JP2002315567A

JP2002315567A - 細胞接着活性物質を含有してなる幹細胞培養用基材

Info

Publication number: JP2002315567A
Application number: JP2001119786A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiko Tabata; 泰彦田畑; Tatsuya Osumi; 辰也大隅; Sukehito Kurokawa; 祐人黒川
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2001-04-18
Filing date: 2001-04-18
Publication date: 2002-10-29

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】幹細胞を、その分化能を維持したまま効率良
く増殖させるための培養基材を提供する。【解決手段】遺伝子組み換え微生物によって合成さ
れ、細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配列を１分子
中に少なくとも１個有するポリペプチドからなる細胞接
着活性物質（Ａ）を含有することを特徴とする幹細胞
（Ｂ）培養用の基材を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、幹細胞培養用の基
材に関する。さらに詳しくは効率良くその双分化能を維
持させた状態で幹細胞の数を増やすための培養基材に関
する。

【０００２】

【従来の技術】幹細胞の研究や幹細胞を用いた細胞移植
治療のための方法として、細胞との親和性の高いＩ型コ
ラーゲンをコートした培養基材、コラーゲンゲル等の培
養基材を用いて培養する方法が一般に知られている（カ
プラン（A.I.Caplan）、セルトランスプランテーション
（Cell Transplantation）、1992年）。また、コラーゲ
ン以外の細胞外マトリックス成分、例えばラミニン、フ
ィブロネクチン等をコートした培養基材の研究も行われ
ている（ブルーダー等（S.P.Bruder et al.）、ジャー
ナルオブボーンアンドジョイントサージェリ
ー（Journal of Bone and Joint Surgery）80A,1998
年、985−996頁）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の生理活性を持つ生体成分（Ｉ型コラーゲン、ラミニン
及びフィブロネクチン等）をコートした培養基材を用い
ても、細胞の増殖速度は十分ではなく、細胞表面レセプ
ター、細胞内メカニズム等の解析に必要な細胞数を確保
するために多大の労力が必要であった。すなわち、本発
明の目的は、幹細胞を効率的に高い細胞活性を維持した
まま増殖させることのできる培養基材を提供することで
ある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ねてきた結果、細胞接着活性物質の存在下で幹細胞を
培養することにより上記の目的を達成し得ることを見い
だし本発明に到達した。すなわち、本発明の幹細胞培養
用基材の特徴は、細胞接着活性物質（Ａ）を含有してな
る点にある。これにより、細胞接着活性が高まり、双分
化能を維持した状態で幹細胞の増殖を促進することが可
能となる。

【０００５】

【発明の実施の形態】まず、細胞接着活性物質（Ａ）に
ついて説明する。（Ａ）は、細胞接着活性を有する物質
であり、天然系物質及び人工系物質が使用できる。天然
系物資としては、基底膜に存在する糖タンパク（例え
ば、エンタクチン（ナイドジェン）、テネイシン、アグ
リン、オステオネクチン、オステオカルシン、オステオ
ポンチン、フィブルイン、フィブリノーゲン、ビトロネ
クチン、アンカリン、バミン及びトロンボスポンジン
等）、プロテオグリカン（例えば、アグリカン、パール
カン、ビグリカン、デコリン、フィブロモジュリン、バ
ーシカン、デュリン、ニューロカン、ブレビカン、ルー
ミカン、セルグリシン、シンデカン、ＣＤ４４、ベータ
グリカン、トロンボモデュリン、グリピカン、セレブロ
グリカン及びＮＧ２プロテオグリカン等）、細胞膜に存
在する糖タンパク（例えば、インテグリン、インテグリ
ンスーパーファミリー、カドヘリン及びカドヘリンスー
パーファミリー等）、タイトジャンクションに関する物
質（例えば、オクルディン等）等が挙げられる。

【０００６】人工系物質としては、遺伝子組換微生物に
よって合成され、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ
酸配列を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド
（Ａ１）等が挙げられる。ポリペプチド（Ａ１）におい
て、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列として
は、接着シグナルとして働くものであればいずれも使用
でき、例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏ
ｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁に記載されて
いる最小アミノ酸配列等が挙げられる。

【０００７】この中で、接着する細胞が多いという点
で、アミノ酸一文字表記で現わされるＲＧＤ配列、ＬＤ
Ｖ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配
列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡ
ＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧ
ＥＡ配列及びＨＡＶ配列が好ましく、さらに好ましくは
ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴ
ＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ま
しくはＲＧＤ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列であ
る。ポリペプチド（Ａ１）は、これらの最小アミノ酸配
列の少なくとも１種の配列を含んでいればよく、２種以
上の配列を組み合わせて含んでいてもよい。

【０００８】ポリペプチド（Ａ１）中には前記最小アミ
ノ酸配列が１分子中に少なくとも１個含有される必要が
ある。最小アミノ酸配列が含有されない場合、細胞接着
性が低下する結果、本材料上又は本材料内での細胞の増
殖が不十分となる傾向がある。この最小アミノ酸配列の
含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、１分子中３〜
５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に
好ましくは５〜２０個である。

【０００９】ポリペプチド（Ａ１）の数平均分子量は、
細胞に対する毒性が低く、接着性能が高いという点で、
５，０００〜５，０００，０００が好ましく、さらに好
ましくは１０，０００〜１，０００，０００、特に好ま
しくは５０，０００〜５００，０００である。なお、ポ
リペプチド（Ａ１）の数平均分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法（Ｎａドデシルスルフェイト−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法）で、（Ａ１）を水中で展開し、泳動距
離を標準物質と比較することによって求められる。

【００１０】ポリペプチド（Ａ１）には、細胞接着シグ
ナルを現わす最小アミノ酸配列以外に、（Ａ１）の熱安
定性、構造安定性及び／又は必要により適当な水溶性を
向上させるアミノ酸配列、例えばシルクフィブロイン由
来のアミノ酸配列ＧＡＧＡＧＳ等を有することが好まし
く、これらのアミノ酸配列を少なくとも２個（好ましく
は３〜５０個、さらに好ましくは５〜２０個）有するこ
とがさらに好ましい。

【００１１】ポリペプチド（Ａ１）の好ましい具体例と
しては、三洋化成工業（株）製プロネクチンＦ（遺伝子
組換大腸菌により製造され、細胞接着シグナルＲＧＤ配
列とＧＡＧＡＧＳ配列を１分子中に各々約１３個有する
数平均分子量約１１万のポリペプチド）、同プロネクチ
ンＦプラス（プロネクチンＦとジメルアミノエチルクロ
ライドと反応させて水溶性にしたもの）、同プロネクチ
ンＬ（遺伝子組換大腸菌により製造され、細胞接着シグ
ナルＩＫＶＡＶ配列とＧＡＧＡＧＳ配列を１分子中に各
々約７個有する数平均分子量約９万のポリペプチド）等
が挙げられる。

【００１２】ポリペプチド（Ａ１）は、遺伝子組換微生
物（例えば、酵母、細菌及び大腸菌等）によって生産さ
れ、例えば、特表平３−５０２９３５号公報等に記載さ
れている方法により、容易に得られる。なお、化学合成
でも生産可能であるが、微生物によって合成されるもの
が均一であり、細胞増殖性に優れているので好ましい。

【００１３】本発明の基材は、細胞培養用容器及び／又
は培地と、細胞接着活性物質（Ａ）とを含有してなる基
材であることが好ましい。細胞培養用容器としては、プ
ラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリアルファオレ
フィン、ポリプロピレン、ポリエチレン及びこれらの複
合体等）及び／又は無機物（例えば、ガラス、セラミッ
クス、金属及びこれらの複合体等）からなる細胞培養用
容器であれば特に制限はなく使用できる。容器の形状と
しては、マルチウェルプレート（例えば、６穴プレー
ト、２４穴プレート及び９６穴プレート等）、シャーレ
（例えば、直径；３５，６０，１００mm等）、Ｔ−フラ
スコ（例えば、容量；２５，７５，１５０，２２５ｍL
等）、ローラーボトル（例えば、培養面積；６９０，９
７０，１２００，１３００ｃｍ²等）、マイクロキャリ
アビーズ及びホローファイバー等の他、繊維状、布帛状
又はスポンジ状等の３次元的な構造物に成形したもの等
が用いられる。

【００１４】細胞接着活性物質（Ａ）を含有した細胞培
養用容器を作製する方法としては、容器の表面に
（Ａ）をコーティング処理する方法、（Ａ）とプラス
チックとからなる混合物を成形し容器とする方法等が挙
げられる。の方法の場合、細胞接着活性物質（Ａ）の
コーティング量は、基材の培養表面積１００ｃｍ²あた
り、０．００００１〜１００００ｍｇが好ましく、さら
に好ましくは０．０００１〜１０００ｍｇ、特に好まし
くは０．００１〜１００ｍｇ、最も好ましくは０．０１
〜１０ｍｇである。また、の方法の場合、基材中の細
胞接着活性物質（Ａ）の含有量は、基材１０ｇ当り、
０．００００１〜５０００ｍｇが好ましく、さらに好ま
しくは０．０００１〜１０００ｍｇ、特に好ましくは
０．００１〜１００ｍｇ、最も好ましくは０．０１〜１
０ｍｇである。これらのうち、細胞接着活性物質（A）
の含有量を種々変更した基材を容易に得られるという観
点から、の方法が好ましい。

【００１５】容器への細胞接着活性物質（Ａ）のコーテ
ィング方法としては、（１）（Ａ）を溶媒に溶かした溶
液を予め作製し、プレート、シャーレ又はＴ−フラスコ
等に加え、所定のコーティング時間静置した後に余分の
溶液を捨て乾燥させるか、余分の溶液を捨てずに乾燥さ
せる方法、（２）（Ａ）を溶媒に溶かした溶液をローラ
ーボトルに加え、所定のコーティング時間ローラーボト
ルを回転させた後に余分の溶液を捨て乾燥させるか、余
分の溶液を捨てずに乾燥させる方法、（３）（Ａ）を溶
媒に溶かした溶液中にマイクロキャリアビーズを入れて
所定のコーティング時間必要に応じて撹拌した後に溶液
から取り出し必要に応じて乾燥させる方法、（４）
（Ａ）を溶媒に溶かした溶液をホローファイバー中に所
定のコーティング時間循環させた後、必要に応じて乾燥
させる方法等が挙げられる。

【００１６】細胞接着活性物質（Ａ）の溶液を作製する
ために用いられる溶媒としては特に制限はないが、無機
塩、アミノ酸、ビタミン、有機酸塩、アルコール、脂
質、糖類、酸及び／又は塩基を水溶液の重量に基づいて
０．１〜５０重量％（好ましくは１〜３０重量％）含有
する水溶液、並びに水等が使用できる。無機塩として
は、ハロゲン化アルカリ金属、硫酸アルカリ金属及び過
塩素酸アルカリ金属等が使用でき、例えば、塩化ナトリ
ウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシ
ウム、硝酸鉄、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸
ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、
リン酸水素カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、塩化リチウム、
臭化リチウム及び過塩素酸リチウム等が挙げられる。

【００１７】アミノ酸としては、炭素数２〜１１のＬ−
アミノカルボン酸等が用いられ、例えば、アルギニン、
ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フ
ェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシ
ン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン等が
挙げられる。ビタミンとしては、例えば、コリン、イノ
シトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミンＡ及
びビタミンＢ１２等が挙げられる。

【００１８】有機酸塩としては、炭素数１〜７の有機酸
塩等が用いられ、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウ
ム、安息香酸リチウム、安息香酸ナトリウム、メタンス
ルホン酸カリウム及びトルエンスルホン酸ナトリウム等
が挙げられる。アルコールとしては、炭素数１〜５のア
ルコール等が用いられ、例えば、メタノール、エタノー
ル、エチレングリコール、イソプロピルアルコール、プ
ロピレングリコール、グリセリン、ブタノール及びトリ
メチロールプロパン等が挙げられる。

【００１９】脂質としては、脂肪酸グリセリド（脂肪酸
（炭素数８〜２２）のグリセリド等）、リン脂質（脂肪
酸（炭素数８〜２２）のリン酸エステル等）、糖脂質
（スフィンゴ糖脂質及びスルホリピド等）等が挙げられ
る。糖類としては、単糖（例えば、ブドウ糖、エリトロ
ース、リボース及びフルクトース等）、２糖（例えば、
ラクトース、スクロース、トレハロース及びマルトース
等）、オリゴ糖（例えば、アミロース及びアミロペクチ
ン等）及びアミノ糖（例えば、前記アミノ酸）等が挙げ
られる。酸としては、無機酸及び炭素数１〜６の有機酸
等が使用でき、例えば、塩酸、燐酸、硝酸、過塩素酸、
硫酸、酢酸、蟻酸、プロピオン酸、マレイン酸及びフェ
ノール等が挙げられる。

【００２０】塩基としては、無機塩基及び炭素数２〜６
の有機塩基等が使用でき、例えば、水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、アンモニア、モ
ノエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレン
ジアミン、トリエチレンテトラミン及びトリエチルアミ
ン等が挙げられる。水としては、蒸留水、イオン交換
水、水道水及びイオン交換蒸留水等が挙げられる。これ
らの溶媒の中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する
水溶液並びに水が好ましく、さらに好ましくは無機塩を
含有する水溶液並びに水、特に好ましくは無機塩を含有
する水溶液である。

【００２１】細胞接着活性物質（Ａ）の溶液の濃度は、
溶媒１ｍｌ当り、０．０１μｇ〜１００ｍｇが好まし
く、さらに好ましくは０．１μｇ〜１０ｍｇ、特に好ま
しくは１μｇ〜１ｍｇである。コーティング時間として
は、３０秒〜４８時間が好ましく、さらに好ましくは１
分〜２４時間、特に好ましくは３分〜１２時間である。
必要に応じて行われる乾燥の条件についても特に制限は
なく通常の方法が適用でき、例えば、必要に応じて順風
乾燥機や減圧乾燥機等を用いて、０〜２００℃、０．０
０１Ｐa〜大気圧の圧力下で、０．１〜１００時間乾燥
することで行える。

【００２２】また、必要に応じて、乾燥の前及び／又は
後に、無機塩を含有する水溶液又は水で通常の方法で洗
浄することもできる。また、コーティングの後に、必要
に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限
はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス
滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。

【００２３】培地としては、用いる幹細胞（Ｂ）の種類
に応じて変化するが、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ
培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ
−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培
地、ＲＰＭＩ培地及びこれらの混合物等（例えば、朝倉
書店発行、日本組織培養学会編「組織培養の技術」第三
版５８１頁）、並びにこれらの培地に血清成分（例え
ば、ウシ胎児血清等）等を添加したもの等が用いられ
る。

【００２４】培地中には、添加剤として、血清成分以外
に必要に応じてさらに、細胞増殖因子（Ｃ）を含有させ
ることができる。細胞増殖因子（Ｃ）を含有することに
により、さらに（Ｂ）の増殖速度を高めたり、細胞活性
を高めたりすることができる。細胞増殖因子（Ｃ）は細
胞を増殖させる活性のある物質であり、例えば、線維芽
細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細
胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、イ
ンスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因
子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリ
ン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長
因子、アンジオポエチン、コンドロモジュリン、テノモ
ジュリン、サイトカイン類、インターロイキン類、アド
レナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活
性ペプチド等（例えば、財団法人名古屋大学出版会発行
「上田実編ティッシュエンジニアリング」（１９９９
年）４３〜５１頁）が挙げられる。

【００２５】これらの中で、幹細胞の増殖活性が高く、
細胞の分化にあまり関与していない考えられているとい
う観点から、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミン
グ増殖因子、肝細胞増殖因子、インシュリン様増殖因
子、血管内皮細胞増殖因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖
因子及び結合組織成長因子が好ましく、さらに好ましく
は線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因
子、血管内皮細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子及び肝細
胞増殖因子である。

【００２６】細胞増殖因子（Ｃ）を使用する場合、
（Ｃ）の含有量は、幹細胞（Ｂ）１００重量部に対し
て、０．００００１〜５００重量部が好ましく、さらに
好ましくは０．０００１〜５０重量部、特に好ましくは
０．００１〜１０重量部である。細胞増殖因子（Ｃ）の
含有量がこの範囲であると、細胞の増殖性がさらに促進
される。細胞増殖因子（Ｃ）を培地に添加する方法とし
ては、培地に（Ｃ）を直接加える方法や、予め（Ｃ）を
前記の溶媒等に溶解又は分散したものを加える方法等が
挙げられる。

【００２７】さらに培地中には必要に応じて、他の成分
（Ｄ）として、安定化剤（例えば、酸化防止剤及び抗菌
剤等）及びｐＨ調整剤（例えば、炭酸カルシウム及びリ
ン酸カルシウム等）等を含有させることができる。他の
成分（Ｄ）を使用する場合、（Ｄ）の含有量は、幹細胞
（Ｂ）１００重量部に対して、０．００００１〜５００
重量部が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜５
０重量部、特に好ましくは０．００１〜１０重量部であ
る。

【００２８】次に、幹細胞（Ｂ）について説明する。幹
細胞（Ｂ）は、各種組織や臓器中に含まれ、（多）分化
能をもち、増殖させることができる細胞の総称であり、
将来、各組織や臓器を構成する成熟細胞になる能力をも
つ前駆細胞や芽細胞も含まれる。この細胞を効率良く利
用することで、細胞各種組織や臓器の一部として機能
し、各種組織や臓器の欠損や損傷を修復できるものであ
る。

【００２９】具体的には、例えば、骨髄未分化間葉系幹
細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹
細胞（oval cell、small hepatocyte等）、脂肪組織幹
細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、
精子幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管
上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、
角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆
細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細
胞等）等が挙げられる。これらのうち好ましいものは、
骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細
胞、神経幹細胞、肝幹細胞、脂肪組織幹細胞、前駆細胞
（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リ
ンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）及び胚性幹細胞で
あり、さらに好ましいものは骨髄未分化間葉系幹細胞、
骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞及
び脂肪組織幹細胞である。

【００３０】幹細胞（B）が、分化能を有することは、
分化誘導させる前後の細胞が産生する物質の変化を計測
することで判定でき、例えば骨関連細胞系列に分化した
場合は培地中のカルシウムが増加することや、アルカリ
フォスファターゼ活性が高まることで簡易的に判断でき
るが、厳密には、細胞毎に特定の分化マーカーが発現す
るかどうかで判定することができる（カプラン（A.I.Ca
plan）、セルトランスプランテーション（Cell Trans
plantation）1992年、ブルーダー等（S.P.Bruder et a
l.）、ジャーナルオブボーンアンドジョイント
サージェリー（Journal of Bone and Joint Surger
y）80A,（1998年）985−996頁）。本願発明の基材を用
いて幹細胞を培養すると、増殖した細胞の大部分におい
て分化マーカーの発現が見られず未分化状態を維持した
ままである。

【００３１】例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞は未分化
の状態ではオステオカルシンを発現しないが、骨関連細
胞系列に分化し幹細胞ではなくなるとオステオカルシン
を発現することから、オステオカルシンが発現している
かどうかを計測することで幹細胞かどうかが判別でき
る。同様に、骨格筋幹細胞が平滑筋に分化した場合には
スムースマッスルミオシンＩＩが発現され、脂肪組織幹
細胞が脂肪細胞に分化した場合にはグリセロールトリホ
スフェートデハイドロジェネース（ＧＢＤＨ）が発現さ
れるため、幹細胞かどうかが判別できる。

【００３２】本発明の基材は、幹細胞（Ｂ）を分化能を
有したまま培養し増殖させるために好適に用いられる。
本発明の基材に幹細胞（Ｂ）を加えて、例えばＣＯ₂イ
ンキュベーター中で、一定の条件で維持することで簡易
に培養できる。幹細胞（Ｂ）を培養する方法としては特
に制限は無く、通常の方法を用いることができる。幹細
胞（Ｂ）の含有量としては、培養基材表面積１ｃｍ2当
り、０．１個〜１０００万個が好ましく、さらに好まし
くは１〜５００万個、特に好ましくは１００〜１００万
個である。

【００３３】培養条件としては、特に制限は無く、ＣＯ
2濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１２時間〜１００
日間、必要に応じて１〜３日毎に培地交換しなら培養す
る条件等が挙げられる。好ましい条件としては、ＣＯ2
濃度５体積％、３７℃１〜３６日間、２〜３日毎に培地
交換しなら培養することである。

【００３４】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。実施例１＜細胞培養プレートの作製＞三洋化成工業（株）製プロ
ネクチンＦの４．５規定の過塩素酸リチウム溶液（プロ
ネクチンＦの濃度；１ｍｇ／ｍｌ）をリン酸バッファー
液（ＰＢＳ）でプロネクチンＦの濃度が１０μｇ／ｍｌ
となるように希釈し、ＰｎＦ溶液を作製した。旭テクノ
グラス製６穴細胞培養プレート（ＩＷＡＫＩＳＣＩＴ
ＥＣＨＤＩＶ）にＰｎＦ溶液を１穴当り３．３ｍｌづ
つ加え、５分間室温で静置後、残液を除き、室温で１２
時間放置して乾燥した。さらにそれぞれの穴についてＰ
ＢＳ６ｍｌで２回洗浄し、プロネクチンＦをコートした
細胞培養プレート１を得た。

【００３５】＜細胞培養；ラット骨髄間葉幹細胞＞６週
齢の雄フィッシャーラットの大腿骨を取り出し、骨両端
を切り取った後、注射器を用いて５ｍｌのＰＢＳを骨髄
内に注入し回収することで骨髄細胞をＰＢＳ溶液分散体
として得た。この分散体を培地（比率：ＧＩＢＣＯＢ
ＲＬ製ＭＥＭアルファ培地４ｍｌ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａ
ｋｅｒ製ＦＢＳ０．４ｍｌ，ナカライテスク製硫酸カナ
マイシン０．０００２４ｇ，炭酸水素ナトリウム０．０
０８８ｇ、以下、断りがない限り培地はこの組成のもの
である。）１０ｍｌに縣濁し、細胞濃度；１×１０6個
／ｍｌの細胞縣濁液を得た。この細胞懸濁液１０ｍｌを
直径１０ｃｍの培養シャーレに加えて、３７℃、５体積
％ＣＯ2で培養した。３日後、上清を除き、浮遊してい
る細胞を除去した後、再び培地を１０ｍｌ加えてさらに
１週間同じ条件で培養した。培地を除き、トリプシン処
理を行い、ラット骨髄未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を
得た。

【００３６】ラットＭＳＣを培地に分散し、細胞数２０
０万個／ｍｌの縣濁液を作製し、１穴当り、該懸濁液
０．１ｍｌ（細胞数；２０万個／穴）と培地２ｍｌを上
記細胞培養プレート１に加え、３７℃、５％ＣＯ2、で
２週間培養した。培地成分をマイクロピペットを用いて
除き、プレート底面に接着した細胞数を水溶性ＭＴＴ試
薬（和研薬株式会社製）を用いて測定し、また、培地に
ついて、ＯＣＰＣ法カルシウム定量キット（和研薬株式
会社製）によって培地中のカルシウム量を測定した。こ
れらの測定結果を表１に示す。

【００３７】比較例１プロネクチンＦを使用せず、旭テクノグラス製６穴細胞
培養プレートを細胞培養プレート２としてそのまま使用
すること以外は実施例１と同様にして、細胞培養を行
い、プレート底面に接着した細胞数及び培地中のカルシ
ウム量を測定した。これらの測定結果を表１に示す。

【００３８】比較例２ＰｎＦ溶液の代わりに新田ゼラチン（株）製の０．３重
量％Ｉ型Ａコラーゲン塩酸溶液（ｐＨ３）を使用するこ
と以外は実施例１と同様にして、コラーゲンをコートし
た細胞培養プレート３を得た。さらに実施例１と同様に
して、細胞培養を行い、プレート底面に接着した細胞数
及び培地中のカルシウム量を測定した。これらの測定結
果を表１に示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】実施例１及び比較例１〜２のいずれにおい
ても細胞の増殖は見られたが、プロネクチンＦをコート
した細胞培養プレート１を用いた場合、増殖細胞数は最
も多いことが判る。また、何もコートされていない細胞
培養プレート２は、細胞の増殖促進能力が低かった。ま
た、コラーゲンをコートした細胞培養プレート３では細
胞増殖とともにカルシウム量の増加が見られた。これ
は、細胞培養に伴って細胞が骨関連細胞系列に分化した
ことを示している。これらの結果は、細胞の分化を抑え
た状態で細胞の増殖を促進することが、プロネクチンＦ
をコートした細胞培養プレートを用いることで可能とな
ったことを示している。

【００４１】実施例２＜細胞培養プレートの作製＞プロネクチンＦ（ＰｎＦ溶
液）の代わりに、三洋化成工業(株)製プロネクチンＬ
（ＰｎＬ溶液、プロネクチンＬの濃度：１０μｇ／ｍ
ｌ）を使用すること以外は実施例１と同様にして、プロ
ネクチンＬをコートした細胞培養プレート４を得た。

【００４２】＜細胞培養；ラビット骨髄間葉幹細胞＞６
週齢の日本白色種雄ラビットの骨髄から、実施例１で行
った細胞培養と同様の方法でラビットＭＳＣを得た。ラ
ビットＭＳＣを培地に分散し、細胞数２００万個／ｍｌ
の縣濁液を作製し、１穴当り、該懸濁液０．１ｍｌ（細
胞数；２０万個／穴）と培地２ｍｌを細胞培養プレート
４に加え、３７℃、５％ＣＯ2、で２週間培養した。そ
して、実施例１と同様にして、プレート底面に接着した
細胞数及び培地中のカルシウム量を測定した。これらの
測定結果を表２に示す。

【００４３】＜分化誘導；ラビット骨髄間葉幹細胞のア
ルカリホスファターゼ活性＞細胞培養プレート４につい
て、上記と同様にして細胞培養を開始し細胞培養１日後
に培地を、１００ｎｇ／ｍｌの割合で骨形成因子（ｒｈ
ＢＭＰ−２）を加えたｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ培地（ＢＭ
Ｐ培地、ＭＥＭアルファ培地４ｍｌ、ＦＢＳ０．６ｍ
ｌ，硫酸カナマイシン０．０００２４ｇ，炭酸水素ナト
リウム０．００８８ｇ、Ｌ−アスコルビン酸０．４ｍ
ｇ，β−グリセロホフェイト０．０４ｍｍｏｌ，デキサ
メタゾン４×１０-6ｍｏｌ）に交換し、分化誘導の指標
であるアルカリホスファターゼ活性をニトロフェニルホ
スフェイト法によって測定した。また、ＢＭＰ培地中の
濃度が３μｇ／ｍｌとなるように繊維芽細胞増殖因子
（ｂＦＧＦ）をさらに加えた培地（ＢＭＰ＋培地）に交
換した場合のアルカリホスファターゼ活性を測定した。
これらの測定結果を表３に示す。

【００４４】比較例３プロネクチンＬを使用せず、旭テクノグラス製６穴細胞
培養プレートを細胞培養プレート２としてそのまま使用
すること以外は実施例２と同様にして、細胞培養を行
い、プレート底面に接着した細胞数及び培地中のカルシ
ウム量を測定した。これらの測定結果を表２に示す。

【００４５】比較例４ＰｎＬ溶液（プロネクチンＬの濃度：１０μｇ／ｍｌ）
の代わりに新田ゼラチン（株）製の０．３重量％Ｉ型Ａ
コラーゲン塩酸溶液（ｐＨ３）を使用すること以外は実
施例２と同様にして、コラーゲンをコートした細胞培養
プレート３を得た。さらに実施例２と同様にして、細胞
培養を行い、プレート底面に接着した細胞数及び培地中
のカルシウム量を測定した。これらの測定結果を表２に
示す。

【００４６】＜分化誘導；ラビット骨髄間葉幹細胞のア
ルカリホスファターゼ活性＞細胞培養プレート３につい
て、実施例２と同様にして細胞培養を開始し細胞培養１
日後に培地を、実施例２と同様のＢＭＰ培地に交換し、
分化誘導の指標であるアルカリホスファターゼ活性をニ
トロフェニルホスフェイト法によって測定した。また、
ＢＭＰ培地中の濃度が３μｇ／ｍｌとなるように繊維芽
細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに加えた培地に交換し
た場合のアルカリホスファターゼ活性を測定した。これ
らの測定結果を表３に示す。

【００４７】

【表２】

【００４８】実施例２及び比較例３〜４のいずれにおい
ても細胞の増殖は見られたが、プロネクチンＬをコート
した細胞培養プレート４を用いた場合、コラーゲンをコ
ートしたプレート３（比較例４）と比較して細胞数が高
く、また、カルシウム量も異常には高くなっていない。
このことは、プロネクチンＬをコートすることによっ
て、ラビットＭＳＣにおいても、未分化のままでその細
胞増殖を促進していることが判る。なお、何もコートし
ていない細胞培養プレート２を用いた場合（比較例２）
には、細胞の増殖は良いが、カルシウム含量が少ない。
これは細胞の活性が低下していることを示している。

【００４９】

【表３】表中、ＢＭＰ培地をＢＭＰと、ＢＭＰ培地に繊維芽細胞
増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに加えた培地をＢＭＰ＋と
略記した。

【００５０】プロネクチンＬをコートした細胞培養プレ
ート４及びコラーゲンをコートした細胞培養プレート３
のいずれの場合も、骨形成因子（ｒｈＢＭＰ−２）と繊
維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）との同時添加でアルカリ
ホスフィターゼ活性が上昇しており、細胞の骨系列への
分化誘導が確実に起こっていることが判る。これは、増
殖した細胞が分化能を維持していたことを示している。

【００５１】

【発明の効果】本発明の細胞接着活性物質を含有してな
る幹細胞培養用基材を用いることによって、幹細胞が分
化せずに極めて効率良く増殖され、細胞活性も高く、ま
た、その分化能も保持している。本発明の基材を用いる
ことにより、幹細胞に関する研究、及び幹細胞を用いる
細胞移植治療又は再生医療において、正常で高活性な幹
細胞を迅速かつ十分な量で得ることができ、研究、移植
治療及び再生医療の効率が極めて高くなる。

フロントページの続き (72)発明者黒川祐人京都府京都市東山区一橋野本町11番地の１三洋化成工業株式会社内Ｆターム(参考） 4B029 AA08 AA21 BB11 CC02 CC08 GA03 GB09 4B065 AA90X BB34 BC41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞接着活性物質（Ａ）を含有してなる
ことを特徴とする幹細胞（Ｂ）培養用基材。
【請求項２】（Ａ）が、遺伝子組換微生物によって合
成され、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を
１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ａ１）
である請求項１記載の基材。
【請求項３】（Ａ１）中の細胞接着シグナルを現わす
最小アミノ酸配列の数が３〜５０個である請求項２記載
の基材。
【請求項４】細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸
配列が、アミノ酸一文字表記で現わされるＲＧＤ配列、
ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧ
Ｒ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮ
ＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、
ＤＧＥＡ配列及びＨＡＶ配列からなる群より選ばれる少
なくとも１種の配列である請求項２又は３記載の基材。
【請求項５】（Ａ１）が、さらにＧＡＧＡＧＳのアミ
ノ酸配列を少なくとも２個有してなる請求項２〜４のい
ずれか記載の基材。
【請求項６】（Ａ）を、基材の表面積１００ｃｍ2あ
たり、０．０００１〜１０００ｍｇの割合で含有してな
る請求項１〜５のいずれか記載の基材。
【請求項７】さらに、細胞増殖因子（Ｃ）を含有して
なる請求項１〜６のいずれか記載の基材。
【請求項８】細胞増殖因子（Ｃ）が、線維芽細胞増殖
因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様
増殖因子、肝細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、ヘ
パリン結合上皮細胞増殖因子及び結合組織成長因子から
なる群より選ばれる少なくとも１種の細胞増殖因子であ
る請求項７記載の基材。
【請求項９】（Ｂ）が、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨
格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、脂
肪組織幹細胞、脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨
前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞及び胚性
幹細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の幹細胞
である請求項１〜８のいずれか記載の基材。