ES2258787T3 - Preparacion microbiana de sustancias del metabolismo aromatico. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE PREPARACION MICROBIANA DE SUSTANCIAS, ESPECIALMENTE DE AMINOACIDOS AROMATICOS, COMO LA L - FENILALANINA, EMPLEANDO UNA PROVISION INCREMENTADA DE INTERMEDIARIOS METABOLICOS, ESPECIALMENTE DE ETITROSA - 4 - FOSFATO. EN DICHOS PROCEDIMIENTOS, SE INCREMENTA LA ACTIVIDAD DE UNA TRANSALDOLASA EN UN MICROORGANISMO QUE PRODUCE DICHAS SUSTANCIAS A PRODUCIR. EN REALIZACIONES PREFERIDAS DE LA INVENCION, SE INCREMENTA ADICIONALMENTE LA ACTIVIDAD DE UNA TRANSCETOLASA O DE UNA PROTEINA DE TRANSPORTE PARA ASEGURAR EL APORTE, INDEPENDIENTE DE FOSFOENOLPIRUVATO (PEP), DE UN AZUCAR Y/O LA ACTIVIDAD DE UNA QUINASA QUE FOSFORILA EL AZUCAR RELEVANTE. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A ESTRUCTURAS GENICAS, Y A CELULAS TRANSFORMADAS QUE PORTAN DICHAS ESTRUCTURAS, QUE PERMITEN LLEVAR A CABO DICHOS PROCEDIMIENTOS CON GRAN EXITO.

Description

Preparación microbiana de sustancias del metabolismo aromático.

La invención se refiere a un proceso para la preparación microbiana de sustancias, en particular aminoácidos aromáticos, de acuerdo con las reivindicaciones 1-23, 36 y 37, a estructuras génicas de acuerdo con las reivindicaciones 24-29, y a células transformadas de acuerdo con las reivindicaciones 30-35.

Las sustancias preparadas microbialmente, tales como productos químicos finos, en particular aminoácidos aromáticos, presentan gran interés económico, continuando en aumento el requerimiento de aminoácidos, por ejemplo. Así, la L-fenilalanina, por ejemplo, se utiliza para preparar medicamentos y, en particular, también en la preparación del edulcorante aspartamo (éster metílico de \alpha-L-aspartil-L-fenilalanina,). El L-triptófano es requerido como medicamento y como aditivo para piensos animales; existe asimismo necesidad de L-tirosina como medicamento y asimismo como materia prima en la industria farmacéutica. Además del aislamiento a partir de materiales naturales, la preparación biotecnológica es un método muy importante para la obtención de aminoácidos en la forma ópticamente activa deseada en condiciones económicamente justificables. La preparación biotecnológica se efectúa utilizando enzimas o utilizando microorganismos. La última preparación, es decir la microbiana, presenta la ventaja de que pueden emplearse materias primas simples y económicas. Sin embargo, dado que la biosíntesis de aminoácidos en la célula está controlada en una gran diversidad de modos, se han hecho ya un gran número de intentos para aumentar la formación de productos. Así, por ejemplo, se han empleado análogos de aminoácidos, con objeto de eliminar la regulación de la biosíntesis. Por ejemplo, mutantes de Escherichia coli que permiten una producción incrementada de L-fenilalanina se han obtenido por selección de la resistencia a análogos de fenilalanina (GB-2.053.906). Una estrategia similar condujo también a la superproducción de cepas de Corynebacterium (JP-19037/1976 y JP-39517/1978) y Bacillus (EP-0.138.526). Adicionalmente, se conocen microorganismos que se han construido utilizando técnicas de DNA recombinante, en los cuales la regulación de la biosíntesis está eliminada análogamente, siendo clonados y expresados los genes que codifican enzimas clave que ya no están sometidas a inhibición de la realimentación. Como prototipo, EP-0.077.196 describe un proceso para producir aminoácidos aromáticos en el cual una 3-desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato-sintasa (DAHP-sintasa) que ya no está sometida a inhibición de la realimentación se sobreexpresa en E. coli. EP-0.145.156 describe una cepa de E. coli en la cual se sobreexpresan adicionalmente corismato-mutasa/prefenato-deshidratasa para el propósito de producir L-fenilalanina.

Una característica común a las estrategias mencionadas anteriormente es que la intervención para mejorar la producción está restringida al camino de biosíntesis que es específico para los aminoácidos aromáticos. Sin embargo, con objeto de aumentar todavía más la producción, tienen que realizarse esfuerzos para mejorar la provisión de los metabolitos primarios, fosfoenolpiruvato (PEP) y eritrosa-4-fosfato (Ery4P), que son necesarios para la producción de los aminoácidos aromáticos.

PEP es un precursor activado del producto de glicolisis piruvato; Ery4P es un compuesto intermedio en el camino pentosa-fosfato.

Se han realizado diversos intentos para conseguir una mejora específica en la provisión de dicho metabolito primario Ery4P. Un flujo incrementado de carbono a través del camino pentosa-fosfato fue conseguido en E. coli por eliminación de la enzima fosfoglucosa-isomerasa; esto dio como resultado la formación de triptófano (Mascarenhas D. et al., Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 2995-99). US-A-5.168.056 dio a conocer que la sobreexpresión de una transcetolasa, conseguida por medio de técnicas de DNA recombinante, hace posible obtener una provisión incrementada de Ery4P y, como consecuencia, un aumento en la formación de L-triptófano, L-tirosina o L-fenilalanina como productos. Tanto Draths K.M. et al. (J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 3956-62) como Flores N. et al. (Nat. Biotechnol. 14 (1996) 620-3) demostraron el mismo efecto. Sin embargo, como ha expuesto Feldmann, el aumento simple de la actividad de transcetolasa en cepas de Zymomonas mobilis que carecen de actividad de transaldolasa conduce al enriquecimiento de metabolitos del camino pentosa-fosfato en las células y, como consecuencia, a efectos negativos sobre el crecimiento celular (Feldmann S.D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 354-61). Este efecto fisiológico puede ser atribuible posiblemente a una concentración intracelular excesiva de sedoheptulosa-7-fosfato. Los autores de la invención han encontrado también una inhibición correspondiente del crecimiento de la biomasa como consecuencia de la sobreexpresión de transcetolasas en el caso de cepas tal^{+} de E. coli.

El objeto de la invención es, por consiguiente, poner a disposición un proceso alternativo para la producción de sustancias, en particular aminoácidos aromáticos, proceso que se distingue por una provisión incrementada de compuestos intermedios del metabolismo intracelular para la síntesis de estas sustancias sin presentar las desventajas de los procesos arriba citados, desventajas que son consecuencia de aumentar únicamente la actividad de la trascetolasa.

Sorprendentemente, este objeto se consigue, de acuerdo con la invención, poniendo a disposición un proceso para la preparación microbiana de sustancias, en cuyo proceso la actividad de una transaldolasa se incrementa en un micro-organismo que es productor de estas sustancias, estando presente, reducida o ausente en este microorganismo la actividad de un sistema de absorción de azúcares dependiente del fosfoenolpiruvato (PEP).

Este resultado es particularmente sorprendente dado que no es en modo alguno evidente en sí mismo que las transaldolasas jueguen un papel importante en el crecimiento de microorganismos y en su producción de sustancias. Esto es particularmente aplicable en el caso del crecimiento sobre hexosas. Así, se conocen, por ejemplo, cepas de levadura que son capaces todavía de crecer sobre glucosa a pesar de tener una mutación en el gen de trans-aldolasa (Schaaff L. et al., Eur. J. Biochem. 188 (1990) 597-603). De acuerdo con ello, una transaldolasa no debería ejercer influencia esencial alguna sobre el crecimiento celular. Esto está respaldado por el hecho de que se conocen también especies bacterianas que son capaces de crecer en ausencia de una transaldolasa (Feldmann S.D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 354-62).

Adicionalmente, hexosas tales como glucosa, en contraste con xilosa y otras pentosas, pueden ser metabolizadas también por caminos de degradación distintos del camino pentosa-fosfato. Por consiguiente no es evidente en absoluto en sí mismo que la transaldolasa tenga una función esencial en la degradación de la glucosa.

Puede indicarse también que un flujo incrementado por la vía de las enzimas del camino pentosa-fosfato se midió in vitro en extractos de células de Saccharomyces cerevisiae en los cuales la actividad de una transaldolasa se incrementó (Senac T. et al., Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 1701-6). Sin embargo, las condiciones experimentales que se seleccionaron en este estudio no permiten transferencia alguna de los resultados a los fenómenos naturales de la fisiología del metabolismo que tienen lugar en los microorganismos vivos, en particular bacterias. Adicionalmente, puede indicarse que Liao J.C. et al. Biotechn. Bioeng. 52 (1996) 129-140 han demostrado que cuando las actividades de una transaldolasa y AroG se incrementan simultáneamente, aumenta la formación de DAHP. Este efecto debe adscribirse principalmente al aumento en la actividad de AroG. Un aumento en la producción de sustancias como resultado de un aumento en la actividad de transaldolasa como tal no ha sido descrito ni indicado. Por consiguiente, no debe esperarse en modo alguno que exista una relación causal entre un aumento en la actividad de transaldolasa en los microorganismos y la provisión de Ery4P para la producción incrementada de sustancias. El aumento de la actividad (sobreexpresión) de una transaldolasa de acuerdo con la presente invención pone a disposición un proceso alternativo para la implementación de un flujo incrementado de carbono a través del camino pentosa-fosfato y la consecución consiguiente de una provisión incrementada del metabolito primario Ery4P. Una cantidad incrementada de Ery4P está disponible por tanto para la síntesis microbiana de sustancias, en cuya síntesis está implicado al menos un compuesto intermedio del camino pentosa-fosfato, y en particular Ery4P. Los autores de la presente invención han demostrado que la disponibilidad incrementada de Ery4P ocurre tanto en microorganismos en los cuales la actividad de un sistema de absorción de azúcares dependiente de PEP está presente o reducida como en microorganismos en los cuales está ausente dicha actividad. Así pues, de acuerdo con la invención no sólo pueden utilizarse organismos que tienen todavía sistemas de fosfotransferasa (PTS) activos o sistemas de fosfotransferasa con actividad reducida (cepas pts^{+}) sino también organismos en los cuales la PTS ha sido eliminada
(cepas pts^{-}).

Dentro del significado de la invención, las sustancias deben entenderse como, por ejemplo, productos químicos finos tales como aminoácidos aromáticos, índigo, ácido indolacético, ácido adípico, melanina, quinonas, y ácido benzoico, así como sus derivados potenciales y productos secundarios - o bien, de manera general, productos secundarios de compuestos intermedios del camino pentosa-fosfato. Sin embargo, esto debería incluir también todos aquellos compuestos, por ejemplo piridoxina y sus derivados, cuya síntesis bioquímica esté promovida por la provisión de eritrosa-4-fosfato. Dentro del contexto de esta invención, todas estas sustancias se consideran también como sustancias procedentes del metabolismo aromático. Puede indicarse en este contexto que se requieren alteraciones genéticas ulteriores de los microorganismos productores de la sustancia, además de las nuevas intervenciones, para la preparación de índigo, ácido adípico y otros productos secundarios no naturales. El proceso de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para la preparación de sustancias en microorganismos que no han sido seleccionados, antes del incremento de la actividad de transaldolasa, como cepas con un sistema de fosfotransferasa eliminado (cepas pts^{-}) a partir de cepas que albergaban previamente un sistema de fosfotransferasa (cepas pts^{+}). En conexión con esto, puede indicarse que la memoria descriptiva de patente WO-96/34961 no publicada previamente describe una selección de este tipo a partir de lo que eran previamente cepas pts^{+}, pero en este estudio dicha selección precede al aumento de la actividad de transcetolasa o transaldolasa.

Con relación al aumento de la actividad de una transaldolasa, se da preferencia a aumentar la actividad de una transaldolasa de Escherichia coli y, en particular, la actividad de transaldolasa B (TalB) de Escherichia coli. Cuando se utiliza el gen talB correspondiente, este gen procede preferiblemente de Escherichia coli K12 o de una cepa que se deriva de ella. Aparte de éste, sin embargo, es adecuado también cualquier gen cuyo producto génico catalice una reacción que corresponde a la de la una transaldolasa, es decir la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato más gliceraldehído-3-fosfato en Ery4P y fructosa-6-fosfato.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, se incrementa la actividad de una transcetolasa además de aumentar la actividad de una transaldolasa. En presencia de pentosas, la expresión de un gen de transcetolasa conduce por sí misma a una acumulación de metabolitos en el camino de fosfato de pentosa (Feldmann S.D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 354-61). Esto tiene un efecto nocivo sobre la célula y da como resultado, entre otras cosas, que las células transformadas crezcan a una tasa disminuida. Los autores de la invención han observado también un efecto idéntico en el caso de una cepa de Escherichia coli que estaba creciendo sobre glucosa y que exhibía actividad incrementada de transcetolasa. Sin embargo, se ha encontrado ahora que el aumento simultáneo de la actividad de una transcetolasa además del de una transaldolasa es muy beneficioso para proporcionar Ery4P y no exhibe los efectos secundarios negativos de una sobreexpresión exclusiva de una transcetolasa. La acumulación de metabolitos del camino pentosa-fosfato que ocurre cuando se incrementa la actividad de una transcetolasa no se materializa por consiguiente como resultado del aumento de la actividad de una transaldolasa, como resultado de lo cual la reducción del crecimiento de las células no sólo se detiene, sino que incluso se convierte en un aumento de crecimiento. Resulta, por tanto, que el aumento de la actividad de una transcetolasa particularmente en cepas que tienen una actividad incrementada de transaldolasa de acuerdo con la invención es una medida sensible.

Con relación al aumento de la actividad de una transcetolasa, se da preferencia a aumentar la actividad de una transcetolasa de Escherichia coli y, en particular, la actividad de la transcetolasa A (TktA) de Escherichia coli. Cuando se utiliza el gen tktA correspondiente, este gen procede preferiblemente de Escherichia coli K12 o de una cepa que se deriva de ella. Aparte de esto, sin embargo, es adecuado también cualquier gen cuyo producto génico catalice una reacción que corresponde a la de una transcetolasa, es decir la conversión de ribosa-5-fosfato más xilulosa-5-fosfato en sedoheptulosa-7-fosfato más gliceraldehído-3-fosfato o la conversión de xilulosa-5-fosfato más Ery4P en fructosa-6-fosfato más gliceraldehído-3-fosfato.

En otra realización particularmente preferida de la invención, la actividad de una proteína de transporte para la absorción independiente de PEP de un azúcar y/o la actividad de una quinasa que fosforila el azúcar correspondiente se incrementa(n) además de aumentar la actividad de una transaldolasa o aumentar la actividad de una transaldolasa y una transcetolasa. El caso de la proteína de transporte, la actividad de esta proteína se entiende como la tasa de absorción mediada por la proteína. El aumento adicional en la actividad de una de estas últimas proteínas, es decir la proteína de transporte y la quinasa, o de ambas proteínas hace posible conseguir una producción todavía mayor de sustancias, en particular aminoácidos aromáticos, debido al hecho de que se proporciona PEP en cantidad incrementada para la condensación con Ery4P para formar el metabolito primario del camino general para la biosíntesis de compuestos aromáticos, a saber desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato (DAHP).

Es aconsejable utilizar un facilitador como la proteína de transporte para la absorción independiente de PEP de un azúcar, es decir una proteína de transporte que actúa de acuerdo con el principio de la difusión facilitada mediada por proteínas. En particular, es adecuado utilizar la proteína facilitadora de glucosa (Glf) de Zymomonas mobilis. Cuando se utiliza esta última, el gen codificante de la proteína, glf, se obtiene, por ejemplo, a partir de Z. mobilis ATCC 10988, ATCC 29191 o ATCC 31821. Sin embargo, otros genes bacterianos de transporte de azúcares cuyos productos génicos transportan glucosa, fructosa o sacarosa, por ejemplo, y al hacerlo así no utilizan PEP alguno, por ejemplo el sistema GalP de Escherichia coli, son también adecuados para el nuevo proceso. Pueden utilizarse también genes para sistemas de transporte de azúcares, tales como HXT1 a HXT7, procedentes de microorganismos eucariotas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis o Kluyveromyces lactis, o genes de transporte de azúcares procedentes de otros organismos en general, con tal que los mismos puedan expresarse de manera funcional en los microorganismos y que los productos génicos puedan, en este contexto, operar sin utilizar PEP para transportar los azúcares. Para que ello sea posible, es particularmente aconsejable expresar los genes de transporte de azúcares en microorganismos que produzcan aminoácidos (productores de aminoácidos).

Es particularmente adecuado, por tanto, utilizar el gen facilitador glf, aislado de Z. mobilis ATCC 31821, para absorber azúcares tales como glucosa, fructosa o manosa cuando se preparan aminoácidos aromáticos de acuerdo con el nuevo proceso. (Parker C. et al., Mol. Microbiol. 15 (1995) 795-802; Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351-4). El proceso de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para la preparación de aminoácidos aromáticos en microorganismos en los cuales el sistema PTS tiene una actividad reducida o está completamente ausente. En tales casos, el sistema PTS puede reducirse o suprimirse antes, pero también después del aumento de la actividad de transaldolasa.

El gen glf, en particular, debería insertarse preferiblemente con un número de copias bajo del gen a fin de evitar efectos nocivos sobre la célula debidos a la expresión excesiva de proteínas de membrana. Así pues, se prefiere un número de copias del gen comprendido entre 2 y 5, por ejemplo, para el gen glf. Es particularmente ventajoso insertar el gen glf en uno de los genes del operón ptsHI-crr, por ejemplo en el gen ptsI.

Cuando se emplea una quinasa fosforilante de azúcares, es aconsejable utilizar una quinasa fosforilante de hexosas, preferiblemente una quinasa, en particular glucoquinasa (Glk), de Zymomonas mobilis. Cuando se utiliza la última, el gen codificante de la proteína, glk, se deriva, por ejemplo, de Z. mobilis ATCC 10988, ATCC 29191 o ATCC 31821. Otros genes para quinasas fosforilantes de hexosas procedentes de bacterias cuyos productos génicos fosforilen hexosas al tiempo que consumen ATP, tales como una fructoquinasa o una manoquinasa, son adecuados asimismo para el nuevo proceso. Adicionalmente, genes para, por ejemplo, quinasas procedentes de microorganismos eucariotas, tales como Saccharomyces cerevisiae, o, de manera general, genes para quinasas fosforilantes de azúcares procedentes de otros organismos, son también adecuados, con tal que los mismos puedan expresarse de una manera funcional en los microorganismos, en particular productores de aminoácidos, y puedan operar sin utilizar PEP para fosforilar los azúcares. El gen de glucoquinasa, glk, para fosforilación de glucosa, gen que se aísla a partir de Z. mobilis ATCC 29191, es particularmente adecuado para preparación de aminoácidos aromáticos de acuerdo con el nuevo proceso.

La disponibilidad de PEP para producir el primer producto intermedio del metabolismo de los aminoácidos aromáticos puede estar limitada en microorganismos en los cuales está incrementado el flujo de material hacia Ery4P. En estos casos, puede ser ventajoso reducir, o eliminar por completo, otras reacciones consumidoras de PEP en el metabolismo, tales como la reacción del sistema de fosfotransferasa PEP:azúcar (PTS), que cataliza una absorción de azúcar dependiente de PEP, si está presente este sistema. De acuerdo con la invención, puede hacerse uso a la vez de organismos que poseen todavía genes PTS activos (cepas pts^{+}) y, para la mejora adicional del proceso, de mutantes pts en los cuales la actividad del pts está reducida (que se considerarán también como pts^{+} en el caso presente) o en los cuales el pts está eliminado (cepas pts^{-}). Una disminución de esta naturaleza puede efectuarse o bien al nivel enzimático o por utilización de métodos genéticos, por ejemplo por inserción de un gen glf y/o un gen glk en el cromosoma y, en particular, en el locus del gen ptsI, procedimiento que estabiliza simultáneamente el DNA recombinante en el cromosoma (estabilidad de segregación) y significa por consiguiente que puede prescindirse del uso de un vector. Las experiencias de los autores de la invención han demostrado que la reducción o eliminación de la actividad del PTS no debería tener lugar preferiblemente antes de aumentar la actividad de la transaldolasa.

Dentro del significado de la invención, las medidas para aumento de la actividad deben entenderse como todas aquellas medidas que son adecuadas para aumentar la actividad de la transaldolasa, de la transcetolasa, de la proteína de transporte, y de la quinasa. Las medidas siguientes son particularmente adecuadas para este propósito:

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introducción de genes, por ejemplo utilizando vectores o fagos moderados;

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aumento del número de copias del gen, por ejemplo utilizando plásmidos con la finalidad de introducir los genes de acuerdo con la invención en el microorganismo con un número de copias incrementado, es decir con un número de copias que está ligeramente (v.g. de 2 a 5 veces) incrementado hasta fuertemente (v.g. de 15 a 50 veces) incrementado;

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aumento de la expresión génica, por ejemplo por aumento de la tasa de transcripción, por ejemplo por utilización de elementos promotores tales como Ptac, Ptet u otras secuencias nucleotídicas reguladoras, y/o por aumento de la tasa de traducción, por ejemplo por utilización de un sitio de fijación de ribosoma de consenso;

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aumento de la actividad endógena de enzimas que están presentes, por ejemplo por medio de mutaciones que se producen de manera aleatoria por métodos convencionales, utilizando por ejemplo irradiación UV o productos químicos que provocan mutaciones, o por medio de mutaciones, tales como uno(a) o más deleciones, inserciones y/o intercambios de nucleótidos, que se producen de manera específica utilizando métodos de ingeniería genética;

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aumento de la actividad de enzimas por alteración de la estructura de las enzimas, por ejemplo por medio de mutagénesis utilizando métodos físicos, químicos o de biología molecular u otros métodos microbiológicos;

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utilización de enzimas desreguladas, por ejemplo enzimas que ya no están sujetas a inhibición de realimentación;

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introducción de genes correspondientes que codifican las enzimas desreguladas.

Combinaciones de los métodos arriba mencionados y otros métodos análogos pueden emplearse también para aumentar la actividad. La actividad endógena o introducida de proteínas de transporte puede incrementarse, por ejemplo, por clonación del gen utilizando los métodos mencionados anteriormente, por ejemplo, o por selección de mutantes que exhiben un transporte de sustratos incrementado.

Preferiblemente, la actividad se incrementa por integración del gen, o los genes, en una estructura génica, o en varias estructuras génicas, introduciéndose cada gen o cada uno de los genes en la estructura génica como una sola o más copias o en número de copias incrementado. Dentro del significado de la invención, una estructura génica debe entenderse como un gen y cualquier otra secuencia nucleotídica que sea portadora de los genes de acuerdo con la invención. Secuencias nucleotídicas apropiadas pueden ser, por ejemplo, plásmidos, vectores, cromosomas, fagos u otras secuencias nucleotídicas que no están cerradas circularmente.

Un cromosoma, dentro del significado de la invención, es un cromosoma en el cual se ha insertado al menos un gen de acuerdo con la invención, conteniendo la secuencia de ácido nucleico resultante al menos un gen, o una copia del gen, más que el que está contenido naturalmente en este cromosoma. Por otra parte, por ejemplo, la recombinación homóloga dentro de un locus del gen conduce a un cromosoma que no tiene que diferir necesariamente de la forma natural. Los cromosomas que se preparan por recombinación homóloga no deben considerarse, por consiguiente, como de acuerdo con la invención si el número natural de genes homólogos no se sobrepasa.

Dentro del significado de la invención, una estructura génica debe entenderse también como una combinación de los portadores de genes mencionados anteriormente, tales como vectores, cromosomas y fagos moderados, en los cuales están distribuidos los genes de acuerdo con la invención. Por ejemplo, dos genes tal pueden estar introducidos en la célula en un vector o dos genes tal pueden estar insertados en un cromosoma. Además, un gen adicional puede, por ejemplo, introducirse en la célula utilizando un fago. Esto mismo es aplicable a los otros genes de acuerdo con la invención. Estos ejemplos no pretenden excluir otras combinaciones de distribuciones de los genes de la invención. En cualquier caso, es crucial que el número de genes contenidos en el microorganismo de acuerdo con la invención sobrepase el número natural de los genes correspondientes. Preferiblemente, el número de genes glf, por ejemplo, estará incrementado en un factor de 2 a 5 a fin de conseguir el aumento de actividad de acuerdo con la invención. A estas concentraciones no aparecerá efecto tóxico alguno en las células. Sin embargo, es imaginable también introducir los genes de acuerdo con la invención en el microorganismo con un número de copias mayor, de hasta 50 copias del gen de una forma que tenga el mismo efecto.

En el nuevo proceso para producción de sustancias, se da preferencia al empleo de microorganismos en los cuales una o más enzimas que están implicadas adicionalmente en la síntesis de las sustancias están desreguladas y/o tienen una actividad incrementada.

Estas enzimas son, en particular, las enzimas del metabolismo de los aminoácidos aromáticos y, especialmente, DAHP-sintasa, shikimato-quinasa y corismato-mutasa/prefenato-deshidratasa, así como todas las restantes enzimas que están implicadas en la síntesis de compuestos intermedios del metabolismo de los aromáticos y sus productos secundarios.

Aparte de las enzimas de acuerdo con la invención, es particularmente importante la desregulación y sobreexpresión de DAHP-sintasa para preparar sustancias tales como ácido adípico, ácidos biliares y compuestos quinónicos y sus derivados. Adicionalmente, la shikimato-quinasa debería desregularse, e incrementarse su actividad, a fin de lograr una síntesis superelevada de, por ejemplo, triptófano, tirosina, índigo y derivados del ácido hidroxibenzoico y el ácido aminobenzoico y naftoquinonas y antraquinonas, así como sus productos secundarios. La corismato-mutasa/prefenato-deshidratasa desregulada y sobreexpresada tiene adicionalmente una importancia particular para la producción eficiente de fenilalanina y ácido fenilpirúvico y sus derivados. Sin embargo, debe entenderse también que esto abarca todas las restantes enzimas cuyas actividades contribuyen a la síntesis bioquímica de sustancias, es decir de compuestos cuya producción es promovida por la provisión de eritrosa-4-fosfato, por ejemplo piridoxina y sus derivados. Puede indicarse que se requieren alteraciones genéticas adicionales a los microorganismos productores de sustancias, además de las nuevas intervenciones, para el propósito de preparación de índigo, ácido adípico y otros productos secundarios no naturales.

El nuevo proceso es adecuado, en particular, para la preparación de aminoácidos aromáticos, en particular fenilalanina. En el último caso, la expresión génica y/o la actividad enzimática de una DAHP-sintasa desregulada (v.g. AroF o AroH en E. coli) y/o de una corismato-mutasa/prefenato-deshidratasa (PheA) asimismo desregulada está preferiblemente incrementada.

Especies de Escherichia, así como microorganismos de los géneros Serratia, Bacillus, Corynebacterium o Brevibacterium, y otras cepas que son conocidas por métodos convencionales de aminoácidos, son adecuadas para uso como organismos de producción. Es particularmente adecuado Escherichia coli.

Otro objeto de la invención es proporcionar estructuras génicas adecuadas, así como células transformadas portadoras de estas estructuras génicas, que permiten la implementación del proceso de una manera particularmente satisfactoria. Dentro del contexto de esta invención, se ponen ahora a disposición nuevas estructuras génicas, estructuras génicas que contienen, de forma recombinante, a) un gen que codifica una transaldolasa o un gen que codifica una transaldolasa y un gen que codifica una transcetolasa, y b) al menos un gen que codifica una proteína de transporte para la absorción independiente de PEP de un azúcar o que codifica una quinasa que fosforila un azúcar. En estas estructuras génicas, se prefiere que el gen para la proteína de transporte codifique un facilitador y el gen para la quinasa codifique una quinasa fosforilante de hexosas. En particular, los genes para la transaldolasa y la transcetolasa se derivan de Escherichia coli y los genes para la proteína de transporte y la quinasa se derivan de Zymomonas mobilis.

Son particularmente ventajosas estructuras génicas en las cuales el gen para la transaldolasa es Escherichia coli talB y el gen para la transcetolasa es Escherichia coli tktA, mientras que el gen para la proteína de transporte es Zymomonas mobilis glf y el gen para la quinasa es Zymomonas mobilis glk.

Los genes apropiados se aíslan, y las células se transforman, de acuerdo con métodos corrientes: las secuencias nucleotídicas completas de los genes talB y tktA de Escherichia coli K12 son conocidas (Yura T. et al., Nucl. Acid. Res. 20 (1992) 3305-8; Sprenger G.A., Biochem. Biophys. Acta 1216 (1993) 307-10; Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930-9) y están depositadas en bases de datos tales como la del EMBL en Heidelberg. Cuando el gen talB de Escherichia coli se somete a clonación, es adecuado el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo, para amplificar específicamente el gen utilizando DNA cromosómico de las cepas K12 de Escherichia coli (Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930-9). La complementación homóloga de un mutante deficiente en transcetolasa es adecuada, por ejemplo, cuando se somete a clonación el gen tktA de Escherichia coli (Sprenger G.A. en: Bisswanger H. et al., Biochemistry and physiology of thiamine diphosphate enzymes, VCH (1991) 322-6).

Cuando se somete a clonación el gen de transporte glf de Zymomonas mobilis o el gen glk de glucoquinasa de Zymomonas mobilis, por ejemplo, es adecuada la PCR, por ejemplo, para amplificar específicamente el gen utilizando DNA cromosómico de las cepas ATCC 29191 o ATCC 31821 de Zymomonas mobilis, como lo es también la complementación heteróloga de mutantes de Escherichia coli que son deficientes en las funciones de PTS y que son por tanto inadecuados para transportar glucosa, por ejemplo (Snoep J.L. et al., J. Bacteriol. 174 (1994) 1707-8; Parker C. et al., Mol. Microbiol. 15 (1995) 795-82; Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351-4). Después de aislar los genes y recombinar los mismos in vitro con vectores conocidos de bajo número de copias tales como pACYC184, pACYC177, pSC101 o pZY507 (Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351-4), la célula hospedadora se transforma utilizando métodos químicos, electroporación, conjugación o transducción.

El gen de transaldolasa aislado puede integrarse, junto con uno o más de los genes descritos dentro del contexto de la invención, en cualquier combinación, en una estructura génica o en varias estructuras génicas. Sin considerar la asignación precisa de las estructuras génicas, esto conduce a combinaciones tales como talB, talB + tktA, talB + glf, talB + glk, talB + glf + glk, talB + tktA + glf, talB + tktA + glk o talB + tktA + glf + glk.

Son ventajosas las estructuras génicas que contienen al menos una secuencia de un gen regulador que está asignada a uno de los genes. Así, el refuerzo de los elementos reguladores puede efectuarse preferiblemente al nivel de la transcripción, particularmente por refuerzo de las señales de transcripción. Esto puede efectuarse, por ejemplo, aumentando la actividad del promotor o los promotores por alteración de las secuencias promotoras que están localizadas aguas arriba de los genes estructurales o reemplazando por completo los promotores con promotores más eficaces. La transcripción puede reforzarse también ejerciendo una influencia apropiada sobre un gen regulador que está asignado a los genes; además de esto, sin embargo, es también posible reforzar la traducción mediante, por ejemplo, mejora de la estabilidad del RNA mensajero (mRNA).

Las estructuras génicas más adecuadas son aquéllas en las cuales al menos uno de los genes descritos está incorporado de tal manera que el mismo se encuentra bajo el control de un promotor inducible. Cuando los genes están dispuestos en una estructura génica de acuerdo con la invención, un promotor puede estar localizado aguas arriba de un gen o estar localizado, como un promotor común, aguas arriba de varios genes, o puede hacerse uso de dos promotores opuestos entre los cuales están dispuestos los genes de tal manera que los mismos se leen en direcciones opuestas. En este contexto, el gen glf, por ejemplo, puede estar localizado aguas abajo de un promotor relativamente débil (v.g. Ptet) y otros genes pueden estar bajo el control del promotor tac. Una o más secuencias de DNA pueden estar localizadas aguas arriba y/o aguas abajo de los genes contenidos en una estructura génica, con o sin un promotor aguas arriba o con o sin un gen regulador asignado. Por medio de la utilización de elementos promotores inducibles, v.g. lacI^{q}/Ptac, es posible la puesta en marcha de nuevas funciones (inducción de la síntesis de enzimas), por ejemplo por adición de inductores químicos tales como isopropiltiogalactosido (IPTG).

El objeto de la invención se alcanza también proporcionando células transformadas que albergan una estructura génica de acuerdo con la invención en forma replicable.

Dentro del significado de la invención, una célula transformada debe entenderse como cualquier microorganismo que lleva una estructura génica de acuerdo con la invención, estructura génica que da lugar a la formación incrementada de sustancias en la célula. Las células hospedadoras pueden transformarse por medio de métodos químicos (Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580) y también por medio de electroporación, conjugación o transducción.

Para la transformación, es ventajoso emplear células hospedadoras en las cuales una o más enzimas que están involucradas adicionalmente en la síntesis de las sustancias están desreguladas y/o tienen una actividad incrementada. Una cepa de microorganismo, en particular Escherichia coli, que es productora de un aminoácido aromático u otra sustancia de acuerdo con la invención se transforma con la estructura génica que contiene los genes relevantes. Para transformación con las estructuras génicas, es ventajoso emplear células hospedadoras en las cuales la actividad del sistema de absorción de azúcares dependiente de PEP, si está presente, está reducida o eliminada.

En particular, se proporcionan las células transformadas que son capaces de producir un aminoácido aromático, siendo el aminoácido aromático preferiblemente L-fenilalanina.

Utilizando el nuevo proceso, y el microorganismo que se ha transformado de acuerdo con la doctrina de la invención, pueden emplearse un amplio espectro de sustratos para producción de sustancias. Dentro del contexto de la invención, se proporciona también por consiguiente un proceso para la preparación microbiana de sustancias en el cual se cultivan células que han sido transformadas de acuerdo con la invención y en las cuales está presente una estructura génica que contiene al menos una secuencia génica reguladora que está asignada a uno de los genes, induciéndose la síntesis enzimática en los microorganismos después de al menos 2 divisiones celulares (comienzo de la fase de crecimiento exponencial). Como consecuencia, la producción de los microorganismos puede incrementarse con independencia de su crecimiento.

En una realización particularmente preferida del nuevo proceso, se emplean células transformadas que, además de los compuestos intermedios del camino pentosa-fosfato, contienen también una disponibilidad incrementada de otros metabolitos del metabolismo central. Estos metabolitos incluyen, por ejemplo, piruvato procedente de la glicólisis o gluconeogénesis, u oxaloacetato procedente del ciclo del ácido cítrico. Adicionalmente, el compuesto relevante, o sus precursores, es decir los precursores del piruvato o de los metabolitos del ciclo del ácido cítrico, tales como fumarato o malato, pueden ponerse a disposición de las células en crecimiento por alimentación.

La invención se explica con mayor detalle más adelante con ayuda de unos cuantos ejemplos de implementación. Las cepas siguientes se han depositado en el DSM de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest:

DSM 11210 Escherichia coli AT2471/pZYTT7tal

DSM 11209 Escherichia coli AT2471/pZY557tkttal

DSM 11206 Escherichia coli AT2471GP704g1fint PTS^{+}

DSM 11205 Escherichia coli AT2471g1fint PTS^{-}

El organismo hospedador empleado, a saber AT2471, ha sido depositado por Taylor y Trotter (Bacteriol. Rev. 13 (1967) 332-353) en el CGSC bajo el número 4510 y está disponible libremente.

Las características y la procedencia de todos los microorganismos empleados dentro del contexto de esta solicitud de patente se describen en detalle en la Tabla 1.

El texto que sigue tiene por objeto indicar los materiales y métodos empleados y respaldar la invención con ejemplos experimentales y ejemplos comparativos:

Métodos generales

En los estudios genéticos, se cultivaron cepas de E. coli, a no ser que se indique otra cosa, en medio LB constituido por bacto-triptona Difco (10 g\cdotl^{-1}), extracto de levadura Difco (5 g\cdotl^{-1}) y NaCl (10 g\cdotl^{-1}). Dependiendo de las propiedades de resistencia de las cepas empleadas, se añadió/añadieron al medio carbenicilina (20-100 mg\cdotl^{-1}) y/o cloranfenicol (17-34 mg\cdotl^{-1}) en caso necesario. Para esto, la carbenicilina se disolvió primeramente en agua, y el cloranfenicol en etanol, y las soluciones se añadieron, después de haber sido esterilizadas por filtración, al medio tratado previamente en autoclave. Se añadió bacto-agar Difco (1,5%) al medio LB para preparación de placas de agar. Se aisló DNA plasmídico de E. coli por medio de lisis alcalina utilizando un sistema disponible comercialmente (Quiagen, Hilden). Se aisló el DNA cromosómico de E. coli y Z. mobilis como ha sido descrito por Chen y Kuo (Nucl. Acid Res. 21 (1993) 2260).

Se utilizaron enzimas de restricción (DNA-polimerasa I, fosfatasa alcalina, RNasa y DNA-ligasa T4 de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes (Boehringer Mannheim, Alemania o Promega, Heidelberg, Alemania). Para el análisis de restricción, los fragmentos de DNA se fraccionaron en geles de agarosa (0,8%) y se aislaron de la agarosa por medio de extracción utilizando un sistema disponible comercialmente (Jetsorb Genomed, Bad Oeynhausen, Alemania).

Para los análisis Southern, se digirió el DNA cromosómico (10 \mug) con enzimas de restricción, se fraccionó por tamaños mediante electroforesis en gel y se transfirió a una membrana de nailon (Nytran 13, Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania) por medio de difusión mediada a vacío (VacuGene System, Pharmacia, Freiburg, Alemania). Se aislaron fragmentos de DNA apropiados, se marcaron con digoxigenina-dUTP y se utilizaron como sondas. La marcación, la hibridación, los procedimientos de lavado y la detección se realizaron con ayuda de un sistema de marcación y detección disponible comercialmente (Boehringer Mannheim, Alemania).

Para la transformación, las células se incubaron a 37ºC y 200 rpm durante 2,5-3 h en medio LB (tubos de 5 ml). A una densidad óptica (620 nm) de aprox. 0,4, las células se redujeron a un sedimento por centrifugación y se recogieron en una décima parte de su volumen de TSS (medio LB que contiene 10% (p/v) de PEG8000, 5% (v/v) de DMSO y MgCl_{2} 50 mM). Después de una incubación de 30 minutos a 4ºC con 0,1 a 100 ng de DNA, e incubación subsiguiente a 37ºC durante 1 h, las células se extendieron en placas sobre medio LB que contenía un antibiótico apropiado.

Ejemplo 1 Preparación de pZY557tal, pBM20tal y pZY557tkttal como prototipos de estructuras génicas basadas en plásmidos de acuerdo con la invención, y de pZY557tkt

El plásmido pZY507 (Weisser et al. 1995 J. Bacteriol 177:3351-3345) se abrió utilizando las enzimas de restricción BamHI y HindIII y se aisló el fragmento mayor (10,1 kB de DNA). Una parte del sitio de clonación múltiple se escindió del vector pUCBM20 (Boehringer Mannheim, Alemania) utilizando BamHI y HindIII y se ligó al fragmento grande pZY507BamHI/HindIII, dando como resultado el vector pZY557, que es similar al vector pZY507 aparte de los otros sitios de escisión por restricción. Se amplificó el gen talB a partir del vector pGSJ451 (Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930-36) por medio de PCR. Para esto, se hizo uso del oligonucleótido I: 5' CCGCATGCTGTTTAAAGAGAAATA 3' (los pares de bases que se han subrayado aquí corresponden a los pares de bases 84 a 101 de la secuencia talB de Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995)5930-6), que se proporcionó con un sitio de restricción para la enzima de restricción SphI, y del iniciador de secuenciación disponible comercialmente M13/pUC (No. 1010093, Boehringer Mannheim, Alemania) como oligonucleótido II. El fragmento de DNA amplificado resultante contiene un sitio de escisión para SphI en cada extremo y se escindió con la enzima de restricción SphI. Este fragmento se ligó luego a los vectores pZY557 y pUCBM20, respectivamente, vectores que habían sido también linealizados con SphI. Los plásmidos recombinantes pZY557tal y pBM20tal, respectivamente, se obtuvieron después de transformar E. coli con las dos soluciones de ligación y clonación de los transformantes. El gen tktA se amplificó por PCR a partir del vector pGSJ427 (Sprenger G.A. et al., Eur. J. Biochem. 230 (1995) 525-32) insertando un sitio de escisión para la enzima de restricción NotI en el extremo 5' e insertando un sitio de escisión para la enzima SphI en el extremo 3'. En este caso se hizo uso de los oligonucleótidos III: 5' TTAGCGGCCGCCCTTCATCATCCGATCT 3' (los pares de bases que se han subrayado en este caso corresponden a los pares de bases 126 a 146 de la secuencia tktA de Sprenger G.A. et al., Biochem. Biophys. Acta. 1216 (1993) 307-10), que se proporcionó con un sitio de escisión para la enzima de restricción NotI, y IV: 5' ATAGCATGCTAATTACAGCAGTTC 3' (los pares de bases que se han subrayado en este caso corresponden a los pares de bases 2018 a 2036 de la secuencia tktA de Sprenger G.A. Biochem. Biophys. Acta. 1216 (1993) 307-10), que se proporcionó con un sitio de escisión para SphI. El fragmento PCR resultante se escindió con NotI y SphI y se ligó al vector pZY557tkt, que había sido tratado del mismo modo, dando como resultado el vector pZY557tkt. pZY557tkt se abrió luego con SphI y se ligó al fragmento PCR escindido con SphI que contenía talB. Después de la transformación de E. coli y clonación de los transformantes (véase arriba), se obtuvieron plásmidos que contenían el gen tktA y el gen talB orientado en la misma dirección aguas abajo del promotor tac y que se utilizaron subsiguientemente como la estructura génica pZY557tkttal.

Los transformantes resultantes se guardaron a -80ºC en medio LB en la forma de cultivos de glicerol (30%). Cuando fueron necesarios, los cultivos de glicerol se descongelaron inmediatamente antes de su utilización.

Ejemplo 2 Efecto de la actividad incrementada de una transaldolasa sobre el crecimiento de cepas en las cuales está incrementada también la actividad de transcetolasa

Se investigó el crecimiento de las cepas de E. coli AT2471, AT2471/pZY557tkt, AT2471/pZT557tal y AT2471/
pZY557tkttal en glucosa en medio mineral. Éste estaba constituido por citrato de Na\cdot3H_{2}O (1,0 g\cdotl^{-1}), MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,3 g\cdotl^{-1}), KH_{2}PO_{4} (3,0 g\cdotl^{-1}), K_{2}HPO_{4} (12,0 g\cdotl^{-1}), NaCl (0,1 g\cdotl^{-1}), (NH_{4})_{2}SO_{4} (5,0 g\cdotl^{-1}), CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (15,0 mg\cdotl^{-1}). FeSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,75 g\cdotl^{-1}) y L-tirosina (0,04 g\cdotl^{-1}). Se añadieron minerales adicionales en la forma de una solución de elementos traza (1 ml\cdotl^{-1}), que estaba compuesta de Al_{2}(SO_{4})_{3}\cdot18H_{2}O (2,0 g\cdotl^{-1}), CoSO_{4}\cdot6H_{2}O (0,7 g\cdotl^{-1}), CuSO_{4}\cdot5H_{2}O (2,5 g\cdotl^{-1}), H_{3}BO_{3} (0,5 g\cdotl^{-1}), MnCl_{2}\cdot4H_{2}O (20,0 g\cdotl^{-1}), Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O (3,0 g\cdotl^{-1}), NiSO_{4}\cdot3H_{2}O (2,0 g\cdotl^{-1}) y ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O (15,0 g\cdotl^{-1}). Se disolvió vitamina B1 (5,0 mg\cdotl^{-1}) en agua y se añadió, después de haber sido esterilizada por filtración, al medio después que se hubo tratado este último en autoclave, al igual que carbenicilina y/o carbenicilina y cloranfenicol en caso necesario. Se trató en autoclave separadamente glucosa (30 g\cdotl^{-1}) y se añadió asimismo al medio después que este último se hubo tratado en autoclave.

Para los experimentos, se inocularon matraces de sacudidas (1000 ml, que contenían 100 ml de medio mineral) con 2 ml de cultivo de glicerol y se incubaron a 37ºC y 150 rpm durante 72 h en un agitador de sacudidas orbital. Después de alcanzar una densidad óptica (620 nm) de \approx 1, las células se indujeron por adición de 15-100 \mum de IPTG. La densidad óptica del cultivo se midió a intervalos regulares hasta este momento. En las condiciones arriba descritas, el organismo hospedador E. coli AT2471 alcanzó una densidad óptica de 1,2 después de 7,25 h. El aumento en la actividad de la transcetolasa en el mutante AT2471/pZY557tkt condujo a una reducción acusada en la tasa de crecimiento; si bien tenía una densidad óptica idéntica al comienzo del experimento, esta cepa alcanzó sólo una densidad óptica de 0,49 después de 7,25 h. El efecto inhibidor del crecimiento es atribuible probablemente a la síntesis de concentraciones inhibidoras de compuestos intermedios metabólicos del camino pentosa-fosfato.

El aumento en la actividad de la transaldolasa en el mutante AT2471/pZY557tal condujo también a una reducción acusada (casi tan acusada como en el caso de la transcetolasa) en la tasa de crecimiento; se alcanzó una densidad óptica de 0,52 después de 7,25 h. Fue posible alcanzar una densidad óptica de 1,1 después de 7,25 h por aumento de la actividad de transaldolasa además de la de la transcetolasa, como se efectuó en el caso de E. coli AT2471/pZY557tkttal. Este resultado establece claramente que el aumento adicional de la actividad de una transaldolasa en una cepa que tiene una actividad incrementada de transcetolasa cancela los efectos negativos del aumento exclusivo de la actividad de la transcetolasa y permite un crecimiento virtualmente exento de inhibición.

Ejemplo 3 Determinación de las actividades enzimáticas de la transaldolasa

Con objeto de determinar la actividad de la transaldolasa, las células de E. coli AT2471, AT2471/pZY557, AT2471/
pZY557tal y AT2471/pZY557tkttal se cultivaron como se ha descrito arriba, añadiendo sin embargo ácido 3-
(morfolino)propano-sulfónico (MOPS, 16,7 g\cdotl^{-1}) al medio y reduciendo la concentración de fosfato a una décima parte de la concentración que se empleó en los experimentos de crecimiento. Con objeto de comprobar la inducción de las células, se dispusieron mezclas experimentales paralelas, una de cuyas mezclas se indujo por adición de IPTG (20 \muM) después de 7 divisiones celulares (OD \approx 1). Se retiraron 20 ml del caldo de cultivo de todas las mezclas inmediatamente antes de añadir el inductor a los matraces pertinentes y 3 h después del tiempo de inducción, y las células se sedimentaron a 6000 g durante 10 min a 4ºC.

Las células cosechadas se lavaron en tampón de glicilglicina 50 mM, pH 8,5, que contenía ditiotreitol 1 mM, MgCl_{2} 10 mM y tiamina-difosfato 0,5 mM. Las células contenidas en el sedimento se disgregaron por tratamiento ultrasónico (Sonificador Branson 250, provisto de una microboquilla) en un ciclo de tratamiento por ultrasonidos de 25% y a una intensidad de 40 vatios durante 4 min por ml de suspensión de células. Después de centrifugación a 18.000 g durante 30 min a 4ºC, se utilizó el sobrenadante (extracto bruto) para medir la actividad de la transaldolasa.

La actividad de la transaldolasa en el extracto bruto se determinó utilizando un ensayo enzimático que se acopló ópticamente para la formación de NAD. Para esto, el extracto bruto se incubó en un volumen total de 1 ml que contenía fructosa-6-fosfato 0,8 mM, eritrosa-4-fosfato 4 mM y NADH 0,3 mM en tampón (glicilglicina 50 mM, pH 8,5, ditiotreitol 1 mM, MgCl_{2} 10 mM y tiamina-difosfato 0,5 mM). El gliceraldehído-3-fosfato resultante se hizo reaccionar con las enzimas triosafosfato-isomerasa (9 U) y glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (3 U), enzimas que se añadieron también, con la formación de NAD. La oxidación de NADH se observó espectrofotométricamente a 340 nm (\varepsilon = 6,3\cdot10^{3} l\cdotmol^{-1}\cdotcm^{-1}), siendo la conversión de 1 \mumol de NADH equivalente al consumo de 1 \mumol de fructosa-6-fosfato. La reposición de 1 \mumol de NADH por min se definió como 1 U.

La concentración de proteína en los extractos brutos se determinó como ha sido descrito por Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254) utilizando un reactivo colorante disponible comercialmente. Como patrón se utilizó seroalbúmina bovina.

La Tabla 2 muestra los resultados de las medidas enzimáticas cuando se utilizó la cepa hospedadora E. coli AT2471 y sus mutantes que albergan uno de los plásmidos pZY557, pZY557tal o pZY557tkttal. En el momento de la inducción, se encontró que la cepa hospedadora y la cepa portadora del vector pZY557 tenían una actividad de transcetolasa de aproximadamente 0,65 U \cdot (mg de proteína)^{-1}. Como se demuestra para E. coli AT2471/pZY557, este valor aumentó en 3 horas, como resultado del crecimiento fisiológico, a 0,8 U \cdot (mg de proteína)^{-1}. Debido a la ausencia del gen tal en el vector empleado, no era de esperar que la inducción que se realizó en este experimento tuviera efecto
alguno.

En mezclas experimentales paralelas, se encontró que E. coli AT2471/pZY557tal tenía actividades de transcetolasa de 0,53 y 0,61 U \cdot (mg de proteína)^{-1}, respectivamente, en el momento de la inducción. Mientras que el valor de la actividad de transaldolasa aumentaba en 3 h a sólo 0,6 U \cdot (mg de proteína)^{-1} cuando no se indujo el cultivo, la actividad de transaldolasa aumentaba hasta un valor de 1,06 U \cdot (mg de proteína)^{-1} como resultado de la inducción. En otras mezclas experimentales, se utilizó E. coli AT2471/pZY557tkttal en lo que eran por lo demás experimentos idénticos; en este caso, la actividad de transaldolasa había aumentado en las 3 primeras horas después de la inducción de las células desde 0,8 a 1,16 U \cdot (mg de proteína)^{-1}, lo que correspondía a una duplicación de la actividad en comparación con los experimentos correspondiente que utilizaron la cepa hospedadora.

Ejemplo 4 Producción de sustancias utilizando cepas que exhiben una actividad incrementada de transcetolasa además de la actividad incrementada de transaldolasa

El medio que se empleó para los experimentos de crecimiento se utilizó para determinar la eficiencia de la síntesis. Los cultivos de E. coli AT2471 y AT2471/pZY557tkttal se indujeron a una densidad óptica de 1 y el período de cultivo se prolongó hasta 72 h. Después de 24 y 48 h, se midió el pH de los cultivos y se llevó de nuevo al valor inicial de 7,2, en caso requerido, por adición de KOH (45%). Adicionalmente, se tomaron muestras (2 ml) después de 24, 48 y 72 h para determinar la densidad óptica así como las concentraciones de glucosa y L-fenilalanina.

La concentración de fenilalanina se determinó por medio de cromatografía líquida de alta presión (HPLC, Hewlett Packard, Munich, Alemania) en combinación con detección de fluorescencia (extinción 335 nm, emisión 570 nm). Se utilizó como fase sólida una columna Nucleosil-120-8-C18 (250 \times 4,6 mm); la columna se eluyó utilizando un gradiente (eluyente A: 90% ácido fosfórico 50 mM, 10% metanol, pH 2,5; eluyente B: 20% ácido fosfórico 50 mM, 80% metanol, pH 2,5; gradiente: 0-8 min 100% A, 8-13 min 0% A, 13-19 min 100% A). La tasa de elución se ajustó a 1,0 ml\cdotmin^{-1}; la temperatura de la columna se ajustó a 40ºC. Se llevó a cabo la derivatización después de la columna utilizando dialdehído o-ftálico en un capilar de reacción (14 m \times 0,35 mm) a la temperatura ambiente. Se encontró que la L-fenilalanina tenía un tiempo de retención de 6,7 min en las condiciones descritas.

La medida de la concentración de glucosa con tiras de ensayo enzimático (Diabur, Boehringer Mannheim, Alemania) y, dependiendo de los resultados, la adición subsiguiente de 2 ml de una solución concentrada de glucosa (500 g\cdotl^{-1}) aseguró que no se presentaba limitación de glucosa en las mezclas experimentales. Después de un tiempo de incubación de 48 h, se alcanzó un valor índice (fenilalanina) de 119 después de inducir la cepa hospedadora E. coli AT2471; esto se compara con un valor de fenilalanina de 100 para la cepa hospedadora no inducida. La simple introducción del plásmido pZY557tkttal de la cepa hospedadora daba como resultado el incremento de este valor índice, que describe la concentración de fenilalanina, hasta 167 incluso sin inducción de las células. Como demuestran los experimentos, la inducción de la cepa E. coli AT2471/pZY557tkttal daba como resultado un aumento ulterior hasta un valor de 204. Esto correspondía a un aumento de 71% en comparación con la cepa hospedadora
inducida.

Este resultado demuestra el efecto positivo de acuerdo con la invención, efecto que incrementa la síntesis de compuestos aromáticos, del aumento adicional de la actividad de una transcetolasa en cepas que tienen ya una actividad de transaldolasa incrementada, o del aumento adicional de la actividad de la transaldolasa en cepas que tienen ya una actividad incrementada de transcetolasa.

Ejemplo 5 Producción de sustancias utilizando cepas que tienen una actividad incrementada de transaldolasa

El mutante E. coli AT2471/pZY557tal se cultivó en un experimento que era por lo demás idéntico al descrito en el Ejemplo 4. Después de 48 h, la inducción de la cepa dio como resultado un valor índice (fenilalanina) de 131, que se compara con un valor de fenilalanina de 100 para la cepa no inducida.

Este resultado demuestra claramente el efecto positivo que ejerce el aumento de la actividad de una transaldolasa sobre la síntesis de sustancias aromáticas, particularmente después de inducción de acuerdo con la invención.

Ejemplo 6 Producción de sustancias utilizando mutantes de PTS en los cuales se está expresando un sistema de absorción de azúcares independiente de PEP además de existir en ellos una actividad incrementada de transaldolasa, incrementándose la actividad de transaldolasa después de la introducción del sistema de absorción de azúcares independiente de PEP

Se obtuvo el gen glf, como ha sido descrito por Weisser P. et al. (J. Bacteriol. 177 (1995) 3351-54) utilizando PCR (Mullis K.B. et al., Meth. Enzymol. 155 (1987) 335-50). La secuencia de nucleótidos completa de este gen está disponible (Barnell W.O. et al., J. Bacteriol. 172 (1990) 7227-40). El Gen glf se amplificó utilizando el plásmido pZY600 como molde (Weisser P. et al., J. Bacteriol 177 (1995) 3351-4).

Para propósito de integración del gen glf en genes que codifican componentes del sistema PTS de E. coli, el plásmido pPTS1 (véase la Tabla 1) se digirió con BglII y se trató con fragmento Klenow. El sitio de escisión único está localizado en el gen ptsI. Se aisló el gen glf, como un fragmento BamHI-KpnI, a partir del plásmido pBM20glfglk y se trató análogamente con fragmento Klenow. Se obtuvieron clones que llevaban el glf en la misma orientación que los genes ptsHI por ligación de extremos romos. Un fragmento PstI de 4,6 kb que llevaba la región 3' del gen ptsH y PtsI que contenía glf y crr integrados se obtuvo a partir del plásmido resultante pPTSglf. Este fragmento se ligó al sitio de escisión EcoRV del vector pGP704. Dado que este vector está disponible únicamente para replicación en cepas \lambdapir, el vector se ha integrado en el cromosoma por transformantes que no albergan este fago si estos transformantes son capaces de crecer en carbenicilina. La integración se comprobó por análisis mediante transferencia Southern (Miller V.L. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2575-83). Los transformantes resultantes contenían los genes PTS completos además del gen glf.

El resto vector puede recombinarse en un segundo cruzamiento homólogo, dando como resultado la pérdida de la resistencia a la carbenicilina. Dado que, en este caso, los genes pts están interrumpidos por la inserción del gen glf, el PTS no se expresa de manera funcional en estos mutantes. Los mutantes de PTS deseados se seleccionaron como sigue: después de subcultivar los transformantes, que eran todavía PTS^{+}, varias veces en medio LB sin antibióticos, partes alícuotas de la suspensión de células se extendieron en placas LB que contenían 100 \mug\cdotl^{-1} de fosfomicina. Los mutantes PTS^{-} son capaces de crecer en estas placas. Los clones de crecimiento se aplicaron en bandas sobre placas LB que contenían fosfomicina o 20 \mug\cdotl^{-1} de carbenicilina. Se aisló DNA cromosómico a partir de los clones que exhibían todavía crecimiento en las placas de fosfomicina pero que no eran capaces de crecer en las placas de carbenicilina. La integración del gen glf en los genes que codifican el sistema PTS se confirmó por análisis Southern. Los mutantes correspondientes se identificaron como fenotípicamente deficientes en PTS. Se seleccionó un clon como el organismo hospedador E. coli AT2471glfintPTS^{-} y se utilizó para las transformaciones (véase arriba) con el plásmido pZY557tal. Siguiendo las condiciones experimentales descritas para los Ejemplos 4 y 5, el mutante PTS-negativo E. coli AT2471glfintPTS^{-}/pZY557tal, y la cepa hospedadora correspondiente AT2471glfintPTS^{-}, se cultivaron en cada caso en dos mezclas paralelas y las células de una mezcla se indujeron en cada caso después de aprox. 7
divisiones.

La inducción reducía la eficiencia de síntesis de la cepa hospedadora, que tenía inicialmente un valor índice de 100 sin inducción, hasta un valor de 56. Por comparación, la inducción aumentaba el valor índice de fenilalanina desde 73 a 103, y por consiguiente por encima del valor inicial para la cepa hospedadora, en cultivos de la cepa transformada AT2471glfintPTS^{-}/pZY557tal.

Este resultado demuestra que el aumento simple de la actividad de transaldolasa tiene un efecto positivo sobre la síntesis de fenilalanina incluso en aquellos microorganismos en los cuales la actividad del sistema PTS está reducida, o este sistema está completamente eliminado, y en el cual se ha integrado al mismo tiempo un sistema de absorción de azúcares independiente de PEP.

Ejemplo 7 Producción de sustancias utilizando mutantes PTS^{-} en los cuales además de una actividad incrementada de transaldolasa se ha expresado un sistema de absorción de azúcares independiente de PEP, incrementándose la actividad de transaldolasa antes de la introducción del sistema de absorción de azúcares independiente de PEP

Se obtuvo E. coli AT2471/pZY557tal como se describe en el Ejemplo 1. Subsiguientemente, se integró en esta cepa un gen glf en los genes que codifican los componentes del sistema PTS de E. coli. Esta integración se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 6. Utilizando las condiciones experimentales descritas en los Ejemplos 4 y 5, se cultivaron estos mutantes de E. coli AT2471glfintPTS^{-}/pZY557tal PTS-negativos. Se encontró que la eficiencia biosintética de los mutantes derivados correspondía a la de las cepas descritas en el Ejemplo 6.

Ejemplo 8 Producción de sustancias en un vaso de fermentación utilizando cepas que tienen una actividad incrementada de transaldolasa y cepas que tienen una actividad incrementada de transcetolasa además de su actividad incrementada de transaldolasa

Los mutantes E. coli AT2471, E. coli AT2471/pZY557tal y E. coli AT2471/pZY557tkttal en un vaso de fermentación (volumen del reactor 15 l). A este fin, se utilizaron para precultivo dos matraces de sacudidas (2000 ml) con el medio mineral descrito en el Ejemplo 2 (250 ml). En este proceso, la concentración de glucosa se redujo a 5,0 g\cdotl^{-1}. Los matraces se inocularon con 2 ml de cultivo de glicerol y se incubaron en un agitador de sacudidas orbital a 37ºC y 150 rpm hasta que se alcanzó una densidad óptica (600 nm) de 3.

Los precultivos se utilizaron para inocular 4,5 l de medio de producción. Éste contenía MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,3 g\cdotl^{-1}), KH_{2}PO_{4} (3,0 g\cdotl^{-1}), NaCl 0,1 (g\cdotl^{-1}), (NH_{4})_{2}SO_{4} (5,0 g\cdotl^{-1}), CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (15,0 mg\cdotl^{-1}), FeSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,75 g\cdotl^{-1}) y L-tirosina (0,24 g\cdotl^{-1}). Se añadieron minerales adicionales en la forma de una solución de elementos traza (1,5 ml\cdot l^{-1}), que estaba compuesta de Al_{2}(SO_{4})_{3}\cdot18H_{2}O (2,0 g\cdotl^{-1}), CoSO_{4}\cdot6H_{2}O (0,7 g\cdotl^{-1}), CuSO_{4}\cdot5H_{2}O (2,5 g\cdotl^{-1}), H_{3}BO_{3} (0,5 g\cdotl^{-1}), MnCl_{2}\cdot4H_{2}O (20,0 g\cdotl^{-1}), Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O (3,0 g\cdotl^{-1}), NiSO_{4}\cdot3H_{2}O (2,0 g\cdotl^{-1}) y ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O (15,0 g\cdotl^{-1}). Se disolvió vitamina B1 (75,0 mg\cdotl^{-1}) en agua y se añadió, después de haber sido esterilizada por filtración, al medio después que se hubo tratado este último en autoclave. Se trató glucosa (15 g\cdotl^{-1}) separadamente en autoclave y se añadió análogamente al medio después que se hubo tratado este último en autoclave. Por adición de NH_{4}OH (25%), se controló el valor del pH en el medio a 7, controlándose la presión parcial de oxígeno a un valor de 20% mediante la velocidad del agitador, el volumen de aire alimentado y la presión en el interior del vaso de fermentación. Por adición de una solución de glucosa (700 g\cdotl^{-1}) la concentración de glucosa en el medio de cultivo se mantuvo en valores de aproximadamente 5 g\cdotl^{-1}. Dependiendo del tiempo de fermentación, se añadió L-tirosina a la solución de fermentación en concentraciones variables a fin de evitar la limitación de L-tirosina.

En los experimentos en que se efectuó la inducción de las células, esto se hizo de acuerdo con la invención después de 6 horas por adición de 50 \muM de IPTG. Después de un tiempo de incubación de 36 horas, se alcanzó un valor índice (fenilalanina) de 120 por introducción simple del plásmido pZY557tal; esto se compara con un valor (fenilalanina) de 100 para la cepa hospedadora no inducida E. coli AT2471. Por medio de inducción de acuerdo con la invención, este valor pudo elevarse ulteriormente hasta 153. Por introducción del plásmido pZY557tkttal solo y aumentando así la actividad de transcetolasa además de la actividad de transaldolasa, pudo alcanzarse un valor índice (fenilalanina) de 130 comparado con la cepa hospedadora. Los experimentos demostraron adicionalmente que la inducción de la cepa de E. coli AT2471/pZY557kttal permitía un aumento ulterior en el valor índice (fenilalanina) a 250. Esto corresponde a un aumento de 92% comparado con la cepa no inducida.

Este resultado demuestra que incluso en experimentos realizados en vasos de fermentación puede conseguirse un aumento en la síntesis de compuestos aromáticos de acuerdo con la invención por aumento de la actividad de transaldolasa así como por aumento de la actividad de transcetolasa en cepas que tienen ya una actividad incrementada de transaldolasa.

TABLA 1

Cepas y plásmidos	Genotipo/características	Fuente de referencia
E. coli AT2471	tyrA4, relA1, spoT1, thi-1	Taylor y Trotter, Bacteroil. Rev. 13 (1967)
		332-53
E. coli SY327	araD, \Delta(lac-pro), Rif^{r}, recA56, fago \lambda	Miller et al, J. Bacteriol. 170 (1988) 2675-83
	función pir
E. coli CC118	\Delta(ara-leu), araD, \DeltalacX74, galE, galk,	Manoil et al., Proc. Natl. Sci. USA 82 (1985)
	phoA20, thi-Acad, rpsE, rpoB, argE	8129-33
	(Am), recA1, lisógeno \lambda pir
pZY507	Cm^{r}	Weisser et al., J. Bacteriol 177 (1995) 3351-4
pZY507 glfglk	genes glf y glk de Z. mobilis en p-ZY607	Weisser., J. Bacteriol 177 (1995) 3351-4
pZY557	pZY507, sitio de donación múltiple de	Sprenger, no publicado
	PU Cbm20, Cm^{r}
pZY557tkttal	genes tktA y talB de E coli en pZY557	Esta solicitud de patente

TABLA 1 (continuación)

Cepas y plásmidos	Genotipo/características	Fuente de referencia
pACYC184	Cm^{r}, Tet^{r}	Chang y Cohen, J. Bactetiol 134 (1978)
		1141-1156
pDIA3206	Ap^{r} inserción de 11,5 kb del cromosoma	DeReuse et al., J. Becteriol. 170 3827-37 (1988)
	de E. coli K12 que incluye los genes
	ptsHI-crr
pPTS1	pACYC184 que contiene un fragmento	Jahreis, universidad de Osnabruck.
	ClaI de 4 kb que contiene los genes	no publicado
	ptsHI y crr de pDIA3206: Cm^{r}
pGP704	Amp^{r}	Milter et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2576-83

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TABLA 2

Microorganismo	Tiempo después de la	Actividad de transaldolasa/U\cdot(mg de proteína)^{-1}
	inducción/h
		Sin inducción	Con inducción
E. coli AT2471/	0		0,64
E. coli AT2471/pZY557	0		0,65
	3		0,80
E. coli AT2471/pZY557tal	0	0,53	0,61
	3	0,06	1,06
E. coli AT2471/pZY557tkttal	0	0,70	0,80
	3	0,45	0,16

Claims (37)

1. Proceso para la preparación microbiana en un micro-organismo de sustancias del metabolismo aromático, siendo las sustancias productos secundarios de compuestos intermedios del camino pentosa-fosfato, que comprende los pasos de

(i)

aumentar la actividad de un transaldolasa en el micro-organismo productor de dichas sustancias, y

(ii)

producir una de dichas sustancias en dicho micro-organismo,

con la condición de que dicho micro-organismo no es uno que, antes del aumento de dicha actividad de una transaldolasa, se haya seleccionado como una cepa con un sistema de fosfotransferasa eliminado (cepa pts^{-}) procedente de cepas que albergaban previamente un sistema de fosfotransferasa (cepas pts^{+}).

2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se preparan sustancias del metabolismo aromático en cuya síntesis está implicado al menos un compuesto intermedio del camino pensosa-fosfato.

3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto intermedio es eritrosa-4-fosfato (Ery4P).

4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque la transaldolasa es una transaldolasa de Escherichia coli.

5. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la transaldolasa es transaldolasa B (TalB) de Escherichia coli.

6. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en el paso (1) se incrementa adicionalmente la actividad de una transcetolasa en el micro-organismo productor de dichas sustancias.

7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la transcetolasa es una transcetolasa de Escherichia coli.

8. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque la transcetolasa es transcetolasa A (TktA) de Escherichia coli.

9. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en el paso (i) la actividad de un sistema de absorción de azúcares dependiente de PEP, en caso de estar presente, se reduce o se elimina, y caracterizado además porque, adicionalmente, la actividad de una proteína de transporte para la absorción independiente de PEP de un azúcar se incrementa en el micro-organismo productor de dichas sustancias.

10. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en el paso (i) la actividad de un sistema de absorción de azúcares dependiente de PEP, en caso de estar presente, se reduce o se elimina, y caracterizado además porque, adicionalmente, la actividad de una quinasa que fosforila un azúcar que es absorbido en una forma no fosforilada en el micro-organismo se incrementa en el micro-organismo productor de dichas
sustancias.

11. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en el paso (i) la actividad de un sistema de absorción de azúcares dependiente de PEP, en caso de estar presente, se reduce o se elimina, y caracterizado además porque, adicionalmente, la actividad de una proteína de transporte para la absorción independiente de PEP de un azúcar y la actividad de una quinasa que fosforila dicho azúcar se incrementa en el micro-organismo productor de dichas sustancias.

12. Proceso de acuerdo con la reivindicación 9 ó 11, caracterizado porque la proteína transportadora es un facilitador.

13. Proceso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque el facilitador es la proteína facilitadora de glucosa (Glf) de Zymomonas mobilis.

14. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 11, caracterizado porque la quinasa es una quinasa fosforilante de hexosas.

15. Proceso de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque la quinasa se deriva de Zymomonas mobilis.

16. Proceso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la quinasa es glucoquinasa (Glk) de Zymomonas mobilis.

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17. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque en el paso (i) la actividad de al menos uno de los siguientes componentes, a saber transaldolasa, transcetolasa, proteína de transporte y quinasa, se incrementa en el micro-organismo productor de dichas sustancias:

a)

por introducción de los genes,

b)

y/o por aumento del número de copias de gen,

c)

y/o por aumento de la expresión génica,

d)

y/o por aumento de la actividad endógena de dichas enzimas,

e)

y/o por alteración de la estructura de las enzimas,

f)

y/o por utilización de enzimas desreguladas,

g)

y/o por inserción de genes que codifican enzimas desreguladas.

18. Proceso de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque el aumento en la actividad se consigue por integración del gen o los genes en una estructura génica o en varias estructuras génicas, introduciéndose el gen o los genes en la estructura génica como una sola o más copias o en número de copias incrementado.

19. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque se emplea un micro-organismo en el cual una o más enzimas, que están implicadas adicionalmente en la síntesis de las sustancias, están desreguladas y/o exhiben actividad incrementada.

20. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la sustancia que se prepara es un aminoácido aromático.

21. Proceso de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque el aminoácido aromático es L-fenilalanina.

22. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el micro-organismo empleado pertenece a los géneros Escherichia, Serratia, Bacillus, Corynebacterium o Brevibacterium.

23. Proceso de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque el micro-organismo es Escherichia coli.

24. Estructura génica que contiene, en forma recombinante,

a)

un gen que codifica una transaldolasa o un gen que codifica una transcetolasa, y

b)

al menos un gen que codifica una proteína de transporte para la absorción independiente de PEP de un azúcar o que codifica una quinasa fosforilante de hexosas.

25. Estructura génica de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizada porque el gen para la proteína de transporte codifica un facilitador y el gen para la quinasa codifica una quinasa fosforilante de hexosas.

26. Estructura génica de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, caracterizada porque los genes para la transaldolasa y la transcetolasa se derivan de Escherichia coli y los genes para la proteína de transporte y la quinasa se derivan de Zymomonas mobilis.

27. Estructura génica de acuerdo con las reivindicaciones 24 a 26, caracterizada porque el gen para la transaldolasa de Escherichia coli es talB y el gen para la transcetolasa de Escherichia coli es tktA, y el gen para la proteína de transporte de Zymomonas mobilis es glf y el gen para la quinasa de Zymomonas mobilis es glk.

28. Estructura génica de acuerdo con una de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizada porque la estructura génica contiene al menos una secuencia génica reguladora que está asignada a uno de los genes.

29. Estructura génica de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizada porque al menos uno de los genes en la estructura génica está incorporado de tal modo que el mismo se encuentra bajo el control de un promotor inducible.

30. Célula transformada, que alberga, en forma replicable, una estructura génica de acuerdo con las reivindicaciones 24 a 29.

31. Célula transformada de acuerdo con la reivindicación 30, caracterizada porque, en la célula, una o más enzimas que están implicadas adicionalmente en la síntesis de las sustancias del metabolismo aromático, que son productos secundarios de compuestos intermedios del camino pentosa-fosfato, están desreguladas y/o exhiben actividad incrementada.

32. Célula transformada de acuerdo con la reivindicación 30 ó 31, caracterizada porque la célula es una célula de Escherichia coli.

33. Célula transformada de acuerdo con las reivindicaciones 30 a 32, caracterizada porque la actividad del sistema de absorción de azúcares dependiente de PEP, si está presente este sistema, está reducida o eliminada.

34. Célula transformada de acuerdo con una de las reivindicaciones 30 a 33, caracterizada porque la misma es capaz de producir un aminoácido aromático.

35. Célula transformada de acuerdo con la reivindicación 34, caracterizada porque el aminoácido aromático es L-fenilalanina.

36. Proceso para la preparación microbiana de sustancias del metabolismo aromático, siendo dichas sustancias productos secundarios de compuestos intermedios del camino pentosa-fosfato, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque se cultivan células transformadas de acuerdo con una de las reivindicaciones 30 a 35, en las cuales existe una estructura génica de acuerdo con la reivindicación 29, en el cual durante el cultivo, se efectúa una inducción lo antes posible después de 2 divisiones celulares, de tal modo que se obtienen células transformadas que contienen compuestos intermedios del camino pentosa-fosfato en disponibilidad incrementada.

37. Proceso de acuerdo con la reivindicación 36, caracterizado porque la célula transformada, además de contener compuestos intermedios del camino pentosa-fosfato en disponibilidad incrementada, contiene también otros metabolitos del metabolismo central en disponibilidad incrementada.