JP2001340096A - グリシンの微生物学的な製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物を用いグリシノニトリルからグリシン
を生産するにあたり、菌体当たり、かつ単位時間当たり
活性が高く、培地や菌体を多量に廃棄せず、反応液のｐ
Ｈを調整するための緩衝液を用いず、グリシンとアンモ
ニアが定量的に、かつ容易に回収する方法を提供する。 【解決手段】 ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、
グリシノニトリルの水溶液にシュードモナス属に属する
微生物を作用させるグリシンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グリシンの微生物
学的製造方法に関する。さらに詳しくは、ホルムアルデ
ヒド、青酸、およびアンモニアの反応で得られるグリシ
ノニトリルをシュードモナス属に属する微生物の作用に
よる加水分解反応に付し、ｐＨを調整するための酸、ア
ルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、または
該反応条件と閉鎖系の反応条件下もしくは生成するアン
モニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で選択
的にグリシンを回収することを特徴とするグリシンの微
生物学的製造方法に関する。得られるグリシンは食品添
加物、洗浄剤、医農薬合成原料として有用である。本発
明の製造法は、有用なグリシンを効率よく工業的に製造
するため利用することができる。

【０００２】

【従来の技術】グリシンは、従来、ホルムアルデヒド、
青酸、およびアンモニアからシュトレッカー法にて一旦
グリシノニトリルを合成し、これを苛性ソーダ等のアル
カリで加水分解しグリシンソーダとアンモニアに変換し
た後、硫酸等の酸で中和し製造されている。この時、ア
ンモニアはアルカリで加水分解される際、蒸発して回収
され、グリシンは酸で中和後、晶析法で回収される（特
開昭４３−２９９２９号、特開昭５１−１９７１９号、
特開昭４９−１４４２０号、特開昭４９−３５３２９
号）。このように従来法は、アルカリや酸を多量に用い
る欠点に加え、中和工程で塩類が多量に副成されるため
廃棄物が多く、環境負荷が大きい欠点があった。さら
に、中和副成する塩類はグリシンに溶解度が酷似してい
るため、グリシンを精製回収するためには、晶析操作を
複数回繰り返したり母液を循環する等の煩雑な操作が必
要であった（特開昭５１−３４１１３号）。

【０００３】一方、グリシノニトリルを酵素的に加水分
解しグリシンを得る方法も知られている。特公昭５８−
１５１２０号明細書には、ブレビバクテリウムＲ３１２
株を苛性カリ等でｐＨ８に調整した反応液に懸濁し加水
分解反応に用いる方法が、また、特開平３−６２３９１
号明細書には、コリネバクテリウムＮ−７７４株をリン
酸緩衝液でｐＨ７．７に調整した反応液に懸濁し反応に
用いる方法が開示されている。しかし、これらの方法
は、実施例によるとグリシンを得るためには、グリシン
重量の１倍から１０倍に相当する多量の菌体を用いる必
要があり、さらに、反応液のｐＨを調整するため緩衝液
が用いられる問題があった。すなわち、多量の菌体を用
いるため培地や菌体を多量に浪費する欠点があり、ま
た、ｐＨ調整剤として緩衝液を用いるため緩衝液消費や
廃棄が避けられない欠点があった。さらに、緩衝液はア
ンモニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨
げる問題もある。

【０００４】ロドコッカス属、アルスロバクター属、カ
セオバクター属、シュードモナス属、エンテロバクター
属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、コリネバ
クテリウム属、またはストレプトマイセス属の微生物を
用いる特開平３−２８０８８９号明細書においては、菌
体使用量は生成グリシン重量の約２０分の１に改良され
ているが、反応時間が約４０時間と長い欠点がある、さ
らに、緩衝液を反応に用いる問題は解決されていない。

【０００５】このように、従来の微生物を用いたグリシ
ノニトリルからグリシンを生産する方法は、乾燥菌体当
たり、かつ単位時間当たりの活性が低いため、菌体や培
地を多量に消費し廃棄する欠点があった。さらに、反応
液のｐＨを調整するために緩衝液や酸またはアルカリを
消費し、シュトレッカー法と同様に、それらの廃棄が避
けられない欠点を持っていた。また、従来の微生物を用
いた方法では、アンモニアを回収する工夫は開示されて
いないが、緩衝液や酸を用いると、緩衝液や酸がアンモ
ニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨げる
問題に加え、酸またはアルカリを使用すると、シュトレ
ッカー法と同様に、グリシンの回収を妨げることが予想
される。このように、従来の微生物を用いる方法も、工
業的に実施できるものではなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ホルムアル
デヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られるグ
リシノニトリルから、微生物を用いてグリシンを生産す
るにあたり、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活
性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐ
Ｈを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や
廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成
し、これらの分解および消費を伴わず、グリシンとアン
モニアを別々に回収するグリシンの製造法を提供するこ
とを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、このような
工業的諸問題を解決するため、菌体当たり、かつ単位時
間当たり高い活性を持ち、反応系で生成したグリシンや
アンモニアを分解または消費せず、グリシンとアンモニ
アを別々に、定量的に、かつ容易に回収できる反応系を
構築すべく、適した微生物の探索と反応方法の検討を鋭
意行った。驚くべきことに、ｐＨを調整するための酸、
アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件下で反応
が進行し、単位時間当たり高い活性を持つ微生物を見い
だすことがでた。さらに、こうした高活性菌体の中に、
閉鎖系の反応条件下、あるいは減圧反応蒸留や不活性ガ
スを流通しながら生成するアンモニアを反応と同時に分
離する条件下で好ましく働く微生物を見いだすことがで
き、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明によれば、ｐＨを調整す
るための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応
条件下、または該反応条件と閉鎖的反応条件下もしくは
減圧反応蒸留や不活性ガスを流通しながら生成するアン
モニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で、ホ
ルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得
られるグリシノニトリルの水溶液にシュードモナス属に
属する微生物を作用させることで、乾燥菌体当たり、か
つ単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄
を伴わず、反応液のｐＨを調整するための酸、アルカリ
または緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモ
ニアが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わ
なず、グリシンとアンモニアを別々に回収するグリシン
の製造法が提供される。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明について、以下具体的に説
明する。本発明に使用できる微生物として、シュードモ
ナス（Pseudomonas ）属に属する微生物が適しているこ
とが新たに発見された。本発明に適した微生物として具
体的には、シュードモナスｓｐ．８８−ＳＢ−ＣＮ５株
の微生物が使用できる。シュードモナスｓｐ．８８−Ｓ
Ｂ−ＣＮ５株は土壌中よりニトリル資化菌として分離し
たもので、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
（微工研菌寄手続き中）受託番号を付与されており、微
生物学的性質は以下に示すとおりである。

【００１０】

【表１】

【００１１】

【表２】 分離株８８−ＳＢ−ＣＮ５株は極毛による運動生を示す
グラム陰性桿菌で、カタラーゼおよびオキシダーゼ共に
陽性を呈することから、シュードモナス属の菌体に分類
した。菌株の同定に際しては、バージェイズ・マニュア
ル・オブ・システマティク・バクテリオロジー（Bergy'
s Manual of Determinative Bacteriolog）第２巻（１
９８６）およびザ・プロカリオート（The Prokaryote
s）第２版（１９９２）に従って分類した。

【００１２】本発明に使用される微生物の培養には、通
常用いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリ
ン、有機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、
窒素源としてはアンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩お
よび有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペ
プトン、肉エキス等が用いられる。また、培地にはリン
酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバ
ルト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加され
る。培養はｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２
０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で好気的に行われ
る。本発明の微生物の培養において、上記の培地に酵素
誘導剤を加えてもよい、例えば、ラクタム化合物（γ−
ラクタム、δ−ラクタム、ε−カプロラクタム等）、ニ
トリル化合物、アミド化合物等を用いてもよい。

【００１３】本発明の微生物は、そのまま工業使用でき
るが、適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしくは
遺伝子工学的手法により改良された変異株、例えば、酵
素を構成的に生産する変異株を育成し用いることもでき
る。本発明の菌体とは、培養液から採取した菌体または
菌体処理物（菌体の破砕物、菌体破砕物より分離した酵
素、および菌体または菌体から分離抽出された酵素を固
定化した処理物）である。培養液からの菌体の採取は、
公知の方法で行うことができる。本発明において用いる
グリシノニトリルは、公知の方法で合成することができ
る。例えば、ホルムアルデヒドと青酸およびアンモニア
から得る方法、あるいはホルムアルデヒドと青酸を反応
させ一旦グリコロニトリルを合成し、継いでアンモニア
を作用させて得る方法で合成される。どちらも、シュト
レッカー法として総称されている。

【００１４】本発明においては、上述の方法で分離した
菌体および菌体処理物は、ｐＨを調整しない反応条件下
でグリシノニトリル水溶液に懸濁しすることで、速やか
に加水分解反応が進行し、生成するアンモニアを反応と
同時に分離することにより、グリシンを製造することが
できる。すなわち、通常、前記微生物菌体または菌体処
理物を、例えば、０．０１〜５重量％およびグリシノニ
トリルを１〜３０重量％含むｐＨを調整しない水性懸濁
液をオートクレーブ等の閉鎖的反応容器、または生成す
るアンモニアを反応分離する装置が付属した反応容器に
仕込み、温度として例えば０〜６０℃の条件、好ましく
は１０〜５０℃の条件を用いて、反応時間を例えば１〜
２４時間、好ましくは３〜８時間反応させればよい。こ
の場合、グリシノニトリルを薄い濃度で仕込み経時的に
追加添加したり、反応温度を経時的に変化させてもよ
い。

【００１５】本発明においては、反応生成するアンモニ
アは密閉型反応容器中に一旦蓄積するか、反応と同時に
反応分離することができる。反応分離方法は、反応蒸留
法や不活性ガスの流通法で実施することができる。反応
蒸留を行う場合、加水分解反応容器に、アンモニアと同
伴する水を冷却回収する冷却器の付いた単管搭、棚段
搭、または充填塔を備え、反応水溶液の沸騰圧以下、例
えば、６０℃で２０．０ｋＰａ以下から０℃で０．６ｋ
Ｐａ以下の減圧条件下で、連続的にまたは間欠的に減圧
反応蒸留することが好ましい。さらに好ましくは１２．
６ｋＰａから１．３ｋＰａの圧力条件下で、減圧反応蒸
留することができる。不活性ガスを流通する場合、不活
性ガスの吹き込みノズルと、アンモニアや同伴する水を
不活性ガスから回収する冷却トラップとを備え、微加圧
から減圧条件下で連続的にまたは間欠的に、アンモニア
を不活性ガスに同伴し反応液から分離することができ
る。さらに、アンモニア分離を促進するため減圧反応蒸
留を不活性ガス流通条件下で行うこともできる。

【００１６】かくして、グリシノニトリルは、ほぼ１０
０％のモル収率で加水分解し、生成するアンモニアの全
部は密閉型反応容器中に、一旦グリシンのアンモニウム
塩を含むグリシンの高濃度水溶液として生成蓄積させる
ことができる。また、生成するアンモニアの全部または
殆どは、反応と同時に反応蒸留法や不活性ガスの流通法
で反応液から分離し冷却回収される。もし、グリシンア
ミドが残存する場合は、グリシンアミドの加水分解活性
を持つ菌体もしくは酵素を追添加することにより、完全
にグリシンおよびアンモニアに転換することも可能であ
る。グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度
水溶液からのグリシンの回収は、例えば、反応液から菌
体を遠心濾過、膜分離等によって除いた後、グリシンは
晶析法、イオン交換法または貧性溶媒による分別沈澱法
にて回収できる。また、アンモニアは一部の水と一緒に
蒸発後、蒸留や抽出によって回収することができる。本
発明を実施例に基づいて説明する。

【００１７】

【実施例１】（１）グリシノニトリルの合成 ホルマリンに等量の青酸を作用させて、一旦生成したグ
リコロニトリル水溶液に、過剰量のアンモニア水溶液を
添加し３０重量％グリシノニトリル水溶液を得た。 （２）菌体の培養 シュードモナスｓｐ．８８−ＳＢ−ＣＮ５株を、下記の
条件で培養した。 (1) 培地 フマル酸 １．０重量％ 肉エキス １．０ ペプトン １．０ 食塩 ０．１ ε−カプロラクタム ０．３ リン酸第一カリウム ０．２ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ 塩化アンモニウム ０．１ 硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３ 塩化マンガン・４水塩 ０．００２ 塩化コバルト・６水塩 ０．００２ ｐＨ ７．５ (2) 培養条件 ３０℃／１日

【００１８】（３）グリシノニトリルの加水分解 菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸
留水等で洗浄したものを反応に用いた。密閉した１００
ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として７３ｍ
ｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを
１７ｍｌの蒸留水で調合し、２０℃にて反応を開始し
た。反応開始２時間後、ｐＨは１０になっていた。この
反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノ
ニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成してい
た。

【００１９】そこで、２時間毎に反応温度を５℃昇温
し、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを
追加添加して反応液を液体クロマトグラフィー法で分析
した。この操作を４回切り返し、合計１０時間反応を行
った。得られた３２ｇの反応液のうち２ｇを用い、生成
したアンモニアはネスラー法により定量し、原料のグリ
シノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフ
ィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシ
ンとアンモニアが定量的に生成していた。乾燥菌体当た
りのグリシンの生成量は８３ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グ
リシンの生成活性は８ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの３
０ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１
０に濃縮し、４．９ｇのグリシンを晶析回収した。一
方、冷却回収した蒸発水溶液中のアンモニアは１．２５
ｇであった。

【００２０】

【実施例２】実施例１で合成した３０重量％グリシノニ
トリル水溶液を用い、反応方式を代えて実施した。同様
に、菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌
し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の
付いた１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラ
ブルフラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズ
ル、ドライアイストラップに接続したミストセパレータ
ー、温度計、およびサンプリング管を備えた。このセパ
ラブルフラスコに乾燥菌体量として１．０４ｇを仕込
み、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌ
と蒸留水１７０ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少
量の窒素ガスを１時間当たり３リットルフィードしなが
ら、３０℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、こ
の反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシ
ノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成してい
た。

【００２１】そこで、基質の３０重量％グリシノニトリ
ル水溶液３０ｍｌを追加添加した。この操作をさらに３
回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイスト
ラップには固体が１５ｇ回収された。固体を５０ｍｌの
水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニ
アが１４ｇ回収されていた。反応液は２９８ｇ回収され
た。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニア
をネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと
生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析
した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的
に生成し、トレース量のアンモニアが残存していた。乾
燥菌体当たりのグリシンの生成量は５８ｇ／ｇ乾燥菌体
であり、グリシンの生成活性は１１ｇ／ｇ・Ｈｒであっ
た。残りの３０１ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、
沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して５６ｇのグリシンを
晶析回収した。

【００２２】

【発明の効果】本発明の製造方法は、ｐＨを調整するた
めの酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件
下、または該反応条件と閉鎖的反応条件下もしくは減圧
反応蒸留や不活性ガスを流通しながら生成するアンモニ
アを反応と同時に系外に分離する反応条件下で、ホルム
アルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られ
るグリシノニトリルの水溶液に、シュードモナス属に属
する微生物を作用させることで、乾燥菌体当たり、かつ
単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄を
伴わず、反応液のｐＨを調整するための酸、アルカリま
たは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニ
アが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わな
ず、グリシンとアンモニアを別々に回収できる効果を有
する。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｐＨを調整するための酸、アルカリまた
   は緩衝液の添加をしない反応条件下で、グリシノニトリ
   ルの水溶液にシュードモナス属に属する微生物を作用さ
   せることを特徴とするグリシンの製造法。
2. 【請求項２】 反応条件がｐＨを調整するための酸、ア
   ルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、かつ閉
   鎖的反応条件であることを特徴とする請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】 反応条件がｐＨを調整するための酸、ア
   ルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、かつ反
   応液中に生成するアンモニアを反応液から分離する反応
   条件であることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 アンモニアを反応液から分離する方法が
   反応蒸留であることを特徴とする請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 反応蒸留を減圧下で行うことを特徴とす
   る請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 反応蒸留を不活性ガスの存在下で行うこ
   とを特徴とする請求項４または５記載の方法。
7. 【請求項７】 シュードモナス属に属する微生物がシュ
   ードモナスｓｐ．８８−ＳＢ−ＣＮ５株（微工研菌寄手
   続き中）であることを特徴とする請求項１ないし６のい
   ずれかに記載の方法。