JP2000230000A - 一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレ
ン−ヘモグロビン結合体、その製造方法および該結合体
を含有する人工酸素運搬体を提供する。 【解決手段】 ヘモグロビン中にアミノ基にポリオキシ
アルキレン誘導体が結合し、またシステイン残基のチオ
ール基に一酸化窒素代謝物が結合した分子量が１００，
０００〜２，０００，０００ダルトンであるヘモグロビ
ン結合体、その製造方法および該ヘモグロビン結合体を
含有する酸素運搬体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、代替血液や臓器かん流
液に有用な一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレン−
ヘモグロビン結合体、該結合体の製造方法および該結合
体を含有する酸素運搬体に関し、詳しくは血中での安定
性が高く、しかも体内注入時に血圧上昇等の問題の無い
セルフリーヘモグロビン系酸素運搬体に関する。

【０００２】

【従来の技術】人や牛の赤血球から抽出したセルフリー
ヘモグロビンを赤血球輸血の代替酸素運搬体として利用
する試みが現在盛んに行われている。セルフリーヘモグ
ロビンをそのまま赤血球輸血代替酸素運搬体として用い
るためには、種々の問題を解決する必要がある。まず赤
血球溶血液には膜断片であるストローマ（ｓｔｒｏｍ
ａ）が残存し、血液凝固を惹起する。この分野では１９
６７年にＲａｂｉｎｅｒらがヘモグロビン溶液からスト
ローマを除去したストローマフリーヘモグロビンの製造
方法を確立し（Ｒａｂｉｎｅｒ ＳＦ ｅｔａｌ，Ｅｖ
ａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔｒｏｍａ−ｆｒｅｅ
ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ
ｕｓｅ ａｓ ａ ｐｌａｓｍａｅｘｐａｎｄｅｒ，Ｊ
Ｅｘｐ Ｍｅｄ１９６７；１２６：１１２７−１１４
２）、播種性血管内凝固症候群（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔ
ｅｄ ＩｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒＣｏａｇｕｌａｔｉ
ｏｎ：ＤＩＣ）の問題がほぼ解決した。次に、ヘモグロ
ビン分子が腎糸球体から漏出し腎尿細管に毒性を示す。
１９６９年にＢｕｎｎらがヘモグロビンに分子内架橋を
導入することによって糸球体からのヘモグロビンの排泄
を回避できることを見出し（Ｂｕｎｎ Ｆ ｅｔａｌ，
Ｔｈｅ ｒｅｎａｌｈａｎｄｌｉｎｇ ｏｆ ｈｅｍｏ
ｇｌｏｂｉｎ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１９６９；１２９：
９０９−９２４）、続いてポリエチレングリコールでヘ
モグロビンを化学修飾し高分子化することによって尿中
への排出を防止し、血管内半減期を延長できること（特
公平５−６４１２８号公報，特公平６−７６３３３号公
報等）などが判明し、腎毒性の問題もほぼ解決された。
これらの技術改良によりセルフリーヘモグロビンの赤血
球代替酸素運搬体としての研究が進み、すでに米国では
数種類のものが臨床試験に入っている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、こうしたヘモ
グロビン誘導体の研究が進むうちに、新たに２つの問題
点が浮上してきた。血管収縮に伴う血圧上昇反応、腸管
収縮に伴う腹痛である。

【０００４】第１の血圧上昇反応の原因は、ヘモグロビ
ン誘導体投与によって引き起こされる細動脈を中心とし
た血管収縮がその主なものと考えられている。この現象
は通常の赤血球輸血を行った場合には認められず、また
細動脈の収縮は酸素授受が行なわれる毛細血管への血流
を抑制するため、好ましく無いと考えられている。この
血管収縮については、血管内皮由来弛緩因子〔ＥＤＲ
Ｆ：一酸化窒素または一酸化窒素放出物質と考えられて
いる。（佐久間一郎．血管弛緩因子としてのＮＯ．実験
化学１９９１；９：１３４７−１３５１）〕とセルフリ
ーヘモグロビンが反応し、ＥＤＲＦが除去されるために
血管が収縮すると考えられている（Ｍｏｔｔｅｒｌｉｎ
ｉ Ｒ ｅｔａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｎｉｔｒｉ
ｃｏｘｉｄｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔ
ｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｒａｎｓｆｕｉｏｎ
Ｍｅｄ Ｒｅｖ１９９６；１０：７７−８４）。特
に、ヘモグロビン分子が血管内皮間隙から内部に取り込
まれＥＤＲＦを血管壁内部で消去することが重要である
（Ｎａｋａｉ Ｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｅｒｍｅａｂｌｌ
ｉｔｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｈｅ
ｍｏｇｌｏｂｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｃｒｏ
ｓｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃ
ｅｌｌｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ．Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ
Ｍｅｄ １３２：３１３−３１９，１９９８．）。

【０００５】次に、近年になり人体での臨床試験が開始
され、セルフリーヘモグロビン誘導体による腸管収縮が
新たな問題として注目されはじめている。この原因はま
だ特定されていないが、多くは分子内架橋型ヘモグロビ
ンによる臨床試験で観察され、これらはやはり血管内皮
などより漏洩したセルフリーヘモグロビンにより、非ア
ドレナリン作働性非コリン作働性神経伝達物質の候補で
ある一酸化窒素が除去されることが原因と推定されてい
る（Ｍｕｒｒａｙ ＪＡ，ｅｔａｌ Ｔｈｅｅｆｆｅｃ
ｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈ
ｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｏｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｍ
ｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎｈｕｍａｎｓ．Ｇ
ａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９５；１０９：
１２４１−１２４８）。

【０００６】これらの副作用は、いずれもヘモグロビン
による一酸化窒素の消去が原因であることから、一酸化
窒素代謝物の運搬と放出性を付与された一酸化窒素代謝
物結合ヘモグロビンが効果的であるとの提案も行われて
いる（Ｓｔａｍｌｅｒ ；ＷＯ９６／３０００６）。一
酸化窒素代謝物結合ヘモグロビンはヘモグロビンのβ鎖
のシステイン残基に一酸化窒素代謝物が可逆的に結合さ
れたヘモグロビン修飾体であり、ヘモグロビンのヘムに
よる一酸化窒素消去を代償して生理活性を有する一酸化
窒素代謝物を放出可能である。しかし、この一酸化窒素
代謝物結合ヘモグロビンは分子内架橋型ヘモグロビンで
あり分子量が小さいため、尿中へ排泄されやすく血管内
半減期が短いという問題点が残っている。

【０００７】このようにヘモグロビン修飾体は酸素運搬
体としての赤血球代替輸血や臓器還流液などの用途にき
わめて有望でありながら、以上のように、排泄されにく
く体内半減期が長く、しかも血管収縮および腸管収縮と
いった副作用のないものに関しては、未だ提案されてい
ないのが実情である。

【０００８】このため安全で自由に使用でき、しかも長
期保存可能なセルフリーヘモグロビン誘導体の開発が待
ち望まれている。

【０００９】本発明の目的は、腎糸球体や血管内皮から
の漏出が極めて制限され、しかも血管内皮由来の一酸化
窒素の除去を代償しうる一酸化窒素代謝物放出性を有し
た、安全で自由に使用できる長期保存可能な酸素運搬体
を提供することにある。また本発明の別の目的は、本発
明の一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグ
ロビン結合体（以下、「修飾体」と称することもある）
を特定濃度含有する酸素運搬液を提供することにあり、
簡便に酸素運搬液を調整できるので、緊急時の赤血球代
替輪血や臓器還流液として有用である。

【００１０】

【発明を解決するための手段】本発明者らは、腎毒性や
血圧上昇、腹痛などの副作用の無い安全で自由に使用で
きる酸素運搬体について鋭意検討した結果、人または牛
などに由来する赤血球から抽出したセルフリーヘモグロ
ビンに、特定のポリオキシアルキレン誘導体と、一酸化
窒素代謝物とを結合させた分子量１００，０００〜２，
０００，０００ダルトンの誘導体がきわめて有望な酸素
運搬体であることを見出し、本発明に到達した。

【００１１】すなわち本発明は、ヘモグロビン中の結合
可能なアミノ基の総数の１０〜３０％にポリオキシアル
キレン誘導体が結合し、システイン残基のチオール基の
総数の１０〜１００％に一酸化窒素代謝物が結合した分
子量が１００，０００〜２，０００，０００ダルトンで
ある一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグ
ロビン結合体（修飾体）である。

【００１２】さらに詳しくは、式（１）のポリオキシア
ルキレン誘導体を用いることを特徴とする上述の一酸化
窒素代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合
体であり、

【００１３】

【化２】

【００１４】（ただし、Ｂは２〜６個の水酸基を持つ化
合物の残基、ＡＯは炭素数３または４のオキシアルキレ
ン基、Ｒは炭素数１〜３０の炭化水素基または水酸基、
ｋとｍはオキシエチレン基の平均付加モル数で各々０≦
ｋ≦５００、０≦ｍ≦５００、かつ２０≦ｋ＋ｍ≦１０
００を満足する数、１とｎはオキシアルキレン基の平均
付加モル数で各々０≦１≦１０、０≦ｎ≦１０、かつ０
≦１＋ｎ≦１０を満足する数、０≦ａ≦６、１≦ｂ≦
６、かつ２≦ａ＋ｂ≦６を満足する数である。Ｘは式
（２）、式（３）、式（４）または式（５）に示すアミ
ノ基と結合できる官能基である。）

【００１５】−（ＣＨ_２）_ｃ−ＣＯＯＹ …（２） （ただし、ｃは０〜２、Ｙは水素またはｐ−ニトロフェ
ニル基またはＮ−ヒドロキシサクシンイミド残基であ
る。）

【００１６】 −ＯＣ−（ＣＨ_２）_ｄ−ＣＯＯＹ …（３） （ただし、ｄは２〜６、Ｙは水素またはＮ−ヒドロキシ
サクシンイミド残基である。）

【００１７】−（ＣＨ_２）_ｅ−ＣＨＯ …（４） （ただし、ｅは１〜２である。）

【００１８】−ＣＯＺ…（５） （ただし、Ｚはイミダゾール基である。）

【００１９】また別の本発明は、一酸化窒素代謝物とし
て低分子チオール体のニトロソ体、例えばｓ−ニトロソ
グルタチオンを用いることを特徴とする前述の一酸化窒
素代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体
である。

【００２０】また更に別の本発明は、一酸化窒素代謝物
−ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体を１０ｇ
／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ含有することを特徴とする酸素運搬
体である。

【００２１】更にまた別の本発明は、１段法、すなわ
ち、ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体に、一
酸化窒素代謝物を反応させること特徴とする、ヘモグロ
ビン中の結合可能なアミノ基の総数の１０〜３０％にポ
リオキシアルキレン誘導体が結合し、システイン残基の
チオール基の総数の１０〜１００％に一酸化窒素代謝物
が結合した分子量が１００，０００〜２，０００，００
０ダルトンである一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキ
レン−ヘモグロビン結合体の製造方法である。

【００２２】そして、更に別の本発明は、２段法、すな
わち、ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体に、
一酸化窒素代謝物を反応させ、更にポリオキシアルキレ
ン誘導体を反応させることを特徴とする、ヘモグロビン
中の結合可能なアミノ基の総数の１０〜３０％にポリオ
キシアルキレン誘導体が結合し、システイン残基のチオ
ール基の総数の１０〜１００％に一酸化窒素代謝物が結
合した分子量が１００，０００〜２，０００，０００ダ
ルトンである一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレン
−ヘモグロビン結合体の製造方法である。

【００２３】

【発明の実施の形態】本発明に使用するセルフリーヘモ
グロビンは、人あるいは牛など由来のものであればその
ままでも分子内架橋させたものでも使用できるが、倫理
的面を考慮すれば人由来のヘモグロビンを使用するのが
好ましく、さらに好ましくは、ピリドキサール−５’−
燐酸、２−ノルー２−ホルミルピリドキサノール−５’
−燐酸などのピリドキサール燐酸類、あるいはピリドキ
サール−５’−硫酸などのピリドキサール−硫酸類、グ
リセリン−２，３−ジ燐酸などのグリセリン燐酸類、グ
ルコース−６−燐酸、アデノシン−５’−燐酸などの糖
燐酸などで分子内架橋させたものを用いるのが好まし
い。

【００２４】また、ヘモグロビン中の結合可能なアミノ
基（リジン残基のアミノ基やＮ末端アミノ基）数は、使
用するヘモグロビンの種類によって異なる。人ヘモグロ
ビンの場合は４個のＮ末端アミノ基と４４個のリジン残
基のアミノ基があり結合可能なアミノ基としては合計４
８個、牛ヘモグロビンの場合は４個のＮ末端アミノ基と
４６個のリジン残基のアミノ基があり結合可能なアミノ
基としては合計５０個あると考えられる。また使用する
ポリオキシアルキレン誘導体の官能基数（ｂ）によって
も異なるため、アミノ基に結合させるポリオキシアルキ
レン誘導体の数は特定できないが、少なすぎると細胞か
らの漏れを充分に防止するまで目的化合物の分子量を上
げることが出来なくなるので好ましくなく、他方、過多
に結合させようとすると過激な反応条件が必要となりヘ
モグロビンの立体構造を壊すため酸素運搬能を低下させ
るので好ましくない。このため、結合可能なアミノ基の
総数の１０〜３０％の範囲に限定される。好ましい範囲
は１５〜２５％である。

【００２５】また、ヘモグロビン中に２個ある結合可能
なシステイン残基のチオール基に結合させる一酸化窒素
代謝物の数は、少なすぎると血圧上昇作用の抑制効果が
充分ではない。血圧上昇作用を抑制するためにはシステ
イン残基由来のチオール総数の１０％〜１００％の一酸
化窒素代謝物を結合させる必要がある。本発明に使用で
きる一酸化窒素代謝物としては、低分子チオール体のｓ
−ニトロソ体なら任意のものを使用できるが、Ｎ−Ａｃ
ｅｔｈｙｌ−ＤＬ−ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ（Ｎ−
アセチル−ペニシルアミン）、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−
ｓｙｓｔｅｉｎ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）、ｓ
−ニトロソシステイン、ｓ−ニトロソグルタチオンなど
を列挙することが出来る。しかしながら、反応性等を考
慮するとｓ−ニトロソグルタチオンを使用すると反応性
が良いので好ましい。

【００２６】本発明で得られる一酸化窒素代謝物−ポリ
オキシアルキレン−ヘモグロビン結合体の分子量の範囲
は、１００，０００〜２，０００，０００ダルトンであ
り、１００，０００ダルトンより小さいと血管内皮等か
らの漏れが起こりやすくなり、また２，０００，０００
ダルトンを超えると粘度が高くなりすぎるため取り扱い
が困難になる。

【００２７】好ましい範囲は、１５０，０００〜１，５
００，０００ダルトンである。なお、分子量は最大ピー
クのピークトップの分子量である。

【００２８】また、式（１）においてＢで示される２〜
６個の水酸基を持つ化合物の残基としては、エチレング
リコール、プロピレングリコール、ブチレングリコー
ル、グリセリン、トリメチロールプロパン、ジグリセリ
ン、ペンタエリスリトール、トリグリセリン、ソルビト
ール、テトラグリセリンなどの残基が列挙される。

【００２９】また、ＡＯで示される炭素数３または４の
オキシアルキレン基としては、オキシプロピレン基、オ
キシイソプロピレン基、オキシブチレン基、オキシイソ
ブチレン基が挙げられる。

【００３０】また、Ｒで示される炭素数１〜３０の炭化
水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イ
ソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、
イソペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、オクチ
ル基、イソオクチル基、ノニル基、イソノニル基、デシ
ル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ヘ
キサデシル基、オクタデシル基、オクタデセニル基、エ
イコシル基、ドコシル基、テトラコシル基、ヘキサコシ
ル基、オクタコシル基、トリアコンチル基などがあげら
れ、目的に合わせてどれを使用しても良いが、炭素数が
大きいと界面活性能により、泡立ち等の問題がおきやす
くなるため、炭素数の好ましい範囲は１〜４、さらに好
ましくは１〜２である。

【００３１】オキシエチレン基はヘモグロビン誘導体の
周囲に親水層を形成させるために必須であり、その付加
モル数はｋとｍであらわされ、少なすぎると親水層の大
きさが充分でなくなるため腎糸球からの漏洩が多くなる
ので好ましくなく、大きすぎると粘度が上昇し誘導体の
ハンドリングが困難になるので好ましくない。このため
本発明の目的に使用できる範囲は０＜ｋ、ｍ＜５００か
つ２０＜ｋ＋ｍ＜１０００の範囲であり、好ましくは０
＜ｋ、ｍ＜５００かつ５０＜ｋ＋ｍ＜８０００である。

【００３２】オキシアルキレン基は、ポリオキシアルキ
レン誘導体とヘモグロビンとの結合部位の安定性を増す
ために導入するものであって、１とｎであらわされるオ
キシアルキレン基の付加モル数が多くなりすぎると親水
層の形成を妨害するので０＜１、ｎ＜１０かつ０＜１＋
ｎ＜１０の範囲に限定される。好ましい範囲は０＜１、
ｎ＜４かつ０＜１＋ｎ＜４である。

【００３３】ａはヘモグロビンと結合できないポリオキ
シアルキレン鎖の数を示し、ｂはヘモグロビンと結合で
きるポリオキシアルキレン鎖の数を示す。ｂはヘモグロ
ビンとオキシアルキレン誘導体を結合させるために必ず
１は必要であり、ｂの数を２以上にすると一酸化窒素代
謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体同士
を部分的に架橋させ分子量を効率的に増加させることが
可能となる。しかしｂの数を増やしすぎると架橋が進み
すぎ、ゲル化等の問題が起こりやすくなるため、好まし
いｂの範囲は１〜４である。

【００３４】Ｘはヘモグロビンのリジン残基のアミノ基
やＮ末端アミノ基と結合できるものならば任意の官能基
が使用できるが、反応性等を考慮すると、式（２）また
は式（３）に示される活性化カルボン酸型、または式
（４）に示されるアルデヒド型、または式（５）に示さ
れるイミダゾール型を使用するのが好ましい。また、特
に好ましくは式（２）または式（３）に示される活性化
カルボン酸型が好ましい。

【００３５】本発明の一酸化窒素代謝物−ポリオキシア
ルキレン−ヘモグロビン結合体は、凍結乾燥した状態で
は極めて安定に酸素運搬能を維持するので、簡便に長期
保存が可能であり、実際の使用時に生理食塩水等で希釈
して赤血球代替輸血や臓器還流液などに用いることがで
きる。このとき一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレ
ン−ヘモグロビン結合体の濃度は、使用する一酸化窒素
代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体の
分子量や骨格中に組み込まれたポリオキシアルキレン誘
導体の構造により異なり、また使用目的の酸素運搬能に
よっても異なるので必ずしも特定できないが、濃度が１
０ｇ／Ｌより少ないと溶液中のヘモグロビン誘導体の濃
度が低くなり過ぎ酸素運搬液の酸素運搬能が充分でなく
なる恐れがあり、２００ｇ／Ｌを超えると酸素運搬液の
粘度が高くなりすぎ取り扱いが困難になる恐れがあるた
め１０〜２００ｇ／Ｌである。好ましくは５０〜１５０
ｇ／Ｌであり、特に好ましくは６０〜１２０ｇ／Ｌであ
る。

【００３６】本発明で使用する式（１）のポリオキシア
ルキレン誘導体は、たとえば以下の方法で得ることがで
きる。

【００３７】Ｂで示される２〜６個の水酸基を持つ化合
物に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、金属ナトリ
ウム、ナトリウムメチラートなどのアルカリ触媒を用い
て常法にしたがってエチレンオキシドと必要に応じて炭
素数３または４のアルキレンオキシドを付加反応させた
後、塩酸、燐酸などの鉱酸を用いてアルカリ触媒を中和
し、脱水後、生成する中和塩をろ過により除去して、末
端に水酸基を持つ一般式（６）の化合物を得る。

【００３８】

【化３】

【００３９】次に、得られた式（６）の化合物の末端水
酸基を目的に合わせて、式（２）、式（３）、式（４）
または式（５）であるアミノ基と結合できる官能基に変
更する。

【００４０】このとき使用できる方法としては、公知の
各種の方法を使用できる。

【００４１】たとえば、水酸基を式（２）の末端化合物
に変更するには、アルカリ触媒の存在下、モノクロル酢
酸、モノブロモ酢酸などのハロゲン化カルボン酸と反応
させる方法や水酸基にアルカリ触媒の存在下アクリロニ
トリルを反応させた後加水分解する方法、過酸化水素や
過マンガン酸あるいは白金やパラジウムの炭素担持触媒
を用いて末端水酸基を酸化する方法で、末端がカルボン
酸の化合物を得た後ジシクロヘキシルカルボジイミド等
の脱水剤を用いてＮ−ヒドロキシサクシンイミドとのエ
ステルを作ることにより得ることができる。また、別の
方法としてはホスゲンなどのクロロホルメートと反応さ
せて末端を酸クロライドの形にしたのちＮ−ヒドロキシ
サクシンイミドと反応させてもよい。また、水酸基に塩
基性触媒の存在下、直接ｐ−ニトロフェニルクロロホル
メートなどの活性化クロロホルメートを反応させても良
い。これらについては、公知の方法が数多くありそのど
の方法を用いても良い。

【００４２】また水酸基を式（３）の末端化合物に変更
するには、無水コハク酸や無水グルタル酸などの２塩基
酸無水物をそのまま、あるいは塩基性触媒の存在下に反
応させて末端がカルボン酸の化合物とした後、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド等の脱水剤の存在下Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミドと反応させて活性化エステルとする
ことにより得ることができる。

【００４３】また、水酸基を式（４）の末端化合物に変
更するには、ジメチルスルホキシドおよび無水酢酸の存
在下、または過マンガン酸カリウムの存在下で末端水酸
基を酸化して得ることができる。

【００４４】また、水酸基を式（５）の末端化合物に変
更するには塩基性触媒の存在下カルボニルジイミダゾー
ルを反応させて得ることができる。

【００４５】本発明の一酸化窒素代謝物−ポリオキシア
ルキレン−ヘモグロビン結合体を得るには、まず前述の
方法等により得られた式（１）の化合物（ポリオキシア
ルキレン誘導体）とヘモグロビンを反応させて、ポリオ
キシアルキレン−ヘモグロビン結合体（以下、便宜上、
「前駆修飾体」という）を得る。

【００４６】次いで、この前駆修飾体をｐＨ７から１０
の緩衝液中で０〜４０℃の温度条件下、使用したヘモグ
ロビン１モルに対して２から１０倍モルの一酸化窒素代
謝物（例えば、ｓ−ニトロソグルタチオンなど）と反応
させて、一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘ
モグロビン結合体（以下、「目的ヘモグロビン修飾体」
という）を得る。

【００４７】この場合、適当な限外ろ過膜で未反応ヘモ
グロビンや未反応ポリオキシアルキレン誘導体、一酸化
窒素代謝物、緩衝塩などを除去する。またこの後、必要
に応じて凍結乾燥させて粉体としてもよい。

【００４８】或いは、先ず式（１）のポリオキシアルキ
レン誘導体とヘモグロビンを反応させて、ポリオキシア
ルキレン−ヘモグロビン誘導体（以下、「前駆予備修飾
体」という）を得、次いでこの前駆予備修飾体に上記と
同様に一酸化窒素代謝物を反応させ、更に式（１）の化
合物と反応させて、一酸化窒素代謝物−ポリオキシアル
キレン−ヘモグロビン結合体（目的ヘモグロビン修飾
体）を得る。この場合も、上述と同様に未反応物などを
限外ろ過膜で除去する。また、この後、必要に応じて、
凍結乾燥させて粉体とする。

【００４９】上記において、前駆修飾体または前駆予備
修飾体を得るに当たっては、公知方法（例えば特公平６
−７６３３３号公報、特公平５−６４１２８号公報等）
に準じて反応させることによって行う。

【００５０】ヘモグロビンと式（１）のポリオキシアル
キレン誘導体との反応時の比率は、ポリオキシアルキレ
ン誘導体の構造や目的とする分子量によっても異なるの
で必ずしも特定できないが、ヘモグロビン１モルに対し
て０．５から７０モル程度、好ましくは１から２０モル
である。

【００５１】図面を概説すると次のとおりである。

【００５２】図１は、ヒト由来ヘモグロビンを使用した
ｓ−ニトロソグルタチオン−ポリオキシエチレン−ヘモ
グロビン結合体のゲルパーミュエーションクロマトグラ
フィーの測定成果を示す。

【００５３】図２は、ｓ−ニトロソグルタチオン−ポリ
オキシエチレン−ヘモグロビン結合体におけるｓ−ニト
ロソグルタチオンの導入率の測定結果を示す。

【００５４】図３は、ウシ由来ヘモグロビンを使用した
ｓ−ニトロソグルタチオン−ポリオキシエチレン−ヘモ
グロビン結合体のゲルパーミュエーションクロマトグラ
フィーの測定結果を示す。

【００５５】図４は、培養ウシ内皮単層を使用した透過
性測定法の簡略説明図である。

【００５６】

【発明の効果】本発明の一酸化窒素代謝物−ポリオキシ
アルキレン−ヘモグロビン結合体（目的ヘモグロビン修
飾体）は、ヘモグロビンにポリオキシアルキレンを結合
させ分子量を一定以上にしたことにより、ヘモグロビン
の酸素運搬能力を低下させずかつ安定性を高くし、腎糸
球や血管内皮からの漏れを無くし、しかも一酸化窒素代
謝物を一定量結合させたことにより体内注入時の血圧上
昇等の問題がおきないため、簡便かつ安全に赤血球代替
輸血や臓器還流液として使用できる。

【００５７】

【実施例】以下製造例、実施例および比較例により本発
明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの例示に
限定されるものではない。

【００５８】製造例１ ポリエチレングリコール＃６０００（日本油脂（株）
製；分子量８５００ダルトン）８５ｇとトルエン１００
ｍｌおよび酢酸ナトリウム０．２ｇを窒素吹き込み管・
撹拌装置・温度計・冷却管−検水管を取り付けた４つ口
フラスコに入れ、８０℃まで昇温し、完全に溶解するま
で撹拌した。ついで窒素ガスを吹き込みながら溶剤（ト
ルエン）が還流しはじめるまでゆっくりと加熱し、その
まま還流を１時間続けた。ついで検水管に析出してきた
水を廃棄し、検水管を４つ口フラスコから取り外し、冷
却管を再び取り付けた。

【００５９】次に無水コハク酸２．４ｇを入れ、１０５
℃で３時間撹拌を続けた。ついで１００ｍｍＨｇ以下の
減圧下、未反応の無水コハク酸およびトルエンを留去し
た。８０℃まで冷却したのち減圧濾過により過剰の酢酸
ナトリウムを除去して、７８ｇのポリエチレングリコー
ルジサクシネートを得た。

【００６０】得られたポリエチレングリコールジサクシ
ネートの酸価は１２．９、鹸化価は２６．１であった。

【００６１】ついで、ポリエチレングリコールジサクシ
ネート１７．４ｇとジメチルホルムアミド２００ｍｌを
共栓付き三角フラスコに入れ、マグネチックスターラー
で撹拌しながら４０℃に昇温した。ついでジシクロヘキ
シルカルボジイミド０．９８ｇとＮ−ヒドロキシサクシ
ンイミド０．５６ｇを入れ１２時間撹拌した。次に反応
混合液をジエチルエーテル１Ｌ中に撹拌しながら滴下し
て結晶を析出させ、加圧下ろ過して、ポリエチレングリ
コール＃６０００の活性化エステルを１６．５ｇの白色
結晶として得た。

【００６２】得られた化合物の構造式を表１に示す。

【００６３】

【表１】

【００６４】製造例２ ポリオキシエチレングリセリルエーテル（ユニオックス
Ｇ−２０００ 日本油脂（株）製；分子量２０００ダル
トン）１０００ｇを撹拌装置・温度計・窒素吹き込み管
のついた５Ｌオートクレーブに入れ、６０℃に昇温し
た。つぎに、ナトリウムメチラート９０ｇを入れ、１０
０℃で３時間１００ｍｍＨｇ以下の減圧下で脱メタノー
ルを行った。ついで温度を１１５℃に上げ、モノブロモ
酢酸メチル２５２ｇを滴下槽より徐々に圧入した。全量
圧入後、同温度でさらに５時間撹拌を続けた。

【００６５】ついで温度を３０℃に下げ、３０％水酸化
カリウム水溶液２００ｇを入れ、再び温度を８０℃に上
げ５時間撹拌を続け、鹸化反応を行った。

【００６６】鹸化反応終了後、反応液を全量４つ口フラ
スコに取りだし、撹拌しながら１７．５％塩酸を用いて
ｐＨを２に調整した。ついでクロロホルム１Ｌで３回ポ
リエチレングリコールモノグリセリルエーテルの末端カ
ルボン酸誘導体を抽出した。得られたクロロホルム層を
エバポレーターで濃縮乾固し、９８２ｇの誘導体を得
た。

【００６７】ついで得られた誘導体２６ｇを水２００ｇ
に溶解したのち、陰イオン交換樹脂Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ａ
ＧＩＸ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，ＵＳＡ）にかけ、末端カルボン酸誘導体を一旦樹脂
に吸着させ、イオン交換水で吸着されなかった未反応ポ
リオキシエチレングリコールモノグリセリルエーテル等
の不純物を洗い流し、ついで吸着物を０．０５規定塩酸
１Ｌで溶出させた。溶出液に食塩２３０ｇとクロロホル
ム１Ｌを加え、生成物を再びクロロホルム層に抽出し
た。得られたクロロホルム層をエバポレーターで濃縮乾
固し、２２．１ｇの精製末端カルボン酸誘導体を得た。
得られた末端カルボン酸誘導体の酸価は８１．３であっ
た。

【００６８】ついで、ジシクロヘキシルカルボジイミド
とＮ−ヒドロキシサクシンイミドとを用いて製造例１と
同様の方法で末端カルボン酸を活性エステルとした。

【００６９】得られた化合物の構造式を表１に示す。

【００７０】製造例３ メトキシポリエチレングリコール（分子量２０，０００
ダルトン）２０ｇをクロロホルム１００ｍｌに溶解し、
ピリジン１０ｍｌおよびｐ−ニトロフェニルクロロホル
メート０．３ｇを加え、室温で５時間反応させた。つい
で、反応液を１Ｌのジエチルエーテルに撹拌しながら滴
下し、析出する結晶をろ別後、デシケーター中で乾燥し
て１９．８ｇのメトキシポリエチレングリコールモノｐ
−ニトロフェニルホルメートを得た。

【００７１】得られた化合物の構造式を表１に示す。

【００７２】実施例１ 期限切れ輸血用血液の赤血球１００ｍｌを０．９％食塩
水１００ｍｌに浮遊させて遠心分離機を用いて４℃で４
回洗浄した。ヒト洗浄赤血球６０ｍｌを１８０ｍｌの注
射用水を用いて溶血し孔径０．２２μのフィルター（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いて膜成分を
除いた。さらに残存する膜成分は遠心分離機で６０００
ｒｐｍで１時間遠心分離して除いた。

【００７３】得られたヒトヘモグロビン３．２９ｇ
（０．０５１ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌのリン酸０．１
モル緩衝液（ｐＨ８．６）に溶解し、ついで製造例１で
製造した活性化ポリオキシエチレン４．５４ｇ（０．５
１ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンで酸素分圧１ｍｍＨｇま
で引き下げ、４℃で２時間反応させて、ポリオキシエチ
レン−ヘモグロビン結合体（いわゆる前駆修飾体）を得
た。

【００７４】ついで、この前駆修飾体の反応液に濃度１
ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）および０．
５ｍＭのＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）を加
え、さらに燐酸２ナトリウムを用いて反応液のｐＨを
８．６に調整した。ついでｓ−ニトロソグルタチオン
（一酸化窒素代謝物）８５．７ｍｇ（０．２５５ｍｍｏ
ｌ）を加え４℃で１２時間反応させた。

【００７５】反応後、反応液を分画分子量３００００ダ
ルトンの限外ろ過膜（アミコン社製、ＰＭ３０）にか
け、未反応ポリエチレングリコール誘導体が１００ｐｐ
ｍ以下になるまで繰り返し精製した。

【００７６】次に得られた反応液を凍結乾燥して５．９
５ｇの本発明の化合物であるｓ−ニトロソグルタチオン
−ポリオキシエチレン−ヘモグロビン結合体（いわゆる
目的ヘモグロビン修飾体）を得た。

【００７７】得られた化合物のゲルパーミュエーション
クロマトグラフィーの結果を図１に示す。

【００７８】ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ
ーの測定条件は次の通りである。 カラム：Ｔｏｓｏ ＳＷ４０００ＸＬ 展開液：５０ｍＭ ＮＰ、０．２モルＮａＣｌ、ｐＨ
６．８ 流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ サンプル注入量：５μＬ（０．５％） 測定吸光度：４２０ｎｍ

【００７９】図１より、得られた生成物中には原料とし
て用いた未反応ヘモグロビンや未反応ポリオキシエチレ
ンが無いことがわかる。

【００８０】また、得られたｓ−ニトロソグルタチオン
−ポリオキシエチレン−ヘモグロビン結合体（修飾体）
の分子量は８７０，０００ダルトンであった。

【００８１】また、得られた本発明の化合物中のメト化
率は１．２％であった。

【００８２】メトヘモグロビン率の測定は、シアンメト
化法によった。具体的には、ヘモグロビン試料を１％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ（アルドリッチ社製）を含有する０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ６．８）にて希釈し４ｍＬと
した後、２本の分光セルに分注する。１本のセルについ
て、６３０ｎｍの吸収を測定（λＭ１）し、次いで８％
シアンカリを１０ｕＬ加え同様に吸光度を測定する（λ
Ｍ２）。別のセルは８％フェリシアンカリを１０ｕＬ加
え吸光度測定（λＴ１）し、次いで８％シアンカリを同
量加え同様に吸光度を測定（λＴ２）する。

【００８３】メト化率は、（λＭ１−λＭ２）／（λＴ
１−λＴ２）にて算出した。

【００８４】ｓ−ニトロソグルタチオン−ポリオキシエ
チレン−ヘモグロビン結合体の測定は、ゲルパーミッシ
ョンクロマトグラフィーを用いた方法によった（Ａｋａ
ｉｋｅ Ｔ ｅｔａｌ．Ｎａｎｏｍｏｌａｒ ｑｕａｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｎｉｔｒｏｓｏｔｈ
ｉｏｌｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕ
ｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｏｗ ｒｅａｃｔｏｒｓ ｏ
ｆ ｍｅｔａｌｓ ａｎｄ ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅ
ｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：４５９−４６６，
１９９７）。具体的な測定条件は次の通りである。

【００８５】カラム：エイコム ＧＦＣ−２００ 展開液：０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ ｍＭ 酢酸
緩衝液（ｐＨ５．５） １次反応液：ＥＤＴＡを含まない上記展開液の１．７５
ｍＭ塩化水銀溶液 １次反応後カラム：エイコム ＣＡ−ＯＤＳ ２次反応液：１％スルファニルアミド／０．１％Ｎ−ナ
フチルエチレンジアミン／２％リン酸（Ｇｒｉｅｓｓ反
応液） 測定：５４０ｎｍ吸光度 サンプル注入量：５ｕＬ

【００８６】標準物質として亜硝酸イオンを同様に測定
し、クロマトグラフィー積分値よりｓ−ニトロソグルタ
チオン（一酸化窒素代謝物）−ヘモグロビン結合体の量
を算出し、注入したヘモグロビン分子数よりヘモグロビ
ンへのｓ−ニトロソグルタチオン（一酸化窒素代謝物）
導入率を計算した。

【００８７】また、得られた本発明の化合物のｓ−ニト
ロソグルタチオン（一酸化窒素代謝物）の導入率は図２
より４８％であった。

【００８８】反応性アミノ基の数をトリニトロベンゼン
スルホン酸を用いて滴定し（Ａ．Ｆ．Ｓ．Ａ．Ｈａｂｅ
ｅｂ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ
ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｂｙ ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉ
ｃ ａｃｉｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４（１９
６６）３２８−３３６）、ポリオキシアルキレン誘導体
を用いた修飾の前後で比較し修飾率を決定した。

【００８９】修飾率の計算式は次の通りである。 修飾率＝１００ × （１ − 修飾後残存アミノ基数
／修飾前アミノ基数）

【００９０】本実施例において測定した結果、修飾率は
１８．８％であり、９．０２個のアミノ基に製造例１の
化合物（活性化ポリオキシエチレン）が結合したことが
わかる。

【００９１】なお、上記のヘモグロビン溶液の調整は、
特公平６−７６３３３号公報記載の方法に準じた。

【００９２】実施例２ ウシの新鮮赤血球５０ｍｌを０．９％食塩水５０ｍｌで
遠心分離機を用いて４℃で４回洗浄した。ついで得られ
た４０ｍｌの赤血球溶液に注射用水８０ｍｌを加えて溶
血し、８０００ｒｐｍで１時間遠心分離したのち限外ろ
過膜（排除限界１０００００ダルトン）で処理して更に
膜成分とヘモグロビンを分離した。

【００９３】得られたヘモグロビン３．８７ｇ（０．０
６ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶
解し、全量を２５ｍｌにした。ついで酸素分圧が２ｍｍ
Ｈｇ以下となるまで激しくアルゴンを吹き込むことによ
り脱酸素したのち、公知の方法（Ｒ．Ｂｅｎｅｓｃｈ
ｅｔ．ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２５７（３）１３
２０−１３２４（１９８２））によりピリドキサール−
５’−リン酸を付加し、ピリドキサール化ヘモグロビン
を得た。得られたピリドキサール化ヘモグロビン溶液に
０．１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加え全量を１Ｌ
とした。

【００９４】ついで製造例２で製造した活性化ポリオキ
シエチレン誘導体０．２３ｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を加
え、アルゴンで酸素分圧１ｍｍＨｇまで引き下げ、２℃
で４時間反応させて、ポリオキシエチレン−ピリドキサ
ール化ヘモグロビン結合体（いわゆる前駆予備修飾体）
を得た。

【００９５】ついで、この前駆予備修飾体反応液に１ｍ
ｍｏｌのＥＤＴＡおよび０．５ｍｍｏｌのＤＴＰＡを加
え、さらに燐酸２ナトリウムを用いて反応液のｐＨを
８．６に調整した。ついでｓ−ニトロソグルタチオン１
００ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）を加え室温で４時間反応さ
せて、ｓ−ニトロソグルタチオン−ポリオキシエチレン
−ヘモグロビン結合体（いわゆる前駆修飾体）を得た。

【００９６】この前駆修飾体に、さらに製造例３で製造
した活性化ポリオキシアルキレン誘導体２４．１ｇ
（１．２ｍｍｏｌ）を加え４℃で４時間反応を続行し
た。

【００９７】反応液を分画分子量１００，０００ダルト
ンの限外ろ過膜（アミコン社製、ＹＭ１００）にかけ、
未反応ポリエチレングリコール誘導体が１００ｐｐｍ以
下になるまで繰り返し精製した。

【００９８】次に得られた反応液を凍結乾燥して１３．
８ｇの本発明の化合物であるｓ−ニトロソグルタチオン
−ポリオキシエチレン−ポリオキシアルキレン−ヘモグ
ロビン（いわゆる目的ヘモグロビン修飾体）を得た。

【００９９】得られた化合物のゲルパーミュエーション
クロマトグラフィーの結果を図３に示す。

【０１００】得られた本発明の化合物の分子量は１，６
７０，０００ダルトンであり、アミノ基の修飾率は２
０．１％であり、１０．１個のアミノ基にポリオキシア
ルキレン鎖が結合していた。

【０１０１】また、ｓ−ニトロソグルタチオン（一酸化
窒素代謝物）の導入率は１９％であった。

【０１０２】比較例１ 特公平６−７６３３３号公報記載の方法に準じて、ポリ
オキシアルキレン−ヘモグロビン結合体の合成をおこな
った。

【０１０３】まずはじめに、製造例１と同様の方法でポ
リエチレングリコール＃４０００（日本油脂株製：分子
量３，１００ダルトン）の活性化エステルを合成した。

【０１０４】ポリエチレングリコール６２ｇとトルエン
１００ｍｌおよび酢酸ナトリウム０．２ｇを窒素吹き込
み管・撹拌装置・温度計・冷却管−検水管を取り付けた
４つ口フラスコに入れ、８０℃まで昇温し、完全に溶解
するまで撹拌した。ついで窒素ガスを吹き込みながら溶
剤（トルエン）が還流しはじめるまでゆっくりと加熱
し、そのまま還流を１時間続けた。ついで検水管に析出
してきた水を廃棄し、検水管を４つ口フラスコから取り
外し、冷却管を再び取り付けた。

【０１０５】次に無水コハク酸４．８ｇを入れ、１０５
℃で３時間撹拌を続けた。ついで１００ｍｍＨｇ以下の
減圧下、未反応の無水コハク酸およびトルエンを留去し
た。８０℃まで冷却したのち減圧濾過により過剰の酢酸
ナトリウムを除去して、５７ｇのポリエチレングリコー
ルジサクシネートを得た。

【０１０６】得られたポリエチレングリコールジサクシ
ネートの酸価は３３．９、鹸化価は６７．９であった。

【０１０７】ついで、ポリエチレングリコールジサクシ
ネート１３．２ｇとジメチルホルムアミド２００ｍｌを
共栓付き三角フラスコに入れ、マグネチックスターラー
で撹拌しながら４０℃に昇温した。ついでジシクロヘキ
シルカルボジイミド１．９６ｇとＮ−ヒドロキシサクシ
ンイミド１．１２ｇを入れ１２時間撹拌した。次に反応
混合液をジエチルエーテル１Ｌ中に撹拌しながら滴下し
て結晶を析出させ、加圧下ろ過して、ポリエチレングリ
コール＃４０００の活性化エステルを１０．８ｇの白色
結晶として得た。

【０１０８】実施例２と同様の方法で作成した膜成分を
除去したウシヘモグロビン５．１６ｇ（０．０８ｍｍｏ
ｌ）を０．１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００ｍｌ
に溶解し、ポリエチレングリコール＃４０００の活性化
エステル６．５ｇ（１．８４ｍｍｏｌ）とリジン１１３
ｍｇ（０．７７３ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンで酸素分
圧を２ｍｍＨｇまで下げたあと４℃で２時間反応させ
た。

【０１０９】反応液を分画分子量１００，０００ダルト
ンの限外ろ過膜（アミコン社製、ＹＭ１００）にかけ、
未反応ポリエチレングリコール誘導体が１００ｐｐｍ以
下になるまで繰り返し精製した。

【０１１０】次に得られた反応液を凍結乾燥して６．４
６ｇの化合物を得た。

【０１１１】得られた化合物の分子量は８９，０００ダ
ルトンであり、アミノ基の修飾率は１２．６％であり、
６．３個のアミノ基にポリオキシアルキレン鎖が結合し
ていた。

【０１１２】比較例２ 比較実験として一酸化窒素代謝物−ヘモグロビン結合体
の合成をおこなった。

【０１１３】はじめに実施例２と同様の方法で、ピリド
キサール化ヘモグロビン溶液を得た。

【０１１４】ウシの新鮮赤血球５０ｍｌを０．９％食塩
水５０ｍｌで遠心分離機を用いて４℃で４回洗浄した。
ついで得られた４０ｍｌの赤血球溶液に注射用水８０ｍ
ｌを加えて溶血し、８，０００ｒｐｍで１時間遠心分離
したのち限外ろ過膜（排除限界１００，０００ダルト
ン）で処理して更に膜成分とヘモグロビンを分離した。

【０１１５】得られたヘモグロビン３．８７ｇ（０．０
６ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶
解し、全量を２５ｍｌにした。ついで酸素分圧が２ｍｍ
Ｈｇ以下となるまで激しくアルゴンを吹き込むことによ
り脱酸素したのち、公知の方法（Ｒ．Ｂｅｎｅｓｃｈ
ｅｔ．ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２５７（３）１３
２０−１３２４（１９８２））によりピリドキサール−
５’−リン酸を付加し、ピリドキサール化ヘモグロビン
を得た。得られたピリドキサール化ヘモグロビン溶液に
０．１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加え全量を１Ｌ
とした。

【０１１６】次に、反応液に１ｍｍｏｌのＥＤＴＡおよ
び０．５ｍｍｏｌのＤＴＰＡを加え、さらに燐酸２ナト
リウムを用いて反応液のｐＨを８．６に調整した。つい
でｓ−ニトロソグルタチオン１００ｍｇ（０．３ｍｍｏ
ｌ）を加え室温で４時間反応させた。

【０１１７】得られた反応液を分画分子量３０，０００
ダルトンの限外ろ過膜（アミコン社製、ＰＭ３０）で未
反応ｓ−ニトロソグルタチオンが５ｐｐｍ以下になるま
で精製した。

【０１１８】次に得られた反応液を凍結乾燥して２．６
ｇの化合物を得た。

【０１１９】実施例３ 実施例１、実施例２、比較例１および比較例２で得られ
た化合物をそれぞれ５％濃度になるように生理食塩水に
溶解させ、ｗｉｓｔｅｒ ｒａｔ（７〜８週齢、体重２
４０〜２８０ｇ）の静脈に２．５ｍｌ／ｋｇを注入し
た。

【０１２０】各々の注入後の血圧上昇率を表２に記載す
る。

【０１２１】

【表２】

【０１２２】実施例４ 実施例１、実施例２、比較例１および比較例２で得られ
た化合物について、血管内皮細胞の透過性を次のモデル
実験により測定した。図４は透過性の測定方法の簡略説
明図である。

【０１２３】ウシ大動脈由来血管内皮細胞を０．４μｍ
の孔径を有するコラーゲンフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ
Ｃｏａｓｔｅｒ 社、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ｃｏｌｌ
ａｇｅｎ）上に単層培養し、上層を仮想血管内腔、下層
を仮想血管壁側とし、実施例１、実施例２、比較例１お
よび比較例２で得られた化合物について^１２５Ｉ標識し
たのち内腔側にヘモグロビン濃度１５．５μＭとなるよ
うに加えた。一時間後、下層に移動したヘモグロビン結
合体をガンマーカウンターにて定量し、透過性（×１０
^−６ｃｍ／ｓｅｃ）を計算した。

【０１２４】結果を表３に示す。

【０１２５】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で得られたヒト赤血球由来ヘモグロ
ビン使用のｓ−ニトロソグルタチオン−ポリオキシエチ
レン−ヘモグロビン結合体のゲルパーミュエーションク
ロマトグラフィーの測定結果を示す。

【図２】 実施例１で得られたｓ−ニトロソグルタチオ
ン−ポリオキシエチレン−ヘモグロビン結合体のｓ−ニ
トロソグルタチオン導入率の測定結果を示す。

【図３】 実施例２で得られたウシ赤血球由来ヘモグロ
ビン使用のｓ−ニトロソグルタチオン−ポリオキシエチ
レン−ヘモグロビン結合体のゲルパーミュエーションク
ロマトグラフィーの測定結果を示す。

【図４】 実施例４における培養ウシ内皮単層を使用し
た透過性測定法の簡略説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐久間 一郎 北海道札幌市中央区北10条西20丁目１番５ 号 (72)発明者 仲井 邦彦 宮城県仙台市青葉区川内亀岡町68番地５番 21号 (72)発明者 安河内 徹 神奈川県横浜市都筑区茅ヶ崎東１丁目１番 地３号401 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA06 AA07 BA31 BA37 BA44 DC50 MA44 MA66 NA05 NA06 NA12 ZA522 4H045 AA10 AA20 AA50 BA51 BA57 CA42 EA34 EA61 GA10 GA15 HA07

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘモグロビン中の結合可能なアミノ基の
   総数の１０〜３０％にポリオキシアルキレン誘導体が結
   合し、システイン残基のチオール基の総数の１０〜１０
   ０％に一酸化窒素代謝物が結合した分子量が１００，０
   ００〜２，０００，０００ダルトンである一酸化窒素代
   謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体。
2. 【請求項２】 ポリオキシアルキレン誘導体として式
   （１）の化合物を用いることを特徴とする請求項１記載
   の一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグロ
   ビン結合体。 【化１】 （ただし、Ｂは２〜６個の水酸基を持つ化合物の残基、
   ＡＯは炭素数３または４のオキシアルキレン基、Ｒは炭
   素数１〜３０の炭化水素基または水酸基、ｋとｍはオキ
   シエチレン基の平均付加モル数で各々０≦ｋ≦５００、
   ０≦ｍ≦５００、かつ２０≦ｋ＋ｍ≦１０００を満足す
   る数、１とｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で
   各々０≦１≦１０、０≦ｎ≦１０、かつ０≦１＋ｎ≦１
   ０を満足する数、０≦ａ≦６、１≦ｂ≦６、かつ２≦ａ
   ＋ｂ≦６を満足する数である。Ｘは式（２）、式
   （３）、式（４）または式（５）に示すアミノ基と結合
   可能な官能基である。） −（ＣＨ_２）_ｃ−ＣＯＯＹ …（２） （ただし、ｃは０〜２、Ｙは水素またはｐ−ニトロフェ
   ニル基またはＮ−ヒドロキシサクシンイミド残基であ
   る。） −ＯＣ−（ＣＨ_２）_ｄ−ＣＯＯＹ …（３） （ただし、ｄは２〜６、Ｙは水素またはＮ−ヒドロキシ
   サクシンイミド残基である。） −（ＣＨ_２）_ｅ−ＣＨＯ …（４） （ただし、ｅは１〜２である。） −ＣＯＺ…（５） （ただし、Ｚはイミダゾール基である。）
3. 【請求項３】 一酸化窒素代謝物として低分子チオール
   体のｓ−ニトロソ体を用いることを特徴とする請求項１
   または請求項２記載の一酸化窒素代謝物−ポリオキシア
   ルキレン−ヘモグロビン結合体。
4. 【請求項４】 一酸化窒素代謝物がｓ−ニトロソグルタ
   チオンである請求項１または請求項２記載の一酸化窒素
   代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体。
5. 【請求項５】 請求項１、請求項２、請求項３または請
   求項４記載の一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレン
   −ヘモグロビン結合体を１０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ含有
   することを特徴とする酸素運搬体。
6. 【請求項６】 ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結
   合体に、一酸化窒素代謝物を反応させること特徴とす
   る、ヘモグロビン中の結合可能なアミノ基の総数の１０
   〜３０％にポリオキシアルキレン誘導体が結合し、シス
   テイン残基のチオール基の総数の１０〜１００％に一酸
   化窒素代謝物が結合した分子量が１００，０００〜２，
   ０００，０００ダルトンである一酸化窒素代謝物−ポリ
   オキシアルキレン−ヘモグロビン結合体の製造方法。
7. 【請求項７】 ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結
   合体に、一酸化窒素代謝物を反応させ、更にポリオキシ
   アルキレン誘導体を反応させることを特徴とする、ヘモ
   グロビン中の結合可能なアミノ基の総数の１０〜３０％
   にポリオキシアルキレン誘導体が結合し、システイン残
   基のチオール基の総数の１０〜１００％に一酸化窒素代
   謝物が結合した分子量が１００，０００〜２，０００，
   ０００ダルトンである一酸化窒素代謝物−ポリオキシア
   ルキレン−ヘモグロビン結合体の製造方法。