JP2002521340A - 有機溶媒含有または非含有溶液を利用した軟骨部抽出物を得る方法およびそれから分離された抽出物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、軟骨抽出物の調製とそれらの分留のために、純水の代りに有機溶媒含有溶液を利用する方法に関するものである。少なくとも基質金属プロテアーゼに対する作用（抗ＭＭＰ）を有する、生物学的有効成分を含有する抽出物の調製のために、異なる有機溶媒が試験された。本発明はまた、分子量が約５００ｋＤａ（０〜５００画分）未満の分子から成るサメの軟骨部の全ての液体抽出物を、分子量が約１ｋＤａ（０〜１画分）以下の分子と、約１〜５００ｋＤａ（１〜５００画分）の間にある分子から成る２つのよく分離された画分に、精製する工程に関するものである。結合の形成を防ぎ、有効成分の安定性と溶解性を改良するために、サッカロースまたは他の安定剤を添加することが可能である。体積重量１％のサッカロースを含有する、０〜５００画分、０〜１画分、１〜５００画分、ならびにそれらの同等物は、抗ＭＭＰおよび抗腫瘍作用作用を有する。本発明はまた、２４４ａｍｕ（原子量単位）の質量をもち、少なくとも抗ＭＭＰ作用および抗腫瘍作用を有する成分を提供するものである。さらに、転移状態の形成、および／または新血管形成、ＭＭＰ酵素阻害のための、上記の抽出物、得られた画分、または成分の利用についても記載がなされている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、サメの軟骨部から抽出した低分子量成分と、それらの調製工程に関
するものである。本発明はまた、さまざまな条件下における、軟骨部抽出物の分
離と精製処理に関するものである。低分子量成分は、抗マトリックス金属プロテ
アーゼ作用（抗ＭＭＰ）、抗アンギオジェニン作用および抗腫瘍作用のうちの少
なくとも一つを示す。

【０００２】 （背景技術） サメの軟骨部抽出物の調製方法と抽出物は、国際公開公報ＷＯ ９５／３２７
２２，ＷＯ ９６／２３５１２およびＷＯ ９７／１６１９７において開示されて
いる。サメの軟骨部の液体抽出物には、抗アンギオジェニン作用、抗コラーゲン
溶解性作用、直接の抗腫瘍増殖作用および消炎作用に対するさまざまな分析試験
が行われてきた。

【０００３】 ＷＯ ９５／３２７２２は、生体外（in vitro）でのじかの抗腫瘍増殖作用と
生体外（in vivo）での抗腫瘍作用において、抗アンギオジェニン作用をもつサ
メの軟骨部抽出物を得るための方法を開示している。その方法は、サメの軟骨部
組織を混ぜ、その軟骨部組織を水中で約５００mmの粒子の大きさに細かくする工
程と、有効成分を水中へ抽出し、そのようにして得られた抽出物を分子量が約５
００ｋＤａ(０〜５００画分（fraction）)より小さい分子を取り出すために分別
を行う工程とを含む。その液体軟骨部抽出物は、分子量が約５００ｋＤａ以下で
ある分子から成る凝縮された液体抽出物を形成するために、約１ｋＤａのわずか
の多孔性をもつ膜に集められる。その抽出物は、約１〜５００ｋＤａの間の分子
量をもつ分子に凝縮されており、その０〜５００画分は、分子量が約１〜１２０
ｋＤａの範囲にわたる抗腫瘍増殖分子を含む抽出物を多数形成するためにさらに
分別される。しかし、公開公報ＷＯ ９５／３２７２２は、分子量が約１ｋＤａ
以下の成分に対する特定の回収法を開示しておらず、また、有機溶媒含有溶液に
おける、軟骨部抽出物またはその分別されたものを得る工程を明らかにしていな
い。

【０００４】 国際公開公報、ＷＯ ９６／２３５１２は、水溶液においてどんな種類の軟骨
部からでも、生物学的に有効な成分を抽出するための方法を開示している。さら
にこの公開公報は、サメの軟骨部を含む液体と結びついた他の生物学的作用、す
なわち、抗コラーゲン溶解性作用及び消炎作用を明らかにした。しかし、そのＷ
Ｏ ９６／２３５１２は、分子量が約１ｋＤａ以下の成分の回収法を開示してお
らず、また有機溶媒含有溶液を使用する方法についての開示もない。

【０００５】 国際公開公報、ＷＯ ９７／１６１９７は、分子量が約０．１〜５００ｋＤａ
の間にある分子に凝縮された水性の抽出物を、取り出すための方法を開示してい
る。その方法は、分子量が約１ｋＤａ以下の成分を抽出するのに用いられるが、
特定の低分子量成分を取り出すことには用いられない。さらに、分離されたまた
は精製された形態における成分については開示されていない。

【０００６】 マトリックス金属プロテアーゼは、新血管の形成、初期段階の腫瘍の成長促進
および転移状態の形成の過程に関係があると、技術上において一般的に理解され
ている。従って，抗アニギオジェニン作用および／または抗マトリックス金属プ
ロテアーゼ作用を示す化合物または薬剤は、新血管の形成の抑制、腫瘍の成長の
抑制、細胞への転移の抑制および血管形成に関連した病気の治療のうち、少なく
とも一つに有用であると考えられてきた。

【０００７】 サメの軟骨部から得られた成分にそのような関与があるとするならば、それら
の調製と、生物学的作用があるとまだ知られていない他の成分の精製と分離のた
めに改良された方法が必要となる。

【０００８】 （発明の開示） 本発明は、サメの軟骨部から得られた抽出物の調製のために改良された方法を
提供するものである。

【０００９】 ある見地からすると、本発明は、生物学的に有効な成分を含む、軟骨部抽出物
およびその画分の調製のために、さまざまな条件が設けられた方法を提供してい
る。具体的には、本発明は、抗ＭＭＰ作用を少なくとも有する成分をもつサメの
軟骨部抽出物の調製方法を提供するものである。

【００１０】 また他の見方をすると、本発明は、軟骨部液体抽出物から得られた生物学的に
有効な成分である０〜５００分子量の画分を、第一の画分が分子量が約１ｋＤａ
以下(０〜１画分)である成分を含み、第二の画分が分子量が約１〜５００ｋＤａ
(１〜５００画分)の間にある成分を含むような２つの画分に分離する方法を提供
するものである。

【００１１】 成分の結合を最小限に抑えるためや溶解性および安定した可溶な形態の持続性
改良のために、サッカロース、または、デキストラン、フイコル（Ficoll^TM）、
フルクトース、ゼラチン、ブドウ糖、グリシン、イノシトール、乳糖、マンニト
ール、ソルビトールのような好適な安定剤のうち１または２以上の安定剤を、０
〜５００、０〜１、１〜５００の画分のいずれかに十分に安定する分量だけ添加
したり、また製造過程のいずれかの段階において使用することができる。ここで
、画分や、溶液または抽出物に関して用いられる、「体積重量１％のサッカロー
ス含有」という表現は、体積重量で約１％のサッカロースを含有している抽出物
や、溶液、画分を示している。０〜１、１〜５００の画分における生物学的に有
効な成分は、抗ＭＭＰ、抗アンギオジェニンおよび抗腫瘍作用を有している。

【００１２】 別の見方をすれば、本発明は、分子量が約２４４ａｍｕ(原子量単位)である、
サメの軟骨部抽出成分を提供するものである。ここでは、抗ＭＭＰ作用および抗
腫瘍作用のうちの少なくとも一つを有しているものを、 （以下、本明細書においてはＡＥ−９８６と表す）と称する。ＡＥ−９８６の精
製のために用いられる材料および方法は、異なる溶媒相やクロマトグラフ法にお
いて、本成分の分割区分が可能であるという、後の物理化学的特徴をいくつか明
らかにした。本発明は、ＡＥ−９８６成分またはそれに相当する軟骨部の種類に
よらず抽出された成分の分離と精製方法も提供する。

【００１３】 また、さらに別の見方によれば、抗ＭＭＰ作用と抗腫瘍作用を有し、サメの軟
骨部から分離した約２４４ａｍｕの分子量をもつ化合物に相当するような、軟骨
部の種類によらず抽出され精製された生物学的に有効な化合物を提供するもので
ある。

【００１４】 なおかつ、本発明はＭＭＰ酵素を抑制する方法を提供するものである。その方
法は、本発明にそって用意されたＡＥ−９８６成分、または１または２以上の軟
骨部抽出物や、それらより得た画分の効果的な量をもって、先の酵素により分裂
できる基質に接触する工程を含むものである。

【００１５】 さらに、本発明の他の側面は、新血管形成や転移状態の形成を抑制する方法を
提供するものである。その方法は、軟骨部から得た抽出物、溶液、ホモジェネー
ト、懸濁液、０〜５００、０〜１、１〜５００の画分等や、体積重量１％のサッ
カロース含有の同様な画分、またはＡＥ−９８６成分のような成分を効果的な量
だけ目標の組織に接触する工程を含むものである。

【００１６】 別途示す図面は本明細書の一部であり、本発明の態様のさらなる説明に用いら
れるものである。本発明は、ここにあげられている特定の実施態様の詳細な説明
と組み合わせて、これら図面の一つまたはそれより多くの図面を参照することに
より、さらに理解し易くなるであろう。

【００１７】 （発明の説明） （生物学的分析） サメの軟骨部抽出物や、それらから得た画分およびＡＥ−９８６成分の生物学
的特性は、以下の分析評価のうちの少なくとも一つを用いることによって決定さ
れる。

【００１８】 ・ゼラチナーゼ抑制分析（Gelatinase Inhibition Assay；ＧＩＡ）：抗ＭＭ
Ｐ作用の分析評価 ・未発育な血管の発達試験（Embryonic Vascularisation Test；ＥＶＴ）：抗
血管形成作用の分析評価 ・ルイス型肺がん腫転移マウスモデル(Lewis Lung Carcinoma metastatic mou
se model；ＬＬＣ)：抗腫瘍作用の分析評価

【００１９】 （ＧＩＡ） ＧＩＡは、市販キット（ベーリンガー マンハイム（Boehringer Mannheim）
）を用いて試験がなされた。このＧＩＡは、ゼラチナーゼＡ酵素（ＭＭＰ−２）
の活動を抑制するＡＥ−９８６成分の、または軟骨部抽出物やそれらの画分にお
ける成分の能力測定のために使用されるものである。

【００２０】 簡潔に述べると、ＧＩＡは以下のように行われた。ビオチンと標識したゼラチ
ン基質が、液体軟骨部抽出物やその派生物がある場合とない場合において、ゼラ
チナーゼＡとともに用意された。続いて、反応混合物がストレプトアビジンコー
トされた微量滴定皿にのせられた。ビオチンと標識したゼラチンはその遊離した
ビオチン残留物の媒介で、ストレプトアビジンコートされた微量滴定に固定され
る。もしその基質、すなわちゼラチンが、ゼラチナーゼによって結合されていな
ければ、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）共役は、ゼラチナーゼ
−ビオチン複合体に結合する。その時ＰＯＤは添加されたＡＢＴＳ基質を、４０
５ｎｍの大きさの新しい最終生成物に転化する。しかしながら、もしビオチンと
標識したゼラチンがゼラチナーゼによって結合されると、ゼラチンの小片のみが
形成される。これらの小片は微量滴定皿に付着した後、ストレプトアビジン−Ｐ
ＯＤ共役を固定する力を有しなくなる。従って、色彩反応は起こらない。

【００２１】 以上より、ゼラチナーゼの活動が活発なときに低いシグナルを生じ、その反対
に（例えば、阻害剤の添加等により）ゼラチナーゼの活動が鈍いときに高いシグ
ナルがもたらされる。 軟骨部抽出物やそれらの画分における成分を求める活動は、ゼラチナーゼに対す
る抑制作用や、ゼラチナーゼとそのゼラチン基質との間の相互作用と競合する作
用となるであろう（例として、競合成分はゼラチンと結合する）。

【００２２】 （ＥＶＴ） 未発育な血管の発達試験（ＥＶＴ）は、新しい血管の形成を抑えるために（抗
アンギオジェニン作用）、サメの軟骨部液体抽出物やそれらの画分における成分
の効力を測定するために行われた。

【００２３】 ひなの胚の通常の発育は、卵黄（黄身）から発育中の胚へ養分を運ぶ、卵黄素
膜にある外部血管系の形成を伴う。卵黄素膜に設置されると、抗アンギオジェニ
ン基質は卵黄素膜に起こる血管の形成を抑制することができる。

【００２４】 サメの軟骨部液体抽出物や、それらの画分や、適切な対照からの成分を異なっ
た量含むメチルセルロースディスク（不活性の固体で透明な基質）が、血管形成
過程が生じる卵黄素膜の血管周辺の外部境界に設置された。積極的対照は、２−
メトキシエストラジオールを１．５ｍｇ／ｍｌ含むメチルセルロースディスクか
ら構成されている。対照とサンプル含有ディスクは、３日目の段階にある胚の卵
黄素膜に設置された。この時点では、主要な血管の始まり部分のみが卵黄に広が
っている。また、消極的対照やサメの軟骨部液体抽出物やそれらの画分からのあ
る量の成分を含むメチルセルロースディスクは、同じ胚の卵黄素膜に共に前々か
ら設置されている。その消極的対照に対し前述の成分の効果を比較する際、個々
の変動を最小にするために、その胚の頭部から尾部にかかる軸に関して、両方の
ディスクが対称形に設けられている。血管新生はディスクを置いた２４時間後に
評価され、結果は血管形成に影響を受けた胚のパーセントで表示した。血管形成
は、その生長径路に、消極的対照と比較してディスクを越える生長が見られなか
ったときや、少なかったり、それたりした場合において影響を受けたとみなされ
た。

【００２５】 （ＬＬＣモデル） ルイス型肺がん腫転移マウスモデル（ＬＬＣ）は、肺のなかで転移状態が形成
されるのを抑制するための、ＡＥ−９８６や、サメの軟骨部液体抽出物や、それ
らの画分の成分の効力を測定するために用いられた。

【００２６】 細胞の培養：ルイス型肺がん腫瘍クローンＭ２７は、肺への強い転移力があり
、ドクター ピー ブロット（ブロット ピー、キャンサー レス．，４６：２
４４２，１９８６（Brodt P, Cancer Res., 46:2442,1986））によって確認され
た。このモデルは広く認知されており、in vitroとin vivoでの活動において、
予測的な相互関連をもつことで知られている。細胞は、二酸化炭素が５％の条件
下で、１０％のウシ胎仔血清と１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補った
ＲＰＭＩ−１６４０の培地で培養され、一週間に二度移動された。細胞の基部が
生成され、初期段階の径路として蓄えられ、同じ径路を用いて全ての試験が実施
された。腫瘍の誘発のために、Ｍ２７細胞が完全な媒体上で７０％の集合で培養
され、その後０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％のトリプシン
、Ｃａ＋＋またはＭｇ＋＋が含まれていないＨＢＳＳにおける０．５３ｍＭのＥ
ＤＴＡ−４Ｎａ）を用いて集められた。次に、細胞は遠心分離機にかけられ、洗
浄された後、懸濁状態とされた（Ｃａ＋＋とＭｇ＋＋を含まないＰＢＳ２００μ
ｌにつき、ＬＬＣ細胞が１×１０^６個）。生育力は、トリプタンブルーで着色す
ることによって試験され、生育力が９５％を越えるフラスコのみが接種に利用さ
れた。

【００２７】 腫瘍の誘発：Ｃ５７ＢＬ／１０型雌マウス（１５〜２０ｇ）（チャールズ リ
ヴァー インク．（Charles River Inc.））が、ルイス型肺がん腫瘍を誘発する
ために用いられた。一週間の培養の後、ＬＬＣ細胞は、０日目に右横側のわきの
部分の皮下に移植された（１００μｌにつき５×１０^５生細胞）。全ての動物に
、同じ部位に接種を施した。腫瘍の成長は、カリパスを用いて毎日観測が行われ
た。腫瘍の相対的な体積は、以下の公式を用いて計算された。：長さ（ｃｍ）×
〔幅（ｃｍ）〕^２／２ ここで、長さは腫瘍の最も長い軸に相当し、幅は垂直と
なる最も短い軸に相当する。最初の腫瘍の大きさが０．５〜１．０ｃｍ^３に達し
たとき（接種後１０日）、近似的に同じ大きさの最初の腫瘍を生じているマウス
は、各１５匹ずつの特定の実験動物グループに任意に割り当てられ、耳に穴をあ
ける方法を用いて番号を付された。手術は、無菌状況下で行われた。皮膚を小さ
く切開した後（０．５〜１ｃｍ）、腫瘍は慎重に周囲の健康な組織から切り離さ
れた。ＬＬＣ細胞（発達の初期段階における）は非常に局在化した腫瘍を形成す
るので、正常な組織に著しい損傷を与えることなく分離を行うことは容易であっ
た。立体観察により、腫瘍の接種を行った部位に残っている腫瘍は肉眼で見当た
らないことが明らかであり、また我々の条件下では腫瘍の再発現は観測されなか
った。除去後、腫瘍の重さを測定し、傷口を外科用のステンレス鋼クリップで閉
じ、プロビドン(providone)−ヨウ素で消毒を行った。

【００２８】 有効性試験の実験計画：異なった試験サンプル（ＡＥ−９８６や、サメの軟骨
部液体抽出物またはそれらの画分の成分）での処理は、腫瘍を除去した次の日に
始まった（接種後１１日）。生理食塩水（saline）または軟骨部抽出物が、二週
間の間、毎日口からの食事で与えられた。口からの食事（０．５ｍｌ）は、２２
Ｇの曲がった針を用いて行われた。以前の実験から、肺の表面に平均して３０か
ら５０の根粒を得るのに、最初の腫瘍除去後およそ二週間の期間があれば十分で
あることが示されているので、動物達は二週間後に二酸化炭素室で処分された。
死体解剖の次に、両方の肺を取り出し、重量を計り、１０％のボウインの固定液
（Bouin’s fixative）で固定した。肺の表面の転移は、立体顕微鏡（４Ｘ）を
用いて数えられた。

【００２９】 体重の測定：体重は処分されるまで、１日または２日おき毎に観測された。

【００３０】 （軟骨部抽出物調製のための工程） （有機溶媒含有溶液を用いたサメの軟骨部からの有効成分の抽出） 本発明は、軟骨部抽出物調製のための方法と、それらの生物学的に有効な成分
を精製または分離し、得るための方法を提供するものであり、ここでは、正確に
言えば生物学的に有効な成分の部分は、タンパク質の性質ではない。しかしなが
ら、タンパク質含有成分の抽出に役立つカオトロピック試薬が、本発明の工程で
利用される。

【００３１】 ここで用いられている、「有機溶媒含有溶液」という言葉は、有機溶媒の一部
を少なくとも含んでいる混合物または溶液について言及している。有機溶媒含有
溶液は、一つまたはそれ以上の有機溶媒から構成され、水を含むことができる。
ここで用いられている有機溶媒の化合物や有機溶媒としては、有極性であるのが
好ましい。一例として、メタノールやエタノールのうちの少なくとも一つが、サ
メの軟骨部液体抽出物の調製に利用されている。アセトニトリル、プロパノール
、イソプロパノール、アセトンのような有機溶媒は、利用し得る有極性の溶媒と
して好適である。有機溶媒は、一つまたはそれより多くのハロゲン化した、エー
テル、プロトン性、非プロトン性、極性、無極性、塩基性、酸性、疎水性、親水
性の溶媒を含むことができる。

【００３２】 好適なハロゲン化溶媒としては、以下のものを含有する：クロロホルム、ジブ
ロモメタン、ブチルクロライド、ジクロロメタン。

【００３３】 好適なエーテル溶媒としては、以下のものを含有する：ジメトキシメタン、テ
トラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、
エチレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル
、トリエチレングリコールジメチルエーテル、ｔ−ブチルエチルエーテルまたは
ｔ−ブチルメチルエーテル。

【００３４】 好適なプロトン性溶媒としては、例としてかつ上限なく以下のものを含有する
：メタノール、エタノール、２−ニトロエタノール、２−フルオロエタノール、
２,２,２−トリフルオロエタノール、エチレングリコール、１−プロパノール、
２−プロパノール、２−メトキシエタノール、１−ブタノール、２−ブタノール
、ｉ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、２−エトキシエタノール、ジ
エチレングリコール、１−、２−、３−ペンタノール、ネオ−ペンチルアルコー
ル、ｔ−ペンチルアルコール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、シク
ロヘキサノール、アニソール、ベンジルアルコール、フェノールまたはグリセロ
ール。

【００３５】 好適な非プロトン性溶媒としては、例としてかつ上限なく以下のものを含有す
る：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１
,３−ジメチル−３,４,５,６−テトラヒドロ−２(１Ｈ)−ピリミジノン (ＤＭＰ
Ｕ)、１,３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、Ｎ−メチルピロリジ
ノン（ＮＭＰ）、ホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−メチルホルムア
ミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、プロピオニトリル、ギ酸エチル
、酢酸エチル、アセトン、エチルメチルケトン、酢酸エチル、スルホラン、Ｎ,
Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、テトラメチル尿素、ニトロメタン、ニトロベン
ゼンまたはヘキサメチルホスホルアミド。

【００３６】 好適な塩基性溶媒としては、以下のものを含有する：２−、３−、４−ピコリ
ン、ピロール、ピロリジン、モルホリン、ピリジンまたはピペリジン。

【００３７】 好適な酸性溶媒としては、以下のものを含有する：トリフルオロ酢酸、酢酸、
プロピオン酸またギ酸。

【００３８】 好適な炭化水素溶媒としては、以下のものを含有する：ベンゼン、シクロヘキ
サン、ペンタン、ヘキサン、トルエン、シクロヘプタン、メチルシクロヘキサン
、ヘプタン、エチルベンゼン、オクタン、インダン、ノナンまたはナフタレン。

【００３９】 有機溶媒含有溶液は、有機溶媒の混合物および／または有機溶媒と水の化合物
から構成される。好適な水とプロトン性溶媒の化合物は、例としてかつ上限なく
以下のものを含むことができる：水−メタノール、水−プロパノール、水−イソ
プロパノールまたは水−ブタノール。

【００４０】 好適な非プロトン性溶媒の水を有するまたは有しない化合物は、例としてかつ
上限なく以下のものを含むことができる：水−アセトニトリル、水−ジメチルス
ルホキシド、メタノール−アセトニトリル、メタノール−ジメチルスルホキシド
、エタノール−アセトニトリルまたはエタノール−ジメチルスルホキシド。

【００４１】 本発明における有機溶媒の量は、軟骨部から抽出される成分の物理的特性や性
質によって変えることが可能である。一般的に、有機溶媒含有溶液は、全溶液の
体積に関する有機溶媒の体積の割合が、約１〜１００％ｖ／ｖ、約４０〜８０％
ｖ／ｖ、少なくとも１％ｖ／ｖ、少なくとも１０％ｖ／ｖ、少なくとも２５％ｖ
／ｖ、少なくとも５０％ｖ／ｖ、少なくとも９０％ｖ／ｖまたは少なくとも９９
％ｖ／ｖであるものを含む。

【００４２】 従って、本発明は以下の工程から構成される、サメの軟骨部からの抽出物調製
方法を提供するものである。 ａ）サメの軟骨部材料を、サメの軟骨部の可溶成分から成る第１の混合物を形成
するために、相当量の有機溶媒含有溶液で処理する。 ｂ）その第１の混合物を分離して、前述の可溶成分を含む第１の液体抽出物と、
第１の固形物を形成する。 ｃ）上記の第１の液体抽出物から有機溶媒を取り除く。

【００４３】 さらに、この方法は以下の工程を含むことができる。 ｄ）前記第１の液体抽出物から十分な量の液体を取り除き、実質上乾いた第２の
固形物を形成する。 ｅ）先の第２の固形物に水を加えて、第２の混合物を形成する。 ｆ）前記の第２の混合物を分離して、最終液体抽出物と第３の固形物を形成する
。

【００４４】 サメの軟骨部材料を含む第１の固形物は、有機溶媒含有溶液や、またはその代
りとなる水を用いて、少なくとも残りの量のサメの軟骨部の可溶な成分を含んで
いる、第２、第３、またはさらに最終の液体抽出物を形成するために、上記ａ）
からｃ）の工程に従い、追加して１回またはそれより多くの回数抽出することが
できる。

【００４５】 工程ｂ）における固体と液体の分離は、例としてかつ上限なく、遠心分離法、
ろ過法、ダイアフィルトレーション、限外ろ過、精密ろ過、固体の沈殿と上清の
除去等の方法を含む技術において知られた多くの方法の、いずれかに従って行な
うことができる。

【００４６】 工程ｃ）に記されているように有機溶媒の除去は、例としてかつ上限なく、蒸
発、凍結乾燥、蒸留、脱水、有機溶媒吸収剤の添加、液体／液体抽出、回転蒸発
（rotovapping）等の方法を含む技術において知られた多くの方法のうちのいず
れかに従って行なうことができる。

【００４７】 ここで用いられているサメの材料は、固体であったり、例えば、粉状、小粒状
、棒状、粒子状でありうる。工程ａ）の際、もしくはその前に、サメの材料を均
質化することができる。ここで使用されている「均質にする（homogenize）」、
「均質化している（homogenizing）」、「均質化（homogenization）」という言
葉は、以下のａ）、ｂ）のどちらかによって、軟骨部材料から必要な成分を抽出
する効率を上げる工程を指している。ａ）軟骨部材料の全ての、または特定の表
面積を増加する。ｂ）軟骨部材料から入用な成分の放出を促進する。均質化は、
一つまたはそれ以上の化学的方法や物理的方法、およびそれらの組み合わせによ
って行なうことができる。

【００４８】 軟骨部材料を均質化するための化学的手段には、軟骨部材料をふくらませ、軟
骨部材料における細胞外の基質や細胞を溶解させたり、分裂させたりする、およ
び／または、軟骨部材料の多孔性を増加させる、一つまたはそれ以上の化学薬品
が含まれる。具体例としてのそのような化学薬品は上限なく、洗浄剤、界面活性
剤、イオン剤、非イオン剤、還元剤、キレート化剤、グリコシル化剤、カオトロ
ピック試薬、尿素、グアニジン、燐脂質、糖脂質、ジチオトレイトール、β−メ
ルカプトエタノール、ラウリル硫酸ナトリウム、トリトン溶液や、それらの技術
分野において知られた、またはジュディス ニューゲバウアー（Ｊｕｄｉｔｈ
Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ）著による「生物学および生物化学における洗浄剤の利用
と特性の案内（A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biolog
y and Biochemistry）（カルバイオケム−ノヴァバイオケム コーポレーション
、１９８８（Calbiochem-Novabiochem Corporation, 1988）」によって公表され
ている他の薬剤等を含むものとする。なお、その明細はここで参考に含まれてい
る。

【００４９】 軟骨部材料を均質化するための物理的手段は、概してサメの原料の平均粒径を
減少させ、それによりその表面積を増加させるものとなる。粒径の大きさを減少
させることは、以下にあげる、粉砕する、微粉化する、製粉機にかける、すりつ
ぶす、切り刻む、高速で混ぜ合わせることや、それらの技術分野において知られ
た他の方法等を含めた例示的な方法の、いずれか一つまたはそれ以上によって行
われる。

【００５０】 抽出溶液は、軟骨からの成分の抽出を強化させる抽出強化剤を含有させること
が可能である。これらの抽出強化剤は、有機酸および無機酸、有機塩基および無
機塩基、高分子、緩衝剤、塩、およびそれらの技術分野において知られた他の同
様な薬剤を含むことができる。

【００５１】 ある実施態様に従えば、軟骨からの低分子量物質の抽出は、以下によって行わ
れる。 ａ）均質化されたサメの軟骨部材料（１ｋｇ）をメタノール（１ｋｇ）で処理し
、サメの軟骨部の可溶な成分から構成される第１の混合物を形成する。 ｂ）先の第１の混合物を遠心分離にかけ、第１の固形物と先の可溶な成分から構
成される、第１の液体抽出物を形成する。 ｃ）上記の第１の液体抽出物から、メタノールを蒸発させる。 ｄ）さらに上記の第１の液体抽出物から、十分な量の液体を蒸発させ、実質的に
乾いた第２の固形物を形成する。 ｅ）前記の第２の固形物に水（１ｋｇ）を加え、第２の混合物を形成する。 ｆ）上記の第２の混合物を遠心分離にかけ、最終の液体抽出物と第３の固形物を
形成する。

【００５２】 上述の工程ｃ）とｄ）は、第１の液体抽出物から第２の固形物へ、直接進むた
めに任意に組み合わせることが可能である。

【００５３】 上記の工程により、サメの軟骨からの抽出物や繰り返し抽出されたものから生
じた全ての液体抽出物は、可溶成分の回収の指標として、それらの乾重量とプロ
テイン濃度（スタンダードブラッドフォードプロテイン分析（standard Bradfor
d protein assay）により測定）が分析された。抗ＭＭＰ作用もまた評価された
。ＧＩＡは、２０Ｘ濃縮のサンプル４０μｌを用いて行われた。その結果は、表
１に示す。

【００５４】

【表１】

【００５５】 表１で使われている、「ＣＴＲＬ（対照試料（control sample））」は、抽出
溶媒として精製水を用いたときに得られる最終液体抽出物を示している。「ＳＵ
−ＭＥＴ」は、有機溶媒含有溶液としてメタノールを用いて得られた最終液体抽
出物を示している。「ＳＵ−ＥＴＨ」は、有機溶媒含有溶液としてエタノールを
用いて得られた最終液体抽出物を示している。「Ｓ１」、「Ｓ２」および「Ｓ３
」という印は、精製水または有機溶媒含有溶液として表示された溶媒を用いて、
それぞれ第１の最終液体抽出物、第２の最終液体抽出物、第３の最終液体抽出物
を表わしている。

【００５６】 その結果、水性および非水性の有機溶媒含有溶液の両方が、サメの軟骨から抗
ＭＭＰ作用を少なくとも示す生物学的に有効な成分を回収することに役立つこと
が証明された。さらに、サメの軟骨の固体粒子の連続した再抽出により、残りの
作用を抽出できる。乾重量分析とプロテイン回収によって測定された、抗ＭＭＰ
作用と分離した物質の量の間には、明らかな直接的相関はみられない。

【００５７】 （液体抽出物の生成における軟骨部と精製水との比の影響） 本発明の方法の第一の実施態様に従って、軟骨部（Ｃ）と精製水（Ｅ）がそれ
ぞれ約１ｋｇと１ｌの割合となるように、未加工の液体抽出物が水の混合物とし
て用意された。成分を回収する方法は、以下の工程を含む。 ａ）均一にするために、軟骨が約５００μ以下の平均粒径となる固体粒子へ小さ
くなるまで、水性溶液でサメの軟骨を均質化する。 ｂ）生物学的に有効な成分を抽出するために、先の均質化したものを先の水性溶
液に平衡させ、前記の生物学的に有効な成分を含有する第１の液体抽出物（ＬＥ
）と第１の固形物を含む第１の混合物を形成する。 ｃ）上記の第１の固形物と、上記の第１の液体抽出物を分離する。 ｄ）先の第１の液体抽出物に分離工程を施し、分子量が約５００ｋＤａ以下（Ｌ
Ｅ−０−５００）の軟骨の分子を含む第２の液体抽出物を形成する。 ｅ）前記の第２の液体抽出物を、０．２２ミクロンのわずかな間隙をもつ精密ろ
過フィルター膜にかけ、最終液体抽出物（Ｐ−Ｃ１−Ｅ１；０〜５００画分に相
当）を形成する。

【００５８】 本方法はまた、以下に示す種々の軟骨と水の比を用いて行われた。

【００５９】 上記の方法に従って調製された全ての第１の液体抽出物は、それらの乾重量、
プロテイン濃度、抗ＭＭＰ作用に対して分析が行われた。その結果を表２に示す
。

【００６０】

【表２】

【００６１】 この結果は、サメの軟骨材料1キログラムにつき、約２０ｇの可溶成分が回収
できることを示している。特定の条件下での可溶成分の回収は最大で、サメの軟
骨がそれぞれ1ｋｇにつき（Ｐ−Ｃ１−Ｅ２とＰ−Ｃ１−Ｅ３）、可溶成分が１
９．８（９．９×２）ｇおよび１８．９（６．３×３）ｇであった。

【００６２】 これらの結果はまた、乾重量、プロテイン濃度と同様に、抗ＭＭＰ作用を有す
る成分を、異なった軟骨と精製水の比を用いて効率的に回収し得ることを示して
いる。

【００６３】 Ｐ−Ｃ１−Ｅ１抽出物から回収された第１の固形物は、同じ軟骨と精製水の比
を用いて、そこに含まれている残りの成分を回収するために、さらに２回再抽出
された。繰り返し行われた第１固形物の抽出方法は、以下の工程から構成される
。 ｆ）工程ｃ）で回収された前記の第１の固形物を精製水で処理し、第２の液体抽
出物（Ｐ−Ｃ１−Ｅ１−２）と第２の固形物を形成するために分離される第２の
混合物を形成する。ここで、先の第２の液体抽出物は、工程 ｄ）とｅ）に従っ
て処理することができる。さらに、任意で ｇ）上記の第２の固形物に工程 ｆ）を繰り返し行ない、第３の液体抽出物（Ｐ
−Ｃ１−Ｅ１−３）と第３の固形物を形成する。ここで、先の第３の液体抽出物
は、工程 ｄ）とｅ）に従って処理することができる。

【００６４】 表３は、上記の工程ａ）からｇ）にわたって用いられた、サメの軟骨と水の量
を手短に記載したものである。

【００６５】

【表３】

【００６６】 上記の工程から生じる全ての液体抽出物は、乾重量、プロテイン濃度、抗ＭＭ
Ｐ作用に対して分析を行なった。その結果を表４に示す。

【００６７】

【表４】

【００６８】 これらの結果は、上記のａ）からｃ）にわたる工程に従うサメの軟骨の１回ま
たはそれより多くの抽出は、サメの軟骨の可溶成分の回収を増加させることがで
きることを示す。さらに、抗ＭＭＰ作用を有する残りの成分を、同じ固体粒子の
２回目や３回目の抽出の後まだ抽出することができる。

【００６９】 本技術分野において明らかなように、例えば、温度、抽出回数、抽出溶媒のよ
うな抽出パラメーターの変更を、生物学的に有効な成分や、プロテイン、固体の
回収量を最も効果的にするように設定することができる。

【００７０】 （軟骨から得られた成分のさまざまな分子量画分を調製するための工程） ０〜５００画分：０〜５００画分は、約５００ｋＤａより小さい分子量をもつ
成分から成るサメの軟骨の液体抽出物である。０〜５００画分に対する予備的方
法は、国際公開公報 ＷＯ ９５／３２７２２、ＷＯ ９６／２３５１２、ＷＯ ９７／１６１９７において発表されている。また、ここでそれに関係のある開示
は、参考にふくまれている。これらの先行技術の方法は、以下の工程を含むもの
である。 ａ）軟骨が約５００μｍ以下の大きさの固体粒子へ小さくなるまで、軟骨にある
生物学的に有効な成分の完全な状態の維持と適合した状況に、水性溶液でサメの
軟骨を均質化する。 ｂ）先の生物学的有効成分を、前記水性溶液に抽出し、上記の生物学的有効成分
を含む未加工の液体抽出物（ＬＥ）と固体粒子の混合物を生成する。 ｃ）前記の固体粒子から前記の液体抽出物を分離する。 ｄ）さらに、約５００ｋＤａより小さい分子量をもつ分子（ＬＥ−０−５００）
を含む最終の液体抽出物を得るために、未加工の液体抽出物を分離する。 ｅ）ＬＥ−０−５００を精密ろ過フィルター膜（０．２２ミクロン）にかけ、さ
らに凍結させ、最終の液体抽出物（０〜５００画分）を得る。

【００７１】 ０〜１および１〜５００画分：０〜１画分は、約１ｋＤａ以下の分子量をもつ
成分から成るサメの軟骨の液体抽出物である。１〜５００画分は、約１〜５００
ｋＤａの間にある分子量をもつ成分から成るサメの軟骨の液体抽出物である。サ
メの軟骨抽出物の０〜１および１〜５００画分は、約１ｋＤａのわずかな分子量
を除外する膜を用いる限外ろ過装置で調製された。この装置を用いて、二つの軟
骨の画分は、精製の１サイクル後に得られた（精製の１サイクルは、透過物の５
０％が回収されたとき、精製段階の捕捉物によって決定される）。１〜５００画
分は残留物（Ｒ）を含み、精製に用いられた軟骨抽出物の元の体積に等しい最終
の体積に精製水で溶くと、精製に用いられた元の抽出物に関して、０．５Ｘの濃
度で約１ｋＤａより小さい分子量をもつ成分と、１Ｘの濃度で約１〜５００ｋＤ
ａの分子量をもつ成分を構成する。０〜１画分は透過物（Ｐ）を含み、１Ｘの濃
度で約１ｋＤａ以下の分子量をもつ成分のみから構成される。限外ろ過装置を用
いて、１〜５００画分は表５に例証されるように、さらに精製サイクルを加えて
さらに精製される。

【００７２】

【表５】

【００７３】 ０〜１および１〜５００画分の複数のバッチが、上記の方法により調製された
。結合の形成を抑えるためや、安定した可溶な形態の維持と溶解性を改良するた
めに、体積重量１％のサッカロース水溶液が抽出物の安定剤として用いられた。

【００７４】 ０〜１および１〜５００画分は、上述の先の技法に従うＬＥ−０−５００画分
のバッチの最初の調製と、次に以下に述べる新奇な工程をつけ加えることにより
得られた。 ｅ）任意で、ＬＥ−０−５００抽出物を、体積重量で約１％の最終濃度にサッカ
ロース含有溶液で調製し、１％のサッカロースを伴うＬＥ−０−５００画分を形
成する。 ｆ）約１ｋＤａ以下の分子量をもつ軟骨分子から成る液体抽出物を形成するため
に（各Ｐｎ−０−１と１％のサッカロースを伴うＰｎ−０−１画分。ここで、「
ｎ」は表５における精製サイクルを表している。）、ＬＥ−０−５００または１
％のサッカロースを伴うＬＥ−０−５００を、約１ｋＤａのわずかな分子量を除
外する膜でフィルター処理にかけ、約１ｋＤａより重い分子量をもつ軟骨分子か
ら成る残留液体抽出物を形成する。（各Ｒｎ−０−１と１％のサッカロースを伴
うＲｎ−０−１画分。ここで、「ｎ」は表５における精製サイクルを表している
。） ｇ）残留および透過液体抽出物を、約０．２２ミクロンの間隙をもつ精密ろ過フ
ィルター膜に通してろ過処理を行う。

【００７５】 上記の手順は、サッカロースを含まない抽出物を調製するために、工程ｅ）を
省いて実行することができる。残留液体抽出物は、約１ｋＤａ以下の分子量をも
つ軟骨成分から成る追加のろ過液液体抽出物を形成するために（Ｐ１−０−１か
らＰ６−０−１）、１回またはそれより多く、好ましくは４回またはそれより多
くの精製サイクルで限外ろ過にかけることができ、１から約５００ｋＤａの間に
ある分子量をもつ軟骨成分から成る残留抽出物を形成する（Ｒ６−１−５００と
１％のサッカロースを伴うＲ６−１−５００）。その液体抽出物は、保管のため
に任意で凍結することもできる。

【００７６】 従って、ここで述べた工程は、以下にあげる液体抽出物を調製するために用い
られた； １）ＬＥ０−５００から調製される０〜５００画分 ２）１％のサッカロースを伴ったＬＥ−０−５００から調製される１％のサッカ
ロースを伴った０〜５００画分 ３）Ｐ１−０−１から調製される０〜１画分 ４）１％のサッカロースを伴ったＰ１−０−１から調製される１％のサッカロー
スを伴った０〜１画分 ５）Ｒ６−１−５００から調製される１〜５００画分 ６）１％のサッカロースを伴ったＲ６−１−５００から調製される１％のサッカ
ロースを伴った１〜５００画分

【００７７】 第１の固形物を水で処理する際に形成された第２の混合物の分離により得られ
た第２の固形物は、サメの軟骨の可溶な画分のさらなる量を回収するために、水
で繰り返し抽出することができる。

【００７８】 上記の手順に従って調製された全ての液体抽出物は、それらの乾重量とプロテ
イン含有量について分析された。さらに、抗ＭＭＰ作用と同様にそれぞれの画分
の抗アンギオジェニン作用と抗腫瘍作用もまた測定された。その結果を表６に示
す。

【００７９】

【表６】

【００８０】 その分析結果から、０〜１画分とそれに１％のサッカロースを伴うものは両方
とも、回収された乾重量の９０％超を含んでいる一方、含まれるプロテインは、
ほとんど検出できない程に非常に少ない量であることが示される。

【００８１】 しかしながら、抗ＭＭＰ作用が０〜１画分と１〜５００画分の両方で観測され
たことは、以下にあげることを示唆する。１）少なくともプロテインではない成
分が一つは、この作用に係わっている。２）一つ以上の成分が、抗ＭＭＰ作用を
有している。さらに、有効成分は、プロテインやペプチドの性質である可能性と
そうではない可能性がある。

【００８２】 さらに、抗アンギオジェニン作用が、ＥＶＴに従って測定されたように、０〜
１画分においてもっぱら観測された。サッカロースの存在は、１％のサッカロー
スを伴った１〜５００画分において、抗アンギオジェニン作用の回収にわずかに
関与していることに気づいた。

【００８３】 Ｍ２７腫瘍細胞（ＬＬＣ）を接種された動物の治療においては、肺の表面にお
ける肉眼で見ることができる転移状態の根粒の数を著しく減少させた。０〜１画
分と０〜５００画分は両方とも、転移状態の根粒の数の著しい減少を引き起こし
た（約３０％）。しかしながら、１〜５００画分は、０〜１画分または０〜５０
０画分のどちらよりも有効性が低かった。このことは、０〜１画分における有効
成分が、抗腫瘍作用に少なくとも部分的に関与していることを示唆している。こ
れらの結果はまた、１〜５００画分における他の抗腫瘍成分の存在も示唆してい
る。追加で動物のいくつかのグループに、体積重量１％のサッカロースを含有す
る同じ分子量の画分を用いて適用した。本発明者らは、グループ間に著しい違い
を見出さなかったが、しかしながら、高分子量の画分には、サッカロースの存在
でより活性化する傾向がある（上記の表）。本発明者らが、動物達の体重量の減
少を観測しなかったということは、ＬＬＣモデルにおいて軟骨抽出物の毒性がな
いことを示唆している。

【００８４】 （抗ＭＭＰ成分の分離と特徴） （クロマトグラフィー分離と精製） 有効な生物学的作用を有している複数の成分が、０〜５００画分に、特に０〜
１画分に存在することが見出された。次の段階では、それらから有効成分の分離
を行なった。

【００８５】 四つの異なる手順が、０〜５００画分から抗ＭＭＰ作用を含有する成分を分離
、精製するために進められた。

【００８６】 手順１： ステップ１：上で述べた手順により得られた０〜５００画分は、凍結乾燥され
、精製水で元に戻された（元の体積に対し２０Ｘの濃度）。元に戻されたものを
、生物学的有効成分の溶解を最大にするため、１５分間、超音波処理を行なった
。４℃で１０分間、２２００ｇの遠心分離にかける等の分離の後、上清はさらな
る精製のために保管された。

【００８７】 ステップ２：固定相抽出カラム（ＳＰＥ−Ｃ18 ニュートラル（neutral））を
用いて、吸着クロマトグラフィーによる分析が行われた。

【００８８】 ５００ｍｇのＣ１８吸着剤（スペルコ No.5-7012、寸法 3 cc（Supelco No.5-
7012, dimension 3 cc））をめたＳＰＥカラムが、２ｍｌのメタノール（１００
％）で2回と、２ｍｌの精製水で3回調整された。元に戻された２０Ｘの軟骨抽出
物１ｍｌが、そのカラムへ入れられた。吸着ビーズは、１．５ｍｌの精製水で洗
浄され、抗ＭＭＰ作用を有する成分は、第１の溶出液を形成するために、合せて
用いられる二つの精製水２．５ｍｌ部分に溶出された。

【００８９】 最初の抗ＭＭＰ作用の約５０％が、第１の溶出液で回収された。残りの５０％
がカラムを通過し、洗浄の段階で失われた。それゆえ中性の状態が、抗ＭＭＰ作
用を有する成分の保有を少なくするとみられる。このクロマトグラフィー媒体を
用いるが、成分の保有が少ないことは、イオン化した、またはイオン成分の徴候
である。

【００９０】 ステップ３：元に戻した２０Ｘの軟骨抽出物のさまざまなサンプルで、上記の
方法を複数回にわたり繰り返した後、第１の溶出液は各々溜められ、スピード
バック（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ）遠心分離機を用いて蒸発させた。そこから得られ
た固体は、用いられた０〜５００画分の元の体積に対し、２００倍の濃度に精製
水で溶かれた。さらに、超音波処理と遠心分離処理を行なった後、その上清は次
の段階の精製のために保管された。

【００９１】 ステップ４：その上清にある生物学的有効成分の、低溶解度半調整ＨＰＬＣ分
離（A low resolution semi-preparative HPLC separation）が、中性の状態で
行われた。ノヴァパック（Ｎｏｖａｐａｃｋ） Ｃ１８ＨＲ（７．６×３００ｍ
ｍ；Waters）カラムが使用された。用いられた移動相（mobile phase）は、リン
酸ナトリウム（0.01M,pH7）／メタノール（９２：８）であった。温度と流量は
、３０℃で２ｍｌ／分にそれぞれ維持された。上記の２００Ｘで戻された画分（
１００μｌ）が、そのカラムに注入され、２ｍｌの画分が、イソクラティック溶
出とＵＶ検出（２０５ｎｍ）を用いて集められた。作業時間は、３０分であった
。抗ＭＭＰ作用を有する成分が、１１〜１３分の間の保持時間をもつそれらに対
応する溶出液画分において見つかった。

【００９２】 ステップ５：ステップ４が、２００Ｘに戻された画分の様々な１００μｌ部分
標本で繰り返し行われ、対応する必要な溶出液画分が、溜められ、蒸発され、用
いられた０〜５００画分の元の体積に対して５００Ｘの濃度に精製水で溶かれ、
超音波処理と遠心分離処理が行なわれた。その上清は次の段階の精製のために保
管された。

【００９３】 ステップ６：中間状態において高溶解度半調整ＨＰＬＣ（A higher resolutio
n semi-preparative HPLC）が、ステップ５から得られた上清に行われた。この
高溶解度半調整ＨＰＬＣに用いられる手順は、上記のステップ４の場合と、エス
テル緩衝液（0.01M,pH7）／メタノール（９７：３）が移動相として使用される
ことをことを除いて、似ている。抗ＭＭＰ作用を有する成分が、２３から２７分
の間の保持時間をもつそれらに対応する溶出液画分において見つかった。

【００９４】 ステップ７：ステップ６を繰り返した後、有効成分を含む対応する溶出液画分
を溜め、溶媒を蒸発させ、十分に固体の残留物を形成する。その残留物は、用い
られた０〜５００画分の元の体積に対して、５００〜２０００Ｘの濃度に水で溶
かれ、超音波処理と遠心分離処理が行なわれ、さらなる分子量分析と抗ＭＭＰ作
用の測定のために保管された。生物学的有効成分は、「ＡＥ−９８６」と称され
た。

【００９５】 手順２： 一般に、ｐＨ３において、Ｃ１８相クロマトグラフィー媒体におけるＡＥ−９
８６のより良い保有が観測される、ということが測定された。それゆえ、ＳＰＥ
手順（上記ステップ２）と半調整クロマトグラフィー系（上記ステップ４と６）
が変更された。以下にあげる条件は、ＳＰＥ手順において、より強い洗浄溶液の
使用を可能にし、より精製された最終抽出物を生成し、半調製精製段階のうちの
一つを省略できる（手順１のステップ４）。例えば、手順１のステップ１〜３が
繰り返され、ステップ４は以下のものによって置き換えられた。

【００９６】 ステップ４：上記のステップ２におけるものと同じＳＰＥ Ｃ−１８カラムが
使用されたが、クロマトグラフィー媒体は、２ｍｌのアンモニウムギ酸エステル
（0.01M, pH3）で３回調整された。ステップ３から得られた２００Ｘに戻された
抽出物１ｍｌが、そのカラムに入れられた（サンプルを入れる前に、ギ酸でｐＨ
３に調整）。吸着剤ビーズは、２ｍｌのアンモニウムギ酸エステル／メタノール
（ｐＨ３において９０：１０）で３回洗浄された。ＡＥ−９８６の溶出は、１ｍ
ｌのメタノール（１００％）で行われた。カラムのメタノール溶出から得られた
画分は、水を含有することが、当技術分野において明らかなようである。従って
、本段階における溶出溶媒は、他の有機溶媒、好ましくは、イオン化した、およ
び／または、水混和性の有機溶媒であることが可能であり、溶出溶媒は水を含有
することが可能である。

【００９７】 ステップ５：手順１のステップ５が、精製水で戻された抗ＭＭＰ画分の濃度が
４０００Ｘであることを除いて、繰り返された。

【００９８】 ステップ６：このステップは、移動相がアンモニウムギ酸エステル／メタノー
ル（ｐＨ３において７５：２５）であることを除いて、手順１のステップ６と同
一である。

【００９９】 ステップ７：ステップ７は、前述のステップ６におけるように、同じ４０００
Ｘの濃度が維持されたことを除いて、手順１のステップ７と同じものである。

【０１００】 手順３：この手順は、ステップ６におけるギ酸エステル緩衝液のｐＨが、酸性
（ｐＨ３）から中性（およそｐＨ７）の状態へ変わったことを除いて、手順２と
実質上同じものである。

【０１０１】 手順４： この精製手順においては、はじめから酸性移動相が用いられた。

【０１０２】 ステップ１：素となる０〜５００画分（濃度１Ｘ）がギ酸でｐＨ３に調整され
、その後１０分間、２２００ｇで遠心分離処理がなされた。その上清はステップ
２において使用された。

【０１０３】 ステップ２：その上清は、酸性の状態に調整されたＳＰＥ Ｃ−１８カートリ
ッジ（スペルコ ＃5.-7136：寸法６０cc（Supelco #5.-7136：dimension 60cc
）固体支持相１０ｇと詰められたもの）に入れられた。そのカラムは、メタノー
ル１２０ｍｌ（１００％）とギ酸１２０ｍｌ（0.01M、pH3）で調整された。１Ｘ
の酸性化した軟骨抽出物５００ｍｌがそのカラムへ入れられ、１００ｍｌのギ酸
（0.01M(pH3)／メタノール ９０：１０）６個に溶出された。生物学的に有効な
成分は、溶出液画分３、４および５において得られた。

【０１０４】 ステップ３：ステップ２の溶出液画分３、４および５は溜められ、その溶媒が
ほとんど乾くまで蒸発された。その後、その画分はＡＥ−９８６含有溶液を形成
するために、元の４０００Ｘの濃度まで希釈された。

【０１０５】 ステップ４：ＡＥ−９８６は、ｐＨ３のギ酸緩衝液で調整ＨＰＬＣカラムにお
いて精製された。そのカラム（プロディジィ OSD−プレップ（Prodigy OSD-pre
p）,10u,250×50mm, フェノミネックス（Phenomenex））は調整され、室温で作
業が行われた。その移動相の組成は、ギ酸（0.01M, pH3）／メタノール（７０：
３０）であり、流量は４５ｍｌ／分であった。４０００Ｘの濃度で４ｍｌのＳＰ
Ｅ Ｃ−１８画分が注入され、そのカラムからＵＶ検出（２０５ｎｍ）を用いて
イソクラティックモードで溶出された。画分は６０分間、１分間隔で集められた
。ＡＥ−９８６の抗ＭＭＰ作用は、３３〜３６分の間で抽出された。

【０１０６】 ステップ５：抗ＭＭＰ作用を示す画分は溜められ、１００００Ｘの濃度の画分
を得るために蒸発させられた。

【０１０７】 ステップ６：このステップは、移動相がギ酸（0.01M, pH3）／メタノール（７
５：２５）であることを除いて、手順２のステップ６と同一である。１００００
Ｘの濃度の画分の５００μｌ部分標本が、そのカラムに入れられた。抗ＭＭＰ作
用を含む成分が、２１〜２３分の間に溶出された。

【０１０８】 ステップ７：ステップ７は、手順１のステップ７と同じものである。前述のス
テップ６におけるものと同じ４０００Ｘの濃度が保たれた。

【０１０９】 手順１に従い調製された半精製画分：本発明者らは、ＨＰＬＣ精製画分（上述
のステップ１から生成された画分）が、抗ＭＭＰ作用を有する成分をもつことを
初めて示した。このように精製された成分はまた、上述したin vivoＬＬＣモデ
ルにおいて明らかにされたように、抗腫瘍作用を示す。抗腫瘍作用は、ＨＰＬＣ
精製画分の３つの異なる濃度で、動物を治療することによって測定された。２．
５Ｘの濃度の服用量に対し、約５０％の最大有効性（ｐ＜０．００５）を伴うベ
ル型服用量反応曲線（A bell-shape dose response curve）が、観測された（濃
度は、軟骨抽出物の元の体積に関して、精製段階における１００％の回収にもと
づいている）。

【０１１０】 血管形成とマトリックス金属プロテアーゼ作用は、腫瘍の増殖と転移状態の進
行に密接に関連しているので、抗ＭＭＰ成分を表しているＨＰＬＣ精製画分は、
抗腫瘍作用に関与しているとみられる。それゆえ、これらの作用を有する成分は
、ガンの治療に役立つ作用物質となり得る（トルネイ，Ｅ．他、ジェイ キャン
サー レス クリン．オンコル．123:652-658,1997（Tolnay, E. et al., J. Ca
ncer Res Clin. Oncol. 123:652-658,1997）；スコウブ，Ｍ．他、ネイチャー
メディスン 3:1222-1227,1997（Skobe,M.,et al. Nature Medicine, 3:1222-122
7,1997）。

【０１１１】 手順４に従い調製された半精製画分：本部分における画分は、ステップ２）と
３）が以下のように行われたことを除き、上記手順４に従い調製された。

【０１１２】 ステップ２：上清は、酸性の状態に調整されたＳＰＥ Ｃ−１８カートリッジ
（スペルコ ＃5.-7012：寸法３cc（Supelco#5.-7012：dimension 3cc）固体支
持相５００ｍｇと詰められたもの）に入れられた。そのカラムは、４ｍｌのメタ
ノール（１００％）と６ｍｌのギ酸（0.01M、pH3）で調整された。１Ｘの酸性化
された軟骨抽出物１０ｍｌがそのカラムに入れられ、１．０ｍＬ体積のギ酸で３
回洗浄され（0.01M(pH3)／メタノール ９０：１０）、そこから生物学的有効成
分を、メタノール１．０ｍＬで溶出した。

【０１１３】 ステップ３：生物学的有効成分を含有するステップ２の溶出液画分は、乾くま
で蒸発された。その後、その画分は、ＡＥ−９８６含有溶液を形成するために、
もとの２０Ｘまたは４０Ｘの濃度にまで希釈された。

【０１１４】 この手順から生成される全ての液体抽出物は、抗ＭＭＰ作用に対して分析され
る。その結果を表７に示す。

【０１１５】

【表７】

【０１１６】 従って、本発明の方法は、抗ＭＭＰ作用を有する、特定のサメの軟骨画分の調
製品を提供する。さらに、水性のものと有機溶媒含有溶液の両方が、少なくとも
抗ＭＭＰ作用を有する軟骨抽出物を調製するために使用できる。０〜５００画分
と１〜５００画分の両方が抗ＭＭＰ作用をもつが、手順により精製された抗ＭＭ
Ｐ成分は、おもに０〜１ｋＤａ部分に含まれる。同様な結果は、体積重量１％の
サッカロースを含有する等価の画分において観測された。最後に、抗ＭＭＰ作用
を、異なった精製水と軟骨の比を用いて、効率的に回収することができる。

【０１１７】 （ＬＣ／ＭＳによる抗ＭＭＰ成分の分子量の測定） ５多次元クロマトグラフィー系（Five multi-dimensional chromatographic s
ystems）が、液体クロマトグラフィー／質量分析法（liquid chromatography／m
ass spectrometry；ＬＣ／ＭＳ）により、サメの軟骨の画分の分子量の測定を行
うために展開された。５つの系はそれぞれ、以下の表８〜１２に示されている。

【０１１８】 その実験は、作業後の抗ＭＭＰ作用測定のために用いられるＬＣからの画分収
集と同様に、スプリット（７：１）クロマトグラフィーカラム溶出液のＭＳ操作
を必要とする。ＭＳと抗ＭＭＰ生物学的作用の関連は、使用されたクロマトグラ
フィー系のそれぞれに対し、関心がある化合物の保持時間と同様に、溶出液画分
を識別することに特に役立つ。

【０１１９】 ＭＳ陰イオン検出のために、アンモニウム水酸化物の溶液（０．１５ｍｌ／分
において、体積換算で０．７５％（ｖ／ｖ））が、ＭＳイオンソースへ導入され
る前に、カラムの溶出液に添加された。生成された混合物のｐＨは、８〜１０の
間であった。それは、ＭＳ陰イオンの形成と検出を改良する。

【０１２０】

【表８】

【０１２１】

【表９】

【０１２２】

【表１０】

【０１２３】

【表１１】

【０１２４】

【表１２】

【０１２５】 多次元クロマトグラフィー実験が、５００〜１０００Ｘの精製されたリン酸塩
の最終の画分（精製手順１のステップ７から得られた）１００μｌを注入するこ
とによって行われた。１）．この濃度では、ＡＥ−９８６の強い、明瞭な徴候は
、ＭＳ走査モードでは検出されなかった（全イオン）。関心がある領域（効力が
ある画分）における、全ての個々のイオン信号（１００〜１０００ａｍｕ）の作
業後の観測により、興味あるピークが検出された。

【０１２６】 ２０００Ｘまでの濃度で精製された画分の注入は、ＡＥ−９８６に対応する基
となるクロマトグラムのピークにおいてと同様に、全イオンのクロマトグラムに
おいて、小さなピークを示した。

【０１２７】 陽イオン検出モードにおいて（表１３）、２２７と２４５Ｍ＋１イオンのみが
、関心がある領域（ＡＥ−９８６）ではっきりと検出された。ＬＣＱ ＭＳにお
ける操作と設計により、アルコール官能基を含有する分析物に対し、分子イオン
（Ｍ＋１）と同様に水分子の欠損に相当するイオンの観測が常時行われた。水（
Ｈ_２Ｏ）の分子量の欠損に相当する１８ａｍｕの差と同様に、２２７と２４５Ｍ
＋１イオンの共通のプロファイルは、陽イオンのモードでＭ＋１種に相当する２
４５、２４４の分子量をもつ興味ある単一の成分の存在を強く示唆する。

【０１２８】 異なったクロマトグラフィー系における半精製ＡＥ−９８６の注入から得られ
た、単一のイオンクロマトグラム（２４５Ｍ＋１ ｍ／ｅ）と同様に、全イオン
クロマトグラム（ＴＩＣ）の例が、図１から４に示されている。それらのクロマ
トグラムの作業後の分析より、抗ＭＭＰ作用を有する成分を含む異なったクロマ
トグラフィー系から集められたそれぞれの画分において、２４５（Ｍ＋１）イオ
ンの存在が示された。

【０１２９】 ＨＰＬＣ Ｃ１８系（アンモニウムギ酸エステル、中性ｐＨ７、イソクラティ
ック）で分離したＡＥ−９８６の分析から得られた、単一のイオンクロマトグラ
ム（２４５Ｍ＋１）と同様に全イオンクロマトグラムが、図１に表されている。
ＡＥ−９８６は、ｍ／ｅ ２４５Ｍ＋１ピークの溶出のための保持時間１４．１
４分に対応する、１３．５分から１５．０分の間で集められた画分において検出
された。

【０１３０】 ＨＰＬＣ Ｃ１８系（アンモニウムギ酸エステル、酸性ｐＨ３、グラジエント
）で分離したＡＥ−９８６の分析から得られた、単一のイオンクロマトグラム（
２４５Ｍ＋１）と同様に全イオンクロマトグラムが、図２に表されている。ＡＥ
−９８６は、ｍ／ｅ ２４５Ｍ＋１ピークの溶出のための保持時間１６．６２分
に対応する、１６．５分〜１７．０分の間で集められた画分において検出された
。

【０１３１】 ＨＰＬＣ Ｃ１８系（アンモニウムギ酸エステル、酸性ｐＨ３、イソクラティ
ック）で分離したＡＥ−９８６の分析から得られた、単一のイオンクロマトグラ
ム（２４５）と同様に全イオンクロマトグラムが、図３に表されている。ＡＥ−
９８６は、ｍ／ｅ ２４５Ｍ＋１ピークの溶出のための保持時間１６．７９分に
対応する、１６分〜１８分の間で集められた画分において検出された。

【０１３２】 ＨＰＬＣ ＮＨ２系（アンモニウムギ酸エステル、酸性ｐＨ３、グラジエント
）で分離したＡＥ−９８６の分析から得られた、単一のクロマトグラム（２４５
）と同様に全イオンクロマトグラムが、図４に表されている。ＡＥ−９８６は、
ｍ／ｅ ２４５ピークの溶出のための保持時間１４．２８分に対応する、１４分
〜１６分の間で集められた画分において検出された。

【０１３３】 陰イオンのモード（表１４）のみでは、評価された全てのクロマトグラフィー
系において、２８９と２４３イオンが関心のある領域（ＡＥ−９８６）で検出さ
れた。それら２つのイオンの完全に共通した溶出は、イオン２４３におけるギ酸
エステル付加化合物の形成を示唆する。この現象は、アンモニウムギ酸エステル
が移動相で緩衝液として使用されたとき、陰イオンで度々観測される。このこと
は、アンモニウムギ酸エステル緩衝液を、同じｐＨにおけるアンモニウムアセテ
ート緩衝液で置き換えることによって、証明された。アンモニウムアセテート移
動相は、ＭＳ検出より前に、アンモニウム水酸化物溶液を用いてカラムの後、ア
ルカリ化された。どちらの系もイオン２４３に対し明瞭なシグナルを示したが、
イオン２８９はギ酸エステル系においてのみ検出された。さらに、アセテート付
加化合物に相当する新しいイオン（３０３）が、第２のクロマトグラフィー系に
おいて検出された。従って、ＡＥ−９８６成分は、約２４４ａｍｕの分子量を持
つことが考えられる（陰イオンモードにおいてＭ−１種と等価である２４３）。

【０１３４】

【表１３】

【０１３５】

【表１４】

【０１３６】 （ＡＥ−９８６の部分的構造の解明と経験的製法） ＬＣ−ＭＳ経験的手法の決定：質量分析法が、ＡＥ−９８６の構造に関する情
報を得るために用いられた。表１５に、ＡＥ−９８６のＬＣ−ＭＳ分析において
使われた条件を示す。

【０１３７】

【表１５】

【０１３８】 ２４５、２４６、２４７の同位体比の測定は、それらのイオンの弱いシグナル
を読む精度を増すために、拡大走査モードで行われた。２４６／２４５（Ａ＋１
型）と２４７／２４５（Ａ＋２型）のイオンに対して得られた同位体比は、以下
に表の形式で記載した。

【０１３９】 ｍ／ｅ２４７／２４５のピークの高さ（Ａ＋２型の同位体比）の５．９％の比
は、その分子における硫黄とごくわずかの酸素原子の存在を強く示唆する。

【０１４０】 Ａ＋１型の要素（ｍ／ｅ２４６／２４５のピークの高さ）に対する１１．８％
の同位体比は、その分子における１０までの炭素または炭素、窒素、硫黄（１）
の混合物を説明することができる。

【０１４１】 ２４４ａｍｕの分子量により、偶数の窒素（０、２、４）のみが、この分子に
存在する可能性がある。

【０１４２】 ＬＣ／ＭＳｎ構造の解明：ＡＥ−９８６の構造の部分的解明が、タンデム型質
量分析実験の実施により行われた。

【０１４３】

【表１６】

【０１４４】 その分子イオン２４５ ｍ／ｅ（Ｍ＋１）に関する陽イオンにおいて行われた
タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）実験は、１８ａｍｕ（ｍ／ｅ ２２７．１）
と３６ａｍｕ（ｍ／ｅ ２０９）（少数）の欠損を示した。それらの欠損は、１
つおよび２つの水分子（各−Ｈ_２Ｏおよび−２Ｈ_２Ｏ）の欠損に相当し、ＡＥ−
９８６における、アルコールおよび／またはジオール一部分の存在を表わしてい
る。実際のＭＳ／ＭＳスペクトルが、図５に掲載されている。

【０１４５】 ｍ／ｅ ２２７イオンで行われたＭＳ／ＭＳ実験は、ＡＥ−９８６の化学的構
造に関する多くの特徴部分をもつ複雑なスペクトルを生じた。このスペクトルに
現れる断片は、このスペクトルに現れる他の強いイオンの分裂、もしくはｍ／ｅ ２２７イオンの分裂の１つ、または両方のどちらかにより生じた可能性がある
。（すなわち、ｍ／ｅ １６６は、２０９イオンの分裂によるものである。）従
って、さらなるＭＳ／ＭＳ実験が、 ｍ／ｅ ２２７イオンの選ばれた断片におい
て実施された。得られたそのＭＳ／ＭＳスペクトルを図６に示す。

【０１４６】 ６０ａｍｕの欠損に由来する、２０９ ｍ／ｅイオン（Ｍ＋１−２Ｈ_２Ｏ）に
おけるＭＳ／ＭＳ実験が、カルボキシル酸（−ＣＨ_３ＣＯＯＨ）の一部分の欠損
の特徴となるｍ／ｅ １４９を生じた。

【０１４７】 その後、１４９ ｍ／ｅイオン（Ｍ＋１−２Ｈ_２Ｏ−ＣＨ_３ＣＯＯＨ）が、Ｍ
Ｓ／ＭＳにより再分析され、以下にあげるｍ／ｅ １０５、１１５、１１６、１
３４の断片が得られた。１４９から１３４までの１５の減少は、ＣＨ_３の欠損に
対応するとみられる。３３と３４の減少は、ＳＨとＨ_２Ｓの欠損の特徴とみられ
、それゆえ、ＡＥ−９８６において硫黄含有基（チオール、またはチオエーテル
）の存在が強く示唆される。ｍ／ｅ １４９から１０５までの４４の減少は、い
くつかの異なった基の欠損による可能性がある。

【０１４８】 化学誘導の構造解明：ＡＥ−９８６は、以下に詳しく述べるように、カルボキ
シル酸のエステル化に対して通常用いられる条件を課された。

【０１４９】 （メチル化（ＨＣｌ／メタノール）） 精製された画分のメチル化のために、本発明者らは、ＡＥ−９８６の精製画分
１５μｌ（４０００Ｘ）を蒸発させ、閉鎖した小瓶に１００μｌのＨＣｌ（１２
Ｎ）：ＭｅＯＨ／（１：９９）を加えた。その混合物は、４５℃で６０〜９０分
保持された後、乾かすために蒸発され、さらに１００μｌの水に溶解された。こ
の溶液は、ＬＣ／ＭＳの構造解明に使われたクロマトグラフィー条件に従い、注
入が行われた。

【０１５０】 （メチル化（ＢＦ_３／メタノール）） 精製された画分のメチル化のために、本発明者らは、ＡＥ−９８６の精製画分
１５μｌ（４０００Ｘ）を蒸発させ、閉鎖した小瓶に１００μｌのＢＦ_３／メタ
ノール溶液を加えた。その混合物は、４５℃で６０〜９０分保持された後、乾か
すために蒸発され、さらに１００μｌの水で溶解された。この溶液は、ＬＣ／Ｍ
Ｓの構造解明に使われたクロマトグラフィー条件に従い、注入が行われた。

【０１５１】 （精製された画分の希釈（４０００Ｘ）） 誘導の回復を立証するために、本発明者らは、ＡＥ−９８６の精製画分１５μ
ｌ（４０００Ｘ）を８５μｌの水で希釈した。その希釈された溶液は、ＬＣ／Ｍ
Ｓの解明に使われたクロマトグラフィー条件に従い、分析が行われた。

【０１５２】 （結果） ４５℃で１時間の間、ＢＦ_３／メタノール、または、Ｈ^＋／メタノールでＡＥ
−９８６の成分を誘導することにより、９５％以上によるＡＥ−９８６に対する
予想保持時間での信号強度によって決められたクロマトグラフィー信号の消失を
生じた。これらの２つの反応は、カルボキシル酸がそれらに対応するメチルエス
テルに転換することで知られている。メチル化は、クロマトグラフィー系におけ
るＡＥ−９８６の保持時間の増加と同様に、ＡＥ−９８６の分子量の増加も引き
起こす。ここで生成されたＡＥ−９８６誘導体の濃度では、誘導生成物を検出す
ることができなかった。

【０１５３】 物理化学的特性：ＡＥ−９８６におけるカルボキシル酸のような弱酸性作用基
の存在は、ギ酸エステル緩衝液のｐＨが７から３へ減少したとき、ＨＰＬＣ Ｃ１８カラムにおけるその保持時間の増加によって裏づけられた。このことは、
ＡＥ−９８６において、およそ４またはそれ以上のｐＫａを有する部分が存在す
ることを、強く示唆する。

【０１５４】 チオールまたはチオエーテル作用基が、ＭＳ／ＭＳデータによって示唆された
ようにＡＥ−９８６に存在するならば、軟骨と０〜５００画分からＡＥ−９８６
を回収することに影響する可能性がある。チオールは溶液中で他の硫黄含有分子
（プロテイン、ペプチド、アミノ酸等のような）と二硫化結合（Ｓ＝Ｓ）を形成
しやすいので、ＡＥ−９８６の化合していないチオール部分のみが、本工程に従
い抽出することができるように思われる。二硫化付加化合物の形成は、一般的に
チオール基を含有する分子の物理化学的特性を変更し、抽出によるそれらの回収
に影響を及ぼす。ＡＥ−９８６の二硫化付加化合物は、０〜５００画分（２０Ｘ
）の直接抽出により分離されない可能性がある。ＡＥ−９８６の二硫化付加化合
物の形成は、それを含む溶液を、抽出前に１５分間ｐＨ７で室温においてトリブ
チルホスファミドで処理することによって、特にはｐＨ３で処理することによっ
て（ＳＰＥ Ｃ１８ ｐＨ３）、最小にすることができる。ジチオトレイトール、β−メルカ
プトエタノールのような、他の二硫化結合分裂試薬を、ＡＥ−９８６の二硫化付
加化合物の形成を最小にするために、用いることができる。

【０１５５】 サメの軟骨部からの生物学的作用の分離と回収に対する上記の工程は、（１）
必要な生物学的作用を示す画分を抽出するために、（２）それらの生物学的作用
を有する特定の成分を抽出するために、どのような軟骨素材にも適用することが
できる。

【０１５６】 本発明より、生物学的有効成分はさまざまな親水性の溶媒における軟骨から抽
出されるので、上記の工程は異なった種の軟骨から、生物学的有効成分を抽出す
ることに適用することが可能である。軟骨材、好ましくはサメの軟骨、から分離
されたいかなる成分も、すなわち、１）ＡＥ−９８６成分の生物学的作用面と同
じもの、または、似通った生物学的作用面を有している、および／または２）２
４４ａｍｕの質量を持つものは、本発明の範囲内であるとみなされる。

【０１５７】 本発明は、特定の実施態様を参照しながら、これまでに述べられてきた。上記
の記述からそれることなく改造することは、熟練した職人の能力の範囲内である
。これらの変更も、付された請求項に定められたように、本発明の範囲内である
。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ、１Ｂ】 イソクラティック溶出とアンモニウムギ酸エステル緩衝液(ｐＨ７)を用いた、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｃ１８系におけるＡＥ−９８６の分析
から得られた単イオンクロマトグラム(２４５Ｍ＋１)、ならびに全イオンクロマ
トグラムを表す図。

【図２Ａ、２Ｂ】 グラジエント溶出とアンモニウムギ酸エステル緩衝液(ｐＨ３)を用いた、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｃ１８系におけるＡＥ−９８６の分析から
得られた単イオンクロマトグラム(２４５Ｍ＋１)、ならびに全イオンクロマトグ
ラムを表す図。

【図３Ａ、３Ｂ】 イソクラティック溶出とアンモニウムギ酸エステル緩衝液(ｐＨ３)を用いた、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｃ１８系におけるＡＥ−９８６の分析
から得られた単イオンクロマトグラム(２４５)、ならびに全イオンクロマトグラ
ムを表す図。

【図４Ａ、４Ｂ】 グラジエント溶出とアンモニウムギ酸エステル緩衝液(ｐＨ３)を用いた、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ＮＨ２系におけるＡＥ−９８６の分析から
得られた単イオンクロマトグラム(２４５)、ならびに全イオンクロマトグラムを
表す図。

【図５】 水分子の欠損に相当する１８ａｍｕの損失を示しているＡＥ−９８６のマスス
ペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ）のスペクトルを表す
図（主要ピーク ｍ／ｅ ２２７．１）。

【図６】 イオン２２７(２４５Ｍ＋１から水分子を引いたもの)の特定の画分のマススペ
クトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ）のスペクトルを表す図
。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年７月１７日（２０００．７．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】 有機溶媒含有または非含有溶液を利用した軟骨部抽出物を得る方法およびそれか
ら分離された抽出物

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 デニス レサール カナダ国，ケベック，レヴィス，733 デ ボワ ギローム (72)発明者 セルジェ アウジェール カナダ国，ケベック，サン−ランベール， 646 デス ロシニョール Ｆターム(参考） 4C087 AA01 AA02 AA04 BB46 NA14 ZA36 ZB21 ZB26 ZC19 ZC20 4H055 AA01 AA02 AA03 AB20 AB28 AC60 AD22 AD50 CA82 DA03 DA09 DA15

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の工程、 ａ）適量の有機溶媒含有溶液で軟骨材を処理し、軟骨部の可溶成分を含む第１の
   混合物を形成する工程と、 ｂ）前記第１の混合物を分離し、前記可溶成分を含む第１の液体抽出物と第１の
   固形物を形成する工程と を含む軟骨から可溶成分を得る方法であって、前記可溶成分は抗マトリックス金
   属プロテアーゼ（anti-matrix metalloprotease）作用、抗腫瘍 (anti-tumor)
   作用および抗アンギオジェニン(anti-angiogenic) 作用のうち１またはそれより
   多くを示すものである軟骨から可溶成分を得る方法。
2. 【請求項２】 さらに、 ａ）前記第１の液体抽出物から十分な量の液体を取り除き、実質上乾燥した第２
   の固形物を形成する工程と、 ｂ）前記第２の固形物を水で処理し、第２の混合物を形成する工程と、 ｃ）前記第２の混合物を分離し、前記可溶成分を含む最終液体抽出物と第３の固
   形物を形成する工程と、 を含む請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 さらに、前記第１の液体抽出物から、前記有機溶媒を実質上
   全て除去する工程を含む請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記有機溶媒含有溶液は、ハロゲン化された、エーテル性、
   プロトン性、非プロトン性、塩基性、酸性、極性、無極性、親水性、疎水性の一
   つまたはそれより多い有機溶媒を含む請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記有機溶媒含有溶液は、クロロホルム、ジブロモメタン、
   ブチルクロライド、ジクロロメタン、ジメトキシメタン、テトラヒドロフラン、
   ジエチルエーテル、エチレングリコール、ジメチルエーテル、エチレングリコー
   ルジエチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、トリエチレング
   リコールジメチルエーテル、ｔ−ブチルエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエー
   テル、メタノール、エタノール、２−ニトロエタノール、２−フルオロエタノー
   ル、２、２、２−トリフルオロエタノール、エチレングリコール、１−プロパノ
   ール、２−プロパノール、２−メトキシエタノール、１−ブタノール、２−ブタ
   ノール、ｉ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、２−エトキシエタノー
   ル、ジエチレングリコール、１−、２−、３−ペンタノール、ネオ−ペンチルア
   ルコール、ｔ−ペンチルアルコール、ジエチレングリコールモノメチルエーテル
   、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、シクロヘキサノール、アニソール
   、ベンジルアルコール、フェノール、グリセロール、ジメチルホルムアミド（Ｄ
   ＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１、３−ジメチル−３、４、５、
   ６−テトラヒドロ−２(１Ｈ)−ピリミジノン(ＤＭＰＵ)、１、３−ジメチル−２
   −イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ホルムア
   ミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−メチルホルムアミドのうち、一つまたはそ
   れより多くの有機溶媒を含む請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記有機溶媒含有溶液は、メタノール、エタノール、アセト
   ニトリル、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルホキシド
   のうち、一つまたはそれより多くの有機溶媒を含む請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記有機溶媒含有溶液は、メタノールとアセトニトリル、メ
   タノールとジメチルスルホキシド、エタノールとアセトニトリル、エタノールと
   ジメチルスルホキシドの有機溶媒の組合せを含む請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記有機溶媒含有溶液は、水と、メタノール、プロパノール
   、イソプロパノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドのう
   ちの１種類の有機溶媒との組合せを含む請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記有機溶媒含有溶液は、全溶液の体積に対して、約１〜１
   ００％ｖ／ｖの量である有機溶媒を含む請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記有機溶媒は、全溶液の体積に対して、約４０〜８０％
    ｖ／ｖの量で存在する請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記有機溶媒は、全溶液の体積に対して、少なくとも約１
    ０％ｖ／ｖの量で存在する有機溶媒を含む請求項９に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記第１の混合物は、上清の除去後、固体の沈殿、透析、
    ろ過、遠心分離処理のうちの１つまたはそれより多くの方法によって分離される
    ものである請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前述の液体の除去が、蒸発、凍結乾燥、蒸留、アゼオトロ
    ープ蒸留、脱水、液体／液体抽出、有機溶媒吸収剤の添加、回転蒸発等の方法の
    うちの１つまたはそれより多くの方法によってなされるものである請求項２に記
    載の方法。
14. 【請求項１４】 前記軟骨材がサメの軟骨である請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 さらに、前記軟骨材の有機溶媒含有溶液による処理を行な
    う前、もしくはその間、またはその後、前記軟骨材を均質化する工程を含む請求
    項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 １つまたはそれより多くの物理的および化学的方法によっ
    て、前記均質化がなされた請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 さらに、 ａ）適量の有機溶媒含有溶液で、前記第１の固形物を処理し、軟骨部の可溶成分
    を含む第２の混合物を形成する工程と、 ｂ）前記第２の混合物を分離し、前記可溶成分を含む第２の液体抽出物と第２の
    固形物を形成する工程と を含む請求項１に記載の方法。
18. 【請求項１８】 さらに、 ａ）適量の有機溶媒含有溶液で、前記第２の固形物を処理し、軟骨部の可溶成分
    を含む第３の混合物を形成する工程と、 ｂ）前記第３の混合物を分離し、前記可溶成分を含む第３の液体抽出物と第３の
    固形物を形成する工程と を含む請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 さらに、前記第１、第２および第３の液体抽出物を混合し
    、全液体抽出物を形成する工程とを含む請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記可溶成分は前記第１の液体抽出物から分離されたもの
    である請求項１に記載の方法。
21. 【請求項２１】 ａ）ホモジェネートを形成するために、軟骨の平均粒子寸
    法が約５００ミクロンより小さくなるまで、水性溶液で軟骨を均質化処理する工
    程と、 ｂ）前記生物学的有効成分を前記水性溶液中に抽出するために、前記ホモジェネ
    ートを平衡状態に保ち、前記生物学的有効成分を含む第１の液体抽出物と第１の
    固形物から成る第１の混合物を形成する工程と、 ｃ）前記第１の固形物と、前記第１の液体抽出物とに分離する工程と、 ｄ）前記第１の液体抽出物を分離工程にかけ、各分子量が約５００ｋＤａ以下で
    ある生物学的有効成分を含む第２の液体抽出物を形成する工程と、 を含む軟骨から生物学的有効成分を得る方法であって、 さらに、 ｅ）分子量が約１ｋＤａ以下である第１の生物学的有効成分を含むろ過液と、分
    子量が約１〜５００ｋＤａである第２の生物学的有効成分を含む残留物を形成す
    るために、約１ｋＤａ程度のわずかな分子量を遮断する膜を用いて、前記第２の
    液体抽出物にろ過処理を行う工程と、 を含む軟骨から生物学的有効成分を得る方法であって、 前記第１と第２の生物学的有効成分が、少なくとも抗マトリックス金属プロテア
    ーゼ作用を示すものである軟骨から生物学的有効成分を得る方法。
22. 【請求項２２】 前記ｃ），ｄ）およびｅ）工程のうちのいずれか２つまた
    はそれより多くの工程を、単一の工程に結合した請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記ｄ）およびｅ）工程のうちのいずれか２つまたはそれ
    より多くの工程を、単一の工程に結合した請求項２１に記載の方法。
24. 【請求項２４】 粉砕、微粉化、製粉機にかける、すりつぶし、切り刻み、
    混合、膨潤化、細胞外の基質分裂、細胞の溶解、軟骨材の多孔性増加処理等のう
    ちの１つまたはそれより多くの方法によって、前記均質化処理が行われる請求項
    ２１に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記第１の生物学的有効成分は、前記ろ過液から分離され
    たものである請求項２１に記載の方法。
26. 【請求項２６】 さらに、前記第１の生物学的有効成分は、抗アンギオジェ
    ニン作用と抗腫瘍作用を有する請求項２１に記載の方法。
27. 【請求項２７】 １またはそれより多くの追加の第１の液体抽出物を形成す
    るために、前記第１の固形物に、ｂ）とｃ）工程が１回またはそれより多くの回
    数なされる請求項２１に記載の方法。
28. 【請求項２８】 工程ｃ）における前記分離処理が、ろ過、ダイアフィルト
    レーション、透析、限外ろ過、精密ろ過、デプスフィルターろ過、遠心分離、上
    清の回収を伴う固体の沈殿のうちの１つまたはそれより多くの方法により行われ
    る請求項２１に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記軟骨材がサメの軟骨である請求項２１に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記第２の液体抽出物は、透析、ダイアフィルトレーショ
    ン、限外ろ過のうちの１つまたはそれより多くの方法によりろ過処理されるもの
    である請求項２１に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記第１の液体抽出物は、さらに安定剤を含むものである
    請求項１に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記最終の液体抽出物は、さらに安定剤を含むものである
    請求項２に記載の方法。
33. 【請求項３３】 さらに、前記第１の液体抽出物、第２の液体抽出物および
    ろ過液のうちの少なくとも１つが、安定剤を含むものである請求項２１に記載の
    方法。
34. 【請求項３４】 請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８
    、２９、３０、および３３のいずれか１つに記載の方法によって調製された第１
    または第２の生物学的有効成分。
35. 【請求項３５】 請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８
    、２９、３０、および３３のいずれか１つに記載の方法によって調製された第１
    の生物学的有効成分であって、さらに、該成分は抗腫瘍作用を有するものである
    第１の生物学的有効成分。
36. 【請求項３６】 前記軟骨材がサメの軟骨であり、前記第１の生物学的有効
    成分の分子量が約２４４である請求項２５に記載の方法により調製された第１の
    生物学的有効成分。
37. 【請求項３７】 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
    、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３１および３２のいずれ
    か１つに記載の方法により調製された可溶成分。
38. 【請求項３８】 前記軟骨材がサメの軟骨である請求項３７に記載の可溶成
    分。
39. 【請求項３９】 前記可溶成分が、少なくとも抗マトリックス金属プロテア
    ーゼ作用を有する請求項３７に記載の可溶成分。
40. 【請求項４０】 さらに、前記可溶成分が抗アンギオジェニン作用と抗腫瘍
    作用のうちの少なくとも１つを有する請求項３９に記載の可溶成分。
41. 【請求項４１】 前記可溶成分の分子量が約２４４である請求項３８に記載
    の可溶成分。
42. 【請求項４２】 約１ｋＤａ未満の分子量および抗マトリックス金属プロテ
    アーゼ作用を有する生物学的有効成分であって、前記生物学的有効成分は軟骨材
    から得られたものである生物学的有効成分。
43. 【請求項４３】 前記成分がサメの軟骨から抽出されたものである請求項４
    ２に記載の生物学的有効成分。
44. 【請求項４４】 前記成分は、軟骨材から分離した成分と類似する生物活性
    を有する請求項４２に記載の生物学的有効成分。
45. 【請求項４５】 さらに、 弱酸性官能基、 メチル化可能な官能基、 少なくとも０、２、または４の窒素原子、 少なくとも０、１、または２の硫黄原子、 水性溶液に対する可溶性、 有機溶媒含有溶液に対する可溶性、 の特性のうち少なくとも１つを有する請求項４２に記載の生物学的有効成分。
46. 【請求項４６】 前記成分の分子量が約２４４である請求項４３に記載の生
    物学的有効成分。
47. 【請求項４７】 さらに、 抗腫瘍作用、 新血管形成の抑制効果、 転移状態の形成の抑制効果、 の生物学的特性のうち少なくとも１つを有する請求項４２に記載の生物学的有効
    成分。
48. 【請求項４８】 マトリックス金属プロテアーゼ酵素を抑制する方法であっ
    て、 前記酵素に、効果的な量の請求項１に記載の方法により調製された前記可溶成分
    を、前記酵素を抑制するのに十分な時間接触させる工程を含むマトリックス金属
    プロテアーゼ酵素抑制方法。
49. 【請求項４９】 マトリックス金属プロテアーゼ酵素を抑制する方法であっ
    て、 前記酵素に、効果的な量の請求項２１に記載の方法により調製された前記第１と
    第２の生物学的有効成分のうちの少なくとも１つを、前記酵素を抑制するのに十
    分な時間接触させる工程を含むマトリックス金属プロテアーゼ酵素抑制方法。
50. 【請求項５０】 マトリックス金属プロテアーゼ酵素を抑制する方法であっ
    て、 前記酵素に、効果的な量の請求項４２に記載の方法により調製された前記生物学
    的有効成分を、前記酵素を抑制するのに十分な時間接触させる工程を含むマトリ
    ックス金属プロテアーゼ酵素抑制方法。
51. 【請求項５１】 マトリックス金属プロテアーゼ酵素を抑制する方法であっ
    て、 前記酵素に、効果的な量の請求項４６に記載の方法により調製された前記生物学
    的有効成分を、前記酵素を抑制するのに十分な時間接触させる工程を含むマトリ
    ックス金属プロテアーゼ酵素抑制方法。
52. 【請求項５２】 生体組織における転移状態の形成抑制方法、および新血管
    形成抑制方法のうちの少なくとも１つの方法であって、 前記組織に、効果的な量の請求項１に記載の方法により調製された可溶成分を、
    組織における前記転移状態の形成、および新血管形成のうちの少なくとも１つを
    抑制するのに十分な時間、接触させる工程を含む生体組織における転移状態の形
    成の抑制法、および新血管形成の抑制法のうちの少なくとも１つの方法。
53. 【請求項５３】 生体組織における転移状態の形成抑制方法、および新血管
    形成抑制方法のうちの少なくとも１つの方法であって、 前記組織に、効果的な量の請求項２６に記載の方法により調製された前記第１お
    よび第２の生物学的有効成分のうちの少なくとも１つを、組織における前記転移
    状態の形成、および新血管形成のうちの少なくとも１つを抑制するのに十分な時
    間、接触させる工程を含む生体組織における転移状態の形成の抑制法、および新
    血管形成の抑制法のうちの少なくとも１つの方法。
54. 【請求項５４】 生体組織における転移状態の形成抑制方法、および新血管
    形成抑制方法のうちの少なくとも１つの方法であって、 前記組織に、効果的な量の請求項４７に記載の生物学的有効成分を、先の組織に
    おける上記の転移状態の形成、および新血管形成のうちの少なくとも１つを抑制
    するのに十分な時間、接触させる工程を含む生体組織における転移状態の形成の
    抑制法、および新血管形成の抑制法のうちの少なくとも１つの方法。
55. 【請求項５５】 治療効果を得るために十分な期間、治療に有効な量の請求
    項１に記載の方法により調製された可溶成分をほ乳動物に与えることによる、前
    記ほ乳動物におけるマトリックス金属プロテアーゼに関連した病気、腫瘍に関連
    した病気、血管形成に関連した病気のうちの少なくとも１つに対する治療方法。
56. 【請求項５６】 治療効果を得るために十分な期間、治療に有効な量の請求
    項２６に記載の方法により調製された可溶成分をほ乳動物に与えることによる、
    前記ほ乳動物におけるマトリックス金属プロテアーゼに関連した病気、腫瘍に関
    連した病気、血管形成に関連した病気のうちの少なくとも１つに対する治療方法
    。
57. 【請求項５７】 治療効果を得るために十分な期間、治療に有効な量の請求
    項４０に記載の方法により調製された前記第１及び第２の生物学的有効成分のう
    ちの少なくとも１つをほ乳動物に与えることによる、前記ほ乳動物におけるマト
    リックス金属プロテアーゼに関連した病気、腫瘍に関連した病気、血管形成に関
    連した病気のうちの少なくとも１つに対する治療方法。
58. 【請求項５８】 治療効果を得るために十分な期間、治療に有効な量の請求
    項４７に記載の前記生物学的有効成分をほ乳動物に与えることによる、ほ乳動物
    におけるマトリックス金属プロテアーゼに関連した病気、腫瘍に関連した病気、
    血管形成に関連した病気のうちの少なくとも１つに対する治療方法。