ITMI20012110A1 - Vettori multi-cistronici utilizzabili in protocolli di trsferimento genico - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale

La presente invenzione ha per oggetto la costruzione di vettori plasmidici di espressione eucariotica multicistronici, nei quali è possibile esprimere da due a quattro geni contemporaneamente, caratterizzati da unità di trascrizione bicistroniche differentemente regolate. La peculiarità di questi vettori è data dalla presenza di un meccanismo di inizio della traduzione cap-indipendente che si basa sulla capacità di una sequenza IRES (internal ribosomal entry site) di tradurre due proteine sotto il controllo di un unico promotore. Questa famiglia di vettori multicistronici può essere usata vantaggiosamente in diverse applicazioni biotecnologiche, dove è necessaria l’espressione simultanea di due o più geni, come protocolli di trasferimento genico, immunizzazione a DNA o per l’espressione di diverse molecole nella stessa cellula.

STATO DELL’ARTE

Esistono in letteratura diversi approcci per ottenere la co-espressione di più di un gene all'interno di uno stesso vettore sia di tipo virale, retrovirale o DNA plasmidico.

Ogni strategia descritta in letteratura ha l’obiettivo di evitare i problemi associati all’uso di più promotori in un vettore per l’espressione di più proteine, quali la possibilità di riarrangiamenti o delezioni, interferenza competitiva di diversi promotori o soppressione di promotori. La presenza di più promotori all'interno dello stesso vettore infatti porta spesso ad interferenze di trascrizione o all’espressione dissociata dei diversi geni, con la possibilità di una mancata espressione del gene di interesse.

Un approccio alternativo descritto consiste nell’uso di proteine di fusione, cioè due geni vengono fusi in frame in modo tale da ottenere una proteina chimerica. Questo meccanismo è però caratterizzato da numerosi problemi che rendono il suo uso non applicabile in molti casi, in quanto non sempre due proteine fuse mantengono la stessa attività; inoltre, la localizzazione cellulare delle due proteine originali può essere diversa e rendere problematica l’espressione e la funzionalità delle singole proteine di interesse.

Una seconda alternativa è la costruzione di una unità policistronica composta da molte sequenze codificanti in stretta prossimità l’una dell’altra in modo tale da favorire il meccanismo di re-inizio della traduzione. H limite di questo approccio è che l’efficienza di traduzione dei geni successivi al primo risulta spesso drasticamente ridotta.

Nella presente invenzione viene descritto un nuovo approccio basato sull’uso di sequenze virali IRES in grado di risolvere tutti i problemi legati alla co-espressione di più proteine all’interno di uno stesso vettore. Queste sequenze permettono Γ inizio indipendente della traduzione di ogni peptide grazie al meccanismo di funzionamento che consiste nella traduzione del primo gene in modo cap-dipendente, mentre il secondo gene viene tradotto in un modo IRES-dipendente. E’ stato dimostrato che questo meccanismo porta ad un efficiente trascrizione e traduzione del secondo cistrone, senza nessun tipo di interferenza con il meccanismo di espressione del primo cistrone.

In particolare, il vettore tetracistronico descritto nella presente invenzione è caratterizzato dalla presenza di due sequenze IRES di diversa origine, essendo tale configurazione in grado di incrementare la stabilità del vettore e di evitare la competizione tra fattori di trascrizione e traduzione coinvolti nell’espressione delle proteine clonate.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

E’ stata trovata e viene ora descritta una nuova famiglia di vettori di espressione eucariotici multi-cistronici caratterizzati da due unità di trascrizione bicistroniche distinte, complete e differenzialmente regolate. Questi vettori sono caratterizzati dalla presenza di due differenti sequenze promoter/enhancer, cytomegalovirus (p/eCMV) e Rous sarcoma virus (pRSV), che guidano independentemente la trascrizione di cDNA ricombinanti. La peculiarità dei vettori bicistronici secondo la presente invenzione è legata alla presenza di un meccanismo alternativo di inizio della traduzione cap-independente, che si basa sulla capacità della sequenza IRES (sito di legame interno del ribosoma) di tradurre due proteine sotto il controllo di un singolo promotore. E’ inoltre descritto lo sviluppo di vettori tri- o tetra- cistronici direttamente derivanti dai suddetti vettori bi-cistronici, aventi la proprietà comune di poter esprimere diverse proteine, con la possibilità che una delle proteine codificate possa modulare l’effetto di altre.

Abbiamo dimostrato in vitro l’efficienza di espressione di tali vettori in differenti protocolli di trasferimento genico, tramite la trasfezione di cellule COS, analizzando l’espressione di geni reporter.

Questi vettori multicistronici possono essere impiegati in tutte le applicazioni biotecnologiche nelle quali sia necessario esprimere simultaneamente due o più geni, quali per esempio il trasferimento genico, l immunizzazione mediante somministrazione di DNA plasmidici a scopo sia profilattico che terapeutico e per l’espressione di differenti molecole che modulino l’una l’effetto dell’altra.

La capacità degli elementi IRES di promuovere l’inizio interno della traduzione dell’RNA ha facilitato l’espressione di due o più proteine da un’unità di trascrizione policistronica in cellule eucariotiche. Vettori di espressione utilizzati per co-esprimere geni portano spesso ad interferenze trascrizionali e/o ad espressione genica dissociata, con una frazione delle cellule selezionate che esprimono solo uno dei geni di interesse. La coespressione di due proteine, dove una è un gene reporter, un marker selezionabile, un antigene o qualsiasi molecola con attività immunomodulante o immunostimolante, è spesso un requisito delle applicazioni biotecnologiche; in particolare, molte applicazioni nelle terapie geniche richiedono il rilascio coordinato di più di una proteina.

In anni recenti, per evitare i problemi associati con la stabilità dell’mRNA di differenti trascritti, sono stati sviluppati vettori bicistronici contenenti elementi IRES che sono stati applicati ad una varietà di situazioni sperimentali, dalle coltivazioni cellulari agli animali transgenici. La presente invenzione ha per oggetto la costruzione di una nuova serie di plasmidi per la terapia genica e per l’espressione di proteine, caratterizzati dal contenere elementi regolatori di origine virale o da geni eucariotici. Queste sequenze sono contenute in un plasmide compatto e relativamente piccolo, non più grande di 8000 bp; la piccola taglia del vettore consente l’introduzione di geni di notevole dimensione senza compromettere l’efficienza della trasfezione, o la produzione di plasmidi su larga scala da ceppi di E. coli.

I plasmidi oggeto della presente invenzione sono caraterizzati da una o due unità indipendenti di trascrizione, ognuna delle quali consiste in un forte promoter/enhancer virale (p/eCMV or pRSV), sequenze introniche (CMV-Intron A o Introne della β-globina di coniglio) per aumentare la stabilità dei transcritti così otenuti, un IRES virale, ed un efficiente elemento di terminazione della trascrizione (Sito di poliadenilazione di SV-40 o terminatore dell'ormone della crescita BGH). Entrambe le unità transcrizionali contengono specifici siti di restrizione rari dove un cDNA ricombinante può essere facilmente clonato.

In questi nuovi vetori, le interferenze trascrizionali sono evitate tramite l’impiego di promotori e segnali di poliadenilazione di origine differente, ed introducendo siti di pausa al termine della prima cassetta per terminare efficacemente la trascrizione.

Una peculiarità dei nostri vetori è che ogni unità di trascrizione contiene una differente sequenza IRES, derivata dal virus della encefalomiocardite (ECMV) o dal virus della epatite C (HCV), che può essere usata per assemblare operoni eucariotici artificiali, dove il primo cistrone è tradoto in un classico meccanismo cap-dipendente ed il successivo cistrone si basa su un inizio della traduzione cap-indipendente. E’ stato infatti inaspettatamente trovato che la presenza di sequenze IRES differenti aumenta la stabilità del vetore ed evita la competizione per fatori che agiscono in trans sulla sequenza stessa. Questi elementi IRES sono noti per essere tra i più forti indutori di traduzione e mostrano uno scarso tropismo tissutale {Barman AM, et al. " Comparison of picoraviral IRES-driven internai initìation of translation in cultured cells of different origins" Nucleic Acids Research. 25 (5) : 925-932. 1997).

I vettori secondo la presente invenzione sono costruiti sulla base di un vettore procariotico pUC19, con un gene per la resistenza alla kanamicina ed un’origine di replicazione (ori) basata su pUC19, per Γ amplificazione ed il mantenimento in batteri.

Infine, la possibilità di clonaggio con 4 siti di restrizione diversi e rari, permette di inserire in questi plasmidi qualsiasi cDNA e di utilizzarli per svariate applicazioni biotecnologiche e terapeutiche.

Pertanto, l’oggetto principale della presente invenzione è rappresentato da un vettore plasmidico ricombinante multicistronico per l’espressione di almeno due proteine di interesse, uguali o distinte tra loro, contenente almeno una cassetta di espressione eucariotica comprendente, in fase di lettura, ima sequenza promoter/enhancer, una sequenza intronica, un sito di clonaggio, una sequenza virale IRES, un sito di clonaggio ed un terminatore di catena.

Preferibilmente, la sequenza IRES proviene dal virus della encefalomiocardite o dal virus della epatite C, la sequenza promoter/enhancer è p/eCMV o pRSV , la sequenza intronica è CMV-Intron A o lintrone della β-globina di coniglio, mentre i terminatori sono PolyA-SV40 e il BGH terminator (terminatore del'ormone della crescita bovino).

Secondo uno degli aspetti preferiti dell’ invenzione, la sequenza promoter/enhancer e la sequenza intronica possono essere fuse tra loro; in particolare, la sequenza promoter/enhancer p/eCMV è preferibilmente fusa alla sequenza intronica CMV-Intron A.

Nel caso in cui il vettore contenga due distinte cassette, le due sequenze IRES sono preferibilmente di differente origine virale; normalmente, una cassetta conterrà la sequenza IRES proveniente dal virus della encefalomiocardite e l’altra cassetta conterrà la sequenza IRES proveniente dal virus della epatite C. Analogamente, una cassetta conterrà preferibilmente la sequenza promoter/enhancer p/eCMV e l’altra cassetta la sequenza pRSV, così come una cassetta conterrà la sequenza intronica CMV-Intron A e l’altra l’introne della β-globina di coniglio. Analogamente una cassetta conterrà il terminatore Poly A-SV40 e l'altra il terminatore dell'ormone della crescita bovino (BGH).

I siti di clonaggio preferiti sono: SalI, XhoI, BsiWI, NotI, BstBI, EcoKV. In particolare, i vettori plasmidici aventi sequenza: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ED NO 4, riportati in figura 4, costituiscono un aspetto preferenziale della presente invenzione.

Ulteriori oggetti dell’ invenzione sono rappresentati dalle cellule ospiti eucariotiche contenenti almeno un vettore plasmidico come sopra definito, un procedimento per l’espressione di almeno due proteine eucariotiche comprendente la coltivazione di tale celula ospite (e, opzionalmente, il recupero delle proteine), nonché l’uso dei vettori plasmidici secondo la presente invenzione nel trasferimento genico, nella terapia genica e nellimmunizzazione a DNA.

Ulteriori aspetti dell’invenzione risulteranno evidenti dalla seguente parte sperimentale, che non deve essere considerata limitativa della stessa.

Esempi

Sistema di selezione con marcatore procariotico

gene Amp<R >è stato eliminato dal vettore pUC19 vector (New England, Biolabs) tramite digestione con AlwNI e SspI ed il plasmide rimanente è stato ligato con il gene per la resistenza alla kanamicina, precedentemente recuperato dal vettore pET39 (Novagen) tramite digestione con Asp700 e AlwNI, per ottenere Pl-62 (2583 bp).

Purificazione del plasmide. DNA contenuto nel ceppo di E.coli trasformato DH5-a (SUPE44,AlacU 169(Φ80 lacZAM15), hsdR17, ree A1, endA1, gyrA96, thi-1, relAl) è stato fatto crescere in terreno LB supplementato con 30 μg/ml di kanamicina, e il DNA plasmidico è stato purificato con il Kit Clontech Miniprep plasmid Kit. Il DNA è stato quantificato mediante spettrofotometria UV e la sua purezza verificata calcolando il rapporto delle assorbanze a 260nm e a 280nm.

Tecniche di clonaggio

Tutte le tecniche di clonaggio sono state eseguite seguendo le procedure convenzionali descritte (SambrookJ, et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory Manual 2<nd >ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Enzimi di restrizione e di modificazione sono stati ottenuti da New England Biolabs, Ine. e usati come raccomandato dal venditore.

Clonaggio dei seni reporter

I geni codificanti per i geni reporter sono stati amplificati per PCR utilizzando primers contenenti specifici siti di restrizione per favorire l'integrazione dei geni nei siti di clonaggio dei due vettori, fi gene codificante per la EGFP-1 (735 bp) è stato amplificato dal vettore pEGFP (Clontech) con i primers EGFP-1

SalI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) ed EGFP-2 XhoI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), digerito con gli enzimi di restrizione SalI e XhoI e ligato ai siti SalI e XhoI (MCS1) di PI- 163, per ottenere il vettore P1-174 (5961 bp), e con i primers GFP-178-A

EcoRV sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e GFP-178-B BstBI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), digerito con i siti di restrizione EcoRV e BstBI e ligato ai siti EcoRV, BstBI (MCS3) di P1- 178, per ottenere il plasmide PI- 189 (5200 bp). Il gene codificante per Luciferase (1630 bp) è stato amplificato per PCR dal plasmide pi 87 ( Clontech ) con i primers Luc-1 BsIWI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e Luc-2 sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), e ligato al plasmide Pl-174 , precedentemente digerito con BsIWI (MCS2), per ottenere il plasmide P1-177 (7636 bp), e con i primers Lucif-1 Noti sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e Lucif-2 BglI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), digerito con Noti e BglI e ligato ai siti Noti e BglI (MCS4) of P1-189, per ottenere il vettore Pl-193 plasmid (5200 bp). Tutti i plasmidi ottenuti sono stati controllati con analisi di restrizione e sequenza.

Test di trasfezione

Allo scopo di dimostrare l’attività delle unità trascrizionali inserite nei vettori pl-177 e pl-193 e contenenti i cDNA per la luciferasi e EGFP-1, come in precedenza descritto, e conseguentemente verificare la corretta attività dell’IRES posta tra i due cDNA, abbiamo transfettato i vettori ottenuti in una linea cellulare eucariotica (COS) di cellule renali di scimmia.

Le cellule COS sono state cresciute in condizioni di monostrato, su terreno non selettivo DMEM in presenza di 10% siero fetale bovino, e mantenute a 37°C in ambiente umidificato e condizionato con il 10% di C02. Le cellule COS, mantenute in coltura alla concentrazione compresa tra 1x105 e 3x106, sono state trasfettate con il metodo della precipitazione del DNA tramite calcio fosfato [Ca3(P04)2] utilizzando sia il plasmide ricombinante p1177 che il vettore di controllo pll63, alla concentrazione finale di 10-20 μg/ml. Le cellule usate per la transfezione sono state seminate 24 ore prima alla densità di 0.5-1x106 per piastra da 10 cm. Il terreno di coltura è stato rinnovato 4-8 ore prima e 8-10 ore dopo la trasfezione.

Lo stesso procedimento è stato seguito con il vettore pl-193.

Discussione

Nella presente invenzione descriviamo la strategia di costruzione di una nuova famiglia di vettori multicistronici utilizzabili per diverse applicazioni biotecnologiche e terapeutiche. La famiglia di vettori è stata ottenuta dalla costruzione di due vettori base bicistronici contenenti promotori costitutivi di origine virale e differenti elementi trascrizionali, correlati ad alti livelli di espressione e ad un’ aumentata stabilità della resa dei trascritti.

Tutti i plasmidi costruiti sono basati sullo scheletro del vettore pUC19, che contiene Torigine di replicazione ColEl per la produzione di un alto numero di copie di plasmide per cellula batterica, e che è stato modificato sostituendo il gene endogeno per la resistenza allampicillina utilizzato per una appropriata selezione in sistemi batterici (es. E.coli) con il gene per la resistenza alla kanamicina.

I vettori comunemente descritti in letteratura, basati su un sistema di selezione che utilizza la resistenza all’ampicillina, non sarebbero infatti accettabili dalle autorità regolatorie intemazionali (FDA e WHO) per l’impiego in terapia genica umana, poiché lampicillina potrebbe conferire la resistenza agli antibiotici beta-lattamici oltre che indurre shock anafilattico in individui sensibili qualora fosse presente in tracce come contaminante del DNA plasmidico.

Pertanto, i vettori oggetto della presente invenzione sono caratterizzati dalla presenza del gene che codifica per la resistenza alla kanamicina e dall’assenza di altre sequenza di origine batterica che sono state eliminate per evitare i possibili effetti negativi sui livelli di espressione dei costrutti. Per costruire il primo plasmide bicistronico PI- 190 i differenti elementi trascrizionali, ottenuti mediante amplificazione per PCR, sono stati ligati nei siti di clonaggio presenti nella sequenza del vettore base pUC19 (Figura 1), mentre tutti gli elementi trascrizionali del vettore bicistronico PI- 178 sono stati clonati nel sito di restrizione FspI di pUC19, che è localizzato circa 200 nucleotidi a valle della regione di clonaggio (poly-linker) del vettore pUC19 (Figura 2). Questo è stato fatto per due motivi: primo per avere la possibilità di clonare direttamente la cassetta di trascrizione completa di PI- 178 nel plasmide PI- 190, per ottenere un vettore tetracistronico chiamato Pl-250 (Figura 3), secondo per creare una distanza di circa 200 nucleotidi tra le due cassette, per essere certi che l’RNA polimerasi I si fermi dopo il segnale di terminazione presente nella prima unità di trascrizione.

Il vettore tricistronico Pl-249 è stato ottenuto eliminando mediante digestione con enzimi di restrizione, la sequenza HCV-IRES dal vettore Pl-250.

E’ stato anche clonato un sito di pausa a valle della prima cassetta di trascrizione, per eliminare la possibilità di avere interferenza tra le due unità di trascrizione. E’ stato dimostrato infatti che quando un sito di pausa è posizionato immediatamente a valle di un forte segnale di poliadenilazione, si ottengono significativi livelli di terminazione della trascrizione. ( Leviti N , et al “ A pause site for RNA polymerase II is associateti with termination of transcription ". Embo J 10, 7, 1833-1842). La richiesta di un sito di pausa funzionale nella terminazione della trascrizione da parte del RNA polimerasi Π è stata dimostrato in diversi geni: globina umana a2, adenovirus major late e polioma virus late ( Adami G. et., EMBO J 1998. 7, 2107-2116 "The slowing down orpausing ofthe elongation RNA polymerase beyond thè 3’ processing signals of thè gene is a key component of thè termination process"; Eggermont J., Proudfoot NJ “Poly(A) signals and transcriptional pause sites combine to prevent interference between RNA polymerase II promoters”. 1993 EMBO j. 12 (6): 2539-2548).

Nei costrutti descritti è stato utilizzato il sito di pausa del gene umano della globina a2 che è stata riportata essere una regione di 92 pb, molto ricca in A e caratterizzata da una sequenza ripetuta quasi perfetta (CA^, che agisce in modo dipendente dall’orientamento per decrementare la velocità alla quale il segnale a valle di forte processamento è raggiunto dal RNA polimerasi. La metà 3’ del sito di pausa non ha evidenti siti di legame per proteine, nemmeno può essere ripiegato in una significativamente stabile struttura di RNA. ( Moreira A. et al., “Upstream sequence elements enhance poly(A) site efficiency of thè C2 complement gene and are phylogenetically conserved”. EMBOJ. 1995. 14 (15): 3809-3819 ).

Quando la regione di 92 bp è posta al 3’ di un efficiente sito di poliadenilazione, è possibile non solo determinare una pausa della trascrizione, ma anche significativi livelli di terminazione dopo il sito di pausa. Questa regione sembra interagire con il sito di poliadenilazione per facilitare la terminazione della trascrizione.

Per costruire le due unità di trascrizione sono stati utilizzati diversi elementi trascrizionali quali forti promotori virali (p/eCMV e pRSV), sequenze introniche (CMV-IntronA e Γ-β-globin-Intron), siti di poliadenilazione ed elementi IRES. I promotori ed i segnali di terminazione utilizzati erano di di diversa origine per eliminare qualsiasi possibilità di interferenze trascrizionali.

La maggior parte dei vettori di espressione in mammifero commerciali portano un promotore che deriva da virus patogeni. Sebbene questi elementi derivano da virus, essi sono diventati elementi molto utili per il loro uso in protocolli di terapia genica e per l’immunizzazione genetica, grazie alla loro alta capacità di iniziare la trascrizione in molti tessuti di mammifero. promotore/ enhanc er del citomegalovirs (p/eCMV) e il promotore di Rous Sarcoma Virus (pRSV) sono due promotori virali molto forti e sono i promotori più utilizzati comunemente poiché inducono una forte espressione di tipo costitutivo in diversi tipi cellulari. I due promotori mostrano una forza simile, permettendo la co-espressione di due o più geni ed evitando differenze di espressione quando utilizzati insieme nello stesso vettore.

A proposito degli effetti benefici dati dall’uso di sequenze introniche per l’espressione di proteine, è stato dimostrato che essi incrementano l’espressione di geni eterologhi in vitro. ( Chapman et al. "Effect of intron A from human cytomegalovirus (T owne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells". 1991. NAR 19 (14): 3979-3986). Il loro effetto sull’espressione della trascrizione è stato associato principalmente ad un ‘aumentata velocità di poliadenilazione dell’RNA e/ associata al trasporto nucleare associato allo splicing del RNA. Inoltre le sequenze introniche hanno un importante effetto sull’espressione dell’antigene e sono state dimostrate incrementare l’espressione genica in diversi sistemi di transfezione. L’effetto positivo dell’Introne A e dell’Introne della β-globina di coniglio sull’espressione delle proteine, può derivare dalla regolazione di elementi a monte con attività di promotore/enhancer, o dal contributo al processamento di mRNA stabili. (Huang MT and Gorman CM " Intervening sequences increase efficiency of RNA 3 ’ processing and accumulation of cytoplasmic RNA " . 1990. NAR.

18: 937-946). Un altro importante elemento necessario per una corretta ed efficiente terminazione della trascrizione è costituito dai siti di poliadenilazione. La poliadenilazione è un processo essenziale per la produzione di mRNA stabili e per aumentare l’efficienza di traduzione del mRNA che può essere variabile a seconda dei diversi terminatori che vengono utilizzati. Inoltre, quando la velocità di inizio della trascrizione è incrementata utilizzando forti elementi promotori/enhancer, il processo di terminazione della trascrizione può diventare un fattore limitante per Γ efficienza di trascrizione. {Jackson RJ and Standart . “Do thè poly(A) tail and 3’ untranslated region control mRNA translation?’’. Cell. 1990; 62: 15-24) . Il segnale di poliadenilazione tardivo di SV40 è molto efficiente ed incrementa la stabilità ed i livelli di RNA circa 5 volte di più del segnale Poly-A SV40 iniziale. {Carswell S and Alwine JC “Efficiency of utilization of thè simian virus 40 late polyadenilation site: effects of upstream sequences ”. 1989. Molecular and Cellular Biology. 9: 4248-4258 ). Nei plasmidi descritti, questo segnale di poliadenilazione è stato localizzato appena a valle del sito di clonaggio, in modo tale da facilitare l’efficiente processamento dei geni clonati che potrebbero non avere un efficiente segnale di poliadenilazione.

L’altro sito di poliadenilazione utilizzato nei nostri vettori è il terminatore derivato dall'ormone della crescita bovino (BGH), che contiene il segnale di poliadenilazione essenziale ed elementi di terminazione a valle, ma può essere anche il terminatore derivato dal gene della β-globina di coniglio (mRGB) . {Leviti et al. " Definition of an efficìent synthetic poly(A) site ".

1989, Genes and Dev. 3: 1019-1025). La presenza di questi terminatori della trascrizione ottimizzati è stata dimostrata incrementare l’espressione proteica paragonata ad altri terminatori (Hartikka J et al. "An improved plasmici DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle” Human Gene Therapy 1996.7: 1205-1217).

La caratteristica peculiare della famiglia di vettori plasmidici da noi costruita è data dalla presenza di due diverse sequenze virali IRES, EMCV-IRES e HCV-IRES, utilizzate per ottenere la traduzione del secondo cistrone nei mRNAs bicistronici.

I siti di legame interno del ribosoma (IRES) sono elementi che agiscono in cis reclutando la subunità ribosomale piccola in un codone di inizio interno presente nel mRNA, con l’aiuto di fattori cellulari che agiscono in trans. Questa regione può funzionare come iniziatore di un'efficiente traduzione del codice di lettura, con nessuna influenza sul meccanismo di traduzione cap-dipendente che regola la traduzione del primo cistrone. Il meccanismo dei due processi differisce anche chiaramente dall’uso di diversi fattori cellulari.

Gli elementi IRES possono assumere una particolare struttura secondaria che catalizza l’assemblaggio dei ribosomi e la loro scansione. Alcuni geni di mammifero contengono elementi IRES per assicurare la traduzione in specifici stadi di normale sviluppo o quando la traduzione è soppressa in seguito ad un infezione. ( Birstìel ML.et al, “Transcription termination and 3’ processing: thè end is in site. ” 1985 Celi. 4: 349-359 ). I virus patogeni spesso reindirizzano risorse di traduzione cellulare dell’ospite verso la replicazione virale, distruggendo il meccanismo di traduzione capdipendente dell’ospite e traducendo i loro trascritti in un modo IRES-mediato. Sebbene la maggior parte di questi messaggeri virali siano monocistronici, i loro elementi IRES possono essere usati per assemblare operoni eucariotici artificiali dove il primo cistrone è tradotto in un meccanismo classico cap-dipendente e il successivo cistrone secondo un meccanismo di inizio della traduzione cap-indipendente. (Fussenegger M. et al. “Regulated multicistronic expression technology for mammalian metabolic engeneering”. Cytotechnology 1998. 28: 111-125).

La capacità degli elementi IRES di promuovere Γ inizio interno della traduzione del RNA ha facilitato l’espressione di due o più proteine da un’unità di trascrizione policistronica in cellule eucariotiche ( Borman AM. et al. “Comparison of picomaviral IRES-driven internai initiation of translation in cultured cells of different origins" NAR. 1997. 25 (5): 925-932); nella maggior parte dei casi l’efficienza dell’espressione del secondo gene viene incrementata ( Goliardo HF, et al. “ The internal rìbosome entry site of thè encephalomyelitis virus enables reliable coespression of two transgenes in human primary T lymphocytes” . Gene Therapy. 1997.

4:1115-1119).

Nel virus di Encefalomiocardite (EMCV) la regione IRES, che è stata inclusa secondo una classificazione generale nelle IRES di Picomavirus di tipo , consiste di circa 450-600 nucleotidi della regione al 5’ non tradotta, termina al 3’ con un elemento di 25 nucleotidi che consiste di un motivo conservato UUUC, seguito da un tratto più variabile ricco in pirimidine e uno spaziatore povero di G, e infine di una tripletta AUG, che è considerata essere l’attuale sito di entrata del ribosoma. La presenza di questa regione facilita la creazione di un vettore bicistronico in quanto permette la traduzione di due ORFs da un solo messaggero. (Jang SK. Et al., “A segment of thè 5 ‘ non translated region of encephalomyocarditis virus RNA directs internai entry of ribosomes during in vitro translation”. J. Of Virology 1998. 62 (8): 2636-2643).

La sequenza IRES del virus dell’epatite C (HCV) si comporta come un IRES di tipo I, come le IRES di EMCV e di FMDV, che sono state descritte come migliori candidati per guidare l’inizio di traduzione interna. Questa regione è nota per essere in grado di iniziare la traduzione della poliproteina di HCV mediante un sito di legame interno del ribosoma (IRES), che coinvolge la maggior parte delle regioni non tradotte. La sequenza IRES di HCV è fortemente dipendente sia dalla sequenza primaria di questo segmento che dalla sua capacità di formare complessi di struttura secondaria e terziaria del RNA; in questa regione la maggioranza dei genotipi virali di HCV possiede 5 codoni AUG, che non vengono utilizzati per l’inizio della traduzione.

Differenti lavori mostrano che l’IRES di HCV guida l’inizio della traduzione in tutte le linee cellulari testate, incluse quelle che non derivano dai primati. Inoltre l’IRES di HCV, come dimostrato in altre IRES di tipo I, risulta molto più efficiente in vivo che in vitro. La minima sequenza HCV-IRES è ancora controversa. ( Fukushì S. et al. “Complete 5’ non coding region is necessary far thè effìcient internai initiation ofhepatitis C virus RNA " BBRC. 1994. 199 (2): 425-432; Tsukiyama-Kohara K et al. “ Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA ". J. Of Virology.

1992. 66 (3): 1476-1483). Diversi studi descrivono la sequenza IRES estesa circa dal nucleotide 44 fino al 354 del genoma di HCV. Noi abbiamo scelto di usare la sequenza nucleotidica compresa dal nucleotide 109-341 (230 bp del genotipo virale lb), poiché è stato dimostrato essere la minima regione funzionale. {Collier AJ. Et al. "Translation efficiencies of thè 5’ untranslated region from representatives of thè six major genotypes of hepatitis C virus using a novel bicistronic reporter assay System”. 1998. Journal of General Virology. 79: 2359-2366 ).

L’utilizzo di un corto segmento IRES è particolarmente importante per la costruzione di vettori dicistronìci poiché permette di incrementare le dimensioni dello spazio per Γ inserimento di un gene terapeutico. La funzionalità dei nostri vettori è stata testata in vitro trasfettando cellule COS, utilizzando il metodo del CaCl2 e clonando i geni reporter EGFP e luciferasi, facilmente rilevabili sia in vitro che in vivo.

Conclusioni

La famiglia dei nuovi vettori descritta nella presente invenzione rappresenta un versatile strumento che permette la creazione di nuove combinazioni geniche in un singolo vettore. La possibilità di co-esprimere due o più geni in un singolo vettore è significativamente più efficace e conveniente rispetto all'utilizzo di due vettori separati. Questa famiglia di vettori policistronici può trovare molte diverse applicazione in settori che includono approcci di terapia genica, studi di co-espressione, analisi dell’effetto sinergico di due geni in un particolare sistema cellulare e coespressione di due o più subunità di una proteina.

L’uso di un singolo vettore semplifica ed incrementa drammaticamente gli studi di co-trasfezione, poiché permette di risparmiare tempo nel processo di produzione di co-trasfettanti stabili in un singolo step di selezione, per produrre co-trasfettanti per esprimere entrambi i geni e raggiungere livelli di espressione simili per due proteine.

I nuovi vettori descritti nella presente invenzione sono perciò utilizzabili per esprimere due o più geni in diverse applicazioni biotecnologiche, in particolare per applicazioni di terapia genica, come terapia genica del cancro, terapia immunogenica e vaccinazione a DNA. In tutti queste applicazioni, l’approccio multigenico ha dimostrato infatti una maggiore efficienza rispetto all’approccio monogenico.

Fig. 1 Descrizione schematica della costruzione del vettore Pl-190 a) p/eCMV-IntronA (1622 bp) è stato amplificato per PCR dal vettore Pl-187 con i primers EP1A-1 PstI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e EP1A-2 PstI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), digerito con l'enzima di restrizione PstI e ligato al sito PstI del sito di clonaggio di Pl-62 , per ottenere il plasmide Pl-93 (4205 bp).

promotore p/eCMV è stato clonato nella stessa direzione del promotore LacZ del vettore pUC19, lo stesso è stato fatto per tutti gli altri frammenti clonati a valle del promotore p / eCMV .

b) ECMV-IRES (631 bp) è stato amplificato da pIRES (Invitrogen) con i primers pIRES-1 BamHI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e pIRES-2 BamHI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), digerito con l'enzima di restrizione BamHI e ligato al sito BamHI di Pl-93, per ottenere il vettore Pl-137 (4829 bp). c) Il frammento PolyA-SV40 (430 bp) è stato amplificato per PCR dal vettore pREP4 (Invitrogen) con i primers Poly-2A g g g g BsIWI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e Poly-3A NheI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), e ligato al vettore Pl-137 precedentemente digerito con EcoRI e trattato con l'enzima di modificazione Klenow. Questo clonaggio risulta nel vettore PI- 163 (5242 bp). I siti di restrizione BsIWI e Nhel sono stati introdotti nei primers per facilitare i seguenti passaggi di clonaggio.

d) Il frammento del sito di pausa (98 bp) è stato amplificato dal vettore P-GEM-P (Ottenuto sinteticamente da Baseclear, BH Leiden, The Netherland) con i primers PLS-1 Nhel sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e PLS-2 Nhel sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), e ligato al vettore PI- 163 , precedentemente digerito con Nhel. clonaggio da origine al plasmide PI- 190 (5340 bp).

Tutti i vettori ottenuti sono stati controllati mediante analisi di restrizione e di sequenza. MCS = siti di clonaggio multiplo. MCS1 = SalI, Xhol; MCS2 = BsIWI.

Fig. 2a/b Descrizione schematica della costruizone del vettore Pl-178 a) Per la costruzione del plasmide Pl-178 tutti i frammenti sono stati amplificati per PCR in modo tale da creare specifici siti di restrizione per integrare i frammenti nel vettore Pl-62 vector e anche per creare nuovi siti di clonaggio unici per i successivi passaggi di clonaggio.

Introne della β-globina di coniglio (700 bp) è stato amplificato dal vettore Pl-79 con i primers Intron-1 KasI sito sottolineato, EcoRV sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e Intron-2 Ndel sito sottolineato, Nhel sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), e ligato al vettore Pl-62 , precedentemente digerito con gli enzimi di restrizione Ndel e KasI. Il clonaggio da origine al vettore Pl-140 (3230 bp). I siti di restrizione EcoRV e Nhel sono stati introdotti per facilitare i successivi passaggi di clonaggio. b) pRSV (623 bp) è stato amplificato dal vettore pREP-4 (Invitrogen) con i primers pRSV-1 Nhel sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e pRSV-2 Ndel sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), digerito con Ndel e Nhel e ligato ai siti Ndel e Nhel di Pl-140, per creare il vettore Pl-154 (3850 bp).

c) Per la costruzione del plasmide PI- 165 il frammento codificante la regione HCV-IRES (260 bp) (Prodotto sinteticamente da Baseclear, BH Leiden, The Netherland) è stato tagliati per restrizione con gli enzimi BglI e EcoRV dal vettore pGEM HCV-IRES e ligato ai siti BglI e EcoRV del plasmide Pl-154 per ottenere il vettore PI- 165 (4110 bp).

d) Il frammento BGH (390 bp) è stato amplificato dal vettore Pl-187 con i primers mRGB-1 BglI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento) e mRGB-2 FspI sito sottolineato, minuscolo = appaiamento), digerito con BglI and FspI e ligato ai siti BglI e FspI di Pl-165, per ottenere il vettore Pl-178 (4500 bp).

Tutti i vettori ottenuti sono stati controllati mediante analisi di restrizione e di sequenza. MCS = siti di clonaggio multiplo. MCS3 = Eco RV, BstBI; MCS4 = Noti, BglI ( Il sito di restrizione BglI non sarà un sito unico nel vettore tetracistronico.

Fig. 3 Costruzione dei vettori multicistronici

Per la costruzione del plasmide Pl-250 che potenzialmente può esprimere 4 geni, il vettore Pl-178 è stato digerito con FspI e Ndel , trattato con Klenow e clonato nel sito FspI di Pl-190 per ottenere il plasmide finale Pl-250.

Per la costruzione del plasmide Pl-249, che potenzialmente può esprimere 3 geni, la sequenza HCV-IRES è stata eliminata per restrizione dal vettore Pl-250 con gli enzimi EcoRV-Notl.

Claims (21)

1. RIVENDICAZIONI 1. Vettori plasmidici ricombinanti multicistronici utilizzabili per l’espressione di almeno due proteine di interesse, uguali o distinte tra loro, contenenti almeno una cassetta di espressione eucariotica comprendente, in fase di lettura, una sequenza promoter/enhancer, una sequenza intronica, un sito di clonaggio, una sequenza virale IRES, un sito di clonaggio ed un terminatore di catena.
2. 2. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta sequenza IRES proviene dal virus della encefalomiocardite o dal virus della epatite C.
3. 3. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta sequenza promoter/enhancer è p/eCMV o pRSV.
4. 4. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta sequenza intronica è CMV-Intron A o l’introne della βglobina di coniglio.
5. 5. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta sequenza promoter/enhancer e detta sequenza intronica sono fuse tra loro.
6. 6. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto terminatore di catena è selezionato tra PolyA-SV40, BGH o mRGB.
7. 7. Un vettore plasmidico secondo le rivendicazioni 1-6 caratterizzato dal fatto che dette cassette di espressione sono due.
8. 8. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 7 caratterizzato dal fatto che le due sequenze IRES sono di differente origine virale.
9. 9. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 8 caratterizzato dal fatto che una cassetta contiene due sequenze IRES provenienti da genomi virali diversi.
10. 10. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 9 caratterizzato dal fatto che una cassetta contiene la sequenza IRES proveniente dal virus della encefalomiocardite e l’altra cassetta contiene la sequenza IRES proveniente dal virus della epatite C.
11. 11. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 7 caratterizzato dal fatto che una cassetta contiene la sequenza promoter/enhancer p/eCMV e l’altra cassetta contiene la sequenza promoter/enhancer pRSV.
12. 12. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 7 caratterizzato dal fatto che una cassetta contiene la sequenza intronica CMV-Intron A e l’altra cassetta contiene l’introne della β-globina di coniglio.
13. 13. Un vettore plasmidico secondo le rivendicazioni 7-12 caratterizzato dal fatto che ima cassetta contiene la sequenza promoter/enhancer pCMV fusa alla sequenza intronica hCMV-Intron A e la sequenza IRES proveniente dal virus della encefalomiocardite mentre l’altra cassetta contiene la sequenza promoter/enhancer pRSV, l’introne della βglobina di coniglio e la sequenza IRES proveniente dal virus della epatite C.
14. 14. Un vettore plasmidico secondo le rivendicazioni 7-12 caratterizzato dal fatto che una cassetta contiene la sequenza del terminatore PolyA-SV40, mentre laltra cassetta contiene il terminatore BGH o mRGB.
15. 15. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che i siti di clonaggio sono selezionati tra: SalI, XhoI, BsiWI, Noti, BstBI, EcoRV.
16. 16. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 avente le seguenti sequenze: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4.
17. 17. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che almeno una di dette proteine è un gene reporter, un marker selezionabile, un antigene o qualsiasi molecola con attività immunomodulante o immunostimolante.
18. 18. Un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 contenente, in distinti siti di clonaggio, le sequenze geniche codificanti per dette almeno due proteine di interesse.
19. 19. Cellule ospiti eucariotiche caratterizzate dal fatto di contenere almeno un vettore plasmidico secondo la rivendicazione 18.
20. 20. Un procedimento per l’espressione di almeno due proteine eucariotiche comprendente la coltivazione di una cellula ospite trasformata secondo la rivendicazione 19 e, opzionalmente, il recupero di dette proteine.
21. 21. Uso di un vettore plasmidico secondo le rivendicazioni 1-18 nel trasferimento genico, nella terapia genica e nell’ immunizzazione a DNA.