CN105555971B - 用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针 - Google Patents

Abstract

提供了用于检测和定量核酸的方法和组合物。在某些实施方案中，方法涉及采用包含与报告基团相连之非天然核苷酸的引物或探针。通过互补探针或引物的聚合来检测靶核酸，所述互补探针或引物整合与淬灭基团连接的同源非天然核苷酸。

Description

用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针

本申请要求于2013年8月9日提交的美国临时申请序列No.61/864.128的优先权权益，通过引用将其全部内容并入本文。

发明背景

1.技术领域

本发明一般性涉及分子生物学领域。更特别地，其涉及核酸的检测。

2.背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因克隆、亲子鉴定和DNA计算。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点(end-point)或者平台期进行DNA检测，这使得难以对起始模板进行定量。实时PCR或动态PCR通过记录反应过程中的扩增子浓度，从而提高了终点PCR分析的能力。最通常通过与被扩增的靶标有关的荧光信号的改变来记录扩增子浓度。实时PCR相对于终点检测的优势还在于，由于其在封闭的系统中进行，因此限制了污染。其它优势包括更高的灵敏度、动态范围、速度和需要较少的过程。

在实时PCR检测方法中已经采用了几种测定化学。这些测定化学包括采用双链DNA结合染料、双标记的寡核苷酸，例如发夹引物和发夹探针。然而，目前实时PCR的一个缺陷在于其受限的多重性(multiplexing)能力。目前的实时PCR技术采用在溶液中游离的报告荧光染料。在多重反应中，该设计必须在每个测定中采用光谱不同的荧光色素。例如，设计来检测4个靶序列的多重反应将需要能够通过光谱不同来区分4个不同的、游离漂浮的荧光色素的仪器，这还不包括对照。这些要求不仅限制了实际的多重能力，而且增加了成本，其原因在于这样的设备通常需要多个发射源、检测器和滤器。目前的实时PCR技术的多重能力为大约1-6重(plex)。

发明概述

本发明涉及用于DNA扩增和检测的系统和方法。特别是，本发明提供的系统和方法极大地提高了实时核酸扩增(例如经PCR)的多重能力。

在一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与第一引物组接触，所述第一引物组包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团(reporter)；(ii)具有已知熔链点(melt point)的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列；(b)用所述第一引物组扩增所述靶核酸，其中在用淬灭基团(quencher)标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第一引物上报告基团的信号改变(例如信号淬灭)来检测所述靶核酸分子的存在。

因此，在一个更特定的实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其包括：(a)将所述样品与至少第一和第二引物组接触，每组引物包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列，其中所述第一和第二引物组的报告基团相同，并且其中所述第一和第二引物组包含具有可区分熔链点的发夹；(b)用所述第一和第二引物组扩增所述靶核酸(以获得扩增产物)，其中在用淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一和第二引物组之第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第一或第二引物组之第一引物上的报告基团的信号改变来检测靶核酸分子的存在；以及(d)改变所述样品的温度并确定对应于所述报告基团未淬灭时的熔链点或熔链峰(melt peak)，来确定第一靶核酸分子、第二靶核酸分子或两者的存在是否导致所述报告基团的信号淬灭，由此检测所述第一和第二靶核酸分子的一个或两者的存在(例如，基于所述第一和第二引物组的发夹的可区分熔链点)。

在某些方面，该实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接在所述第一引物5’端的荧光团。因此，在一些情况下，信号的改变可以是荧光信号的降低。在另一方面，检测所述第一引物上报告基团的信号改变还包括与扩增产物杂交，所述扩增产物包含报告基团和淬灭基团(例如暗淬灭基团(dark quencher))。

在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或者降低至低于)所述样品中一个或更多个引物之发夹的熔链点。当存在两个或更多个引物组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品温度从低于第一和第二引物组之两个第一引物的发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹的熔链点的温度。

实施方案的某些方面涉及采用至少一个非天然核苷酸。在一些方面，非天然核苷酸为异碱基(isobase)，例如异鸟嘌呤(isoG)或异胞嘧啶(isoC)。在该方面，淬灭基团标记的非天然核苷酸为同源isoC(或isoG)。在另一些方面，第一和/或第二引物的至少一个在靶特异性序列中包含至少一个非天然核苷酸。例如，在某些方面，靶特异性序列中的非天然核苷酸调节序列特异性退火，由此增强了核苷酸的序列特异性扩增的引物-模板杂交(参见例如PCT公开WO2011/052078，通过引用并入本文)。

在另一方面，所述实施方案的方法还包括：(a)将样品与第二(或其它)引物组接触，所述第二(或其它)引物组包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与第二(或其它)靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第二(或其它)靶核酸第二链上的区域互补的序列；(b)用第二引物组扩增所述第二靶核酸(以获得扩增产物)，其中在用淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第二(或其它)引物组之第一引物上报告基团的信号改变，来检测所述第二(或其它)靶核酸分子的存在。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二引物组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二引物组可以包含相同报告基团，以及在一些情况下，所述第一和第二引物组包含具有可区分熔链点的发夹(例如熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。

在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将所述样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组接触，每组引物包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核酸，和(v)靶特异性序列，其与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第三、第四、第五或第六靶核酸第二链上的区域互补的序列；(b)用所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组扩增所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸，以获得扩增产物，其中在用淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一引物的非天然核苷酸碱基配对；(c)通过检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组的第一引物上报告基团的信号改变，来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸的存在。在一方面，所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组中各自可以包含可区分的报告基团或具有可区分熔链点的发夹。因此，在另外一些方面，根据实施方案的多重方法可以包括采用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多不同引物组，其中每个引物组包含(1)包含具有可区分熔链点的发夹的第一引物，或(2)可区分的报告基团，以使得每个不同引物组的信号可以被单独分辨。

在另一些方面，根据实施方案的至少一组引物包含第二引物，所述第二引物包含至少一个报告基团标记的非天然核苷酸(例如，以提供所述引物组的第二报告基团信号)。例如，至少一组引物可包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列和至少一个报告基团标记的非天然核苷酸，其中所述引物产生的扩增子的熔链点可与所述第一引物发夹的熔链点区分开。可替换地，或者另外地，所述第二引物可以包含这样的序列，所述序列具有至少一个报告基团标记的非天然核苷酸，其中所述报告基团不同于所述第一引物的报告基团。因此，当温度改变至(1)高于所述第一引物发夹的熔链点时和(2)高于所述引物所产生的扩增子的熔链点时，这样的引物组会产生可分辨的信号改变。这样的其它信号可以进一步确认靶核酸分子的存在。

由此，在另一个实施方案中提供了组合物，其包含根据实施方案的至少第一引物组。例如，引物组可包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰(其可以形成部分发夹)；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列。在某些方面，根据实施方案的引物组的第二引物包含至少一个报告基团标记的非天然核苷酸。在一些方面，所述组合物还包含淬灭基团标记的非天然核苷酸、聚合酶、参照探针、参照样品和/或游离核苷酸。

在另一方面，组合物还包含第二(或其它)引物组，所述第二(或其它)引物组包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与第二靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第二靶核酸第二链上的区域互补的序列。在某些方面，所述第一和第二引物组包含可区分的报告基团和/或具有可区分熔链点的发夹。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多不同引物组。

在另一方面，提供了试剂盒，其包含(a)第一引物组，其包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列；和(b)淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一方面，所述试剂盒至少包含二、三、四、五或六个不同引物组。在某些方面，所述引物组包含可区分的报告基团或具有可区分熔链点的发夹。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸或试剂盒的使用说明。

在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：将所述样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员(例如报告基团)标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列(mirrored tag sequence)；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接(T-junction)；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员(例如淬灭基团)标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物(label)的信号改变来检测所述靶核酸。例如，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针互补的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列，例如与所述下游探针的标签序列互补。在另一些方面，所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列。因此，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基(例如，至少3，4，5，6，7，8或9个碱基)的3’序列。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探针的熔链点低于60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50℃。

因此，在一个更特定的实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其包括(a)使所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变(例如，基于第一和第二探针组发夹探针的可区分熔链点)来检测所述第二靶核酸。例如，可以顺序检测或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含相同报告基团，以及在一些情况下，所述第一和第二引物组形成具有可区分熔链点的发夹(例如，熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。

在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)探针组接触，每组探针包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变，来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸。在一些方面，实施方案的多重方法包括具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分报告基团的探针组，和/或形成具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分熔链温度的发夹探针的探针组。因此，在一些方面，实施方案的多重方法可以用于检测(例如，在同一反应中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个不同靶核酸序列。

在某些方面，本实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接至所述第一探针(例如在5’端)的荧光团。因此，在一些情况下，信号改变可以为荧光信号的降低。

在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或者改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或降低至低于)样品中一个或更多个探针的发夹的熔链点。当两个或更多个探针组存在的情况下，改变样品的温度可以包括将样品的温度从低于第一和第二探针两者之发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹探针的熔链点的温度。

因此，在另一个实施方案中，提供包含第一探针组的组合物，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。

在另一方面，组合物还包含第二(或其它)探针组，所述第二(或其它)探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在某些方面，所述第一和第二探针组包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的探针组。

在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；以及(b)报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一方面，所述试剂盒至少包含两个、三个、四个、五个或六个可区分的探针组。在某些方面，所述探针组包含可区分的报告基团或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸，或试剂盒的使用说明。

在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与第一探针组接触，所述第一探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，从而形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及(d)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针互补(例如与所述下游探针的标签序列互补)的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列。在另一些方面，所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列并至少包含第一未标记的非天然核苷酸。因此，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探针的熔链点低于60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50℃。

因此，在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其还包括：(a)使所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及(d)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸(例如，基于第一和第二探针组发夹探针的可区分熔链点)。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含相同报告基团，在一些情况下，所述第一和第二探针组形成具有可区分熔链点的发夹探针(例如熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。

在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)探针组接触，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其至少包含第一报告基团标记的非天然核苷酸；和(ii)与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上镜像标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及(d)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸。在一些方面，实施方案的多重方法包括具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分报告基团的探针组，和/或形成具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分熔链温度的发夹探针的探针组。因此，在一些方面，实施方案的多重方法可以用于检测(例如，在同一反应中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个不同靶核酸序列。

在某些方面，本实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接所述第一探针(例如在5’端)的荧光团。因此，在一些情况下，信号的改变可以是荧光信号的降低。

在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或者降低至低于)所述样品中一个或更多个探针的发夹的熔链点。当存在两个或更多个引物组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品温度从低于第一和第二探针两者的发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹探针的熔链点的温度。

因此，另一个实施方案提供了组合物，其包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。

在另一方面，组合物还包含第二(或其它)探针组，所述第二(或其它)探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在某些方面，所述第一和第二探针组包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的探针组。

在另一个实施方案中，提供试剂盒，其包含：(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；和(b)报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一方面，所述试剂盒至少包含两个、三个、四个、五个或六个可区分的探针组。在某些方面，所述探针组包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸或试剂盒的使用说明。

在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)经报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的发夹标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针；(c)使所述上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针互补(例如与所述下游探针的标签序列互补)的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列。在另一些方面，所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸。因此，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9个碱基)的3’序列。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探针的熔链点低于60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50℃。

因此，在另一个实施方案中提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其还包括：(a)将所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的发夹标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸(例如，基于第一和第二探针组发夹探针的可区分熔链点)。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含相同的报告基团，在一些情况下，所述第一和第二探针组形成具有可区分熔链点的发夹探针(例如，熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。

在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)探针组接触，每组探针包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的发夹标签序列互补的序列，并形成延伸的上游探针；(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及(e)通过检测所述上游探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸。在一些方面，实施方案的多重方法包括具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分报告基团的探针组，和/或形成具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分熔链温度的发夹探针的探针组。因此，在一些方面，实施方案的多重方法可以用于检测(例如，在同一反应中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个不同靶核酸序列。

在某些方面，本实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接在所述第一探针(例如在5’端)的荧光团。因此，在一些情况下，信号的改变可以是荧光信号的降低。

在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或者降低至低于)所述样品中一个或更多个探针的发夹的熔链点。当存在两个或更多个引物组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品温度从低于第一和第二探针两者的发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹的熔链点的温度。

因此，另一个实施方案提供了包含第一探针组的组合物，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。

在另一方面，组合物还包含第二(或其它)探针组，所述第二(或其它)探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在某些方面，所述第一和第二探针组包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的探针组。

在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含：(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少第一非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含标签序列和所述标签序列之反向互补序列的发夹标签，以使得所述序列形成发夹；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；以及(b)报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一方面，所述试剂盒至少包含两个、三个、四个、五个或六个可区分的探针组。在某些方面，所述探针组包含可区分的报告基团或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸，或试剂盒的使用说明。

在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)将所述样品与至少第一引物组接触，所述第一引物组包含第一引物，其从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第一链上的区域互补的序列；(b)用所述引物扩增所述靶核酸，以产生扩增的样品；(c)将所述扩增的样品与探针接触，所述探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述探针，所述非天然核苷酸能够与所述第一引物中的至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对，以形成延伸的探针；以及(e)使所述延伸的探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)通过检测所述探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在某些方面，所述探针还包含(iii)位于所述标签序列和与所述靶核酸第一链上之第一区域互补的序列之间的聚合酶延伸阻断修饰。

因此，在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其还包括：(a)将所述样品与至少第二引物组接触，所述第二引物组包含第一引物，其从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与第二靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第二靶核酸第一链上的区域互补的序列；(b)用所述引物扩增所述靶核酸，以生成扩增的样品；(c)将所述扩增的样品与第二探针接触，所述第二探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述探针，所述非天然核苷酸能够与所述第一引物中的至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对，以形成延伸的探针；以及(e)使所述延伸的探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)通过检测所述探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸(例如，基于第一和第二探针之发夹探针的可区分熔链点)。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含相同的报告基团，在某些情况下，所述第一和第二探针组形成具有可区分熔链点的发夹探针(例如，熔链点相互之间差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范围)。

第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)。

在另一方面，所述方法为多重方法，其还包括：(a)将样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)引物组接触，所述引物组包含第一引物，其从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的区域互补的序列；(b)用所述引物扩增所述靶核酸，以产生扩增的样品；(c)将所述扩增的样品与第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)探针接触，所述探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述探针，所述非天然核苷酸能够与所述第一引物中的至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对，以形成延伸的探针；以及(e)使所述延伸的探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)通过检测所述探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范围)靶核酸。在一些方面，实施方案的多重方法包括具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分报告基团的探针，和/或形成具有一个、二个、三个、四个、五个或六个可区分熔链温度的发夹探针的探针。因此，在一些方面，实施方案的多重方法可以用于检测(例如，在同一反应中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个不同靶核酸序列。

在某些方面，本实施方案中使用的报告基团可以为荧光团，例如连接至所述探针(例如在5’端)的荧光团。因此，在一些情况下，信号改变可以为荧光信号的降低。

在另一些方面，检测报告基团的信号改变可以包括检测信号的改变(或者改变速率)，例如当样品温度改变时信号未淬灭。在一方面，样品温度可以提高至高于(或降低至低于)样品中一个或多个探针的发夹的熔链点。当存在两个或更多个探针组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品的温度从低于第一和第二探针两者发夹的熔链点的温度提高至高于两个发夹探针的熔链点的温度。

因此，在另一个实施方案中，提供了包含第一引物的组合物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第一链上的区域互补的序列；和探针，所述探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列。

在另一方面，组合物还包含第二(或其它)引物组和探针，所述第二(或其它)引物组包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与第二靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第二靶核酸第一链上的区域互补的序列；和第二探针，其从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列。在某些方面，所述第一和第二(或其它)探针包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的探针。

在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含(a)第一引物组，其包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)包含至少一个未标记的非天然核苷酸的标签序列；和(ii)靶特异性序列，其与靶核酸第二链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第一链上的区域互补的序列；(b)探针，所述探针从5’至3’包含，(i)与所述第一引物的标签序列相同的标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和(c)报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。在某些方面，所述探针包含可区分的报告基团或形成具有可区分熔链点的发夹探针。在一些方面，所述试剂盒还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸，或试剂盒的使用说明。

在另一个实施方案中，提供了用于检测至少第一靶核酸之存在的方法，其包括：(a)将样品与第一靶特异性引物-探针组接触，所述引物-探针组包含：(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，其中所述第一和第二测定探针的一个标记有报告基团，而另一个标记有淬灭基团；(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将所述样品与所述靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将所述标签序列从所述靶特异性探针释放；(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；(e)沿着所述第一测定探针延伸杂交的标签序列，并切割与所述第一测定探针杂交的所述第二测定探针；(f)通过检测所述第一或第二测定探针上报告基团信号的改变(例如未淬灭)来至少检测第一靶核酸。在某些方面，检测报告基团的信号改变包括检测对应于测定探针的熔链峰的减少或消除，这指示了所述第二测定探针被切割，并指示了所述靶核酸的存在。在另一些方面，所述引物-探针组之组分(i)-(iv)的一个或更多个分别与样品接触。例如，可以在所述靶特异性引物和/或探针之后添加所述第一或第二测定探针。在某些方面，所述报告基团可以为荧光团，信号改变可以为荧光信号的未淬灭。在一些方面，所述第一和/或第二测定探针至少包含第一非天然核苷酸，例如isoG和/或isoC。在某些方面，所述第一测定探针的第二区域包含2至5个非天然核苷酸，而所述第二测定探针包含与所述第一测定探针的2至5个非天然核苷酸碱基配对的2至5个非天然核苷酸。在另一些方面，所述第一测定探针的至少第一非天然核苷酸标记有报告基团，所述第二测定探针的至少第一非天然核苷酸标记有淬灭基团(或反之)。在一些优选方面，所述第一测定探针的每个非天然核苷酸标记有报告基团，所述第二测定探针的每个非天然核苷酸标记有淬灭基团(或反之)。

在某些方面，所述第一和第二测定探针具有已知熔链点，并且检测报告基团的信号改变包括样品温度改变时检测报告基团的信号改变。在某些方面，样品的温度可以提高至高于(或降低至低于)所述第一和第二测定探针的熔链点，以观察报告基团的信号改变。

在另一方面，所述第一靶特异性探针包含与所述靶核酸第一链上的第二区域互补的序列，其长度为5、10、15、20、25、30至40、50、75、100、125、150、175或200个核苷酸。在一方面，所述5’标签序列的长度为6至50个核苷酸。

在另一些方面，根据实施方案的靶特异性引物-探针组之第一测定探针的第二区域包含聚合酶延伸-阻断修饰。因此，当延伸所述靶特异性探针的标签序列时，第二测定探针只有一部分被切割，这导致了所述第一和第二测定探针之间的熔链点发生改变。所观察到的熔链点或熔链峰的这种改变可以用于检测靶核酸分子的存在。因此，在一些方面，至少检测第一靶核酸序列包括检测样品温度改变时报告基团(第一或第二测定探针上)的信号改变。

在一个特定方面，实施方案的方法包括检测第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的方法，其包括(a)将样品与至少第一和第二靶特异性引物-探针组接触，每个引物-探针组包含：(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，其中所述第一和第二测定探针的一个标记有报告基团，而另一个标记有淬灭基团；并且其中所述第一和第二测定探针具有已知熔链点，其中所述第一引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点可与所述第二引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点区分开；(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将所述样品与所述引物-探针组的靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将所述标签序列从所述靶特异性探针释放；(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；(e)沿着所述第一测定探针延伸杂交的标签序列，并切割与所述第一测定探针杂交的所述第二测定探针；(f)通过检测所述第一和/或第二引物-探针组的第一或第二测定探针上报告基团的信号未淬灭来检测靶核酸；以及(g)通过对所述第一和第二测定探针进行熔链曲线分析来确定所述第一靶特异性引物-探针组、第二靶特异性引物-探针组或两者的第二测定探针是否被切割，其中对应于特定第一和第二测定探针组之熔链峰的减少或消除指示了所述第二测定探针被切割，并且指示所述第一或第二靶核酸的存在。因此，在一些方面，顺序或基本同时检测所述第一和第二(或其它)靶核酸的存在。在另一方面，所述第一引物-探针组的报告基团与所述第二引物-探针组的报告基团相同。在某些方面，所述第一5’标签和第一抗标签报告基团探针(anti-tag reporter probe)的熔链点可与所述第二5’标签和第二抗标签报告基团探针的熔链点区分开。因此，在一些方面，实施方案的方法是多重方法，其包括采用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36个或更多个引物-探针组，以检测靶核酸分子，其中每个引物-探针组包含(1)可区分的报告基团或(2)具有可区分熔链点的第一和第二测定探针。在另一些方面，所述第一测定探针的第二区域至少包含第一非天然核苷酸(例如2至5个非天然核苷酸)，所述第二测定探针至少包含与至少所述第一测定探针的第一非天然核苷酸碱基配对的第一非天然核苷酸(例如与所述第一测定探针的非天然核苷酸碱基配对的2至5个非天然核苷酸)。

在某些方面，实施方案的第一测定探针包含聚合酶延伸阻断序列，例如一个或更多个非天然核苷酸位置。因此，在某些方面，提供了用于检测第一和第二靶核酸的一个或两者之存在的方法，其包括(a)将样品与至少第一和第二靶特异性引物-探针组接触，每个引物-探针组包含：(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域，所述第二区域包含聚合酶延伸-阻断修饰；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，所述第二区域包含延伸-阻断修饰，其中所述第一和第二测定探针的一个标记有报告基团，另一个标记有淬灭基团；(b)在适合于所述靶核酸杂交的条件下，将所述样品与所述引物-探针组的靶特异性引物和靶特异性探针一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶对杂交的靶特异性探针进行切割，以将所述标签序列从所述靶特异性探针释放；(d)将释放的标签序列与所述第一测定探针杂交；(e)沿着所述第一测定探针将杂交的标签序列延伸至延伸阻断序列，从而将与所述第一测定探针杂交的所述第二测定探针的一部分切割，其中在所述切割之后，所述第一和第二测定探针具有已知熔链点，并且其中在所述切割之后，所述第一引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点可与所述第二引物-探针的第一和第二测定探针的熔链点区分开；(f)通过对所述第一和第二测定探针进行熔链曲线分析来确定所述第一靶特异性引物-探针组、第二靶特异性引物-探针组或两者的第二测定探针是否被切割，由此检测靶核酸，其中对应于特定第一和第二测定探针组之熔链峰的温度迁移(shift)指示了所述第二测定探针被切割，并且指示所述第一或第二靶核酸的存在。因此，将第二测定探针的一部分(与所述延伸阻断序列互补的5’序列)切割之后，实现了所述测定探针的可区分熔链点。在一些方面，在切割所述第二测定探针(的一部分)之后，所述第一靶特异性引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点与所述第二靶特异性引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点相差2℃至10℃。在另一些方面，在切割所述第二测定探针之前，所述第一靶特异性引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点与所述第二靶特异性引物-探针组的第一和第二测定探针的熔链点相同。例如，除了聚合酶延伸-阻断修饰的位置之外，所述第一和第二靶特异性引物-探针组的第一测定探针的第二区域可以相同。在另一些方面，所述第一测定探针的第二区域至少包含第一非天然核苷酸(例如2至5个非天然核苷酸)，所述第二测定探针至少包含至少与所述第一测定探针的第一非天然核苷酸碱基配对的第一非天然核苷酸(例如与所述第一测定探针的非天然核苷酸碱基配对的2至5个非天然核苷酸)。

在另一方面，所述方法还包括将样品与靶特异性引物接触，所述靶特异性引物与靶核酸第二链上的区域互补。在一些方面，方法还可包括进行多重聚合酶链式反应循环。在一些方面，检测报告基团的信号改变包括在进行多重聚合酶链式反应循环之前、期间、或之后(或循环期间)检测信号。在另一方面，检测报告基团的信号改变包括仅在进行多重聚合酶链式反应循环之后检测信号。在该方面，所述方法还包括将所检测到的报告基团之信号与预定比相比较，所述预定比为所述报告基团的信号和非杂交探针上报告基团的参照信号的比。

在一些方面，实施方案的方法还包括对所述样品中靶核酸的量进行定量。例如，对所述样品中靶核酸的量进行定量包括：采用标准曲线；确定所述靶核酸的相对量；采用终点定量；或者通过将相对于背景可检测到信号的PCR循环数与存在的靶标量相关联，来确定所述靶核酸的量。

在另一个实施方案中，提供了包含实施方案的一个或多个引物-探针组的组合物。例如，组合物可以包含(i)引物，其与所述靶核酸第一链上的第一区域互补；(ii)靶特异性探针，其与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补，并且包含不与所述靶核酸互补的5’标签序列；(iii)第一测定探针，其包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域；和(iv)第二测定探针，其与所述第一测定探针的第二区域互补，其中所述第一测定探针或第二测定探针标记有报告基团，另一个标记有淬灭基团。在另一些方面，所述第一测定探针包含与所述靶特异性探针的标签序列互补的第一区域和位于所述第一区域下游的第二区域，所述第二区域至少包含第一非天然核苷酸；并且第二测定探针(iv)包含与所述第一测定探针的第二区域互补的序列，和至少与所述第一测定探针的非天然核苷酸碱基配对的第一非天然核苷酸，其中所述第一测定探针的非天然核苷酸或所述第二测定探针的非天然核苷酸标记有报告基团，另一个标记有淬灭基团。在某些方面，所述组合物还包含能够与所述测定探针的非天然核苷酸碱基配对的(未标记的)非天然核苷酸。在另一些方面，实施方案的测定探针包含2至5个非天然核苷酸。在一些方面，组合物还包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的靶特异性引物、具有核酸外切酶活性的聚合酶、参照探针、参照样品和/或游离核苷酸。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个可区分的引物-探针组。

在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含实施方案的一个或更多个引物-探针组。在另一方面，所述试剂盒还包含具有核酸外切酶活性的聚合酶、参照探针、游离核苷酸、游离非天然核苷酸、参照样品或试剂盒的使用说明。

在另一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)将样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，所述上游探针包含与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和下游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含具有报告基团的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在淬灭基团标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述下游探针的非天然核苷酸碱基配对；以及(c)通过检测所述下游探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。例如，在一些方面，所述上游探针包含与所述下游探针的标签序列互补的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基的3’序列(例如与所述下游探针的标签序列互补的3至10个碱基的3’序列)。在一些方面，所述上游探针的3’序列定义为与所述下游探针的标签序列具有互补序列，小于所述标签序列的全长。在某些方面，然而，在靶序列不存在下，所述上游和下游探针基本没有特异性杂交。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探针的熔链点低于55、50、45、40或35℃。在所述方法的另一方面，延伸所述上游探针包括合成与所述下游探针的标签序列互补的3’延伸，其包含淬灭基团标记的非天然核苷酸。

在本文中，T-连接是指当与靶序列杂交时上游和下游探针形成的结构。特别是，所述上游和下游探针基本与所述靶核酸的相邻序列杂交，以使得所述下游探针的5’标签游离，并且不与靶标碱基配对。在一些方面，然而，所述下游探针的5’标签与所述上游探针的3’部分碱基配对(参见例如图4A，中间图)。

在一些方面，下游探针(和/或上游探针)可以连接固体支持物，例如珠(例如编码的珠)或表面。在一方面，下游探针的5’非天然核苷酸为isoG(或isoC)。在该方面，淬灭基团标记的非天然核苷酸为同源isoC(或isoG)。因此，在一些方面，延伸所述上游探针包括合成与所述下游探针的标签序列互补的3’延伸，其包含所述淬灭基团标记的非天然核苷酸。在另一些方面，检测所述下游探针上报告基团的信号改变还包括将延伸的上游探针和下游探针杂交。

如本文进一步详述的，在某些方面，所述报告基团为荧光团，检测报告基团的信号改变包括检测荧光信号的降低。在某些方面，检测报告基团的信号改变包括样品温度改变时检测报告基团的信号改变。例如，检测报告基团的信号改变包括当样品的温度提高至高于(或降低至低于)延伸的上游探针和下游探针的熔链点时，检测报告基团的信号改变。

在另一方面，方法包括：(a)将样品与第二探针组接触，所述探针组包含上游探针，所述上游探针包含与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和下游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含报告基团标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在淬灭基团标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述下游探针的非天然核苷酸碱基配对；以及(c)通过检测所述下游探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸。例如，可以顺序或基本同时检测所述第一和第二靶核酸的存在。在某些方面，所述第一和第二探针组包含相同报告基团或可区分的报告基团。在另一些方面，第一和第二探针组包括在所述上游和下游探针之间可区分的熔链点。

在另一方面，实施方案的方法为多重方法，其包括：(a)将样品与第三、第四、第五或第六探针组接触，每组探针包含与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和下游探针，其从5’至3’包含，(i)包含报告基团的5’非天然核苷酸；(ii)标签序列和(iii)与所述第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；(b)在淬灭基团标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述下游探针的非天然核苷酸碱基配对；以及(c)通过检测所述下游探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五或第六靶核酸。优选地，所述第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探针组各自包括在所述上游探针和下游探针之间可区分的报告基团或可区分的熔链点。

在另一些方面，实施方案的方法可以包括进行多重聚合酶链式反应循环，例如多重PCR循环而没有用于除去循环间游离漂浮之淬灭基团的洗涤步骤。在某些方面，检测报告基团的信号改变包括在多重聚合酶链式反应循环之前、之后和/或期间检测信号。在一些方面，检测报告基团的信号改变包括仅在进行多重聚合酶链式反应循环之后检测信号。在某些方面，方法还包括将所检测到的报告基团之信号与预定比相比较，所述预定比为所述报告基团的信号和非杂交探针上报告基团的参照信号的比。因此，在一些方面，实施方案的方法包括对所述样品中靶核酸的量进行定量。例如，对所述样品中靶核酸的量进行定量可包括：采用标准曲线；确定所述靶核酸的相对量；采用终点定量；和/或通过将相对于背景可检测到信号的PCR循环数与存在的靶标量相关联，来确定所述靶核酸的量。

在另一个实施方案中，提供了包含第一探针组的组合物，所述探针组包含上游探针，所述上游探针包含与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和下游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含具有报告基团的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在一些方面，所述组合物还包含第二探针组，所述探针组包含上游探针，所述上游探针包含与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和下游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含报告基团标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。在某些方面，所述组合物包含至少两、三、四、五或六组探针。优选地，每组探针包括在所述上游和下游探针之间可区分的报告基团或可区分的熔链点。在另一些方面，所述组合物另外包含淬灭基团标记的非天然核苷酸、聚合酶、参照探针和/或游离核苷酸。

在一个相关实施方案中，提供了试剂盒，其包含(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，所述上游探针包含与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；和下游探针，其从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含报告基团标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；和(b)淬灭基团标记的非天然核苷酸。在某些方面，所述试剂盒包含至少两、三、四、五或六组探针。优选地，每组探针包括在所述上游和下游探针之间可区分的报告基团或可区分的熔链点。在另一些方面，所述试剂盒另外包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸、和/或试剂盒的使用说明。

如本文中使用的，固体支持物可以为具有磁性的珠和/或具有使其停留在溶液中二维表面上之密度的珠。颗粒可以通过磁力、重力或离子力或通过化学键或本领域技术人员已知的任何其他方式中的一种或另一种停留在二维表面上。颗粒可以由玻璃、聚苯乙烯、乳胶、金属、量子点、聚合物、硅石、金属氧化物、陶瓷或任意其它适于结合核酸的物质，或者然后可以连接至核酸的化学物质或蛋白质组成。所述颗粒可以为杆状或球形或盘形，或包括任其他意形状。所述颗粒还可以通过其形状或大小或物理位置而区分开来。由于具有组合物可使得所述颗粒在光谱上不同，所述组合物包含染料或包含多个比或多个浓度的一种或多种染料或荧光染料，或者通过条形码或全息图像或其它印迹形式的颗粒编码可以将所述颗粒区分开。当颗粒为磁性颗粒时，可以通过施加磁场将它们吸引至室表面。同样地，通过去除磁场，可以将磁性颗粒从室表面分散开来。磁性颗粒优选为顺磁或超顺磁。在没有磁场时，顺磁和超顺磁颗粒具有可忽略的磁性，但是施加磁场诱导颗粒中的磁域对齐，从而导致颗粒被吸引至场源。当去除所述场时，磁域恢复至随机方向，从而颗粒间无磁性吸引或排斥。在超顺磁性的情况下，磁域几乎立即恢复至域的随机方向，而顺磁材料在去除磁场之后的一段时间内将仍保持域对齐。当颗粒具有足够的密度时，通过重力可以将它们吸引至室的底面，并通过搅拌室(例如通过涡旋、超声或流体运动)，从室的底面分散开来。室的搅拌还可以用于在方法和系统中进一步帮助颗粒分散，在所述方法和系统中，颗粒通过其它力被吸引至室表面，例如磁力或离子力、或吸力、或真空过滤、或亲和力、或亲水性或疏水性，或其任意组合。

标记物(也可以称为报告基团)是一种分子，其有利于检测其所连接的分子(例如核酸序列)。已知有大量的报告基团分子可以用于标记核酸。直接的报告基团分子包括荧光团、生色团和放射团(radiophore)。荧光团的非限制性实例包括例如红色荧光方酸菁染料(squarine dye)(例如2，4-双[1，3，3-三甲基-2-二氢亚吲哚基甲基]环丁烯二-1，3-二氧戊环(2，4-Bis[1，3，3-trimethyl-2-indolinylidenemethyl]cyclobutenediylium-1，3-dio-xolate))、红外染料(例如2，4双[3，3-二甲基-2-(1H-苯基[e]二氢亚吲哚基甲基)]环丁烯二-1，3-二氧戊环(2，4Bis[3，3-dimethyl-2-(1H-benz[e]indolinylidenemethyl)]cyclobutenediylium-1，3-dioxolate))或橙色荧光方酸菁染料(例如2，4-双[3，5-二甲基-2-吡咯基]环丁烯二-1，3-二氧戊环(2，4-Bis[3，5-dimethyl-2-pyrrolyl]cyclobutenediylium-1，3-diololate))。荧光团的另一些非限制性实例包括：量子点，Alexa Fluor^TM染料，AMCA，BODIPY^TM630/650，BODIPY^TM 650/665，BODIPY^TM-FL，BODIPY^TM-R6G，BODIP Y^TM-TMR，BODIPY^TM-TRX，Cascade Blue^TM，CyDye^TM，包括但不限于Cy2^TM、Cy3^TM和Cy5^TM，DNA嵌入染料，6-FAM^TM，荧光素，HEX^TM，6-JOE，Oregon Green^TM 488，Oregon Green^TM500，Oregon Green^TM 514，Pacific Blue^TM，REG，藻胆蛋白包括但不限于藻红蛋白和别藻蓝蛋白，Rhodamine Green^TM，Rhodamine Red^TM，ROX^TM，TAMRA^TM，TET^TM，四甲基罗丹明，或TexasRed^TM。信号放大试剂，例如tyramide(PerkinElmer)，可以用于增强荧光信号。间接报告基团分子包括生物素，其必须结合另一分子(例如链霉亲和素-藻红蛋白)以进行检测。也可以采用标志物对，例如荧光共振能量转移对或染料-淬灭基团对。

标记的扩增产物可以被直接或间接标记。可以通过例如采用标记的引物，标记的dNTP、标记的核酸插入剂或上述组合实现直接标记。可以通过例如将标记的探针与扩增产物杂交实现间接标记。

本文公开的方法还可以包括对样品中的核酸靶标的初始量进行定量。所述定量可以包括例如通过在对数坐标上相对于循环数对荧光作图，来在实时PCR的指数期内确定存在的DNA相对浓度。之后，可通过将结果与标准曲线比较来确定DNA的量，通过对已知量DNA的连续稀释进行实时PCR生成所述标准曲线。另外，实时PCR可以与逆转录聚合酶链式反应组合以对包含低丰度RNA的样品中的RNA进行定量。

本文公开的方法提供了多重能力，以使得多个引物对(和/或探针组)可以对单个扩增反应中的多个靶核酸进行扩增。在某些实施方案中，在扩增反应中具有至少6、7、8、9、10、11或1°个不同引物对(或探针)。在一些实施方案中，在扩增反应中具有8至100、8至80、8至60、8至40、8至20、8至18、8至16、8至12、10至100、10至80、10至60、10至40、10至20、10至18、10至16、10至12、12至100、12至80、12至60、12至40、12至20、12至18、或12至16个不同引物对(或探针)。在某些实施方案中，在扩增反应中具有至少6、7、8、9、10、11或12个不同靶核酸。在一些实施方案中，在扩增反应中具有8至100、8至80、8至60、8至40、8至20、8至18、8至16、8至12、10至100、10至80、10至60、10至40、10至20、10至18、10至16、10至12、12至100、12至80、12至60、12至40、12至20、12至18、或12至16个不同靶核酸。扩增反应中存在的探针在一些方面可以包含阻断的3’羟基，以防止所述探针被聚合酶延伸。所述3’羟基可以被例如磷酸基团或3’反向dT阻断。根据实施方案采用的核酸扩增方法包括但不限于PCR和等温扩增法。

靶核酸序列可以为任意目的序列。包含所述靶核酸序列的样品可以为任何含有核酸的样品。在本发明的某些方面，样品为例如筛选是否存在一个或多个基因突变或多态性的对象。在本发明的另一方面，样品可以来自被测试是否存在病原体的对象。当从对象获得样品时，可以通过本领域技术人员已知的方法获得样品，例如吸入、生物活检、拭子、静脉穿刺、脊髓穿刺、粪便样品或尿样。在本发明的一些方面，样品可以为环境样品，例如水、土壤或空气样品。在本发明的另一些方面，样品来自植物、细菌、病毒、真菌、原生动物或多细胞动物。

每个扩增循环具有三个阶段：变性阶段、引物退火阶段和引物延伸阶段。可以重复扩增循环直至产生所需量的扩增产物。通常，扩增循环重复大约10至40次。对于实时PCR，扩增产物的检测通常在每个扩增循环之后进行。但是在本发明的某些方面，可以在每2个，3个，4个或5个扩增循环之后检测扩增产物。还可以进行检测以使得分析或检测少至2个或更多个扩增循环。扩增循环可以与扩增检测在相同的室内进行，在此情况下，该室需要包含加热元件，从而可以在扩增循环的变性阶段、引物退火阶段和引物延伸阶段对室内的温度进行调节。加热元件通常受处理器控制。然而，扩增循环可以与扩增检测在不同室内进行，在此情况下，“扩增”室需要包含加热元件，而“检测”或“成像”室不需要具有加热元件。当扩增和检测发生在不同室内时，扩增反应的流体可以通过例如泵或活塞在所述室间转移。所述泵或活塞可以受处理器控制。或者，流体可以经手动(例如使用移液器)在所述室间转移。

扩增可以在反应混合物中进行，所述反应混合物包含至少一个具有非天然核苷酸的非天然核苷酸。所述反应混合物的至少一个非天然核苷酸可以与第一和/或第二引物组之引物中存在的至少一个非天然核苷酸碱基配对。任选地，所述非天然核苷酸与可以包括荧光团和淬灭基团的标记物偶联。所述淬灭基团可以使所述第一和/或第二引物组之引物中存在的荧光团淬灭。

检测可以包括对群中的一个或更多个多核苷酸进行扩增。例如，在至少一个非天然核苷酸存在下，检测可以包括对群中的一个或更多个多核苷酸扩增。所述非天然核苷酸可以具有非天然核苷酸(例如isoC和isoG)，其可任选地能够与寡核苷酸混合物的非天然核苷酸(例如，变性寡核苷酸中存在的非天然核苷酸)碱基配对。所述非天然核苷酸可以与标记物偶联。适当的标记物包括荧光团和淬灭基团。

所述方法可以用来在扩增期间或实时持续检测靶标。所述方法可以定量使用。

在一些实施方案中，第一引物和第二引物中的至少一个包含可存在于一个或多个位置处的至少一个非天然核苷酸(例如isoC和isoG)。第一引物和第二引物中的至少一个可以包含标记物。当所述第一引物和第二引物均包含标记物时，所述标记物可以相同或不同，优选不同。适当的标记物包括荧光团和淬灭基团。任选地，标记物可以偶联至所述非天然核苷酸。可以采用反应混合物进行扩增，所述反应混合物包含至少一个具有非天然核苷酸的非天然核苷酸，其可以任选地与所述第一引物、第二引物或者两者中存在的非天然核苷酸碱基配对。所述反应混合物的非天然核苷酸可以包含标记物。适当的标记物可以包括荧光团和淬灭基团，其可任选地能够使所述第一和第二引物中的至少一个(优选两者)的荧光团(如果存在)淬灭。

可以在一个或更多个非天然核苷酸和/或在至少一个与非天然核苷酸偶联之淬灭基团的存在下进行扩增。在一些实施方案中，与所述至少一个淬灭基团偶联的非天然核苷酸可以为isoCTP或isoGTP。

在一些方法中，第一和第二标记物可以不同。在一些方法中，第一和第二淬灭基团可以不同，并且能够淬灭两种不同的荧光团。在另一些方法中，第一和第二淬灭基团可以相同，并且能够淬灭两种不同的荧光团。

本文所述的方法可以包括确定扩增子(例如至少一个经扩增的HIV核酸和扩增的对照核酸之扩增的核酸)的熔链温度。所述方法可以包括确定核酸复合物的熔链温度，所述核酸复合物包括与靶核酸(其可以包括扩增的靶核酸)杂交的经标记的探针。将所述扩增子或核酸复合物暴露于温度梯度并观察标记物的信号，由此可以确定所述熔链温度。任选地，可以通过(a)在温度梯度下将扩增子与嵌入剂反应和(b)观察嵌入剂的可检测信号，来确定所述熔链温度。可以通过(1)将探针与靶核酸杂交以形成核酸复合物，其中所述探针和所述靶核酸中的至少一个包含标记物；(2)将所述核酸复合物暴露于温度梯度；和(3)观测所述标记物的信号，来确定核酸复合物的熔链温度。

可以在任意适当条件下在任意适当反应室中实施所述方法。例如，可以在不打开反应室的情况下，在所述反应室中实施所述方法。所述反应室可以为反应室阵列的一部分。在一些实施方案中，所述方法的步骤可以在不同反应室中分别进行。

在一些实施方案中，所述方法能够检测样品(例如体积大约为25微升的样品)中不超过大约100拷贝的靶核酸。在另一些实施方案中，所述方法能够检测样品(例如体积大约为25微升的样品)中不超过大约500拷贝、1000拷贝、5000拷贝或10000拷贝。

在另一些实施方案中，采用实时检测，在不超过大约150个、不超过大约100个、不超过大约90个、不超过大约80个、不超过大约70个、不超过大约60个、不超过大约50个、不超过大约40个、或者不超过大约30个的PCR循环内，所述方法能够检测样品(例如体积大约为25微升的样品)中不超过大约100拷贝的靶核酸。

如本文说明书中使用的没有数字限定的表述可以意指一个/种或更多个/种。如本文权利要求中使用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数字限定的表述可以意指一个/种或多于一个/种。

尽管本公开内容支持仅指替代以及“和/或”的定义，但是权利要求中使用术语“或”用来意指“和/或”，除非明确表示其仅仅为替代或所述替代是互斥的。本文中使用的“另一个/种”可以意指至少第二个/种或更多个/种。

贯穿该申请，术语“约/大约”用来表示这样的值，所述值包括装置、用于确定该值的方法的固有误差变化，或存在于研究对象之间的差异。

通过以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优势将变得明显。然而，应当理解的是，说明本发明一些优选实施方案的详细描述和特定实施例仅通过举例说明的方式给出，因此根据所述详细描述，在本发明精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得明显。

附图说明

以下附图构成了本说明书的一部分，并且包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过参考这些附图的一个或更多个并结合本文对特定实施方案的详细描述，将更好地理解本发明。本专利或申请文件包括至少一个彩色附图。经请求并支付必需费用，本局将提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的复印件。

图1A-F-使用发夹可延伸探针的一个非限制性示例示意图。图1A-设计发夹可延伸探针，所述发夹可延伸探针包含位于其5’端的随后有发夹序列的报告基团(星号)，随后有设计用来阻断延伸的修饰(例如C3间隔区；实心圆)，随后有isoC核苷酸，随后有靶特异性序列。图1B-在PCR反应期间，所述探针用作用于聚合酶合成第一链的引物。在图1C中-接下来，采用下游反向引物，所述聚合酶延伸相对的链，由此合成第二链。在一些方面，这样的第二引物还可以包含标记的非天然核苷酸。图1D-在PCR反应期间，当相对的链向后延伸时，isoC-淬灭基团(“Q”)将整合相对的isoG核苷酸。图1E-将发夹可延伸探针设计为具有唯一的熔链温度(T_m)，例如55、60、65、70、75和80℃，使得能够对每个颜色通道进行6重反应，以进行检测。这使得例如能够采用6色检测通道进行36重反应。图1F-熔链谱示出一个示例，其中通过C₂探针检测样品中存在的靶序列，因此当报告基团和淬灭基团分离后，在60℃下，产生了熔链峰高度或曲线下面积的增加。通过对所述熔链曲线进行一阶导数来确定图1F中示出的熔链峰。

图2A-F-示出水解官能化测定探针的一个非限制性示例示意图。图2A-序列A(标签序列)是熔链-区分模板特异性杂交序列。序列B是靶特异性杂交序列。当与熔链-区分模板(参见，图2C中的序列C)杂交时，序列A杂交并可以延伸。当与靶序列杂交时，序列B杂交并可任选地延伸。序列A和序列B一起包含靶特异性探针。图2B-当上游引物被与有核酸内切酶能力的聚合酶延伸时，序列B降解，导致序列A从序列B切割并释放。图2C-经切割探针的序列A与熔链-区分模板杂交，所述熔链-区分模板也称为“第一测定探针”(序列C)，其位于预先设计的熔链-区分探针的上游，所述熔链-区分探针也称为“第二测定探针”(序列D)。序列C在其5’端的一个位置上标记有报告基团(星号)。在一些情况下，序列可以包含非天然核苷酸，例如isoG。在isoC的情况下，序列D在其3’端的核苷酸与序列C 3’端的核苷酸碱基配对并标记有淬灭基团(Q)。所述标记的核苷酸用于形成报告基团-淬灭基团对。图2D-序列A延伸，导致序列D降解。这使报告基团-淬灭基团对分解，从而使得PCR反应过程中报告基团的信号增加。图2E中-将熔链区分模板-探针对设计为具有唯一的熔链温度(T_m)，例如55、60、65、70、75和80℃，使得能够对每个颜色通道进行6重反应，以进行检测。这使得例如能够采用6色检测通道进行36重反应。图2F-在该实施方案中，靶序列的存在使得特定预定的熔链区分模板-探针对的熔链峰高度或曲线下面积降低。通过对所述熔链曲线进行一阶导数，来确定图2F中示出的熔链峰。

图3A-D-示出水解官能化探针和具有延伸阻断剂的熔链-区分模板的一个非限制性示例示意图。图3A-序列B降解(参见图2A-B)之后，序列A与位于预设熔链-区分探针(模板D)上游的熔链-区分模板(序列C)杂交。序列C与序列D杂交的部分包含设计用于阻断延伸的修饰(例如C3间隔区或者一个或更多个非天然核苷酸；用实心圆表示)。序列C在其3’端具有用报告基团(星号)标记的核苷酸(此处为isoG)。序列D在其3’端的核苷酸(此处为isoC)与序列C 5’端的核苷酸碱基配对并标记有淬灭基团(Q)。所述标记的核苷酸用于形成报告基团-淬灭基团对。图3B-序列A延伸，其导致对应于延伸阻断剂5’部分的序列D部分的降解。图3C-设计熔链区分模板-探针对以使得每个完整熔链区分模板-探针对具有相同的T_m，例如80℃。然而，对它们进行设计以使得降解之后保留的部分具有唯一的熔链温度(T_m)，例如50、55、60、65、70和75℃。这使得能够对每个颜色通道进行6重反应，以进行检测。这使得例如能够采用6色检测通道进行36重反应。图3D-在该实施方案中，靶序列的存在使得对应于样品中存在的靶序列之特定预定熔链区分模板-探针对的熔链峰温度发生迁移。对所述熔链曲线进行一阶导数，来确定图3D中示出的熔链峰。

图4A-B-示出T-连接探针的一个非限制性示例示意图。图4A-设计两个探针以在扩增子的链上形成T-连接。较长的下游探针在其5’端包含报告基团标记的isoG(星号)核苷酸，并且任选地，在其3’端包含阻断延伸的修饰(实心圆)。上游探针的延伸将整合淬灭基团标记的isoC核苷酸(Q)，其使报告基团淬灭并降低反应中的信号。图4B-将T-连接探针设计为具有唯一的熔链温度(T_m)，例如55、60、65、70、75和80℃，这使得能够对每个颜色通道进行6重反应，以进行检测。这使得例如能够采用6色检测通道进行36重反应。可以进行熔链分析并揭示靶扩增子。

图5A-C-示出另一些T-连接探针的一个非限制性示例示意图。图5A-设计两个探针以在扩增子的链上形成T-连接。上游探针包含位于其5’端的报告基团标记的isoC核苷酸(“isoC^＊”)，标签序列，与扩增子互补的序列(用“A”表示)，以及任选地，可以与下游探针的“isoprimer互补序列”碱基配对的一个或更多个核苷酸。下游探针包含5’isoC(未标记)；与上游探针的标签序列成镜像的序列(“镜像标签”)；任选地，包含isoG和/或isoC位置的序列(“isoprimer互补序列”)以及与扩增子互补的序列(标记为“B”)。上游探针的延伸将合成与下游探针上的“isoprimer互补序列”和“镜像标签”互补的序列(即“isoprimer”和“标签互补”序列)，并且整合淬灭基团标记的isoG核苷酸(isoG^Q)。图5B-描绘了图5A中描述的T-连接探针的一个替代实施方案。在该情况下，下游探针不包含5’isoC位置。上游探针的延伸将合成与下游探针上的“isoprimer互补序列”和“镜像标签”互补的序列(即“isoprimer”和“标签互补”序列)。然后，通过“标签”和“标签互补”序列的碱基配对，上游探针可以形成发夹，这使得所述探针整合淬灭基团标记的isoG核苷酸(isoG^Q)。图5C-是多重信号检测的示意图，其采用了所述示例性T-连接探针(例如图5A-5B中描绘的那些)。可以将所述探针设计为具有唯一的熔链温度(T_m)，例如55、60、65、70、75和80℃，这使得能够对每个颜色通道进行6重反应，以进行检测。这使得例如能够采用6色检测通道进行36重反应。可以进行熔链分析以区分具有不同熔链温度的探针并揭示靶扩增子。

图6-示出T-连接探针的另一个非限制性示例示意图。设计两个探针以在扩增子的链上形成T-连接。上游探针在其5’端包含报告基团标记的isoG核苷酸(“isoG^＊”)，与扩增子互补的序列(用“A”表示)，以及任选地，可以与下游探针的“isoprimer互补序列”碱基配对的一个或更多个核苷酸。下游探针包含与其自身碱基配对以形成发夹的序列(“发夹标签互补序列”)；任选地，包含isoG和/或isoC位置的序列(“isoprimer互补序列”)以及与扩增子互补的序列(标记为“B”)。上游探针的延伸将合成与下游探针上的“isoprimer互补序列”和“发夹标签互补序列”互补的序列。所述延伸的上游探针现包含发夹序列，其使得所述探针能够进一步延伸并合成与“isoprimer”和“A”序列互补的序列，并且使得所述探针整合淬灭基团标记的isoC核苷酸(isoC^Q)。可以将所述探针设计为具有唯一的熔链温度(T_m)，例如通过调整所述发夹标签、“A”序列或isoprimer序列的序列和长度。可以进行熔链分析以区分具有不同熔链温度(并由此在不同温度下未淬灭)的探针。

图7-示出实施方案的探针系统的一个非限制性示例示意图。在该实施方案中，采用至少第一标记的引物来扩增靶序列。特别地，标记的引物包含5’isoC，随后是“镜像标签”序列。报告基团探针包含位于其5’端的报告基团标记的isoC核苷酸(“isoC^＊”)，标签序列(“标签”)，任选地，延伸阻断修饰；以及与扩增子互补的序列(用“A”表示)。在靶扩增子存在下，报告基团探针与扩增子的经标记的链杂交，并延伸至扩增子的末端，以整合“标签互补”序列和3’淬灭基团标记的isoG(“isoG^Q”)。延伸的报告基团探针现包含标签和标签互补序列，其使得探针能够形成发夹，由此使经标记的isoC的荧光淬灭。可以将所述探针设计为具有唯一的熔链温度(T_m)，例如通过调整所述标签标签的序列和长度。因此，可以进行熔链分析以区分具有不同熔链温度(并由此在不同温度下未淬灭)的探针。

图8-延伸反应可变探针1和探针2。图示出了受试探针的扩增曲线(上图)和熔链曲线(下图)。只有当存在模板时，具有6(1-6)、7(1-7)、8(1-8)或9(1-9)个核苷酸之臂长的探针1在探针2的5'FAM处产生淬灭。所有产物具有类似的T_m。

图9-10-不对称PCR的结果。图示出了采用不同浓度PCR引物之受试探针的扩增曲线(上图)和熔链曲线(下图)。PCR引物采用了三个不同浓度：[FWD]/[REV]＝80/40nM(短划线)；[FWD]/[REV]＝40/40nM(虚线)和[FWD]/[REV]＝40/80nM(实线)。图9示出了使用表3的原始探针的结果，而图10示出了使用表3的缩短探针的结果。

图11-SNP检测。图示出了SNP检测探针的扩增曲线(上图)和熔链曲线(下图)。在扩增曲线的结果中；探针SNP1_7-2，10(实线)；探针SNP1_7-2，6(虚线)；探针SNP1_7-2，3(长的短划线；平均Ct.38.4)；和对照(短的短划线；平均Ct.34.2)。在熔链曲线结果中，对照(短的短划线)的Tm为66.7℃，而探针SNP1_7-2，3(长的短划线)的Tm是66.1℃。表4中示出了所述探针序列。

图12-全长T-SNAP探针的不对称PCR结果。图示出了表5探针的扩增曲线(上图)和熔链曲线(下图)。进行不对称PCR，其中引物浓度为Fwd/Rev＝80/40nM，模板为500fM。当臂为发夹茎的一部分(用实线表示)时，熔链曲线的振幅更大。

示例性实施方案的描述

熔链分析检测利用熔链或退火峰以区分扩增子的身份，但是在相同温度附近熔链并且属于靶标的天然序列组成的扩增子中，这些熔链峰并不容易被区分。通过产生具有唯一熔链谱的发夹序列，可以在单色通道中实现多重性，由此使得能够用多色通道实现甚至更多的多重性。

公开了用于检测样品中核酸的方法和试剂盒。通常，所述方法包括检测信号，例如荧光团发出的信号。还公开了寡核苷酸，特别是引物和探针，其可以用于检测靶核酸。

I.定义

本文中使用的“核酸”意指DNA或RNA，单链或双链及其任意化学修饰。修饰包括但不限于提供其它化学基团的那些，其整合另外的电荷、极性、氢键、静电相互作用以及对核酸配体碱基或整个核酸配体的流动性(fluxionality)。这样的修饰包括但不限于，2’位的糖修饰，5位的嘧啶修饰，8位的嘌呤修饰，环外胺处的修饰，4-硫代尿苷的替换，5-溴或5-碘代-尿嘧啶的替换，骨架修饰，甲基化和不常见的碱基配对组合，例如异碱基。因此，本文所述的核酸不仅包括标准碱基腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，还包括非标准的或非天然的核苷酸。例如在U.S.专利No.5,432,272，5,965,364，6,001,983，6,037,120和6,140,496中描述了形成氢键碱基配对的非标准或非天然核苷酸，通过引用将其全部并入本文。“非标准核苷酸”或“非天然核苷酸”意指除了A、G、C、T或U之外的碱基，其易于整合至寡核苷酸中并且能够通过氢键或疏水、熵或范德华相互作用与互补的非标准或非天然核苷酸碱基配对以形成碱基对。一些实例包括US专利No.6,037,120中举例说明的iso-C/iso-G，K/X，K/P，H/J和M/N的碱基对组合，所述文献通过引用并入本文。

这些非标准或非天然核苷酸对的氢键类似于天然碱基的那些，其中配对的非标准或非天然核苷酸的氢键受体和氢键供体之间形成两个或三个氢键。天然碱基与这些非标准或非天然核苷酸的一个区别在于氢键受体和氢键供体的数目和位置。例如，胞嘧啶可以被认为是供体/受体/受体碱基，而鸟嘌呤是互补的受体/供体/供体碱基。Iso-C是受体/受体/供体碱基，而iso-G为互补的供体/供体/受体碱基，如US专利No.6,037,120中所举例说明的，所述文献通过引用并入本文。

另一些用于寡核苷酸的非天然核苷酸包括例如萘、菲和芘衍生物，如例如在Ren等，J.Am.Chem.Soc.1996，118：1671和McMinn等，J.Am.Chem.Soc.1999，121：11585中所讨论的，所述文献通过引用并入本文。这些碱基不利用氢键以进行稳定，而是依赖疏水或范德华相互作用以形成碱基对。

本文使用的术语“样品”以其最宽的含义使用。样品可以包括身体组织或体液，所述体液包括但不限于血液(或者血液级分，例如血浆或血清)、淋巴、粘液、眼泪、尿和唾液。样品可以包括细胞、染色体、细胞器或病毒的提取物。样品可以包含DNA(例如基因组DNA)，RNA(例如mRNA)，和/或cDNA，可以扩增任意它们以提供扩增的核酸。样品可以包含溶液中的核酸或者结合至基底(例如微阵列的一部分)。样品可以包括从环境地点(例如，水体，土壤等)获得的材料，或者从传染物(fomite)(即用来使病原体从一个宿主转移至另一个宿主的无生命物体)获得的材料。

术语“核酸源”是指含有核酸(RNA或DNA)的任何样品。特别优选的靶核酸源是生物样品，包括但不限于，血液、血浆、血清、唾液、脑脊液、胸腔液、乳汁、淋巴、痰和精液。

本文中使用的术语“检测限(limit of detection)”是指可以被检测和定量的分析物(例如核酸)的最低水平或最低量。检测限可以表示为摩尔值(例如，2.0nM的检测限)，按克的测量值(例如特定反应条件下的2.0微克的检测限)，拷贝数(例如1x10⁵拷贝数的检测限)，或其它本领域已知的表达方式。

本文中使用的关于核酸分子的术语“分离的”是指从生物体和生物材料(例如血液、细胞、血清、血浆、唾液、尿、粪便、痰、鼻咽吸出物等)分离的核酸分子，其存在于核酸分子的天然来源中。当通过重组技术产生时，分离的核酸分子(例如cDNA分子)可以基本不含有其它细胞材料或者培养基，或者当化学合成时，所述分离的核酸分子基本不含有化学前体或其它化学物质。在一些实施方案中，还可以分离或纯化编码多肽/蛋白质的核酸分子。核酸分离的方法是本领域公知的，可以包括总核酸分离/纯化方法、RNA特异性分离/纯化方法、或DNA特异性分离/纯化方法。

本文中使用的术语“微阵列”是指多个多核苷酸、多肽或其它化学化合物在基底上的排列。术语“元件”和“阵列元件”是指在微阵列上具有唯一和确定位置的多核苷酸、多肽或其它化学化合物。

本文中使用的寡核苷酸理解为具有骨架上之碱基序列的分子，其主要由具有确定间隔的相同单体单元构成。所述碱基在所述骨架上以这样的方式排列，使其可以与核酸键合，所述核酸具有与所述寡核苷酸的碱基互补的碱基序列。最常见的寡核苷酸具有糖磷酸单元骨架。由2’位置不具有羟基的“dNTP”构成的寡脱氧核糖核苷酸和由2’位置具有羟基的“NTP”构成的寡核糖核苷酸之间可有差别。寡核苷酸还可以包括衍生物，其中羟基的氢被有机基团(例如烯丙基)取代。

寡核苷酸为包含至少两个核苷酸的核酸。用在本文公开方法中的寡核苷酸通常包含至少大约10个核苷酸，更通常至少大约15个核苷酸。用于本文公开的方法的优选寡核苷酸包含大约10-25个核苷酸。寡核苷酸可以被设计作为“引物”。“引物”是短核酸，通常为ssDNA寡核苷酸，其可以通过互补碱基配对来与靶多核苷酸退火。然后，可沿着靶DNA或RNA链通过聚合酶(例如DNA聚合酶)延伸所述引物。引物对可以用于扩增(和鉴定)核酸序列(例如通过聚合酶链式反应(PCR))。寡核苷酸可以被设计作为“探针”。“探针”是指用于检测相同、等位或相关核酸序列的寡核苷酸、其互补序列或其片段。探针可以包含已经连接至可检测标记物或报告基团分子的寡核苷酸。典型的标记物包括荧光染料、淬灭基团、放射性同位素、配体、闪烁剂、化学发光剂和酶。

可以将寡核苷酸设计为对样品中的靶核酸序列具有特异性。例如，可以将寡核苷酸设计为包括靶核酸的“反义”核酸序列。本文中使用的术语“反义”是指能够与特定靶核酸序列的“有义”(编码)链进行碱基配对的任意组成。反义核酸序列可以与靶核酸序列“互补”。本文中使用的“互补性”描述了通过碱基配对而退火的两个单链核酸序列之间的关系。例如，5′-AGT-3′与其互补序列3′-TCA-5′配对。在一些实施方案中，可以将引物或探针设计为包含不同位置处的错配。本文中使用的“错配”意指不包含标准Watson-Crick碱基对的核苷酸对，或者没有优先形成氢键的核苷酸对。所述错配可以包含天然核苷酸或者被靶标中特定碱基替换的非天然或非标准核苷酸。例如，探针或引物序列5′-AGT-3′与靶序列3′-ACA-5′具有单个错配。所述探针或引物的5’“A”与靶标的3’“A”错配。类似地，靶序列5′-AGA-3′与探针或引物序列3′-(iC)CT-5′具有单个错配。此处，iso-C替换了天然“T”。然而，序列3′-(iC)CT-5′与序列5′-(iG)GA-3′没有错配。

还可以将寡核苷酸设计为简并寡核苷酸。本文中使用的“简并寡核苷酸”意在包括含有不同序列混合物的寡核苷酸群、库(pool)或多个寡核苷酸，其中序列差异发生在所述群的每个寡核苷酸的特定位置上。多种替换可以包括任意天然或非天然核苷酸，而且可以包括任意数目的在任意给定位置上不同的可能核苷酸。例如，上述简并寡核苷酸可以替代地包括R＝iC或iG，或者R＝A或G或T或C或iC或iG。

本文中描述的寡核苷酸通常能够与具有互补碱基序列的寡核苷酸形成氢键。这些碱基可包括天然碱基，例如A、G、C、T和U，以及人工的、非标准或非天然核苷酸，例如iSo-胞嘧啶和iso-鸟嘌呤。如本文中描述的，当与第二序列的连续碱基(从3′至5′读)比较时，第一序列的连续碱基(从5′至3′读)遵循Watson-Crick的碱基配对规则，此时寡核苷酸的第一序列被描述为与寡核苷酸的第二序列100％互补。寡核苷酸可以包括核苷酸替换。例如，人工碱基可以用于代替天然碱基，以使得所述人工碱基显示与天然碱基类似的特异性相互作用。

对靶核酸具有特异性的寡核苷酸还可以对与所述靶核酸序列具有“同源性”的核酸序列具有特异性。本文中使用的“同源性”是指两个或更多个多核苷酸序列或者两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换的序列同一性。用于多核苷酸序列的术语“百分比同一性”和“％同一性”是指采用标准算法(例如BLAST)时至少两个多核苷酸序列之间残基匹配的百分比。

对靶核酸具有特异性的寡核苷酸将在适当条件下与靶核酸“杂交”。本文中使用的“杂交”或“与……杂交”是指在确定的杂交条件下，寡核苷酸单链经碱基配对与互补链退火的过程。“特异性杂交”是指两个核酸序列共有高度互补性。在允许退火的条件下形成特异性杂交复合物，并在任意洗涤步骤之后保持杂交。允许核酸序列退火的条件可以由本领域普通技术人员常规地确定，并且可以在例如大约6×SCC存在下于65℃下进行。可以部分参照进行洗涤步骤的温度表示杂交的严格性。在确定的离子强度和PH下，通常选定的温度比特异性序列的热熔链点(T_m)低大约5℃至20℃。T_m是指50％靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和PH下)。计算T_m的等式例如最邻近参数(nearest-neighborparameter)，并且核酸杂交的条件是本领域已知的。

本文中使用的“靶标”或“靶核酸”是指含有至少与寡核苷酸部分互补之序列的核酸分子，所述寡核苷酸例如为探针或引物。“靶”序列可以包括基因或基因组的一部分。

本文中使用的“核酸”、“核苷酸序列”或“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或其任意片段，以及天然存在或合成的分子。这些术语还指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以为单链或双链，并且可以为有义或反义链，或者任何DNA样或RNA样材料。提及DNA序列的“RNA等同物”由与参照DNA序列相同的核苷酸线性序列构成，不同之处在于含氮碱基胸腺嘧啶全部被尿嘧啶取代以及糖骨架由核糖而不是脱氧核糖构成。RNA可以用于本文所述的方法中，和/或可以通过在本文所述方法中采用的逆转录转化为cDNA。

本文中使用的“扩增”是指产生核酸序列的另外的拷贝。通常采用本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。术语“扩增反应系统”是指使核酸靶序列的拷贝增加的任意体外装置。术语“扩增反应混合物”是指包含用于扩增靶核酸之多种试剂的水溶液。这些试剂可以包括酶(例如热稳定聚合酶)、缓冲水溶液、盐、扩增引物、靶核酸、核苷三磷酸，以及任选地，至少一个标记的探针和/或任选地，至少一个用于确定经扩增靶核酸的熔链温度的试剂(例如荧光嵌入剂，在双链核酸存在下，其表现出荧光的改变)。

本文描述的扩增方法可以包括“实时监测”或“连续监测”。这些术语是指，在PCR循环期间监测多次，优选在温度转变期，并且更优选在每个温度转变时获得至少一个数据点。术语“均匀检测测定(homogeneous detection assay)”用来描述包括偶联的扩增和检测的测定，其可以包括“实时监测”或“连续监测”。

核酸扩增可以包括核酸或这些核酸之亚区域的扩增。例如，扩增可以包括通过选择适当引物序列和采用PCR对30至50、50至100或100至300碱基长的核酸部分进行扩增。在另一些方面，可以采用等温扩增技术(即，不需要热循环)实现扩增。例如，等温核酸扩增的方法，例如U.S.专利6,410,278和US专利公开20080182312中提供的环介导等温扩增(loopmediated isothermal amplification，LAMP)，每个所述文献通过引用整体并入本文。

所公开的方法可以包括对样品中至少一个或更多个核酸进行扩增。在所公开的方法中，采用实时放法对扩增进行监测。

扩增混合物可以包含天然核苷酸(包括A、C、G、T和U)和非天然或非标准核苷酸(例如，包括iC和iG)。DNA和RNA寡核苷酸分别包括通过磷酸二酯键偶联的脱氧核糖或核糖。每个脱氧核糖或核糖包含与糖偶联的碱基。天然存在的DNA和RNA中整合的碱基为腺苷(A)、鸟苷(G)、胸苷(T)、胞苷(C)和尿苷(U)。这五个碱基是“天然碱基”。根据Watson和Crick阐述的碱基配对规则，所述天然碱基杂交以形成嘌呤-嘧啶碱基对，其中G与C配对，A与T或U配对。这些配对规则有利于寡核苷酸与互补寡核苷酸的特异性杂交。

每个碱基对的两个碱基之间产生两个或三个氢键有利于天然碱基形成碱基对。每个碱基包含两个或三个氢键供体和氢键接受者。通过一个碱基上的至少一个氢键供体与另一碱基上的氢键接受者的相互作用来各自形成碱基对的氢键。氢键供体包括例如，具有至少一个连接的氢的杂原子(例如，氧或氮)。氢键接受者包括例如具有孤对电子的杂原子(例如，氧或氮)。

本文中使用的天然或非天然核苷酸可以通过非氢键位点的替换而衍生，以形成经修饰的天然或非天然核苷酸。例如，通过将反应官能基团(例如，巯基、肼、醇、胺等)偶联至核苷酸的非氢键原子，可将天然核苷酸衍生以连接至支持物。另一些可能的取代物包括例如，生物素、洋地黄毒苷、荧光基团、烷基(例如甲基或乙基)等。

根据本文所公开方法的非天然核苷酸的用途可延伸超出了对样品中存在之核酸序列的检测和定量。例如，通过催化与核酸相关的反应的多种酶，可以识别非天然核苷酸。虽然聚合酶需要互补核苷酸以继续聚合并延伸寡核苷酸链，但是其它酶并不要求互补核苷酸。如果非天然核苷酸存在于模板中并且反应混合物中不存在其互补非天然核苷酸，则当尝试将延长的引物延伸通过所述非天然核苷酸时，聚合酶通常会停止(或者，在一些情况下，当给予足够量的时间时，会错整合碱基)。然而，催化与核酸相关的反应的另一些酶，例如连接酶、激酶、核酸酶、聚合酶、拓扑异构酶、解旋酶等，可以催化涉及非天然核苷酸的反应。非天然核苷酸的这些特征可以被利用，并落在本文公开的方法和试剂盒的范围内。

本文所公开的包括非天然核苷酸的核苷酸可以偶联标记物(例如淬灭基团或荧光团)。可以采用本领域已知的方法进行偶联。

本文方法中的寡核苷酸可以作为引物。在一些实施方案中，所述寡核苷酸被标记。例如，用发射可检测信号的报告基团(例如荧光团)标记寡核苷酸。寡核苷酸可以包括至少一个非天然核苷酸。例如，寡核苷酸可以包含具有不是A、C、G、T或U碱基的至少一个核苷酸(例如，iC或iG)。当寡核苷酸用作例如用于PCR的引物时，扩增混合物可以包括至少一个标记有淬灭基团(例如Dabcyl)的核苷酸。所述经标记的核苷酸可以包含至少一个非天然或非标准核苷酸。例如，所述经标记的核苷酸可以包含具有不是A、C、G、T或U(例如，iC或iG)碱基的至少一个核苷酸。

在一些实施方案中，可以将寡核苷酸设计为不形成分子内结构(例如发夹)。在另一些实施方案中，可以将寡核苷酸设计为形成分子内结构(例如发夹)。例如，可以将寡核苷酸设计为形成发夹结构，在所述寡核苷酸与靶核酸杂交之后，以及任选地，在采用所述寡核苷酸作为引物对靶核酸进行扩增之后，所述发夹结构发生改变。

寡核苷酸可以用荧光团标记，当所述寡核苷酸作为引物整合至扩增的产物中时，所述荧光团表现出淬灭。在另一些实施方案中，在寡核苷酸作为引物整合至扩增的产物中之后，所述寡核苷酸可以发射可检测信号(例如，固有地，或通过荧光诱导或荧光去淬灭(dequenching))。这样的引物是本领域已知的(例如，LightCycler引物、Amplifluor^TM引物、Scorpion^TM引物、和Lux^TM引物)。当嵌入双链核酸时，用于标记寡核苷酸的荧光团可以发射信号。因此，在寡核苷酸作为引物扩增核酸后，荧光团可以发射信号。

用于所公开方法的寡核苷酸可以适合作为引物以扩增样品中的至少一个核酸，以及作为探针以检测样品中的至少一个核酸。在一些实施方案中，用至少一个荧光染料标记寡核苷酸，其可以产生可检测信号。所述荧光染料可以作为荧光供体以进行荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。当寡核苷酸用于扩增靶核酸时，所述可检测信号可被淬灭。例如，扩增混合物可以包含用淬灭基团标记的核苷酸以通过荧光团发射的可检测信号淬灭。任选地，寡核苷酸可以标记有第二荧光染料或可作为荧光接受者(例如对于FRET)的淬灭基团染料。当寡核苷酸标记有第一荧光染料和第二荧光染料时，可以检测所述第一荧光染料、第二荧光染料或者两者的信号。可以在一定的温度梯度下检测信号(例如为了确定扩增子的熔链温度，包括与靶核酸杂交之探针的复合物、发夹或T探针复合物的熔链温度)。

可以用任意适当数目的寡核苷酸进行所公开的方法。当采用多个寡核苷酸(例如2个或更多个寡核苷酸)时，不同的寡核苷酸可以用能够产生可检测信号的不同荧光染料标记。在一些实施方案中，寡核苷酸标记有两个不同荧光染料中的至少一个。在另一些实施方案中，寡核苷酸标记有三个不同荧光染料中的至少一个。

在一些实施方案中，每个不同荧光染料发射的信号可以与用来标记寡核苷酸的其它任意不同荧光染料发射的信号区分。例如，不同荧光染料可具有最大发射波长，所有最大发射波长相互之间相差至少大约5nm(优选至少大约10nm)。在一些实施方案中，每个不同荧光染料被不同波长能量激发。例如，不同荧光染料可具有最大吸收波长，所有最大吸收波长相互之间相差至少大约5nm(优选至少大约10nm)。

当采用荧光染料确定所述方法中核酸的熔链温度时，荧光染料可发射的信号可以与用来标记寡核苷酸的其它任意不同荧光染料发射的信号区分。例如，用于确定核酸熔链温度的荧光染料具有的最大发射波长可与用来标记寡核苷酸的其它任意荧光染料的最大发射波长相差至少大约5nm(优选至少大约10nm)。在一些实施方案中，用于确定核酸熔链温度的荧光染料可以被不同于用来标记寡核苷酸的其它任意不同荧光染料之波长能量的波长能量激发。例如，用于确定核酸熔链温度的荧光染料的最大吸收波长可与用来标记寡核苷酸的任意荧光染料的最大吸收波长相差至少大约5nm(优选至少大约10nm)。

所述方法可以包括确定样品中至少一个核酸(例如，扩增子或包含与靶核酸杂交之探针的核酸复合物)的熔链温度，其可以用于鉴定核酸。确定熔链温度可以包括将扩增子或核酸复合物暴露于温度梯度，并观察荧光团的可检测信号。任选地，当所述方法的寡核苷酸标记有第一荧光染料时，确定检测的核酸的熔链温度可以包括观察与第一荧光染料不同的第二荧光染料的信号。在一些实施方案中，用于确定检测的核酸之熔链温度的第二荧光染料是嵌入剂。适当的嵌入剂可以包括但不限于，SYBR^TM Green 1染料、SYBR染料、PicoGreen、SYTO染料、SYTOX染料、溴化乙锭、乙锭同源二聚体-1、乙锭同源二聚体-2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭-吖啶异源二聚体、单叠氮乙锭(ethidium monoazide)、碘化丙啶、花青素单体、7-氨基放线菌素D、YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花青素二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、及其混合物。在一些合适的实施方案中，所选择的嵌入剂为SYBR^TM Green1染料。

在所公开的方法中，每个经扩增的靶核酸或报告基团探针-模板对具有不同的熔链温度。例如，每个经扩增的靶核酸或报告基团探针-模板对的熔链温度可与其它任意经扩增靶核酸或报告基团探针-模板对的熔链温度相差1-10℃，例如至少大约1℃，更优选至少大约2℃，或甚至更优选至少大约4℃。

本文中使用的“标记物”或“报告基团分子”是用于标记核酸的化学或生化部分。“标记物”和“报告基团分子”包括荧光剂、化学发光剂、生色剂、淬灭剂、放射性核素、酶、底物、辅因子、闪烁剂、抑制剂、磁性颗粒和其它本领域已知的部分。“标记物”或“报告基团分子”能够产生可测量的信号，并且可以与寡核苷酸共价或非共价连接。

本文中使用的“荧光染料”或“荧光团”为可以被光激发而发射荧光的化学基团。一些合适的荧光团可以被光激发而发射磷光。染料可以包括能够将荧光供体染料的荧光信号淬灭的接受者染料。可以用于所公开方法中的染料包括但不限于，荧光团，例如红色荧光方酸菁染料(例如2，4-双[1，3，3-三甲基-2-二氢亚吲哚基甲基]环丁烯二-1，3-二氧戊环)、红外染料(例如2,4双[3，3-二甲基-2-(1H-苯基[e]二氢亚吲哚基甲基)]环丁烯二-1，3-二氧戊环)或橙色荧光方酸菁染料(例如2，4-双[3，5-二甲基-2-吡咯基]环丁烯二-1，3-二氧戊环)。荧光团的另一些非限制性实例包括：量子点，Alexa Fluor^TM染料，AMCA，BODIPY^TM 630/650，BODIPY^TM 650/665，BODIPY^TM-FL，BODIPY^TM-R6G，BODIPY^TM-TMR，BODIPY^TM-TRX，Cascade Blue^TM，CyDye^TM(包括但不限于Cy2^TM、Cy3^TM和Cy5^TM)，DNA嵌入染料，6-FAM^TM，荧光素，HEX^TM，6-JOE，Oregon Green^TM 488，Oregon Green^TM 500，Oregon Green^TM 514，Pacific Blue^TM，REG，藻胆蛋白包括但不限于藻红蛋白和别藻蓝蛋白，Rhodamine Green^TM，Rhodamine Red^TM，RON^TM，TAMRA^TM，TET^TM，四甲基罗丹明，或Texas Red^TM。

荧光染料或荧光团可以包括经修饰以有利于缀合至另一反应分子的衍生物。因此，荧光染料或荧光团可以包括胺反应衍生物，例如荧光团的异硫氰酸盐衍生物和/或琥珀酰亚胺酯衍生物。

所公开方法的寡核苷酸和核苷酸可以用淬灭基团标记。淬灭可包括动态淬灭(例如通过FRET)，静态淬灭或两者。适当的淬灭基团包括Dabcyl。适当的淬灭基团还包括暗淬灭基团，其可以包括以商品名″BHQ″销售(例如，BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3，BiosearchTechnologies，Novato，CA)的黑洞淬灭基团。暗淬灭基团还可以包括以商品名″QXL^TM″销售(Anaspec，San Jose，CA)的淬灭基团。暗淬灭基团还可以包括包含2，4-二硝基苯基的DNP型非荧光团。

II.实施例

包括以下实施例以证明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是，以下实施例中公开的技术代表本发明人所发现的能够很好实施本发明的技术，因此，可以认为其构成了其实施的一些优选方式。然而，本领域技术人员应当理解，根据本公开内容，在所公开的特定实施方案中可以进行很多变化，并且在未偏离本发明精神和范围的情况下仍然获得相同或相似的结果。

实施例1-具有独特熔链特征的发夹探针延伸

已设计具有发夹的可延伸探针来在熔链分析期间提供独特的熔链峰，以使得在熔链测定中更好地区分靶标身份，这可使得进行更多多重检测。当针对扩增子中的序列进行第二级区分时，所述可延伸探针可以作为探针，或者其可以用作引物组中的引物(图1A-B)。

所述可延伸探针在序列中从5’端至3’端包含报告基团(星)(例如荧光团)、能够形成发夹的序列、设计用于在第二链合成期间阻断延伸的修饰(例如，C3间隔区)、isoG核苷酸和靶特异性序列。在采用所述延伸的探针作为模板的第二链合成期间，可以整合与isoG核苷酸相对的淬灭基团标记的isoC核苷酸(图1C-D)。

如果设计发夹探针以使得每个发夹具有唯一的T_m，则通过熔链分析可以区分所述探针。可以预计的是，可用于单色通道中之发夹的熔链温度(T_m)可以为55、60、65、70、75和80℃(图1E)。因此，采用六色通道可以建立36重测定。当对多个发夹进行熔链分析时，为了获得可区分的峰，必须设计发夹的熔链温度以确保使其低于反应中存在之所有扩增子的熔链温度(T_m)。

在该实施方案中，靶序列的存在将启动链式反应，由于发夹可延伸探针上报告基团的淬灭导致检测通道中的信号降低。然后，在熔链分析之后，由于报告基团与淬灭基团分离，在其预设的T_m(例如60℃)下，反应中存在其靶序列的探针将产生增加的熔链峰高度或曲线下面积(例如，图1F)。或者，在退火分析之后，由于退火后报告基团的淬灭，在其预设的Tm(例如65℃)下，反应中存在其靶序列的探针将产生减低的退火峰高度或曲线下面积(例如图2F)。

另外，如果需要扩增子自身的熔链峰，则报告基团-淬灭基团对可以在发夹熔链区分探针之扩增子的相对端使用。发夹序列还可以在扩增子的两端使用，以更加证明得到了靶扩增子。在扩增子相对端使用的荧光团可以具有不同的发射光谱。

实施例2-熔链-区分探针-模板对的核酸内切酶反应及随后的延伸和核酸外切酶切割

设计可延伸探针，在其3’端具有靶特异性杂交序列(序列B，图2A)，并且在其5’端具有熔链-区分模板特异性杂交序列(序列A，图2A)。在靶序列存在下，PCR反应期间，上游引物的聚合酶延伸切割熔链-区分模板特异性杂交序列(图2B)，并使靶特异性杂交序列降解。经切割的熔链-区分模板特异性杂交序列与熔链-区分模板(序列C，图2C)杂交并在其上延伸，所述熔链-区分模板具有在所述熔链-区分模板特异性杂交序列的结合位点下游杂交的预设熔链-区分探针(序列D，图2C)(图2C)。所述熔链-区分模板的3’端包含报告基团标记的isoG核苷酸，而所述熔链-区分探针的5’端包含淬灭基团标记的isoC核苷酸。在允许所述熔链-区分探针与所述熔链-区分模板杂交的条件下，报告基团和淬灭基团足够接近以使得所述报告基团淬灭。在PCR反应过程中，通过聚合酶延伸所述熔链-区分模板特异性杂交序列导致熔链-区分探针降解(图2D)。在PCR反应过程中，所述熔链-区分探针的降解导致报告基团信号的增加。

为了使反应多重进行，对熔链-区分探针-熔链-区分模板对进行设计以使得每对具有唯一的T_m。可以设计六对探针，这六对中每对的T_m为55、60、65、70、75或80℃，由此可以仅采用单色检测通道进行6重反应(图2E)。采用多个报告基团-淬灭基团对(其各自均在单个颜色通道上检测)使得能够用6个报告基团-淬灭基团对在六色通道上进行36重反应。在此情况下，在PCR反应之后的熔链分析中，熔链-区分探针的降解导致所述熔链-区分探针-熔链-区分模板复合物特定温度处的曲线下面积减小。(例如，图2F)。

实施例3-包含延伸阻断剂的熔链-区分探针-模板对的核酸内切酶反应及随后的延伸和核酸外切酶切割

此处呈现了实施例2中所述的熔链-区分探针-熔链-区分模板对的一个替代实施方案。在该实施方案中，所述熔链-区分模板(序列C)包含修饰(例如C3间隔区)，将所述修饰设计来阻断与熔链-区分探针(序列D)杂交的模板部分的延伸(图3A)。当来自经水解的靶特异性探针的序列A与熔链-区分模板(序列C，图3A)杂交并在其上延伸，所述熔链-区分模板具有在所述熔链-区分模板特异性杂交序列的结合位点下游杂交的预设熔链-区分探针(序列D，图3A)。所述熔链-区分模板的3’端包含报告基团标记的isoG核苷酸，而所述熔链-区分探针的5’端包含淬灭基团标记的isoC核苷酸。在允许所述熔链-区分探针与所述熔链-区分模板杂交的条件下，报告基团和淬灭基团足够接近以使得所述报告基团淬灭。在PCR反应过程中，通过聚合酶对所述熔链-区分模板特异性杂交序列的延伸会在延伸阻断修饰处停止，从而导致熔链-区分探针的部分降解(图3B)。在PCR反应过程中，所述熔链-区分探针的部分降解不影响报告基团的信号。只有在熔链分析后才获得信号。

对熔链-区分探针-熔链-区分模板对进行设计以使得每个完整对具有相同的T_m，例如80℃。然而，对每对进行设计以使得降解之后仍然与模板结合的探针部分具有唯一的T_m，例如50、55、60、65、70或75℃，由此使得能够仅采用单色检测通道就可以进行6重反应(图3C)。采用多个报告基团-淬灭基团对(其各自均在单个颜色通道上检测)使得能够采用6个报告基团-淬灭基团对在六色通道上进行36重反应。在该实施方案中，所述熔链-区分探针的部分降解导致熔链-区分探针-熔链-区分模板对的熔链谱发生迁移，其对应了反应中存在的靶序列(例如，图3D)。

实施例4-具有独特熔链特征的T-连接探针延伸

将在扩增子的链上形成T-连接的两个探针设计为仅与靶链杂交时延伸(图4-5)。在图4A所示的设计中，较长的下游探针在其5’端包含报告基团标记的isoG核苷酸，以及任选地，在其3’端包含阻断延伸的修饰。当这两个探针与靶链杂交时，较短的上游探针可以延伸并在其3’端整合淬灭基团标记的isoC核苷酸，其将使报告基团淬灭，并降低反应中的信号。

为了使反应多重进行，对可延伸探针进行设计以使得每对具有唯一的T_m，由此使得能够采用熔链分析以确定靶序列的存在。可以设计六对探针，所述六对中的每对T_m为55、60、65、70、75或80℃，由此使得能够仅采用单色检测通道进行6重反应(图4B)。采用多个报告基团-淬灭基团对(其各自均在单个颜色通道上检测)使得能够采用6个报告基团-淬灭基团对在六色通道上进行36重反应。

在该实施方案中，靶序列的存在将启动链式反应，由于所述发夹可延伸探针上报告基团的淬灭，导致检测通道内信号的降低。然后，在熔链分析后，由于报告基团与淬灭基团分离，在其预设的T_m(例如60℃)下，反应中存在其靶序列的探针将产生增加的熔链峰高度或曲线下面积(参见例如图1F)。或者，在退火分析后，由于退火后报告基团的淬灭，在其预设的T_m(例如65℃)下，反应中存在其靶序列的探针将产生降低的退火峰高度或曲线下面积(参见例如图2F)。

图5A示出了另一个经修饰的T-连接延伸探针系统。在此情况下，下游探针在其5’端包含未标记的isoC核苷酸，“镜像标签”序列，任选地，包含异碱基位置的序列(“isoprimer互补序列”)，与靶序列互补的序列，以及任选地，在其3’端包含修饰阻断延伸。另一方面，上游探针包含荧光标记的isoC核苷酸，“标签”序列，任选地，延伸阻断修饰，与靶序列互补的序列，以及任选地，与所述下游探针“isoprimer互补”序列的一个或更多个核苷酸互补的序列。当这两个探针与靶链杂交时，上游探针可延伸以整合与isoprimer互补序列和镜像标签互补的序列，并在其3’端整合淬灭基团标记的isoG核苷酸。在延伸之后，所述上游探针能够自杂交成发夹结构，其中标记的5’和3’异碱基彼此相邻(参见例如图5C)。因此，淬灭基团标记的isoG将使标记的isoC的荧光淬灭，其将使报告基团淬灭，并降低反应信号。

图5B示出了另一个经修饰的T-连接延伸探针系统。在此情况下，下游探针从5’至3’包含“镜像标签”序列(或所述序列的一部分)，任选地，包含异碱基位置的序列(“isoprimer互补序列”)，与靶序列互补的序列，以及任选地，在其3’端之阻断延伸的修饰。另一方面，上游探针包含荧光标记的isoC核苷酸，“标签”序列，任选地，延伸阻断修饰，与靶序列互补的序列，以及任选地，与所述下游探针的“isoprimer互补”序列的一个或更多个核苷酸互补的序列。当这两个探针与靶链杂交时，上游探针可延伸以整合与isoprimer互补序列和镜像标签序列(或该序列的一部分)互补的序列。在延伸之后，上游探针能够自杂交成发夹结构，而且3’序列可以进一步延伸以在其3’端整合淬灭基团标记的isoG核苷酸。所得到的发夹探针分子包含彼此相邻的经标记的5’和3’异碱基(参见例如附图5C)。因此，淬灭基团标记的isoG将使标记的isoC的荧光淬灭，其将使报告基团淬灭，并降低反应信号。

为了采用上述发夹型上游探针使反应多重进行，设计探针以使得上游探针所形成的每个发夹具有唯一T_m，由此使得能够采用熔链分析以确定靶序列的存在。特别地，可以改变标签序列的长度和组成，以提供每个探针的唯一熔链温度。例如，可以设计六个不同探针，所述六个探针的每个的T_m为55、60、65、70、75或80℃，由此使得能够仅采用单色检测通道进行6重反应(图5C)。采用多个报告基团-淬灭基团对(其各自均在单个颜色通道上检测)使得能够采用6个报告基团-淬灭基团对在六色通道上进行36重反应。

实施例5-单核苷酸多态性(SNP)检测的T-SNAP探针

如实施例4和图4A中所示的排列，设计在扩增子的链上形成T-连接的两个探针。较长的下游探针2(图5A中用“B”表示)在其5’端包含未标记的isoG核苷酸。较短的上游探针1(图4A中用“A”表示)在其5’端包含isoG-FAM核苷酸(任选地，标签序列和/或阻断延伸的修饰)和与靶标互补的序列。当这两个探针与靶链杂交时，基于探针1的3’延伸(在此情况下没有isoprimer部分)检测SNP，探针1的3’延伸与探针2的5’部分互补。整合与isoC-FAM相对的isoG-dabcyl核苷酸之后，探针1的延伸终止(图4A和4B)。

表1.用于阶段1和阶段2的示例性T-SNAP探针(如下所述)

表2.表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)PCR引物

阶段1

在延伸反应中形成T-连接

采用延伸测定以评价具有可变臂长(6-9个核苷酸)的探针1设计。简而言之，将10nM探针1和20nM探针2添加至反应混合物，所述反应混合物包含pH 9.1 BTP-KCl缓冲液，2.5mM dNTP，2.5mM MgCl₂，1mM dabcyl-isoG， Titanium Taq酶(Clontech)。采用有模板和没有模板进行多重复制。使用的模板为合成的扩增子序列，IDT的ultramer。在58℃下孵育33分钟，进行延伸反应，之后是熔链分析方案：60℃20秒，95℃1秒，之后在40℃下进行冷却步骤。结果示出，在这些浓度下，只有存在模板时，所有探针形成T-连接(图9)。

在不对称PCR中形成T-连接

在非对称PCR中进一步评价具有7个核苷酸臂长的探针1的T-连接形成。探针1和2两者的序列特异性区段均缩短，以获得更好的特异性，新序列在表3中示出。还进行了引物滴定(primer titration)，以确定探针对靶向模板的特异性。简而言之，将80nM探针1和40nM探针2添加至反应混合物，所述反应混合物包含pH 9.1 BTP-KCl缓冲液，2.5mM dNTP，2.5mM MgCl₂，1mM dabcyl-isoG，Titanium Taq酶(Clontech)。采用有模板和没有模板进行多重复制。使用的模板为合成的扩增子序列，所述序列来自IDT的ultramer(100fM)，并且使用三个不同浓度的PCR引物(80/40nM，40/40nM和40/80mM的Fwd/Rev)。在所有条件下检测特定产物。这些研究的结果示出不对称PCR有利于得到产生清楚和灵敏熔链曲线的靶向模板(图9-10)。

表3.用于以上详述的不对称PCR测定的探针。具有下划线的核苷酸表示探针“臂”。

阶段2-SNP检测

建立多重设计以测试T-SNAP方法检测SNP的能力。用于该研究的探针列在下表4中。SNP位于探针2之序列特异性区段上的3个不同位置，为连接处的6个核苷酸，连接处的10个核苷酸和连接处的3个核苷酸。结果示出SNP探针1_7-2，6和1_7-2，10表现出无延伸，表明良好的SNP鉴定，而SNP探针1_7-2，3表现出极小的延伸，表明无最佳的SNP鉴定(图11)。

表4.SNP探针。有下划线的核苷酸表示探针“臂”。有双下划线的核苷酸表示SNP位置。

阶段3-在单重PCR全长探针中的T-SNAP

根据图5A中的图设计探针，没有任选的“isoprimer”和“isoprimer互补序列”元件。所设计的探针序列显示在下表5中，探针1和探针2序列分别对应于图5A中的“A”和“B”探针。对于该研究，如上所述进行非对称PCR反应。采用的引物为Fwd/Rev＝80/40nM，模板为500fM。初步PCR数据显示，当臂为发夹茎的一部分时，如探针FL-探针1_8_04，熔链曲线的振幅更大(图12)。

表5.全长探针序列。有下划线的核苷酸表示探针“臂”。

实施例5-另一些发夹探针检测系统

图6详细描述了另一些发夹探针检测系统。在该系统中，设计两个探针以在扩增子的链上形成T-连接。上游探针在其5’端包含报告基团标记的isoG核苷酸(“isoG^*”)，与扩增子互补的序列(用“A”表示)，以及任选地，可以与下游探针的“isoprimer互补序列”碱基配对的一个或更多个核苷酸。下游探针包含与其自身碱基配对以形成发夹的序列(“发夹标签互补序列”)；包含isoG和/或isoC位置的序列(“isoprimer互补序列”)以及与扩增子互补的序列(用“B”表示)。上游探针的延伸将合成与下游探针上“isoprimer互补序列”和“发夹标签互补序列”互补的序列。经延伸的上游探针现包含发夹序列，其能够使探针进一步延伸，合成与(任选的)“isoprimer”和“A”序列互补的序列，并整合淬灭基团标记的isoC核苷酸。可以设计探针使其具有唯一的熔链温度(T_m)，例如通过调整发夹标签、“A”序列或isoprimer序列的序列和长度。可进行熔链分析以区分具有不同熔链温度的探针(并由此在不同温度下未淬灭)。

图7示出发夹探针检测系统的另一个实施例。在该系统中，采用至少第一经标记的引物来扩增靶序列。特别地，经标记的引物包含5’isoC，以及随后的“镜像标签”序列(和靶特异性序列)。报告基团探针在其5’端包含报告基团标记的isoC核苷酸(“isoC^*”)，标签序列(“标签”)，以及任选地，延伸阻断修饰；和与扩增子互补的序列(用“A”表示)。在靶扩增子存在下，报告基团探针与扩增子杂交，并延伸至扩增子的端部以整合“标签互补”序列和3’淬灭基团标记的isoG(“isoG^Q”)。延伸的报告基团探针现包含标签和标签互补序列，其使得探针形成发夹，并由此使标记的isoC的荧光淬灭。例如通过调节标签序列的序列和长度，可以将探针设计为具有唯一的熔链温度(T_m)。因此，可以进行熔链分析以区分具有不同熔链温度的探针(并由此在不同温度下未淬灭)。

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根据本公开内容，不需要过度实验就可以进行和实施本文公开和要求保护的所有方法。尽管在一些优选实施方案中对本发明的组合物和方法进行了描述，但是对于本领域技术人员来说，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，对本文描述的方法和步骤或方法步骤中的顺序进行变动是明显的。更特别地，化学和生理两者均相关的某些试剂可以替代本文所述的试剂同时达到相同或类似效果是明显的。对于本领域技术人员来说明显的是所有这样的类似替代和修饰被认为落在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

以下参考文献以提供了作为本文所述那些之补充的示例性程序或其它细节的程度，特别通过引用并入本文。

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U.S.公开文本No.2005/0191625；2008/0182312；和2009/0148849。

国际(PCT)公开No.WO/2011/050278。

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Ren等，J.Am.Chem.Soc.1996，118：1671。

Claims (74)

1.用于检测靶核酸存在的体外方法，其包括：

(a)将样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；

(b)延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成延伸的上游探针；

(c)使所述延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；

(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针中的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及

(e)通过检测所述发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述靶核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3至10个碱基的3’序列。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针的标签序列互补的3至10个碱基的3’序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基的3’序列。

6.如权利要求1所述的方法，其中在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游探针和所述下游探针的熔链点低于55℃。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述报告基团-淬灭基团对的第一成员为报告基团。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述报告基团为荧光团。

9.如权利要求8所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括检测荧光信号的改变。

10.如权利要求1所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括当样品温度改变时检测所述报告基团-淬灭基团对的信号改变。

11.如权利要求10所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括当样品的温度升高至高于发夹探针的熔链点时检测所述报告基团-淬灭基团对的信号改变。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述下游探针连接固体支持物。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个非天然核苷酸或淬灭基团标记的非天然核苷酸为isoG，另一个为isoC。

14.如权利要求1所述的方法，其还包括：

(a)使所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含第二上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第二下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述第二上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第二上游探针包含与所述第二下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述第二探针组形成T-连接；

(b)延伸所述第二上游探针以合成与所述第二下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成第二延伸的上游探针；

(c)使所述第二延伸的上游探针与其自身杂交以形成第二发夹探针；

(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述第二发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述第二上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及

(e)通过检测所述第二发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述第二靶核酸。

15.如权利要求14所述的方法，其还包括：

(a)将所述样品与第三、第四、第五或第六探针组接触，每组探针包含第三、第四、第五或第六上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第三、第四、第五或第六下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述第三、第四、第五或第六上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第三、第四、第五或第六上游探针包含与所述第三、第四、第五或第六下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述第三、第四、第五或第六靶核酸杂交时，所述第三、第四、第五或第六探针组形成T-连接；

(b)延伸所述第三、第四、第五或第六上游探针以合成与所述第三、第四、第五或第六下游探针上的镜像标签序列互补的序列，以形成第三、第四、第五或第六延伸的上游探针；

(c)使所述第三、第四、第五或第六延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；

(d)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述第三、第四、第五或第六发夹探针，所述非天然核苷酸能够与所述第三、第四、第五或第六上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；以及

(e)通过检测所述第三、第四、第五或第六发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述第三、第四、第五或第六靶核酸。

16.如权利要求14所述的方法，其中基本同时检测所述第一和第二靶核酸的存在。

17.如权利要求14所述的方法，其中顺序检测所述第一和第二靶核酸的存在。

18.如权利要求14所述的方法，其中所述第一和第二探针组包含可区分的标记物。

19.如权利要求14所述的方法，其中所述第一和第二探针组包含相同的标记物。

20.如权利要求19所述的方法，其中由所述第一和第二探针组形成的所述发夹探针包括可区分的熔链点。

21.如权利要求15所述的方法，其中由所述第一、第二、第三、第四、第五和第六探针组形成的所述发夹探针各自包括可区分的标记物或可区分的熔链点。

22.如权利要求1所述的方法，其还包括进行多重聚合酶链式反应循环。

23.如权利要求22所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括在进行多重聚合酶链式反应循环之前和之后检测所述报告基团的信号。

24.如权利要求22所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括仅在进行多重聚合酶链式反应循环之后检测所述报告基团的信号。

25.如权利要求24所述的方法，其还包括将所检测到的标记物之信号与非杂交探针上标记物的参照信号相比较。

26.如权利要求22所述的方法，其还包括对样品中靶核酸的量进行定量。

27.如权利要求26所述的方法，其中对所述样品中靶核酸的量进行定量包括：采用标准曲线；确定所述靶核酸的相对量；采用终点定量；或者通过将相对于背景可检测到信号的PCR循环数与存在的靶标量相关联，来确定所述靶核酸的量。

28.包含第一探针组的组合物，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。

29.如权利要求28所述的组合物，其还包含第二探针组，所述第二探针组包含第二上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第二下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述第二上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第二上游探针包含与所述第二下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述第二探针组形成T-连接。

30.如权利要求29所述的组合物，其中所述第一和第二探针组包含可区分的标记物，或者形成具有可区分熔链点的发夹探针。

31.如权利要求29所述的组合物，其包含至少四组探针。

32.如权利要求28所述的组合物，其还包含用报告基团标记的或者用淬灭基团标记的非天然核苷酸。

33.如权利要求28所述的组合物，其还包含聚合酶、参照探针或游离核苷酸。

34.试剂盒，其包含：

(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，其从5’至3’包含，(i)用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)标签序列；和(iii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)与所述上游探针的标签序列具有相同序列的镜像标签序列；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；以及

(b)用报告基团标记的或者用淬灭基团标记的非天然核苷酸。

35.如权利要求34所述的试剂盒，其包含至少四组探针。

36.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述探针组包含可区分的标记物，或者形成具有可区分熔链点的发夹探针。

37.如权利要求34所述的试剂盒，其还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸、参照样品或试剂盒的使用说明。

38.用于检测靶核酸存在的方法，其包括：

(a)将样品与第一探针组接触，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；(ii)与所述靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；

(b)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探针以合成与所述下游探针上的镜像标签序列互补的序列，从而形成延伸的上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；

(c)使延伸的上游探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及

(d)通过检测所述发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述靶核酸。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3至10个碱基的3’序列。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针的标签序列互补的3至10个碱基的3’序列。

41.如权利要求38所述的方法，其中所述下游探针还包含(iii)包含一个或更多个非天然碱基的isoprimer互补序列，其位于所述镜像标签序列和与所述靶核酸第一链上之位于第一区域下游的第二区域互补的序列之间，所述镜像标签序列与所述上游探针的标签序列具有相同序列并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述上游探针包含与所述下游探针的isoprimer互补序列互补的3至10个碱基的3’序列。

43.如权利要求38所述的方法，其中在延伸之前，在靶核酸不存在下，所述上游探针和下游探针的熔链点低于55℃。

44.如权利要求38所述的方法，其中所述报告基团-淬灭基团对的第一成员为报告基团。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述报告基团为荧光团。

46.如权利要求45所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括检测荧光信号。

47.如权利要求38所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括当样品温度改变时检测所述报告基团的信号改变。

48.如权利要求47所述的方法，其中检测所述报告基团的信号改变包括当样品的温度升高至高于发夹探针的熔链点时检测所述报告基团的信号改变。

49.如权利要求38所述的方法，其中所述下游探针连接固体支持物。

50.如权利要求38所述的方法，其中所述至少一个非天然核苷酸或淬灭基团标记的非天然核苷酸为isoG，另一个为isoC。

51.如权利要求38所述的方法，其还包括：

(a)使所述样品与第二探针组接触，所述第二探针组包含第二上游探针，所述第二上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第二下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述第二上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第二上游探针包含与所述第二下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述第二探针组形成T-连接；

(b)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在的情况下，延伸所述第二上游探针以合成与所述第二下游探针上的镜像标签序列互补的序列，并形成第二延伸的上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述第二上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；

(c)使第二延伸的上游探针与其自身杂交以形成第二发夹探针；以及

(d)通过检测所述第二发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述第二靶核酸。

52.如权利要求51所述的方法，其还包括：

(a)将所述样品与第三、第四、第五或第六探针组接触，所述探针组包含第三、第四、第五或第六上游探针，所述第三、第四、第五或第六上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其至少包含第一报告基团标记的非天然核苷酸；和(ii)与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第三、第四、第五或第六下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述第三、第四、第五或第六上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第三、第四、第五或第六上游探针包含与所述第三、第四、第五或第六下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述第三、第四、第五或第六探针组形成T-连接；

(b)在用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸存在的情况下，延伸所述第三、第四、第五或第六上游探针以合成与所述第三、第四、第五或第六下游探针上的镜像标签序列互补的序列，并形成第三、第四、第五或第六延伸的上游探针，所述非天然核苷酸能够与所述第三、第四、第五或第六上游探针的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对；

(c)使所述第三、第四、第五或第六延伸的上游探针与其自身杂交以形成第三、第四、第五或第六发夹探针；以及

(d)通过检测所述第三、第四、第五或第六发夹探针上的所述报告基团-淬灭基团对来检测所述第三、第四、第五或第六靶核酸。

53.如权利要求51所述的方法，其中基本同时检测所述第一和第二靶核酸的存在。

54.如权利要求51所述的方法，其中顺序检测所述第一和第二靶核酸的存在。

55.如权利要求51所述的方法，其中所述第一和第二探针组包含可区分的标记物。

56.如权利要求51所述的方法，其中所述第一和第二探针组包含相同的标记物。

57.如权利要求56所述的方法，其中由所述第一和第二探针组形成的发夹探针包括可区分的熔链点。

58.如权利要求52所述的方法，其中由所述第一、第二、第三、第四、第五和第六探针组形成的发夹探针各自包括可区分的标记物或可区分的熔链点。

59.如权利要求38所述的方法，其还包括进行多重聚合酶链式反应循环。

60.如权利要求59所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括在进行多重聚合酶链式反应循环之前和之后检测所述报告基团的信号。

61.如权利要求59所述的方法，其中检测所述报告基团-淬灭基团对包括仅在进行多重聚合酶链式反应循环之后检测所述报告基团的信号。

62.如权利要求61所述的方法，其还包括将检测到的标记物之信号与非杂交探针上标记物的参照信号相比较。

63.如权利要求59所述的方法，其还包括对样品中的靶核酸的量进行定量。

64.如权利要求63所述的方法，其中对样品中的靶核酸的量进行定量包括：采用标准曲线；确定所述靶核酸的相对量；采用终点定量；或者通过将相对于背景可检测到信号的PCR循环数与存在的靶标量相关联，来确定所述靶核酸的量。

65.包含第一探针组的组合物，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接。

66.如权利要求65所述的组合物，其还包含第二探针组，所述第二探针组包含第二上游探针，所述第二上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与第二靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及第二下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述第二上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述第二靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述第二上游探针包含与所述第二下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述第二探针组形成T-连接。

67.如权利要求66所述的组合物，其中所述第一和第二探针组包含可区分的标记物，或者形成具有可区分熔链点的发夹探针。

68.如权利要求66所述的组合物，其包含至少四组探针。

69.如权利要求65所述的组合物，其还包含报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。

70.如权利要求65所述的组合物，其还包含聚合酶、参照探针或游离核苷酸。

71.试剂盒，其包含：

(a)第一探针组，所述探针组包含上游探针，所述上游探针从5’至3’包含，(i)标签序列，其包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸；和(ii)与靶核酸第一链上的第一区域互补的序列；以及下游探针，其从5’至3’包含，(i)镜像标签序列，其与所述上游探针的标签序列具有相同序列，并且至少包含第一未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述靶核酸第一链上之位于所述第一区域下游的第二区域互补的序列，其中所述上游探针包含与所述下游探针互补的3个或更多个碱基的3’序列，以使得当与所述靶核酸杂交时，所述探针组形成T-连接；和

(b)报告基团标记的或者淬灭基团标记的非天然核苷酸。

72.如权利要求71所述的试剂盒，其包含至少四组探针。

73.如权利要求72所述的试剂盒，其中所述探针组包含可区分的标记物，或者形成具有可区分熔链点的发夹探针。

74.如权利要求71所述的试剂盒，其还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸、参照样品或试剂盒的使用说明。