質の合計生成物形成は等しい。しかし
ながら、位置選択性は大部分のアイソフォーム及び基質に関して確認された値の
反対となる。ベンジル基及びメトキシ基が互いに非常に接近しているため、活性
部位において二つの官能基の急速な回転が発生すると考えられる。したがって、
分子間同位体効果が４Ｂ１に関してマスクされないのは驚きではない。ｏ−ＭＡ
からのフェノール生成物の量が極めて低い事実は、ＢｚＨ：ＯＤＡｌｋとして表
現される逆位置選択性の結果と共に、Ｋeq≠１であること、又はカーティン−ハ
メットの原則に関して、ベンジル基ヒドロキシル化の遷移状態が立体的に妨げら
れることを示す。
【０２２６】 本発明の一部として４Ｂ１の活性部位がヘム上の狭いチャンネルを有すること
が可能であり、これは基質パラ−ＭＡの速い回転を許さないが、ｐ−ＭＡをヘム
から翻訳し、フリップし、ヘムに対して翻訳し直せることを提示する。提示する
狭いチャンネルは、二つの官能基のいずれかに適応できるが、メトキシ基の方が
上手く適応する。これを示すのは（ｉ）テストした大部分のアイソフォームと比
較した時、ｐ−ＭＡの位置選択性が最低値を示す事実、及び（ｉｉ）大部分のア
イソフォームの結果とは反対に、ｏ−ＭＡに関してメトキシ基の代謝がベンジル
基の代謝よりも好ましいことである。他のアイソフォームとは対照的に、ｏ−Ｍ
Ａが４Ｂ１によって代謝される時、環ヒドロキシル化はほとんど観察されない。
これも、好適な結合モードの考え方を裏付ける。
【０２２７】 アミノ、代替アミノ基、又は酸素原子の存在が４Ｂ１（８０）に関する基質特
異性を与える可能性が指摘されている。ヘムに近い４Ｂ１の活性部位における正
に荷電したアミノ酸の存在は、結合及び位置選択性に静電的構成要素を与える可
能性がある。正の電荷は、基質のＮ又はＯのいずれかと相互作用し、活性部位の
基質の位置にバイアスをかける可能性がある。
【０２２８】 ２Ｂ６によるｏ−ＭＡに関する同位体効果の結果は、活性部位において基質が
急速な回転を起こすことを示す。しかしながら、２Ｂ６に関する位置選択性の値
は、ＢｚＨ：ＯＤＡｌｋ及びＢｚＨ：Ａｒｏｍとして表現される時、１Ａ２、２
Ｂ１、及び２Ｅ１の位置選択性の反対となる。文献のデータは、ここで開示する
結果と一致する。発現２Ｂ６によるトルエンの代謝は、他のアイソフォームと比
較する時、高いＢｚＨ：ＯＤＡｌｋの比率につながる。本発明の一部として、２
Ｂ６の活性部位はパラ−ＭＡの急速な回転を可能にするのに十分な大きさであり
、２Ｂ６はヘムに近い活性部位に狭いチャンネルを有することを提示する。この
狭いチャンネルは、ある配向においてオルト異性体を抑制する原因となる。結論
として、本データは、ｏ−ＭＡ−２Ｂ６複合体に関してＫeq≠１であることを示
す。
【０２２９】 ｏ−ＭＡに関する本位置選択性データの追加の観察では、メトキシ基に対する
パラでの環ヒドロキシル化とＯＤＡｌｋとの比率は、アイソフォームによって、
４．５（１Ａ２）、３．５（２Ｂ１）、１．５（２Ｃ９）、及び３．５（２Ｅ１
）である。これらのデータは、アニソール（Ｐｈ−ＯＣＨ3）が４種類のミクロ
ソーム系によって代謝された時に観察されるｐ−ヒドロキシアニソールとフェノ
ールとの比率（ 平均比率＝２．９）と類似する。本データ及びリンゼイ・スミスのデータは、こ
こで２Ｂ６及び４Ｂ１に関して測定したＯＤＡｌｋ：Ａｒｏｍの比率、０．３及
び０．０３と対照的である。これは、立体的要素が、２Ｂ６及び４Ｂ１によるｏ
−ＭＡに関して観察された位置選択性及びＫＩＥに大きく寄与するという仮説に
裏付けの追加を与える。
【０２３０】 遷移状態の対称性の度合いは、ベンジル基位置での代謝に関する分子内ＫＩＥ
から計算したＰ値を使用して評価できる。ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、２Ｂ６、及び
２Ｅ１によるｐ−ＭＡに関する平均Ｐ値は５±１で、ｏ−ＭＡに関する平均Ｐ値
は８±３である。オクタンの平均Ｐ値は７．６であり、これは対称遷移状態を有
すると仮定される（ジョーンズ他（１９８７）、アメリカ化学学会ジャーナル１
０９（J. Am. Chem. Soc. 109）、２１７１乃至３）。ｐ−ＭＡに関する平均Ｐ
値の５は、非対称遷移状態及びオクタンからのＨ原子分離に比べて放熱反応であ
ることを意味する。ｏ−ＭＡに関する平均Ｐ値は対称遷移状態を意味する。本発
明の一部として、ｐ−メトキシ基が遷移状態における共鳴安定性を提供し、オク
タンのＰ値に比べて低いｐ−ＭＡのＰ値の原因となることを提示する（図１２参
照）。
【０２３１】 ｏ−及びｐ−ＭＡに関する平均分子内ＫＩＥの差異の理由は知られていないが
、２種類の異性体が電子的に異なる事実によって説明される可能性が最も高い。
マレンダ及びウェストハイマによれば（マレンダ，Ｌ．（１９６０）、反応速度
に関する同位体効果（Isotope Effect on Reaction Rates）、ロナルドプレス、
ニューヨーク）、固有ＫＩＥの規模は、遷移状態の対称性が司る。したがって、
本データはｐ−ＭＡの炭素−水素結合分離における遷移状態がｏ−ＭＡの遷移状
態よりも速く起こることを示す。ハモンドの公理に基づくと、ｐ−ＭＡに関する
反応は、ｏ−ＭＡと比べる時、放熱性が高く、生成物はより安定している。この
比較は、両異性体の遷移状態が線形であることに基づいており、オルト化合物の
立体的な妨害は非線形遷移状態を誘導するため、これは正しくない可能性がある
。しかしながら、非線形遷移状態の影響は、同位体効果を低くすることが予想さ
れる。パラ化合物が（線形であり）基準として使用される場合、オルト異性体は
パラ異性体と比較して低い固有ＫＩＥを有することが予想される。共鳴効果は、
オルト及びパラ反応物及び生成物の安定性の差異、及びしたがって異なるＫＩＥ
の原因となる可能性がある。
【０２３２】 α−クロロメチル−ｐ−キシレン： 表１３の結果は、分子間ＫＩＥ≡一次ＫＩＥであることを示す。活性部位にお
ける基質の急速な回転は、ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ１、及び２Ｂ６に関して推測され
る。これら３種類のアイソフォームの中で、１Ａ２及び２Ｂ１は類似する位置選
択性結果を示す。合計生成物形成は、１Ａ２及び２Ｂ１に関する基質のジュウテ
リウム化によって減少しないため、水の形成はＫＩＥをマスクしない原因とはな
らない。１Ａ２及び２Ｂ６に関しては、結論として、Ｋｅｑ＝１であり、α−ク
ロロ−メチル基はベンジル基位置よりもエネルギ特性的に０．３６乃至０．９３
ｋｃａｌ／ｍｏｌ好ましい。
【０２３３】 α−クロロ−メチル基での代謝がベンジル基位置よりも有利であることは、水
素原子分離の結果である基生成物の安定性の比較のみに基づいて予測された優先
度である。Ｃｌに隣接する炭素分子での水素原子分離から形成される生成物は、
Ｃｌ分子により共鳴が安定する。パラ位置のベンジル基からの弱い誘導効果は、
−ＣＨ3基での水素原子分離から形成される生成物を安定させる。
【０２３４】 ２Ｂ６に関する同位体効果の結果は活性部位での基質の急速な回転を示すが、
位置選択性データは活性部位の立体的制約が大きいことを示す。これは、位置選
択性の結果と１Ａ２及び２Ｂ１に関する結果との比較に基づいている。この結果
は、ｏ−ＭＡの２Ｂ６との相互作用の結果と相関している。
【０２３５】 ２Ｃ９に関する位置選択性データは急速な回転に関して評価できないが、この
結果と観察されたｐ−ＭＡに関する位置選択性との比較に基づいて興味深い指摘
が可能である。２Ｃ９によるｐ−メチルアニソール及びα−クロロメチル−ｐ−
キシレンの−ＣＨ3基での代謝は、テストした他のほとんどのアイソフォームと
比較した時、このメチル基に対するパラ位置での代謝に比べ、非常に有利であり
、それぞれ２０：１及び８：１である。２Ｃ９の活性部位における提示した正の
電荷の領域（ジョーンズ他（１９９６）、薬品の代謝の性質２４（Drug Metab.
Dispos. 24）、１乃至６）は、メトキシ基の酸素及びα−クロロメチル基の塩素
からの（複数の）孤立電子対と相互作用する可能性がある。これは、基質の含有
を維持し、その後、この静電相互作用によって位置選択性の結果に影響を与える
役割を果たすことになる。
【０２３６】 ２Ｅ１に関して分子間ＫＩＥは分子内ＫＩＥと等しくなく、これは活性部位に
おける基質の回転が速くないことを示す。この化合物のオルト異性体のインキュ
ベーションにより、活性部位における置換体の急速な交換が潜在的に可能になり
、立体的その他の制約なしに位置選択性の結果を評価できる。 ４Ｂ１に関する同位体効果の結果は、基質が高速ではないことを表している。位
置選択性データは、α−クロロメチル基での代謝に対して、ベンジル基ヒドロキ
シル化が大幅に有利であることを示し、優先度は３０まで：１である。基質のジ
ュウテリウム化は統計的な意味を示すが、非常に小さく、代替性生物形成におい
ては２．２ｎｍｏｌから１．８７ｎｍｏｌに減少する。位置選択性及び非競合生
成物データは、酵素によって強制される大きな構造的制約を示す。潜在的な４Ｂ
１基質の相互作用に関する別の可能性は、活性部位における正に荷電した領域の
存在である。この考え方は、ｏ−ＭＡに関する位置選択性データ、及び４Ｂ１基
質の優先度を説明するのに使用される（ブレイズ・スミス他（１９９５）、生化
学薬理学５０（Biochem. Pharmacol. 50）、１５６７乃至７５）。既知の４Ｂ１
のリストは、通常、アミノ基、代替アミノ基、又は酸素原子を有する化合物を含
む。
【０２３７】 Ｋeq＝１（基準２）であるかどうかの正確な判断は、電子及び立体的要素を分
離するための開示した方法論の使用において最も困難な要素である。複数のアイ
ソフォームに関する位置選択性を比較する本発明の方法は間接的な方法である。
本発明では、この概念が有効であると結論しているが、いくつかの潜在的な不足
が存在する。この手法では、代謝の研究に多数のアイソフォームを要する。化合
物が十分に多くの数のアイソフォームに関して優れた基質ではない場合、基準２
を評価するための標本サイズは小さくなる。小さな標本サイズで位置選択性の値
に大きな幅がある場合、基質に立体的制約を強制しているアイソフォームが存在
するとしても、それがどれなのか決定できない可能性がある。
【０２３８】 α−クロロメチル−ｐ−キシレンに関する本データの中では、分子間及び分子
内同位体効果の値の比較によって判断されるように、３種類のアイソフォーム（
１Ａ２、２Ｂ１、及び２Ｂ６）のみが活性部位における急速な回転を示す。３種
類のアイソフォームのうち二つに関する位置選択性の値は一致しており（１Ａ２
及び２Ｂ１）、もう一つのアイソフォーム（２Ｂ６）は、反対の位置選択性の値
を示す。三つのみの標本サイズでは、値が一致する２種類のアイソフォームが外
れ値ではなく、異なる値が更に大きな一連の共通データを表していないことを証
明するのは困難である。しかしながら、複数の基質からのデータ集合を比較する
ことで情報が得られる。例えば、アイソフォーム２Ｂ６及び４Ｂ１は、基質ｏ−
メチルアニソールに構造的な制約を強制すると結論され、α−クロロメチル−ｐ
−キシレンに関するデータは、この情報を考えに入れて評価される。ｏ−メチル
アニソール及びα−クロロメチル−ｐ−キシレンの両方に関して、アイソフォー
ム２Ｂ６及び４Ｂ１の位置選択性データは一致し、両方の場合において、位置選
択性の値はエネルギ特性的に有利ではない部位において代謝が多く発生すること
を示す（提示された炭素をベースとする基生成物の予測される安定性から判断）
。このデータの一貫性は、本発明に裏付けを与える。最初の仮説を強化するため
に、追加アイソフォーム及び追加基質による位置選択性の値と同位体効果の実験
とが入手できる。
【０２３９】 こうした結果、更にリンゼイ・スミス他（化学学会パーキンス報告書ジャーナ
ルＩＩ（Journal of the Chemical Society Perkins Transactions II）、６２
１乃至８、１９８３）及びハラダ他（生物化学ジャーナル２5９（J. Biol. Chem
. 259）、３００５乃至１０、１９８４）の結果により、アポタンパク質からの
構造的制約を受けずに代謝される感応基の反応性の順位を確立できる。以下の反
応性の順位、α−クロロメチルヒドロキシル化＞ベンジル基ヒドロキシル化＞Ｏ
−脱エチル化＞芳香族酸化＞Ｏ−脱アルキル化が予測される。リンゼイ・スミス
他及びハラダ他は、基質の急速な回転をチェックする厳格な一連の同位体効果実
験を実施していないが、両データセットの化学量論的結果は急速な回転の可能性
が高いことを示している。
【０２４０】 要するに、ＣＹＰ媒介反応の電子構成要素に構造的構成要素が存在しないかど
うかを判断する方法論が策定された。こうした基質の相対的に小さいサイズは、
部分的に、このモデルの成功の原因となっている。電子モデルは、約８０％の基
質に関する代謝の一次部位を正確に予測する。基質の急速な回転を許さないＣＹ
Ｐ酵素に関しても、立体構成要素と結合して電子構成要素が存在している。その
ため、電子モデルは、ほとんどのＣＹＰ酵素に関する予測モデルにおいて必要と
なる。
【０２４１】 こうした実験的研究からの位置選択性の結果は、ＣＹＰ反応を予測する既存の
計算的又は化学的方法と比較し、これらの検証に使用することができる。加えて
、この実験データは、計算モデルの精緻化を支援するために使用すること、及び
新しいモデルを策定するためのガイドラインとして使用することが可能である。
最終的には、反応性に対する電子構成要素を予測する方法は、タンパク質構造が
代謝に与える影響を予測する方法と組み合わせることができる。理想的には、こ
れにより、完全で更に正確なモデル、つまり、基質のサイズによる制限を受けず
に、電子的及び立体的要素両方の影響を取り入れたモデルの構築が可能になる。
この例において、化学物質及び試薬は例２で説明したように入手される。
【０２４２】 アルコール及びトルエンの合成。メチル−４−メトキシベンゾアート及びメチ
ル−２−メトキシベンゾアートは、対応する置換ベンジル−α−2Ｈ2アルコール
の合成のための開始物質として使用され、置換トルエン−α，α，α−2Ｈ3及び
α−2Ｈ1は、それぞれ対応するＤ2及びＤ0アルコールから合成され、例２及び３
において説明した手順によって精製される。
【０２４３】 ４−メトキシ−３−メチル−フェノールの合成。フェノールの合成は、２ステ
ップの合成で、アルデヒドを得るためにビルスマ−ハーク縮合を利用し、その後
、バイヤ−ビリンガ酸化によってフェノールを与える。オキシ塩化リン（５．１
ｍＬ、０．０５７ｍｏｌ）を、窒素下でジメチルホルムアミド（６ｇ）内の２−
メチルアニソール（５．３３ｍＬ、０．０４３ｍｏｌ）の溶液に滴下し追加する
。追加後、混合物を４時間加熱及び還流し、冷却後、１００ｍＬの水を加える。
１０％を超えるＮａＯＨを追加し、この溶液を４×１００ｍＬのエーテルで抽出
する。エーテル層を水、その後ブライン溶液で洗い、硫酸マグネシウムにより乾
燥させ、減圧下で蒸発させる。残った黒い油（５．０ｇ、７７％）をカラムクロ
マトグラフィ（シリカゲル：９０％ヘキサン、１０％酢酸エチル）によって精製
する。残りの油（１．７８ｇ、２８％）をジクロロメタン（１００ｍＬ）で溶解
し、その後、３．０３ｇの（０．０１８ｍｏｌ）３−クロロ安息香酸を追加する
。混合物を窒素下で５時間まで還流し、冷却後、減圧下で蒸発させる。残留物を
酢酸エチルで溶解し、水性の飽和した重炭素ナトリウムで洗う。有機層をマグネ
シウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させる。残った黒い油を７ｍＬのメタノールに
溶解し、１０％水性の水酸化カリウム溶液を追加する。この溶液を窒素下で２時
間まで攪拌し、水を追加し、溶液をエーテルにより抽出する。エーテル層は、飽
和した重炭素ナトリウム溶液、その後、水により、化合させ洗浄する。このエー
テルを硫酸マグネシウムにより乾燥させ、減圧下で蒸発させる。残った油（１．
２１ｇ、７４％）をヘキサンにより２度再結晶化し、長く白い針状の結晶を作る
（０．３４ｇ、＜１％）。ＮＭＲ及びＧＳ−ＭＳにより純度を評価する。
【０２４４】 α−クロロメチル−ｐ−ベンジル−α−2Ｈ2アルコールの合成。エーテル内の
４−（クロロメチル）安息香酸（２．５ｇ、０．０１５ｍｏｌ）に、エーテル内
の過剰なジアゾメタンを追加する。過剰なジアゾメタンが反応から蒸発した後、
エーテルを減圧下で蒸発させ、固体（２．６８ｇ、９９％未精製収量）を残し、
これをエーテルで溶解し、０℃に冷却したエーテル内の重水素化アルミニウムリ
チウム（０．７３ｇ、０．０１７ｍｏｌ）の溶液に滴下し追加する。例２のパラ
−置換ベンジル−α−2Ｈ2アルコールによるワークアップ後、白い半固体が分離
される（２．３１ｇ、９９％）。この化合物は、更に精製を行わず使用する。
【０２４５】 α−クロロメチル−ｐ−ベンジルアルコールの合成。水素化アルミニウムリチ
ウムを重水素化アルミニウムリチウム（８２％収量）に置き換えることを除き、
α−クロロメチル−ｐ−ベンジル−α−2Ｈ2アルコールの合成に関する前の説明
と同じ方法を使用し、反応を起こす。
【０２４６】 α−クロロメチル−ｐ−キシレン−ｄ３及びα−クロロメチル−ｐ−キシレン
−ｄ１の合成。これらはメチルアニソールと同じ方法で作成する。残った油を最
初にシリカゲルカラムクロマトグラフィ（１００％ヘキサン）で、その後アルミ
ナカラム（１００％ヘキサン）で精製する。
【０２４７】 ＨｅｐＧ２発現ＣＹＰの作成、インキュベーション条件、制御、精製物分離、
データ分析。アイソフォーム２Ｂ６、２Ｂ８、及び４Ｂ１のタンパク質発現及び
作成と、インキュベーション条件と、標本のワークアップと、データ分析の方法
及び詳細とは、以下の詳細を除き、例２において前記したものと同じである。競
合同位体効果の実験は、Ｄ0及びＤ3基質により三重で実施し、それぞれの最終濃
度は０．１２５μＭである。Ｄ0及びＤ3基質からの生成物形成の独立した測定は
、最終濃度０．２５μＭで実施する。Ｄ0基質からの生成物形成は、ベンジル基
炭素でジジュウテリウム化した置換ベンジルアルコール１０ｎｍｏｌを内部標準
として測定し、Ｄ3基質については、対応する内部の非ジュウテリウム化ベンジ
ルアルコールを標準として使用した。ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、及び４
−メトキシ−３−メチルフェノールは、ｐ−ブロモベンザルデヒド２０ｎｍｏｌ
を内部標準とし、標準曲線と比較して定量化した。少量のバックグラウンドのｏ
−又はｐ−クレゾールを定量化し、観察された対応するクレゾール生成物の量か
ら減じた。
【０２４８】 ＧＣ−ＭＳによる生成物の分析。オーブン条件が５０℃で０．５分間、１０℃
／分で１４５℃まで、２０℃／分で２５０℃まで、及び２５０℃で２分間である
ことを除き、第ＩＩ章の実験の節で述べたものと同じＧＣ−ＭＳ実行条件により
、ＨＰ−カラムを使用して生成物の定量化を行った。ＨＰＷａｘカラムを使用し
、４−メトキシ−３メチルフェノールの確認を行う。その他の詳細については例
２を参照されたい。
【０２４９】 ｏ−メチルアニソール代謝の確認。ｏ−メチルアニソール及びＣＹＰのインキ
ュベーションからの標本をＧＣ−ＭＳ分析した後、３種類の生成物ピークが確認
された。２種類のピークは、本来の標準と比較することで、間違いなく４−メト
キシベンジルアルコール及びｏ−クレゾールとして確認された。第三のピークは
、すべてのアイソフォームに関して、ＨＰ−１及びＨＰＷａｘカラムの両方にお
いて、本来の４−メトキシ−３−メチルフェノール化合物と同一の質量スペクト
ル断片パターン及びＧＣ保持時間を示した。質量スペクトル断片パターンは、通
常、任意の化学物質に固有であるため、第三のピークは４−メトキシ−３−メチ
ルフェノールと分類した。
【０２５０】 しかしながら、考えられる他の三つのフェノール位置異性体に対応する本来の
化合物は、第三のピークとの比較には利用できない。内部標準と比較して、質量
スペクトル断片パターン、保持時間、及びエリアカウントがすべての異性体に関
して同じである場合、４−メトキシ−３−メチルフェノールのデータは、環ヒド
ロキシル化生成物の合計を表す。すべてのｏ−ＭＡインキュベーション標本を、
ＨＰ−１カラムより極性があるＨＰＷａｘカラムで分析した。ＨＰＷａｘカラム
は、ＨＰ−１カラムでは通常重複する他の異性体化合物に関するピークを分離す
るのに使用した。すべてのｏ−ＭＡインキュベーション標本のＨＰＷａｘカラム
での分析では、任意の度合いのピーク分離は生じなかった。したがって、第三の
生成物が４−メトキシ−３−メチルフェノールであることは論理的に確かである
。
【０２５１】 統計的分析。マイクロソフトＥｘｃｅｌ９７のＤａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｔｏｏｌｐａｋを使用し、均等な分散を仮定したスチューデントのｔ−テストに
より、すべての統計的分析を実行した。
【０２５２】 例５、水素原子分離に関する相対速度定数の尺度としての位置選択性： 上で説明したように、実験的な代謝物比率は、酵素が強制する立体的制約の欠
如を示す基質の急速な回転を考えると、ＣＹＰ反応に関する理論モデルのパラメ
ータ化に使用できる。こうしたＣＹＰ酵素における急速な回転を確認する追加の
手段は、４−メチルアニソールのベンジル基ヒドロキシル化及びＯ−脱アルキル
化の相対速度の調査である。２種類の反応から観察された生成物比率により、電
子要素を使用した反応の単純なモデル化が可能かどうかを確認できる。
【０２５３】 表１５は、様々なＣＹＰ酵素による４−メチルアニソールの反応に関して、急
速な回転速度が存在することを示している。
【０２５４】
【表１５】
【０２５５】 ベンジル基ヒドロキシル化に関して観察された通常の同位体効果に加え、脱メ
チル化に関して、逆同位体効果が観察される。これは、テストした酵素のほとん
どに関して、メチル及びメトキシ基の相互交換の速度が速いことを示している。
すべての酵素はベンジル基酸化を優先し、ΔＧ+で表す平均差異は１．３ｋｃａ
ｌ／モルである。この標準偏差はモデルの予測誤差の範囲内である。したがって
、このデータは、異なる官能基の酸化に関する相対速度定数を提供するための実
験的代謝比率の使用を更に裏付ける。
【０２５６】 水素原子分離をパラメータ化するために、最近の研究の結果は興味深いことが
証明されており、これは機械論的洞察に関してだけではなく、ＣＹＰ媒介反応に
関する潜在的なアポタンパク質の独立したモデルによって提示されているためで
ある。Ｎ−脱アルキル化反応のメカニズムの研究においては、明確な特徴を有す
る水素原子アブストラクタであるｔ−ブトキシ基によって多数の実験が行われた
。こうした研究では、ｔ−ブチルペロキシドをｔ−ブトキシ基に閃光分解するた
めにレーザを使用する他者による以前の研究を拡張した。この古典的な方法では
、ジフェニルメタノールを使用して、競合反応の水素原子分離の速度を追跡する
。
【０２５７】 特に興味深いのは、ｔ−ブトキシ基水素原子分離、外球体電子移動後のラジカ
ルカチオンの脱プロトン化、及びＣＹＰ媒介反応の同位体効果プロフィールの比
較である。これらは同位体効果プロフィールが類似するだけでなく、置換ジメチ
ルアニソールによるｔ−ブトキシ及びＣＹＰ媒介反応に関しても本質的に同一で
あることが分かった。これは、ｔ−ブトキシ基が全般的なＣＹＰ媒介反応の優れ
たモデルであるという仮説につながった。
【０２５８】 ＢＬＹ／６−３１Ｇ*密度関数法を使用し、基底状態の記述子を得ることで、
ｔ−ブトキシ基による水素原子分離に関して実験的に測定した１４の速度定数（
Ｉｎ ｒａｔｅ）間の線形関係（式２４及び図１４参照）と、ＢＬＹ／６−３１
Ｇ*反応熱（Ｈreac）及びｋｃａｌ／ｍｏｌで表す基中間体ＨＯＭＯエネルギ（
ＥHOMO）とが得られた。この相関に関する推定の標準誤差は約０．９ｋｃａｌ／
モルである（図１４参照）。
【０２５９】
【数２０】
【０２６０】 これらの結果は計算モデルを実験的にパラメータ化するための化学系の使用を
裏付ける。
【０２６１】 例６、芳香族酸化に関する相対速度の尺度としての位置選択性： 実験的代謝比率は、ＣＹＰ反応に関する理論モデルにおける芳香族酸化反応を
パラメータ化することにも使用できる。前例で説明した水素原子分離と同じよう
に、芳香族酸化と代替位置の実験的比率は、様々なＣＹＰ酵素を使用して決定で
きる。芳香族ヒドロキシル化反応のパラメータ化に使用できる基質の例は図１３
に示している。これらの基質は、小さなサイズ、代謝の代替位置の存在、及び疎
水性に基づいて選択した。
【０２６２】 基質を有効にするために、活性部位での回転速度が高速であるべきである。５
種類の基質、つまり７−エトキシクマリン、トルエン、ｏ−キシレン、ｐ−キシ
レン、及びアニソールに関して、同位体効果の研究は、関連する位置の急速な交
換が発生する。残りの基質は水素結合を形成できない。したがって、こうした基
質の結合には疎水性相互作用が関与する可能性が最も高く、回転は高速であると
思われる。こうした研究にはいくつかの人間の発現ＣＹＰ酵素が使用され、これ
にはＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｄ６、２Ｅ１
、３Ａ４、及び３Ａ５が含まれる。複数の酵素の使用は、活性部位における任意
の配向優先度の合理的な平均を保証する（図１参照）。
【０２６３】 水素分離及び芳香族酸化の両方に関するモデルの分析及び構築には、両反応か
らのデータの結合が必要である。これは前記の式５及び６を使用して達成される
。ここに記載した参考文献は全て、断わりの有無に拘わらず、出典を明記するこ
とによりその開示内容全体を本願明細書の一部とする。
【０２６４】 以上本発明を詳細に説明したことで、本発明の趣旨及び範囲から逸脱すること
なく、不適切な実験を行わずに、広範な同等のパラメータ、濃度、及び条件の中
で同様に実施し得ることは、当業者には理解されよう。
【０２６５】 本発明を特定の実施形態と結びつけて説明してきたが、更なる変形が可能であ
ることは理解されよう。本願は、本発明が関連する技術内の既知又は慣習的な実
施に属するような及び前記特許請求の範囲内で上述した本質的な特徴に適用され
るような本開示からの逸脱を含み且つ一般には本発明の原理に従う任意の変形、
使用、又は適用を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 シトクロムＰ４５０に関する提示された触媒サイクルを示す図。
【図２】 毒性化合物に代謝される可能性のあるシトクロムＰ４５０基質を示す図。
【図３】 メトキシ基との水素分離反応の結果を示す図。
【図４】 ＤＦＴ値と一致させるための反応のＡＭ１熱の修正を示す図。
【図５】 水素分離及び芳香族酸化反応の速度に関する実験的なΔΔＧ対予測されるΔΔ
Ｈを示す図。
【図６】 発現ＣＹＰとのパラ置換トルエンに関する同位体効果プロフィール（ＩＥＰ）
を示す図。
【図７】 位置選択性の測定に使用されるＣＹＰ基質を示す図。
【図８】 Ｐ４５０によるｐ−メチルアニソールからのｐ−クレゾール及びｐ−メトキシ
ベンジルアルコールの形成を示す図。
【図９】 ｐ−メチルアニソールのシトクロムＰ４５０媒介代謝による二種類の代謝物を
示す図。
【図１０】 α−クロロメチル−ｐ−キシレンのシトクロムＰ４５０媒介代謝による二種類
の代謝物を示す図。
【図１１】 様々なサイズの五種類のシトクロムＰ４５０を示す図。
【図１２】 ｏ−メチルアニソールに関する炭素ベースの基に向けた共鳴の安定化を示す図
。
【図１３】 芳香族酸化のパラメータ化に使用する基質を示す図。
【図１４】 ｔ−ブトキシ基及びＤＦＴエネルギの実験的な反応速度の相関関係を示す図。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年５月１８日（２００１．５．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５９】
【数１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６６】
【数２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６８】
【数３】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８３】
【数４】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８５】
【数５】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８６】
【数６】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９０】
【数７】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９２】
【数８】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０７】
【数９】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０８】
【数１０】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３４】
【数１１】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５０】
【数１２】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５１】
【数１３】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５４】
【数１４】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５５】
【数１５】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１７３】
【数１６】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１７４】
【数１７】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１７７】
【数１８】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１９３】
【数１９】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２５９】
【数２０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＺ，ＶＮ，ＺＡ (72)発明者 コーゼクワ・ケネス・アール． アメリカ合衆国 カリフォルニア州94040 マウンテン・ビュー，クリストバル・プ リバダ，1203 (72)発明者 ジョンズ・ジェフリィ・ピー． アメリカ合衆国 ワシントン州99163 プ ルマン，ウェスト・メイン・ストリート， 420 (72)発明者 ヒギンズ・リーアン アメリカ合衆国 ワシントン州98115 シ アトル，エヌ．イー．＃２，39番・アベニ ュー，7527 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB01 FB05 FB20 JA01 JA02

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 広範な基質特異性を有する酵素により化合物の代謝に関する
    電子的傾向を決定する方法であって、 ａ）前記酵素を参照せずに、前記酵素が媒介する任意の一または複数の反応に
    より代謝転換に向かう前記化合物の各官能基の位置特異的反応性を決定するステ
    ップと、 ｂ）各酵素媒介反応の活性化エネルギを量子化学記述子に関連させる一つ以上
    の式を導くステップと、 ｃ）前記一つ以上の式から、核反応の活性化エネルギを予測することで前記化
    合物の代謝を決定するステップと、 を備え、 前記決定された電子的傾向が前記反応の電子構成要素を提供するものである方
    法。
  2. 【請求項２】 ステップｂ）が、各酵素媒介反応の活性化エネルギを、前記
    化合物の反応熱に関連させることを含む請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ステップｂ）が、半経験的方法を前記一つ以上の式の根拠に
    することを含む請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 ステップｂ）が、更に、活性化エネルギにおける誤差を補正
    するために、実験結果によってパラメータ化することで、前記一つ以上の式を精
    緻化することを含む請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記経験的パラメータ化が、前記（複数の）反応に関する同
    位体効果を決定することで、酵素の活性部位における基質の回転の相対速度を確
    認することを含む請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 ステップｂ）が、更に、活性化エネルギにおける誤差を補正
    するために、高レベル量子化学パラメータを計算することで、前記一つ以上の式
    を精緻化することを含む請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 ステップｂ）が、更に、前記一つ以上の式における量子化学
    活性化エネルギ（ＡＭ１）及び又はスピン汚染を補正するために、非経験的方法
    の応用を含む請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 ステップｃ）が、化合物の代謝が （１）毒性代謝物の過度な濃縮の形成、 （２）薬品として有効な基質の代謝の過度な速度、 （３）薬品として有効な基質の代謝の不適切な速度、 （４）薬品以外として有効な基質の代謝の過度な速度、 のうちの一つ以上を生じるかどうかを確認することを含む請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記任意の一または複数の酵素媒介反応が、水素原子分離及
    び又は酸素添加を含む請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記反応がヒドロキシル化及び又は芳香族酸化である請求
    項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記酵素がモノオキシゲナーゼである請求項１０記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 前記モノオキシゲナーゼがシトクロムＰ−４５０である請
    求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記シトクロムＰ−４５０が、人間の酵素ＣＹＰ２Ｅ１、
    ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ１Ａ１、Ｃ
    ＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ｂ１、及びＣＹＰ２Ａ６
    を含む集合から選択される請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記反応が電子構成要素により立体的に進められる請求項
    １記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記官能基が、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｃ、Ｃ＝Ｃ、Ｃ≡Ｃ、Ｃ＝Ｏ
    、Ｃ−Ｎ、Ｃ＝Ｎ、−Ｓ−、−Ｎ−、−Ｎ＝、−ＣＨＯ、−ＯＨ、及び−ＣＯＨ
    から成る集合から選択される請求項１記載の方法。
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