IT201700019088A1 - Composizione per montaggio di vetrini portaoggetti e metodo per la preparazione di campioni biologici citologici, istologici e autoptici - Google Patents
Composizione per montaggio di vetrini portaoggetti e metodo per la preparazione di campioni biologici citologici, istologici e autopticiInfo
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Description
“COMPOSIZIONE PER MONTAGGIO DI VETRINI PORTAOGGETTI E METODO PER LA PREPARAZIONE DI CAMPIONI BIOLOGICI CITOLOGICI, ISTOLOGICI E AUTOPTICI”
RIASSUNTO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto una composizione per montaggio di vetrini portaoggetti e un metodo per la preparazione di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici. L’invenzione ha anche per oggetto detti campioni montati con la composizione dell’invenzione.
CONTESTO DELL’INVENZIONE
Nella diagnostica istocitopatologica, l’osservazione microscopica di campioni biologici è finalizzata alla formulazione della diagnosi.
La preparazione dei campioni biologici, ovvero dei tessuti e delle cellule, è un processo multistadio che si avvale di tecnologie automatiche e/o protocolli manuali finalizzati a rendere il campione stesso adatto all’osservazione al microscopio.
Com’è noto nella pratica, i campioni sono sottoposti a svariate operazioni che prevedono la fissazione, la diafanizzazione e la colorazione, prima di essere “montati” su un vetrino portaoggetti per l’analisi al microscopio.
Il “montaggio” consiste nel ricoprire il campione che si trova sul vetrino portaoggetti con un vetrino coprioggetti, di norma avente uno spessore inferiore al millimetro. L’adesione stabile del vetrino coprioggetti al vetrino portaoggetti si ottiene utilizzando un mezzo di montaggio che abbia un indice di rifrazione simile a quello del vetrino.
I mezzi di montaggio sono sostanze viscose, di solito solubili in solventi organici, che agiscono da collante e, una volta essiccate, garantiscono una buona conservazione del campione. Inoltre, è requisito fondamentale che tutti i materiali utilizzati per il montaggio siano ultra trasparenti, in modo che la luce proveniente dalla sorgente luminosa arrivi quantitativamente all’obiettivo. Il mezzo di montaggio più diffuso è il balsamo del Canada (anche comunemente noto come trementina del Canada).
Il vetrino montato viene quindi sottoposto all’osservazione al microscopio ottico, al fine di formulare la diagnosi.
Il montaggio dei vetrini rappresenta una sorta di confezionamento del campione istocitopatologico e incide molto sulla sua leggibilità e sulla resistenza nel tempo.
Lo scopo del montaggio è quindi fare in modo che il campione da analizzare si trovi all’interno di mezzi con indice di rifrazione omogenei, per evitare eventuali distorsioni dell’immagine al momento dell’osservazione microscopica.
Un’altra funzione del montaggio è quella di proteggere il campione e permetterne la conservazione per lunghi periodi.
Nella procedura pratica di montaggio dei vetrini, dopo aver effettuato la colorazione con sostanze idrosolubili (come la colorazione tipica ematossilina-eosina), è necessario procedere alla disidratazione del campione mediante immersioni del vetrino in scala alcolica crescente con ultimo passaggio in xilolo. La disidratazione si rende necessaria poiché il mezzo montante di cui sopra non è miscibile con l’acqua o con le sue soluzioni. Dopo una corretta disidratazione si depone sul vetrino, per mezzo di una pipetta usa e getta a perdere, un’aliquota di mezzo montante, facendo attenzione a non dispensarne in eccesso. Subito dopo viene adagiato sul vetrino il sottile vetrino coprioggetti.
Questa procedura può avvenire in modalità manuale o in modalità automatica, mediante l’utilizzo di montavetrini automatici.
Un montavetrini automatico standard è in grado di applicare in sequenza i vetrini coprioggetti sui vetrini portaoggetti supportanti la sezione di campione, prelevandoli direttamente dal cestello utilizzato per la colorazione. A colorazione ultimata, il cestello viene collocato in un cassetto del montavetrini automatico, successivamente una pinza preleva dal cestello un vetrino alla volta disponendolo in posizione orizzontale sotto l’ugello del sistema erogatore di mezzo montante.
Dopo l’erogazione di un aliquota di montante, una ventosa appone sul vetrino un vetrino coprioggetto terminando l’allestimento del preparato.
Alcuni di questi montavetrini automatici non utilizzano vetrini coprioggetti, bensì una pellicola che viene rilasciata sulla superficie del vetrino portaoggetti dopo averlo opportunamente bagnato con xilene per consentire un’aderenza opportuna.
La procedura di montaggio del campione correntemente utilizzata e brevemente esposta più sopra, presenta tuttavia diversi svantaggi.
Nel caso in cui si adoperi una procedura di montaggio manuale, vi sarà la necessità di utilizzo della cappa aspirata. Difatti, essa viene utilizzata per limitare il rischio derivante dall’utilizzo di sostanze tossiche quali lo xilolo, impiegato sia per il trattamento delle sezioni sia come diluente del mezzo montante.
Vi è inoltre la criticità della corretta apposizione del vetrino coprioggetti sul vetrino portaoggetti (sia in caso di montaggio manuale, sia automatizzato). Può capitare che il vetrino coprioggetti sporga leggermente dai bordi del vetrino portaoggetti, e nei casi di maggior disallineamento il vetrino coprioggetti dev’essere rimontato dall’operatore.
Tuttavia, questa operazione diventa irreversibile dal momento in cui il mezzo montante si asciuga. Se si volesse agire a mezzo montante asciutto, il vetrino montato dovrebbe permanere in xilene in alcuni casi anche 3-4 giorni prima di poter rimuovere il vetrino coprioggetti disallineato, per poi rimontarne nuovamente un altro. Ancora, i microscopi sono dotati di un’aletta metallica, agganciata al vassoio mobile, utile per mantenere fermo il vetrino durante l’osservazione. Nel momento del posizionamento del vetrino sotto la lente, l’aletta metallica urta energicamente il vetrino montato provocando la rottura di piccoli frammenti dagli spigoli del vetrino. La non corretta apposizione del vetrino coprioggetti sul vetrino portaoggetti può peggiorare notevolmente la scheggiatura del vetrino montato al microscopio, in quanto i frammenti creati vanno ad accumularsi sulla lampada del microscopio (posta al di sotto del vetrino) e lasciano inoltre i bordi del vetrino montato pericolosamente scheggiati.
Ancora, la criticità più frequente è la possibilità di formazione di bolle d’aria tra vetrino coprioggetti e campione. Nella procedura di montaggio, le bolle d’aria si formano come conseguenza alla manipolazione da parte dell’operatore, per semplice spostamento del contenitore oppure per prelievo del mezzo montante con la pipetta (qualora si fosse versato del montante in eccesso). Tutte queste operazioni causano lo scorrimento del vetrino coprioggetti sul vetrino portaoggetti, provocando l’inglobamento di piccole bolle d’aria da parte del mezzo montante. Queste rimangono intrappolate in esso a causa della sua viscosità, causando disturbi alla corretta visione microscopica.
Un ulteriore svantaggio riguarda l’imprecisa ed eventuale abbondante dispensazione del mezzo montante. Qualora ciò accada, sarà necessario rimuovere il mezzo montante in eccesso che fuoriesce dal vetrino montato, in quanto esso possiede un forte potere adesivo, complicando evidentemente la manipolazione da parte dell’operatore. La rimozione del mezzo montante in eccesso è un procedimento delicato, in quanto eventuali sbavature del fluido su vetrino coprioggetti comprometterebbero la visione microscopica. Lo “smontaggio” del preparato costituisce un’altra criticità. Difatti, nei casi in cui ci sia necessità di recuperare il campione biologico da un vetrino montato da molto tempo (allo scopo di effettuare ulteriori indagini), per poter rimuovere il vetrino coprioggetti, come detto, il vetrino montato deve permanere in un bagno di xilolo per almeno 3 giorni. Con il passare del tempo, infatti, il mezzo montante diventa meno prono alla solubilizzazione in xilene (solvente ad hoc per solubilizzare e/o diluire i più comuni mezzi montanti). Inoltre se l’operazione di risolubilizzazione del mezzo montante non viene fatta in modo opportuno, la rimozione del vetrino coprioggetti provoca il distacco del campione dal vetrino portaoggetti o l’asportazione di una parte di esso, compromettendo irrimediabilmente l’impiego del campione stesso per le ulteriori indagini necessarie. Si comprende pertanto che il montaggio richiede un elevato dispendio di tempo, che è proporzionale al numero di vetrini da montare e che è anche dovuto alla grande precisione richiesta per applicazione di mezzo montante e vetrino coprioggetti. A questo tempo va sommato il tempo necessario per la completa asciugatura dei vetrini montati. Per accelerare il processo di asciugatura si tende quindi ad incubare i vetrini montati all’interno di una stufa a 60 °C per circa 30 minuti. Nei laboratori in cui questa pratica non è condivisa, i vetrini montati non vengono archiviati immediatamente dopo la lettura, ma di solito rimangono in laboratorio per i successivi 3-4 giorni, in attesa della completa asciugatura del montante. Pertanto, è evidente che un vetrino montato con mezzi montanti convenzionali non è archiviabile immediatamente dopo l’analisi dello stesso, in quanto il mezzo montante si deve asciugare completamente per avere un archivio gestibile, ovvero per avere un archivio con i vetrini che non si incollino e fissino tra di loro.
Per quanto riguarda la procedura automatizzata, vi sono altri svantaggi rispetto alla procedura manuale. Tra questi, vi è la delicata calibrazione dello strumento. Dato che la procedura di montaggio richiede una notevole precisione, lo strumento ha bisogno di una calibrazione millimetrica per evitare errori macroscopici di preparazione. Ad esempio, una calibrazione imprecisa del meccanismo che muove la pinza può portare alla rottura del vetrino; parimenti, l’apposizione non perfettamente centrata del vetrino coprioggetti costringe l’operatore a smontare e montare nuovamente il preparato. Inoltre tutti i componenti del circuito di prelievo del montante devono essere perfettamente saldi per evitare la formazione di bolle d’aria.
Esistono anche dei montavetrini automatici che utilizzano una pellicola in sostituzione al vetrino coprioggetti; tali montavetrini necessitano di un’accurata calibrazione, al fine di assicurare che la pellicola sia distesa in modo uniforme e non causi degli artefatti sul vetrino.
Inoltre, trattandosi di uno strumento di alta precisione, esso deve essere posto su un tavolo dedicato privo di vibrazioni e, possibilmente, anche su pavimento anti-vibrazione. Ancora, è opportuno collocare lo strumento sotto cappa, in posizione perfettamente orizzontale, poiché il mezzo montante è spesso diluito con xilolo e le operazioni di pulizia vengono generalmente effettuate con xilolo.
In aggiunta, le operazioni di pulizia dello strumento sono necessarie ogni giorno. Al termine dell’utilizzo del montavetrini automatico devono essere rimossi i residui di montante dai caricatori di prelievo, dalla pinza e dal nastro trasportatore, oltre che dall’ugello dispensatore di montante. Queste operazioni di pulizia vengono effettuate con un panno imbevuto in xilolo, tossico per l’operatore, soprattutto se lo strumento non viene posizionato sotto la cappa aspirante. Bisogna inoltre prestare estrema attenzione perché non penetrino liquidi all’interno dello strumento e nei contatti elettrici. Inoltre, se dovesse restare del solvente all'interno dello strumento, si possono sviluppare vapori di solvente. Con un impiego dell'unità senza cappa, sussiste il rischio di incendio ed avvelenamento. Poiché la rottura di piccoli frammenti di vetrino è frequente a causa di piccole imperfezioni nella calibrazione di tutto il sistema, si rende necessaria la rimozione di suddetti frammenti dal nastro trasportatore, dalla vaschetta di raccolta dei vetrini, dalla cassetta di carico, dalla ventosa e dal vano interno dello strumento. Inoltre, sono chiaramente necessarie numerose operazioni di manutenzione degli strumenti utilizzati. Infine, i vetrini per l’analisi immunoistochimica vengono spesso dotati di un’etichetta con codice a barre sulla banda sabbiata, prima ancora dell’apposizione del campione biologico. Tale etichetta, necessaria per l’identificazione, può essere causa di malfunzionamento della pinza del montavetrini automatico, in quanto residui di colla provenienti dall’etichetta tendono ad accumularsi sulle morse, rendendo necessaria la pulizia con xilolo.
In vista di quanto precede, si comprende che vi è la necessità trovare sistemi per il montaggio di vetrini in grado di ovviare ai numerosi svantaggi legati alla procedura di montaggio convenzionale dei campioni biologici.
SCOPI DELL’INVENZIONE
È scopo della presente invenzione fornire una composizione che permetta di ridurre il tempo di montaggio di vetrini portaoggetti per l’analisi di campioni citologici, istologici e autoptici rispetto al montaggio convenzionale.
È pure scopo della presente invenzione fornire una composizione che permetta di ottenere un vetrino montato in assenza di bolle e che al contempo che fornisca altri vantaggi, come un’adatta protezione al vetrino stesso.
È ulteriore scopo della presente invenzione fornire l’uso di detta composizione per la preparazione di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici per la loro osservazione al microscopio.
È anche scopo della presente invenzione fornire un metodo rapido ed efficace per la preparazione di vetrini portaoggetti per l’analisi di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici.
È infine scopo della presente invenzione fornire dei campioni biologici montati con detta composizione.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto una composizione per il montaggio di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici che comprende che comprende:
a) almeno un componente liquido scelto tra xilene, etilacetato, butilacetato e solventi a base di isoparaffine; e
b) uno o più polimeri scelti tra polimetilmetacrilato, polietilmetacrilato, polibutilmetacrilato, polimetilacrilato e polietilacrilato, al 15% - 80% ([g di polimero/100 ml di detto componente liquido]).
Tutte le percentuali espresse nella presente invenzione, a meno che non espressamente indicato, si riferiscono alla concentrazione percentuale massa/volume ([g/100 ml]) cioè al peso di composto, ad esempio al peso di composto (b), rispetto a 100 unità di volume di componente liquido. A titolo di esempio, un polimero (b) al 20% indica che nella composizione sono presenti 20 g di polimero (b) e 100 ml di componente liquido.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 20-70%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 20-50%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 20-40%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 30-70%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 30-60%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 30-40%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 40-70%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 40-60%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 40-50%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 50-70%.
Secondo una forma di realizzazione, detto uno o più polimeri (b) è al 60-70%.
Secondo una forma di realizzazione preferita, detto uno o più polimeri (b) sono presenti in ragione del 10-50%, ancor più preferibilmente del 20-40%.
Nella presente invenzione, per “solventi a base di isoparaffine” si intende un componente liquido che comprende, tra gli altri sostanze, miscele di idrocarburi alifatici, preferibilmente aventi fino a 13 atomi di carbonio, in cui dette miscele di idrocarburi sono presenti, nel componente liquido, in quantità preferibilmente superiori al 40%, vantaggiosamente almeno al 50%. come ad esempio i prodotti attualmente commercializzati dalla Richiedente con le denominazioni commerciali Diasolv<®>ed Ottix Plus<®>.
In una forma di realizzazione preferita, la composizione secondo l’invenzione comprende inoltre uno o più mezzi montanti attualmente commercializzati con la denominazione commerciale Diamount<®>(che comprende isoparaffine), Micromount<®>(che comprende xilene ed etilbenzene), Eukitt<®>(che comprende xilene) ed OpticMount<®>(che comprende toluene e polimeri acrilati), in quantità dal 5% al 30% v/v rispetto al volume totale della composizione formata da (a) e (b)..
L’invenzione ha altresì per oggetto l’uso della composizione nella preparazione di vetrini portaoggetti di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici (qui di seguito denominati anche solo campioni biologici).
La composizione secondo l’invenzione può essere assimilata sostanzialmente ad una resina ed è utile per il montaggio di campioni, in genere biologici, in microscopia ottica. Nella presente invenzione, per “resina” si intende un materiale liquido viscoso, in grado di indurirsi in determinate condizioni, come sarà spiegato successivamente.
Nella presente invenzione, per “montaggio” si intende, come detto, il passaggio all’interno del procedimento di allestimento di un campione, in genere biologico, ad esempio istologico o citologico, ma anche di altri tipi, su un vetrino portaoggetti, solitamente eseguito al fine condurre delle analisi al microscopio, ben noto all’esperto del ramo.
La composizione secondo l’invenzione comprende quindi esteri di polimeri dell’acido metacrilico e acrilico, come polimetilmetacrilato, polietilmetacrilato, polibutilmetacrilato, polimetilacrilato e polietilacrilato, o una miscela di questi, ed almeno un componente liquido scelto tra xilene, etilacetato, butilacetato, solventi a base di isoparaffine. Tuttavia, secondo delle forme di realizzazione, la composizione secondo l’invenzione può altresì comprendere altri componenti oltre a quelli sopramenzionati. Difatti, la composizione secondo l’invenzione può comprendere dei componenti in grado di migliorare l’adesione della composizione secondo l’invenzione al vetrino portaoggetti (composti “bond enhancer”), come uno o più derivati organosilani funzionalizzati, preferibilmente γ-metacrilossipropiltrimetossisilano; tali componenti sono preferibilmente allo 0,5% - 10% e più preferibilmente all’1% - 5%.
Ancora, la composizione secondo l’invenzione può comprendere degli agenti antigraffio, come polisilossani (ovvero, siliconi) e/o paraffina, preferibilmente polidimetilsilossano; tali componenti sono preferibilmente allo 0,01% - 5% e più preferibilmente allo 0,1% -1%.
La composizione secondo l’invenzione può ulteriormente comprendere degli antiossidanti, preferibilmente fenoli e/o ammine aromatiche funzionalizzati, ancor più preferibilmente butilidrossitoluene (BHT); tali componenti sono preferibilmente allo 0,05% - 2% e più preferibilmente allo 0,1% - 1%.
La composizione secondo l’invenzione può comprendere anche dei componenti in grado di proteggere la composizione stessa dai raggi UV (“UV absorber”), preferibilmente benzofenoni e/o benzotriazoli funzionalizzati, come ad esempio il 2-idrossibenzofenone, il 4-idrossibenzofenone e il 2-idrossifenil benzotriazolo. Tali componenti sono preferibilmente allo 0,01% - 2% e più preferibilmente allo 0,1% - 1%.
La composizione secondo l’invenzione può inoltre comprendere dei plastificanti, preferibilmente almeno un plastificante scelto tra quelli della famiglia degli ftalati, degli adipati e dei benzoati; preferibilmente allo 0,05% - 5%, preferibilmente allo 0,1% - 3%. L’esperto del ramo è perfettamente in grado di comprendere l’utilità di ciascuno dei componenti sopra citati all’interno della composizione.
Il procedimento di preparazione di una qualsiasi forma di realizzazione della composizione secondo l’invenzione non richiede condizioni od operazioni critiche. Difatti, il procedimento può avvenire interamente a temperatura ambiente, e può essere condotto in un recipiente, preferibilmente opaco od ambrato, dotato di tappo o di un altro tipo di chiusura al fine di evitare l’evaporazione del componente liquido. A questo recipiente si aggiunge il componente liquido e successivamente sotto agitazione, meccanica o magnetica, si aggiungono gli altri elementi che compongono la composizione secondo l’invenzione od una delle sue forme di realizzazione preferite.
Infine, si lascia in agitazione fino all’ottenimento di una miscela limpida omogenea. Degli esempi pratici del procedimento di preparazione di alcune forme di realizzazione rappresentative secondo l’invenzione sono forniti nella sezione sperimentale.
La composizione secondo l’invenzione, come sarà ampiamente spiegato di seguito, è in grado di proteggere efficacemente il campione biologico e di non generare distorsioni al microscopio, essendo questa ultratrasparente, ed inoltre riproduce tutte le caratteristiche di funzionalità di un vetrino coprioggetti. Ancora, la composizione secondo l’invenzione è caratterizzata da elevata aderenza al vetrino portaoggetti, resistenza alle sollecitazioni meccaniche ed elevata stabilità nel tempo. In aggiunta, per sua natura, la composizione secondo l’invenzione non interferisce con il materiale, non producendo alterazioni od artefatti nella struttura o nella colorazione del campione.
La particolare combinazione dei polimeri che compongono la composizione secondo l’invenzione conferisce al materiale flessibilità e rigidità allo stesso tempo. È evidente che un certo grado di flessibilità è necessario per creare uno strato livellato e omogeneo su tutta l’area del vetrino, che rivesta uniformemente il vetrino portaoggetti per circa 3-5 micron, senza rischio di fratture in corrispondenza dei bordi della sezione dopo completa asciugatura della composizione. Nel contempo, è necessario che la composizione sia dotata di una rigidità tale da creare una barriera protettiva, ad esempio resistente agli stress di tipo meccanico, in grado di proteggere efficacemente il campione.
Inoltre, la composizione secondo l’invenzione vanta di un indice di rifrazione molto vicino a quello del vetrino (1.48 – 1.50), apparendo ultratrasparente ad occhio nudo (come raffigurato in Figura 3), sia per apposizione di un unico strato (nel caso in cui la composizione sia applicata sul vetrino portaoggetti tramite dispensazione orizzontale, come sarà spiegato di seguito), sia per apposizione di uno strato doppio (nel caso in cui la composizione sia applicata sul vetrino tramite immersione del vetrino portaoggetti, come sarà spiegato di seguito). La composizione secondo l’invenzione è particolarmente adatta per l’esame al microscopio, perché non crea aberrazioni, distorsioni né alterazioni del colore del campione biologico; difatti, è possibile notare dalla Figura 4, che rappresenta l’immagine al microscopio di un campione biologico montato con la composizione secondo l’invenzione, che il campione appare ultratrasparente, perfettamente adatto all’osservazione, e non presenta distorsioni od aberrazioni.
È possibile modulare accuratamente la viscosità della composizione secondo l’invenzione, allo scopo di prevenire l’inglobamento di bolle d’aria e allo stesso tempo di promuovere (i) l’adesione di uno strato di adeguato spessore sul vetrino portaoggetti e (ii) l’auto-livellamento della composizione in seguito alla sua applicazione. La modulazione della viscosità è ottenibile modificando le proporzioni tra polimeri e componente liquido; com’è evidente per l’esperto del ramo, aumentando la quantità di componente liquido all’interno della composizione secondo l’invenzione, la viscosità diminuirà, e viceversa. Inoltre, la totale immiscibilità della composizione secondo l’invenzione con l’acqua la rende un materiale non alterabile dall’umidità dell’aria. Essa risulta invece solubile in xilolo, toluene e solventi a base di limonene e solventi a base di isoparaffine.
Nei casi in cui si renda necessario lo smontaggio del vetrino montato, ad esempio per ulteriori analisi del materiale istocitologico, la composizione dell’invenzione può essere rimossa dal vetrino per semplice immersione in uno dei solventi sopramenzionati, che sono in grado di solubilizzare la composizione. L’operazione di risolubilizzazione della composizione e smontaggio del campione necessita di un tempo limitato, ovvero qualche minuto (5-7 minuti), di molto inferiore rispetto alla medesima operazione che prevede l’utilizzo di vetrini portaoggetti montati convenzionalmente, ovvero tramite mezzo montante e vetrino coprioggetti, che richiede diversi giorni.
È evidente quindi che l’applicazione della composizione secondo l’invenzione sulla superficie del vetrino portaoggetti porti a numerosi vantaggi rispetto alla procedura di montaggio convenzionale. Infatti, come detto, tale applicazione crea un film uniforme, livellato, ultratrasparente, privo di bolle d’aria, che permette un rapido smontaggio e avente opportune caratteristiche di rigidità e flessibilità.
Un ulteriore vantaggio è rappresentato dalle condizioni che consentono l’indurimento della composizione secondo l’invenzione (la quale è assimilabile ad una resina) in seguito all’applicazione della composizione stessa su uno o più vetrini. Queste condizioni infatti non richiedono un irraggiamento UV, né temperature eccessive, bensì la semplice esposizione all’aria oppure un moderato trattamento termico, ad esempio ad una temperatura di circa 60 °C, in questo ultimo caso con un risparmio di tempo rispetto alla sola esposizione all’aria.
Le condizioni di indurimento della composizione secondo l’invenzione portano quindi un importante vantaggio relativamente ai limiti di stabilità dei campioni biologici, che non sono in grado di tollerare in modo accettabile gli stress termici prolungati o le radiazioni UV persistenti. In seguito a tali stress, vi è la concreta possibilità che diverse caratteristiche del campione risultino alterate, ad esempio a causa dell’interferenza con il DNA, con le strutture biologiche nell’insieme e con i coloranti, creando così alterazioni o artefatti nella struttura del campione.
Peraltro, il processo di polimerizzazione mediante UV richiede una orientazione ben definita del vetrino rispetto alla sorgente UV e un orientamento non ottimale dilaterebbe i tempi di irraggiamento deteriorando il campione biologico. D’altra parte, se si utilizzano i comuni coloratori automatici, dove i vetrini sono sistemati nel cestello, per realizzare un orientamento ottimale dei vetrini rispetto alla sorgente UV, l’operatore sarebbe costretto ad intervenire per rimuoverli dal cestello e sistemarli su una superficie opportuna, operazione questa che richiede tempo e annulla i vantaggi della processazione automatica. Diversamente, la presente invenzione consente all’operatore di montare i vetrini direttamente nel cestello utilizzato per la colorazione, con un’unica semplice operazione e senza bisogno di rimuovere/risistemare i vetri.
Un altro vantaggio offerto dalla composizione secondo l’invenzione è che il tempo necessario all’indurimento della composizione secondo l’invenzione è breve ma lascia comunque all’operatore, o allo strumento automatico, un tempo sufficiente per manipolare in modo opportuno il vetrino da montare.
Infatti, il tempo di indurimento della composizione secondo l’invenzione costituisce il tempo ideale per permettere all’operatore, o allo strumento automatico, un’agevole manipolazione del vetrino da montare, consentendo al contempo una rapida e veloce operazione di montaggio, riducendo in modo sensibile i tempi di allestimento dei preparati biologici e ottimizzando così il flusso di lavoro. A titolo di esempio, un unico vetrino sul quale è stata applicata la composizione secondo l’invenzione necessita di circa 8 minuti per indurire all’aria e di circa 4 minuti per indurire in stufa alla temperatura di 65 °C.
La composizione secondo l’invenzione può essere applicata direttamente sul vetrino disposto in posizione orizzontale, in quanto la sua viscosità può essere messa a punto variando la quantità di xilene e/o etilacetato e/o butilacetato e/o solventi a base di isoparaffine all’interno della composizione dell’invenzione stessa, permettendo ad essa di auto-livellarsi sulla superficie del vetrino, senza fuoriuscire dai bordi.
Inoltre, la composizione secondo l’invenzione può essere convenientemente applicata sul vetrino da montare grazie alla semplice e veloce immersione di uno o più vetrini, solitamente in posizione verticale, nella composizione secondo l’invenzione. Questa applicazione porta a tutti i vantaggi sopradescritti e a molti altri ancora.
Tra questi vantaggi addizionali, vi è un ulteriore e notevole risparmio di tempo. Infatti, come sarà mostrato nella sezione sperimentale della presente descrizione, l’operazione di immersione all’interno della composizione secondo l’invenzione può coinvolgere più vetrini contemporaneamente, ovvero può essere eseguita in parallelo su un numero variabile di vetrini, ad esempio fino a 30 se viene utilizzato come supporto un cestello standard. Ciò comporta un evidente risparmio di tempo rispetto al procedimento di montaggio convenzionale, che prevede la disposizione di mezzo montante e vetrino coprioggetti un campione alla volta, ovvero in serie.
Sebbene l’operazione di immersione diretta depositi su entrambe le superfici del vetrino stesso uno strato della composizione secondo l’invenzione, non risultano alterazioni delle strutture o aberrazioni dell’immagine in sede di osservazione microscopica. La composizione secondo l’invenzione all’interno del cestello che contiene i vetrini da montare/montati può essere facilmente rimossa con un veloce lavaggio del cestello con un solvente opportuno, ad esempio xilolo o suoi sostituti, o con acetato di etile.
Ancora, la composizione secondo l’invenzione consente all’operatore di montare i vetrini direttamente nel cestello normalmente utilizzato per la colorazione, con un unico semplice gesto (l’immersione del cestello) e senza bisogno di rimuovere e riallocare i vetrini, con un ulteriore risparmio di tempo. A titolo di esempio, nella sezione sperimentale sarà descritto un procedimento manuale per il montaggio di campioni che comprende l’utilizzo della composizione secondo l’invenzione ed un cestello normalmente utilizzato per la colorazione.
Oltre che per le comuni procedure di montaggio manuale, la composizione secondo l’invenzione può essere utilizzata comodamente anche in coloratori automatici convenzionali, normalmente utilizzati nella preparazione di campioni biologici e sicuramente noto all’esperto del ramo. Ciò è molto vantaggioso, in quanti il coloratore automatico non possiede tutte le criticità sopra discusse possedute dal montavetrini automatico, come per esempio una precisa e meticolosa calibrazione dello strumento, e permetterà inoltre di fornire un preciso procedimento di montaggio senza l’ausilio di alcun operatore.
A titolo informativo, un coloratore automatico è uno strumento che comprende diverse vasche contenenti fluidi, in genere soluzioni coloranti, ed un braccio meccanico. Il braccio meccanico è in grado di sollevare, posizionare ed immergere autonomamente il cestello contenente i vetrini da colorare all’interno delle diverse vasche. È possibile programmare il braccio meccanico in modo da stabilire la sequenza di immersione nelle diverse vasche, così come il tempo di immersione in ciascuna vasca.
Nei coloratori automatici convenzionali è sufficiente destinare una delle vasche di suddetto coloratore al contenimento della composizione secondo l’invenzione, preferibilmente riscaldata (cosiddette vasche “oven”), per ricreare le funzionalità di una stufa.
Questa applicazione della composizione secondo l’invenzione offre l’ennesimo risparmio di tempo rispetto alle procedure di montaggio convenzionali, e a titolo di esempio, nella sezione sperimentale, verrà descritto un procedimento di montaggio che comprenderà un coloratore automatico e la composizione secondo l’invenzione, estremamente rapido e preciso rispetto ai metodi di montaggio convenzionali che prevedono un montavetrini automatico.
Sarà evidente che il tempo risparmiato per il procedimento di montaggio grazie alla composizione secondo l’invenzione è di grande entità. Difatti, il procedimento di montaggio convenzionale, che sia manuale od automatico, richiede un tempo proporzionale al numero di vetrini. Un esempio comparativo del procedimento di montaggio convenzionale sarà fornito nella sezione sperimentale.
La composizione secondo l’invenzione permette quindi di eliminare tutta la serie di passaggi di precisione volti all’allestimento di un preparato alla volta, sostituendola con un’unica operazione eseguibile per più vetrini alla volta, esente da imprecisioni e altamente riproducibile.
Un ennesimo vantaggio della composizione secondo l’invenzione risiede nell’efficienza di archiviazione. Difatti, come già detto, i campioni montati per mezzo di mezzi montanti convenzionali, in seguito all’analisi al microscopio, hanno bisogno di almeno un giorno di tempo per poter essere archiviati. Questo tempo di archiviazione viene azzerato con l’utilizzo dell’invenzione: difatti il campione, una volta analizzato, è archiviabile, con un evidente risparmio di tempo e una più facile gestione dell’archivio dei campioni.
L’uso secondo l’invenzione fornisce tutti i vantaggi sopra descritti per la preparazione di campioni per l’analisi al microscopio, nello specifico per il passaggio di montaggio all’interno della preparazione di campioni, tra i quali ad esempio un notevole risparmio di tempo, e la processazione in modo preciso e riproducibile di campioni biologici. L’invenzione ha altresì per oggetto un metodo per la preparazione di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici per l’osservazione al microscopio che comprende montare il campione che si trova sul vetrino portaoggetti con la composizione dell’invenzione, come qui descritto.
L’invenzione ha infine per oggetto i campioni biologici, citologici, istologici e autoptici montati con la composizione dell’invenzione.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Le Figure 1 e 2 rappresentano la composizione secondo l’invenzione dopo asciugatura, alla fine del procedimento di montaggio.
La Figura 3 dimostra l’ultratrasparenza della composizione secondo l’invenzione.
La Figura 4 mostra un’immagine al microscopio che rappresenta un campione biologico montato con la composizione secondo l’invenzione.
SEZIONE SPERIMENTALE
Esempio 1
Procedimento di preparazione di una forma di realizzazione della composizione secondo l’invenzione
Un recipiente opaco viene riempito con 800 ml di butilacetato. Si aggiungono 1,05 grammi di n-ottadecil-3-(3',5'-di-t-butil-4'-idrossilfenil)propionato (agente antiossidante) e si lascia in agitazione fino a completo scioglimento, ovvero circa 2 minuti. A questo punto, si aggiungono 200 grammi di polimetilmetacrilato e si lascia in agitazione per circa 2 ore a temperatura ambiente fino ad ottenimento di una miscela limpida omogenea. Si aggiungono quindi 10,45 g/ml di γ-metacrilossipropiltrimetossisilano (“bond enhancer”) e 10 grammi di adipato di 2-etilesile (plastificante).
Il procedimento è interamente eseguito a temperatura ambiente, l’agitazione meccanica viene fermata solo ad ottenimento di una miscela limpida omogenea (20 minuti circa). La formulazione finale appare quindi viscosa e priva di particolato.
Esempio 2
Procedimento di preparazione di una forma di realizzazione della composizione secondo l’invenzione
Per la produzione di 1 litro di soluzione, un recipiente opaco viene riempito con 700 ml di xilene. Si aggiungono 1,7 grammi di butilidrossitoluene (BHT, agente antiossidante) e si lascia in agitazione fino all’ottenimento di una miscela limpida omogenea, ovvero circa 2 minuti. A questo punto, si aggiungono 300 grammi di polietilmetacrilato e si lascia in agitazione per circa 2 ore fino all’ottenimento di una miscela limpida omogenea a temperatura ambiente. Si aggiungono quindi, sempre a temperatura ambiente, 2 grammi di paraffina liquida (agente antigraffio) e 2,1 grammi di 2-(5-ter-butil-2-idrossifenil)benzotriazolo (“UV absorber”). Dopo circa 30 minuti sotto agitazione, si ottiene una miscela limpida omogenea. La formulazione finale appare così viscosa e priva di particolato.
Esempio 3
Procedimento di preparazione di una forma di realizzazione della composizione secondo l’invenzione
Per la produzione di 1 litro di soluzione, un recipiente opaco viene riempito con 600 ml di xilene. Si aggiungono 2 grammi di n-ottadecil-3-(3',5'-di-t-butil-4'-idrossilfenil)propionato (agente antiossidante) e si lascia in agitazione fino all’ottenimento di una miscela limpida omogenea, ovvero circa 2 minuti. A questo punto, si aggiungono 400 grammi di polibutilmetacrilato e si lascia in agitazione per circa 2 ore a temperatura ambiente fino all’ottenimento di una miscela limpida omogenea. Si aggiungono quindi, sempre a temperatura ambiente 15 grammi di dibutilftalato (plastificante). Dopo circa 30 minuti sotto agitazione si ottiene una miscela limpida omogenea, la quale appare viscosa e priva di particolato.
Esempio 4
Procedimento di preparazione di una forma di realizzazione della composizione secondo l’invenzione
Un recipiente opaco viene riempito con 1000 ml di xilene e con 250 ml di Diamount<®>. Si aggiungono 400 grammi di polibutilmetacrilato e si lascia in agitazione per circa 2 ore a temperatura ambiente fino all’ottenimento di una miscela limpida, omogenea, viscosa e priva di particolato.
Esempio 5
Procedimento di preparazione di una forma di realizzazione della composizione secondo l’invenzione
Un recipiente opaco viene riempito con 800 ml di xilene e con 240 ml di Micromount<®>. Si aggiungono 250 grammi di polietilmetacrilato e si lascia in agitazione per circa 2 ore a temperatura ambiente fino all’ottenimento di una miscela limpida, omogenea, viscosa e priva di particolato.
Esempio 6
Procedimento di preparazione di una forma di realizzazione della composizione secondo l’invenzione
Un recipiente opaco viene riempito con 800 ml di xilene e con 100 ml di OpticMount<®>. Si aggiungono 200 grammi di polietilacrilato e si lascia in agitazione per circa 2 ore a temperatura ambiente fino all’ottenimento di una miscela limpida, omogenea, viscosa e priva di particolato.
Esempio 7
Procedimento di montaggio
Esempio 7.1 (Comparativo)
Procedimento di montaggio convenzionale manuale
Alla fine del normale procedimento di colorazione manuale, terminante con lavaggio in alcol, ciascuno di 30 vetrini portaoggetti è stato sottoposto ai seguenti passaggi: (i) posizionamento orizzontale del vetrino portaoggetti sul piano di lavoro; (ii) dispensazione della giusta quantità di mezzo montante sul vetrino portaoggetti (circa 2 gocce); (iii) apposizione del vetrino coprioggetti; e (iv) aggiustamento del vetrino coprioggetti. Tempo totale necessario per montare ciascun vetrino: circa 15 secondi; moltiplicato per ciascun vetrino: circa 450 secondi (ovvero, circa 7 minuti e mezzo)
Al tempo totale utilizzato per il montaggio convenzionale di tutti i vetrini, c’è da sommarvi il tempo di asciugatura del mezzo montante, il quale impiega almeno 5 minuti per asciugare in modo accettabile, per un tempo totale di montaggio di circa 12 minuti e 30 secondi.
Come è evidente dall’esempio appena descritto, le quattro operazioni sopra riportate necessarie per il montaggio convenzionale, oltre ad impiegare un’elevata quantità di tempo, non sono affatto esenti da errori od imprecisioni. Per questo motivo, il tempo totale dell’operazione sopra descritta è ulteriormente dilatato qualora: (a) il mezzo montante sia messo in eccesso sul vetrino portaoggetti e fosse necessario rimuovere tale eccesso; e (b) il mezzo montante dovesse fuoriuscire dal vetrino portaoggetti e fosse necessario attendere la completa e totale asciugatura dello stesso per una gestione pratica del flusso di lavoro.
Infine, c’è bisogno di attendere almeno un giorno dopo l’operazione di montaggio per l’efficace archiviazione dei vetrini così montati, in quanto bisogna attendere che questi si asciughino completamente.
Esempio 7.2
Procedimento manuale di montaggio utilizzando la composizione secondo l’invenzione A seguito del normale procedimento di colorazione manuale, terminante con lavaggio in xilolo (o solventi analoghi), un cestello contenente 30 vetrini portaoggetti è immerso manualmente in una vasca contenente la composizione secondo l’invenzione per circa 3 secondi, dopodiché è rimosso l’eccesso di composizione secondo l’invenzione tramite la disposizione manuale del cestello in una vasca vuota (o, in alternativa, sul piano di lavoro) per circa 35 secondi. Infine, i 30 vetrini montati sono lasciati per circa 8 minuti sotto una cappa aspirante, per un tempo totale di montaggio di 30 vetrini di circa 8 minuti e 38 secondi.
Un vetrino così montato è rappresentato nelle Figure 1 e 2.
In alternativa, i 30 vetrini montati possono essere posti in stufa a 65°C per circa 5 minuti, fornendo così un processo di montaggio avente un tempo totale di circa 5 minuti e 38 secondi.
Esempio 7.3
Procedimento di montaggio automatizzato utilizzando la composizione secondo l’invenzione
A seguito del normale procedimento di colorazione tramite coloratore automatico, terminante con lavaggio in xilolo, 30 vetrini portaoggetti (appena colorati) sono prelevati dal braccio automatico ed immersi per 20 secondi in una vasca, sempre del coloratore automatico, contenente la composizione secondo l’invenzione. Successivamente, il braccio automatico del coloratore automatico trasferisce i vetrini in una vasca vuota, al fine di eliminare l’eccesso della composizione secondo l’invenzione, per un tempo di permanenza di 35 secondi. Infine i vetrini vengono posti tramite il braccio automatico in una vasca vuota, nella quale permangono per 5 minuti per la completa asciugatura della composizione secondo l’invenzione. Il cestello con i vetrini così montati viene spostato nello scomparto dei vetrini in uscita. Il procedimento di montaggio dei vetrini così esemplificato inizia immediatamente dopo la colorazione e termina in circa 5 minuti e 55 secondi, senza impegnare in alcun modo l’operatore.
Dopo l’immersione nella composizione secondo l’invenzione e successivo sgocciolamento, il cestello potrà essere trasferito manualmente in stufa o, alternativamente, fatto asciugare a temperatura ambiente.
È evidente che i procedimenti di montaggio che prevedono l’uso della composizione secondo l’invenzione, ovvero gli Esempi 7.2 e 7.3, forniscono un importante risparmio di tempo rispetto al tempo necessario per il montaggio convenzionale, come descritto nell’Esempio 7.1, riducendo il tempo totale di preparazione dei campioni biologici e ottimizzando il flusso operativo.
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Composizione per il montaggio di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici che comprende: a) almeno un componente liquido scelto tra xilene, etilacetato, butilacetato, solventi a base di isoparaffme e le loro miscele; e b) uno o più polimeri scelti tra polimetilmetacrilato, polietilmetacrilato, polibutilmetacrilato, polimetilacrilato e polietilacrilato, al 15%-80% ([g di polimero/100 mi di componente liquido]).
- 2. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che detti uno o più polimeri (b) sono presenti in ragione del 10-50%.
- 3. Composizione secondo la rivendicazione 2, caratterizzata dal fatto che detti uno o più polimeri (b) sono presenti in ragione del 20-40%.
- 4. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzata dal fatto che almeno uno di detti uno o più polimeri (b) è il polimetilmetacrilato.
- 5. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzata dal fatto che comprende anche un agente antiossidante.
- 6. Uso della composizione secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, per la preparazione di campioni biologici per la loro osservazione al microscopio.
- 7. Uso della composizione secondo la rivendicazione 6, per il montaggio di campioni biologici per la loro osservazione al microscopio
- 8. Metodo per la preparazione di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici per l’osservazione al microscopio che comprende montare un campione che si trova su un vetrino portaoggetti con la composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5.
- 9. Campioni biologici, citologici, istologici o autoptici montati con la composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5.
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1201777A (en) * | 1966-10-27 | 1970-08-12 | Brunswick Corp | Purification of polymers produced by peroxide-catalysed reactions |
| GB2155943A (en) * | 1984-03-20 | 1985-10-02 | Erba Farmitalia | Composition for mounting microscope slide specimens |
| WO2002012857A1 (en) * | 2000-08-07 | 2002-02-14 | 3M Innovative Properties Company | Microscope cover slip materials |
| US20070166197A1 (en) * | 2004-03-04 | 2007-07-19 | Guenter Hauke | Means for covering microscopic specimens |
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|---|---|---|---|---|
| US4188246A (en) * | 1977-06-23 | 1980-02-12 | Julius Lipshaw | Microscope slide and method for making same |
| JP2533576B2 (ja) * | 1987-10-20 | 1996-09-11 | 関西ペイント株式会社 | 熱感応性樹脂組成物 |
| US7491233B1 (en) * | 2002-07-19 | 2009-02-17 | Advanced Cardiovascular Systems Inc. | Purified polymers for coatings of implantable medical devices |
| JP2005352422A (ja) * | 2004-06-14 | 2005-12-22 | Sekisui Chem Co Ltd | 屈折率分布型光学材料の製造方法 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1201777A (en) * | 1966-10-27 | 1970-08-12 | Brunswick Corp | Purification of polymers produced by peroxide-catalysed reactions |
| GB2155943A (en) * | 1984-03-20 | 1985-10-02 | Erba Farmitalia | Composition for mounting microscope slide specimens |
| WO2002012857A1 (en) * | 2000-08-07 | 2002-02-14 | 3M Innovative Properties Company | Microscope cover slip materials |
| US20070166197A1 (en) * | 2004-03-04 | 2007-07-19 | Guenter Hauke | Means for covering microscopic specimens |
| WO2011031578A1 (en) * | 2009-09-08 | 2011-03-17 | Creative Nail Design, Inc. | Removable color gel basecoat for artificial nail coatings and methods therefore |
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