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IT202100022682A1 - Derivati pirimidinici e loro uso nel trattamento di tumori - Google Patents

Derivati pirimidinici e loro uso nel trattamento di tumori Download PDF

Info

Publication number
IT202100022682A1
IT202100022682A1 IT102021000022682A IT202100022682A IT202100022682A1 IT 202100022682 A1 IT202100022682 A1 IT 202100022682A1 IT 102021000022682 A IT102021000022682 A IT 102021000022682A IT 202100022682 A IT202100022682 A IT 202100022682A IT 202100022682 A1 IT202100022682 A1 IT 202100022682A1
Authority
IT
Italy
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tetrahydropyrimidin
carboxamide
dioxo
independently selected
alkyl
Prior art date
Application number
IT102021000022682A
Other languages
English (en)
Inventor
Luigi Frati
Original Assignee
Luigi Frati
St Pasteur Italia
Irccs Neuromed S P A
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Luigi Frati, St Pasteur Italia, Irccs Neuromed S P A filed Critical Luigi Frati
Priority to IT102021000022682A priority Critical patent/IT202100022682A1/it
Priority to PCT/IB2022/055143 priority patent/WO2023031683A1/en
Priority to EP22730616.4A priority patent/EP4396166A1/en
Publication of IT202100022682A1 publication Critical patent/IT202100022682A1/it

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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/52Two oxygen atoms
    • C07D239/54Two oxygen atoms as doubly bound oxygen atoms or as unsubstituted hydroxy radicals
    • C07D239/545Two oxygen atoms as doubly bound oxygen atoms or as unsubstituted hydroxy radicals with other hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/557Two oxygen atoms as doubly bound oxygen atoms or as unsubstituted hydroxy radicals with other hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms, e.g. orotic acid

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Description

Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo:
?Derivati pirimidinici e loro uso nel trattamento di tumori?
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Campo dell?invenzione
La presente invenzione si riferisce a derivati pirimidinici e al loro uso nel trattamento di tumori.
Sfondo dell?invenzione
Le terapie classiche contro i tumori comprendono attualmente chirurgia, radioterapia, chemioterapia, procedure immunologiche e terapia genica.
? importante osservare che le cellule neoplastiche necessitano sia di nutrienti che di ossigeno per la loro crescita; recentemente l?attenzione ? stata concentrata sull?inibizione della neovascolarizzazione per ?affamare? le cellule neoplastiche e arrestare la progressione dei tumori (Goldman E, The growth of malignant disease in man and the lower animals with special reference to the vascular system Lancet (1907) 2:1236-40; Gullino PM, Angiogenesis and oncogenesis J Natl Cancer Inst (1978) 61:639-43; Ferrara N, VEGF and the quest for tumor angiogenesis factors Nature Rev Cancer (2002) 2:795-803).
Le cellule normali e quelle tumorali per la loro replicazione necessitano di energia, che viene accumulata nel citoplasma sotto forma di molecole di adenosintrifosfato(ATP), prodotte mediante il metabolismo del glucosio, che viene prima bi-fosforilato e poi processato per entrare nel ciclo mitocondriale detto di Krebs (via energetica denominata ?fosforilazione ossidativa?) con un consumo di ossigeno e una produzione finale sia di CO2 che di 38 molecole energetiche di ATP (produzione netta di 36 molecole di ATP).
Nelle cellule cancerose Otto Warburg ha descritto una via energetica alternativa denominata ?glicolisi aerobia? (Warburg O, The metabolism of tumors. J Physiol Chem (1910) 56:66-305). La glicolisi ? un processo mediante il quale le cellule convertono il glucosio in piruvato e lattato per generare ATP (4 molecole, produzione netta di 2). Warburg ricevette nel 1931 il premio Nobel ?per la sua scoperta della natura e della modalit? d?azione degli enzimi respiratori? nelle cellule cancerose. L?opinione di Warburg era che la glicolisi aerobia fosse ?causativa? del cancro (Warburg O, On the origin of cancer cells Science 1956; 123:309-14), mentre oggi noi sappiamo che lo shift metabolico descritto da Warburg (glicolisi aerobia) ? secondario alle molteplici fasi oncogeniche, che modificano il metabolismo, cio? la regolazione epigenetica dell?attivit? di molti enzimi, come la piruvato chinasi-PK e la lattato deidrogenasi (Cairns RA, Harris IS, Mak TW, Regulation of cancer cell metabolism Nat Rev Cancer (2011) 11(2):85-95).
Per cercare nuove strategie da utilizzare nella terapia antitumorale l?interesse per la glicolisi aerobia nel cancro ? oggi rafforzato (Kritikou E, Warburg effect revisited Nature Reviews Cancer (2008) 8:247; Xu XD, Shao SX, Jiang HP et al, Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism Oncology Research and Treatment 2015; 38:117-122). L?obiettivo ? quello di ricercare molecole che inibiscano tale via metabolica e che possano essere utilizzate per arrestare la crescita tumorale. L?enzima chiave ? la lattato deidrogenasi (LDH), che catalizza il passaggio piruvato-lattato con produzione netta di 2 molecole energetiche di ATP e una parallela riduzione del nicotinammide adenina dinucleotide (NAD) in NADH.
Sfortunatamente inibitori dell?attivit? di LDH, come l?ossammato, esercitano il loro effetto solo ad alte concentrazioni (mM). Sebbene la glicolisi aerobia sia oggetto di approfondite indagini, ad oggi non sono stati identificati composti in grado di inibire questa via metabolica a bassa concentrazione (?M) cos? che possano essere utilizzati come farmaci antitumorali nell?uomo.
Sintesi dell?invenzione
Lo scopo di questa descrizione ? quello di fornire nuovi farmaci antitumorali in grado di ridurre la crescita tumorale mediante l?inibizione della glicolisi aerobia, preferibilmente mediante l?inibizione dell?enzima lattato deidrogenasi.
Secondo l?invenzione, il suddetto scopo viene raggiunto grazie all?oggetto richiamato in modo specifico nelle rivendicazioni che seguono, che si intendono parte integrante della presente esposizione.
La presente invenzione si riferisce a derivati pirimidinici, specificamente derivati della 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide e loro derivati bioisosterici, e al loro uso nel trattamento del cancro. L?inventore ha di fatto scoperto che derivati della 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide sono inibitori della glicolisi aerobia mediante l?inibizione dell?enzima lattato deidrogenasi.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un derivato della 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I):
dove
R1 e R2 sono indipendentemente selezionati tra idrogeno, un fenile sostituito o non sostituito, un eterociclo sostituito o non sostituito e un eterociclo benzofuso sostituito o non sostituito;
R3 e R4 sono indipendentemente selezionati tra idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH e NO2;
X ? selezionato tra CH2, C=O, S, SO, SO2 e nessun sostituente;
in cui detti uno o pi? sostituenti sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH, OR5, NHR5 ed NR5R6, in cui R5 ed R6 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, e un anello aromatico Ar sostituito o non sostituito;
un suo sale, sale idrato, polimorfo, racemo, diastereoisomero o enantiomero farmaceuticamente accettabile,
con l?eccezione di:
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-clorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-metilfenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(piridin-4-il)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(piridin-2-il)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(tiazol-2-il)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un derivato della 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione di un tumore e una composizione farmaceutica comprendente almeno un derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) e un veicolo farmaceuticamente accettabile.
Breve descrizione dei disegni
L?invenzione verr? ora descritta in dettaglio, a puro titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento alle figure allegate, in cui:
- Figura 1: Effetto dell?ossammato sulla proliferazione di cellule tumorali di medulloblastoma in vitro (dosi comprese tra 1 e 100 mM). ns=non significativo, **p < 0,01, ***p < 0,001 dal test ANOVA mediante GraphPad Prism versione 6.0.
- Figura 2: Effetto del composto #1 a dosi millimolari sulla proliferazione di cellule tumorali. ***p < 0,001 dal test ANOVA mediante GraphPad Prism versione 6.0.
- Figura 3: Pannello A. Effetto del composto #1 a dosi micromolari sulla proliferazione di cellule tumorali. ns = non significativo, ***p < 0,001 dal test ANOVA mediante GraphPad Prism versione 6.0. Pannello B. Curva dose-risposta del composto #1 generata per regressione non lineare.
- Figura 4: Effetto del composto #1 sull?attivit? dell?enzima LDH.
- Figura 5: Espressione del gene LDHA nel cancro del pancreas umano.
- Figura 6: Pannello A. Effetto del composto #1 sulla proliferazione di cellule tumorali. ns=non significativo, * p < 0,05, *** p < 0,001 dal test ANOVA mediante GraphPad Prism versione 6.0. Pannello B. Curva dose-risposta del composto #1 generata per regressione non lineare.
- Figura 7: Effetto del composto #1 sulla crescita tumorale di cellule di tumore del pancreas in vivo. Pannello A. Effetto del composto #1 sulla crescita tumorale. ns=non significativo, ** p <0,01 per test t mediante GraphPad Prism versione 6.0. Pannello B. Variazione del peso dei topi a T = 0 e T = 17. Pannello C. Fotografie di topi sottoposti a eterotrapianto a T = 17 trattati con veicolo e composto #1.
- Figura 8: Luminescenza in vivo di masse tumorali in topi trattati con composto #1 o veicolo.
- Figura 9: Effetto dose-risposta dei vari composti (#1-#7) sulla proliferazione di cellule tumorali. Le cellule sono state trattate con la concentrazione indicata dei composti per 24 h e quindi contate. I valori sull?asse Y rappresentano la percentuale di proliferazione cellulare.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
Nella seguente descrizione, vengono forniti numerosi dettagli specifici per permettere una comprensione completa delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere messe in pratica senza uno o pi? dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione.
Il riferimento in tutta la presente descrizione a ?una sola forma di realizzazione? o a ?una forma di realizzazione? indica che un/una particolare aspetto, struttura o caratteristica descritto/descritta in relazione alla forma di realizzazione ? incluso/inclusa in almeno una forma di realizzazione. Pertanto, le forme delle espressioni ?in una sola forma di realizzazione? o ?in una forma di realizzazione? in vari punti in tutta la presente descrizione non si riferiscono necessariamente tutte alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i/le particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono essere combinati/combinate in qualsiasi modo adatto in una o pi? forme di realizzazione.
Le intestazioni qui fornite sono solo per comodit? e non interpretano l?ambito o lo scopo delle forme di realizzazione.
L?espressione ?derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide? indica composti derivati dalla seguente struttura chimica:
Con l?espressione ?inibitore della glicolisi aerobia? s?intende indicare un composto che inibisce la via della glicolisi aerobia, preferibilmente che inibisce l?enzima lattato deidrogenasi (LDH).
Con il termine ?trattamento? si intende indicare la prevenzione o l?attenuazione di sintomi o condizioni, o l?inibizione dell?avanzamento di una patologia che comprende disturbi della proliferazione cellulare (tra cui tumore e tumore resistente a farmaci antitumorali).
Con l?espressione ?C1-6 alchile? s?intende una catena di 1-6 atomi di carbonio contenente solo legami singoli tra atomi di carbonio adiacenti. Preferibilmente, il gruppo C1-6 alchile ? selezionato tra metile, etile, propile, isopropile, butile e suoi isomeri, pentile e suoi isomeri, esile e suoi isomeri.
Con l?espressione ?C2-6 alchenile? s?intende una catena di 2-6 atomi di carbonio contenente almeno un doppio legame tra atomi di carbonio adiacenti. Gli alchenili comprendono isomeri cis e trans. Preferibilmente, il gruppo C2-6 alchenile ? selezionato tra etilenile, propilenile, 1-butenile, 2-butenile, isobutenile, 1-pentenile, 2-pentenile, 3-metil-1-butenile, 2-metil-2-butenile, 2,3-dimetil-2-butenile.
Con l?espressione ?C2-6 alchinile? s?intende una catena di 2-6 atomi di carbonio contenente almeno un triplo legame tra atomi di carbonio adiacenti. Preferibilmente, il gruppo C2-6 alchinile ? selezionato tra etinile, propinile, pentinile e loro isomeri.
Con l?espressione ?C1-6 alcossile? s?intende catene di alchile a 1-6 atomi di carbonio contenenti un atomo di ossigeno. Preferibilmente, il gruppo C1-6 alcossile ? selezionato tra metossile, etossile, propossile, pentossile e loro isomeri.
Con l?espressione ?C2-6 alcossicarbonile? s?intende una catena di alchile a 2-6 atomi contenente un gruppo OC=O. Preferibilmente, il gruppo C2-6 alcossicarbonile ? selezionato tra metossicarbonile, etossicarbonile, metossicarbonilmetile, etossicarbonilmetile.
Con l?espressione ?C3-10 cicloalchile? s?intende un gruppo idrocarburico ciclico avente 3-10 atomi di carbonio. Ciascun atomo di carbonio pu? essere sostituito con uno o pi? sostituenti selezionati tra C1-6-alchile o alogeno. Preferibilmente, il gruppo C3-10 cicloalchile ? selezionato tra ciclopropile, ciclobutile, ciclopentile e cicloesile.
Con l?espressione ?eterocicloalchile a 3-10 elementi? s?intende un idrocarburo ciclico saturo avente da 3 a 10 atomi di carbonio, in cui uno o pi? atomi di carbonio sono sostituiti con uno o pi? eteroatomi, come azoto, zolfo, ossigeno o loro combinazioni, per esempio, senza limitazioni, un atomo di azoto e un atomo di zolfo, un atomo di azoto e un atomo di ossigeno. Preferibilmente, il gruppo eterocicloalchile a 3-10 elementi ? selezionato tra pirrolidina, piperidina, piperazina, morfolina, tiomorfolina.
Il termine ?eterociclo? intende indicare composti eterociclici aromatici in cui uno o pi? atomi di carbonio dello scheletro della molecola sono stati sostituiti con un atomo diverso dal carbonio. Eteroatomi tipici comprendono azoto, ossigeno e zolfo. Preferibilmente, l?eterociclo ? selezionato tra pirrolo, tiofene, furano, piridina e pirimidina.
Con l?espressione ?eterociclo benzofuso? s?intende un composto eterociclico aromatico in cui uno o pi? legami sono fusi con un anello di fenile. Preferibilmente, l?eterociclo benzofuso ? selezionato tra indolo, benzotiofene, benzofurano, chinolina e isochinolina.
L?espressione ?sale o sale idrato farmaceuticamente accettabile? si riferisce a sali con acidi inorganici e organici, o a sali con basi inorganiche od organiche, che conservano le loro propriet? biologiche originarie e non presentano effetti collaterali indesiderati. I sali con acidi inorganici vengono preparati utilizzando acidi come, ad esempio, acido cloridrico, acido solforico, acido fosforico, acido nitrico. I sali con acidi organici vengono preparati utilizzando acidi come, ad esempio, acido acetico, acido propionico, acido succinico, acido maleico, acido citrico, acido ascorbico, acido pamoico, acido glicolico, acido stearico, acido fenilacetico, acido benzoico, acido salicilico, acido metansolfonico, acido toluensolfonico. I sali con basi inorganiche vengono preparati utilizzando basi quali, ad esempio, carbonato di sodio, soda caustica, ammoniaca, idrossido di ammonio. I sali con basi organiche vengono preparati utilizzando basi quali, ad esempio, dimetilammina, piperidina, piperazina, morfolina, tiomorfolina.
L?inibizione dell?attivit? della lattato deidrogenasi riduce la progressione dei tumori (per riduzione di molecole energetiche di ATP e di precursori per la biosintesi di macromolecole), con un?applicazione terapeutica soprattutto nei tumori ad alta glicolisi, come i tumori del cervello e del pancreas (Le A, Cooper CR, Gouw AM et al, Inhibition of lactate dehydrogenase A induces oxidative stress e inhibits tumor progression Proc Natl Acad Sci USA (2010) 107:2037-42; Calvaresi EC, Granchi C, Tuccinardi T et al. Dual targeting of the Warburg effect with a glucose-conjugated lactate dehydrogenase inhibitor ChemBioChem (2013) 14, numero 17; Rong Y, Wu W, Ni X et al. Lactate dehydrogenase A is overexpressed in pancreatic cancer e promotes the growth of pancreatic cancer cells Tumor Biol (2013) 34:1523-30; Valvona CJ, Fillmore HL, Nunn PB, Pilkington GJ. The regulation e function of lactate dehydrogenase A: therapeutic potential in brain tumor Brain Pathol (2016) 26:1-17).
Una recente rassegna ha sintetizzato i dati sulla diversa espressione di LDH in varie linee di cellule cancerose per ricercare inibitori dell?attivit? di LDH da utilizzare nella terapia antiblastica: nessuna di queste molecole ? stata registrata per l?applicazione terapeutica (Feng Y et al, Lactate dehydrogenase A. A key player in carcinogenesis e potential target in cancer therapy Cancer Med (2018) 7:6124-36; Le A, Cooper CR, Gouw AM et al, Inhibition of lactate dehydrogenase A induces oxidative stress e inhibits tumor progression Proc Natl Acad Sci USA (2010) 107:2037-42; Calvaresi EC, Granchi C, Tuccinardi T et al. Dual targeting of the Warburg effect with a glucoseconjugated lactate dehydrogenase inhibitor ChemBioChem (2013) 14, issue 17).
10 anni fa, durante la ricerca sull?induzione dell?apoptosi su cellule di neuroblastoma umano in vitro (Petroni M, ? Frati L, ? Myc sensitizes human neuroblastoma to apoptosis ? Molecular Cancer Res (2011) 9:67-77) il presente inventore osserv? che queste cellule tumorali esercitano la glicolisi aerobia, con l?attivit? dell?enzima lattato deidrogenasi inibita da alcune molecole ben note, come ossammato o bromopiruvato (saggio spettrofotometrico). Purtroppo queste molecole - nonostante siano molto efficaci nell?inibire l?LDH - esercitano l?attivit? solo ad alte concentrazioni (mM) o hanno il peso di effetti tossici che ne impediscono l?utilizzo in un trattamento clinico.
La presente invenzione riguarda derivati di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) e loro derivati bioisosterici, e il loro uso per il trattamento di un paziente affetto da tumore. L?inventore ha di fatto scoperto che i derivati di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) sono inibitori della glicolisi aerobia, cio? inibitori della lattato deidrogenasi.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I):
in cui
R1 ed R2 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, un fenile sostituito o non sostituito, un eterociclo sostituito o non sostituito e un eterociclo benzofuso sostituito o non sostituito;
R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-
6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2;
X ? selezionato tra: CH2, C=O, S, SO, SO2 e nessun sostituente;
in cui detti uno o pi? sostituenti (dei residui R1 ed R2) sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-
10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH, OR5, NHR5 ed NR5R6; e
R5 ed R6 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-
6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, e un anello aromatico Ar1 sostituito o non sostituito;
un suo sale, sale idrato, polimorfo, racemo, diastereoisomero o enantiomero farmaceuticamente accettabile,
con l?eccezione di:
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-clorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-metilfenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(piridin-4-il)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(piridin-2-il)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide,
2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(tiazol-2-il)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide.
In una forma di realizzazione, R1 ed R2 sono indipendentemente selezionati tra: fenile non sostituito, e un eterociclo sostituito o non sostituito.
In una forma di realizzazione, R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile e C3-10 cicloalchile.
In una forma di realizzazione, X ? selezionato tra: CH2 e C=O.
In una forma di realizzazione, R5 ed R6 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile e C3-10 cicloalchile.
In una forma di realizzazione, l?anello aromatico Ar1 ? selezionato tra: fenile, benzile, fenossile, benzilossile, naftile, naftilossile, bifenile ed eterociclo. Preferibilmente, l?anello aromatico Ar1 ? selezionato tra: fenile, benzile, eterociclo.
In una forma di realizzazione, detti uno o pi? sostituenti dell?anello aromatico Ar1 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2. Preferibilmente, detti uno o pi? sostituenti dell?anello aromatico Ar1 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile e alogeno.
In una forma di realizzazione, il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide ha formula (II):
in cui
R1<i>, R1<ii>, R1<iii>, R1<iv>, R1<v>, R2<i>, R2<ii>, R2<iii>, R2<iv>, R2<v >sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, -CN, NH2, OH, NO2, OR7, NHR8 ed NR7R8;
R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2;
R7 ed R8 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-
6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, e un anello aromatico Ar2 sostituito o non sostituito;
X ? selezionato tra: CH2, C=O, S, SO2, SO, e nessun sostituente; e
W, Y e Z sono indipendentemente selezionati tra: CH, N, NH, O e S.
In una forma di realizzazione, R1<i>, R1<ii>, R1<iii>, R1<iv>, R1<v>, R2<i>, R2<ii>, R2<iii>, R2<iv>, R2<v>, R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, alogeno.
In una forma di realizzazione, R7 ed R8 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, e un anello aromatico Ar2 sostituito o non sostituito.
In una forma di realizzazione, X ? selezionato tra: CH2, C=O.
In una forma di realizzazione, W, Y e Z sono indipendentemente selezionati tra: N, NH, O, S.
In una forma di realizzazione, l?anello aromatico Ar2 ? selezionato tra: fenile, benzile, fenossile, benzilossile, naftile, naftilossile, bifenile ed eterociclo. Preferibilmente, l?anello aromatico Ar2 ? selezionato tra: fenile, benzile, eterociclo.
In una forma di realizzazione, detti uno o pi? sostituenti dell?anello aromatico Ar2 sono selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2.
Preferibilmente, detti uno o pi? sostituenti dell?anello aromatico Ar2 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile e alogeno.
In una forma di realizzazione, il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidina di formula (I) ? selezionato tra:
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(3-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (2);
? 2,4-Diosso-3-(4-fluorobenzil)-N-(2-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (3);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (4);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(3,5-dimetossifenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (5);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(4-carbossammidofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (6);
? 2,4-Diosso-3-(4-metossibenzil)-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (7);
? 2,4-Diosso-3-(2,4-difluorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (8);
? 2,4-Diosso-3-(4-clorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (10);
? 2,4-Diosso-3-(2,4-diclorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (11);
? 2,4-Diosso-3-(3-fluoropiridin-4-ilmetil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (12);
? 2,4-Diosso-3-(piridin-4-ilmetil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (13);
? 2,4-Diosso-3-(pirimidin-4-ilmetil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (14);
? 2,4-Diosso-3-(4-fluorobenzil)-N-(4-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (16); ? 2,4-Diosso-3-(2,4-difluorobenzil)-N-(4-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (17);
? 2,4-Diosso-3-(benzil)-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (18);
? 2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-aminofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (21);
? 2,4-Diosso-3-(benzil)-N-(3,5-diclorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (25);
? 2,4-Diosso-3-(benzil)-N-(4-carbossammidofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (26).
La struttura chimica dei composti (1) a (7) ? mostrata di seguito.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) per l?uso nel trattamento di un paziente affetto da un tumore,
in cui
R1 ed R2 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, un fenile sostituito o non sostituito, un eterociclo sostituito o non sostituito e un eterociclo benzofuso sostituito o non sostituito;
R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-
6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2;
X ? selezionato tra: CH2, C=O, S, SO, SO2 e nessun sostituente;
in cui detti uno o pi? sostituenti (dei residui R1 ed R2) sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-
10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH, OR5, NHR5 ed NR5R6; e
R5 ed R6 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-
6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, e un anello aromatico Ar1 sostituito o non sostituito;
un suo sale, sale idrato, polimorfo, racemo, diastereoisomero o enantiomero farmaceuticamente accettabile.
In una forma di realizzazione, il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) per l?uso nel trattamento di un tumore ? selezionato tra:
? 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (1);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(3-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (2);
? 2,4-Diosso-3-(4-fluorobenzil)-N-(2-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (3);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (4);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(3,5-dimetossifenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (5);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(4-carbossammidofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (6);
? 2,4-Diosso-3-(4-metossibenzil)-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (7).
In una forma di realizzazione preferita, il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) per l?uso nel trattamento di un tumore ? selezionato tra: 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (1); 2,4-Diosso-3-benzil-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (4); 2,4-Diosso-3-benzil-N-(4-carbossammidofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (6); 2,4-Diosso-3-(4-metossibenzil)-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (7). Pi? preferibilmente, il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) per l?uso nel trattamento di un tumore ? 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (1).
In una forma di realizzazione, il tumore ? selezionato tra tumori del cervello e del pancreas. Preferibilmente, il tumore ? selezionato tra medulloblastoma, neuroblastoma e adenocarcinoma duttale del pancreas; pi? preferibilmente il tumore ? selezionato fra medulloblastoma e adenocarcinoma duttale del pancreas.
In una forma di realizzazione, il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I), preferibilmente 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide, deve essere somministrato a una dose compresa tra 0,001 e 10 mM, preferibilmente tra 0,01 e 1 mM.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente almeno un derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) e un veicolo farmaceuticamente accettabile
in cui
R1 ed R2 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, un fenile sostituito o non sostituito, un eterociclo sostituito o non sostituito e un eterociclo benzofuso sostituito o non sostituito;
R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-
6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2;
X ? selezionato tra: CH2, C=O, S, SO, SO2 e nessun sostituente;
in cui detti uno o pi? sostituenti (dei residui R1 ed R2) sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-
10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH, OR5, NHR5 ed NR5R6; e
R5 ed R6 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-
6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, e un anello aromatico Ar1 sostituito o non sostituito;
un suo sale, sale idrato, polimorfo, racemo, diastereoisomero o enantiomero farmaceuticamente accettabile.
In una forma di realizzazione, il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) contenuto nella composizione farmaceutica ? selezionato tra:
? 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (1);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(3-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (2);
? 2,4-Diosso-3-(4-fluorobenzil)-N-(2-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (3);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (4);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(3,5-dimetossifenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (5);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(4-carbossammidofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (6);
? 2,4-Diosso-3-(4-metossibenzil)-N-(2-clorofenil)1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (7).
In una forma di realizzazione, il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) contenuto nella composizione farmaceutica ? selezionato tra:
? 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (1);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (4);
? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(4-carbossammidofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (6);
? 2,4-Diosso-3-(4-metossibenzil)-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (7).
In una forma di realizzazione, la composizione farmaceutica contiene il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I), preferibilmente 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide, a una concentrazione compresa tra 0,001 e 10 mM, preferibilmente 0,01 e 1 mM.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda l?uso di un derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) per la produzione di un medicamento per il trattamento di un tumore.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente almeno un derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) e un veicolo farmaceuticamente accettabile per l?uso nel trattamento di un tumore.
La presente descrizione mette in evidenza anche un procedimento per il trattamento di un paziente affetto da un tumore, che comprende la somministrazione al paziente che ne necessita di almeno un derivato della 1,2,3,4tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) in una quantit? sufficiente per effettuare detto trattamento.
L?attuale disponibilit? di librerie di sostanze chimiche con struttura molecolare nota sta consentendo nuovi approcci di modellazione molecolare (per esempio docking molecolare, modellazione del farmacoforo) volti all?identificazione di molecole candidate per le terapie. Utilizzando questi approcci, il presente inventore ha identificato alcune molecole candidate da testare per la capacit? di inibire l?attivit? di LDH.
Innanzitutto ? stata misurata-standardizzata l?inibizione dell?enzima da parte dell?ossammato, un ben noto inibitore della LDH. Il saggio dell?attivit? di LDH ? stato eseguito su una preparazione commerciale dell?enzima (Sigma, piruvico chinasi free) con un saggio spettrofotometrico (a 340 nm), secondo il procedimento descritto da Bergmeyer H.U., Methods of enzymatic analysis, Academic Press, NY, 1965 p. 986.
Per esplorare candidati a piccola molecola per l?inibizione di LDH, ? stato utilizzato il modello molecolare di LDH (struttura cristallografica della Protein Data Bank, codice pdb 5W8K - Rai G., Brimacombe K.R., Maloney D.J. et al., J Med Chem (2017) 60: 9184-9204) ed ? stato esplorato il sito catalitico dell?enzima per la interazione con ossamato e con molecole teoricamente selezionabili da librerie commerciali. Per rifinire la selezione, studi di docking molecolare e modellazione farmacoforica sono stati affidati al Dipartimento di Chimica Farmaceutica dell?Universit? degli Studi di Roma ?La Sapienza?, laboratorio diretto dal dott. Romano Silvestri.
Per la modellazione molecolare ? stato utilizzato il sistema operativo MacPro dual 2.66 GHz Xeon Ubuntu 14 LTS.
Per il docking ? stato utilizzato il software PLANTS (Korb O, St?tzle T, Exner T E, J. Chem. Inf. Model. (2009) 49:84-96) con un training set da librerie commerciali (www.Maybridge.com, www.SPECS.net e www.Lifechemicals.com) e le molecole candidate sono state selezionate secondo le regole drug-like di Lipinski (Lipinski CA, Lombardo F, Dominy BW, Feeney PJ, Adv. Drug Deliv. Rev. (2001) 46: 3-26).
Dal docking molecolare e dallo studio farmacoforico, il presente inventore ha identificato derivati dello scaffold di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide come nuovi farmaci antitumorali in grado di ridurre la crescita tumorale mediante l?inibizione della glicolisi aerobia, preferibilmente mediante l?inibizione dell?enzima lattato deidrogenasi.
Tabella 1. Attivit? inibitoria relativa di composti selezionati<a>
a) Inibizione relativa: *** forte; ** media; * debole.
? stata scelta come candidata per l?inibizione della crescita delle cellule tumorali la molecola 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide. La molecular fitness ha confermato che la molecola selezionata ? appropriata per un?interazione inibitoria con il sito catalitico dell?enzima LDH grazie ad un?elevata complementarit? di tale molecola con il sito catalitico dell?enzima. Il composto ? stato quindi testato per verificare se la crescita tumorale fosse inibita dalla sua somministrazione. I risultati (sia in vitro che in vivo) sono stati positivi come mostrato di seguito.
Per accertare l?attivit? antitumorale di questo composto (anche ?composto #1?), ? stata testata l?inibizione in vitro della crescita di cellule tumorali su linee cellulari stabilizzate caratterizzate da uno shift metabolico glicolitico, come certi tumori pancreatici e neurologici. In primo luogo, queste linee cellulari sono state incubate con il composto #1 e, come controllo, con l?ossammato, inibitore standard della LDH. Entrambi i composti hanno ridotto significativamente la proliferazione delle cellule di tumore del pancreas (cellule Panc1), essendo l?IC50 del composto #1 all?interno del range micromolare, mentre quella dell?ossammato ? all?interno del range millimolare.
Il composto #1 recentemente identificato ha mostrato una comparabile capacit? di ridurre la crescita tumorale a una concentrazione >700 volte inferiore rispetto all?ossammato. Quindi, data la potenza e i risultati in vitro molto incoraggianti, il composto #1 ? stato testato anche in vivo.
A questo scopo, un tumore del pancreas Panc1 ? stato fatto crescere in topi nu/nu immunodeficienti; quando la massa tumorale ha raggiunto circa 200 mm<3>, i topi sono stati trattati con il composto #1 (20 mg/Kg) vs veicolo (olio di mais). In queste condizioni sperimentali, dopo due settimane la massa tumorale ? raddoppiata nei topi di controllo, mentre nel gruppo trattato i tumori non sono cresciuti affatto. Alla fine dell?esperimento, le masse tumorali erano 2,5 volte pi? piccole nei topi trattati rispetto ai controlli. Al contrario, il peso di entrambi i gruppi di topi ? rimasto invariato.
? stato effettuato un ulteriore esperimento per valutare la regressione della massa tumorale con un procedimento simile a quelli utilizzati nell?uomo, ad es. tramite visualizzazione in vivo della massa tumorale. A questo scopo cellule Panc1 sono state trasdotte stabilmente con lentivirus (5 MOI) esprimente il gene della luciferasi e impiantate per via sottocutanea in topi atimici nudi (nu/nu) Balb/C immunodeficienti. Dopo l?iniezione di luciferina la massa tumorale ? stata valutata per la progressione/regressione sul sistema di imaging in vivo Lumina III (PerkinElmer). Nei topi trattati con il veicolo, i tumori hanno mostrato un?emissione di segnali luminosi che ? aumentata significativamente dopo 17 giorni, indicando cos? una progressione del tumore. Al contrario, nei topi trattati con il composto #1 il segnale luminescente ha mostrato una significativa regressione nel tempo, indicando ulteriormente una forte efficacia terapeutica di questo composto in modelli animali portatori di tumore umano.
Complessivamente, i risultati qui osservati mostrano chiaramente che l?inibitore di LDH qui denominato #1 o IPI/01.LF [cio? la 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide] induce la regressione del cancro nei topi portatori di tumori umani senza significativi effetti collaterali (il peso di entrambi i gruppi di topi, cio? topi trattati e topi di controllo, ? rimasto invariato). Pertanto, il composto #1 ? una molecola nuova e molto promettente da valutare ulteriormente per la terapia dei tumori umani.
Materiali e Procedimenti
Chimica. Tutti i reagenti e i solventi sono stati utilizzati secondo la scheda dei dati di sicurezza del materiale indicati dal fornitore e sono stati utilizzati come acquistati senza ulteriore purificazione. Le soluzioni organiche sono state essiccate su solfato di sodio anidro. L?evaporazione dei solventi ? stata effettuata su un B?chi Rotavapor R-210 dotato di un controllore del vuoto B?chi V-850 e una pompa del vuoto B?chi V-700. La cromatografia su colonna ? stata eseguita su colonne impaccate con gel di silice della Merck (70-230 mesh). Per la TLC sono state utilizzate lastre per cromatografia su strato sottile (TLC) di gel di silice della Merck (lastre di alluminio prerivestite con gel di silice con indicatore fluorescente visualizzabile a 254 nm). Le piastre sviluppate sono state visualizzate con un?apparecchiatura UV Spectroline ENF 260C/FE. I punti di fusione (p.f.) sono stati determinati su un?apparecchiatura Stuart Scientific SMP1 e sono riportati non corretti. Gli spettri infrarossi (IR) sono stati registrati su uno spettrofotometro FT-IR PerkinElmer Spectrum 100 dotato di un accessorio universale a riflettanza totale attenuata. I dati IR sono stati acquisiti ed elaborati dal software PerkinElmer Spectrum 10.03.00.0069. La posizione delle bande e i range di assorbimento sono dati in cm<-1>. Gli spettri di risonanza magnetica nucleare protonica (<1>H NMR) sono stati registrati con uno spettrometro Bruker Avance (400 MHz) nel solvente indicato e i file fid corrispondenti sono stati elaborati dal software MestreLab Research SL MestreReNova 6.2.1-769. Gli spostamenti chimici sono espressi in unit? ? (ppm) dal tetrametilsilano. La purezza dei composti testati ? stata verificata mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC). La purezza dei composti testati ? risultata essere >95%. Il sistema HPLC Dionex UltiMate 3000 della Thermo Fisher Scientific Inc. consisteva in un vassoio per solvente SR-3000, una pompa analitica quaternaria LPG-3400SD, uno scomparto per colonna TCC-3000SD, un rivelatore a serie di diodi DAD-3000 e una valvola di iniezione manuale analitica con un loop da 20 ?l. I campioni sono stati disciolti in acetonitrile (1 mg/mL). L?analisi HPLC ? stata eseguita utilizzando una colonna Acclaim 120 C18 della Thermo Fisher Scientific Inc. (5 ?m, 4,6 mm ? 250 mm), a 25 ? 1?C con un gradiente di solvente appropriato (acetonitrile/acqua), portata di 1,0 mL/min e rivelatore di segnale a 206, 230, 254 e 365 nm. I dati cromatografici sono stati acquisiti ed elaborati dal software Chromeleon 6.80 SR15 Build 4656 della Thermo Fisher Scientific Inc.
Procedura generale per la sintesi dei composti di formula (I)
Le 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammidi di formula (I) sono sintetizzate come mostrato nel seguente Schema 1.
L?acido (E)-2-ciano-3-(dimetilammino)acrilico ? stato ottenuto per idrolisi con idrossido di litio idrato di etil-(E)-2-ciano-3-(dimetilammino)acrilato in tetraidrofurano a 25?C per 12 h. L?acido acrilico ? stato trasformato nella corrispondente carbossammide per reazione con un?ammina in presenza di esafluorofosfato di (benzotriazol-1-ilossi)tripirrolidino-fosfonio (pyBOP), trietilammina in N,N-dimetilformammide a 25?C per 12 h in atmosfera di Argon. L?azoto carbossammidico ? stato opzionalmente alchilato per reazione con un alogenuro R3 in presenza di carbonato di potassio in acetone a temperatura ambiente. Questo composto ? stato trattato con una R1-N-urea in etanolo bollente contenente acido cloridrico al 37% per 36 ore, con metossido di sodio in metanolo per 1,5 ore a riflusso, e quindi con nitrito di isopentinile in N,N-dimetilformammide a 65?C per 30 minuti ottenendo R2,R3-N-2,4-diosso-3-(R1)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide. L?alchilazione a N1 ? stata effettuata con un alogenuro R4 in presenza di carbonato di potassio in acetone a temperatura ambiente. I residui R1-R4 hanno i significati sopra indicati.
Reagenti e condizioni di reazione: (a) LiOH?H2O, THF/H2O, 25?C, 12 h; (b) R2-NH2, pyBOP, Et3N, DMF, 25?C, Ar, 12 h; (c) R3-alogenuro, K2CO3, acetone, temperatura ambiente, per una notte; (d) (i) R1-N-urea, 37% HCl, etanolo, temperatura di riflusso, 36 h; (ii) NaOMe, MeOH, temperatura di riflusso, 1,5 h; (iii) nitrito di isopentinile, DMF, 65?C, 30 min; (e) R4-alogenuro, K2CO3, acetone, temperatura ambiente, per una notte.
ESEMPI
Esempio 1. Sintesi dei composti #1-#7
Il composto 2,4-diosso-N-fenil-3-(2-fluorobenzil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (nel seguito anche IPI/01.LF o #1) ? stato sintetizzato come mostrato nel seguente Schema 2.
Sintesi dell?acido 2-ciano-3-(dimetilammino)acrilico. Una miscela di etil-2-ciano-3-(dimetilammino)acrilato (1 mmol) e idrossido di litio monoidrato (1 mmol) in acqua/tetraidrofurano (1:1, 5 mL) ? stata agitata a temperatura ambiente per 12 h sotto flusso di argon. La miscela di reazione ? stata acidificata con soluzione acquosa di acido cloridrico al 37% (pH ? 4-5) ed estratta con acetato di etile, essiccata e filtrata. L?evaporazione del solvente ha fornito l?acido 2-ciano-3-(dimetilammino)acrilico, che ? stato utilizzato senza ulteriore purificazione.
Sintesi di (2-ciano-3-(dimetilammino)-N-arilacrilammide. Ad una miscela di acido 2-ciano-3-(dimetilammino)acrilico (1 mmol), l?anilina appropriata (1 mmol), trietilammina (2 mmol) in N,N-dimetilformammide (2 mL) ? stato aggiunto esafluorofosfato di (benzotriazol-1-ilossi)tripirrolidin-fosfonio (1 mmol) La miscela di reazione ? stata agitata a temperatura ambiente per 12 h sotto flusso di argon, diluita con acqua, estratta con acetato di etile, essiccata e filtrata. L?evaporazione del solvente ha fornito la (2-ciano-3-(dimetilammino)-N-arilacrilammide desiderata, che ? stata utilizzata senza ulteriore purificazione.
Sintesi di 3-benzil-2,4-diosso-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide. Una miscela di (2-ciano-3-(dimetilammino)-N-arilacrilammide (1 mmol) e l?appropriata benzil-urea (1 mmol) in etanolo (2 mL) e soluzione acquosa di acido cloridrico al 37% (0,3 mL) ? stata riscaldata a riflusso per 36 h, raffreddata e il solvente ? stato rimosso a pressione ridotta. La 3-(3-benzilureido)-2-ciano-N-arilacrilammide grezza ? stata utilizzata senza ulteriore purificazione. Ad una soluzione di metossido di sodio in metanolo, preparata da sodio (1 mmol) e metanolo (5 ml) ed etanolo (5 ml), ? stata aggiunta l?appropriata 3-(3-benzilureido)-2-ciano-N-arilacrilammide (1 mmol) in metanolo (15 ml). La miscela di reazione ? stata riscaldata a riflusso per 1,5 h e raffreddata. Il solvente ? stato rimosso a pressione ridotta ottenendo la 6-ammino-1-benzil-2-osso-N-aril-1,2-diidropirimidin-5-carbossammide desiderata che ? stata utilizzata senza ulteriore purificazione Ad una soluzione della 6-ammino-1-benzil-2-osso-N-aril-1,2-diidropirimidin-5-carbossammide appropriata (1 mmol) in N,N-dimetilformammide anidra (3 ml) mantenuta a 65?C, isopentilnitrito (1,5 mmol) in N,N-dimetilformammide anidra (3 ml) ? stato aggiunto in 10 min. La miscela ? stata agitata per 30 min. Il solvente ? stato rimosso a pressione ridotta ottenendo un solido che ? stato purificato mediante cromatografia su colonna (gel di silice, cloroformio:metanolo = 95:5) ottenendo la 3-benzil-2,4-diosso-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide desiderata.
2,4-diosso-3-(2-Fluorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (#1).
Resa 68%, p.f. 234-236?C (da etanolo). <1>H NMR (DMSO-d6): ? 5,12 (s, 2H), 10,83 (s, 1H), 7,08-7,16 (m, 2H), 7,20-7,24 (m, 2H), 7,30-7,36 (m, 3H), 7,66 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 8,39 (s, 1H), 10,83 (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H), 12,37 ppm (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H). IR: v 1686 e 3089 cm<-1>.
Reagenti e condizioni di reazione: (a) LiOH?H2O, THF/H2O, 25?C, 12 h; (b) anilina, pyBOP, Et3N, DMF, 25?C, Ar, 12 h; (c) (i) N-(2-fluorobenzil)urea, 37% HCl, etanolo, temperatura di riflusso, 36 h; (ii) NaOMe, MeOH, temperatura di riflusso, 1,5 h; (iii) nitrito di isopentinile, DMF, 65?C, 30 min.
I Composti #2 - #7 sono stati sintetizzati secondo lo Schema 2.
3-Benzil-N-(3-clorofenil)-2,4-diosso-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (#2).
Resa 76%, p.f. 208-210?C (da etanolo). <1>H NMR (DMSO-d6): ? 5,07 (s, 2H), 7,15-7,17 (m, 1H), 7,25-7,29 (m, 1H), 7,33-7,38 (m, 5H), 7,47-7,50 (m, 1H), 7,96 (t, J = 2,1 Hz, 1H), 8,37 (s, 1H), 10,10 (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H), 12,38 ppm (br s, scomparso dopo trattamento con D2O, 1H). IR: v 1587 e 3087 cm<-1>.
3-(4-fluorobenzil)-N-(2-fluorofenil)-2,4-diosso-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (#3).
Resa 70%, p.f. 204-206?C (da etanolo). <1>H NMR (DMSO-d6): ? 5,04 (s, 2H), 7,10-7,23 (m, 4H), 7,29-7,34 (m, 1H), 7,38-7,41 (m, 2H), 8,36-8,41 (m, 2H), 11,23 (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H), 12,40 ppm (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H). IR: v 1616 e 3086 cm<-1>.
3-Benzil-N-(2-clorofenil)-2,4-diosso-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (#4).
Resa 73%, p.f. 228-230?C (da etanolo). <1>H NMR (DMSO-d6): ? 5,08 (s, 2H), 7,12-7,16 (m, 1H), 7,25-7,39 (m, 6H), 7,54 (dd, J = 1,4 e 6,6 Hz, 1H), 8,41 (s, 1H), 8,49 (dd, J = 6,8 e 11,6 Hz, 1H), 11,39 (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H), 12,40 ppm (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H). IR: v 1582 e 3074 cm<-1>.
3-Benzil-N-(2,4-dimetossifenil)-2,4-diosso-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (#5).
Resa 79%, p.f. 232-234?C (da etanolo). <1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): ? 3,76 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 5,07 (s, 2H), 6,51 (dd, J = 2,7 e 6,2 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,25-7,36 (m, 5H), 8,26-8,33 (m, 2H), 11,00 (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H), 12,23 ppm (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H). IR: v 1671 e 3196 cm<-1>.
3-Benzil-N-(4-carbamoilfenil)-2,4-diosso-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (#6).
Resa 65%, p.f. > 320?C (da etanolo). <1>H NMR (DMSO-d6): ? 5,07 (s, 2H), 7,25-7,29 (m, 2H), 7,33-7,34 (m, 4H), 7,72-7,75 (m, 2H), 7,86-7,89 (m, 3H), 8,38 (s, 1H), 11,06 (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H), 12,37 ppm (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H). IR: v 1604 e 3171 cm<-1>.
3-Benzil-N-(4-carbamoilfenil)-2,4-diosso-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (#7).
Resa 71%, p.f. 220-222?C (da etanolo). <1>H NMR (DMSO-d6): ? 3,73 (s, 3H), 5,00 (s, m2H), 6,89 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,12-7,16 (m, 1H), 7,29 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,34-7-39 (m, 1H), 7,54 (dd, J = 1,4 e 8,0 Hz, 1H), 8,38 (s, 1H), 8,48 (dd, J = 1,5 e 8,3 Hz, 1H), 11,41 (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H), 12,36 ppm (br s, scomparso dopo trattamento con ossido di deuterio, 1H). IR: v 1686 e 3075 cm<-1>.
Esempio 2. L?ossammato inibisce la glicolisi aerobia e la crescita tumorale.
Gli esperimenti di inibizione della crescita tumorale sono stati programmati dall?inventore e parzialmente affidati ad un team esperto del Dipartimento di Medicina Molecolare dell?Universit? degli Studi di Roma ?La Sapienza? (sotto la supervisione di Gianluca Canettieri, M.D.).
Il classico test in vitro per verificare la riduzione della crescita tumorale mediante l?inibizione della glicolisi aerobia ? stato eseguito con ossammato (un ben noto inibitore della LDH).
L?inventore ha utilizzato cellule tumorali di medulloblastoma/MB Sonic HedgeHog/SHH (SHH MB), un tumore del cervelletto dovuto a mutazioni che attivano la via di segnalazione di Hedgehog (HH) (Di Magno L, Coni S, Di Marcotullio L, Canettieri G. Digging a hole under Hedgehog: downstream inhibition as an emerging anticancer strategy Biochim Biophys Acta (Review) (2015) 1856: 62-72; Di Magno L, Manni S, Di Pastena F, Coni S, Macone A, Cairoli S et al. Phenformin Inhibits Hedgehog-Dependent Tumor Growth through a Complex I-Independent Redox/Corepressor Module Cell reports (2020) 30:1735-1752). La scelta di questo tumore ? stata dovuta all?attivazione aberrante della via di Sonic Hedgehog, che provoca una riprogrammazione del metabolismo energetico verso la glicolisi (Di Magno L, Manzi D, D?Amico D, Coni S, Macone A, Infante P et al. Druggable glycolytic requirement for Hedgehog-dependent neuronal e medulloblastoma growth Cell Cycle (2014) 13:3404-3413) attivando specifici bersagli trascrizionali. Per questo motivo, le cellule SHH MB mostrano una marcata vulnerabilit? a inibitori della glicolisi, come dicloroacetato (DCA) o bromopiruvato, sostanze chimiche che non possono essere utilizzate in vivo a causa della loro tossicit?.
Le cellule Med1-MB (una linea cellulare di medulloblastoma di topo fornita dal Dr Yoon-Jae Cho, Stanford, CA USA e descritta in Hayden Gephart et al. Journal of Neuro-Oncology (2013) volume 115, pagine 161-168) sono state mantenute in DMEM integrato con il 10% di FBS e 100 unit? di penicillina/streptomicina.
Le cellule Med1-MB sono state coltivate in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di FBS (siero bovino fetale), penicillina-streptomicina 1 mM e glutammina 1 mM in un incubatore umidificato a 37?C e con il 5% di CO2. Per il test in vitro, per verificare la riduzione della crescita tumorale mediante l?inibizione della glicolisi aerobia, 2,5?10<3 >cellule Med1-MB/cm<2 >sono state seminate in una piastra da 12 pozzetti e incubate per una notte a 37?C. Dopo 24 ore dalla piastratura, le cellule sono state trattate con ossammato a diverse concentrazioni, come indicato in Figura 1. Dopo 72 ore, le cellule sono state tripsinizzate e contate con il procedimento di esclusione con tripan blue.
L?ossammato riduce la proliferazione in vitro delle cellule Med1-MB a >20 mM, una dose che ? tossica in vivo. I risultati sono mostrati in Figura 1.
Esempio 3. effetto di IPI/01.LF e derivati sulla proliferazione di cellule tumorali
Per valutare l?effetto sulla crescita tumorale del composto IPI/01.LF e dei derivati, 1 ? 10<4 >cellule Med1-MB sono state inseminate in una piastra da 12 pozzetti e incubate per una notte a 37?C in un incubatore umidificato. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di composti per 72 h. Alla fine dell?esperimento, la proliferazione cellulare ? stata analizzata mediante il procedimento di esclusione con Tripan Blu. I valori di IC50 sono stati determinati generando curve dose-risposta per regressione non lineare. I dati sono espressi come media ? DS di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in triplicato.
Come mostrato nelle Figure 2 e 3, IPI/01.LF inibisce la proliferazione delle cellule Med1-MB a dosi micromolari, con una IC50 calcolata di circa 0,029 mM.
L?attivit? inibitoria degli altri 6 derivati (composti #2-#7) ? indicata nella precedente Tabella 1 e nella Figura 9.
I valori registrati per IPI/01.LF sono circa 700 volte inferiori a quelli ottenuti con l?ossammato, l?inibitore di riferimento dell?enzima LDHA (vedere Figura 1).
Esempio 4. effetto di IPI/01.LF e derivati sull?attivit? dell?enzima LDHA.
Per valutare se l?effetto antiproliferativo osservato di IPI/01.LF e derivati sia una conseguenza specifica dell?attivit? inibitoria sull?enzima LDHA, l?inventore ha eseguito saggi di attivit? enzimatica misurando il tasso di consumo di NADH in seguito all?aggiunta di piruvato mediante spettrofotometria a 340 nM, come precedentemente descritto [Miskimins WK, Ahn HJ, Kim JY, Ryu S, Jung YS, Choi JY. Synergistic anti-cancer effect of phenformin e oxamate. PLoS One. 2014;9(1):e85576].
1?10<5 >cellule Med1-MB sono state raccolte, sospese in KH2PO4 0,1 M (pH 7,2), EDTA 2 mM e ditiotreitolo 1 mM (DTT), sonicate in 300 ?L di tampone di saggio (50 mmol/L di fosfato di potassio, pH 7,4) e centrifugate a 10.000 g per 10 minuti a 4?C. Il supernatante ? stato aggiunto a fosfato di potassio 50 mM (pH 7,4), piruvato 2 mM e NADH 20 ?M. L?assorbanza ? stata misurata in 10 minuti a 340 nm utilizzando uno spettrofotometro.
Alla dose di 100 ?M, IPI/01.LF (composto #1) e derivati (composti #2-#7) hanno mostrato un marcato effetto inibitorio sull?attivit? enzimatica di LDHA come mostrato nella Figura 4 e indicato nella precedente Tabella 1.
Esempio 5. Espressione del gene LDHA nel cancro del pancreas.
L?espressione genica analizzata dal database R2 Genomics Analysis e Visualization Platform (http://r2.amc.nl) indica che l?espressione del mRNA di LDHA ? significativamente pi? alta nell?adenocarcinoma pancreatico umano, un tumore molto aggressivo con prognosi severa, fortemente dipendente dalla riprogrammazione metabolica in senso glicolitico per effetto dell?elevata espressione del gene LDH (Yan L, Raj P, Yao W, Ying H. Glucose Metabolism in Pancreatic Cancer. Cancers (Review) (2019) 11(10):1460) come risposta adattativa alla richiesta di energia.
Il modulo Mega Sampler R2 ? stato utilizzato per studiare il livello di espressione del gene LDHA in cellule di cancro del pancreas (#6) e in tessuti normali (#2), raggruppati nel database di analisi R2. Il gruppo di sonde di LDHA con il segnale medio presente (APS) pi? alto ? stato selezionato [(200650_s_at) APS=2246,1(88) Media=2246,1] e i livelli di espressione dei set di dati sono stati convertiti in valori non trasformati. ? stato eseguito un test statistico ANOVA ad una via e il grafico risultante ? stato rappresentato a istogrammi come mostrato nella Figura 5.
Esempio 6. Analisi dell?attivit? antitumorale di IPI/01.LF in modelli preclinici.
L?inventore ha testato il composto #1-IPI/01.LF sulla proliferazione di cellule Panc1 di adenocarcinoma duttale del pancreas umano (PDAC) (American Tissue Cell Culture (ATCC, Manassas, VA, USA); codice prodotto: ATCC? CRL-1469<TM>) una linea di cellule tumorali umane che mostra una alta attivit? glicolitica (Liu L, Gong L, Zhang Y, Li N. Glycolysis in Panc-1 human pancreatic cancer cells is inhibited by everolimus Experimental and therapeutic medicine (2013) 5: 338-342).
Le cellule PANC-1 sono state mantenute in DMEM integrato con il 10% di FBS e 100 unit? di penicillina/streptomicina.
1 ? 10<5 >cellule sono state inseminate in una piastra da 12 pozzetti e trattate con il composto IPI/01.LF alle concentrazioni indicate nella Figura 6. Dopo 72 h la proliferazione cellulare ? stata misurata mediante il procedimento di esclusione con Tripan Blu. Il valore di IC50 ? stato determinato generando curve dose-risposta per regressione non lineare. I dati sono espressi come media ? DS di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in triplicato.
Come mostrato in Figura 6, il composto #1-IPI/01.LF ha mostrato una notevole attivit? antiproliferativa, all?interno del range micromolare, con una IC50 di circa 0,023 mM, analogamente a quanto ? stato osservato con le cellule Med1-MB.
Esempio 7. Esperimenti in vivo sul composto IPI/01.LF.
Per valutare gli effetti terapeutici in vivo del composto IPI/01.LF sono stati eseguiti studi su modelli murini nudi (nu/nu) immunodeficienti sottoposti a eterotrapianto con cellule di tumore pancreatico umano Panc1.
Cellule Panc1 sono state trasdotte stabilmente con 5 MOI di un lentivirus esprimente il gene della luciferasi (pLenti CMV Puro LUC (w168-1)). Il vettore lentivirale ? stato acquistato dalla Addgene, Watertown, MA 02472 USA (plasmide #17477); Campeau E, et al A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells PLoS One (2009) 4(8):e6529.
Cellule Panc1 stabilmente trasdotte sono state impiantate per via sottocutanea in topi atimici nudi Balb/C immunocompromessi. Quando i tumori hanno raggiunto il volume di 200 mm<3>, i topi sono stati trattati con 20 mg/kg di composto IPI/01.LF disciolti in olio di mais o solo con olio di mais (veicolo) ? stata loro praticata un?iniezione per via intraperitoneale ogni due giorni. La crescita tumorale ? stata monitorata con un calibro a giorni alterni. I dati sono espressi come media ? DS di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in triplicato.
Come mostrato nella Figura 7, la velocit? di crescita tumorale in vivo era significativamente pi? bassa nei topi trattati con il composto IPI/01.LF rispetto ai topi di controllo trattati con il veicolo. Alla fine del trattamento, il volume medio dei tumori era significativamente ridotto rispetto ai controlli, mentre il peso di entrambi i gruppi di topi era invariato.
Poich? le cellule tumorali Panc1 innestate esprimono il gene ectopico reporter della luciferasi, la luminescenza del tumore ? stata utilizzata per monitorare la crescita tumorale. La luminescenza ? stata misurata utilizzando un sistema di imaging in vivo IVIS Lumina III (PerkinElmer).
Ai topi ? stata iniettata luciferina per via intraperitoneale (substrato bioluminescente di D-luciferina in soluzione RediJect, PerkinElmer) e questi sono stati analizzati misurando l?emissione di fotoni (bioluminescenza).
10 ?L di luciferina (soluzione madre di 15 mg/mL)/grammo di peso corporeo del topo sono stati iniettati nel quadrante addominale inferiore sinistro di topi Balb/C sottoposti a eterotrapianto con un ago da 25 gauge. Dopo 10 minuti, gli animali sono stati anestetizzati con una miscela di ossigeno gassoso e isoflurano vaporizzato. Una volta che gli animali sono stati completamente anestetizzati, sono stati posizionati all?interno della cassetta di imaging per l?acquisizione dell?immagine dell?animale. I dati sono stati analizzati utilizzando il software LivingImage. L?acquisizione delle immagini ? stata eseguita all?inizio (T=0) e alla fine (T=17) dell?esperimento e sono stati determinati i pesi corporei (g) dei topi al momento del sacrificio.
Nei topi trattati con il solo veicolo, i tumori hanno mostrato un?emissione di segnali luminosi che ? aumentata significativamente nel tempo (Figura 8). Al contrario, nei topi trattati con 20 mg/Kg di IPI/01.LF il segnale luminescente ha mostrato una significativa regressione nel tempo, indicando ulteriormente l?efficacia terapeutica del composto in modelli animali portatori di un tumore umano.
Nel complesso, questi dati dimostrano che l?inibitore di LDH IPI/01.LF ha una marcata attivit? inibitoria specifica sull?enzima LDH e un forte effetto antitumorale in vitro e in vivo.

Claims (14)

  1. Rivendicazioni 1. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I):
    in cui R1 ed R2 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, un fenile sostituito o non sostituito, un eterociclo sostituito o non sostituito e un eterociclo benzofuso sostituito o non sostituito; R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2- 6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2; X ? selezionato tra: CH2, C=O, S, SO, SO2 e nessun sostituente; in cui detti uno o pi? sostituenti sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH, OR5, NHR5 ed NR5R6; e in cui R5 ed R6 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, e un anello aromatico Ar1 sostituito o non sostituito; un suo sale, sale idrato, polimorfo, racemo, diastereoisomero o enantiomero farmaceuticamente accettabile, con l?eccezione di: 2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide, 2,4-Diosso-3-(2-clorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide, 2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide, 2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide, 2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-metilfenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide, 2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(piridin-4-il)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide, 2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(piridin-2-il)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide, 2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(thiazol-2-il)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide.
  2. 2. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide secondo la rivendicazione 1, in cui R1 ed R2 sono indipendentemente selezionati tra: fenile non sostituito, un eterociclo sostituito o non sostituito.
  3. 3. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile.
  4. 4. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui X ? selezionato tra: CH2, C=O.
  5. 5. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l?anello aromatico Ar1 ? selezionato tra: fenile, benzile, fenossile, benzilossile, naftile, naftilossile, bifenile ed eterociclo.
  6. 6. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detti uno o pi? sostituenti dell?anello aromatico Ar1 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6-alchile, C3-10-cicloalchile, C2-6-alchenile, C2-6-alchinile, C1- 6-alcossile, C2-6-alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2.
  7. 7. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide ha formula (II):
    in cui R1<i>, R1<ii>, R1<iii>, R1<iv>, R1<v>, R2<i>, R2<ii>, R2<iii>, R2<iv>, R2<v >sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, -CN, NH2, OH, NO2, OR7, NHR8 ed NR7R8; R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2- 6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2; R7 ed R8 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1- 6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, e un anello aromatico Ar2 sostituito o non sostituito; X ? selezionato tra: CH2, C=O, S, SO2, SO, e nessun sostituente; e W, Y e Z sono indipendentemente selezionati tra: CH, N, O oppure S.
  8. 8. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti selezionato tra: ? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(3-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (2); ? 2,4-Diosso-3-(4-fluorobenzil)-N-(2-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (3); ? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (4); ? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(3,5-dimetossifenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (5); ? 2,4-Diosso-3-benzil-N-(4-carbossammidofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (6); ? 2,4-Diosso-3-(4-metossibenzil)-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (7); ? 2,4-Diosso-3-(2,4-difluorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (8); ? 2,4-Diosso-3-(4-clorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (10); ? 2,4-Diosso-3-(2,4-diclorobenzil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (11); ? 2,4-Diosso-3-(3-fluoropiridin-4-ilmetil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (12); ? 2,4-Diosso-3-(piridin-4-ilmetil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (13); ? 2,4-Diosso-3-(pirimidin-4-ilmetil)-N-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (14); ? 2,4-Diosso-3-(4-fluorobenzil)-N-(4-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (16); ? 2,4-Diosso-3-(2,4-difluorobenzil)-N-(4-fluorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (17); ? 2,4-Diosso-3-(benzil)-N-(2-clorofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (18); ? 2,4-Diosso-3-(2-fluorobenzil)-N-(4-aminofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (21); ? 2,4-Diosso-3-(benzil)-N-(3,5-dimetossirofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (25); ? 2,4-Diosso-3-(benzil)-N-(4-carbossammidoofenil)-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide (26).
  9. 9. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I)
    per l?uso nel trattamento di un paziente affetto da un tumore, in cui R1 ed R2 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, un fenile sostituito o non sostituito, un eterociclo sostituito o non sostituito e un eterociclo benzofuso sostituito o non sostituito; R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2- 6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2; X ? selezionato tra: CH2, C=O, S, SO, SO2 e nessun sostituente; in cui detti uno o pi? sostituenti sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH, OR5, NHR5 ed NR5R6; e in cui R5 ed R6 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, e un anello aromatico Ar1 sostituito o non sostituito; un suo sale, sale idrato, polimorfo, racemo, diastereoisomero o enantiomero farmaceuticamente accettabile.
  10. 10. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) per l?uso secondo la rivendicazione 9, in cui il tumore ? selezionato tra tumori del cervello e del pancreas.
  11. 11. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) per l?uso secondo la rivendicazione 9 o la rivendicazione 10, in cui il tumore ? selezionato tra medulloblastoma, neuroblastoma e adenocarcinoma duttale del pancreas.
  12. 12. Derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 a 11, in cui il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidina di formula (I) deve essere somministrato a una dose compresa tra 0,001 e 10 mM.
  13. 13. Composizione farmaceutica comprendente almeno un derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) e un veicolo farmaceuticamente accettabile,
    in cui R1 ed R2 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, un fenile sostituito o non sostituito, un eterociclo sostituito o non sostituito e un eterociclo benzofuso sostituito o non sostituito; R3 ed R4 sono indipendentemente selezionati tra: idrogeno, C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2- 6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH ed NO2; X ? selezionato tra: CH2, C=O, S, SO, SO2 e nessun sostituente; in cui detti uno o pi? sostituenti sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, alogeno, CN, NH2, OH, OR5, NHR5 ed NR5R6; e in cui R5 ed R6 sono indipendentemente selezionati tra: C1-6 alchile, C3-10 cicloalchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, C1-6 alcossile, C2-6 alcossicarbonile, eterocicloalchile avente 3-10 elementi, e un anello aromatico Ar1 sostituito o non sostituito; un suo sale, sale idrato, polimorfo, racemo, diastereoisomero o enantiomero farmaceuticamente accettabile.
  14. 14. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 13, in cui la composizione farmaceutica contiene il derivato di 1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-carbossammide di formula (I) a una concentrazione compresa tra 0,001 e 10 mM.
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