JP2001506486A

JP2001506486A - 芳香族代謝／ｉからの物質の微生物による製造

Info

Publication number: JP2001506486A
Application number: JP52031898A
Authority: JP
Inventors: スプレンガー，ゲオルグ; シーヴェ，ルス; サーム，ヘルマン; カルツ，マルティン; ソンケ，テオドルス
Original assignee: ホーランドスィートナーカンパニーブイ．オー．エフ．; フォルシュングツェントラムジューリッヒゲーエムベーハー
Priority date: 1996-10-26
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2001-05-22
Also published as: EP0934418B1; WO1998018936A1; ES2258787T3; DE69735192T2; DE69735192D1; CN1256440C; CA2269800A1; AU4727797A; ZA979568B; US6316232B1; DE19644566A1; EP0934418A1; KR100528527B1; KR20000052825A; CN1241214A; ATE317015T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞内代謝の中間体、特にエリトロース 4-ホスフェートの増加された供給によって、物質、特に芳香族アミノ酸例えばL-フェニルアラニンの微生物による製造のための代替の方法を利用可能にし、この方法においては、これらの物質を生産する微生物においてトランスアルドラーゼの活性が増加される。本発明の好ましい実施態様においては、トランスケトラーゼの活性または糖のＰＥＰに依存しない摂取のための輸送タンパク質の活性および／または関連する糖をホスホリル化するキナーゼの活性が、追加的に増加される。本発明はまた遺伝子構造物、およびこれらの遺伝子構造物を運ぶ形質転換された細胞に関し、これらは、これらの方法を、特に成功するやり方で実行することを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】芳香族代謝／Ｉからの物質の微生物による製造本発明は、請求項１〜２３、３６および３７に係る、物質特に芳香族アミノ酸の微生物による製造方法、請求項２４〜２９に係る遺伝子構造物および請求項３０〜３５に係る形質転換された細胞に関する。微生物により製造された物質例えばファインケミカル特に芳香族アミノ酸は、経済的関心が大きく、例えばアミノ酸についての要求が増加し続けている。かくして、例えばL-フェニルアラニンは、薬剤を製造するために、特にまた甘味料アスパルテーム（α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンメチルエステル）の製造において使用される。L-トリプトファンは、薬剤として、および動物飼料への添加剤として必要とされ、同様に、薬剤として、また製薬工業における原料としてのチロシンについての必要性がある。天然材料からの分離だけでなく、生物工学的製造は、経済的に正当と認められる条件下で所望の光学的活性形でアミノ酸を得るための非常に重要な方法である。生物工学的製造は、酵素または微生物のいずれを使用してもなされる。後者の、微生物による製造は、簡単な安価な材料を使用することができるという利点を享受する。細胞中でのアミノ酸の生合成は、広範な方法で制御されるが、生成物の生成を増加するために非常に多数の試みがすでになされてきた。かくして、生合成の調節のスィッチを切るために、例えばアミノ酸類似体が使用されてきた。例えば、L-フェニルアラニンの増加された生産を可能にする、大腸菌（エシェリヒアコリ(E scherichia coli))の突然変異体が、フェニルアラニン類似体に対する抵抗性について選択することによって得られた(英国特許出願第2,053,906号)。同様の戦法はまた、コリネバクテリウム(Corynebacterium)（日本国特開昭51-19037号公報および日本国特開昭53-39517号公報）およびバチルス(Bacillus)（欧州特許出願第0,138,526号）の株の過剰生産に至った。さらに、組換えＤＮＡ技術を用いて構成された微生物が知られており、ここでは、生合成の調節は同様に廃止され、もはやフィードバック阻害に供されないところのキー酵素をコードする遺伝子がクローン化され、かつ発現される。原型として、欧州特許出願第0,077,196号は、芳香族アミノ酸を生産する方法を記載し、ここでは、もはやフィードバック阻害に供されないところの3-デオキシ-D-アラビノヘプツロソネート-7-ホスフェートシンターゼ（ＤＡＨＰシンターゼ）が、大腸菌(E．coli)において過剰発現される。欧州特許出願第0,145,156号は、L-フェニルアラニンを生産するために、コリスメートムターゼ／プレフェネートデヒドラターゼが追加的に過剰発現されるE.coli株を記載する。上記した戦法に共通の特徴は、生産を改善するための介入が、芳香族アミノ酸に特異的な生合成経路に限定されることである。しかしながら、なおさらに生産を増加させるために、芳香族アミノ酸を生産するために必要とされる、一次代謝産物であるホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）およびエリトロース 4-ホスフェート（Ｅｒｙ４Ｐ）の供給を改善する努力がなされなければならない。ＰＥＰは、解糖生成物ピルベートの活性化された前駆体であり；Ｅｒｙ４Ｐは、ペントースホスフェート経路における中間体である。前記一次代謝産物Ｅｒｙ４Ｐの供給における特定の改善を成し遂げるために種々の試みがなされてきた。ペントースホスフェート経路を通る炭素の増加した流れが、酵素ホスホグルコースイソメラーゼのスィッチを切ることによって、E.co liにおいて達成された。このことは、トリプトファンの生成をもたらした(マスカレンハス(Mascarenhas)D.ら、Appl．Environ．Microblol．57（1991年）2995- 99頁)。米国特許第5,168,056号明細書は、組換えＤＮＡ技術によって達成されたトランスケトラーゼの過剰発現は、Ｅｒｙ４Ｐの増加した供給、その結果、生成物としてL-トリプトファン、L-チロシンまたはL-フェニルアラニンの形成における改善を得ることを可能にすることを開示した。ドラツ(Draths)K.M．ら（J.Am ．Chem．Soc．114（1992年）3956-62頁）およびフロアーズ(Flores)N.ら（Nat． Biotechnol．14(1996年)620-3頁）の両方が、同じ効果を証明した。しかし、フェルドマン(Feldmann)が示したように、トランスアルドラーゼ活性を欠くザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)株におけるトランスケトラーゼの活性を単に増加するだけでは、細胞におけるペントースホスフェート経路の代謝産物を豊富にし、その結果、細胞の成長に負の効果をもたらす(フェルドマン(Feldmann )S.D.ら、Appl．Microbiol．Biotechnol．38（1992年）354-61頁)。この生理学的効果は、セドヘプツロース-7-ホスフェートの過剰の細胞内濃度にあるいは帰することができる。発明者らはまた、E．coli tal⁺株の場合において、トランスケトラーゼの過剰発現の結果としてバイオマス増大の対応する阻止を見出した。本発明の目的は従って、物質特に芳香族アミノ酸を生産するための代替的方法を利用可能にすることにあり、この方法は、先に引用した方法の欠点（この欠点は、トランスケトラーゼの活性の単なる増加の結果である）を持つことなしに、これらの物質の合成のための細胞内代謝中間体の増加した供給によって特徴づけられる。驚くべきことに、本発明に従い、物質の微生物による製造方法であって、この方法において、トランスケトラーゼの活性がこれらの物質を生産している微生物中で増加され、この微生物におけるホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）に依存する糖摂取系の活性が存在するか、減少されるかまたは不在であるところの方法を利用可能にすることによってこの目的が達成される。この結果は、トランスアルドラーゼが微生物の成長において、かつそれらによる物質の生産において重要な役割を演じることが決して自明でないということにおいて、特に驚くべきものである。このことは、ヘキソースでの成長の場合に特に適用される。かくして、例えば、トランスアルドラーゼ遺伝子に突然変異を持つにもかかわらずグルコースでなお成長することができる酵母株が知られている (シャーフ(Schaaff)L. ら、Eur．J．Biochem．188（1990年）597-603頁)。したがって、トランスアルドラーゼは細胞成長にいかなる本質的な影響をも与えるべきではない。このことは、トランスアルドラーゼ不在中で成長することができる細菌の種がまた知られているという事実によって支持される(フェルドマン(Feldmann)S.D.ら、Appl.Micr obiol.Biotechnol.38(1992年)354-62頁)。さらに、ヘキソース例えばグルコースはまた、キシロースおよび他のペントースと比べて、ペントースホスフェート経路以外の減成経路を経て代謝されることができる。したがって、トランスアルドラーゼがグルコース減成において本質的な機能を有することは、決して自明ではない。トランスアルドラーゼの活性が増加されたサッカロマイセスセレビシエ(Sac charomyces cerevisiae)細胞において、インビトロで、ペントースホスフェート経路の酵素による増加した流れが測定されたことはまた注意され得る（セナック(Senac)T.ら、Appl.Environ.Microbiol.57(1991年)1701-6頁)。しかしながら、この研究において選択される実験条件は、結果を、生きている微生物特に細菌において生じる代謝生理学の自然現象へ移すことをいかにしても許さない。さらに、リアオ(Liao)J.C.ら（Biotechn.Bioeng.52(1996年)129-140頁）が、トランスアルドラーゼおよびＡｒｏＧの活性が同時に増加されるとき、ＤＡＨＰ形成が増加することを示したことが注意され得る。この効果は、ＡｒｏＧ活性における増加に主として帰されるべきものである。トランスアルドラーゼ活性における増加の結果としての物質の生産の増加はそれ自体、記載されておらず、または示されていない。したがって、微生物におけるトランスアルドラーゼ活性の増加と物質の改善された生産のためのＥｒｙ４Ｐの供給との間に原因となる関係があることは、決して予想されるべきものではない。本発明に従いトランスアルドラーゼの活性（過剰発現）を増加させることは、ペントースホスフェート経路を通る炭素の増加された流れを実行し、従って、一次代謝産物Ｅｒｙ４Ｐの改善された供給を成し遂げるための代替的方法を利用可能にする。増加された量のＥｒｙ４Ｐはしたがって、その合成に、ペントースホスフェート経路の少なくとも１の中間体特にＥｒｙ４Ｐが含まれるところの物質の微生物による合成のために利用できる。本発明者らは、Ｅｒｙ４Ｐの改善された利用可能性が、ＰＥＰに依存する糖摂取系の活性が存在するか、または減らされるところの微生物およびそのような活性が不在の微生物の両方において生じることを示した。かくして、本発明に従い、活性なホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）または減じられた活性を有するホスホトランスフェラーゼ系をなお有する生物体（pts⁺株）が使用され得るだけでなく、ＰＴＳがスィッチを切られた生物体（pts^-株）もまた使用され得る。本発明の意味の中で、物質は、例えばファインケミカル例えば芳香族アミノ酸、インジゴ、インドール酢酸、アジピン酸、メラニン、キノン類および安息香酸、およびまたそれらの可能な誘導体および二次生成物、または一般には、ペントースホスフェート経路の中間体の二次生成物であるとして理解されるべきである。しかしながら、これはまた、化合物すべて、例えばピリドキシンおよびその誘導体（その生物化学的合成は、エリトロース 4-ホスフェートの供給によって促進される）を含むべきである。本発明の文脈内で、これらの物質すべてがまた、芳香族の代謝からの物質であるとみなされる。この文脈において、インジゴ、アジピン酸および他の天然でない二次生成物を製造するための新規な介入のほかに、物質を生産する微生物へのさらなる遺伝子の変更が必要とされることが注意され得る。本発明の方法は、トランスアルドラーゼ活性の増加に先立ち、予めホスホトランスフェラーゼ系を有する株（pts⁺株）から、スウィッチを切られたホスホトランスフェラーゼ系を有する株（pts^-株）として選択されなかった微生物における物質の製造のために特に適している。この関係において、非前公開特許明細書WO-96/34961が、予めpts⁺株であるものからのそのような選択を記載するが、この研究においては、この選択は、トランスケトラーゼまたはトランスアルドラーゼ活性の増加より先に起こることが注意され得る。トランスアルドラーゼの活性を増加することに関しては、大腸菌（エシェリヒアコリ）(Escherichia coli)トランスアルドラーゼ、特にエシェリヒアコリトランスアルドラーゼＢ（ＴａｌＢ）の活性を増加するのが好ましい。対応するＴａｌＢ遺伝子を使用するときは、この遺伝子は好ましくは、エシェリヒアコリｋｌ２またはそれから誘導された株に由来する。しかし、この他に、その遺伝子生成物が、トランスアルドラーゼの反応に対応する反応（セドヘプツロース 7-ホスフェートとグリセルアルデヒド 3-ホスフェートのＥｒｙ４Ｐおよびフルクトース-6-ホスフェートへの転化である）を触媒する、任意の遺伝子がまた適当である。本発明の特に有利な実施態様においては、トランスアルドラーゼの活性の増加だけでなく、トランスケトラーゼの活性が増加される。ペントースの存在中で、トランスケトラーゼ遺伝子の自分自身上での発現は、ペントースホスフェート経路における代謝産物の蓄積に至る(フェルドマン(Feldmann)S.D.、Appl.Microbio l.Blotechnol.38(1992年)354-61頁)。これは、細胞に有害な効果を持ち、とりわけ、減らされた速度で成長する形質転換された細胞をもたらす。本発明者らはまた、グルコースで成長し、増加したトランスケトラーゼ活性を示した大腸菌株の場合において同一の効果を観察した。しかしながら、トランスケトラーゼの活性ならびにトランスアルドラーゼの活性を同時に増加することは、Ｅｒｙ４Ｐを供給するために非常に有益であるとは分かっておらず、かつトランスケトラーゼの単独の過剰発現の負の副効果を示さない。トランスケトラーゼの活性が増加されるときに生じるペントースホスフェート経路の代謝産物の蓄積は従って、トランスアルドラーゼの活性を増加する結果として実現することはなく、その結果、細胞の成長における損傷が止まるだけでなく、成長の増加へ転化すらする。したがって、本発明に従い、トランスケトラーゼの活性を、特に増加したトランスアルドラーゼの活性を有する株において増加することは、分別ある方法であることがわかる。トランスケトラーゼの活性を増加することに関しては、大腸菌（エシェリヒアコリ）トランスケトラーゼの活性、特に大腸菌（エシェリヒアコリ）トランスケトラーゼＡ（ＴｋｔＡ）の活性を増加するのが好ましい。対応するｔｋｔＡ遺伝子を使用するときは、この遺伝子は好ましくは、エシェリヒアコリｋｌ２またはそれから誘導された株に由来する。しかし、この他に、その遺伝子生成物が、トランスケトラーゼの反応に対応する反応（リボース 5-ホスフェートとキシルロース 5-ホスフェートのセドヘプツロース 7-ホスフェートとグリセルアルデヒド 3-ホスフェートへの転化、またはキシルロース 5-ホスフェートとＥｒｙ４Ｐのフルクトース 6-ホスフェートとグリセルアルデヒド 3-ホスフェートへの転化である）を触媒する、任意の遺伝子がまた適当である。本発明の別の特に好ましい実施態様においては、トランスアルドラーゼの活性を増加することまたはトランスアルドラーゼとトランスケトラーゼの活性を増加することに加えて、ＰＥＰに依存しない糖の摂取のための輸送タンパク質の活性および／または対応する糖をホスホリル化するキナーゼの活性が増加される。輸送タンパク質の場合には、このタンパク質の活性は、タンパク質が取り次いだ摂取速度であると理解される。これらの後者のタンパク質、すなわち輸送タンパク質およびキナーゼの１つまたは両方のタンパク質の活性におけるさらなる増加は、物質、特に芳香族アミノ酸のより多い生産すら達成することを可能にし、これは、Ｅｒｙ４Ｐと縮合して、生合成する芳香族化合物、すなわちデオキシ-D-アラビノヘプツロソネート-7-ホスフェート（ＤＡＨＰ）のための一般的経路の一次代謝産物を形成するための増加した量でＰＥＰが提供されるという事実に帰する。ＰＥＰに依存しない糖の摂取のための輸送タンパク質として促進剤を使用することは望ましく、これは、タンパク質が取り次いだ促進された拡散の原理に従ってふるまう輸送タンパク質である。特に、ザイモモナスモビリス(Zymomonas m obilis)からの、グルコース促進剤タンパク質（Ｇｌｆ）を使用するのが適当である。後者が使用されると、タンパク質をコードする遺伝子、ｇｌｆが、例えばＺ．モビリスＡＴＣＣ 10988、ＡＴＣＣ 29191またはＡＴＣＣ 31821から得られる。しかしながら、その遺伝子生成物が、例えばグルコース、フルクトースまたはシュークロースを輸送し、そのようにすると、どのようなＰＥＰも、例えば大腸菌からのＧａｌＰ系を使用しない他の細菌性の糖輸送遺伝子がまた、新規な本方法のために適当である。真核微生物例えばサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピチアスチピテイス(Pichia stipitis)またはクリューイベロマイセスラクテイス(Kluyveromyces lactis)からの糖輸送系のための遺伝子、例えばＨＸＴ１〜ＨＸＴ７、または一般に他の生物体からの糖輸送遺伝子が、もし、それらが微生物において機能的なやり方で発現されることができ、かつ遺伝子生成物が、この文脈において、糖を輸送するためにＰＥＰを使用することなく作動することができるとすれば、また使用できる。アミノ酸生産微生物（アミノ酸生産者）において糖輸送遺伝子を発現することが可能であるのが望ましい。したがって、Ｚ．モビリスＡＴＣＣ 31821から分離された促進剤遺伝子ｇｌｆを、新規な本方法に従い芳香族アミノ酸を製造するときに、糖例えばグルコース、フルクトースまたはマンノースを処理するために使用するのが特に適当である。(パーカー(Parker)C.ら、Mol．Microbiol.15(1995年)795-802頁；ウェイサー(Weisser)Pら、J.Bacteriol.177(1995年)3351-4頁)。本発明の方法は、ＰＴＳ系が減じられた活性を有するか、または完全に存在しない微生物において芳香族アミノ酸を製造するのに特に適当である。そのような場合に、ＰＴＳ系は、トランスアルドラーゼ活性の増加の前または後に、減ぜられまたはスウィッチを切られ得る。ｇｌｆ遺伝子は特に、膜タンパク質の過剰な発現に帰する細胞への有害な効果を避けるために、低い遺伝子コピー数(gene copy number)で、好ましくは挿入されなければならない。かくして、例えばｇｌｆ遺伝子については、２〜５の遺伝子コピー数が好ましい。ｇｌｆ遺伝子をｐｔｓＨＴ−ｃｒｒオペロンの遺伝子の１つ、例えばｐｔｓＩ遺伝子に挿入することが特に有利である。糖をホスホリル化するキナーゼが使用されるとき、ヘキソースをホスホリル化するキナーゼ、好ましくはザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)からのキナーゼ、特にグルコキナーゼ（Ｇｌｋ）を使用するのが望ましい。後者が使用されると、タンパク質をコードする遺伝子ｇｌｋが、例えばZ. mobilis ＡＴＣＣ 10988、ＡＴＣＣ 29191またはＡＴＣＣ 31821から誘導される。その遺伝子生成物が、ＡＴＰを消費しながらヘキソースをホスホリル化するところの細菌からのヘキソースホスホリル化キナーゼ、例えばフルクトキナーゼまたはマンノキナーゼのための他の遺伝子が同様に、新規な本方法のために適当である。さらに、例えば真核微生物例えばサッカロマイセスセレビシエ(Sac charomyces cerevisiae)からのキナーゼのための遺伝子、または一般的なやり方では、他の生物体からの、糖ホスホリル化キナーゼのための遺伝子がまた、もしそれらが微生物、特にアミノ酸生産体において、機能的なやり方で発現されることができ、かつ糖をホスホリル化するのにＰＥＰを使用することなしに作動することができるとすれば、適当である。グルコースをホスホリル化するためのグルコキナーゼ遺伝子、ｇｌｋ（この遺伝子は、Z.mobilis ＡＴＣＣ 29191から分離される）は、新規な本方法に従い芳香族アミノ酸を製造するのに特に適当である。芳香族アミノ酸代謝の最初の中間体を生産するためのＰＥＰの利用可能性は、Ｅｒｙ４Ｐへの物質の流れが増加される微生物において制限され得る。これらの場合には、代謝における他のＰＥＰ消費反応、例えばＰＥＰに依存する糖摂取を触媒するＰＥＰ：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の反応を、もしこの系が存在するなら、減らすか、または完全にスウィッチを切ることが有利であり得る。本発明に従って、活性なＰＴＳ遺伝子をなお有する生物体（pts⁺株）および、この方法をさらに改善するために、ｐｔｓの活性が減ぜられたｐｔｓ突然変異体（この場合には、またpts⁺として考えるべきである）またはｐｔｓがスウィッチを切られたｐｔｓ突然変異体（pts^-株）の両方を使用することができる。この性質の減少は、酵素レベルで、または遺伝子的方法を用いることによって、例えばｇｌｆおよび／またはｇｌｋ遺伝子を染色体特にｐｔｓＩ遺伝子の座に挿入することによって、達成することができ、この方法は、染色体中の組換えＤＮＡを同時に安定化し(分離安定化)、従ってベクターの使用を免除されることができることを意味する。本発明者らの実験は、ＰＴＳの活性を減らすまたはスウィッチを切ることは、好ましくはトランスアルドラーゼの活性が増加される前に起こってはならないことを示した。本発明の意味の範囲内で、活性を増加するための方法は、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、輸送タンパク質およびキナーゼの活性を増加させるために適当であるすべての方法であると理解されるべきである。以下の方法は、この目的のために特に適当である： -例えばベクターまたは溶原性ファージを用いた、遺伝子の導入； -例えばプラスミドを用いて、本発明に従う遺伝子を増加されたコピー数で微生物に導入することを目的として、遺伝子コピー数を増加することであって、それは、少し（例えば２〜５倍）増加されたものから、非常に（例えば１５〜５０倍）増加されたものまでのコピー数である； -例えばプロモーター要素例えばＰｔａｃ、Ｐｔｅｔまたは他の調節ヌクレオチド配列を用いることにより、転写速度を増加することによって、および／または、例えば共通リボゾーム結合部位を用いることにより翻訳速度を増加することによって、遺伝子発現を増加すること； -例えばＵＶ照射または突然変異を導き出す化学品を用いて、慣用の方法によって無作為のやり方で生産された突然変異によって、または、遺伝子工学法を用いて特別なやり方で生産された突然変異、例えば欠落、挿入および／またはヌクレオチド交換によって、存在する酵素の内在性の活性を増加すること； -例えば、物理的、化学的または分子生物学的または他の微生物学的方法を用いた突然変異誘発により、酵素の構造を変えることによって酵素の活性を増加すること； -調節解除された酵素、例えばもはやフィードバック阻害に供されない酵素を用いること； -調節解除された酵素をコードする、対応する遺伝子の導入。上記した方法と他の類似の方法の組合せがまた、活性を増加するために使用できる。輸送タンパク質の内在性のまたは導入された活性を、例えば上記した方法を用いて遺伝子をクローン化することにより、または例えば基質の増加した輸送を示す突然変異体を選択することにより、増加することができる。好ましくは、１または複数の遺伝子を、１つの遺伝子構造物またはいくつかの遺伝子構造物へと組み込むことにより、活性が増加され、各遺伝子（１または複数）は、単一のコピー（群）として、または増加されたコピー数で、遺伝子構造物へと導入される。本発明の意味の範囲内で、遺伝子構造物は、本発明に従う遺伝子を運ぶ、遺伝子または他の任意のヌクレオチド配列であると理解されるべきである。適当なヌクレオチド配列は、例えばプラスミド、ベクター、染色体、ファージまたは、環状に閉じられていない他のヌクレオチド配列であり得る。本発明の意味の範囲内で染色体は、本発明に従う少なくとも１の遺伝子が挿入された染色体であり、得られる核酸配列は、少なくとも１の遺伝子、または１つの遺伝子コピーを含み、それより多くが、この染色体に自然に含まれる。一方では、例えば遺伝子座内の相同の組換えは、必然的に自然形と異なっていなければならないわけではない染色体となる。相同の組換えによって製造される染色体は従って、もし相同の遺伝子の自然の数が超えられないならば、本発明に従うものであるとみなされるべきではない。本発明の意味の範囲内で、遺伝子構造物はまた、上記した遺伝子キャリア例えばベクター、染色体および溶原性ファージの組合せであると理解されるべきであり、この上に、本発明に係る遺伝子が分配される。例えば、２つのｔａｌ遺伝子がベクター上で細胞に導入されることができ、または２つのｔａｌ遺伝子が染色体中に挿入されることができる。さらに、さらなる遺伝子が、例えばファージを用いて細胞中に導入されることができる。同じことが、本発明に従う他の遺伝子に適用される。これらの例は、本発明から遺伝子分布の他の組合せを排除することを意図しない。いかなる場合にも、本発明に従う、微生物体に含まれる遺伝子の数は、対応する遺伝子の自然の数を超えることが重大なことである。好ましくは、本発明に従う活性増加を達成するために、ｇｌｆ遺伝子の数が例えば２〜５の因子によって増加される。これらの濃度において、いかなる細胞毒性効果も現れない。しかしながら、本発明に従う遺伝子を、同じ効果を有する形の５０遺伝子コピーまでのより高いコピー数で、微生物体中に導入することがまた考えられる。物質を生産するための新規な本方法においては、物質を合成する際にさらに含まれる１以上の酵素が調節解除された、および／または増加された活性を有するところの微生物を使用するのが好ましい。これらの酵素は、特に芳香族アミノ酸代謝の酵素、特別にはＤＡＨＰシンターゼ、シキメートキナーゼおよびコリスメートムターゼ／プレフェネートデヒドラターゼおよびまた、芳香族の代謝の中間体およびそれらの二次生成物の合成の際に含まれる他の酵素である。本発明に係る酵素に加えて、ＤＡＨＰシンターゼの調節解除および過剰発現は特に、物質例えばアジピン酸、胆汁酸およびキノン化合物およびそれらの誘導体を製造するために重要である。さらに、例えばトリプトファン、チロシン、インジゴおよび、ヒドロキシ安息香酸およびアミノ安息香酸の誘導体およびナフトキノン類およびアンスロキノン類およびまたそれらの二次生成物の極度に高められた合成を達成するために、シキメートキナーゼは調節解除されなければならず、かつその活性は増加されなければならない。調節解除され、かつ過剰発現されたコリスメートムターゼ／プレフェネートデヒドラターゼはその上、フェニルアラニン、フェニルピルビン酸およびそれらの誘導体を効率よく生産するために特に重要である。しかしながら、このことはまた、その活性が、物質（その製造がエリトロース 4-ホスフェートの供給によって促進される化合物、例えばピリドキシンおよびその誘導体）の生化学的合成に寄与する他の酵素すべてを含むことを意図する。新規な介入のほかに、物質を生産する微生物に対するさらなる遺伝子の変更が、インジゴ、アジピン酸および他の自然のものでない二次生成物を製造する目的のために必要とされることは、注意され得る。新規な本方法は、芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニンを製造するために特に適当である。後者の場合、遺伝子発現および／または調節解除されたＤＡＨＰシンターゼの（例えばＥ．ｃｏｌｉＡｒｏＦまたはＡｒｏＨにおける）酵素活性および／または同様に調節解除されたコリスメートムターゼ／プレフエネートデヒドラターゼ（ＰｈｅＡ）の酵素活性が、好ましくは増加される。エシェリヒア(Escherichia)種およびまた、セラティア(Serratia)属、バチルス(Bacillus)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属またはブレビバクテリウム(Brevibacterium)属の微生物および、慣用のアミノ酸法から知られている他の株が、生産生物体として使用するのに適当である。Escherichi a coliが特に適当である。本発明の別の目的は、適当な遺伝子構造物およびこれらの遺伝子構造物を運ぶ形質転換された細胞を提供することであり、これは、本方法を特に成功したやり方で実行することを可能にする。本発明の文脈の範囲内で、新規な遺伝子構造物がここで利用可能にされることができ、この遺伝子構造物は、組換え形で、ａ）トランスアルドラーゼをコードする遺伝子または、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子およびトランスケトラーゼをコードする遺伝子、およびｂ）糖のＰＥＰに依存しない摂取のための輸送タンパク質をコードする、または糖をホスホリル化するキナーゼをコードする少なくとも１の遺伝子を含む。これらの遺伝子構造物において、輸送タンパク質のための遺伝子が促進剤をコードし、かつキナーゼのための遺伝子がヘキソースをホスホリル化するキナーゼをコードすることが好ましい。特には、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼのための遺伝子が大腸菌（Escherichia coli）から誘導され、輸送タンパク質およびキナーゼのための遺伝子がザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)から誘導される。トランスアルドラーゼのための遺伝子がEscherichiacoli tａｌＢであり、かつトランスケトラーゼのための遺伝子がEscherichia coll ｔｋｔＡであり、一方輸送タンパク質のための遺伝子がZymomonas mobilis ｇｌｆであり、かつキナーゼのための遺伝子がZymomonas mobilis ｇｌｋであるところの遺伝子構造物が特に有利である。現行の方法に従って、適切な遺伝子が分離され、細胞が形質転換される：Esch erichia coli ｋｌ２からのｔａｌＢおよびｔｋｔＡ遺伝子の完全なヌクレオチド配列が知られており(ユラ(Yura)T.ら、Nucl.Acid Res．20(1992年)3305-8頁；スプレンガー(Sprenger)G.A.、Biochim．Biophys．Acta 1216（1993年）307-10 頁；スプレンガー(Sprenger)G.A.ら、J.Bacteriol．177（1995年）5930-9頁)、ハイデルベルグのＥＭＢＬのようなデータベースに供託されている。Escherichi a coli ｔａｌＢ遺伝子がクローン化されているとき、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法が、例えばEscherichia coli ｋ１２株からの染色体ＤＮＡを用いて遺伝子を特異的に増幅する（スプレンガー(Sprenger)G.A.ら、J．Bacteriol．177 （1995年）5930-9頁）ために適当である。トランスケトラーゼが不足した突然変異体の相同の相補は、例えばEscherichia coli ｔｋｔＡ遺伝子をクローン化するときに適当である(スプレンガー（Sprenger）G.A.：ビスワンガー（Bisswange r）H.ら、Biochemistry and physiology of thiamine diphosphate enzymes ，VCH（1991年）322-6頁中)。ザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)輸送遺伝子ｇｌｆまたはザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)グルコキナーゼ遺伝子ｇｌｋをクローン化するとき、ＰＴＳ機能に欠陥があり、かつ従って例えばグルコースを輸送することができないエシェリヒアコリ（Escherichia coli）突然変異体の相同の相補でまたあるように、例えばＰＣＲは、例えばザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)株ＡＴＣＣ29191またはＡＴＣＣ 31821からの染色体ＤＮＡを用いて遺伝子を特異的に増幅するために適当である(スネップ（Snoep）J.L．ら、J．Bacteriol．174（1994年）1707-8頁；パーカー(Parker)C.ら、Mol．Microbiol．15（1995年）795-82頁；ウェイサー(Weisser )P.ら、J．Bacteriol．177（1995年）3351-4頁)。遺伝子を分離し、それらを公知の低いコピー数のベクター、例えばｐＡＣＹＣ184、ｐＡＣＹＣ177、pSC101またはpZY507を用いて、インビトロで組換えをした（ウェイサー(Weisser)P.ら、J ．Bacteriol．177（1995年）3351-4頁）後、ホスト細胞が、化学的方法、エレクトロポレーション(electroporation)、接合(conjugation)または形質導入を用いて形質転換される。分離されたトランスアルドラーゼ遺伝子は、本発明の文脈の範囲内で記載された１以上の遺伝子と共に、任意の組合せで、１つの遺伝子構造物またはいくつかの遺伝子構造物へと組込まれ得る。遺伝子構造物への正確な分配を考えることなしに、これは、ｔａＩＢ、ｔａｌＢ＋ｔｋｔＡ、ｔａｌＢ＋ｇｌｆ、ｔａｌＢ＋ｇｌｋ、ｔａｌＢ＋ｇｌｆ＋ｇｌｋ、ｔａｌＢ＋ｔｋｔＡ＋ｇｌｆ、ｔａＩＢ＋ｔｋｔＡ+ｇｌｋまたはｔａｌＢ＋ｔｋｔＡ＋ｇｌｆ＋ｇｌｋのような組合せに至る。遺伝子のうちの１つに割り当てられた、少なくとも１の調節遺伝子配列を含む遺伝子構造物が有利である。かくして、調節要素の強化が、特に、転写シグナルを強化することによって転写のレベルで、好ましくはなされ得る。このことは、例えば、構造遺伝子の上流に置かれたプロモーター配列を変更することにより、またはプロモーターをより有効なプロモーターと完全に取りかえることにより、プロモーターの活性を増加させることによって成し遂げることができる。転写はまた、遺伝子に割り当てられる調節遺伝子に適当な影響をはたらかせることによって強化することができ、しかしこの他に、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性を改善することによって翻訳を強化することがまた可能である。最も適当な遺伝子構造物は、少なくとも１の記載された遺伝子が、誘導できるプロモーターの制御下にそれがあるように組み込まれたものである。遺伝子が本発明に従う遺伝子構造物上に配置されているとき、プロモーターは１つの遺伝子の上流に位置することができ、または一般的なプロモーターとしていくつかの遺伝子の上流に位置することができ、または、その間で遺伝子が、それらが反対方向に読み取られるように配置されるところの２つの向き合ったプロモーターを使用することができる。この状況においては、例えばｇｌｆ遺伝子は、比較的弱いプロモーター（例えばＰｔｅｔ）の下流に位置することができ、また他の遺伝子は、ｔａｃプロモーターの制御下にあることができる。上流プロモーターを用いてまたは用いないで、または、割り当てられた調節遺伝子を用いてまたは用いないで、１以上のＤＮＡ配列が、遺伝子構造物中に含まれる遺伝子の上流および／または下流に位置することができる。誘導できるプロモーター要素、例えばｌａｃＩ^q／Ｐｔａｃを用いることによって、例えばイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような化学的誘導物質を加えることにより、新しい機能（酵素合成の誘導）のスウィッチを入れることが可能である。本発明の目的はまた、本発明に従う遺伝子構造物を複製可能な形で有する、形質転換された細胞を提供することにより達成される。本発明の意味の範囲内で、形質転換された細胞は、本発明に従う遺伝子構造物を運ぶ任意の微生物であると理解されるべきであり、この遺伝子構造物は、細胞において物質の増加された生成を成し遂げる。ホスト細胞は、化学的方法によって(ハナハン(Hanahan)D.,J．Mol．Biol．166（1983年）557-580頁)、またエレクトロポレーション、接合または形質導入によって形質転換されることができる。形質転換のためには、物質の合成に追加的に関与する１以上の酵素が調節解除され、および／または増加された活性を有するところのホスト細胞を使用するのが有利である。本発明に従い芳香族アミノ酸または別の物質を生産している微生物株、特にEscherichia coliは、関連した遺伝子を含む遺伝子構造物を用いて形質転換される。遺伝子構造物を用いて形質転換するためには、ＰＥＰに依存する糖摂取系の活性が、存在するのなら、減少させられ、またはスウィッチを切られるところのホスト細胞を使用するのが有利である。特に、芳香族アミノ酸を生産することができる形質転換された細胞が提供され、芳香族アミノ酸は好ましくはL-フェニルアラニンである。新規な本方法および、本発明の教示に従い形質転換された微生物を用いると、物質の幅広いスペクトルを、物質を生産するために使用することができる。本発明の文脈の範囲内で、本発明に従い形質転換され、かつ遺伝子のうちの１つに割り当てられた少なくとも１つの調節遺伝子配列を含む遺伝子構造物が存在するところの細胞が培養され、酵素合成は少なくとも２の細胞分裂（指数成長期の開始）後に微生物において誘導される、物質の微生物による製造方法が、従ってまた提供される。従って、微生物の生産は、それらの成長と無関係に増加され得る。新規な本方法の特に好ましい実施態様においては、ペントースホスフェート経路の中間体の他に、中心の代謝の他の代謝産物の増加された利用可能性をまた含む、形質転換された細胞が使用される。これらの代謝産物は、例えば解糖または糖新生からのピルベート、またはクエン酸回路からのオキザロアセテートを包含する。さらに、関連した化合物またはその前駆体(ピルベートの前駆体またはクエン酸回路の代謝産物の前駆体)、例えばフマレートまたはマレートが、摂食によって成長する細胞に利用可能となり得る。少しの実施例によって、本発明を以下でより詳細に説明する。以下の株を、ブダペスト条約の合意の下に、ＤＳＭで供託した。 DSM 11210 エシェリヒアコリ(Escherichia coli)AT2471／pZYTT7tal DSM 11209 エシェリヒアコリ(Escherichia coli)AT2471／PZY557tkttal DSM 11206 エシェリヒアコリ(Escherichia coli)AT2471GP704glfint PTS⁺ DSM 11205 エシエリヒアコリ(Escherichia coli)AT2471glfint PTS^- 使用したホスト生物体、すなわちAT2471は、番号4510の下にＣＧＳＣにおいてテイラー(Taylor)およびトロッター(Trotter)（Bacteriol．Rev．13（1967年）3 32-353頁）によって供託されており、自由に利用できる。本特許出願の文脈の範囲内で使用されたすべての微生物の特性および由来は、表１に詳細に記載されている。以下の試験は、使用された材料および方法を示し、実施例および比較例にて本発明を支持することを意図している。一般的方法遺伝子の研究において、大腸菌(E．coli)の株は、特に示さなければ、ディフコバクト-トリプトン(Difco bacto-tryptone)(10ｇ・ｌ^-1)、ディフコ酵母抽出物（５ｇ・ｌ^-1）およびＮａＣｌ（10g・ｌ^-1）からなるＬＢ培地で培養した。使用した株の抵抗性に依存して、カルベニシリン（20〜100mg・ｌ^-1）および／またはクロラムフェニコール（17〜34mg・ｌ^-1）を、必要なら培地に加えた。このために、カルベニシリンをまず最初に水に溶解し、そしてクロラムフェニコールをエタノールに溶解し、そしてこの溶液をろ過滅菌した後に、予めオートクレーブで処理した培地に加えた。寒天板を作るために、ディフコバクト-寒天(bacto-agar)(1.5％)をＬＢ培地に加えた。市販の入手可能な系（Quia gen Hilden）を用いたアルカリ溶解によって、プラスミドＤＮＡをE．coliから分離した。チェン(Chen)およびクオ(Kuo)により記載されている（Nucl.Acid Res .21(1993年)2260頁）ようにして、染色体ＤＮＡをE．collおよびZ．mobilisから分離した。制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼＩ、アルカリホスファターゼ、ＲＮアーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを、製造元の指示（ベーリンガー(Boehrlnger)、マンハイム(Mannheim)、ジャーマニーオアプロメガ(Germany or promega)、ハイデルベルグ、ドイツ国）に従って使用した。制限分析のために、ＮＤＡフラグメントをアガロースゲル（0.8％）中で分画し、市販の入手可能な系（ジェットソルブゲノメッド(Jetsorb Genomed)、バッドエーンハウゼン(Bad Oeynhausen) 、ドイツ国）を用いた抽出によってアガロースから分離した。サザン分析法(Southern analysis)のために、染色体ＤＮＡ（10μg）を、制限酵素で消化し、ゲル電気泳動によりサイズ分画し、真空を介した拡散（VacuGene System、ファルマシア(Pharmacia)、フライブルグ(Freiburg)、ドイツ国）によってナイロン膜（Nytran 13、シュライヒャーアンドシュエル(Schleicher a nd Schuell)、ダッセル(Dassel)、ドイツ国）に移した。適当なＤＮＡフラグメントを分離し、ディゴキシゲニン(digoxigenin)-ｄＵＴＰでラベルし、プローブとして使用した。ラベル化、ハイブリッド形成、洗浄の方法および検出は、市販の入手可能なラベルおよび検出系（ベーリンガー(Boehringer)、マンハイム(Mannheim)、ドイツ国）によって行った。形質転換のために、細胞を、LB培地（５ｍｌチューブ）中で、３７℃、200rpm にて２．５〜３時間インキュベートした。約０．４の光学密度（620nm）にて、細胞を遠心分離し、ｌ／１０体積のＴＳＳ（１０％(w/v)のPEG 8000、５％(v/v) のＤＭＳＯおよび５０ｍＭのMgCl₂を含むＬＢ培地）中に取った。０．１〜１００ｎｇのＤＮＡを用いて４℃で３０分間のインキュベーションおよび引き続き３７℃で１時間のインキュベーションの後、適当な抗生物質を含むＬＢ培地で培養した。実施例１本発明に従う、プラスミドに基づく遺伝子構造物のプロトタイプとしてのpZY557 tal、pBM20talおよびpZY557tkttalの製造およびpZY557tktの製造制限酵素BamHIおよびHindIIIを用いてプラスミドpZY507（ワイサー(Weisser) ら、1995 J．Bacteriol 177:3351-3345）を開き、より大きいフラグメント（10. 1kBのＤＮＡ）を分離した。多クローン化部位の一部を、BamHIおよびHindIIIを用いてベクターpUCBM20（ベーリンガー(Boehringer)、マンハイム(Mannheim)、ドイツ国）から摘出し、大きなpZY507BamHI／HindIIIフラグメントに結合し、他の制限切断部位に加えて、ベクターpZY507と同様のベクターpZY557をもたらした。talB遺伝子を、ＰＣＲによってベクターpGSJ451 （スプレンガー(Sprenger)G.A.ら、J．Bacteriol．177（1995年）5930-36頁）から増幅した。このために、オリゴヌクレオチドＩ：５’ＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡ３’ （ここで下線を引かれた塩基対は、スプレンガー(Sprenger)G.A.ら、J．Bacteri ol．177（1995年）5930-6頁からのtalB配列の塩基対84〜101に対応する）を使用し、これは、制限酵素SphIのための切断部位を備えており、市販されていて入手可能なM131pUC配列決定プライマー（No.1010093、ベーリンガーマンハイム、ドイツ国）をオリゴヌクレオチドIIとして有していた。得られる増幅されたＤＮＡフラグメントは、SphIのための切断部位を各末端に含み、制限酵素SphIで切断された。このフラグメントを次に、ベクターpZY557およびpUCBM20にそれぞれ結合し、これらのベクターはまたSphIで線状にされていた。組換えプラスミドpZY5 57talおよびpBM20talそれぞれが、２つの結合溶液でE．coliを形質転換し、形質転換物をクローン化した後に得られた。tktA遺伝子を、ＰＣＲによって、ベクターpGSJ427（スプレンガー（Sprenger）G.A.ら、Eur．J．Biochem．230（1995年）525-32頁）から増幅し、制限酵素NotIのための切断部位は、５’末端で挿入され、制限酵素SphIのための切断部位は、３’末端で挿入された。この場合には、オリゴヌクレオチドIII：５’ＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＣＧＡＴＣＴ３’ （ここで下線を引かれた塩基対は、スプレンガー(Sprenger) G.A.、Biochim．Biophys．Acta．1216（1993年）307-10頁からのtktA配列の塩基対126〜146に対応する）(これは制限酵素NotIのための切断部位を備えていた) およびIV：５’ＡＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＣ３’ （ここで下線を引かれた塩基対は、スプレンガー(Sprenger)G.A.、Biochim．Bio phys．Acta．1216（1993年）307-10頁からのtktA配列の塩基対2018〜2036に対応する）(これはSphIのための切断部位を備えていた) を使用した。得られるＰＣＲフラグメントをNotIおよびSphIで切断し、ベクター pZY557tkt(同じやり方で処理されていた）へと結合し、ベクターpZY557tktをもたらした。pZY557tktを次にSphIで開き、talBを含む、SphIで切断したＰＣＲフラグメントに結合した。E．coliを形質転換し、形質転換物をクローン化した（上記をみよ）後に、tacプロモーターの下流で同じ方向に配向したtktA遺伝子およびtalB遺伝子を含み、次いで遺伝子構造物pZY557tkttaIとして使用されるプラスミドを得た。得られた形質転換体を、グリセリン培養物（３０％）の形で、LB培地で−８０ ℃にて貯蔵した。必要なときには、グリセリン培養物を使用直前に解凍した。実施例２トランスケトラーゼ活性がまた増加された株の成長におけるトランスアルドラーゼの増加された活性の効果グルコース上でのE.coli株AT2471、AT2471／pZY557tkt、 AT2471／pZT557talおよびAT2471／pZY557tkttalの成長を、無機質培地で調べた。この培地は、クエン酸ナトリウム・３Ｈ₂Ｏ(1.0g・ｌ^-1)、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ(0.3g・ｌ^-1)、ＫＨ₂ＰＯ₄(3.0g・ｌ^-1)、Ｋ₂ＨＰＯ₄(12.0g・ｌ^-1)、ＮａＣｌ(0.1g・ｌ^-1)、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄(5.0g・ｌ^-1)、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ(15.0mg・ｌ^-1 )、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（0.75g・ｌ^-1）およびL-チロシン（0.04g・ｌ^-1）からなっていた。さらなる無機質を微量元素溶液（１ｍｌ・ｌ^-1）の形で添加し、それは、Ａｌ₂（ＳＯ₄）₃・１８Ｈ₂Ｏ(2.0g・ｌ^-1)、ＣｏＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏ(0.7g ・ｌ^-1)、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ(2.5g・ｌ^-1)、Ｈ₃ＢＯ₃(0.5g・ｌ^-1)、ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂Ｏ(20.0g・ｌ^-1)、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ(3.0g・ｌ^-1)、ＮｉＳＯ₄・３Ｈ₂Ｏ(2.0g・ｌ^-1)およびＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（15.0g・ｌ^-1）からなっていた。ビタミンＢ１（5.0ｍｇ・ｌ^-1）を水に溶かし、ろ過により滅菌した後に、必要があればカルベニシリンおよび／またはカルベニシリンとクロラムフェニコールのように、後者をオートクレーブで処理した後に、培地に加えた。グルコース（ 30g・ｌ^-1）を別にオートクレーブ処理し、後者をオートクレーブで処理した後に、同様に培地に加えた。実験のために、振とうフラスコ（無機質培地100ｍｌを含む1000ｍｌ）を２ｍｌのグリセリン培様物にて接種し、３７℃、１５０rpmで７２時間、オービタルシェーカーでインキュベートした。ほぼ１の光学密度（620ｎｍ）に達した後、１５〜１００μＭのＩＰＴＧを添加することによって細胞を誘導した。培養物の光学密度を、この時点まで定期的間隔で測定した。上記した条件下で、ホスト生物体E．coli AT2471は、７．２５時間後に１．２の光学密度に達した。突然変異体AT2471／pZY557tktにおけるトランスケトラーゼの活性の増加は、成長速度における顕著な減少に至り、一方、実験の始めで同一の光学密度を有していたが、この株は７．２５時間後に０．４９の光学密度に達したにすぎなかった。成長阻害効果はおそらく、阻害濃度の、ペントースホスフェート経路の代謝中間体の合成に帰する。突然変異体AT2471／pZY557talにおけるトランスアルドラーゼの活性の増加はまた、成長速度における顕著な減少（ほとんどトランスケトラーゼの場合ほど顕著）に至り、７．２５時間後に０．５２の光学密度が達成された。E．coli AT24 71／pZY557 tkttalにおいてなされたように、トランスケトラーゼの活性の他にトランスアルドラーゼの活性を増加させることによって、７．２５時間後に１．１の光学密度に達することが可能であった。この結果は、トランスケトラーゼの増加された活性を有する株においてトランスアルドラーゼの活性をさらに増加させることは、トランスケトラーゼの活性を増加するだけの負の効果を取り消し、実質的に阻害されない成長を可能にすることを明らかにする。実施例３トランスアルドラーゼの酵素活性の測定トランスアルドラーゼの活性を測定するために、E．coli AT2471、AT2471／pZ Y507、AT2471／pZY557talおよびAT2471／pZY557 tkttalの細胞を上記の様にして培養したが、３−（モルホリノ）プロパン−スルホン酸（ＭＯＰＳ、16.7g。ｌ^-1）を培地に加え、ホスフェート濃度は、成長実験において使用した濃度の１／１０に下げられた。細胞の誘導を確認するために、平行実験混合物をセットし、この混合物のうちの１つは、７細胞分裂（OD=1）後にＩＰＴＧ（20μＭ）を添加することによって誘導した。関連したフラスコに誘導物質を加える直前に、培養ブロス20ｍｌを全ての混合物から除き、誘導の時間の３時間後に、細胞を6000ｇにて４℃で１０分間沈降させた。収集した細胞を、１ｍＭのジチオトレイトール、10ｍＭのＭｇＣｌ₂および0.5 ｍＭのチアミンジホスフェートを含む、50ｍＭのグリシルグリシン緩衝液、ｐＨ８．５中で洗浄した。沈降物中の細胞を、２５％の超音波処理サイクルかつ細胞懸濁物１ｍｌ当たり４０ワットで４分間の強度にて、超音波処理（マイクロチップ付きBranson 250 Sonifier）により粉砕した。18,000gにて４℃で３０分間遠心分離した後、上澄（粗抽出物）を、トランスアルドラーゼの活性を測定するために使用した。粗抽出物におけるトランスアルドラーゼ活性は、ＮＡＤの形成と光学的に結合した酵素試験を用いて測定した。このために、粗抽出物を、緩衝液（50ｍＭのグリシルグリシン、ｐＨ８．５、１ｍＭのジチオトレイトール、10ｍＭのＭｇＣｌ₂ および0.5ｍＭのチアミンジホスフェート）中0.8ｍＭのフルクトース 6-ホスフェート、４ｍＭのエリトロース 4-ホスフェートおよび0.3ｍＭのＮＡＤＨを含む全体積１ｍｌ中でインキュベートした。得られたグリセルアルデヒド 3-ホスフェートを、酵素トリオースホスフェートイソメラーゼ（９Ｕ）およびグリセリン 3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３Ｕ）と反応させ、これらの酵素がまた加えられ、ＮＡＤの形成を伴った。ＮＡＤＨの酸化は、３４０ｎｍ（ε＝6.3x10³l・モル^-1・ｃｍ^-1）にて分光光度測定で監視し、１μモルのＮＡＤＨの転化は、フルクトース 6-ホスフェート１μモルの消費と同等であった。１分当たり１μモルのＮＡＤＨの転化を１Ｕとして定義した。粗抽出物中のタンパク質濃度を、ブラッドフォード（Bradford）(Anal．Bioch em．72（1976年）248-254頁)により記載されたようにして、市販されていて入手可能な着色剤を用いて測定した。ウシ血清アルブミンを標準として使用した。表２は、プラスミドpZY557、pZY557talまたはpZY557tkttalのうちの１つを有するホスト株E．coli AT2471およびその突然変異体を用いたときの酵素測定の結果を示す。誘導時において、ホスト株およびベクターpZY557を運ぶ株は、約0.65 Ｕ・(ｍｇタンパク質)^-1のトランスケトラーゼ活性を有することがわかった。E ．coli AT2471／pZY557について示されているように、生理学的成長の結果として、この値は３時間で0.8Ｕ・(ｍｇタンパク質)^-1まで増加した。使用したベクターにおけるtal遺伝子の不在によって、この実験において行われた誘導がいかなる効果を有するとも、予想されるべきものではなかった。平行実験混合物において、E．coli AT2471／pZY557talは、誘導時に、それぞれ0.53および0.61Ｕ・(ｍｇタンパク質)^-1のトランスケトラーゼ活性を有することが分かった。培養物を誘導しなかったときに、トランスアルドラーゼ活性についての値は、３時間でたった0.6Ｕ・(ｍｇタンパク質)^-1にしか増加しなかったが、トランスアルドラーゼ活性は、誘導の結果、1.06Ｕ・(ｍｇタンパク質)^-1の値に達した。他の実験混合物においては、E．coli AT2471／pZY557tkttalは、他のすべての点は同一の実験であったものにおいて使用され、この場合、トランスアルドラーゼ活性は、細胞を誘導した後最初の３時間で、0.8から1.16Ｕ・(ｍｇタンパク質)^-1に増加し、これは、ホスト株を用いた対応する実験と比べて、活性の倍増に相当した。実施例４増加したトランスアルドラーゼ活性の他に増加したトランスケトラーゼ活性を示す株を用いた、物質の生産成長の実験に使用された培地を、合成の実行を測定するために使用した。E.co li AT2471およびAT2471／pZY557 tkttalの培養物を、光学密度１で誘導し、培養の期間を７２時間に延ばした。２４時間後および４８時間後に、培養物のｐＨを測定し、必要なら、ＫＯＨ（45％）を添加することによって初期値７．２に戻した。さらに、光学密度ならびにグルコースとL-フェニルアラニンの濃度を測定するために、試料（２ｍｌ）を２４、４８および７２時間後に取った。蛍光検出（消光335ｎｍ、発光570ｎｍ）と組合せた高圧液体クロマトグラフイー（HPLC、ヒユーレットパッカード、ミュンヘン、ドイツ国）によって、フェニルアラニン濃度を測定した。ヌクレオシル-120-8-C18カラム（250x4.6ｍｍ）を固体相として使用し；カラムは、濃度勾配（溶離液Ａ：９０％の50ｍＭリン酸、１０％のメタノール、ｐＨ２．５；溶離液Ｂ：２０％の50 ｍＭリン酸、８０％のメタノール、ｐＨ２．５；濃度勾配：０〜８分は１００％Ａ、８〜１３分は０％Ａ、１３〜１９分は１００％Ａ）を用いて溶出した。溶出速度は、１．０ｍｌ／分に設定し；カラム温度は４０℃に設定した。カラム後の誘導化(derivatization)を、室温にて、反応キヤピラリー（14ｍｘ0.35ｍｍ）中でo-フタル酸ジアルデヒドを用いて行った。L-フェニルアラニンは、記載された条件下で６．７分の保持時間を有することが分かった。酵素試験片（ダイアバー(Diabur)、ベーリンガーマンハイム、ドイツ国）を用いたグルコース濃度の測定および、結果に依存して、濃縮したグルコース溶液（500g・ｌ^-1）２ｍｌのさらなる添加は、グルコースの制限が、実験混合物において生じなかったことを保証した。４８時間のインキユベーション時間の後、（フェニルアラニン）指標値119が、ホスト株E．coli AT2471を誘導した後に達成され、これは、誘導されていないホスト株についてのフェニルアラニン値100に匹敵する。プラスミドpZY557 tkttalをホスト株に単に導入することは、細胞を誘導することなしにさえ、フェニルアラニン濃度を記載するこの指標値を１６７に増加させるという結果を有した。実験が示すように、株E．coli AT2471／pZY5 57 tkttalを誘導することは、値204へのさらなる増加をもたらした。これは、誘導されたホスト株と比べて71％の増加に相当した。この結果は、増加されたトランスアルドラーゼ活性をすでに有する株におけるトランスケトラーゼの活性をそのうえ増加する、または増加されたトランスケトラーゼ活性をすでに有する株におけるトランスアルドラーゼの活性をそのうえ増加するという本発明に従う正の効果（この効果は、芳香族化合物の合成を増加する）を証明する。実施例５増加されたトランスアルドラーゼ活性を有する株を用いた物質の生産突然変異体E．coli AT2471／pZY557 talを、実施例４に記載したものと他のすべての点で同一の実験において培養した。４８時間後、株の誘導は、（フェニルアラニン）指標値131をもたらし、これは、誘導されていない株についてのフェニルアラニン値100に匹敵する。この結果は明らかに、トランスアルドラーゼの活性を増加する正の効果が、特に本発明に従い誘導した後に、芳香族物質の合成にはたらくことを証明する。実施例６増加されたトランスアルドラーゼ活性があるだけでなく、ＰＥＰに依存しない糖摂取系が発現されていて、トランスアルドラーゼ活性は、ＰＥＰに依存しない糖摂取系導入の後に増加される、ＰＴＳ^-突然変異体を用いた物質の生産ワイサー(Weisser)P.ら（J．Bacterlol．177（1995年）3351-54頁）によって記載されているようにして、ＰＣＲ（ミュリス(Mullis)K.B.ら、Meth.Enzymol． 155(1987年)335-50頁）を用いてglf遺伝子を得た。この遺伝子の完全なヌクレオチド配列が利用可能である(バーネル(Barnell)W.O.ら、J.Bacteriol．172（1990 年）7227-40頁)。プラスミドpZY600を鋳型として用いて、glf遺伝子を増幅した( ワイサー(Weisser)P.ら、J．Bacteriol．177（1995年）3351-4頁)。 glf遺伝子を、E.coli PTS系の構成成分をコードする遺伝子へ組込むという目的のために、プラスミドpPTS1（表１をみよ）をBglIIで消化し、クレノウフラグメントで処理した。唯一の切断部位は、ptsI遺伝子に位置する。glf遺伝子をBam HI-KpnIフラグメントとして、プラスミドpBM20glfglkから分離し、同様にクレノウフラグメントで処理した。平滑断端結合によって、ptsHI遺伝子として同じ配向でglfを運ぶクローンを得た。ptsH遺伝子の３’領域および組込まれたglfとcr rとを含むptsIを運ぶ４．６kbのPstIフラグメントが、得られるプラスミドpPTSg lfから得られた。このフラグメントをベクターpGP704のEcoRV切断部位へ結合した。このベクターはλpir株において複製することだけができるので、もしこれらの形質転換体がカルベニシリンで成長することができるなら、このファージを有しないところの形質転換体によって、このベクターは染色体に組込まれていた。組込みをサザンブロット分析（ミラー(Miller)V.L.ら、J．Bacteriol．170（1 988年）2575-83頁）によって確認した。得られる形質転換体は、glf遺伝子の他に完全なＰＴＳ遺伝子を含んでいた。ベクターの一部分を、第２の相同交差で組換えることができ、カルベニシリン抵抗性の喪失をもたらす。この場合、glf遺伝子の挿入によってpts遺伝子が中断されるので、これらの突然変異体において、機能的なやり方で、ＰＴＳは発現されない。次のようにして、所望のPTS^-突然変異体を選択した：なおPTS⁺である形質転換体を抗生物質なしのＬＢ培地で数回継代培養した後、細胞懸濁液の一定分量を、１００μｇ・ｌ^-1のホスホマイシンを含むＬＢプレートに塗布し培養した。PTS^-突然変異体はこれらのプレートで成長することができる。成長しているクローンを、ホスホマイシンか２０μｇ・ｌ^-1のカルベニシリンのいずれかを含むＬＢプレートに画線塗布した。染色体のＤＮＡを、なおホスホマイシンプレートでの成長を示したがカルベニシリンプレートでは成長できなかったクローンから分離した。glf遺伝子の、ＰＴＳ系をコードする遺伝子への組込みは、サザン分析によって確認した。対応する突然変異体を、表現型にPTS不足であると同定した。１つのクローンを、ホスト生物体E.coli AT2471glfintPTS^-として選択し、プラスミドpZY557talを用いた形質転換（上をみよ）のために使用した。実施例４および５について記載した実験条件に従って、PTS陰性の突然変異体E.coli AT 2471glfintPTS^-／pZY557talおよび対応するホスト株AT2471glfintPTS^-を、夫々の場合に、２つの平行な混合物で培養し、各場合の１つの混合物の細胞を、約７分裂後に誘導した。誘導は、ホスト株の合成能（誘導なしで指標値１００を初期に有していた）を、値５６へと減じた。比較することによって、誘導は、形質転換された株AT2471glfintPTS^-／pZY557talの培養物において、フェニルアラニン指標値を７３から１０３に、従ってホスト株についての初期値より上に増加させた。この結果は、単にトランスアルドラーゼ活性を増加させるだけで、PTS系の活性が減少されている、またはこの系が完全にスウィッチを切られている、かつ同時にＰＥＰに依存しない糖摂取系が組込まれているところのこれらの微生物体においてすら、フェニルアラニンの合成に正の効果を有することを証明する。実施例７増加されたトランスアルドラーゼ活性の他に、ＰＥＰに依存しない糖摂取系が発現されており、トランスアルドラーゼ活性はＰＥＰに依存しない糖摂取系の導入前に増加される、PTS^-突然変異体を用いた物質の生産実施例１に記載したようにして、E.coli AT2471／pZY557talを得た。次に、この株において、glf遺伝子を、E.coliのＰＴＳ系の構成成分をコードする遺伝子に組込んだ。この組込みは、実施例６に記載したようにして行った。実施例４および５に記載した実験条件を用いて、これらのＰＴＳ陰性のE.coliAT2471glfint PTS^-／pZY557tal突然変異体を培養した。誘導された突然変異体の生合成能は実施例６に記載した株の生合成能に相当することが分かった。実施例８増加されたトランスアルドラーゼ活性を有する株および、増加されたトランスアルドラーゼ活性の他に増加されたトランスケトラーゼ活性を有する株を用いた、発酵容器中での物質の生産突然変異体E.coli AT2471、E.coli AT2471／pZY557talおよびE.coli AT2471／ pZY557tkttalを、発酵容器（反応器容積１５リットル）中で培養した。このために、実施例２に記載した無機質培地（250ｍｌ）を有する２つの振とうフラスコ（2000ｍｌ）を、前培養(preculturing)のために使用した。この方法において、グルコース濃度は５．０g・ｌ^-1に減少された。このフラスコに２ｍｌのグリセリン培養物を接種し、オービタルシェーカーで、３７℃、１５０rpmにて、光学密度（600ｎｍ）３に達するまでインキュベートした。前培養物を、４．５リットルの生産培地を接種するために使用した。これは、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ(0.3g・ｌ^-1)、ＫＨ₂ＰＯ₄(3.0g・ｌ^-1)、ＮａＣｌ(0.1g・ｌ^-1)、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄(5.0g・ｌ^-1)、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（15.0mg・ｌ^-1)、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ(0.75g・ｌ^-1)およびL-チロシン（0.24g・ｌ^-1）を含んでいた。さらなる無機質を微量元素溶液（1.5ｍｌ・ｌ^-1）の形で添加し、それは、Ａｌ₂（ＳＯ₄）₃・１８Ｈ₂Ｏ(2.0g・ｌ^-1)、ＣｏＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏ(0.7g・ｌ^-1)、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ(2.5g・ｌ^-1)、Ｈ₃ＢＯ₃(0.5g・ｌ^-1)、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ(2 0.0g・ｌ^-1)、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ(3.0g・ｌ^-1)、ＮｉＳＯ₄・３Ｈ₂Ｏ(2.0g ・ｌ^-1)およびＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（15.0g・ｌ^-1）からなっていた。ビタミンＢ１（75.0ｍｇ・ｌ^-1）を水に溶かし、ろ過により滅菌した後に、後者をオートクレーブで処理した後に、培地に加えた。グルコース（15g・ｌ^-1）を別にオートクレーブ処理し、後者をオートクレーブで処理した後に、同様に培地に加えた。ＮＨ₄ＯＨ（２５％）を添加することによって培地のｐＨ値を７に制御し、酸素分圧は、撹拌器の速度、供給した空気の体積および発酵容器内の圧力によって２０％の値に制御した。グルコース溶液（700g・ｌ^-1）を添加することによって、培養培地のグルコース濃度をほぼ５ｇ・ｌ^-1の値に保持した。発酵時間に依存して、L-チロシン限界を避けるために、可変濃度でL．チロシンをグルコース溶液に加えた。細胞誘導がなされた実験において、５０μＭのＩＰＴＧを添加することによって６時間後に本発明に従いこのことがなされた。３６時間のインキュベーションの後、単にpZY557talプラスミドを導入することによって、（フェニルアラニン）指標値１２０が達成され；これは、誘導されていないホスト株E．coli AT2471 についての（フェニルアラニン）指標値１００に匹敵する。本発明に従う誘導によって、この値はさらに１５３に上げることができた。pZY557tkttalプラスミドのみを導入し、よってトランスアルドラーゼ活性だけでなくトランスケトラーゼ活性を上げることによって、ホスト株と比べて、（フェニルアラニン）指標値１３０が達成され得た。実験はさらに、株E．coli AT2471／pZY557tkttalの誘導は、（フェニルアラニン）指標値を２５０へさらに増加させることを可能にすることを示した。これは、誘導されていない株と比べて、９２％の増加に相当する。この結果は、発酵容器中で行われた実験においてすら、芳香族化合物の合成の増加が、本発明に従い、すでに増加したトランスケトラーゼ活性を有する株において、トランスケトラーゼ活性の増加だけでなくトランスアルドラーゼ活性を増加させることによって、達成できることを示す。表１表２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:13 1:15 1:185 1:425） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者シーヴェ，ルスドイツ国，76137 カールスルヘ，ゲブハルズストラーセ 10 (72)発明者サーム，ヘルマンドイツ国，52428 ジューリッヒ，ヴェンデリヌスストラーセ 71 (72)発明者カルツ，マルティンオランダ国，6137 ジェイイーシッタルド，ブレタグネストラート 35 (72)発明者ソンケ，テオドルスオランダ国，6143 ビーケーシッタルド，カエシリアストラート 15

Claims

【特許請求の範囲】１．物質の微生物による製造方法であって、これらの物質を生産している微生物においてトランスアルドラーゼの活性が増加され、この微生物におけるホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）に依存する糖摂取系の活性が存在するか、減らされるかまたは不在であるところの方法。２．物質の製造が、トランスアルドラーゼ活性の増加に先立ち、予めホスホトランスフェラーゼ系を有する株（pts⁺株）から、スウィッチを切られたホスホトランスフェラーゼ系を有する株（pts^-株）として選択されなかった微生物においてなされる請求項１記載の方法。３．その合成においてペントースホスフェート経路の少なくとも１の中間体が含まれるところの物質が製造される請求項１または２記載の方法。４．中間体がエリトロース 4-ホスフェート(Ery4P)である請求項３記載の方法。５．大腸菌（Escherichia coli）トランスアルドラーゼの活性が増加される請求項１または４記載の方法。６．大腸菌（Escherichia coli）トランスアルドラーゼＢ(TalB)の活性が増加される請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。７．トランスケトラーゼの活性が追加的に増加される請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。８．大腸菌（Escherichia coli）トランスケトラーゼの活性が増加される請求項７記載の方法。９．大腸菌（Escherichia coli）トランスケトラーゼＡ(TktA) の活性が増加される請求項７または８記載の方法。 10．ＰＥＰに依存しない糖の摂取のための輸送タンパク質の活性および／または関連する糖をホスホリル化するキナーゼの活性が、追加的に増加される請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。 11．輸送タンパク質が促進剤である請求項10記載の方法。 12．促進剤が、ザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)グルコース促進剤タンパク質(Glf)である請求項11記載の方法。 13．キナーゼが、ヘキソースをホスホリル化するキナーゼである請求項10〜12のいずれか１項記載の方法。 14.キナーゼが、ザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)から誘導される請求項13記載の方法。 15.キナーゼが、ザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)グルコキナーゼ(G lk)である請求項14記載の方法。 16．ＰＥＰに依存する糖摂取系（もし、この系があるならば）の活性が追加的に減少され、またはスウィッチを切られる請求項10〜15のいずれか１項記載の方法。 17．トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、輸送タンパク質およびキナーゼのうち少なくとも１の成分の活性が、ａ）遺伝子の導入によって、ｂ）および／または遺伝子コピー数を増加することによって、ｃ）および／または遺伝子発現を増加することによって、ｄ）および／または上記酵素の内在性の活性を増加することによって。ｅ）および／または酵素の構造を変えることによって、ｆ）および／または調節解除された酵素を使用することによって、ｇ）および／または調節解除された酵素をコードする遺伝子を挿入することによって増加される請求項１〜16のいずれか１項記載の方法。 18．１または複数の遺伝子を、１またはいくつかの遺伝子構造物中に組込むことによって活性の増加が達成され、ここで１または複数の遺伝子は、単一のコピーとしてまたは増加されたコピー数で、遺伝子構造物中へ導入される請求項17記載の方法。 19．物質の合成に追加的に関与する１以上の酵素が調節解除されおよび／または増加された活性を示すところの微生物が使用される請求項１〜18のいずれか１項記載の方法。 20．製造される物質が芳香族アミノ酸である請求項１〜19のいずれか１項記載の方法。 21．芳香族アミノ酸がＬ-フェニルアラニンである請求項20記載の方法。 22．使用される微生物が、エシェリヒア(Escherichia)属、セラティア(Serratia )属、バチルス(Bacillus)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属またはブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する請求項１〜21のいずれかｌ１項記載の方法。 23．微生物が大腸菌（Escherichia coli）である請求項22記載の方法。 24．組換え形で、ａ）トランスアルドラーゼをコードする遺伝子、またはトランスアルドラーゼをコードする遺伝子およびトランスケトラーゼをコードする遺伝子、およびｂ）ＰＥＰに依存しない糖の摂取のための輸送タンパク質をコードする、または糖をホスホリル化するキナーゼをコードする、少なくとも１の遺伝子を含む遺伝子構造物。 25．輸送タンパク質のための遺伝子が促進剤をコードし、キナーゼのための遺伝子がヘキソースをホスホリル化するキナーゼをコードする請求項24記載の遺伝子構造物。 26．トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼのための遺伝子が大腸菌（ Escherichia coli）から誘導され、かつ輸送タンパク質およびキナーゼのための遺伝子がザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)から誘導される請求項24または25記載の遺伝子構造物。 27．大腸菌（Escherlchia coli）トランスアルドラーゼのための遺伝子がtalBであり、かつ大腸菌（Escherichia coli）トランスケトラーゼのための遺伝子がtk tAであり、およびザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)輸送タンパク質のための遺伝子がglfであり、かつザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis) キナーゼのための遺伝子がglkである請求項24〜26のいずれか１項記載の遺伝子構造物。 28．遺伝子構造物が、遺伝子の１つに割り当てられた少なくとも１の調節遺伝子配列を含む請求項24〜27のいずれか１項記載の遺伝子構造物。 29．遺伝子構造物中の遺伝子の少なくとも１が、それが、誘導可能なプロモーターの制御下にあるように組込まれている請求項28記載の遺伝子構造物。 30．複製可能な形で請求項24〜29のいずれか１項記載の遺伝子構造物を有する形質転換された細胞。 31．細胞において、物質の合成に追加的に関与する１以上の酵素が調節解除されているおよび／または増加された活性を示す請求項30記載の形質転換された細胞。 32．細胞が、大腸菌（Escherichia coli）細胞である請求項30または31記載の形質転換された細胞。 33．ＰＥＰに依存する糖摂取系（もし、この系があるならば）の活性が減少され、またはスウィッチを切られる請求項30〜32のいずれか１項記載の形質転換された細胞。 34．芳香族アミノ酸を生産することができる請求項30〜33のいずれか１項記載の形質転換された細胞。 35．芳香族アミノ酸がL-フェニルアラニンである請求項34記載の形質転換された細胞。 36．請求項29記載の遺伝子構造物が存在する、請求項30〜35のいずれか１項記載の形質転換された細胞を培養し、最も初期の２細胞分裂後に誘導がなされる請求項１〜23のいずれか１項記載の物質の微生物による製造方法。 37．ペントースホスフェート経路の中間体の他に、形質転換された細胞が中心の代謝の他の代謝産物をまた、増大された入手可能性で含む請求項３６記載の方法。