JP2000511540A

JP2000511540A - 鎮痛剤としての新規アナンダミドアミダーゼインヒビター

Info

Publication number: JP2000511540A
Application number: JP09543074A
Authority: JP
Inventors: マクリヤニス，アレクサンドロス; リン，ソニアン; ヒル，ウィリアム，アダム
Original assignee: ユニバーシティーオブコネティカット
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2000-09-05
Also published as: EP1021406B1; EP1775286A1; US5688825A; US6579900B2; US20020091153A1; WO1997045407A1; DE69737039D1; CA2255620C; US5874459A; US6391909B1; CA2255620A1; EP1021406A1; ES2278391T3; AU3229097A; DE69737039T2

Abstract

(57)【要約】個体または動物におけるアナンダミドアミダーゼの阻害方法およびアナンダミドアミダーゼの新規なインヒビターが開示される。開示された方法および新規な化合物を用いて、痛みを患っている個体または動物の痛みを低減し、癌の化学療法等の化学療法を受けている個体の吐き気を低減させ、個体の食欲を抑制し、緑内障を患っている個体または動物の眼の眼内圧を低下させ、並びに器官の移植を受けた個体の免疫系を抑制することができる。

Description

【発明の詳細な説明】鎮痛剤としての新規アナンダミドアミダーゼインヒビター発明の背景 Δ⁹−テトラヒドロカンナビノール、即ち、精神活性のマリファナ由来のカンナビノイドは、脳のＣＢ１レセプターおよび脾臓のＣＢ２レセプターに結合する。ＣＢ１レセプターを刺激する化合物は、無痛覚と鎮静を誘導すること、気分の高揚を引き起こすこと、吐き気と食欲を制御することおよび眼内圧を低下させることが示されている（Mechoulam、治療剤としてのカンナビノイド、CRC Press、 Boca Raton,.FL（1986）、FrideとMechoulam、Eur．J．Pharmacol．231:313(199 3)、Crawleyら、Pharmacol．Biochem．Behav．46:967（1993）およびSmithら、J ．Pharm．Exp．Therap．270:219(1994)）。また、カンナビノイドは、免疫系を抑制することが示されている（Mechoulam、治療剤としてのカンナビノイド、CRC Press、Boca Raton、FL（1986）。したがって、ＣＢ１レセプターまたはＣＢ２レセプターを直接または間接的に刺激する化合物は、緑内障の治療、器官を移植した患者における組織拒絶の予防、化学療法を受けている患者の吐き気の制御、痛みの制御ならびにエイズ消耗性症候群(AIDS Wasting Syndrome)の個体での食欲の増進および痛みの制御において潜在的に有用である。アラキドニルエタノールアミド（アナンダミド）は、ＣＢ１アゴニストおよびＣＢ２アゴニストとして作用する天然の脳成分であり、マウスにおいてカンナビノイドに匹敵する薬理作用を発揮する（FrideとMechoulam、(1993)、Crawleyら、（1993）およびSmithら、(1994)）。アナンダミドは、アナンダミドアミダーゼによりイン・ビボで切断される。したがって、アナンダミドアミダーゼのインヒビターは、アナンダミドのイン・ビボのレベルを増加させることにより、ＣＢ１レセプターおよびＣＢ２レセプターを間接的に刺激するという効果を有する。ＣＢ１レセプターおよびＣＢ２レセプターでの作用に加えて、カンナビノイドは、細胞膜にも影響し、それにより、嗜眠状態、モノアミンオキシダーゼ機能障害および非レセプター介在の脳機能障害等の望ましくない副作用を生ずる。また、カンナビノイドの麻薬常用癖特性と向精神性特性は、その治療価値を制限する。アナンダミドアミダーゼのインヒビターは、カンナビノイドにより生ずるような望ましくない膜関連副作用を有さないことが期待される。ＣＢ１レセプターおよびＣＢ２レセプターを刺激する代替機構を提供することにより、アナンダミドのインヒビターは、カンナビノイドの麻薬常用癖特性と向精神性特性を有さないであろう。しかしながら、アナンダミドアミダーゼの現インヒビターは、不利な点を有する。例えば、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）は細胞にとって毒である。したがって、細胞に対して毒性の低下した、阻害的な濃度でＣＢ１レセプターとＣＢ２レセプターと有意に相互作用しない、新規かつより強力なアナンダミドアミダーゼのインヒビターに対する要求が存在する。発明の要約酵素活性部位で求核基に不可逆的に結合可能な末端基を有する長鎖脂肪酸および長鎖脂肪酸の芳香族酸のアナログがアナンダミドアミダーゼの強力なインヒビターであることが現在わかっている。例えば、パルミチルスルホニルフルオリドは、インタクトな神経芽細胞腫の細胞において、１０ｎＭで未分解アナンダミドのレベルを５５倍増加させ（実施例１）、よって、アナンダミドアミダーゼの阻害ではフェニルメチルスルホニルフルオリドよりも１００倍強力であることがわかった。同時に、本明細書に開示されたインヒビターは、ＣＢ１レセプターに対して低いアフィニティーを示す（実施例３）。例えば、ＣＢ１レセプターに対するパルミチルスルホニルフルオリドの結合アフィニティーは、アナンダミドよりも約１０倍低い。さらに、パルミチルスルホニルフルオリドは、ラットにおいて、Δ⁹−テトラヒドロカンナビノールのようなＣＢ１レセプターを直接刺激する化合物と同じ薬理効果を生ずることがわかっている。例えば、パルミチルスルホニルフルオリドは、本明細書ではラットにおいて無痛覚を誘導することが示される（実施例４）。これらの結果に基づき、個体または動物において、アナンダミドアミダーゼを阻害し、それによりＣＢ１レセプターとＣＢ２レセプターを刺激する方法が開示される。また、アナンダミドアミダーゼを阻害する新規な化合物も開示される。本発明は、個体または動物におけるアナンダミドアミダーゼの阻害方法である。本方法は、構造式Ｉ：Ｒ−Ｘ−Ｙ（Ｉ）で表される化合物およびその生理学的に許容されうる塩の治療上有効な量を個体または動物に投与する工程を含む。Ｒは、メチル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、複素環基および置換複素環基からなる群より選ばれる。Ｘは、Ｒがアリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、複素環基または置換複素環基の場合、約４〜約１８個の炭素原子を含む直鎖ヒドロカルビル基または置換直鎖ヒドロカルビル基である。Ｘは、Ｒがメチル基の場合、約１０〜約２４個の炭素原子を含む直鎖ヒドロカルビル基または置換直鎖ヒドロカルビル基である。Ｙは、アミダーゼ酵素の活性部位で求核基と不可逆的に結合が可能な部分である。本明細書で開示された方法と新規な化合物は、治療上の用途を有する。例えば、本発明の化合物と方法は、カンナビノイドのように、癌に起因する痛みや癌の化学療法から生ずる吐き気を和らげることができる。当該方法と化合物は、カンナビノイドに関連する望ましくない膜関連副作用を有さないと予想される。また、本明細書に開示された方法と化合物は、免疫抑制的であると予想されるので、器官の移植を受けた個体における器官の拒絶を予防するために使用することができる。本発明の化合物と方法は、個体の食欲を増進するので、食欲喪失の結果として栄養失調に罹っていることが多いエイズ消耗性症候群の患者を治療するために使用することができる。また、本明細書で開示されたアナンダミドアミダーゼの新規なインヒビターは、研究上の用途を有する。例えば、細胞でのアナンダミドの効果を研究するためにイン・ビトロでアナンダミドのレベルを維持したり、個体および動物でのアナンダミドの効果を研究するためにイン・ビボでアナンダミドのレベルを維持するために使用することができる。当該インヒビターは、例えば、細胞の型がカンナビメティック活性かアミダーゼ活性を有するかどうかを決定すること等、細胞のキャラクタライゼーションに使用することができる。例えば、当該インヒビターは、細胞をインヒビターと接触させ、次いで、アナンダミドの濃度の上昇があるかどうかを決定することにより、細胞集団がアナンダミドアミダーゼを発現するかどうかを決定するために使用することができる。また、本明細書で開示されたアナンダミドインヒビターは、例えば、他の化合物がアナンダミドアミダーゼを阻害したりアナンダミドアミダーゼインヒビターの構造活性の要求を決定する能力を試験するアッセイに対照として、薬物の設計に補助として使用することもできる。図面の簡単な説明図１は、神経芽細胞腫細胞（Ｎ１８ＴＧ２）でのアナンダミドレベルにおけるパルミチルスルホニルフルオリドとフェニルメチルスルホニルフルオリドの効果を示すグラフである。図２Ａ〜２Ｅは、（Ａ）ラウリルスルホニルフルオリド；（Ｂ）ミリスチルスルホニルフルオリド；（Ｃ）パルミチルスルホニルフルオリド；（Ｄ）ステアリルスルホニルフルオリド；および（Ｅ）アラキジルスルホニルフルオリドによるアナンダミドアミダーゼの阻害に関するＩＣ₅₀値を示すグラフである。図３は、ＣＢ１に結合する[³Ｈ]ＣＰ−５５９４０との競合における、パルミチルスルホニルフルオリド（Ｋ_iは３５０．４である）、アラキドニルトリフルオロメチル（Ｋ_iは１３２５である）ケトンおよびアラキドニルエタノールアミド（Ｋ_iは７０．０３である）に対する対数用量応答曲線を示すグラフである。図４は、アナンダミド、パルミチルスルホニルフルオリドおよびアナンダミドとパルミチルスルホニルフルオリドの同時投与のラットにおいて、最大可能効果の％により測定した、軽く拘束したマウスが放射加熱刺激から尾を振り払うのにかかった時間（「ラットフリック」テスト）への効果を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明の１つの態様は、個体または動物におけるアナンダミドアミダーゼの阻害方法を規定する。アナンダミドアミダーゼの阻害は、個体または動物におけるアナンダミドのレベルを上昇させる結果となり、それにより、個体または動物のカンナビノイドレセプター、例えば、脳のＣＢ１レセプターおよび脾臓のＣＢ２レセプターの刺激亢進を引き起こす。したがって、本発明は、個体または動物におけるカンナビノイドレセプターの刺激方法でもある。また、本発明は、アナンダミドおよび／またはカンナビノイドのいずれがアゴニストとして作用するかがいまだ発見されていないレセプターを刺激するためにも使用することができるものと解される。構造式Ｉにおける「Ｙ」は、アミダーゼ酵素の活性部位で求核基と不可逆的に結合可能な部分である。したがって、Ｙは、アミダーゼ酵素の活性部位で求核基と安定な共有結合を形成可能である。したがって、Ｙに適する構造は、アミダーゼ酵素の遷移状態のアナログとして作用することが可能であって、当該酵素に可逆的に結合するトリフルオロメチルケトンのような部分を含まない。本明細書で用いる場合、「アミダーゼ」とは、アミド結合の加水分解に関与する酵素である。アミダーゼ酵素の活性部位の求核基とは、酵素活性部位に見出されるアミノ酸の側鎖におけるヘテロ原子含有官能基であり、セリンもしくはスレオニンのヒドロキシル基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基およびリシン、オルニチンもしくはアルギニンのアミノ基またはヒスチジンのイミダゾール基が挙げられる。Ｙに適する構造の例としては：およびが挙げられる。Ｒ１は、−Ｆおよび−Ｏ（Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分枝鎖アルキル基）からなる群より選ばれる。Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分枝鎖アルキル基である。本明細書で用いる場合、「直鎖ヒドロカルビル基」とは、ポリアルキレン、即ち、−（ＣＨ₂）_n−が挙げられる。「ｎ」は、Ｒがメチルの場合約１０〜約２４の正の整数であり、Ｒがアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環または置換複素環の場合約４〜約１８の正の整数である。また、直鎖ヒドロカルビル基は、１以上のエーテル、チオエーテルエーテル、シス− アルケニル、トランス−アルケニルまたはアルキニル結合により連結される、全メチレン炭素原子数が、Ｒがメチルの場合約１０〜約２４個、Ｒがアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環または置換複素環の場合約４〜約１８個であるように、２以上のポリアルキレン基をも含む。例としては、−（ＣＨ₂）_m−Ｏ−（ＣＨ₂）_o−、−（ＣＨ₂）_m−Ｓ−（ＣＨ₂）_o−、 −（ＣＨ₂）_m−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ₂）_o−、−（ＣＨ₂）_m−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ₂）_o −、（式中、ｍおよびｏは、ｍとｏの和がｎに等しくなるような、それぞれ正の整数である）が挙げられる。具体例としては、Ｘが−（ＣＨ₂）₄−（シス−ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂−）₄−ＣＨ₂ ＣＨ₂−、−（ＣＨ₂）₄−（シス−ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂）₃ −（ＣＨ₂）₅−である場合、およびＲ−Ｘ−がドコサテトラエニルまたはホモ −γ−リノレニル部分である場合が挙げられる。本発明の１つの側面において、投与されてアナンダミドアミダーゼを阻害する化合物におけるＲはメチルであり、Ｙは、スルホニルフルオリドまたは分枝鎖スルホニルエステルのＣ１〜Ｃ４の直鎖である。Ｙは、スルホニルフルオリドであることが好ましい。スルホニルフルオリドまたはスルホニルエステルの具体例としては、Ｒ−Ｘ−がアルキジル、Δ⁸，Δ¹¹，Δ¹⁴−エイコサトリエニル、ドコサテトラエニル、ホモ−γ−リノレニルおよびＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n-（式中、ｎは１０（ラウリル）、１１、１２（ミリスチル）、１３、１４（パルミチル）、１５または１６（ステアリル）である）である場合が挙げられる。本明細書で使用する場合、「アリール」基とは、フェニル、１−ナフチルまたは２−ナフチルのような炭素環の芳香環系である。「ヘテロアリール」基は、窒素、酸素または硫黄のような１以上のヘテロ原子を含む芳香環系である。ヘテロアリール基の例としては、２−フラニル、３−フラニル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジニル、３−ピリジニル、４−ピリジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル、５ −ピラゾリル、２−ピラジニル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、１−ピロリル、２−ピロリル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリルおよび５−チアゾリルが挙げられる。また、「ヘテロアリール」基は、１以上のモノ環状アリールまたはモノ環状ヘテロアリール基が他のヘテロアリール基と融合している融合多環系をも含む。例としては、２−ベンゾチエニル、３−ベンゾチエニル、２−ベンゾフラニル、３−ベンゾフラニル、２−インドリル、２−キノリニルおよび３−キノリニルが挙げられる。本明細書で使用する場合、「複素環」基とは、酸素、窒素または硫黄のような１以上のヘテロ原子を含むＣ５〜Ｃ８の非芳香環系である。例としては、２−テトラヒドロフラニル、３−テトラヒドロフラニル、２−テトラヒドロチオフェニル、３−テトラヒドロチオフェニル、２−モルホリノ、３−モルホリノ、４−モルホリノ、２−チオモルホリノ、３−チオモルホリノ、４−チオモルホリノ、１ −ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、１−ピペラジニル、２ −ピペラジニル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４ −ピペリジニルおよび４−チアゾリジニルが挙げられる。直鎖ヒドロカルビル基上の好ましい置換基としては、メチル、エチル、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、チオール、メトキシ、エトキシおよびヒドロキシが挙げられる。アリール、ヘテロアリールまたは複素環基上の好ましい置換基としては、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、（低級アルキル）−Ｏ−、（アリールまたは置換アリール）−Ｏ−、ハロ、−ＣＯ−Ｏ（低級アルキル）、−ＣＨＯ、−ＣＯ−（低級アルキル）、−ＣＯ−ＮＨ（低級アルキル）、−ＣＯ−Ｎ（低級アルキル）₂、−ＮＯ₂、−ＣＦ₃、−ＣＮおよび（低級アルキル）−Ｓ− が挙げられる。低級アルキル基は、Ｃ１〜約Ｃ５の直鎖または分枝鎖のアルキル基である。また、本発明は、アナンナミドアミダーゼを阻害するために用いられうる新規な化合物にも関する。１つの態様において、当該化合物は、構造式(II)：により表される構造およびその生理学的に許容されうる塩を有する。Ｒ１は、− Ｆまたは（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）Ｏ−である。ＲおよびＸは、構造式（Ｉ）に関して前記定義した通りである。別の態様において、本発明の新規な化合物は、構造式(III)：により表される構造およびその生理学的に許容されうる塩を有する。Ｒ’は、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、複素環基および置換複素環基からなる群より選ばれる。Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分枝鎖アルキル基である。ｐは、約６〜約１８の整数である。別の側面において、ｐは、約１０〜約１８の整数である。本明細書で用いられる場合、化合物の「治療上有効な量」とは、個体または動物に投与されると、個体または動物において充分高いレベルのアナンダミドを生じ、カンナビノイドレセプターにより影響または制御される細胞活性において認識されうる増加または減少を引き起こす化合物の量である。例えば、アナンダミドは、フォルスコリン刺激されたアデニレートシクラーゼの阻害に導くレセプター介在のシグナル伝達を刺激することができる(Vogelら、J．Neurochem．61:352 (1993)。また、アナンダミドは、ｃＡＭＰ代謝とは別個に、百日咳毒素感受性Ｇ蛋白質経路を介するＮ型カルシウム流の部分的な阻害をも引き起こす(Mackieら、Mol．Pharmacol．47:711(1993))。また、アナンダミドインヒビターの「治療上有効な量」は、個体または動物において充分高いレベルのアナンダミドを生じ、カンナビノイドレセプターの刺激から生ずる生理学的効果を引き起こす量であってもよい。カンナビノイドレセプター刺激から生ずる生理学的効果には、無痛覚、化学療法から生ずる吐き気の減少、鎮静および食欲増加が含まれる。他の生理学的機能には、緑内障患者における眼内圧の軽減および免疫系の抑制が含まれる。通常、化合物の「治療上有効な量」は、約１０ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の範囲である。本明細書で用いる場合、「個体」とはヒトをいう。「動物」とは、イヌ、ネコ、ウマ等の脊椎動物およびウシ、ブタ、モルモット等の飼育動物をいう。本発明の化合物は、経口、直腸または非経口ルート（例えば、筋肉内、静脈内、皮下、鼻腔または局所）を含む公知の種々の方法により投与することができる。化合物が投与される剤形は、投与ルートにより決定される。かかる形としては、カプセルおよび錠剤処方（経口および直腸投与用）、液体処方（経口、静脈内、筋肉内または皮下投与用）および徐放性マイクロキャリア（直腸、筋肉内または静脈内投与用）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、当該処方は、生理学的に許容されうる賦形剤および任意にアジュバント、香料、着色料および防腐剤を含んでもよい。好適な生理学的に許容されうる賦形剤としては、塩水、滅菌水、リンガー液、等張な塩化ナトリウム溶液が挙げられる。活性成分の具体的な用量のレベルは、例えば、個々の製剤の生物学的活性、治療対象の個体の年齢、体重、性別および一般的健康状態を含む多くの因子に依存する。本発明のスルホニルフルオリド、Ｎ−[（アルキル−スルホニル）オキシ]スクシンイミドおよびＮ−Ｏ−ジアシルヒドロキシルアミンの一般的な調製方法は、それぞれ実施例５、実施例６および実施例７に提供される。本発明を下記実施例によりさらに詳細に説明する。実施例実施例１パルミチルスルホニルフルオリドの存在下における神経芽細胞腫細胞中の増加した[³Ｈ]アナンダミドレベルインタクトな神経芽細胞腫細胞におけるアナンダミドアミダーゼのアッセイは、既報により行なった（Deutsch，D．G.とS．A．Chin，Biochem．Pharmacol．46 ：791-796(1993)）。実験は、６ｃｍディッシュ当たり４ｘ１０⁶個の神経芽細胞腫細胞（Ｎ１８ＴＧ２）で行なった。実験対象の細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを含有し、１０％子ウシ血清（HyClone、ローガン、UT）を補足し、示された濃度のインヒビターを補足したＨａｍｓのＦ−１２／Ｄｕｌｂｅｃｃｏの変法Ｅａｇｌｅの培地（Life Technologies社）からなる２ｍｌの培地中で、２０分間インキュベートした。すべての細胞を、空気中に５％のＣＯ₂を含む湿気のある雰囲気下で、３７℃で生育させた。[³Ｈ]アナンダミド（２２１Ｃｉ／ｍｍｏｌの[³Ｈ]アナンダミドを０．２μＣｉ）を添加し、１時間インキュベーションを続けた。対照細胞は、インヒビターを含まなかった。インキュベーションの終了時に、当該細胞を、細胞培養培地で１回洗浄し、３７℃での０．５３ｍＭのＥＤＴＡ中０．０５％のトリプシン溶液２ｍｌでの短時間のインキュベーション後に、当該プレートから除去した。細胞と培地中の [³ Ｈ]アナンダミド、[³Ｈ]リン脂質および[³Ｈ]アラキドネートの量を、クロロホルムメタノール（１：１）での反応のクエンチング、有機相からの試料の抽出、および酢酸エチル：ヘキサン：酢酸：水（１００：５０：２０：１００）混合物の有機相からなる溶媒系でのチャンネルシリカゲル被覆プレートでのＴＬＣ分析後、当該プレートの適当な領域から掻き取ったシリカの液体シンチレーション計数により定量した。パルミチルスルホニルフルオリドでインキュベートした神経芽細胞腫細胞、フェニルメチルスルホニルフルオリドでインキュベートした神経芽細胞腫細胞および対照細胞において見出される[³Ｈ]アナンダミドのレベルを図１に示す。ナノモラー量のパルミチルスルホニルフルオリドは、アラキドネートのようなアナンダミドの分解産物よりも、アナンダミドに５０％を超える放射能が見出される程十分であった。この結果は、パルミチルスルホニルフルオリドがアナンダミドアミダーゼの阻害で高度に有効であることを示す。１０マイクロモラーを超える濃度のフェニルメチルスルホニルフルオリドが、アナンダミドアミダーゼの阻害の同等なレベルを達成するのに必要であった。対照細胞においては、ほとんど完全な[³Ｈ]アナンダミドの分解が観察された。実施例２アナンダミドアミダーゼのスルホニルフルオリドインヒビターに対するＩＣ₅₀値の決定アナンダミドアミダーゼのイン・ビトロのアッセイは、既報により行なった（ Deutsch，D．G．とS．A．Chin，Biochem．Pharmacol．46:791-796(1993)）。各化合物の示された量を、リン酸緩衝塩水中の３００μｇの粗ラット脳ホモジネート蛋白質、５００μｇ／ｍｌの脂肪酸不含ウシ血清アルブミンからなる、最終容量１．０ｍｌの緩衝液で、３７℃で１０分間プレインキュベートした。粗ラット脳ホモジネートは、メス成体スプラーグドーリーラットを断頭し、所望の組織を解剖して、５倍量の氷冷したＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）でホモジナイズすることにより得た。次いで、基質(２７．７μＭアナンダミド＋０．２μＣｉの２２１Ｃｉ／ｍｍｏｌ[³Ｈ]アナンダミド( [アラキドニル−５，６，８，９，１１，１２，１４，１５−³Ｈ]エタノールアミド))(National Institute on Drug Abuseから入手)を加え、試料を１０分間インキュベートした。反応をクロロホルム：メタノール（１：１）の添加により停止し、酵素活性を、実施例１に記載のようにＴＬＣにより分析した。ラウリルスルホニルフルオリド、ミリスチルスルホニルフルオリド、パルミチルスルホニルフルオリド、ステアリルスルホニルフルオリド、およびアラキジルスルホニルフルオリドに対する結果を、図２に示す。すべての化合物は、アナンダミドアミダーゼの有効なインヒビターであった。アラキジルスルホニルフルオリドを除くすべての化合物は、１０ｎＭ未満のＩＣ₅₀を有していた。アラキジルスルホニルフルオリドは、１００ｎＭ未満の濃度でアナンダミドアミダーゼの有効なインヒビターであった。実施例３パルミチルスルホニルフルオリドは、ＣＢ１レセプターに対してアナンダミドよりも有効に結合しないＣＢＲ１リガンド結合決定のために、脳膜を、デバン(Devane)らにより刊行された手法に従って凍結したラットの脳から調製した(Devane，W．A.ら、Mol．Pha rmacol．34:605-613(1988)）。脂肪酸アナログのＣＢ１への結合の定量は、Ｒｅｇｉｓｉｌ処理ガラス管中で、５００ｐｍの二環性カンナビノイドアナログ[³Ｈ ]ＣＰ−５５９４０、２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、３ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＴｒｉｓ−ＥＤＴＡおよび０．１３５ｍｇ／ｍｌの脂肪酸不含ウシ血清アルブミンを含む２００μｌの最終容量の緩衝液で、示された濃度のアナログを３０μｇの膜蛋白質とインキュベートすることにより行なった。１００ｎＭのデスアセチルレボナントラドールにより示されうるものとして、特異的結合を定義した。３０℃で６０分後、当該インキュベーションを、２５０μｌの５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを添加し、ＧＦ／Ｂフィルターによりすぐに濾過し、氷冷緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭＭｇＣｌ₂ ）で洗浄することにより終了させた。シンチレーション混合物の添加と液体シンチレーションカウンターでの計数に先立ち、当該フィルターを０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで処理した。ＣＢ１に結合する[³Ｈ]ＣＰ−５５９４０との競合におけるパルミチルスルホニルフルオリド、アラキドノイルトリフルオロメチルケトンおよびアラキドノイルエタノールアミドに対する対数用量応答曲線を、図３に示す。この図は、パルミチルスルホニルフルオリドが、アラキドノイルエタノールアミドの１０％未満の効率でＣＢｌに結合することを示す。実施例４パルミチルスルホニルフルオリドはラットにおいて無痛覚を誘導する薬剤混合物は、Δ⁹−ＴＨＣに関する既報のように、２重量部のＴｗｅｅｎ８０と混合し、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ水溶液（生理食塩水）に分散させることにより調製した(Pertweeら、Br．J．Pharmacol．105:980(1992))。薬剤混合物を、体重２３〜２９グラムのオスのＭＦＩマウスに静脈注射した。無痛覚は、軽く拘束したマウスが放射加熱刺激から尾を振り払うのにかかる時間を記録する「ラットフリックテスト」により測定した。当該方法は、ダムール(D 'Amour)とスミス(Smith)により記載された試験に基づいている(D'Amour，F．E. ，Smith，D．L.，J．Pharmacol．Exp．Ther.，72:74-79(1941))。マウスを、− ３０分（対照潜伏期）および１２分（試験潜伏期）でテイルフリックに供した。この時間内で応答しなかったマウスを装置から除去して組織のダメージを予防したので、最大可能テイルフリック潜伏期は、１０秒であった。無痛覚は、（試験潜伏期間−対照潜伏期間）／（１０−ｓ対照潜伏期間）の割合をパーセントとして表すことにより、パーセント最大可能効果として計算した(Compton，D．R．ら、J．Pharmacol．Exp．Ther.，260:201-209(1992))。周囲の温度は、２０〜２２℃に保持した。値は、平均と標準誤差としての誤差の限界として表した。ダンネット(Dunnett)の検定を用いて、各薬剤処理の平均効果と賦形剤、Ｔｗｅｅｎ８０の平均効果との有意差を計算した。図４に結果を示す。パルミチルスルホニルフルオリド、およびパルミチルスルホニルフルオリドと共投与したアナンダミドは、アナンダミド単独よりもマウスにおける無痛覚の生成に約３倍効果的であり、賦形剤よりも約１３倍効果的であった。実施例５アルキルスルホニルフルオリド乾燥エーテル中のアルキルマグネシウムブロミドを、ヘキサン中のスルフリルクロリドの攪拌した溶液（２倍過剰）に０℃で加えた。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、次いで、氷浴を除去して室温で一晩攪拌を続けた。溶媒を真空下で蒸発させ、生成物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製し、対応するアルキルスルホニルクロリドを白色固体として得た。アルキルスルホニルクロリドをアセトンに溶解し、室温で攪拌しながら１０倍過剰のフッ化アンモニウムを加えた。反応混合物を３時間還流した。次いで、反応混合物を濾過して不溶性の塩を除去し、溶媒を蒸発させて生成物を真空乾燥した。水を加えてあらゆる未反応のアルキルスルホニルクロリドを加水分解し、水性混合物をエーテルで抽出した。エーテルによる抽出物を合わせ、乾燥させ、濾過して溶媒を真空除去した。生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製して、対応するアルキルスルホニルクロリドを得た。実施例６アルキル−Ｎ−[アルキル−スルホニル）オキシ]スクシンイミドアルデヒドのジエチルスクシネートとのストッブ縮合により、触媒により水素添加され、その後加水分解して対応するアルキルコハク酸を生じる対応するアルケニルコハク酸モノエチルエステルを得る。当該酸を過剰の無水酢酸と混合し、１時間還流する。過剰の無水酢酸は、真空除去した。真空蒸留により純粋なアルキル無水コハク酸を得る。純粋な生成物を乾燥トルエンに溶解し、還流させる。トルエン中の等モル量の（ベンジルオキシ）アミンを加え、混合物を３０分間還流する。熱い溶液を無水硫酸ナトリウムを通して濾過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。残留物を酢酸エチルに溶解し、１０％の炭酸水素ナトリウムで２回洗浄し、次いで、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製する。生じた３−アルケニル−Ｎ−（ベンジルオキシ）スクシンイミドを、１０％Ｐｄ−Ｃで３時間水素化分解する。次いで、反応混合物をシーライトパッドを通して濾過し、溶媒を真空除去する。次いで、生成した３−アルキル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを乾燥トルエンに溶解し、乾燥ピリジンと種々のアルキルスルホニルクロリドで処理する。反応は、窒素下で室温で一晩攪拌し、次いで、２ＮＨＣｌの添加で停止する。生成物を酢酸エチルで（２回）抽出し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、カラムクロマトグラフィーで精製する。実施例７Ｎ−Ｏ−ジアシルヒドロキシルアミン種々のカルボン酸のメチルエステルを、メタノール中の過剰量のヒドロキシルアミンで処理する。ＴＨＦに溶解した等モル量のＫＯＨと種々の酸塩化物を、０〜５℃でヒドロキサミン酸の水溶液に添加し、対応するＮ，Ｏ−ジアシルヒドロキシルアミンを得る。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識でき、又は確認することができるだろう。かかる均等物は下記の請求の範囲の範疇に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３ＤＡ６１Ｋ 31/221 31/22 ６０１ 31/40 31/40 Ｃ０７Ｄ 207/46 Ｃ０７Ｄ 207/46 239/22 239/22 (72)発明者ヒル，ウィリアム，アダムアメリカ合衆国コネティカット 06278 アシュフォード，アシュフォードセンターロード，アパートメントビー６

Claims

【特許請求の範囲】１．下記構造式：Ｒ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｒは、メチル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、複素環基および置換複素環基からなる群より選ばれ；Ｘは、Ｒがアリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、複素環基または置換複素環基の場合、約４〜約１８個の炭素原子を含む直鎖ヒドロカルビル基または置換直鎖ヒドロカルビル基であり；Ｘは、Ｒがメチル基の場合、約１０〜約２４個の炭素原子を含む直鎖ヒドロカルビル基または置換直鎖ヒドロカルビル基であり；ならびにＹは、アミダーゼ酵素の活性部位で求核基と不可逆的に結合が可能な部分である）で表される化合物およびその生理学的に許容されうる塩の治療上有効な量を個体または動物に投与する工程を含む、個体または動物におけるアナンダミドアミダーゼの阻害方法。２．Ｙがおよび〔式中、Ｒ１は、−Ｆおよび−Ｏ（Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分枝鎖アルキル基）からなる群より選ばれ；ならびにＲ２は、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分枝鎖アルキル基である〕からなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。３．Ｙが−ＳＯ₂Ｏ（Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分枝鎖アルキル基）である、請求項２記載の方法。４．Ｙが−ＳＯ₂ＯＣＨ₃である、請求項２記載の方法。５．Ｒ−Ｘ−が：である、請求項４記載の方法。６．Ｒ−Ｘ−がＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−（式中、ｎは１０〜約２４の整数である）である、請求項４記載の方法。７．Ｙが−ＳＯ₂Ｆである、請求項２記載の方法。８．Ｒ−Ｘ−が：である、請求項７記載の方法。９．Ｒ−Ｘ−がＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−（式中、ｎは１０〜約２４の整数である）である、請求項７記載の方法。１０．ｎが１４である、請求項９記載の方法。１１．下記構造式：〔式中、Ｒ１は、−Ｆまたは（Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分枝鎖アルキル基）Ｏ− であり；Ｒは、メチル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、複素環基および置換複素環基からなる群より選ばれ；Ｘは、Ｒがアリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、複素環基または置換複素環基の場合、約４〜約１８個の炭素原子を含む直鎖ヒドロカルビル基または置換直鎖ヒドロカルビル基であり；ならびにＸは、Ｒがメチル基の場合、約１０〜約２４個の炭素原子を含む直鎖ヒドロカルビル基または置換直鎖ヒドロカルビル基である〕で表される化合物およびその生理学的に許容されうる塩。１２．Ｒ−Ｘ−がＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−（式中、ｎは１０〜約２４の整数である）である、請求項１１記載の化合物。１３．Ｒ１が−Ｆである、請求項１２記載の化合物。１４．Ｒがアリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、複素環基および置換複素環基からなる群より選ばれ；ならびにＸが−（ＣＨ₂）_n−（式中、ｍは約４〜約１８の整数である）である、請求項１１記載の化合物。１５．Ｒ１が−Ｆである、請求項１４記載の化合物。１６．Ｒ−Ｘ−が下記構造式：により表されるものである、請求項１１記載の化合物。１７．下記構造式：（式中、Ｒ’は、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、複素環基および置換複素環基からなる群より選ばれ；Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分枝鎖アルキル基であり；ならびにｐは、約６〜約２０の整数である）で表される化合物およびその生理学的に許容されうる塩。