JP2002514757A - ダイオードレーザをベースとした測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】レーザダイオード等の光源の不均一な光線のプロフィールを調整することにより光の散乱と蛍光の精確な測定を提供するための方法、装置を提供する。 【解決手段】Ｓ１０で、レーザダイオードは光線プロフィールが測定装置の流路を横切ってガウス型になり流路に沿っては任意に未知のプロフィールになるように置かれる。Ｓ２０で、蛍光染料の１００％の濃度の均一なサイズの参照ミクロスフィアが流路に沿って流れセル中を通されて光を受ける。Ｓ３０で、参照イベントが各ミクロスフィアに対してＸ軸に時間単位をＹ軸に蛍光強度の単位を有する二次元グラフ上にプロットされる。Ｓ４０で、レーザダイオードに対するテンプレートは参照イベントの一連の時間合わせされた蛍光強度のプロット平均値を有するように決められる。Ｓ５０で、蛍光参照イベントが測定装置を使用して捕捉される。Ｓ６０で、サンプルイベントは時間的に位置合わせされるまたはテンプレートの上に重ねられる。Ｓ７０で、サンプルイベントは標準化されテンプレートと比較される。Ｓ８０で、標準化されたサンプルイベントは積分されてサンプル中の総蛍光量が決定される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【関連出願】

本出願は、１９９８年５月１４日に出願されここに参考文献として組み込まれ
た米国仮特許出願シリアルナンバー６０／０８５，５２２に基付き優先権主張を
する。

【０００２】

【発明の属する技術分野】

本発明は一般的にダイオードレーザを有する測定装置に関する。より詳細には
、本発明は改良されたビームプロフィールを提供するように配向されたダイオー
ドレーザを有する測定装置に関する。

【０００３】

【発明背景】

体外診断分析は、２０年以上の間ミクロスフィアを使用して行われてきた。ミ
クロスフィアとしてマイクロ粒子、ビーズ、ポリスチレンビーズ、マイクロビー
ズ。ラテックス粒子、ラテックスビーズ、蛍光ビーズ、蛍光粒子、着色粒子およ
び着色ビーズがある。ミクロスフィアは分子反応の媒介物として働く。流動細胞
光度測定法に使用するためのミクロスフィアはテキサス州オースティンのルミネ
ックス株式会社等のメーカーから入手することが可能である。

【０００４】 例証となるミクロスフィアとその製造方法は、例えば、マーク Ｂ．チャンド
ラーおよびドン Ｊ．チャンドラーのタイトルが多重蛍光信号を有するマイクロ
粒子である米国特許出願連続第０９／２３４号、ドン Ｊ．チャンドラー、ヴァ
ン Ｓ．チャンドラーおよびベス ランバートの精確に蛍光染色された粒子とそ
の製造方法とその使用方法のタイトルを有する米国特許出願連続第０９／１７２
，１７４号に見ることができ、両特許出願はここに完全に組み込まれている。一
例として、もしユーザーがＩｇＧ、Ａ、Ｍ、アイソタイプ分析を行った場合、ユ
ーザーはビーズのセットとしてルミネックス８０７０ＩｇＧ、８０６０ＩｇＡお
よび８０５０Ｉｇ Ｍビーズセットを選択する。

【０００５】 ミクロスフィアはその直径が１０ナノメーターから１００ミクロンであり均一
であり高度に球形をしている。ビーズベース分析は標準「ストリップテスト」に
おいて実現化されておりそこにおいて捕捉反応物質でコーティングされたビーズ
は、紙のストリップ上の位置に固定され、他の反応物質を有するビーズは同じ紙
のストリップの他の位置を占拠する。標的の分析物がストリップに導かれると、
第一のタイプのビーズはそれに固着し第二のタイプを流すまたはそれと混ざり、
しばしば色の変化を発生し、そのことが標的の分析物の存在を示す。

【０００６】 より最近のビーズベースの分析は流動細胞光度測定法を使用し関心の対象の標
的の分析物との反応を測定する。従来の流動細胞光度測定装置においては、図１
に示すように、サンプル細胞またはその表面に反応物を有するミクロスフィアを
含んだサンプル生物学的流体はサンプルチューブから鞘流の流れの中央に導入さ
れる。サンプル流体の流れは流れセルまたはキュベット１９１０の中にその中央
部または中央部の近くに注入される。流体力学的フォーカシングとして知られて
いるこの工程により、細胞は測定点の中央に再現性良く移送される。通常は細胞
またはミクロスフィアは流れセル中で懸濁状態にある。

【０００７】 レーザダイオード１９００は懸濁物の流れによってそれらがレーザビーム中を
通過するときにそれらの上にレーザ光線の焦点を合わせる。従来の流動細胞光度
測定装置におけるレーザダイオードは、円形のビームを楕円形のビームに形成し
流れセル１９１０に焦点を合わせることを要求する。図１に見られるように、こ
の楕円形の光線はしばしば円形のビームからレーザダイオード１９００と流れセ
ル１９１０の間に置かれたビーム形成光学装置１９６０を使用して成形される。

【０００８】 流れ中の関心の対象がレーザ光線に打たれたとき、ある信号が検知器により検
知される。この信号は前部光散乱強度と側部光散乱強度を有する。図１に示した
流動細胞光度測定装置において、光散乱検知器１９３０、１９３２は流れセル１
９１０に対してレーザダイオード１９００の反対側に置かれ前部光散乱強度を測
定し、そしてレーザの一側で流体の流れ／レーザ光線の横断と位置合わせされて
側部光散乱強度を測定する。前部光散乱強度は各細胞のサイズに関する情報を提
供し、一方側部光散乱強度は各細胞の相対サイズと屈折率に関する情報を提供す
る。

【０００９】 米国特許第４，２８４，４１２号等の開示されたここに参考として組み込まれ
た公知の流動細胞光度測定装置は血球の小分類を自動的に同定するのに使用され
てきた。同定は蛍光を発する抗体に反応する細胞表面上の抗原性決定基にその基
礎を置いている。サンプルは焦点を合わされたコヒーレント光により発光し、そ
して前部光散乱、直角光散乱と蛍光は検知され細胞を同定するのに使用される。

【００１０】 ここに参考として上げたＶＡＮ ＤＥＮ ＥＮＧＨ等の米国特許第５，７４７
，３４９号に記載されているように、いくらかの流動細胞光度測定装置は蛍光性
ミクロスフィアを使用する。その蛍光性ミクロスフィアは蛍光性染料が含浸され
たビーズである。ミクロスフィアの表面はサンプル流体中の細胞上のレセプタ、
抗原、抗体等に取り付けられたタグによりコーティングされる。したがって、蛍
光染料を有するミクロスフィアは特に細胞の成分と結合する。しばしば二つ以上
の染料が同時に使用され、各染料により特定の状態を検知することができる。

【００１１】 通常は染料はレーザダイオード１９００からのレーザ光線により励起され、そ
して長波長の光を放つ。図１に光を流れセル１９１０から増倍型光電管とフィル
タセット１９５６、１９５８、１９５９と側部光散乱検知器１９３２に導くビー
ムスプリッタ１９４２、１９４４、１９４６を使用する従来技術の流動細胞光度
測定装置を示す。この流動細胞光度測定装置は鏡１９７０を使用して前部光散乱
を前部光散乱検知器１９３０に反射している。

【００１２】 標準の流動細胞光度測定の拮抗的阻害分析においては、抗体は共有結合的にミ
クロスフィアに結合する。これらのビーズは蛍光染色された抗原と一緒に生物学
的サンプルと混合される。関心の抗原の存在の下で、蛍光染色された抗原はビー
ズ上の場所を争い、それがないときに蛍光染色された抗原はビーズを覆う。流動
細胞光度測定法による試験に際して、関心の抗原の存在は関心の抗原を含むサン
プルに比較した蛍光の放射の著しい減少により示される。

【００１３】 しかしこれら二つのタイプのビーズベースの分析の間には強い対比がある。前
者は簡単で廉価であるが、関心の分析物の強いサンプル濃度を伴う粗い分析に限
定される。後者は強力で高感度であるが、分析を行いその結果を解釈するのに１
００，０００ドルの装置と高度に訓練された技術者を必要とする。 これら二つのタイプのビーズベース分析の間を橋渡しする商業的に入手できる
装置はないように思われる。流動細胞光度測定法分析の感度と柔軟性をストリッ
プ分析の簡便性と低コストと結合させる装置は体外診断の技術を進歩させると考
えられる。

【００１４】 流動細胞光度測定装置のコストとサイズの大部分はレーザに帰せられると考え
られる。実際に全ての市販流動細胞光度測定装置では励起源としてアルゴンイオ
ン４８８ｎｍレーザが使用されている。それは大きく数立方フィートを占め大き
な電源を必要とし安定性を維持するために常時強制空冷をする必要がある。他の
小さいより安価なレーザがあるが、流動細胞光度測定法には適さないと思われる
。例えば、色素レーザは非常に急激に燃え尽きる。Ｈｅ−Ｃｄレーザは非常に雑
音が多い。周波数二重レーザは温度に敏感であり不安定である。Ｈｅ−Ｎｅレー
ザはかなり効果的であるが、その赤色出力は雑音が多い。

【００１５】 上記レーザの欠点を考慮して、レーザダイオードの長所が評価される。しかし
ダイオードレーザの問題はその光線のプロフィールである。例えば、図２ａは標
準のレーザダイオードのサンプル光線のプロフィールを示す。レーザダイオード
の光線のプロフィールは、一例として図２ｂに示されるような標準アルゴンイオ
ンレーザのそれと比較して非常に不均一である。

【００１６】 関連する蛍光測定は粒子と細胞の間の極めて均一な励起に依存するので、この
不均一性は流動分析装置にとって著しい障害となると考えられる。この障害につ
いて図３を参考にして説明することができる。図３は、一例として、図２に示す
レーザダイオードの光線のプロフィールの主要軸の二次元グラフである。もしも
図３の光線のプロフィールの主要軸が流動分析装置の流路を横切って置かれると
、流路中の細胞またはミクロスフィア等の対象物は同じまたは実質的に同じレベ
ルの光線を受けない。むしろ、図３に示すように、グラフ上の点１０、１２、１
４、１６および１８は光線のプロフィールを横切って雑然として変わるエネルギ
ーレベルを有する。

【００１７】 ミクロスフィアが流路を通過し光線のプロフィールのグラフの例えば点１０で
レーザダイオードの光線を受けると、同じミクロスフィアが流路を通過し点１４
でレーザダイオードの光線を受けた場合よりも大きいエネルギーを得ることにな
ると考えられる。したがって、光線のプロフィール上の低いエネルギーレベルを
有する点を通過してきた高い蛍光強度を有するミクロスフィアと光線のプロフィ
ール上の高い蛍光強度を有する点を通過してきた低い蛍光強度を有するミクロス
フィアを区別することは不可能と考えられる。

【００１８】 ダイオードレーザを第二のレーザとして有しアルゴンイオンレーザを共に有す
る市販の流動細胞光度測定装置は、ダイオードレーザの光線のプロフィールの変
化の高い係数を当然のこととしている。さらにレーザダイオードは同じ光線のプ
ロフィールを有する必要はない。実際に、共鳴空隙における僅かな変化さえ、例
えば、それぞれの光線のプロフィールの形に影響する。このように、与えられた
型の流動細胞光度測定装置のダイオードレーザは同じ型の他の流動細胞光度測定
装置のダイオードレーザと同じ光線のプロフィールを持つ必要はない。

【００１９】 このように、一例として、図１に示す市販の流動細胞光度測定装置は、プリズ
ム拡張器、光線形成拡張器および微小レンズ列等の光線形成光学装置を有する。
流動細胞工学測定装置のダイオードレーザで従来技術で行おうとしていたことは
、光学的に光線を集め二つの外側のピークを中心に導くことを意図したものであ
った。

【００２０】 そのような光学装置はそれ自体が不必要に高価であり、流動細胞工学測定装置
の製造を複雑にし、装置の全体のコストを高くすると考えられる。さらに、高価
で複雑な光線形成光学装置が使用されるのにも拘わらず、結果として得られる光
線のプロフィールは、図４に示すように未だ満足できるものではない。図４の光
線のプロフィールは図２ａに示されるものよりは良好であるが、例えば、それは
未だ流路に沿ってエネルギー強度においてなお１０〜１５パーセントの変化を発
生している。

【００２１】 上記の点から、不均一なダイオードレーザの光線のプロフィールを調節するこ
とにより、光の散乱と蛍光の精確な測定を提供するための方法および／または装
置を提供することが望ましいと考えられる。

【００２２】 また、レーザダイオードと光学的に協同するまたは接続した光線形成光学装置
のないそのような方法および／またはシステムを提供することが望ましいと考え
られる。

【００２３】 さらにまた、流れ分析装置を有するそのような方法および／またはシステムを
提供することが望ましいと考えられる。

【００２４】

【課題を解決するための手段】

本発明の特徴と利点は、レーザダイオード等の光源の不均一な光線のプロフィ
ールを調整することにより光の散乱と蛍光の精確な測定を提供するための方法お
よび／または装置を提供することである。

【００２５】 また、本発明の特徴と利点は、レーザダイオードおよび／または光学的に協同
するまたは接続した光線形成光学装置のないそのような方法および／またはシス
テムを提供することである。

【００２６】 また、本発明の特徴と利点は、流れ分析装置を有するそのような方法および／
またはシステムを提供し、光の散乱およびミクロスフィアまたはビーズから放射
される蛍光の精確な測定を行うことである。

【００２７】 本発明の特徴と利点は、新規な診断システムを提供することである。この瞬間
診断システムは流路とレーザダイオード等の光源を有する測定装置を有し、コン
ピュータと連通可能である。光源は流路を横切るガウス型の第一の光線のプロフ
ィールと流路に沿った第二の光線のプロフィールを有する。また、診断システム
はさらにコンピュータにより読みとり可能で、そしてコンピュータにより実行可
能なコンピュータへの指令を保存するメモリー手段を有する。指令は次の連続の
、非連続の、または独立のステップを有する。光源の光線のプロフィールに関係
したテンプレートが作られる。測定装置により蛍光サンプルが捕捉される。サン
プルは時間的にテンプレートに位置合わせされる。サンプルはテンプレートに対
して標準化される。標準化されたサンプルは積分されてサンプル中の蛍光の総量
が決定される。

【００２８】 任意に、テンプレートはミクロスフィアのサイズおよび／または流速に関係す
る。任意に、時間的な位置合わせステップは位置合わせのための最少二乗法を使
用することを含む。

【００２９】 任意に、測定装置は流れ分析装置を有する。

【００３０】 任意に、流れ分析装置は、プリズム拡張器、微小レンズ列と光線拡張器等の光
源と光学的に協同する光線のプロフィール形成要素を有しない。任意に、流れ分
析装置は運転時に流路と流路に位置合わせされた主要軸を有する光源の光線のプ
ロフィールを有する。任意に流れ分析装置はサンプルイベントに対して蛍光強度
ピークを検知するためのピーク検出器を有しない。

【００３１】 この発明の特徴と利点は、また、コンピュータと第一の光線のプロフィールと
それを受ける流体流路を有する光源を有する測定装置と使用するためのコンピュ
ータプログラム製品を提供することである。コンピュータプログラム製品はコン
ピュータにより読み取り可能で、コンピュータ指令を保存できるメモリー媒体を
有する。指令は次の連続の、非連続の、または独立のステップを有する。流路に
沿った光源の光線のプロフィールに関係したテンプレートが作られる。光源は流
路を横切るガウス型の第二の光線のプロフィールを有する。測定装置により蛍光
サンプルが捕捉される。サンプルは時間的にテンプレートに位置合わせされる。
サンプルはテンプレートに対して標準化される。標準化されたサンプルは積分さ
れてサンプル中の蛍光の総量が決定される。

【００３２】 任意に、テンプレートはミクロスフィアのサイズおよび／または流速に関係す
る。任意に、時間的な位置合わせステップは位置合わせのための最少二乗法を使
用することを含む。

【００３３】 この発明の他の目的と特徴は測定装置中のレーザダイオード等の光源の光線の
プロフィールを改良する方法を提供することにある。測定装置は流路と流路を横
切るガウス型の光線のプロフィールと流路に沿った第二の光線のプロフィールを
有する光源を有する。この方法は次の連続の、非連続の、または独立のステップ
を有する。光源の光線のプロフィールに関係したテンプレートが作られる。測定
装置により蛍光サンプルが捕捉される。サンプルは時間的にテンプレートに位置
合わせされる。サンプルはテンプレートに対して標準化される。標準化されたサ
ンプルは積分されてサンプル中の蛍光の総量が決定される。

【００３４】 任意に、テンプレートはミクロスフィアのサイズおよび／または流速に関係す
る。任意に、時間的な位置合わせステップは位置合わせのための最少二乗法を使
用することを含む。

【００３５】 この発明の他の特徴と利点は、流路を形成する流れセルを有する流れ分析装置
を提供することにある。流れ分析装置は流路を横切るガウス型第一の光線のプロ
フィールと流路に沿った第二の光線のプロフィールを有するレーザダイオードの
ような一つ以上の光源を有する。任意に、流れ分析装置は光学的に一つ以上の光
源と協同する光線形成光学的要素またはアセンブリーを有しない。

【００３６】 任意に、流れ分析装置はサンプルイベントの蛍光強度ピークを検知するための
ピーク検出器を有しない。任意に、流れ分析装置は、さらに、一つ以上のレーザ
ダイオードと流れセルと協同する一つ以上の光学的検知器を有する。一つ以上の
光学的検知器はアバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、またはｐ−ｉ−
ｎフォトダイオードを有する。

【００３７】 任意に、流れ分析装置は、さらに、各光学的検知器に接続された一つ以上のＡ
−Ｄ変換器を有する。任意に、流れ変換器はまた一つ以上のＡ−Ｄ変換器を制御
する一つ以上のデジタル信号プロセッサを有する。

【００３８】 本発明の他の特徴と利点は一つ以上の光源と流路を形成する流れセルを有する
流れ分析装置において光線のプロフィール特性を改良する方法を有することであ
る。方法は一つ以上の光源を流れセルに対して方向を合わせ一つ以上の光源が流
路を横切るガウス型の第一の光線のプロフィールと流路に沿った非ガウス型の第
二の光線のプロフィールを有することからなる。

【００３９】 任意に、新規な方法において、流れ分析装置は任意に一つ以上の光源に接続さ
れた光線形成要素またはアセンブリを有しない。任意に、一つ以上の光源は一つ
以上のレーザダイオードを有する。

【００４０】 続く詳細な説明がよりよく理解されるようにこの技術分野に対するこの貢献が
よりよく認められるように本発明のより重要な特徴を広く概説した。もちろん、
以下に記載されそして記載の請求項に従属する事項を構成する本発明の他の特徴
がある。

【００４１】 この点に関して、本発明の少なくとも一つの実施態様を説明する前に、本発明
は以下に記述に記載されたまたは図面に描写された構造の詳細と構成要素の配列
に限定されるものではないということを理解されるべきである。本発明は他の実
施態様が可能であり様々な方法で実施され行われることができる。そしてここで
使用されている語法と用語は、記載の目的に使用されたものであり限定のために
使用されたものではないということも理解されるべきである。

【００４２】 このように、当業者は、この開示が基礎を置いているこの概念を、本発明の色
々な目的を実施するために他の構造、方法とシステムを設計するための基礎とし
て使用できることを認識すべきである。したがって、請求項はそれらが本発明の
精神と範囲から逸脱しない限り相当する構造を含むと解釈されることは重要であ
る。

【００４３】 さらに、前記要約により、米国特許および商標庁そして広く公衆、そして特に
この技術分野の特許と法律用語または語法に不慣れな科学者、技術者と同業者は
簡単な調査により本願の技術的開示の性質と本質を速やかに特定することができ
る。要約は請求項で限定される本願の発明を限定する意図を有していないし、決
して本発明の範囲を限定する意図を有していない。

【００４４】 これらは本発明の他の目的とともに、本発明を特徴づける新規性の様々な特徴
とともに添付のこの開示の一部を構成する請求項中の特異性とともに指摘される
。この発明、それを利用することにより達成されるその作用の利点と特別な目的
がよりよく理解されるために、本発明の適した実施態様を図示した添付図面を参
考として添付する。

【００４５】 （注釈および専門語）

【００４６】 下記詳細な説明はコンピュータまたはコンピュータのネットワークで実施され
るプログラムの手順に特有の語で記載される。これらの手続き上の記載と表現は
、同業者により最も効果的に彼らの仕事の内容を他の同業者に伝えるのに使用さ
れる手段である。

【００４７】 手順はここでそして一般的に望ましい結果へ導く首尾一貫した連続のステップ
である。これらのステップは物理量の物理的操作を必要とするものである。通常
、そして必ずしもでないが、これらの量は、保存、伝送、結合、比較およびさも
なければ操作される電気的または磁気的信号の形を取る。これらの信号をビット
、値、要素、記号、特徴、用語、数字等として指示することは時として便利であ
る。しかしながら、これらの総てまたは類似の用語は適当な物理量に関連しこれ
らの量に使用される便利なラベルに過ぎないことに注意しなければならない。

【００４８】 さらに、実行される操作は時々作業者によって行われる通常精神的な作業に関
する追加比較等の用語として示される。このような作業者の可能性は、どのよう
な場合にも、本発明の一部を形成するここに記載するどのような操作に置いても
必要でなくまた望ましくない。運転は機械操作である。本発明の運転を行うため
の有用な機械は汎用デジタルコンピュータまたは類似の装置である。

【００４９】

【発明の実施の形態】

ダイオードレーザの光線のプロフィールは流路を横切りいくつかのピークと谷
を有する測定装置の流路に沿ったガウス型であることが観察された。図５に示す
方法により、光線のプロフィールのピークと谷部を流路に沿うように光線のプロ
フィールのガウス型部分を流路を横切るように向けてレーザダイオードを置いた
。念のために、図５の矢印は流路の方向を示す。例えばこれらの光線のプロフィ
ールの配向を得るために、任意に、レーザダイオードは図２ａに示されるような
ガウス型光線のプロフィールが流路に沿っている向きから９０゜回転される。念
のために、図２ａの矢印は流路の方向を示す。予期せずそして好都合なことに、
得られた光線は、流路に沿ってそして流路を横切っての両者にガウス型であるア
ルゴンイオンレーザと実質的に同じ軸離間特性を発揮した。得られた光線の光線
のプロフィールを図６に例として示す。特に参照番号２０は流路を横切った光線
のプロフィールを示し、参照番号２２は流路に沿った光線のプロフィールを示す
。

【００５０】 高周波成分の存在にも拘わらず、流動細胞光度測定法で使用される実質的に均
一な標準ミクロスフィアは、実質的にまたは精確に光線のプロフィール２２の複
合波形を再現することが発見された。また、光線のプロフィール２２に対する反
射波形は、関連する蛍光放射波形に実質的にまたは精確に同じであることが発見
された。

【００５１】 図７に、一例として、本発明による測定装置を示す。例えば、測定装置は標準
流れ分析装置を有する。標準レーザダイオード１００は、運転時に、標準流れセ
ル１１０中の流体流路に沿って流体流れを貫通して光線を放射する。レーザダイ
オード１００は、その光線のプロフィールが流れセル１１０の流路を横切ってガ
ウス型であり流路に沿って任意の未知のプロフィールとなるように置かれる。他
の方法として、レーザダイオードは、その光線のプロフィールが流れセル１１０
の流路を横切ってガウス型であり流路に沿って任意の未知のプロフィールとなる
ように置かれることが可能な標準の光源に任意に置き換えることができる。任意
に、測定装置はそのような光源を有する標準装置を有する。

【００５２】 反射した光および／または蛍光放射は、一つ以上の標準光学的検知器１２０、
１２２、１２４、１２６、１２８により検知される。任意に光学的検知器は、一
つ以上の蛍光分析用の標準光学的検知器１２０、１２２、１２４を有する。加え
て、または他の方法として、任意に光学的検知器は標準側部散乱検知器１２６お
よび／または標準前部散乱検知器１２８を有する。

【００５３】 光学的検知器１２０、１２２、１２４、１２６、１２８の出力は、一つの標準
Ａ−Ｄ変換器１４０または各光学的検知器用のそれぞれのＡ−Ｄ変換器により任
意に処理される。各Ａ−Ｄ変換器１４０の出力は、一つ以上の標準デジタル信号
プロセッサ１５０または他の標準データ処理装置に入力される。

【００５４】 この瞬間測定装置は、任意に標準二色性ミラーのような一つ以上のビームスプ
リッタ１３０、１３２を有し反射光および／または蛍光放射光を一つ以上の上記
光学的検出器に導く。任意に、瞬間測定装置の小型化を容易にするために、一つ
以上の標準ミラー１６０、１６２が好都合に使用され光をビームスプリッタ１３
０、１３２およびまたは光学的検知器１２０、１２２、１２４、１２６、１２８
に導く。

【００５５】 図示したように、この発明において反射光および放射光はアバランシェフォト
ダイオード（ＡＰＤ）、標準光電子増倍管、そして標準ｐ−ｉ−ｎフォトダイオ
ード等の標準光学的検知機１２０、１２２、１２４、１２６、１２８により測定
される。例えば、ＡＰＤｓの出力は、任意に、連続的に電圧に変換され、それは
、次いで、任意のデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）１５０の制御の下で任意の
Ａ−Ｄ変換器１４０により測定される。

【００５６】 例えば、この発明の運転の方法は図８を参考にして記載される。測定装置のレ
ーザダイオードの光線のプロフィールに関連するテンプレートを作る。図に示し
たように、その主要軸に沿ったレーザダイオードの光線のプロフィールを表現す
る複合波形の像をテンプレートとしてＤＳＰのメモリー中に保存する。例えば、
ステップＳ１０において、レーザダイオード１００は、その光線のプロフィール
が測定装置の流路を横切ってガウス型になり流路に沿っては任意に未知のプロフ
ィールになるように置かれる。ステップＳ２０において、一つ以上の蛍光染料の
１００％の濃度の一つ以上の均一なサイズの参照ミクロスフィアが流路に沿って
流れセル１１０中を通されるそしてレーザダイオードの光線を受ける。ステップ
Ｓ３０において、一つ以上の参照イベントが各ミクロスフィアに対してＸ軸に時
間単位をＹ軸に蛍光強度の単位を有する二次元グラフ上にプロットされる。明白
に軸は逆にされる。ステップＳ４０において、レーザダイオード１００に対する
テンプレートは参照イベントの一連の時間合わせされた蛍光強度ののプロット平
均値を有するように決められる。

【００５７】 ステップＳ５０において、蛍光参照イベントが測定装置を使用して捕捉される
。例えば、流れセル１１０中を流れる生物学的サンプル中の関心の分析物に特有
の反応物でコーティングされたミクロスフィアは、レーザダイオード１００の光
線を通過する。ミクロスフィアは参照ミクロスフィアに使用されたのと同じ一つ
以上の蛍光染料を有する。通過するミクロスフィアは、サンプルイベントの複合
波形の高周波成分を記録するのに充分な非常に速い速度でサンプリングされる。
念のためレーザダイオードの光線を通過する各ミクロスフィアのために、一つ以
上のサンプルイベントは任意にそのために処理され、そのことにより本発明によ
り行われる分析の精度は向上することを理解するべきである。さらにミクロスフ
ィアを上記したが、励起された上で、例えばレーザダイオード等の光源の光線の
プロフィールの写しを実質的に作る蛍光放射強度プロットを有する標準蛍光団は
この発明に有利に適して使用される。

【００５８】 ステップＳ６０において、サンプルイベントは時間的に位置合わせされるまた
はテンプレートの上に重ねられる。例えば、最少二乗フィット法を使用してイベ
ントとテンプレートを時間的に位置合わせする。ステップＳ７０において、サン
プルイベントは標準化されテンプレートと比較される。ステップＳ８０において
、標準化されたサンプルイベントは積分されてサンプル中の総蛍光量が決定され
る。この方法により、一例として、８０％の蛍光染料の濃度を有するミクロスフ
ィアはサンプルサンプルイベントを生成しそれにより時間軸に沿っての全ての点
はテンプレートに対して８０％の蛍光強度を有する。

【００５９】 任意に、比較のために例えば異なるサイズのビーズおよび／または異なる流速
を表す一つ以上のテンプレートが保存される。任意に、サンプル曲線とテンプレ
ートの間に良好な適合がない場合イベントは拒否される。良好な適合があった場
合、選択されたテンプレートは他のチャンネルに適用される。標準化因子は、例
えば散乱および／または蛍光強度の一次関数である。

【００６０】 この波形釣り合い機械を使用することにより、流れ分析装置は一つ以上のダイ
オードレーザを使用し１００，０００ドルの標準装置によって得られるのと同じ
信頼性のある測定を達成することができることが判明した。図解の方法により、
この低コスト装置には沢山の特にビーズベースの分析の分野における応用がある
。

【００６１】 図１０はこの発明のコンピュータを備えた実施態様によるコンピュータ処理を
行うための主中央処理ユニットの図である。ここで記載される手続きは、例えば
、コンピュータまたはコンピュータのネットワークで実行されるプログラム手続
きにに特有の言葉で示される。

【００６２】 図９において外から見ると、参照番号９００で示されるコンピュータシステム
はディスクドライブ９０４と９０６を有するコンピュータ９０２を有する。ディ
スクドライブ指示番号９０４と９０６はコンピュータシステムにより収容される
ディスクドライブの数の記号である。通常、これらはフロッピーディスクドライ
ブ９０４、ハードディスクドライブ（外側からは見えない）とスロット９０６で
示されるＣＤ−ＲＯＭドライブである。通常は、ドライブの数と型は異なったコ
ンピュータの形により異なる。ディスクドライブ９０４と９０６は実際に選択的
であり、空間を考慮して、ここで記載する製造プロセス／装置に関連してコンピ
ュータシステムから容易に除くことができる。

【００６３】 コンピュータシステムは、また、情報が表示される選択的なディスプレーを有
する。いくつかの場合、キーボード９１０とマウス９０１を中央処理ユニット９
０２を操作する入力装置として有する。次いで再度、携帯性を向上するためにキ
ーボード９１０は機能が制限されたキーボードかまたは完全に除かれる。加えて
、マウス９１２は任意にタッチパッド制御装置またはトラックボール装置である
か、同様に完全に除かれる。加えて、コンピュータシステムは、また任意に、以
下に述べるように赤外線信号を送信および／または受信するための少なくとも一
つの赤外線発信器および／または赤外線受信器を有する。

【００６４】 図１０は図９のコンピュータシステム９００の内部ハードウエアのブロック図
である。バス９１４はコンピュータシステム９００の他の要素を接続する主情報
ハイウエーとして働く。ＣＰＵ９１６はプログラムを実行するのに必要な計算と
論理的作業を実行する中央処理ユニットである。リードオンリーメモリ（ＲＯＭ
）９１８とランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）９０２はコンピュータの主メモリ
ーを構成する。ディスク制御装置９２２はシステムのバス９１４に一つ以上のデ
ィスクドライブを接続する。これらのディスクドライブは、例えば９０４のよう
なフロッピーディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭまたは９０６のようなＤＶＤ
（デジタルビデオディスク）ドライブまたは内部または外部ハードドライブ９２
４である。前記したように、これらの色々なディスクドライブとディスク制御装
置は選択的な装置である。

【００６５】 ディスプレーインターフェース９２６はディスプレー９０８を接続しバス９１
４からの情報をディスプレー９０８に表示することを可能にする。再度記載した
ように、ディスプレー９０８はまた選択的な付属品である。例えば、ディスプレ
ー９０８は置き換えられるまたは除かれる。外部装置との通信のために、例えば
、ここで記載されている装置の構成要素は通信ポート９２８を使用することが起
こる。例えば、光ファイバーおよび／または電気ケーブルおよび／または導線お
よび／または光学的通信（即ち赤外線等）および／または無線通信（即ちラジオ
周波数（ＲＦ）等）を外部装置と通信ポートの間の伝送媒体として使用すること
ができる。周辺インターフェース９３０はキーボード９１０とマウス９１２を接
続し、入力データをバス９１４に伝送することを可能にする。コンピュータの標
準構成要素に加えて、コンピュータはまた任意に赤外線発信器および／または赤
外線受信器を有する。赤外線発信器は、データを赤外線信号発信器により発信／
受信する一つ以上の処理構成要素／ステーションと同時にコンピュータシステム
が使用されるとき任意に使用される。赤外線発信器または赤外線受信器を使用す
る変わりに、コンピュータシステムは、任意に、低電力ラジオ発信器および／ま
たは低電力ラジオ受信器をし要する。低電力ラジオ発信器は製造工程で受けられ
る構成要素により受けられるための信号を発信し、そして低電力受信器を介して
構成要素から信号を受ける。低電力ラジオ発信器および／または受信器は産業界
において標準的な装置である。

【００６６】 図１１に図９と１０に示すディスクドライブと使用することができるメモリー
媒体９３２を例として示す。通常は、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭまたは
デジタルビデオディスク等のメモリー媒体は、例えば、コンピュータがここに述
べる機能を実行するのを可能にするためのコンピュータを制御するためのシング
ルバイト言語とプログラム情報用のマルチバイトローカルを内蔵している。他の
方法として、図９と１０に示すＲＯＭ９１８および／またはＲＡＭ９２０は、ま
た、製造工程に関連した作業を実行するために中央処理ユニット９１６を指示す
るのに使用されるプログラム情報を保存するのに使用される。

【００６７】 コンピュータシステム９００は単一の処理装置、単一のハードディスクドライ
ブと単一のローカルメモリを有するように図示されているが、システム９００は
、任意に、適して複数のまたは組合せの処理装置または保存装置を有することが
できる。コンピュータシステム９００は、実際上、この発明の原理により作動で
きる高級計算機、ハンドヘルド、ラップトップ／ノートブック、ミニ、大型コン
ピュータ、スーパーコンピュータおよびそれらの組合せのネットワークの処理シ
ステムを含む適した処理システムに置き換えるまたは処理システムと組み合わせ
ることができる。

【００６８】 従来の処理システム構成については、「コンピュータ機構と構成」 ウィリア
ム ストーリング著 マクミラン出版（株）（第３版 １９９３）により詳細に
記述されている。従来の処理システムネットワークデザインについては、「デー
タネットワークデザイン」 ダーレン Ｌ．スポーン著 マックグロー−ヒル（
株）（１９９３）により詳細に記述されている。そして従来のデータ通信につい
ては、「データ通信原理」 Ｒ．Ｄ．ギトゥリン、Ｊ．Ｆ．ヘイズおよびＳ．Ｂ
．ウェインスタイン著 プリーナム出版（１９９２）およびザ 「テレコミュニ
ケーションに関するアーウィンハンドブック」 プリンシプルズ ジェームス
ヘンリー グリーン著 アーウィン プロフェッショナル 出版（第二版 １９
９２）により詳細に記述されている。前記出版物はここに参考文献として引用さ
れている。他の方法として、ハードウエアの構成は、例えば、さらにコンピュー
タの効率を上げるために多重指示多重データ（ＭＩＭＤ）多重処理フォーマット
により整えることもできる。コンピュータの構成のこの形態については、例えば
、米国特許第５，１６３，１３１号ボクサー、Ａ、バスが無い場合、ＩＥＥＥ
スペクトラム １９９５年２月号４１−４５ｐバラッソ，Ｌ．Ａ．他、ＲＰＭ：
多重システム用ラピッド プロトタイピングエンジン，ＩＥＥＥ コンピュータ
１９９５年２月号２６−３４ｐに詳細に開示されている。それらは全てここに
参考文献として引用されている。他の好ましい実施態様において、上記処理装置
、特にＣＰＵ９１６は、ＰＡＬｓ（プログラマブルアレイロジック）、ＰＬＡｓ
（プログラマブルロジックアレイ）、ＤＳＰｓ（デジタル信号プロセッサ）、Ｆ
ＰＧＡｓ（書替え可能ゲートアレイ）、ＡＳＩＣｓ（特定用途向けＩＣ）、ＶＬ
ＳＩｓ（超ＬＳＩ）等のプログラム可能な論理装置を含む他の適した処理回路に
置き換えるまたは処理回路と組み合わせることができる。

【００６９】 本発明の多くの特徴と利点は詳細な説明から明らかであり、そして、本発明の
本当の精神と範囲に入る本発明の全てのそのような特徴と利点を網羅することは
添付のクレームによって意図される。さらに多くの修正態様と変更態様は当業者
には容易に想到できるので、発明を図示されたおよび記述された構成および作用
に限定することは望ましくなく、したがって、全ての適した修正態様と相当する
態様は本発明の範囲に入ると訴えられるであろう。

【図面の簡単な発明】

【図１】 従来技術の流動細胞光度測定装置のブロック図である。

【図２ａ】 矢印で示される測定装置の流路に沿った標準ダイオードレーザのサンプルガウ
ス型光線のプロフィールである。

【図２ｂ】 標準アルゴンレーザのサンプル光線のプロフィールである。

【図３】 標準ダイオードレーザの光線のプロフィールの主要軸のグラフである。

【図４】 標準光線形成光学装置に掛けられた標準ダイオードレーザの光線のプロフィー
ルのグラフである。

【図５】 矢印で示される測定装置の流路を横切る標準ダイオードレーザのサンプル光線
のプロフィールである。

【図６】 ９０゜移動した同じダイオードレーザの光線のプロフィールの上に重ねられた
流路に沿った標準ダイオードレーザの光線のプロフィールである。

【図７】 本発明による実施態様のブロック図である。

【図８】 本発明による方法のフローチャートである。

【図９】 コンピュータおよび周辺機器の実施態様の図である。

【図１０】 本発明によるコンピュータの構成の実施態様の図である。

【図１１】 メモリー媒体の実施態様の図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 DA05 EA01 EA14 GA07 GB19 HA01 HA02 HA09 HA15 JA02 KA09 LA01 LA02 MA16 NA01 NA06 2G059 AA01 BB04 CC16 DD03 DD12 EE02 EE07 GG01 JJ02 JJ11 JJ12 JJ13 JJ22 KK01 KK02 KK03 MM01 MM03 MM10 NN10 PP04 PP06 【要約の続き】 総蛍光量が決定される。

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コンピュータと通信可能なそして流路と前記流路を横切るガ
   ウス型第一光線のプロフィールと前記流路に沿った第二の光線のプロフィールを
   有する光源を有する測定装置；そして コンピュータにより読み取り可能なそしてコンピュータにより実行可能なコン
   ピュータ指令を保存するメモリー媒体を有し、コンピュータ指令が （ａ）第二の光線のプロフィールを示すテンプレートを作ること； （ｂ）前記測定装置で測定した蛍光サンプルイベントを捕捉すること； （ｃ）サンプルイベントをテンプレートに時間的な位置合わせすること； （ｄ）サンプルイベントをテンプレートに対して標準化すること：および （ｅ）標準化したサンプルイベントを積分しサンプルイベント中の蛍光の総量
   を決定することからなる診断システム。
2. 【請求項２】 前記光源が光線を放射し、そして テンプレート作成指令が実質的に１００％濃度の少なくとも一つの蛍光染料を
   有する少なくとも一つのミクロスフィアを前記光線を通過させること、前記少な
   くとも一つのミクロスフィアに対して少なくとも一つの蛍光強度グラフをプロッ
   トすること；およびテンプレートを画定し少なくとも一つの蛍光強度グラフの平
   均を含めることからなり、テンプレートは単位時間当たりの蛍光強度の最大量を
   表すその下の領域を有することを特徴とする請求項１に記載の診断システム。
3. 【請求項３】 テンプレートが少なくとも一つのミクロスフィアのサイズお
   よび流速に関係することを特徴とする請求項１に記載の診断システム。
4. 【請求項４】 前記時間的な位置合わせ工程（ｃ）が位置合わせのための最
   少二乗法の適用を含むことを特徴とする請求項１に記載の診断システム。
5. 【請求項５】 前記測定装置が流れ分析装置を有することを特徴とする請求
   項１に記載の診断システム。
6. 【請求項６】 前記流れ分析装置が前記光源に光学的に接続された光線のプ
   ロフィール形成要素を有しないことを特徴とする請求項５に記載の診断システム
   。
7. 【請求項７】 前記光線のプロフィール形成要素が少なくとも一つのプリズ
   ム拡張器、微小レンズアレイと光線拡張器を有することを特徴とする請求項６に
   記載の診断システム。
8. 【請求項８】 前記光源がレーザダイオードを有し、前記レーザダイオード
   の光線のプロフィールが流路と位置合わせされた主要軸を有することを特徴とす
   る請求項５に記載の診断システム。
9. 【請求項９】 前記流れ分析装置がサンプルイベントに対する蛍光強度のピ
   ークを検知するためのピーク検知器を有しないことを特徴とする請求項５に記載
   の診断システム。
10. 【請求項１０】 コンピュータおよびそれに接続可能な第一の光線のプロフ
    ィールとそれを受ける流路を有する光源を有する測定装置とともに使用するコン
    ピュータプログラム製品であって、前記コンピュータプログラム製品は、コンピ
    ュータにより読み取り可能なそしてコンピュータにより実行可能なコンピュータ
    指令を保存するメモリー媒体を有し、コンピュータ指令が （ａ）流路に沿った第一の光線のプロフィールを示すテンプレートを作り、光
    源は流路を横切るガウス型の第二光線のプロフィールを有すること； （ｂ）前記測定装置で測定した蛍光サンプルイベントを捕捉すること； （ｃ）サンプルイベントをテンプレートに時間的な位置合わせすること； （ｄ）サンプルイベントをテンプレートに対して標準化すること：および （ｅ）標準化したサンプルイベントを積分しサンプルイベント中の蛍光の総量
    を決定することからなる、コンピュータプログラム製品。
11. 【請求項１１】 テンプレート作成指令が実質的に１００％濃度の少なくと
    も一つの蛍光染料を有する少なくとも一つのミクロスフィアを前記光線を通過さ
    せること；少なくとも一つのミクロスフィアに対して少なくとも一つの蛍光強度
    グラフをプロットすること；テンプレートを画定し少なくとも一つの蛍光強度グ
    ラフの平均を含めることからなり、前記テンプレートは単位時間当たりの蛍光強
    度の最大量を表すその下の領域を有することを特徴とする請求項１０に記載のコ
    ンピュータプログラム製品。
12. 【請求項１２】 テンプレートが少なくとも一つのミクロスフィアのサイズ
    および流速に関係することを特徴とする請求項１０に記載の診断システム。
13. 【請求項１３】 時間的な位置合わせ工程（ｃ）が位置合わせのための最少
    二乗法の適用を含むことを特徴とする請求項１０に記載のコンピュータプログラ
    ム製品。
14. 【請求項１４】 測定装置は第一の光線のプロフィールを有する光源とそれ
    を受ける流路を有することを特徴とする測定装置のレーザダイオードの光線のプ
    ロフィールを改良する方法であって、前記方法は、 （ａ）流路に沿った第一の光線のプロフィールを示すテンプレートを作り、光
    源は流路を横切るガウス型の第二光線のプロフィールを有すること； （ｂ）前記測定装置で測定した蛍光サンプルイベントを捕捉すること； （ｃ）サンプルイベントをテンプレートに時間的な位置合わせすること； （ｄ）サンプルイベントをテンプレートに対して標準化すること：および （ｅ）標準化したサンプルイベントを積分しサンプルイベント中の蛍光の総量
    を決定することからなり、。
15. 【請求項１５】 テンプレート作成指令が実質的に１００％濃度の少なくと
    も一つの蛍光染料を有する少なくとも一つのミクロスフィアを前記光線を通過さ
    せること；少なくとも一つのミクロスフィアに対して少なくとも一つの蛍光強度
    グラフをプロットすること；およびテンプレートを画定し少なくとも一つの蛍光
    強度グラフの平均を含めることからなり、テンプレートは単位時間当たりの蛍光
    強度の最大量を表すその下の領域を有することを特徴とする請求項１４に記載の
    方法。
16. 【請求項１６】 テンプレートが少なくとも一つのミクロスフィアのサイズ
    および流速に関係することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記時間的な位置合わせ工程（ｃ）が位置合わせのための
    最少二乗法の適用を含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
18. 【請求項１８】 光源がレーザダイオードを有する請求項１４に記載の方法
    。
19. 【請求項１９】 そこを通って流れることが可能なサンプルを有する流路を
    形成する流れセル； サンプルを照射するためのそして流路を横切るガウス型の第一の光線のプロフ
    ィールと流路に沿った第二の光線のプロフィールを有する少なくとも一つの光源
    からなる流れ分析装置。
20. 【請求項２０】 前記第二の光線のプロフィールが非ガウス型光線のプロフ
    ィールを有することを特徴とする請求項１９に記載の流れ分析装置。
21. 【請求項２１】 流れ分析装置が前記少なくとも一つの光源に光学的に接続
    される光線形成光学的要素またはアッセンブリを有しない請求項１９に記載の流
    れ分析装置。
22. 【請求項２２】 前記流れ分析装置がサンプルイベントに対して蛍光強度の
    ピークを検知するためのピーク検知器を有しないことを特徴とする請求項１９に
    記載の流れ分析装置。
23. 【請求項２３】 さらに前記少なくとも一つの光源と前記流れセルに接続さ
    れた少なくとも一つの光学的検知器を有する請求項１９に記載の流れ分析装置。
24. 【請求項２４】 前記少なくとも一つの光学的検知器がアバランシェフォト
    ダイオード、光電子増倍管およびｐ−ｉ−ｎフォトダイオードの一つを有するこ
    とを特徴とする請求項１９に記載の流れ分析装置。
25. 【請求項２５】 さらに、それぞれの光学的検知器と連通する少なくとも一
    つのＡ−Ｄ変換器；と 前記少なくとも一つのＡ−Ｄ変換器を制御する少なくとも一つのデジタル信号
    プロセッサを有することを特徴とする請求項２３に記載の流れ分析装置。
26. 【請求項２６】 前記少なくとも一つの光源が少なくとも一つのレーザダイ
    オードを有することを特徴とする請求項１９に記載の流れ分析装置。
27. 【請求項２７】 少なくとも一つの光源と流路を形成する流れセルを有する
    流れ分析装置において、少なくとも一つの光源を流路に対して方角を合わせて、
    少なくとも一つの光源が流路を横切るガウス型の第一光線のプロフィールと流路
    に沿った非ガウス型の第二の光線のプロフィールを有するようにすることからな
    る光線のプロフィール特性を改良する方法。
28. 【請求項２８】 前記流れ分析装置が少なくとも一つの光源に光学的に接続
    された光線形成要素またはアセンブリを有しないことを特徴とする請求項２７に
    記載の方法。
29. 【請求項２９】 少なくとも一つの光源が少なくとも一つのレーザダイオー
    ドを有することを特徴とする請求項２７に記載の方法。