JP2000510324A - ペプチドホルモンレセプターリガンドに関するアッセイ法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、候補化合物が、ペプチドホルモンレセプターの非ペプチド作用物質であるか否かを判定するための方法を特徴とする。この方法において、非ペプチド作用物質の固有の活性を増幅する増強能力を有する形状のペプチドホルモンレセプターに、候補化合物を接触させる。候補化合物の存在下で、強化レセプターのセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性を測定して、候補化合物の非存在下で測定された、強化レセプターのセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性とを比較する。セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性の変化により、候補化合物が作用物質であることが示される。セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性の上昇は、この化合物が、完全または不完全な作用物質であることを示しており、セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性の低下は、この化合物が逆作用物質であることを示している。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドホルモンレセプターリガンドに関するアッセイ法およびその使用 発明の背景 本発明は、国立衛生研究所（National Institute of Health）助成金番号#DK4 6767の下、一部、政府の基金によって行われたものであり、そのため、政府は本 発明において一定の権利を有する。 本発明は、ペプチドホルモンレセプターに対する作用物質である化合物を同定 し、使用する方法に関する。 かなりの数の病気やその他有害な作用が、レセプター活性の異常により起きる ため、ペプチドホルモンレセプターは、薬物研究の重要な標的となっている。目 的のペプチドホルモンの一つである、コレシストキニン（CCK）は、二つの別個 のレセプター、CCK-AおよびCCK-B/ガストリンを有するニューロペプチドである （Vanderhaeghenら，Nature，257:604-605，1975;Dockray，Nature，264:568-57 0，1976;Rehfeld,J．Biol．Chem.，253:4022-4030，1978;Hillら，Brain Res.， 526:276-283，1990;Hillら，Neurosci.，10:1070-1081，1990;Woodruffら，Neur opeptides，(Suppl.)19:57-64，1991）。周縁型レセプターのCCK-Aレセプターは 、不連続な脳核の中に存在し、ある種の生物においては、脊椎に存在し、また、 胆嚢収縮および膵臓の酵素分泌に関与する。CCK-B/ガストリンレセプターは、大 脳皮質、小脳、基底核、および脳の扁桃体の中に最も豊富にあり、胃腸管、ECL 細胞、ならびに腎臓細胞の中にも豊富に存在する。CCK-Bレセプター作用物質は 、不安、パニック発作、痛覚脱失、および飽和を調節すると考えられてきた（Ra vardら，Trends Pharmacol．Sci.，11:271-273，1990;Singhら，Proc．Natl．Ac ad．Sci．U.S.A.，88:1130-1133，1991;Farisら，Science，219:310-312，1983; Dourishら，Eur.J．Pharmacol.，176:35-44，1990;Wiertelakら，Science，256: 830-833，1992;Dourishら，Science，245:1509-1511，1989）。 発明の概要 本出願人らは、ペプチドホルモンレセプターに特異的な作用物質、例えば、ペ プチド、ペプトイド、または非ペプチド作用物質などを同定するための組織的な スクリーニング・アッセイ法を開発した。本アッセイ法は、リガンドの固有の活 性を増幅できるペプチドホルモンレセプター、例えば、構成的な活性を有するペ プチドホルモンレセプターが、レセプター特異的な作用物質を同定するためのス クリーニング用媒体として有用であるとの、本出願人らの認識に基づいている。 対応するヒトの野生型におけるシグナル伝達活性の基礎レベルよりも高いシグナ ル伝達活性を有するレセプターは、逆作用物質によって誘導される、シグナル伝 達活性の低下を検出するために一層有用である。いずれの場合にも、レセプター は、リガンドがヒトの野生型レセプターと相互作用して生じるシグナルと同じよ うに、リガンドがそのレセプターと相互作用して生じるシグナルを増幅する。こ のように、レセプターのシグナル伝達を増幅することができる、レセプターの形 状は、対応するヒトの野生型レセプターに対する正の作用物質および逆作用物質 を効率的にスクリーニングする上で有用である。 したがって、本発明は、候補化合物がペプチドホルモンレセプターの作用物質 であるか否かを判定するための方法を特徴とする。本方法において、作用物質の 固有の活性を増幅させる、より大きなまたは増強された能力を有する形状のペプ チドホルモンレセプター（以後、「強化レセプター」という）に、候補化合物を 接触させる。強化レセプターのセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性を、候 補化合物の存在下で測定して、候補化合物が存在しないところで測定した強化レ セプターのセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性と比較する。セカンドメッ センジャーシグナル伝達活性の変化は、候補化合物が作用物質であることを示し ている。例えば、セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性の上昇は、この化合 物が、完全または不完全な正の作用物質のいずれかであることを示しており、セ カンドメッセンジャーシグナル伝達活性の低下は、この化合物が逆（「負の」と もいう）作用物質であることを示している。本方法は、同定された作用物質を、 作用薬として有効な用量で哺乳動物に投与することによって、ペプチドホルモン レセプターに関係する生理学的障害を治療または予防するために作用物質を用い ることをさらに含みうる。 「固有の活性」とは、レセプターを活性化することができる、すなわち、作用 物質として作用することができるリガンドの能力を意味する。「増幅する」とは 、リガンドが強化レセプターと相互作用するときに生じるシグナルが、同じリガ ンドが、例えば、野生型のヒト・レセプターなど、対応する非強化レセプターと 相互作用するときに生じるシグナルよりも、正の作用物質に対しては高く、また は、逆作用物質に対しては低くなることを意味する。本発明の目的にとって、「 非強化レセプター」とは、目的のペプチドホルモンに対する、野生型のヒト・レ セプターのことである。「対応する」とは、例えば、構成的に活性のある変異レ セプターなどのような、別の形状をとる同型のペプチドホルモンレセプターを意 味する。例えば、構成的に活性のある変異CCK-B/ガストリンレセプターに対応す る野生型は、野生型CCK-B/ガストリンレセプターであり、ヒトのCCK-B/ガストリ ンレセプターは、ラットのCCK-B/ガストリンレセプターに対応するヒト型である 。 本明細書において用いられる「作用物質」には、正の作用物質、例えば、完全 もしくは不完全な正の作用物質、または負の作用物質、すなわち逆作用物質が含 まれる。作用物質は、レセプターの活動を開始させるように、レセプターと結合 する化学物質である。ペプチドホルモンレセプターについて、作用物質は、好ま しくはセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性を変化させる。正の作用物質は 、例えば、セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性などの、レセプターの活性 を促進または上昇させる化合物である。「完全な作用物質」とは、レセプターを 、活性の最大レベル、例えば自然の、すなわち内因性のペプチドホルモンによっ て誘導される活性レベルまで活性化できる作用物質を意味する。「不完全な作用 物質」とは、完全な作用物質に比較して、固有の活性が低下した正の作用物質を 意味する。本明細書において用いられる「ペプトイド」とは、ペプチドに由来す る不完全または完全な作用物質である（Horwellら、Eur．J．Med．Chem.，30 Su ppl.:537S-550S，1995;Horwellら、J．Med．Chem.，34:404-14，1991）。 本明細書において用いられる「逆作用物質」は、負の固有の活性を有し、逆作 用物質の非存在下で測定した野生型レセプターのシグナル伝達活性と比べて、レ セプターのシグナル伝達活性を低下させる。これに対して、本明細書において用 いられる「拮抗物質」とは、レセプター活性を上昇させたり低下させたりする、 作用物質の能力を阻害する化学物質を意味する。「完全な」または「完璧な」拮 抗物質には、固有の活性はなく、レセプターの基礎活性に影響を与えない（図１ ）。ペプチド由来の拮抗物質は、本明細書における目的にとって、非ペプチドリ ガンドであると考えられる。 完全な作用物質、不完全な作用物質、逆作用物質、および拮抗物質の間の違い を説明する概略図が図１に示されている（また、Milliganら、TIPS，16:10-13， 1995も参照のこと）。図１において、不活性状態Ｒと活性状態Ｒ^*との間の平衡 は、それぞれのレセプターによってさまざまであり、レセプターリガンドの存在 によっても変化する。作用物質は、Ｒ^*を安定化させることによって機能するが 、逆作用物質は、Ｒを選択的に安定化させる。完全な作用物質（これらが平衡を 右側に最大に動かすため、シーソーの最右端にある）と完全な逆作用物質（シー ソーの最左端にある）との間には、リガンドの連続性が存在すると考えられる。 拮抗物質は、平衡の位置を変えることはないが、支点の位置を規定する。拮抗物 質とは、例えば、競合的または非競合的阻害物質である。 本発明に係るスクリーニングアッセイ法において有用なペプチドホルモンレセ プター特異的なペプチドおよび非ペプチド作用物質の実例を、以下に述べる。非 ペプチドリガンドには、ベンゾジアゼピンおよびその誘導体、例えば、アザビシ クロ[3.2.2]ノナンベンゾジアゼピン（「L-740,093」；Castro Pineiroら，WO 9 4/03437;Castro Pineiroら，米国特許第5,521,175号参照）が含まれるが、これ らに限定されない。L-740,093 SおよびL-740,093 Rは、それぞれ、L-740,093のS -鏡像体およびR-鏡像体を指す。ペプチドホルモンレセプターが、CCK-Aレセプタ ーまたはCCK-B/ガストリンレセプターである場合には、有用なペプチド作用物質 には、ガストリン（例えば、ガストリン-17の硫酸化型（「ガストリンII」）、 もしくは非硫酸化型（「ガストリンI」）、またはガストリン-34の硫酸化型もし くは非硫酸化型）、またはコレシストキニン（CCK）（例えば、硫酸化CCK-8（CC K-8s）、非硫酸化CCK-8（CCK-8d）、CCK-4、またはペンタガストリン）が含まれ るが、これらに限定されない。CCK-B/ガストリンレセプターの完全な作用物質に は、CCK-8s、およびより好ましくは、ガストリン（ガストリンI）が含まれるが 、これらに限定されない。 強化されたレセプターは、必ずしもとはいえないが、それに対応するヒトの野 生型レセプターの基礎活性より高い基礎活性を有する場合がある。対応する野生 型レセプターの活性と比較した、強化レセプターの活性を測定するための方法は 、以下に説明され、実証されている。強化レセプターの実例としては、例えば構 成的に活性のある変異レセプターなどの、合成された変異レセプター；化合物の 固有の活性を増強させる、正常な基礎活性を有するその他の変異レセプター；例 えば、天然の構成的に活性なレセプターなど、増強されたレセプター活性により 疾患の表現型を生じる変異レセプターなどの、天然の変異レセプター；ならびに 、例えば、ラット、マウス、マストミス（mastomys）、ツメガエル、もしくはイ ヌのレセプター、またはその雑種変異体といった、対応する野生型ヒトレセプタ ーよりもはるかに作用物質シグナルを増幅させる、構成的に活性なもしくは野生 型の非ヒトレセプターが含まれる。 本発明に係るスクリーニングアッセイ法において有用なペプチドホルモンレセ プターの、さらに別の実例には、以下のペプチドホルモンに特異的なレセプター が含まれるが、これらに限定はされない：すなわち、アミリン、アンギオテンシ ン、ボンベシン、ブラジキニン、C5aアナフィラトキシン、カルシトニン、カル シトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH） 、ケモカイン、コレシストキニン（CCK）、エンドセリン、エリスロポエチン（E PO）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ホルミルメチオニルペプチド、ガラニン、ガ ストリン、ガストリン放出ペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、糖 蛋白質ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、レプチン、黄体形成ホルモン（ LH）、メラノコルチン、ニューロペプチドＹ、ニューロテンシン、オピオイド、 オキシトシン、副甲状腺ホルモン、セクレチン、ソマトスタチン、タキキニン、 トロンビン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管形成 性腸管ペプチド（VIP）、およびバソプレッシン。強化レセプターは、例えば、 インシュリンレセプターのように、膜通過ドメインを一つ有するペプチドホルモ ンレセプターも、さらに包含しうる。 本発明はまた、例えば、ペプチド、ペプトイドまたは非ペプチドリガンドなど の、リガンド中の作用物質活性を検出するのに適した型のペプチドホルモンレセ プター、例えば、変異型のペプチドホルモンレセプターを単離する方法を特徴と する。本方法には、（a）第一のペプチドホルモンレセプターの機能的ドメイン 領 域を、第二のペプチドホルモンレセプターの、対応する機的能ドメイン領域と交 換する段階、および（b）対応する野生型ヒトレセプターと比較した、第一のペ プチドホルモンレセプターの作用物質シグナルを増幅する能力を測定する段階が 含まれる。機能的ドメインは、細胞内ループ、細胞内ループに隣接した膜通過ド メイン部位、膜通過ドメイン、細胞内ループから離れたところにある膜通過ドメ イン領域、または細胞外ループでもよい。野生型のヒトレセプターによる増幅レ ベルよりも高い、第一のペプチドホルモンレセプターによる増幅レベルは、第一 のペプチドホルモンレセプターが、非ペプチドリガンドにおける作用物質活性を 検出するのに適していることを示している。対応領域は、例えば、5個から10個 のアミノ酸のブロックのように、1個から10個のアミノ酸でもよいし、または30 個までの、もしくは100個までのアミノ酸長でもよい。第一および第二のペプチ ドホルモンレセプターは、好ましくは、異なるセカンドメッセンジャー経路に結 合している。当業者は、ペプチドホルモンレセプターの、それぞれのアミノ酸の どれが、細胞外にあり、細胞内（細胞質）、またはレセプターの膜通過領域にあ ると考えられるのかを知っている。例えば、CCK-B/ガストリンレセプターの、細 胞外、細胞内、および膜通過領域を、他のレセプターとの配列アラインメント（ 図２）、または親水性解析（Baldwin，EMBO J.，12:1693-1703，1993）によって 判定される。コンフォメーションレセプター模型作製については、さらに後述す る。 非ペプチドリガンドにおける作用物質活性を検出するのに適した形状のペプチ ドホルモンレセプターを単離する別の方法には、（a）本来のアミノ酸を別のア ミノ酸、すなわち置換アミノ酸に置き換えて、レセプターの一連の変異型を構築 する段階、および（b）その結果できるペプチドホルモンレセプターの変異型の 、作用物質シグナルを増幅することができる能力を、対応する野生型のヒトレセ プターによる増幅レベルと比較して測定する段階が含まれる。ペプチドホルモン レセプターの変異型における増幅が、対応する野生型のヒトレセプターによる増 幅レベルよりも大きいことは、変異型が、非ペプチドリガンドにおける作用物質 活性を検出するのに適していることを示している。置換されたアミノ酸は、レセ プターの細胞内ドメイン、もしくは、例えば膜通過ドメインの細胞内ドメイン側 にある部分のような、レセプターの細胞内部位に隣接する膜通過ドメイン領域、 また は、例えば、細胞内ドメインの８もしくは10アミノ酸の中に位置することができ る。置換アミノ酸は、各変異構築物における同型でもよいが、または、さまざま な型のアミノ酸をランダムに置換することができる。置換アミノ酸は、もとのア ミノ酸と同じ電荷のものでも、異なる電荷のものでもよい。例えば、陰性のアミ ノ酸を陽性のアミノ酸と置き換えることができ、陽性のアミノ酸を陰性のアミノ 酸と置き換えることもでき、または、陽性もしくは陰性のアミノ酸と、中性のア ミノ酸を置き換えることもできる。好ましくは、置換アミノ酸は、グルタミン、 グルタミン酸、アスパラギン酸、またはセリンである。 さらに、含まれるのは、本明細書において開示されている、さまざまな変異ペ プチドホルモンレセプターと、それらの各々の核酸コード配列である。本発明に 係る変異ペプチドホルモンレセプターには、CCK-AレセプターMHA21/35、ならび に、変異CCK-B/ガストリンレセプターMH40（配列番号：9）、MH128（配列番号： 10）、MH156（配列番号：11）、MH162（配列番号：12）、MH31（配列番号：17） 、MH131（配列番号：18）、MH13（配列番号：20）、MH130（配列番号:21）、MH1 29（配列番号：22）、MH72が含まれるが、これらに限定はされない。プラスミド 操作、保存、および細胞のトランスフェクトは、通常の技術を持つ当業者に既知 の方法により行なうことができる。例えば、Ausubelら（編）、分子生物学にお ける最新プロトコール（Current Protocol in Molecular Biology）、ジョン・ ウイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク、1988、1995を参照のこと。 所定のペプチドホルモンレセプターに特異的な作用物質を同定するための効果 的で迅速なアッセイ法によって、当業者は、さらなる薬学的研究のための先導化 合物として用いるための作用物質を同定することができる。特に、体系的な化学 修飾を行なうことができ、本発明の方法に従い、強化レセプターを用いて、それ らの効果をさらに評価することができる。このような開発法にしたがって、ペプ チドホルモンレセプターに関係する病気に対する治療に役立つように、新しい作 用物質の固有の活性を最適化することができる。 拮抗物質とは反対に、特定のリガンドが、正の作用物質または逆作用物質とし て機能することがわかると、どのリガンド種が、所与の生理学的な効果を実現す る可能性が最も高いか、または望ましくない副作用なしに生理学的な効果を実現 する可能性が最も高いか同定するのが容易になる。このように、本発明は、さら に、ペプチドホルモンレセプターに関係する生理学的障害を治療または予防する ための方法で、例えば、ヒトなどの哺乳動物に、ペプチドホルモンレセプターに 作用物質として作用するリガンドを投与することを含む方法を特徴とする。リガ ンドは、ペプチドホルモンレセプターに作用物質として作用するのに有効な量、 すなわち、完全もしくは不完全な逆作用物質、または、完全もしくは不完全な正 の作用物質としての効果を有する量で投与される。ペプチドホルモンレセプター は、以下のペプチドホルモンのひとつに特異的なレセプターでありうるが、これ に限定する必要はない：アミリン、アンギオテンシン、ボンベシン、ブラジキニ ン、C5aアナフィラトキシン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド （CGRP）、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）、ケモカイン、コレシストキ ニン（CCK）（例えば、CCK-AまたはCCK-B/ガストリンレセプター）、エンドセリ ン、エリスロポエチン（EPO）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ホルミルメチオニル ペプチド、ガラニン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、グルカゴン、グル カゴン様ペプチド１、糖蛋白質ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、インシ ュリン、レプチン、黄体形成ホルモン（LH）、メラノコルチン、ニューロペプチ ドＹ、ニューロテンシン、オピオイド、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、セク レチン、ソマトスタチン、タキキニン、トロンビン、甲状腺刺激ホルモン、甲状 腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管形成性腸管ペプチド(VIP）、およびバソプレ ッシン。 逆作用物質は、例えば、構成的に活性のあるレセプターなどの、ペプチドホル モンレセプターの強化された基礎活性に起因する生理学的障害を治療または予防 する上で特に有用である。例えば、逆作用物質は、例えば、天然のペプチドホル モンレセプターなどの、ペプチドホルモンレセプターの強化活性によって生じ、 または継続もしくは悪化する新生物を治療するために有用である。実例としては 、例えば、神経内分泌腺腫、ゾリンジャー-エリソン（Zollinger-Ellison）症候 群、または胃カルチノイド腫瘍などの、CCK-B/ガストリン関連腫瘍；TSH関連腫 瘍；多発性内分泌腺腫症I型；例えば、小細胞癌などの肺癌；例えば、CCK関連脳 腫瘍などの脳腫瘍；例えば、副腎腫または腎細胞癌などの腎臓癌が含まれるが、 こ れらに限定されない。作用物質は、例えば、ペプチドホルモンレセプターを発現 している組織における腫瘍、例えば、膵臓、下垂体、もしくは副腎の腫瘍など、 原発性腫瘍の治療に、特に有用である。 本発明の別の態様において、LHレセプターの逆作用物質は、性的早熟を治療ま たは予防するのに有用な化合物であるかもしれず、FSHレセプターの逆作用物質 は、不妊症を治療または予防するのに有用な化合物であるかもしれず、TSHレセ プターの逆作用物質は、甲状腺腫を治療または予防するのに有用な化合物である かもしれない。G-LP1レセプターの逆作用物質または正の作用物質は、肥満症、 またはI型もしくはII型糖尿病などの糖尿病を治療または予防するのに有用な化 合物でありうる。 非ペプチド作用物質はさらに、胃腸管に関係した障害、または、例えば、睡眠 、不安、パニック、食欲調節、ストレス、もしくは痛みなどに関する障害、また は、後述する障害を治療または予防する上で有用である。 生理学的障害を治療または予防する本発明の方法において有用な候補化合物は 、例えば、ペプチド、ペプトイド、または非ペプチドリガンドなど、ペプチドホ ルモンレセプターに特異性をもって結合するリガンドであり、好ましくは非ペプ チドリガンドである。候補化合物は、本明細書において開示されているスクリー ニングアッセイ法によって、正のまたは逆の作用物質であることが示される。例 示されている候補化合物には、ペプチド化合物（例えば、Horwellら、Eur．J．M ed．Chem.，30Suppl．:537S-550S，1995;Horwellら、J．Hed．Chem.，34:404-14 ，1991を参照）、CCKのジペプトイド類似体（例えば、Horwellら、J．Med．Chem .，34:404-14，1991を参照）、環状ヌクレオチド、および修飾アミノ酸（例えば 、Dethloffら、Drug Met ab.，24:267-93，1992を参照）、例えば[Bockら、J．M ed．Chem.，33:450-55，1990]に記載されている化合物などの、ベンゾジアゼピ ン誘導体、またはこれらの誘導体が含まれる。ペプチドホルモンレセプター作用 物質活性を有するさらに別のベンゾジアゼピン誘導体が、以下の特許、および特 許出願に記載されており、それらはそれぞれ、参照として本明細書に組み入れら れる：欧州特許出願第167919号、欧州特許出願第284256号、欧州特許出願第4343 60号、欧州特許出願第434364号、欧州特許出願第434369号、欧州特許出願第5141 25号、欧州特許出願第51426号、欧州特許出願第514133号、欧州特許出願第50879 6号、欧州特許出願第508797号、欧州特許出願第508798号、欧州特許出願第50879 9号、欧州特許出願第523845号、欧州特許出願第523846号、欧州特許出願第55917 0号、欧州特許出願第549039号、欧州特許出願第667334号、国際公開公報第92112 46号、国際公開公報第93032078号、国際公開公報第9308175号、国際公開公報第9 307131号、国際公開公報第9317011号、国際公開公報第9319053号、国際公開公報 第9308175号、国際公開公報第9413648号、国際公開公報第9403437号、国際公開 公報第9611689号、および米国特許第5,521,175号。Henkeら、J．Med．Chem.，39 :2655-58,1996;または、Willsonら、J．Med．Chem.，39:3030-34，1996（どちら も、参照として本明細書に組み入れられる）において説明されている化合物で、 逆作用物質であることが示された化合物も含まれる。 さらなる実例として、ペプチドホルモンレセプターに起因する生理学的障害を 治療または予防する方法において有用なベンゾジアゼピン化合物は、下記の化学 式（I）のベンゾジアゼピン化合物である：式中、 R¹は、Hを表し、C_1-6アルキルは、選択的に1個以上のハロ（halo）、C_3-7シク ロアルキル、シクロプロピルメチル、(CH₂)_rイミダゾリル、(CH₂)_rトリアゾリル 、(CH₂)_rテトラゾリル（ここで、rは、1、2または3）、CH₂CO₂R¹¹（ここで、R¹¹ は、C_1-4アルキル）、または、CH₂CONR⁶R⁷（ここで、R⁶とR⁷は、それぞれ独立に 、HまたはC_1-4アルキルを示し、または、R⁶とR⁷は一緒に、pが4または5である、 CH₂p鎖を形成する）で置換され、 R²は、NHR²または(CH₂)_qR¹³（ここでqは、0、1、2、または3である）を表し、 R³は、C_1-6アルキル、ハロ（halo)、またはNR⁶R⁷を表すが、ここで、R⁶および R⁷は、上記の通り定義される、 R⁴およびR⁵は、それぞれ独立に、H、NR⁹R^9'（R⁹およびR^9'は、上記の通り定義 される）、または、アザシクリック基もしくはアザビシクリック基によって選択 的に置換されたC_1-12アルキル、1個以上のC_1-4アルキル基で選択的に置換された C_4-9シクロアルキル、1個以上のC_1-4アルキル基によってシクロアルキル環の中 で選択的に置換されたC_4-9シクロアルキルC_1-4アルキル、選択的に置換されたア リル、選択的に置換されたアリルC_1-6アルキル、またはアザシクリック基もしく はアザビシクリック基を表し、または、R⁴およびR⁵は共に、選択的に置換された アザシクリック基もしくはアザビシクリック基環系の残基を形成し、 Xは、0、1、2、または3であり、 R¹²は、C_1-6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、C_1-4アルコキシ、テトラゾール環 においてC_1-4アルキルで選択的に置換された(CH₂)_q-テトラゾリル、(CH₂)_qイミ ダゾリル、(CH₂)_q-トリアゾリル（ここで、ｑは、0、1、2、または3である）、5 -ヒドロキシ-4-ピロン、NR⁶R⁷、NR⁹COR¹¹、NR⁹CONR^9'R¹¹（ここで、R⁹およびR^9' は、それぞれ独立に、HまたはC_1-4アルキルであり、また、R¹¹は、上記の通り定 義される）、SO(C_1-6アルキル)、SO₂(C_1-6アルキル)、トリフルオロメチル、CON HSO₂R⁸、SO₂NHCOR⁸（ここで、R⁸は、C_1-6アルキルであるが、選択的に、アリル 、2,2-ジフルオロシクロプロパンまたはトリフルオロメチルで置換される）、SO₂ NHR¹⁰（ここで、R¹⁰は、複素環を含む窒素である）、B(OH)₂、(CH₂)_qCO₂H（こ こで、qは、上記の通り定義される）からなる群より選択される、1個以上の置換 基によって選択的に置換されたフェニル基またはピリジル基を表し、または、R^{1 2} は、下記の置換基を表す： 式中、X¹は、CHまたはNを表し、Wは、CH₂またはNR⁹を表すが、ここで、R⁹は、上 記の通り定義され、かつ、W¹は、CH₂を表し、もしくは、W、およびW¹は、それぞ れ0を表し、または、 R¹²は、下記の置換基で置換されたフェニル基を表す： 式中、X²は、0、S、またはNR⁹であるが、R⁹は上記の通り定義され；Zは、結合、 0、またはSであり；ｍは、1、2、または3であり；nは、1、2、または3であり； かつ、yは、0、1、2、または3であり、 R¹³は、下記の置換基を表す：式中、R¹⁴は、HまたはC_1-6アルキルを表し、R¹⁵は、H、C_1-6アルキル、ハロ、ま たはNR⁶R⁷を表すが、ここでR⁶とR⁷は、上記の通り定義され、かつ、点線は、選 択的な共有結合を表し、また、NR⁴R⁵が、置換されていないアザシクリック環系 を表す場合、R²は、R¹²が、選択的に置換されたフェニルまたは下記の構造式で ある、NHR¹²ではないという条件で、薬学的に許容される塩またはそのプロドラ ッグ： 化学式（I）の化合物は、光学異性体およびその混合物を含む、すべての考え られるラセミ体および異性体を含むものである。各発現は、いずれの構造物にお いても、一回以上出現するが、同じ構造において明確な他の部位とは無関係であ るものとする。本発明は、上記の化学式（I）の化合物のプロドラッグを、その 範囲 中に含む。一般的に、このようなプロドラッグは、必要とされる化学式（I）の 化合物にインビボで容易に変換できる、化学式（I）の化合物の機能的な誘導体 である。適当なプロドラッグ誘導体の選抜および調製のための常法は、例えば、 H．Bungaard編、Elsevier社、1985の「プロドラッグの設計」で説明されている 。 本明細書で用いられる場合、別の特記しない限り、アルキルは、直鎖または分 枝鎖で飽和した炭化水素を意味し、ハロにはフロロ、クロロ、ブロモ、およびヨ ードが含まれ、本明細書で用いられる場合、別に特記しない限り、アルキルは、 直鎖または分枝鎖で飽和した炭化水素を意味し、アザシクリックは、非芳香族の 、窒素を含む単環を意味し、アザビシクリックは、非芳香族の、窒素を含む二重 環を意味し、アリルは、選択的に置換された炭素環またはヘテロ環芳香族置換基 、特に、フェニルを意味し、ヘテロアリルは、好ましくは、rまたは6員環分子を もち、かつ、0、SおよびNから選択される少なくとも１個の原子を含む、芳香環 を意味する。化学式（I）の化合物は、参照として本明細書に組み入れられる国 際公開公報第94/03437号の方法に従い調製される。 本発明に係るスクリーニングアッセイ法によって、当業者は、どの候補リガン ドが治療または予防用途に最適であるかを、容易に同定することができる。例え ば、好ましい作用物質と、それら各々の誘導体には、L-740,093[3(R,S)-アミノ- 1,3-ジヒドロ-5-((1S,4S)-5-メチル-2,5-ジアザビシクロ[2,2,1]ヘプタン-2-イ ル)-2H-1-プロピル-1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン]、L-740,093R[(-)-N-[5-(3- アザビシクロ[3.2.2]ノナン-3-イル)-2,3-ジヒドロ-1-メチル-2-オキソ-1H-1,4- ベンゾジアゼピン-3-イル]-N'-[3-メチルフェニル]尿素、L-740.093S[(＋)-N-[5 -(3-アザビシクロ[3.2.2]ノナン-3-イル)-2,3-ジヒドロ-1-メチル-2-オキソ-1H- 1,4-ベンゾジアゼピン-3-イル]-N'-[3-メチルフェニル]尿素、L-365,260[3R(+)- N-(2,3-ジヒドロ-1-メチル-2-オキソ-5-フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-3- イル]-N'-(3-メチルフェニル尿素)]、およびL-364,718。 本発明のさまざまな態様において用いられる他の用語は、以下の定義から理解 されると思われる。例えば、「ペプチドホルモン」とは、細胞外レセプター、す なわち、「ペプチドホルモンレセプター」と接触することによって、標的細胞と 相互作用するポリペプチドを意味する。「ペプチド」は、ペプチド結合によって 互いに結合しているアミノ酸残基の少なくとも一部を含む分子を意味するために 、本細書において漠然と用いられる。「変異レセプター」は、自然界では優勢で ある対応するレセプター、例えば天然野生型レセプターの一つ以上のアミノ酸残 基が、異なる種類のアミノ酸残基で欠失または置換されている形状のレセプター であると理解される。「構成的に活性のあるレセプター」とは、対応する野生型 レセプターよりも高い基礎活性を有するレセプターを意味するが、ここで、「活 性」とは、正の作用物質による一層の活性化がなくても、シグナル伝達する、レ セプターの自発的能力を意味する。構成的に活性のあるレセプターの基礎活性は 、逆作用物質によって低下させることもができる。「天然の」レセプターとは、 動物の体内に存在するものと同じ形状もしくは配列のレセプター、または、「野 生型」配列として、当業者には既知の配列と同義である形状のレセプターを指す 。当業者は、「野生型」レセプターとは、従来から、レセプターの「野生型」ア ミノ酸コンセンサス配列であると認められているもの、または、リガンド結合お よびシグナル伝達の正常な生理学的パターンを有する「天然」のレセプターを指 すことを理解していると思われる。「セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性 」とは、レセプターの活性化に応答する細胞内刺激（cAMP、cGMP、ppGpp）イノ シトールリン酸、またはカルシウムイオンが含まれるが、これらに限定されない ）の産生、または、レセプター活性化に応答する、キナーゼ、ホスファターゼを 含むがこれらに限定されないタンパク質の活性化、または膜チャンネルの活性化 もしくは阻害を意味する。 本明細書で用いられる「配列の同一性」とは、２つの核酸またはポリペプチド 分子の間のサブユニット配列の類似性を意味する。例えば、２つのポリペプチド のそれぞれの所定の位置（配列アラインメントを行なう従来から既知の方法によ って決定される）がセリンによって占められている場合など、２つの分子の両方 における所定の位置が、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基によって占められ ていれば、それらは、その位置で同一である。２つの配列の間の同一性は、適合 または一致する位置の数の直接の関数であり、例えば10個のうち9個が合致する など、２つのポリペプチド配列における位置が90％一致していたら、この２つの 配列は、互いに、90％の配列同一性を有するということになる。２つの比較配列 の 配列同一性を比較するために、配列を解析しアラインメントする方法は、当業者 には周知である。本明細書で用いられる「生物学的活性」とは、ペプチドホルモ ンレセプターがリガンド、例えば作用物質または拮抗物質に結合し、シグナル伝 達を誘導する能力を意味する。 本発明の、その他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲か ら明らかになると思われる。 詳細な説明 本発明者らは、まず、図面について簡単に説明する。図面 図1は、完全または不完全な作用物質、逆作用物質、および拮抗物質の間の関 係を示す概略図である。 図2は、クローン化されたCCKレセプターの推定アミノ酸配列のマルチプルアラ インメントを示す図である：マストミス（mastomys）のCCK-B（配列番号：1）、 ラットのCCK-B（配列番号：2）、ヒトのCCK-B（配列番号：3）、イヌのCCK-B（ 配列番号：4）、ヒトのCCK-A（配列番号：5）、ラットのCCK-A（配列番号：6） 、およびツメガエルのCCK-XL（配列番号：7）。「A」は、EからQへの置換により 、レセプターの基礎活性を上昇させることなしに、PD135,158における固有の活 性が上昇したhCCK-Aレセプター中の位置を示している。「B」は、LからSまたはE への置換により、レセプターの基礎活性が上昇した、hCCK-Bレセプター中の位置 を示している。hCCK-Aレセプターにおける対応するLからSへの置換は、基礎活性 の上昇を引き起こさなかった。「C」は、VからEへの置換により、基礎活性が上 昇した、hCCK-Bレセプター中の位置を示している。ヒトのCCK-Aレセプターにお ける、対応するIからEへの置換は、基礎活性の上昇をもたらさない。表示した数 字は、包括的なものであり、各レセプターは、欠失または挿入があるために異な っている。 図３は、野生型CCK-B/ガストリンレセプターにおける、ペプチドリガンド、ペ プチド由来リガンド、および非ペプチドリガンドの固有活性（上図）を、構成的 に活性のあるレセプター変異体（下図）において増幅したことを示す棒グラフで ある。 図4は、非ペプチド作用物質L-740,093によるイノシトールリン酸の産生を示す 図である。上図：構成的に活性のあるヒトCCK-B/ガストリンレセプターを発現し ているCOS-7細胞において、L-740,093Sは、イノシトールリン酸産生を刺激した 。下図：YM022は、10nMのL-740,093-Sによって誘導される不完全な作用物質の活 性を弱める。 図5は、非ペプチド逆作用物質L-740,093Rのイノシトールリン酸の産生の阻害 を示す図である。上図：構成的に活性のあるヒトCCK-B/ガストリンレセプターを 発現しているCOS-7細胞において、L-740,093Rが、基礎的なイノシトールリン酸 産生を阻害する。下図：10nMのL-740,093Rによって誘導される逆作用物質の活性 は、YM022によって、濃度依存的な様式で部分的に阻止される。 図6は、野生型レセプターおよび構成的に活性のあるレセプターを利用するCCK -B/ガストリンレセプターリガンドの固有活性を比較したものである。すべての 化合物に対する値は、対数-直線相関に従っている（r2=0.93）。 図７は、¹²⁵I-CCK-8レセプター結合の程度を示す競合結合曲線である。CCK-8 、ガストリンI、およびCCK-4（パートA）、ならびにL-364,718およびL-365,260 （パートB）の濃度を上昇させたときの、hCCK-B-pcDNAIによって一過的にトラン スフェクトされたCOS-7細胞への、₁₂₅1-CCK-8の結合が示されている。 図8は、カルシウムキレート剤EGTAを添加したとき（パートAの左パネル）と、 添加しないとき（パートAの右パネル）の、組換えヒト脳CCK-Bレセプターを発現 するCOS-7細胞における、セカンドメッセンジャーシグナル伝達（すなわち、細 胞内カルシウムの移動）を示すグラフである。これを、イノシトールリン酸の産 生の上昇を平行に並べた（パートB）。 図9は、ヒトCCK-B/ガストリンレセプターの7回膜通過（TM）ドメイン構造を表 す概略図である。第三の細胞内ループのC末端ドメインを、黒で強調してある。 図10は、野生型CCK-B/ガストリンレセプター（WT）、または二つの構成的に活 性のある変異体（Mut.1，Mut.2）の内の一つによってトランスフェクトされたCO S-7細胞における、イノシトールリン酸の基礎的な蓄積を示す棒グラフである。 図11は、ヒトCCK-A（hCCK-A）、ヒトCCK-B（hCCK-B）、イヌCCK-B（dCCK-B） 、マウスCCK-B（mCCK-B）、およびマストミス（mastomys）のCCKレセプターなど の 、CCKレセプターの機能比較を示す棒グラフである。 図12は、作用物質CCK-8、L-365,260、およびPD136,450が、野生型CCK-Aレセプ ターまたは構成的に活性のあるCCK-Aレセプター（MHA21/35）と接触したときに 、イノシトールリン酸（IP）産生を刺激する効率の比較を示す棒グラフである。 図13は、不完全な正の作用物質であるペプトイドPD136,450のさまざまな濃度 での、イノシトールリン酸（IP）応答のレベルを示すグラフである。■：変異CC K-AレセプターMHA21/35、▲：野生型ヒトCCK-Aレセプター。 最近の薬物開発努力によって、拮抗物質として作用することにより、G-蛋白質 に結合したペプチドホルモンレセプターを競合的に遮断する小分子が得られた。 これに対して、このレセプター族を活性化させる、非常に少ない非ペプチドリガ ンドが同定されている。ここにおいて、本出願人らは、CCK-B/ガストリンレセプ ターに対して拮抗物質として作用することが知られている非ペプチドリガンドの 化学的修飾により結果としてこのリガンドが、拮抗物質から正の作用物質または 逆作用物質に変換されることを明らかにする。 本出願人らは、ヒトCCK-B/ガストリンレセプター（³²⁵L→E、MH162（配列番号 ：19））の構成的に活性のある変異体を用いたスクリーニングアッセイ法を設計 したため、このような修飾の結果生じるリガンドの固有活性の変化を検出するこ とができた。いくつかのペプチドリガンド、ペプトイドリガンド、およびベンゾ ジアゼピンをもとにした非ペプチドリガンドを、このアッセイ法で調べ、組換え 野生型レセプターまたは構成的に活性のある変異レセプターそれぞれを活性化さ せる能力を評価した。完全に正の作用物質は、ペプチド作用物質CCK-8の固有の 活性と比較すると、どちらのレセプターにおいても同様のシグナル伝達効果を持 っていた。アッセイ法において、構成的に活性のある変異レセプターを用いると 、低い固有活性をもつリガンドのシグナル伝達効果は対数的に増幅された。ベン ゾジアゼピン由来の非ペプチド拮抗物質の原型であるL-365,260は、ヒトの野生 型CCK-B/ガストリンレセプターの基礎活性をほとんど上昇させなかったが、³²⁵L →E変異体、MH162（配列番号：19）を用いて、不完全な作用物質として同定され た。L-365,260を少し化学修飾すると、純粋な拮抗物質（YMO22）、不完全な作用 物質（L-740,093S）または逆作用物質（L-740,093R）が生じた。このように、例 え ば、正逆のまたは固有の活性をもつ新規の非ペプチド作用物質を発見するプロセ スが、このスクリーニングアッセイ法において、例えば、構成的に活性のある変 異レセプターなどの強化レセプターを用いることによって促進されるはずである 。 Ｉ．実施例： Ａ．CCK-B/ ガストリンレセプター：以下の実施例により、作用物質をスクリー ニングするための、強化されたペプチドホルモンレセプターである、構成的なCC K-B/ガストリンレセプターMH162（³²⁵Ｌ→Ｅ）の使用が明らかにされる。 ヒトCCK-B/ガストリンレセプターの構成的に活性のある変異体を用いて、いく つかのベンゾジアゼピンに基づく椎定非ペプチド「拮抗物質」が、このレセプタ ーに結合されると、検出可能な、作用物質としての固有活性を有することが判明 した。 構成的に活性のあるCCK-B/ガストリンレセプター変異体MH162（³²⁵Ｌ→Ｅ；配 列番号：19）を、一過的にCOS-7細胞の中で過剰発現させた。それが構成的に活 性であったという事実は、リガンド非依存的なイノシトールリン酸の産生があっ たことから明らかであった。これに対して、野生型レセプターは、リガンド依存 的なイノシトールリン酸産生のみを示す。ペプチド作用物質のCCK-8、またはガ ストリンIで最大限に刺激すると、変異レセプターも野生型レセプターも、同じ ようなイノシトールリン酸産生を誘導した（図3）。これに対して、構成的なCCK -Bレセプター変異体MH162（配列番号：19）を、アッセイで用いることによって 、３つのベンゾジアゼピン由来の化合物である、L-740,093R、YMO22、およびL-3 65,260の異なった固有活性が検出されただけであった。これらの化合物は、すべ て、以前から、野生型CCK-B/ガストリンレセプターに対する非ペプチド拮抗物質 の原型であると考えられていた（Castro Pineiroら、国際公開公報第94/03437号 ；Lottiら、Eur．J．Pharmacol.，162:273-280，1989；Nashidaら、J．Pharmaco l．Exp．Ｔher.，270:1256-61，1994；Nashidaら、J．Pharmacol．Exp．Ther.， 269:725-31，1994）。対応するレセプターの親和性より、少なくとも100倍高い 濃度で、すべての化合物の固有活性（イノシトールリン酸形成を最大に刺激する 割合）を調べた。 ベンゾジアゼピンL-365,260は、完全な作用物質であるCCK-8と比べて62％の効 力を持っており、それを根拠に、³²⁵Ｌ→Ｅの構成的に活性のある変異レセプタ ーMH162（配列番号：19）における不完全な作用物質であると同定された（図3、 右側）。実際、L-365,260の機能を、野生型CCK-B/ガストリンレセプターととも に、詳しく再調査してみると、他の非ペプチド化合物では見られなかったような 、わずかにしか検出できないが有意なイノシトールリン酸産生の上昇も明らかに なった。 上記の結果から、ベンゾジアゼピンのバックボーンに結合した化学基における 小さな変化が、小さな非ペプチド化合物の固有の活性に顕著な変容をもたらすこ とができると結論された。ベンゾジアゼピン由来のCCKレセプターリガンドの立 体化学は、レセプター選択性だけでなく結合親和性を変化させることができるも う一つの特徴である（Showellら、J．Med．Chem．37:719-721，1994）。 以下の補足的な観察によって、リガンドの立体化学における差異が、CCK-B/ガ ストリンレセプター特異的な化合物の機能的な特性を決定していることが確認さ れた。例えば、L-740,093Sが、³²⁵Ｌ→Ｅ CCK-B/ガストリンレセプター変異体MH 162（配列番号：19）における、ほとんど完全な作用物質であることが示された （図3）。ヒトの野生型CCK-B/ガストリンレセプターで調べると、L-740,093Sは 、不完全な作用物質（CCK-8と比較すると、25％効力）として機能する。このよ うに、L-740,093Sは、CCK-B/ガストリンレセプターに特異的であることが知られ ている、最初の非ペプチド作用物質である。L-740,093Sの鏡像体であるL-740,09 3Rは、S型鏡像異性体の特性と反対の特性を有する。740,093Rは、構成的に活性 のあるレセプターの基礎活性を、ほぼ、野生型のレベルにまで低下させるため、 逆作用物質として作用している。 本スクリーニングアッセイ法の利点のひとつは、例えば、逆作用物質などの作 用物質と、拮抗物質とを区別することができることである。作用物質を調べると き、ペプチドホルモンレセプターの強化された型（例えば、構成的なレセプター ）で観察されるシグナル伝達活性のレベルは、ヒトの野生型レセプターで観察さ れる活性とは異なる。これに対して、拮抗物質は、強化された型でも、ヒト野生 型レセプターでも、同様のシグナル伝達活性を示す。純粋な作用物質は、さらに 、正の作用物質と逆作用物質の効果を減衰させると考えられる。 試験した化合物の中で、YM022が、野生型または構成的に活性のあるCCK-B/ガ ストリンレセプターのいずれに対しても、固有の活性をほとんど示さなかったた め、「完璧な」逆作用物質に最も近かった。野生型レセプターおよび構成的に活 性のあるレセプターの両方において、YM022は、CCK-8が誘導するイノシトールリ ン酸産生を、同様のpA2値（それぞれ、9.78と9.37）によって表される、ほぼ同 一の親和性で遮断した。L-740,093Sを非ペプチド作用物質として機能的分類した ことに矛盾することなく、この化合物によって誘導されるイノシトールリン酸産 生は、YM022によって遮断することができた（pA2=9.54;図4）。YM022はまた、構 成的に活性のあるCCK-B/ガストリンレセプターに対するL-740,093Rの逆作用物質 活性を減衰させることができる（図5）。濃度依存的な様式で、YM022は、20nMの L-740,093Rで阻害されていた構成的に活性のあるレセプターの基礎活性を部分的 に回復させた。基礎活性が完全に回復されなかったという事実は、YM022それ自 体は、この変異体において、純粋なレセプター作用物質というより、弱い逆作用 物質であるという事実により説明される。 pA2値は、競合的な作用物質の機能的な親和性を測定するものである。IC₅₀値 （50％阻害濃度）とは対照的に、pA₂値は、どの作用物質濃度が、作用物質の親 和性を測るために用いられたかに関係しない。理想的には、pA₂値も、どの特異 的な作用物質化合物が、作用物質の親和性を測るために試験されたかということ とは無関係であるべきである。pA₂値は、作用物質濃度応答曲線を、２倍分（by a factor of two）右にずらす特異的作用物質濃度の負の対数と定義されている 。換言すると、所定の拮抗物質濃度の存在下で、同じ効果を誘導するためには、 拮抗物質がないときに必要とされる作用物質の2倍の量が必要となる。競合的拮 抗物質のpA₂値は、一般的には、シフトプロット（Shift plot）で評価されるが 、簡易化した「ナル（null）」法（Lazarenoら、Trends in Pharmacol．Sci.，1 4:237-239，1993）によって測定してもよい。 非ペプチドリガンドに加えて、構成的に活性のある変異CCK-BレセプターMH162 （³²⁵Ｌ→Ｅ配列番号：19）は、ペプトイドと名付けられた、ペプチド由来の不 完全な作用物質の固有活性を増幅させた（Horwellら、Eur．J．Med．Chem.，30 Suppl.:537S-550S，1995;Horwellら、J．Med．Chem.，34:404-14，1991）。以下 の実験で用いられたペプトイドは、CCKのカルボキシ末端の４アミノ酸を含むテ トラペプチドであるCCK-4を連続的に修飾して得られた。２つのペプトイド化合 物の原型であるPD135,158とPD136,450は、野生型CCK-B/ガストリンレセプターの 存在下で調べると不完全な作用物質であるが、構成的に活性のあるCCK-B/ガスト リンレセプターの存在下では、ほぼ完全な作用物質に変化する。このように、非 ペプチド化合物同様、ペプチド由来の化合物も、野生型のCCK-B/ガストリンレセ プターに比べて、構成的に活性のあるもので調べると、効力の上昇を示すことが できる。効力におけるこのような顕著な変化にもかかわらず、野生型対変異型レ セプターの親和性の比率は、¹²⁵Ｉ-CCK-8競合結合実験で判定したところ、2倍の 範囲内であった（表1A）。CCK-B/ガストリンレセプターリガンドの固有の活性と 、野生型レセプターと構成的に活性のあるレセプターとの間での効力の変化との 間には明らかな相関は見られなかった（表1B）。 L-740,093Sの固有活性は、最近になって、インビボで不完全な作用物質である ことが明らかになった「ペプトイド」リガンドPD135,158（Dingら、Gastroenter ology，109:1181-87，1995）で観察された固有活性に匹敵した。 構成的に活性のあるCCK-B/ガストリンレセプターに関する先例は、非ペプチド 先導化合物について、ある程度の固有活性をスクリーニングするための「拡大鏡 」として変異レセプターを用いる新しい方法を例示している。構成的に活性のあ る³²⁵Ｌ→Ｅ変異体MH162は、化合物が野生型レセプターを刺激するために有して いる固有の活性の検出を確実に促進した（図6）。これは、試験したペプチド、 「ペプトイド」、および非ペプチドのリガンドの範囲すべてに当てはまった。Ｂ．CCK-A レセプター：作用物質を同定するために強化レセプターを用いるもう 一つの実施例において、CCK-Aレセプター変異体のMHA21/35（配列番号：5の¹³⁸ Ｅ→Ｑおよび³⁰³ＡＮＬＭ→ＨＶＳＡ修飾）を用いて、ペプトイド化合物PD136,4 50を試験した。図12は、MHA21/35 CCK-A変異体レセプターの、ヒト野生型CCK-A レセプターに較べて、ペプチドCCK-8、非ペプチドL-365,260、およびペプトイド PD136,450の作用物質の固有活性を強化する能力を示している。図13は、ペプト イド作用物質PD136,450の濃度関数として、構成的なCCK-A変異体レセプターMHA2 1/35による、不完全な作用物質の効力の増幅を示している。 II．レセプター結合および活性の解析： Ａ．レセプター結合解析：以下の実施例によって、例えば、CCK-AまたはCCK-B /ガストリンレセプターなどのCCKレセプターへのリガンドの結合を測定すること ができる。この実施例において、ヒトCCK-B/ガストリンレセプターへのリガンド の結合親和性を測定する。 COS-7細胞（1.5×10⁶）を10-cmの培養皿（ヌンク社(Nunc)）に接種して、5％C O₂、95％空気のインキュベータにて、37℃で、10％仔ウシ血清を含む、ダルベッ コ（Dulbecco's）の改変イーグル（Eagle's）培地で増殖させた。一晩インキュ ベートした後、hCCKB（HCCKB-pcDNA I）を有する5〜7μｇの発現ベクターpcDNA Iで、細胞をトランスフェクトした（Pacholczykら、Nature 350:350-354，1991 ）。トランスフェクトして24時間後、24穴皿（コスター社(Costar)）に細胞を分 けた（2×10⁴細胞/ウェル）。さらに24時間後、25mMのフェニルメチルスルフォ ニルフルオライド（PMSF）を補添したハンクス（Hank's）緩衝液の中で、競合結 合実験を行った。20pMの¹²⁵Ｉ-CCK-8（デュポン-ニューイングランドヌクレア社 (Dupont-New England Nuclear）を、放射性リガンドとして用いた。37℃では、 インキュベートして80秒後に、平衡結合が起きた。次に、細胞の単層を3回洗浄 し、1NのNaOHで加水分解し、レセプターに対する放射活性量を定量した。非標識 作用物質（例えば、CCK-8、非硫酸化CCK-8（CCK-8us）、ガストリンI、CCK-4（ ペニンシュラ社(Peninsula)）と拮抗物質（L-364,718およびL-365,260（メルク 社(Merk)）を、濃度0.1pMから10μＭの範囲にわたって調べた。すべての結合実 験を、3回から5回繰り返した。 放射性リガンド結合解析のために特別に設計されたコンピュータソフトウェア を用いて競合実験データを解析した（インプロット4.0、グラフパッド社(GraphP ad)、カリフォルニア州サンディエゴ）。競合結合と飽和結合データの解析も、 コンピュータ化した非直線的曲線適合を用いて行なうことができる（McPherson ，G.A.，J.Pharmacol Methods，14:213-28，1985）。 ヒトCCK-B/ガストリンレセプターcDNAで安定的にトランスフェクトしたチャイ ニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いた、上記のアッセイを繰り返すことに よって、すべての作用物質と拮抗物質の親和性を確認した。このCHO細胞系は、 標準的なリポフェクチンプロトコール（ベセスダ・リサーチラボラトリー社(Bet hesd a Research Laboratories）を用いて、CHO細胞の中にhCCKB-pcDNAI Neo発 現ベクター（インビトロゲン社(Invitrogen)）をトランスフェクトさせた後、G4 18選抜をすることにより確立された。 単離された原形質膜で、結合パラメータを決定したところ、例えば、22℃、60 分で、結合を行なうことができる（Kopinら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89: 3605-09,1992）。結合した放射性リガンドと遊離放射性リガンドとの分離は、レ セプター結合フィルターマット濾過を用いて行なうことができる（Klueppelberg ，U.G.ら、1989、Biochemistry 28:3463-8）。 本発明に係るCCK-B/ガストリン変異体レセプターの結合特異性を、野生型CCK- B/ガストリンレセプターの典型的な結合特異性と比較するためには、マツモト（ Matsumoto）ら（Am．J．Physiol.，252:G143-G147，1987)、およびリー（Lee） ら、（J．Biol．Chem.，268(II):8164-69，1993）を参照のこと。 結合親和性の、野生型ヒトCCK-Bレセプターとの比較：例えば、ヒトCCK-B/ガ ストリンレセプターなどの、ヒト野生型レセプターへの放射性標識リガンドの結 合に関する基準値を決定した（Leeら、J．Biol．Chem.，268(II):8164-69，1993 を参照のこと）。COS-7細胞で発現するヒト脳CCK-B/ガストリンレセプターの、 作用物質への親和性の特徴を調べた（図7）。構造的に関連する作用物質である 、CCK-8、ガストリンI、およびCCK-4はすべて、¹²⁵Ｉ-CCK-8の、組換えレセプタ ーを発現しているCOS-7細胞への結合に関しては、濃度依存的な様式で競合した 。CCK-8、ガストリンI、およびCCK-4について計算したIC₅₀値は、それぞれ、0.1 4、0.94、および32nMであった（図7、パートA）。同様の¹²⁵Ｉ-CCK-8競合曲線を 、L-364,718とL-365,260についても評価し（図7、パートB）、IC₅₀値が、それぞ れ、145および3.8nMであることが明らかとなった。トランスフェクトされなかっ た細胞は、置換可能な結合を示さなかった。 Ｂ．レセプターシグナル伝達活性解析： CCKレセプターへの作用物質の結合により、細胞内カルシウム濃度とホスファ チジルイノシトールの加水分解とが増加することが明らかになる。 [Ca²⁺] の測定：hCCKB-pcDNAIでトランスフェクトした48時間後、修正クレブス -リンゲル（Krebs-Ringer）重炭酸緩衝液中で、COS-7細胞に、Ca²⁺フルオロフオ アfura-2を組み込んだ。10^-7MのCCK-8、または10^-6MのガストリンIで細胞を刺激 した後の、蛍光放出比（340:380nm）における変化を、以前に説明されていると ころ（Rajanら、Diabetes,38:874-80，1989）にしたがって測定した。ガストリ ン誘導による[Ca²⁺]の増加が、主に、細胞内の[Ca²⁺]プールから発生することを 確認するために、細胞外カルシウムをEGTA（2.5mM）でキレート化することがで きる。 イノシトールリン酸代謝の測定：hCCKB-pcDNAIでトランスフェクトされたCOS- 7細胞を、10μCi/ml[³H]myo-イノシトール（ARC）を添加した、イノシトールを 含まないダルベッコ（Dulbecco's）の改変イーグル（Eagle's）培地（DMEM、ギ ブコ社(GIBCO)）で、解析に先立つ24時間培養した。修正クレブス-リンゲル（Kr ebs-Ringer）重炭酸で、1時間平衡化した後、細胞を、10^-7MのCCK-8で10秒間刺 激して、メタノール-HCl中で回収した。水層をクロロフォルムで抽出して、凍結 乾燥し、強度の陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによって、イノシトー ル1,4,5-三リン酸（Ins-1,4,5-P₃）とイノシトール1,3,4,5-テトラキスリン酸（ Ins-1,3,4,5-P₄）について解析を行なった（Augerら、Cell，57:167-75，1989） 。 シグナル伝達活性の、野生型ヒトCCK-Bレセプターのシグナル伝達活性との比 較：ヒト野生型CCK-Bレセプターのセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性の 基準レベルを、このレセプターを発現しているCOS-7細胞のCCK-8による刺激への 応答で測定した（図8；リー（Lee）ら、J．Biol．Chem.,268(II):8164-69，1993 を参照のこと）。CCK-8（10^-7M）は、遊離した細胞質カルシウム[Ca²⁺]_iの顕著 な増加を誘発した（図8、パートA、左側パネル）。挿入配列を含まない発現ベク ターpcDNAIでトランスフェクトした細胞においては、遊離細胞質カルシウムの変 化は見られなかった。細胞外カルシウム（緩衝液中、1.5mM Ca²⁺）を、2.5mMのE GTAでキレート化した後、CCK-8（10^-7M）を加えても、なお、一過的に[Ca²⁺]_iを 増加させた（図8、パートA、右側パネル）が、このことは、CCK誘導による[Ca²⁺ ]i増加の最初のピークが、主に、細胞内のCa²⁺プールから発生することを示唆し ている。矢印は、CCK-8s（0.1μＭ）またはEGTA（2.5mM）の添加を示す。[Ca²⁺]_i 応答のパターンから、組換えレセプターへのCCK-8の結合が、ホスフォリパーゼ Cの活性化を通して、細胞内シグナル伝達を誘発することが示唆される。このこ とは、hCCKB-pcDNAIでトランスフェクトされたCOS-7細胞中のイノシトールリン 酸代謝を、CCK-8刺激の10秒後に測定することにより確認された（図8、パートB ）。CCK-8に誘導された[Ca²⁺]_iのピークの直前になるため、この時点が選択され た。C CK-8（10^-7M）は、Ins-1,4,5-P₃のレベルを、刺激を受けていない対照のhCCKB-p cDNAIでトランスフェクトされたCOS-7細胞に対して453％上昇させた（n=3，p<0. 001）。Ins-1,4,5-P₃の直接の代謝物であるIns-1,3,4,5-P₄のレベルも、対照に 対して186％上昇した（n=3，p<0.01）。 全イノシトールリン酸含量を測定するための簡易化した方法：上記の方法は、 Ins(1,4,5)P₃の含量を特異的に評価するものであるが、簡易化したスクリーニン グ法を用いて、イノシトールリン酸の全濃度を調べることができる。これは、簡 易化した方法では、特異的な、異性体を区別しないからである。（図3、4、5、6 、および10に示した実験については、この方法を用いて、イノシトールリン酸生 成を測定した。） イノシトールを含まず、3μCi/mlの³Hミオーイノシトール（NEN、45-80 Ci/mm ol）を補添した、無血清のダルベッコ（Dulbecco's）改変イーグル（Eagle's） 培地（DMEM、ギブコ社(GIBCO)）中で、レセプターcDNA-pcDNAIでトランスフェク トしたCOS-7細胞を、解析に先立ち18時間培養した。次に、その細胞をDMEM/10mM LiCl₂で2回洗浄し、リン酸緩衝食塩水/10mM LiCl₂で2回洗浄した。リン酸緩衝食 塩水/10mM LiCl₂の中で、37℃で30分間、推定作用物質で刺激した後、細胞を氷 冷メタノール中で掻き取った。脂質をクロロフォルムで抽出した（Pfeifferら、 FEBS Lett.，204:352-356，1986）。ドウェックス（DoWex）1-X8カラム（バイオ ラド社(BIORA)）と、水/60mM ギ酸アンモニウム（ammonium fornate）/2Mギ酸ア ンモニウム（ammonium fornate）で分別溶出を用いた、強度の陰イオン交換クロ マトグラフィーによって、イノシトールリン酸に関する上層の解析を行なった。 液体シンチレーションカウントによって、溶出された放射活性を測定し、イノシ トールリン酸含量を、カラムに入れた全³H-放射活性の割合として表示した。 頭頂部から取った天然の細胞のガストリンレセプターに結合したセカンドメッ センジャー経路に関する詳細な情報は、以下の参考文献から得ることができる： Mullem，S.ら、1984、Biochim．Bioiphys．Acta．805:181-5;Chew，C.S.ら、198 6、Biochim．Bioiphys．Acta．888:116-25;Roche，S.ら、1991、FEBS Letts.，2 82:147-51。 イノシトールリン酸の産生に加えて、例えば、cAMP、cGMP、ppGpp、もしくは カ ルシウムイオン産生によって、または、例えば細胞内pH、pH-感受性染料、もし くは、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子の発現を指標として 用いて、または、電気生理学的技術によって、チャンネル活性、もしくは細胞の 減極もしくは脱分極を測定して、セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性を測 定することができる。 III．非ペプチド作用物質の固有の活性を増幅することのできる、適当なペプチ ドホルモンレセプター： 本発明に係るスクリーニングアッセイ法は、ペプチドホルモンレセプターで、 対応するヒト野生型レセプターよりも高い活性を有するものを用いて行なうこと ができる。強化された基礎活性によって、リガンドの固有活性が増幅されるため 、不完全な作用物質によるレセプターの活性化、または逆作用物質による阻害の いずれかを検出するのに有用である。対応する野生型レセプターに較べて、強化 された基礎活性をもたないが、それでも、不完全な作用物質の固有活性を増幅す るレセプターも有用である。 非ペプチド作用物質をスクリーニングするために有用なペプチドホルモンレセ プターの実例には、以下のペプチドホルモン（それらそれぞれの野生型アミノ酸 配列に関する参照とともに）と相互作用する、さまざまな形のレセプターが含ま れる：アミリン、アンギオテンシン、ボンベシン、ブラジキニン、C5aアナフィ ラトキシン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、ケモカ イン、コレシストキニン（CCK）、エンドセリン、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ホ ルミルメチオニルペプチド、ガラニン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、 グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、糖蛋白質ホルモン、ゴナドトロピン放出 ホルモン、レプチン、黄体形成ホルモン（LH）、メラノコルチン、ニューロペプ チドＹ、ニューロテンシン、オピオイド、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、セ クレチン、ソマトスタチン、タキキニン、トロンビン、甲状腺刺激ホルモン、甲 状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管形成性腸管ペプチド（VIP）、およびバソ プレッシン。強化レセプターは、さらに、例えば、インシュリンレセプターのよ うに、膜通過ドメインを一つ有するペプチドホルモンレセプターも包含すること ができる。上記ペプチドホルモンレセプターの野生型アミノ酸配列は、ワトソン とア ーキンストール（Watson and Arkinstall）の[G-蛋白質結合レセプター（The G- Protein Linked Receptor）,アカデミック出版、ニューヨーク州、1994]におい て、利用可能であり、および/または参照される。 作用物質の固有活性を増幅することができるペプチドホルモンレセプターの形 には、以下の形状のレセプターが含まれるが、それらに限定されない： １．不完全な作用物質の固有活性を増幅することができる変異ペプチドホルモ ンレセプター。 不完全な「ペプトイド」作用物質PD135,158の固有活性を強化するが、作用物 質に依存しない基礎レセプター活性を外見上上昇させることのない変異ヒトCCK- Aレセプターの既存の実例は、変異CCK-AレセプターMHA35である。MHA35は、ヒト 野生型CCK-Aレセプターのアミノ酸138-ERY-140を、ベクターpcDNAIの中でQRYに 置換することによって作出された（野生型CCK-Aレセプターのアミノ酸配列の例 については、図2を参照のこと）。 ２．¹³⁸E、³⁰⁵Lおよび³¹²Iの1個以上の残基が、別のアミノ酸残基、例えば、 セリン、アスパラギン酸、グルタミン、またはグルタミン酸残基に置換されたCC K-Aレセプター。例えば、5個のアミノ酸を置換して（配列番号：5の¹³⁸E→Qと^{30 3} ANLH→HVSAという変更）、構成的に活性のあるCCK-Aレセプター変異体を構築し 、この結果できたレセプターをMHA21/35と名付けた。 ３．¹⁵¹E、³²⁵Lおよび³³²Vの1個以上の残基を、別のアミノ酸残基、例えば、 セリン、アスパラギン酸、グルタミン、またはグルタミン酸残基に置換したCCK- B/ガストリンレセプター。 ４．天然の構成的に活性のある変異レセプターを含むが、それらに限定されな い天然の変異レセプターであって、例えば、構成的に活性のある天然の変異レセ プターによって生じる表現形質など、病気、またはその他の有害な表現形質に関 係するレセプター。実例としては、以下のペプチドホルモンレセプターが含まれ るが、これらに限定されない： a）黄体形成ホルモン（LH）レセプター遺伝子における点突然変異が、いくつ かの性的早熟の発生の原因である。LHレセプターの以下のアミノ酸残基を変える ことによって、本発明に係る変異レセプターを構築することができる：568番目 のア ラニン残基を別のアミノ酸、例えばバリンに（Latronicoら、J．Clin．Endo．& Meta.，80(8):2490-94，1995）；578番目のアスパラギン残基を別のアミノ酸、 例えば、グリシンまたはチロシンに（Kosugiら、Human Mol．Genet.，4(2):183- 88，1995;Laueら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92(6):1906-10，1995）；571 番目のMet残基を別のアミノ酸、例えばIleに、または577番目のThr残基を別のア ミノ酸、例えばIleに（Kosugiら、前記；Laueら、前記）；542番目のIle残基を 別のアミノ酸に、564番目のAsp残基を別のアミノ酸に、581番目のCys残基を別の アミノ酸に、または578番目のAsp残基を別のアミノ酸に（Laueら、前記）；例え ば、膜通過ヘリクス6または細胞内ループ3において、細胞内ドメイン近傍部位に ある、膜通過へリクス5または6の中のアミノ酸残基（Laueら、前記）。 また、卵胞刺激ホルモン（FSH）レセプター、および甲状腺刺激ホルモン（TSH ）レセプターの対応する残基における突然変異が含まれる（Latronicoら、前記 ）。 b）天然の、構成的に活性のある副甲状腺（PTH）レセプターが、保存された22 3番目でHisからArgへの置換によって生じることがある（Schipaniら、Science， 268:98-100，1995）。関連するレセプターの対応する残基で、代りになるアミノ 酸に置換することによって、例えば、グルカゴン様ペプチド1（G-LP1）レセプタ ーにおける相同体Hisを別のアミノ酸に置き換えて、構成的に活性のある変異G-L P1レセプターを構築することができる。アミノ酸の相同性による、PTHまたはG-L P1に関連するレセプターのいずれかにおける同様の変更には、セクレチン、血管 形成性腸管ポリペプチド（VIP）、グルカゴン、G-LP1、およびカルシトニンが含 まれるが、これらに限定されない。 上に列挙した天然の変異レセプターのいずれかを用いたスクリーニングアッセ イ法において同定された非ペプチドの正または逆の作用物質は、対応する有害な 表現形質に対して、治療上有用である。 ５．合成変異レセプターを同定するための方法 欠失解析により、セカンドメッセンジャーのシグナル伝達において重要な細胞 内レセプターのドメインが明らかとなる：組換えCCK-AおよびCCK-B/ガストリン レセプターは、どちらも、ホスホリパーゼCの活性化とつながっている。本出願 人ら は、CCK-B/ガストリンレセプターの３番目の細胞内ループが、セカンドメッセン ジャーのシグナル伝達において重要な残基を含んでいるのではないかと仮説を立 てた。この仮説を調べるために、各々が３番目の細胞内ループの中で6個から55 個のアミノ酸を欠失した、一連の欠失変異体を作成した。各変異レセプターをCO S-7細胞の中で発現させて、[¹²⁵I]CCK-8結合と、³Hイノシトールリン酸形成を調 べた。３番目の細胞内ループのカルボキシ末端における12アミノ酸を欠失させる と、CCK-8結合に関しては正常な親和性と能力を有するが、CCK-8に誘導されるイ ノシトールリン酸形成の最大値が90％低下する結果になった。ただし、この組に おける他のレセプターはすべて、正常にシグナルを伝達した。そして、後述する ように、機能的に重要であることが明らかになった12アミノ酸を含む領域を、構 成的に活性のある点突然変異に関してスクリーニングした。 方法１：cAMP生成レセプターとのドメイン交換により、構成的なレセプター活 性が生じる：構成的に活性のある変異レセプターを迅速に同定するための方法は 、２つのレセプターの間で、例えば、約5〜10個の長さのアミノ酸である、機能 的なドメインを交換することに依存している。２つのレセプターの一方は、例え ば、野生型レセプターなど、望ましい変異レセプターの主要な鋳型となる形状の レセプターであり、第二のレセプターは、第一のレセプターとは異なるペプチド ホルモンレセプターである。候補レセプターは、例えば、同一のまたは異なるセ カンドメッセンジャー経路によるシグナルなどの、異なるシグナル伝達経路と連 結しており、さらに、アミノ酸配列は密接に関連している。これらの基準は、本 来の意味で正常に機能するアミノ酸鎖は、異なるセカンドメッセンジャーのシグ ナル伝達経路に結合した密接に関連するレセプターに移植された場合、作用物質 とは独立にシグナル伝達を行なうことができるという考えに基づいている。 ドメイン交換法を用いて、CCK-B/ガストリンレセプターの、構成的に活性のあ る変異体を同定した。第三の細胞内ループにおける一連の短い分節を、hCCK-Bと ほとんど同一のレセプターであるバソプレッシン2レセプターに由来する相同な アミノ酸配列で連続的に置換した。バソプレッシン2は、また、CCK-B/ガストリ ンレセプターとは違って、アデニル酸シクラーゼのシグナル伝達経路に結合して いるため、CCK-B/ガストリンレセプターによってドメイン交換をするためのよい 候補 である。 試験したところ、CCK-B/ガストリンレセプターの相同な位置への5個のアミノ 酸置換（QAKLL（配列番号：13）からAHVSA（配列番号：14））は、CCK-B/ガスト リンレセプターの構成的な活性をもたらした。QAKLL（配列番号：13）からAHVSA （配列番号：14）への置換は、イノシトールリン酸形成の基礎レベルを、野生型 CCK-B/ガストリンレセプターの290％まで上昇させる結果をもたらした（図9、変 異体2）。さらに、構成的な活性をもたらす変異体には、LLのSAへの置換、Lから Sへの置換、また、LからEへの置換が含まれる。 方法２：グルタミン酸スキャニング突然変異誘発法によって、構成的に活性の あるレセプターが同定される：欠失解析もしくはドメイン交換に加えて、または それらの代りに、本出願人らが「アミノ酸スキャニング突然変異誘発法」と名付 けた処理法を用いて、変異レセプターを作出することができる。アミノ酸スキャ ニング突然変異誘発法は、レセプターの細胞内ループまたは細胞内部位に隣接す る膜通過ドメインの部分のいずれかに見られる各アミノ酸を連続的に置換するこ とを含む。実験上の選択は、例えば、陰性のアミノ酸を陽性のアミノ酸と交換す ること、陽性のアミノ酸を陰性のアミノ酸と交換すること、または、陽性もしく は陰性のアミノ酸を中性のアミノ酸と交換することなど、アミノ酸の電荷を変化 させることである。もう一つの選択は、例えば、中性の各アミノ酸を別の中性の アミノ酸と交換するなど、各アミノ酸を交換することである。 CCK-B/ガストリンレセプターの場合には、欠失解析を最初に用いて、セカンド メッセンジャーのシグナル伝達に重要な第三の細胞内ループの中に、機能的に重 要な12個のアミノ酸断片を明らかにした。続いて、この12個の断片の中の中性ア ミノ酸のすべてを、次々に別のアミノ酸、好ましくはグルタミン酸と置換した。 スキャニング解析技術は、グルタミン酸を一つ置換すると、野生型の値と比較し て、一過的にトランスフェクトされたCOS-7細胞における、イノシトールリン酸 の蓄積の基礎レベルを228％上昇させる結果になった（図9、変異体1）。 この実施例において、本出願人らは、第三の細胞内（IC）ループのカルボキシ 末端に限定された領域と、第三のICループに隣接した、六番目の膜通過の部分を 集中的に研究した。中性アミノ酸残基の代りに、グルタミン酸残基を（E）を導 入した。 構成的に活性のあるレセプターには、³²⁵L→E（MH162；配列番号：19）と、^{33 2} V→E（MH129；配列番号：22）におけるアミノ酸置換を含んでいる。すべての変 異体を、上述したようにして、pcDNAIベクターの中に構築した。 図9は、ヒトCCK-B/ガストリンレセプターの7つの膜通過（TM）ドメインの構造 を表した概略図である。細胞内シグナル伝達にとって非常に重要な、第三の細胞 内ループのC末端ドメインを黒く塗って強調してある。この断片の中で、レセプ ターに構成的な活性を付与する2つの突然変異が見出された。突然変異の一つは 、グルタミン酸置換スキャニング（変異体1；MH129（配列番号:22））によって 構築され、第二の突然変異は、ドメイン交換によって構築された（変異体2；MH1 62（配列番号：19））。野生型CCK-B/ガストリンレセプター、または2つの異な る構成的に活性のある変異体によってトランスフェクトされたCOS-7細胞におけ る、基礎的なイノシトールリン酸の蓄積を示す棒グラフが、図10に示されている 。 方法３：変異レセプターを作出する第三の方法は、目的のレセプターを、ペプ チドホルモン、生物起源のアミン、ロドプシン、またはその他のG-蛋白質結合レ セプターを含むがこれらに限定されない既知の構成的に活性のある変異レセプタ ーと並べることである。このようなアラインメントの実施例が、図2に示されて いる。一般的に、既知の変異体において構成的な活性をもたらす突然変異を、目 的とするレセプターの対応する位置に導入することができる。既知の構成的に活 性のある変異レセプターの実例には、卵胞刺激ホルモン（FSH）レセプター、甲 状腺 刺激ホルモン（TSH）レセプター、および、例えばLHレセプターにおける568番目 のAlaからValへの突然変異（Latronicoら、J．Clin．Endo．& Meta.，80(8):249 0-94，1995）など、黄体形成ホルモンレセプターが含まれるが、これらに限定は されない。 この方法を用いて、アラインメントに基づき、CCK-A変異レセプターを構築し た。ヒトおよびラットのCCK-A配列、マストミス（mastomys）、ラット、ヒト、 およびイヌのCCK-B/ガストリンレセプター、ならびにツメガエルCCK-A/CCK-Bの 中間レセプター（CCK-XL；図2）を含むマルチプルアラインメントマップが作成 された。このマップに基づいて、強化された変換活性を有する既知の構成的に活 性のあるロドプシン変異体に基づき、CCK-Aレセプターの保存されたアミノ酸138 -ERY-140を、アミノ酸QRYで置き換えた（Arnisら、J．Biol．Chem.，269:23873- 81，1994）。改変されたアミノ酸残基は、膜通過ドメインIIIの中にあり、第二 の細胞内ループに隣接する。シグナル伝達の基礎レベルは上昇しなかったが、非 ペプチドリガンドPD135,158の固有活性は有意に上昇した。 方法4：レセプターの細胞内部位を連続的に欠失させ、野生型レセプターに較 べて基礎活性が上昇するもの、または、不完全な作用物質の過剰活性を探すこと によって、さらに別の変異レセプターを作出することができる。 強化された基礎活性を有する野生型レセプター： 本発明の方法において有用なペプチドホルモンレセプターには、対応するヒト の野生型レセプターと比較すると、非ペプチド作用物質の固有活性を増幅するこ とができるか、またはヒトの野生型レセプターよりも高い基礎活性を有する、非 ヒトレセプターが含まれる。 図11において、イノシトールリン酸産生の基礎レベルを、ヒトCCK-A（hCCK-A ）、ヒトCCK-B（hCCK-B）、イヌCCK-B（dCCK-B）、マウスCCK-B（mCCK-B）、お よびマストミス（mastomys）CCKレセプター（図11、パートA）について測定し、 hCCK-Bの基礎レベルに対する割合で示した。 また、ラットのCCK-B/ガストリンレセプターと、関連するツメガエルCCKレセ プターに関する実験も１回行なった（表2）。ヒトMH162（³²⁵L；配列番号：19） のE変異体を陽性対照として用いた（n=14）。 野生型ヒトCCK-AおよびCCK-B/ガストリンレセプターは、CS-7細胞において、 （空のプラスミドベクターpcDNAIでトランスフェクトした対照用細胞と比較して ）基礎的なイノシトールリン酸産生の有意でない変化を誘導しただけだった。同 様に、野生型のラットCCK-AおよびイヌCCK-B/ガストリンレセプター、また、密 接に関連するツメガエルのCCKレセプターも、すべて、基礎的な状態では、多か れ少なかれ、活性はなかった。これに対して、野生型のマウスCCK-B/ガストリン レセプター、およびマストミス・ナタレンシス（mastomys natalensis）に由来 するその相同レセプターは、COS-7細胞における基礎的なイノシトールリン酸産 生を、対照用pcDNAIよりも有意に上昇させた。野生型ヒトCCK-B/ガストリンレセ プターのわずかな基礎活性と比較すると、野生型のマウスおよびマストミスの相 同レセプターの基礎活性は、それぞれ、7倍および11倍高いと評価された。ちな みに、ヒトのCCK-B/ガストリンレセプターの³²⁵L-E変異体は、基礎的な状態にお いて、ヒトの野生型レセプターよりも、少なくとも16倍は活性があるようだった 。CCK-8による刺激に対する最大の応答が、試験したレセプターすべて（陽性対 照）で同等であったことから、記載された生物種の基礎活性における違いは、レ セプター発現の程度の違いには関連していないことは明らかであった。 IV． 治療的用途 野生型または構成的に活性のあるレセプターの活性を、薬理学的に改変するこ とができれば、新しい種類の臨床的に有用な薬物へのドアを開くことになる。強 化レセプターにより、作用物質として作用することができる薬物の発見が可能と なり、それによって、広い範囲にわたる病気の治療または予防に関する利点を有 する。甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、および副甲状腺ホルモンレセプ ターの、構成的に活性のある変異体が天然に存在することは、既に知られており （上記参照）、非ペプチド作用物質/逆作用物質のスクリーニングのための出発 点が提供されうる。例えば、甲状腺腫の病因であると示唆されている、構成的に 活性のある甲状腺刺激ホルモンレセプターを抑止する薬物を用いて、腫瘍の増殖 を阻害することができた。同様に、構成的に活性のある黄体形成ホルモンレセプ ターを有する患者において、逆作用物質は、性的早熟の開始を遅延させることが できた。 化学式（I）の化合物を含むがこれらに限定されない非ペプチド作用物質は、C CKおよび/またはガストリンレセプターが関係する、中枢神経系疾患を治療およ び予防するための作用物質として有用である。このような病状の例には、消化性 および十二指腸潰瘍などの胃腸潰瘍、過敏性腸管症候群、胃食道逆流病、または 膵臓性もしくはガストリンの過剰分泌、急性膵臓炎、または運動性障害を含む胃 腸障害；神経弛緩障害、晩発性ジスキネジー、パーキンソン病、精神病、または ジル・ド・ラ・ツレット（Gilles de la Tourette）症候群など、CCKがドーパミ ン、セロトニン、およびその他のモノアミン性神経伝達物質と相互作用すること により引き起こされる中枢神経系障害を含む中枢神経系障害；鬱病；精神分裂病 ；食欲調節システムの障害；ゾリンジャー-エリソン（Zollinger-Ellison）症候 群、腔および細胞過形成、または痛みが含まれる。 非ペプチド作用物質は、さらに、以下の用途に有用である： １）CCKレセプターおよび/またはガストリンレセプターに関係する不安または パニックに関する神経学的な障害の治療または予防； ２）アヘンまたは非アヘンによって媒介される痛覚脱失、ならびに知覚麻痺、 または痛覚の喪失を直接的に誘導すること； ３）慢性の治療、または薬物もしくはアルコールの乱用によって生じる禁断応 答の治療または予防。このような薬物には、ベンゾジアゼピン、コカイン、アル コール、およびニコチンが含まれるが、これらに限定されない； ４）ストレスおよびその薬物乱用との関係の治療； ５）CCKレセプターが関係しているかもしれない腫瘍学的疾患の治療。このよ うな腫瘍学的疾患の例には、小細胞腺癌、ならびに中枢神経系グリア細胞および ニューロン細胞の原発性腫瘍が含まれる。例としては、食道下部、胃、腸、結腸 の 腫瘍、および小細胞肺癌を含む肺癌が含まれるが、これらに限定されない； ６）例えば、発作、低糖症、脳性麻痺、一過性の脳虚血発作、心肺外科手術中 または心停止の間に起きる脳虚血、周産期窒息、癲癇、ハンチントン舞踏病、ア ルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、オリーブ橋小脳委縮、 溺れるなどして起こる酸素欠乏症、脊椎および頭部傷害、ならびに環境神経毒を 含む神経毒による中毒などの病的状態の結果として起きる神経変性疾患の治療ま たは予防。 さらに、ある種のタイプの検査および眼内手術の後、化学式（I）の化合物を 用いて、治療目的のために、縮瞳を誘導することができよう。眼内手術の例には 、人工水晶体の移植をともなう白内障手術が含まれる。CCK逆作用物質化合物を 用いて、例えば、虹彩炎、ブドウ膜炎、および外傷に伴って起きる縮瞳を子防す ることができる。逆に、作用物質の誘導体を用いて、例えば、緑内障の治療のた めに、縮瞳を誘導することができる。したがって、本発明は、医薬晶の調製にお いて用いるために、化学式（I）の化合物、またはその塩もしくはプロドラッグ を提供する。 本発明はまた、治療において用いるために、化学式（I）の化合物を提供する 。 さらなる、または代替的な態様において、本発明は、CCKおよび/またはガスト リンレセプターに関係する生理学的障害を治療または予防するための方法で、そ れを必要とする患者に、化学式（I）の化合物を、CCKおよび/またはガストリン レセプターの作用物質または逆作用物質としての用量を投与することを含む方法 を提供する。 ヒト患者において、ペプチドホルモンレセプターの作用物質または逆作用物質 として、ある化合物を用いる場合、一日当たりの用量は、通常、処方する医師が 決定する。一般的に、用量は、患者の症状の重さによるだけでなく、年齢、体重 、および各患者の反応によっても変化する。しかし、多くの場合、効果的な一日 当たりの用量は、体重当たり約0.001mg/kgから約2μｇ/kgの範囲内にあるが、好 ましくは、例えば、体重当たり約0.1mg/kgから約100mg/kgというように、約0.01 mg/kgから約200mg/kgの範囲内にあり、１回でまたは分割して投与される。当業 者は、場合によっては、これらの制限を外れた用量を使用する必要があること を理解している。 さらに、インビトロの試験が指示するところは、例えば、本発明に係る作用物 質が、ナノモル（subnanomolar）の範囲で（例えばL-740,093R）、および20nMの 範囲で（例えばL-740,093S）効果があるなど、有益である。本発明に係る作用物 質は、一回でまたは分割した用量で経口もしくは全身に、または、当業者に知ら れているその他の方法で投与することができる。その他の態様 本発明は、さらに、ペプチドホルモンレセプターの活性に影響を与える作用物 質または逆作用物質を検出するために、その活性を増幅するさらに別の方法を包 含する。例えば、増幅の仕組みには、例えば、ペプチドホルモンレセプターの調 節因子、例えば、G-蛋白質または下流のメッセンジャーとして作用する分子のい ずれかの発現を、過剰発現させるかまたは中和することにより、レセプターに誘 導されるシグナル伝達に関係する細胞内因子を修飾することが含まれる。または 、増幅の仕組みには、レセプターのシグナル伝達を検出するために用いられるシ グナル変換（transduction）アッセイ法の動力学的条件を最適化することが含ま れうる。例えば、β-ガラクトシダーゼアッセイ法などの特定のアッセイ法によ って、作用物質の活性を検出するために、インキュベートする時間を延長するこ とができ、または感度が低下するのを避けるために短くすることもできる。 ペプチドホルモンレセプターのアミノ酸配列、レセプター特異的な作用物質お よび逆作用物質、レセプターのコンフォメーション、薬理学、レセプターをコー ドする遺伝子、引き続き行われる追跡実験のための動物モデル、ならびにデータ ベースの登録番号についてのさらなる情報は、ワトソンとアーキンストール（Wa tson and Arkinstall）のG-蛋白質結合レセプター（The G-Protein Linked Rece ptor）,アカデミック出版、ニューヨーク州、1994；また、コラコフスキー（Kol akowski，L．F.）、「G-蛋白質に結合レセプターのデータベース（The G Protei n-Coupled Database）」ワールド-ワイド-ウェブ・サイト（World-Wide-Web Sit e）、GCRDB-WWWを参照して得ることができる。 上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することがで き、その精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな用途や条件に適合さ せるために、本発明を、さまざまに改変し修飾することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/18 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２６Ｇ 25/24 ６２６Ｌ 35/00 ６３５ Ａ６１Ｋ 31/5513 31/55 ６０２ 38/00 45/00 45/00 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｂ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．候補化合物が、ペプチドホルモンレセプターの作用物質であるか拮抗物質 であるかを判定するための方法であって、 （a）対応する野生型レセプターに較べて、作用物質の活性を増幅させること ができる形状のペプチドホルモンレセプターに、候補化合物を接触させる段階と （b）該候補化合物の非存在下における該形状物の活性と比較して、該候補化 合物の存在下で該形状物の活性を測定する段階であって、該活性の変化によって 、該候補化合物が、作用物質であるか拮抗物質であるかが示される段階とを含む 、方法。 ２．レセプターの形状が、変異レセプターである、請求項１記載の方法。 ３．レセプターの形状が、対応するヒトの野生型レセプターの基礎活性よりも 高い基礎活性を有するものである、請求項１記載の方法。 ４．レセプターの形状が、構成的に活性のあるレセプターである、請求項１記 載の方法。 ５．レセプターの形状が、非ヒトレセプターである、請求項１記載の方法。 ６．レセプターの形状が、非ヒト野生型レセプターである、請求項５記載の方 法。 ７．レセプターの形状が、天然の変異レセプターである、請求項１記載の方法 。 ８．活性の上昇により、候補化合物が正の作用物質であることが示される、請 求項１記載の方法。 ９．正の作用物質が、不完全な作用物質である、請求項１記載の方法。 10．活性の低下により、候補化合物が逆作用物質であることが示される、請求 項１記載の方法。 11．実質的な活性がないことにより、候補化合物が拮抗物質であることが示さ れる、請求項１記載の方法。 12．作用物質が、ペプチド作用物質である、請求項１記載の方法。 13．作用物質が、ペプトイド作用物質である、請求項１記載の方法。 14．作用物質が、非ペプチド作用物質である、請求項１記載の方法。 15．測定段階に、既知の正または逆の作用物質の存在がさらに含まれ、該既知 の作用物質の活性の減衰により、候補化合物が拮抗物質であることが示される、 請求項１記載の方法。 16． リガンドにおける作用物質の活性を検出するのに適当な形状のペプチド ホルモンレセプターを単離する方法であって、 （a）第一のペプチドホルモンレセプターの機能的ドメイン領域を、第二のペ プチドホルモンレセプターの対応する機能的ドメイン領域と交換する段階と （b）対応する野生型ヒトレセプターの、該作用物質のシグナルを増幅させる 能力と比較して、該第一のペプチドホルモンレセプターの、該作用物質のシグナ ルを増幅させる能力を測定する段階であって、該第一のペプチドホルモンレセプ ターにおける増幅により、該第一のペプチドホルモンレセプターが、リガンドに おける作用物質の活性を検出するのに適していることが示される段階とを含む、 方法。 17．第二のペプチドホルモンレセプターが、第一のペプチドホルモンレセプタ ーではなく、異なる第二のメッセンジャー経路に関連している、請求項16記載の 方法。 18．作用物質の固有の活性を増幅させる形状のペプチドホルモンレセプターを 単離する方法であって、 （a）本来のアミノ酸を置換アミノ酸に置き換えることにより、該レセプター の一連の変異型を構築する段階と （b）対応する野生型ヒトレセプターの、該作用物質のシグナルを増幅させる 能力と比較して、第一のペプチドホルモンレセプターの、該作用物質のシグナル を増幅させる能力を測定する段階であって、第一のペプチドホルモンレセプター における増幅により、該第一のペプチドホルモンレセプターが、リガンドにおけ る作用物質の活性を検出するのに適していることが示される段階とを含む、方法 。 19．置換段階に、レセプターの細胞内ドメインにあるアミノ酸を置換すること が含まれる、請求項18記載の方法。 20．置換段階に、レセプターの細胞内部位に隣接した膜通過ドメインにあるア ミノ酸を置換することが含まれる、請求項18記載の方法。 21．置換アミノ酸が、本来のアミノ酸とは異なる電荷を有する、請求項18記載 の方法。 22．置換アミノ酸が、グルタミン酸である、請求項18記載の方法。 23．ペプチドホルモンレセプターの非ペプチド作用物質を、作用物質として有 効な量、哺乳動物に投与することによって、ペプチドホルモンレセプターに関係 する生理学的な障害を治療または予防するために該作用物質を使用することをさ らに含む、請求項１記載の方法。 24．ペプチドホルモンレセプターの非ペプチド作用物質を、作用物質として有 効な量、哺乳動物に投与することを含む、ペプチドホルモンレセプターに関係す る生理学的な障害を治療または子防するための方法。 25．作用物質が、ベンゾジアゼピンまたはその誘導体である、請求項24記載の 方法。 26．化合物が、3(R,S)-アミノ-1,3-ジヒドロ-5-((1S,4S)-5-メチル-2,5-ジア ザビシクロ[2,2,1]ヘプタン-2-イル)-2H-1-プロピル-1,4-ベンゾジアゼピン-2- オンである、請求項25記載の方法。 27．化合物が、(-)-N-[5-(3-アザビシクロ[3,2,2]ノナン-3-イル)-2,3-ジヒド ロ-1-メチル-2-オキソ-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-3-イル]-N'-[3-メチルフェニ ル]尿素である、請求項25記載の方法。 28．化合物が、(+)-N-[5-(3-アザビシクロ[3,2,2]ノナン-3-イル)-2,3-ジヒド ロ-1-メチル-2-オキソ-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-3-イル]-N'-[3-メチルフェニ ル]尿素である、請求項25記載の方法。 29．ペプチドホルモンレセプターが、CCK-B/ガストリンレセプターである、請 求項23記載の方法。 30．ペプチドホルモンレセプターが、CCK-Aレセプターである、請求項23記載 の方法。 31．生理学的障害が新生物である、請求項23記載の方法。 32．新生物が原発性腫瘍である、請求項23記載の方法。 33．MHA21/35として同定されたCCK-Aレセプターの変異型をコードしている核 酸。 34．請求項33記載の核酸によってコードされているポリペプチド。 35．MH40、MH128、MH156、MH162、MH31、MH131、MH13、MH130、MH129、および MH72からなる群より選択される、CCK-B/ガストリンレセプターの変異型をコード している核酸。 36．請求項35記載の核酸によってコードされているポリペプチド。 37．変異型がMH162である、請求項35記載の核酸。 38．請求項37記載の核酸によってコードされているポリペプチド。