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ITMI20110534A1 - "nuovo processo per l'ossidazione selettiva di acidi biliari, loro sali o derivati" - Google Patents

"nuovo processo per l'ossidazione selettiva di acidi biliari, loro sali o derivati" Download PDF

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ITMI20110534A1
ITMI20110534A1 IT000534A ITMI20110534A ITMI20110534A1 IT MI20110534 A1 ITMI20110534 A1 IT MI20110534A1 IT 000534 A IT000534 A IT 000534A IT MI20110534 A ITMI20110534 A IT MI20110534A IT MI20110534 A1 ITMI20110534 A1 IT MI20110534A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
acid
dependent
process according
nad
hsdh
Prior art date
Application number
IT000534A
Other languages
English (en)
Inventor
Erica Elisa Ferrandi
Daniela Monti
Fausto Polentini
Sergio Riva
Original Assignee
Prodotti Chimici Alimentari
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Prodotti Chimici Alimentari filed Critical Prodotti Chimici Alimentari
Priority to IT000534A priority Critical patent/ITMI20110534A1/it
Priority to CN201280015573.0A priority patent/CN103517984B/zh
Priority to JP2014501788A priority patent/JP5872671B2/ja
Priority to PCT/IB2012/051476 priority patent/WO2012131591A1/en
Priority to EP12717864.8A priority patent/EP2691516B1/en
Priority to ES12717864.8T priority patent/ES2586389T3/es
Priority to KR1020137028040A priority patent/KR101948948B1/ko
Publication of ITMI20110534A1 publication Critical patent/ITMI20110534A1/it

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Description

Nuovo processo per l’ossidazione selettiva di acidi biliari, loro sali o derivati.
La presente invenzione à ̈ relativa ad un nuovo processo per la produzione industriale dell’acido ursodesossicolico, a partire da differenti acidi biliari, esemplificati dalla formula generale riportata nello Schema 1, loro sali o derivati facilmente reperibili in commercio, quali ad esempio l’acido colico (acido 3α,7α,12α-triidrossi-5β-colanoico, (I)), l’estere metilico dell’acido colico (II) e l’acido chenodesossicolico (acido 3α,7α-diidrossi-5β-colanoico, (III)).
H3C O
R
CH3OR'
12
CH3H
H
3 7
H OOH
H
(I), Acido colico R = OH; R' = H
(II), Acido colico metil estere R = OH; R' = CH3
(III), Acido chenodesossicolico R = H; R' = H
Schema 1
L’acido ursodesossicolico, ovvero l’acido 3α,7βdiidrossi-5β-colanoico (UDCA), la cui formula à ̈ riportata nella formula (IV) seguente (Schema 2), H3C O
CH3OH
CH3H
H
3 7
H OOH
H
(IV), Acido ursodesossicolico (UDCA)
Schema 2
à ̈ un composto normalmente presente in piccole quantità nella bile umana, dove aumenta la capacità solubilizzante della bile nei confronti del colesterolo. L’UDCA à ̈ noto per le sue proprietà terapeutiche: à ̈ usato infatti per il trattamento delle disfunzioni del distretto epatico, quali la dissoluzione dei calcoli biliari di colesterolo, la cirrosi biliare primitiva e la colangite sclerosante.
E’ quindi di grande interesse avere a disposizione un metodo per la produzione industriale di UDCA.
Attualmente, la produzione di UDCA à ̈ eseguita per via sintetica chimica a partire dall’acido colico estratto dalla bile bovina, attraverso la formazione dell’intermedio acido 12-chetochenodeossicolico (Hoffmann A. F., Acta Chem. Scand., 1963, 17, 173–186; Sammuelson B., Acta Chem. Scand., 1960, 14, 17–20).
Sono state proposte varie strategie sintetiche al posto delle tradizionali sintesi chimiche dell’acido ursodesossicolico, come ad esempio quella descritta in Bovara R., Carrea G., Riva S. and Secundo F. Biotechnology letters 1996, 18, 305-308. Queste strategie utilizzano diversi derivati ossidati dell’acido colico o dell’acido chenodesossicolico (come ad esempio l’acido 3α,12α-diidrossi-7-cheto-5βcolanoico, l’acido 12-chetochenodesossicolico e l’acido 7-chetolitocolico) per la sintesi di UDCA.
I derivati ossidati dell’acido colico e dell’acido chenodesossicolico possono essere sintetizzati sia tramite sintesi chimiche, sia tramite processi enzimatici.
I procedimenti chimici generalmente prevedono l’esterificazione dell’acido biliare, l’acetilazione selettiva dei gruppi ossidrilici che non richiedono l’ossidazione e l’ossidazione dell’ossidrile prescelto a chetone. Tuttavia, le rese e le conversioni che possono essere ottenute mediante i processi sintetici non sono completamente soddisfacenti dal punto di vista industriale.
Come alternativa alla via sintetica chimica, l’ossidazione dell’acido colico può essere realizzata per via enzimatica utilizzando attività enzimatiche idrossisteroide deidrogenasiche (HSDH) NAD(P)H-dipendenti accoppiate ad opportuni sistemi di rigenerazione del cofattore, il quale può quindi essere posto in reazione in quantità catalitiche e non stechiometriche.
Le attività HSDH mostrano una pressoché assoluta regio- e stereoselettività e quindi, differentemente dalle ossidazioni chimiche, le reazioni da esse catalizzate possono essere condotte senza una preventiva protezione dei gruppi idrossilici che non richiedono l’ossidazione.
Poiché le reazioni di ossidoriduzione catalizzate dalle HSDH sono reversibili, il sistema di rigenerazione del cofattore accoppiato alla reazione di ossidazione può essere sfruttato non solo al fine di<+>ridurre le quantità di NAD(P) da utilizzare, ma anche per spingere l'equilibrio di reazione verso elevate percentuali di conversione (Kroutil W., Mang H., Edegger K., Faber K. Adv. Synth. Catal., 2004, 346, 125-142).
Conversioni quantitative possono essere ottenute accoppiando la reazione di ossidazione con una reazione di riduzione non reversibile di un co-substrato catalizzata da una seconda deidrogenasi, come nel caso della amminazione riduttiva dell’acido α-chetoglutarico catalizzata dalla glutammato deidrogenasi in presenza di ammoniaca. Esempi di reazioni di ossidazione di acidi biliari accoppiate a glutammato deidrogenasi per la rigenerazione del cofattore NAD(P)<+>sono ad esempio descritti in Riva S., Bovara R., Pasta P., Carrea G. J. Org. Chem., 1986, 51, 2902-2906; Bovara R., Carrea G., Riva S., Secundo F. Biotechnology letters, 1996, 18, 305-308. Tali reazioni sono però state realizzate solo a basse concentrazioni del substrato acido colico (12,5 mM) e non sono applicabili su larga scala a causa dell’elevato costo del co-substrato acido αchetoglutarico e della indisponibilità commerciale di glutammato deidrogenasi per applicazioni industriali.
Nei casi in cui la reazione di ossidazione à ̈ accoppiata a reazioni di riduzione reversibili catalizzate da altre deidrogenasi, à ̈ invece richiesto l’utilizzo di un eccesso di co-substrato in grado di spostare favorevolmente l’equilibrio della reazione verso il prodotto desiderato.
Ad esempio, nella reazione di ossidazione dell’acido colico operata con una 12α-HSDH NADH-dipendente accoppiata alla riduzione dell’acido piruvico ad acido lattico catalizzata da una lattato deidrogenasi (LDH) NADH-dipendente (Fossati E., Carrea G., Riva S., Polentini F., EP1731618), il co-substrato veniva usato con un eccesso del 100% al fine di ottenere conversioni quantitative. Anche in questo caso, l’elevato costo del co-substrato acido piruvico usato per il riciclo dell’enzima rende tale processo non soddisfacente per l’applicazione su scala industriale. Inoltre, poiché non sono disponibili LDH NADPH-dipendenti, tale sistema di rigenerazione del cofattore può essere accoppiato esclusivamente ad ossidazioni catalizzate da HSDH NADH-dipendenti.
L’accoppiamento dell’ossidazione dell’acido colico catalizzata da una 12α-HSDH NADPH-dipendente con la riduzione di acetone tramite una alcol deidrogenasi (ADH) NADPH-dipendente à ̈ descritta in Fossati E., Polentini F., Carrea G., Riva S., Biotechnol. Bioeng., 2006, 93, 1216-1220. Questo sistema à ̈ economicamente vantaggioso per l’elevata disponibilità sia degli enzimi accoppiati, quali alcol deidrogenasi, e del cosubstrato acetone. Tuttavia, l’equilibrio termodinamico del processo accoppiato non permette la conversione quantitativa dell’acido colico, anche in presenza in un grande eccesso di acetone, poiché entrambe le reazioni enzimatiche sono completamente reversibili. In condizioni ottimizzate, à ̈ stato ottenuto solamente il 92% di conversione dell’acido colico in acido 12-chetochenodesossicolico in una miscela di reazione contenente il 25% (volume/volume) di acetone.
Recentemente, à ̈ stata descritta la riduzione biocatalizzata quasi-irreversibile di chetoni aventi gruppi elettron-attrattori, quali α-alochetoni o 1,3-dichetoni, per azione di alcol deidrogenasi NAD(P)H dipendenti (Bisogno F. R., Lavandera I., Kroutil W., Gotor V. J. Org. Chem., 2009, 74, 1730-1732; Lavandera I., Kern A., Resch V., Ferreira-Silva B., Glieder A., Fabian W.M.F., de Wildeman F., Kroutil W., Organic Letters, 2008, 10, 2155-2158). In questi lavori à ̈ suggerito che queste reazioni di riduzione possano essere accoppiate alla risoluzione enzimatica di alcoli racemici secondari, come ad esempio il 2-ottanolo, per avere un sistema di rigenerazione del cofattore efficiente, usato vicino alle quantità stechiometriche del co-substrato (circa 1,5 equivalenti).
E’ stato ora sorprendentemente trovato un nuovo processo per l’ossidazione enzimatica regioselettiva di acidi biliari, loro sali o derivati, quali l’acido colico, l’acido chenodesossicolico o l’estere metilico dell’acido colico, per azione di idrossisteroide deidrogenasi (HSDH) NAD(P)<+>dipendenti in presenza di una alcol deidrogenasi (ADH) e di metil acetoacetato come co-substrato per la rigenerazione del cofattore NAD(P)<+>.
A differenza dei lavori precedentemente descritti dove una singola ADH agisce in reazione sia nell’ossidazione del substrato di interesse, ad esempio 2-ottanolo, sia nella riduzione del co-substrato sacrificale, ad esempio cloroacetone, in questo nuovo processo si à ̈ realizzato l’accoppiamento di due attività enzimatiche diverse, HSDH e ADH.
Ciò ha comportato la necessità di individuare le condizioni di reazione ottimali per l’attività e la stabilità di entrambi gli enzimi coinvolti nel processo, nonché quelle contemporaneamente più adatte a garantire la solubilità e la stabilità chimica dei substrati acidi biliari e del metil acetoacetato. A tale riguardo, à ̈ importante infatti sottolineare che gli acidi biliari sono solubili in acqua sotto forma di sali sodici o potassici a pH maggiori di 7,5-8,0, mentre il metil acetoacetato à ̈ scarsamente stabile a pH alcalini, particolarmente a temperature maggiori di 25-30° C. Il processo qui presentato à ̈ stato quindi raggiunto verificando sperimentalmente l’influenza di diversi parametri, come la quantità di enzimi HSDH e ADH, la concentrazione dei substrati acidi biliari e del co-substrato metil acetoacetato, la temperatura e il pH, sul grado di conversione della reazione di ossidazione.
<+>In particolare, le HSDH NAD(P) dipendenti utilizzate nel processo della presente invenzione hanno preferibilmente un’attività enzimatica compresa tra 0,25 e 12 U, dove per attività enzimatica (U) si intende la quantità di enzima 7α-HSDH o 12α-HSDH in grado di trasformare in un minuto una micromole del substrato acido colico al corrispondente prodotto ossidato rispettivamente in posizione 7 o 12 in una soluzione di saggio contenente 12,5 mM acido colico, 0,2 mM NAD(P)<+>e 100 mM tampone potassio fosfato, pH 9,0.
I composti (I), (II) e (III), loro sali o derivati sono preferibilmente utilizzati in una concentrazione compresa tra lo 0,5% e il 4% (peso/volume), ovvero in una concentrazione compresa tra 12,5 mM e 100 mM.
Il cofattore NAD(P)+ à ̈ preferibilmente usato in quantità catalitiche, ad una concentrazione compresa tra 0,2 e 0,8 mM.
Il co-substrato metil acetoacetato à ̈ utilizzato in un quantitativo pari a 2 equivalenti rispetto a ciascuno dei composti (I), (II) o (III). In particolare, il co-substrato metil acetoacetato à ̈ utilizzato in quantità comprese tra lo 0,3% e il 2,4% (volume/volume).
Il processo della presente invenzione à ̈ preferibilmente condotto a temperatura ambiente, ovvero a circa 20° C, e preferibilmente à ̈ condotto a pH 8.
Inoltre, mentre negli esempi di letteratura sono descritte reazioni esclusivamente in ambiente acquoso, questo nuovo processo à ̈ applicabile anche a sistemi di reazione bifasici tampone/solvente organico che possono permettere di utilizzare come substrati anche esteri di acidi biliari come l’estere metilico dell’acido colico.
Il sistema di rigenerazione del cofattore utilizzato nel processo della presente invenzione à ̈ sostanzialmente più economico ed efficiente rispetto ai precedenti, in quanto utilizza un enzima ed un cosubstrato, ovvero rispettivamente delle alcol deidrogenasi e metil acetoacetato, poco costosi e permette la conversione quantitativa, cioà ̈ maggiore o uguale del 99,5%, di acidi biliari, loro sali o derivati quali l’acido colico ((I), Schema 3), l’estere metilico dell’acido colico ((II), Schema 4) e l’acido chenodesossicolico ((III), Schema 5) nei rispettivi derivati selettivamente ossidati a seconda della specifica HSDH utilizzata, ovvero 7α-HSDH, 12α-HSDH oppure le loro combinazioni, su una scala preparativa. Negli schemi da 3 a 5, il composto indicato con (V) à ̈ l’acido 3α,12α-diidrossi-7-cheto-5β-colanoico, il composto indicato con (VI) à ̈ l’acido 3α,7α-diidrossi-12-cheto-5β-colanoico, il composto indicato con (VII) à ̈ l’acido 3α-idrossi-7,12-cheto-5β-colanoico, il composto indicato con (VIII) à ̈ l’estere metilico dell’acido 3α,12α-diidrossi-7-cheto-5β-colanoico ed il composto indicato con (IX) à ̈ l’acido 7-chetolitocolico. I punti b) di questi schemi descrivono la reazione di riduzione del metil acetoacetato ad opera di una alcol deidrogenasi NAD(P)H dipendente, accoppiata alle reazioni di ossidazione di cui ai rispettivi punti a).
a)
12
NAD(P)<+>
3 7
(I), Acido colico
7α-HSDH
<7>+
<α-HSDH>12α-HSDH 12α-HSDH
12 12
12
NAD(P)H 3 7 3 7
3 7
(V)(VI) (VII)
7α-HSDH
b)
ADH
NAD(P)H NAD(P)<+>
Metil acetoacetato Metil 3-idrossibutirrato
Schema 3. a) reazione di ossidazione catalizzata da HSDH; b) sistema di rigenerazione del cofattore NAD(P)<+>
a)
H3C O H3C O
OH OH
CH3CH
OMe3OMe
12 12
CH3H CH3H
H<NAD(P)+ 7α-HSDH>+<NAD(P)H>
3 7 3 7 H
H OOH H O<O>
H H
(II), Metil estere dell'acido colico (VIII)
b)
OO ADH OH<O>
OMe<NAD(P)H>
OMe<NAD(P)+>
Metil acetoacetato Metil 3-idrossibutirrato
Schema 4. a) reazioni di ossidazione catalizzate da HSDH; b) sistema di rigenerazione del cofattore NAD(P)<+>
a)
12 12
NAD(P)+<7α-HSDH>NAD(P)H
3 7 3 7
(III), Acido chenodesossicolico (IX)
b)
ADH
NAD(P)H NAD(P)<+>
Metil acetoacetato Metil 3-idrossibutirrato
Schema 5. a) reazioni di ossidazione catalizzate da HSDH; b) sistema di rigenerazione del cofattore NAD(P)<+>
Secondo un aspetto del processo dell’invenzione, la reazione di ossidazione à ̈ eseguita in un sistema monofasico tramite l’aggiunta di una idrossisteroide deidrogenasi (HSDH) NAD(P)<+>-dipendente, quale ad esempio le 12α-HSDH e 7α-HSDH descritte nello Schema 3 o la 7α-HSDH descritta nello Schema 5, ad una soluzione acquosa che contiene un sale sodico dell’acido colico (I) o dell’acido chenodesossicolico (III), insieme a quantità catalitiche di NAD(P)<+>, la cui rigenerazione da NAD(P)H a NAD(P)<+>à ̈ effettuata attraverso la conversione del metil acetoacetato a metil-3-idrossibutirrato usando una alcol deidrogenasi (ADH) NAD(P)H-dipendente.
A seconda del substrato e delle attività enzimatiche utilizzate, le reazioni (ossidazioni di (I) ai derivati (V), (VI) e (VII) e di (VI) al derivato (VII)(Schema 3), e ossidazione di (III) al derivato (IX) (Schema 5)) sono eseguite per un periodo di tempo compreso tra 4 e 16 ore, il sale sodico del substrato acido biliare à ̈ normalmente utilizzato in una concentrazione compresa tra lo 0,5% e il 4% (peso/volume) (ossia tra 12,5 e 100 mM), a pH 8,0 e 20° C, il NAD(P)<+>à ̈ usato in quantità catalitiche, ad una concentrazione compresa tra 0,2 e 0,8 mM, il metil acetoacetato à ̈ usato solitamente in un quantitativo pari a 2 equivalenti rispetto al sale dell’acido biliare, conseguentemente in quantità comprese tra 0,3 e 2,4% (volume/volume). La reazione di ossidazione dell’ossidrile in posizione 7 dell’estere metilico dell’acido colico (II) catalizzata da una 7α-HSDH (Schema 4) à ̈ eseguita in un sistema bifasico tampone potassio fosfato pH 8,0/ i-propilacetato a 20° C, utilizzando lo stesso sistema di rigenerazione dei cofattori. Il substrato (II) à ̈ sciolto ad una concentrazione pari al 4% (peso/volume) (ossia 100 mM) in i-propilacetato ed aggiunto ad un pari volume di tampone potassio fosfato pH 8,0, contenente NAD(P)<+>ad una concentrazione pari a 0,8 mM e il metil acetoacetato in un quantitativo pari a 2 equivalenti rispetto a (II), conseguentemente in quantità pari al 2,4% (volume/volume).
Il nuovo processo qui descritto risulta vantaggioso rispetto a quelli precedentemente descritti per diversi motivi.
Rispetto ai processi chimici, il nuovo processo à ̈ più semplice ed economicamente vantaggioso in quanto non à ̈ necessaria la protezione dei gruppi idrossilici che non richiedono l’ossidazione grazie alla pressoché assoluta regioselettività delle HSDH. Inoltre il processo può essere condotto in condizioni di reazione blande (ad esempio ad una temperatura di 20° C, a pressione atmosferica e ad un pH pari a 8,0), il che comporta vantaggi sia in termini economici che ambientali.
Rispetto ai processi enzimatici descritti in precedenza, esso risulta più vantaggioso economicamente per l’utilizzo di un eccesso di co-substrato ridotto rispetto a quello solitamente usato con le ADH (ad esempio 2,4% anziché 25% (volume/volume) di cosubstrato per l’ossidazione di una soluzione al 4% (peso/volume) di acido colico come descritto in Fossati E., Polentini F., Carrea G., Riva S., Biotechnol. Bioeng., 2006, 93, 1216-1220). Contemporaneamente, il nuovo processo risulta più efficiente in quanto permette conversioni maggiori o uguali del 99,5%, per motivi termodinamici non raggiungibili utilizzando comuni chetoni, ad esempio acetone, come co-substrati. Inoltre, il sistema rigenerante della presente invenzione risulta più versatile rispetto ai precedenti grazie alla disponibilità di ADH sia NADH- che NADPH-dipendenti sviluppate per applicazioni a livello industriale, che possono quindi essere opportunamente accoppiate ad HSDH con la medesima specificità.
Gli enzimi usati nei processi sopra descritti possono provenire da una fonte microbica, quale:
- L’enzima 7α-HSDH NADPH-dipendente può provenire da Clostridium absonum, descritto per esempio in McDonald I.A., Hutchinson D.M., Forrest T.P., J. Lipid Res., 1981, 22, 458-466, che à ̈ stato clonato e sovraespresso in E. coli (manoscritto in preparazione).
- L’enzima 7α-HSDH NADH-dipendente può essere quello da Bacteroides fragilis ricombinante in E.coli Rosetta2(DE3)pLysS, che à ̈ descritto per esempio in Zhu D., Stearns J.E., Ramirez M., Hua L., Tetrahedron, 2006, 62, 4535-4539.
- L’enzima 12α-HSDH NADPH-dipendente può provenire da Clostridium sp. commercializzato da ASA Spezialenzyme GmbH (Germany).
- L’enzima 12α-HSDH NADH-dipendente da una fonte microbica può essere quello commercializzato da Genzyme Biochemicals Ltd. (England).
- L’enzima ADH NADPH-dipendente può provenire da Thermoanaerobacter brockii che à ̈ descritto in Peretz M., Bogin O., Tel-Or S., Cohen A., Li G., Chen J.-S., Burstein Y., Anaerobe, 1997, 3, 259– 270, oppure quello da una fonte microbica commercializzato da SIGMA-ALDRICH.
- L’enzima ADH NADH-dipendente può essere quello da fegato di cavallo commercializzato da SIGMA-ALDRICH.
I derivati ossidati ottenuti con il processo della presente invenzione possono essere utilizzati nella sintesi dell’UDCA ((IV), Schema 2) per via chimica, come descritto in Giordano C., Perdoncin G., Castaldi G., Angew. Chem. Int. Ed., 1985, 24, 499-500; Magni A., Piccolo O., Ascheri A., US4834919; Arosio R., Rossetti V., Beratto S., Talamona A., Crisafulli E., EP0424232A2; Hattori M., Mikami K., JP06002184, o alternativamente, per via enzimatica mediante riduzione regio- e stereoselettiva del gruppo chetonico in 7 catalizzata da una 7β-HSDH, come ad esempio descritto in Riva S., Bovara R., Pasta P., Carrea G. J. Org. Chem., 1986, 51, 2902-2906; Bovara R., Canzi E., Carrea G., Pilotti A., Riva S., J. Org. Chem., 1993, 58, 499-501; Bovara R., Carrea G., Riva S., Secundo F. Biotechnology letters, 1996, 18, 305-308; Pedrini P., Andreotti E., Guerrini A., Dean M., Fantin G., Giovannini P. P., Steroids, 2006, 71, 189-198; Monti D., Ferrandi E. E., Zanellato I., Hua L., Polentini F., Carrea G., Riva S., Adv. Synth. Catal., 2009, 351, 1303-1311.
Gli esempi che seguono devono essere considerati non-limitanti illustrazioni dell'invenzione.
ESEMPI
Esempio 1 - Ossidazione dell’ossidrile in posizione 7 dell’acido colico (I) catalizzata dalla 7α-HSDH NADH-dipendente da Bacteroides fragilis in presenza della ADH NADH-dipendente da fegato di cavallo (SIGMA-ALDRICH).
La reazione à ̈ stata condotta a 20° C e pH 8,0 in un volume totale di 0,5 ml contenente: 0,5% (p/v) del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0 (12,5 mM, ottenuto diluendo una soluzione acquosa 0,2 M del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0), 2 equivalenti (0,3% (v/v)) di metil acetoacetato, 12 U di 7α-HSDH NADH-dipendente da Bacteroides fragilis ricombinante in E. coli Rosetta2(DE3)pLysS, 0,1 U di ADH NADH-dipendente da fegato di cavallo (SIGMA-ALDRICH), 0,8 mM NAD<+>(40 µl di una soluzione acquosa 10 mM di NAD<+>), 50 mM tampone potassio fosfato, pH 8,0.
La conversione completa ( ≥ 99,5%) dell’acido colico (I) in acido 3α,12α-diidrossi-7-cheto-5β-colanoico (V) à ̈ ottenuta in un tempo di 16 h. Il grado di conversione à ̈ stato valutato mediante analisi TLC utilizzando come sistema eluente cloroformio/metanolo/acido acetico (10:1:0,5).
Esempio 2 - Ossidazione dell’ossidrile in posizione 12 dell’acido colico (I) catalizzata dalla 12α-HSDH NADH-dipendente (Genzyme) in presenza della ADH NADH-dipendente da fegato di cavallo (SIGMA-ALDRICH).
La reazione à ̈ stata condotta a 20° C e pH 8,0 in un volume totale di 0,5 ml contenente: 0,5% (p/v) del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0 (12,5 mM, ottenuto diluendo una soluzione acquosa 0,2 M del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0), 2 equivalenti (0,3% (v/v)) di metil acetoacetato, 4 U di 12α-HSDH NADH-dipendente da fonte microbica (Genzyme), 0,05 U di ADH NADH-dipendente da fegato di cavallo (SIGMA-ALDRICH), 0,2 mM NAD<+>(10 µl di una soluzione acquosa 10 mM di NAD<+>), 50 mM tampone potassio fosfato, pH 8,0.
La conversione completa ( ≥ 99,5%) dell’acido colico (I) in acido 3α,7α-diidrossi-12-cheto-5β-colanoico (VI) à ̈ ottenuta in un tempo di 16 h. Il grado di conversione à ̈ stato valutato mediante analisi TLC utilizzando come sistema eluente cloroformio/metanolo/acido acetico (10:1:0,5).
Esempio 3 - Ossidazione dell’ossidrile in posizione 12 dell’acido colico (I) catalizzata dalla 12α-HSDH NADPH-dipendente (ASA) in presenza della ADH NADPH-dipendente da T. brockii (SIGMA-ALDRICH).
La reazione à ̈ stata condotta a 20° C e pH 8,0 in un volume totale di 0,5 ml contenente: 0,5% (p/v) del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0 (12,5 mM, ottenuto diluendo una soluzione acquosa 0,2 M del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0), 2 equivalenti (0,3% (v/v)) di metil acetoacetato, 4 U di 12α-HSDH NADPH-dipendente (ASA), 10 U di ADH NADPH-dipendente da T. brockii (SIGMA-ALDRICH), 0,2 mM NADP<+>(10 µl di una soluzione acquosa 10 mM di NADP<+>), 50 mM tampone potassio fosfato, pH 8,0.
La conversione completa ( ≥ 99,5%) dell’acido colico (I) in acido 3α,7α-diidrossi-12-cheto-5β-colanoico (VI) à ̈ ottenuta in un tempo di 16 h. Il grado di conversione à ̈ stato valutato mediante analisi TLC utilizzando come sistema eluente cloroformio/metanolo/acido acetico (10:1:0,5).
Esempio 4 - Ossidazione dell’ossidrile in posizione 7 dell’acido colico (I) catalizzata dalla 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum in presenza della ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH).
La reazione à ̈ stata condotta a 20° C e pH 8,0 in un volume totale di 0,5 ml contenente: 4% (p/v) del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0 (100 mM, ottenuto diluendo una soluzione acquosa 0,2 M del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0), 2 equivalenti (2,4% (v/v)) di metil acetoacetato, 0,25 U di 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum ricombinante in E. coli, 4 U di ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH), 0,8 mM NADP<+>(40 µl di una soluzione acquosa 10 mM di NADP<+>), 50 mM tampone potassio fosfato, pH 8,0.
La conversione completa ( ≥ 99,5%) dell’acido colico (I) in acido 3α,12α-diidrossi-7-cheto-5β-colanoico (V) à ̈ ottenuta in un tempo di 16 h. Il grado di conversione à ̈ stato valutato mediante analisi TLC utilizzando come sistema eluente cloroformio/metanolo/acido acetico (10:1:0,5).
Esempio 5 - Ossidazione dell’ossidrile in posizione 7 dell’acido colico (I) catalizzata dalla 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum in presenza della ADH NADPH-dipendente da T. brockii (SIGMA-ALDRICH).
La reazione à ̈ stata condotta a 20° C e pH 8,0 in un volume totale di 0,5 ml contenente: 0,5% (p/v) del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0 (12,5 mM, ottenuto diluendo una soluzione acquosa 0,2 M del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0), 2 equivalenti (0,3% (v/v)) di metil acetoacetato, 4 U di 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum ricombinante in E. coli, 10 U di ADH NADPH-dipendente da T. brockii (SIGMA-ALDRICH), 0,2 mM NADP<+>(10 µl di una soluzione acquosa 10 mM di NADP<+>), 50 mM tampone potassio fosfato, pH 8,0.
La conversione completa ( ≥ 99,5%) dell’acido colico (I) in acido 3α,12α-diidrossi-7-cheto-5β-colanoico (V) à ̈ ottenuta in un tempo di 4 h. Il grado di conversione à ̈ stato valutato mediante analisi TLC utilizzando come sistema eluente cloroformio/metanolo/acido acetico (10:1:0,5).
Esempio 6 - Ossidazione dell’ossidrile in posizione 7 dell’acido 12-chetochenodesossicolico (VI) catalizzata dalla 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum in presenza della ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH).
La reazione à ̈ stata condotta a 20° C e pH 8,0 in un volume totale di 0,5 ml contenente: 4% (p/v) del sale sodico dell’acido 12-chetochenodesossicolico a pH 8,0 (100 mM, ottenuto diluendo una soluzione acquosa 0,2 M del sale sodico dell’acido 12-chetochenodesossicolico a pH 8,0), 2 equivalenti (2,4% (v/v)) di metil acetoacetato, 4 U di 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum ricombinante in E. coli, 4 U di ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH), 0,8 mM NADP<+>(40 µl di una soluzione acquosa 10 mM di NADP<+>), 50 mM tampone potassio fosfato, pH 8,0.
La conversione completa ( ≥ 99,5%) dell’acido 12-chetochenodesossicolico (VI) in acido 3α-idrossi-7,12-dicheto-5β-colanoico (VII) à ̈ ottenuta in un tempo di 16 h. Il grado di conversione à ̈ stato valutato mediante analisi TLC utilizzando come sistema eluente cloroformio/metanolo/acido acetico (10:1:0,5).
Esempio 7 - Ossidazione degli ossidrili in posizione 7 e 12 dell’acido colico (I) catalizzata dalla 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum e dalla 12α-HSDH NADPH-dipendente (ASA) in presenza della ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH).
La reazione à ̈ stata condotta a 20° C e pH 8,0 in un volume totale di 0,5 ml contenente: 0,5% (p/v) del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0 (12,5 mM, ottenuto diluendo una soluzione acquosa 0,2 M del sale sodico dell’acido colico a pH 8,0), 2 equivalenti (0,6% (v/v)) di metil acetoacetato, 2 U di 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum ricombinante in E. coli, 4 U di 12α-HSDH NADPH-dipendente (ASA), 4 U di ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH), 0,8 mM NADP<+>(40 µl di una soluzione acquosa 10 mM di NADP<+>), 50 mM tampone potassio fosfato, pH 8,0.
La conversione completa ( ≥ 99,5%) dell’acido colico (I) in acido 3α-idrossi-7,12-dicheto-5β-colanoico (VII) à ̈ ottenuta in un tempo di 16 h. Il grado di conversione à ̈ stato valutato mediante analisi TLC utilizzando come sistema eluente cloroformio/metanolo/acido acetico (10:1:0,5).
Esempio 8 - Ossidazione dell’ossidrile in posizione 7 dell’acido chenodesossicolico (III) catalizzata dalla 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum in presenza della ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH).
La reazione à ̈ stata condotta a 20° C e pH 8,0 in un volume totale di 0,5 ml contenente: 2% (p/v) del sale sodico dell’acido chenodesossicolico a pH 8,0 (50 mM, ottenuto diluendo una soluzione acquosa 0,2 M del sale sodico dell’acido chenodesossicolico a pH 8,0), 2 equivalenti (1,2% (v/v)) di metil acetoacetato, 4 U di 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum ricombinante in E. coli, 3 U di ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH), 0,6 mM NADP<+>(30 µl di una soluzione acquosa 10 mM di NADP<+>), 50 mM tampone potassio fosfato, pH 8,0.
La conversione completa (≥ 99,5%) dell’acido chenodesossicolico (III) in acido 7-chetolitocolico (IX) à ̈ ottenuta in un tempo di 16 h. Il grado di conversione à ̈ stato valutato mediante analisi TLC utilizzando come sistema eluente cloroformio/metanolo/acido acetico (10:1:0,5).
Esempio 9 - Ossidazione in sistema bifasico dell’ossidrile in posizione 7 dell’estere metilico dell’acido colico (II) catalizzata dalla 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum in presenza della ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH).
La reazione à ̈ stata condotta a 20° C, pH 8,0 e 1400 rpm in un volume totale di 1 ml contenente: a) 0,5 ml di una soluzione al 4% (p/v) dell’estere metilico dell’acido colico in i-propilacetato (100 mM, ottenuto sciogliendo 20 mg dell’estere metilico dell’acido colico in 0,5 ml di i-propilacetato); b) 0,5 ml di 50 mM tampone potassio fosfato, pH 8,0, contenente a sua volta 2 equivalenti (2,4% (v/v)) di metil acetoacetato, 5,5 U di 7α-HSDH NADPH-dipendente da C. absonum ricombinante in E. coli, 4 U di ADH NADPH-dipendente ricombinante in E. coli (SIGMA-ALDRICH), 0,8 mM NADP<+>(40 µl di una soluzione acquosa 10 mM di NADP<+>).
La conversione completa ( ≥ 99,5%) dell’estere metilico dell’acido colico (II) nell’estere metilico dell’acido 3α,12α-diidrossi-7-cheto-5β-colanoico (VIII) à ̈ ottenuta in un tempo di 16 h. Il grado di conversione à ̈ stato valutato mediante analisi TLC utilizzando come sistema eluente cloroformio/metanolo/acido acetico (10:1:0,5).

Claims (19)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Processo per l’ossidazione enzimatica regioselettiva nelle posizioni 7 e/o 12 dei composti di formula o dei loro sali o derivati, comprendente il far reagire detti composti con idrossisteroide deidrogenasi (HSDH) NAD(P)<+>dipendente in presenza di un sistema di rigenerazione del cofattore NAD(P)<+>comprendente metil acetoacetato e alcol deidrogenasi (ADH) NAD(P)<+>dipendente.
  2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1, dove la HSDH NAD(P)<+>dipendente ha una attività enzimatica compresa tra 0,25 e 12 U.
  3. 3. Processo secondo la rivendicazione 1, dove i composti di formula (I), (II) o (III), i loro sali o derivati hanno una concentrazione compresa tra lo 0,5% e il 4% (peso/volume).
  4. 4. Processo secondo la rivendicazione 1, dove i composti di formula (I), (II) o (III), i loro sali o derivati hanno una concentrazione compresa tra 12,5 mM e 100 mM.
  5. 5. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti , dove il cofattore NAD(P)<+>à ̈ usato in quantità catalitiche ad una concentrazione compresa tra 0,2 mM e 0,8 mM.
  6. 6. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, dove il co-substrato metil acetoacetato à ̈ utilizzato in un quantitativo pari a 2 equivalenti rispetto a ciascuno dei composti (I), (II) o (III).
  7. 7. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, dove il co-substrato metil acetoacetato à ̈ utilizzato in quantità comprese tra 0,3% e 2,4% (volume/volume).
  8. 8. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, dove l’ossidazione à ̈ quantitativa, ovvero maggiore od uguale al 99,5%.
  9. 9. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, condotto a temperatura ambiente, ovvero a circa 20° C.
  10. 10. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, condotto ad un pH pari a 8.
  11. 11. Processo secondo la rivendicazione 10, ulteriormente comprendente un sistema tampone, preferibilmente costituito dal tampone potassio fosfato.
  12. 12. Processo secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dall’essere eseguita in un sistema bifasico acquoso/organico, dove il solvente organico preferibilmente à ̈ i-propilacetato.
  13. 13. Processo secondo le rivendicazioni 11 e 12, dove il sistema tampone à ̈ il tampone potassio fosfato ed il solvente organico à ̈ i-propilacetato.
  14. 14. Processo secondo la rivendicazione 1, dove il sale dell’acido colico o dell’acido chenodesossicolico à ̈ il sale sodico.
  15. 15. Processo per la preparazione di acido ursodesossicolico (IV), caratterizzato dal fatto di comprendere un processo per la sintesi di acido 3α,12α-diidrossi-7-cheto-5β-colanoico (IV) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14.
  16. 16. Processo per la preparazione di acido ursodesossicolico (IV), caratterizzato dal fatto di comprendere un processo per la sintesi di acido 3α,7α-diidrossi-12-cheto-5β-colanoico (VI) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14.
  17. 17. Processo per la preparazione di acido ursodesossicolico (IV), caratterizzato dal fatto di comprendere un processo per la sintesi di acido 3α-idrossi-7,12-cheto-5β-colanoico (VII) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14.
  18. 18. Processo per la preparazione di acido ursodesossicolico (IV), caratterizzato dal fatto di comprendere un processo per la sintesi di acido 7-chetolitocolico (IX) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14.
  19. 19. Processo per la preparazione di acido ursodesossicolico (IV), caratterizzato dal fatto di comprendere un processo per la sintesi dell’estere metilico dell’acido 3α,12α-diidrossi-7-cheto-5β-colanoico (VIII) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13.
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