A találmány oltóanyag-kompozíciókkal foglalkozik. Közelebbről a találmány olyan vakcinákra vonatkozik, amelyek legalább egy olyan antigént tartalmaznak, amely a b típusú Haemophilus influenzáé kapszuláris poliszacharidját képező nagy molekulatömegű poliribozilribitol-foszfát, tetanusz-anatoxinhoz kapcsolva.
A technika állásából és különösen Rachel Schneerson és munkatársai „Quantitative and Qualitative Analyses of Serum Antibodies Elicited in Adults by Haemophilus influenzáé Type b and Pneumococcus Type 6A Capsular Polysacharide Tetanus Toxoid Conjugates” című cikkéből (Infect. Immun. May 1986) ismert egy antigén, amely felhasználható emberben vakcinálási célokra, hogy megvédje az embert a b típusú Haemophilus influenzáé által okozott fertőzésektől. Ez az antigén a poliribozil-ribitol-foszfát (vagy PRP), melyet a baktérium kapszuláris poliszacharidja képez, és amelyet T-sejtekhez kötöttek egy hordozófehérjéhez, a tetanusz-anatoxinhoz való kapcsolással. Rhesus majomkölykökön végzett kísérletek azt mutatták, amint ebben a cikkben közlik, hogy egyazon állatnál korábbi és ugyanabban az időben nagyobb immunválaszt kaptak, ha az antigént alumínium-hidroxiddal kapcsolták össze. Egy másik cikkben azonban, melynek címe „Clinical and Immunologic responses to the capsular polysacharide of Haemophylus influenzáé type b alone or conjugated to tetanus toxoid in 18-23 month-old children” (The Journal of Pediatrics, May 1988), Bo A. Claesson és munkatársai kimutatták, hogy ez az antigén - alumínium-hidroxidhoz adszorbeálva - tárolás után kevésbé immunogén, mint az az antigén, melyet fiziológiás sóoldatban tartottak, ami a poliszacharid lebomlásának tulajdonítható.
Abból a célból, hogy a PRP-T stabilitásának ezt a problémáját megoldják, korábban a liofilizálást javasolták. Ez a megoldás, még ha lehetővé teszi is, hogy az antigén immunogén jellegét megtartsa az idő folyamán, néhány hátránnyal rendelkezik, különösen az előállítás hozamát tekintve; a liofilizálás és a kondicionálás szükséges egyedi műveletei komplikálják az előállítási eljárást, és megnövelik a költségeket. Ráadásul a beadás időpontjában a liofilizátumot ismét fel kell oldani, ami azt jelenti, hogy biztosítani kell a liofilizátumon kívül egy folyadékot ezen liofilizátum felvételéhez; ez a művelet egy további korlátozást jelent a felhasználónak, és - mint bármely manipuláció - a helytelen kivitelezés rizikóját is magában hordozza.
Emellett a folyékony oltóanyag-kompozíciók egy része egy alumíniumalapú adjuvánson adszorbeálva tartalmazza az antigént, és előnyös lehetne, hogy ezekhez adjuk hozzá a PRP-T által formált antigént immunogenitási veszteség nélkül. Valóban, a technika állásában már javasoltak egy olyan oldatot, mely egy speciális kétkamrás injekciós tűben található (az első kamra tartalmazza a PRP-T-t liofilizált formában és a második kamra az egyéb antigéneket vizes szuszpenzióban), melynek tartalma csak a beadáskor keveredik össze, e készítmény azonban nem volt megfelelő sem a termelési költségeket tekintve, sem a felhasználó által kivitelezendő műveleteket tekintve.
Ezért továbbra is fennáll az igény, hogy olyan oltóanyag-kompozíciót állítsunk elő, amely tartalmazza a rendkívül jó immunogén tulajdonságokkal rendelkező PRP-T antigént, melyek megőrződnek a tárolás folyamán, és melynek gyártási körülményei lehetővé teszik a legalacsonyabb költséggel történő előállítást.
Ezen céloknak az elérésére a találmány egy olyan oltóanyag-kompozícióra vonatkozik, amely legalább egy olyan antigént tartalmaz, amely a b típusú Haemophilus influenzáé kapszuláris poliszacharidját képező nagy molekulatömegű poliribozil-ribitol-foszfát, tetanusz-anatoxinhoz kapcsolva, valamint tartalmaz egy alumíniumalapú adjuvánst, melyre az jellemző, hogy az alumíniumalapú adjuváns zérustöltéspontja kisebb mint megközelítőleg 7,2.
Meglepő módon azt találtuk, hogy ilyen körülmények között a PRP-T hosszú időn keresztül megtartja folyékony közegben kiváló immunogén jellegét.
A találmány egyik előnyös kiviteli módja szerint az alumíniumalapú adjuváns alumínium-hidroxidokat tartalmaz, amelyekhez anionokat adtunk.
így lehető válik, hogy egy kimondottan vakcinákhoz előnyös adjuvánst alkalmazzunk, miközben a PRP-Tben folyékony közegben megmarad a nagyon jó immunogenitás.
A találmány egy másik kiviteli alakja szerint az anionokat a foszfátok vagy citrátok közül választjuk ki.
Ezáltal a kapott kompozíció az összes biztonsági garanciákkal rendelkezik, melyek egy oltóanyag beadásához szükségesek.
A találmány egyik különösen előnyös kiviteli módja szerint az oltóanyag-kompozíció mindezek mellett egy vagy több vakcinavalenciát (antigénkomponens) tartalmaz, melyeket a következőkből választunk ki: diftéria, tetanusz, szamárköhögés, hepatitis B és poliomyelitis.
így lehetővé vált, hogy egy olyan folyékony, stabil oltóanyag-kompozíciót nyerjünk, amelyben minden egyes antigén megtartja immunogenitását, ami lehetővé teszi a felhasználó számára - többletmanipuláció nélkül - a vakcinálást egyidejűleg több betegség ellen; ezzel csökkenthetjük a költségeket, kezdve a termékektől egészen az elvégzendő vizitek számát illetően.
A találmány továbbá oltóanyag-kompozíció előállítására szolgáló eljárásra is vonatkozik, amely oltóanyag legalább egy olyan antigént tartalmaz, amely a b típusú Haemophilus influenzáé kapszuláris poliszacharidját képező nagy molekulatömegű poliribozil-ribitolfoszfát, tetanusz-anatoxinhoz kapcsolva, az eljárás abban áll, hogy egy adjuvánst adunk az oltóanyagkompozícióhoz alumínium-hidroxidok szuszpenziójának formájában, melynek zérustöltéspontja kisebb mint megközelítőleg 7,2.
A jobb megértése céljából az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.
A b típusú Haemophilus influenzáé kapszuláris poliszacharidja által képzett antigén egy lineáris, ribózból, ribitolból és foszforsavból álló polimer, mely (I) képletű monomer szerkezettel rendelkezik.
HU 223 941 Β1
Nagyszámú ilyen típusú monomer (több mint 100) alkot egy poliszacharidot, melynek molekulatömege 500 000-1 000 000 (dalton) tartományba esik.
Abból a célból, hogy kisgyerekekben a T-sejtek immunválaszát indukáljuk, ezt az antigént egy hordozófehérjéhez, a tetanusz-anatoxinhoz konjugáljuk.
Ilyen antigének lehetnek például azok, melyeket Schneerson és munkatársai „Quantitative and Qualitative analysis of serum antibodies elicited in adults by Haemophilus influenzáé type b and Pneumococcus type 6A capsular polysacharidetetanus toxoid conjugates” című cikkében leírt eljárással kapunk [Infect. Immun. 52,519(1986)].
Az antigén megfelelő tulajdonságai: a poliszacharidot alkotó monomerek igen nagy száma, a hordozófehérje természete, a poliszacharid és a hordozófehérje közötti kapcsolódás milyensége előnyös adottságokat, különösen kiváló immunogenitást biztosít.
Ahhoz, hogy ezek a kvalitások folyékony közegben a tárolás során megmaradjanak, azt találtuk, hogy felhasználhatunk olyan alumíniumkomplexeket, melyek zérustöltéspontja kisebb mint megközelítőleg 7,2. Valóban, meglepő módon azt találtuk, hogy amikor a PRP-T-t ilyen alumíniumkomplexekkel kapcsoltuk össze, kiváló immunogenitási tulajdonsága megmarad a tárolás folyamán folyékony közegben, bármilyen is az immobilizáció foka az alumíniumkomplexeken.
Az alumíniumkomplexek zérustöltésének pontja azonos a fehérjék izoelektromos pontjával; az a pH, amelyen az alumíniumkomplex felületén a töltés zérus. Ténylegesen, ez a zérustöltéspont megközelíthető a zéta-potenciál mérésével, amelyet különböző technikák szerint kivitelezhetünk, az alapeljárás az elektroforézis. A méréseket egy készülék segítségével, mint például DELSA 440 (gyártó: Coulter Electronics, Hialeah, FI, USA), kivitelezhetjük.
A mérési módszerek és készülékek különfélék lehetnek, és a kapott eredmények hasonlóképpen változóak. A találmány céljaira alkalmasak azok az alumíniumkomplexek, melyek zérustöltéspontja kisebb mint körülbelül 7,2, ez a 7,2-es érték csak egy megközelítő érték.
A találmány céljaira alkalmasak azok az alumíniumkomplexek, melyeknek természetükből adódóan zérustöltéspontjuk kisebb mint 7,2, vagy pedig azok, melyeket átalakíthatunk azzal a céllal, hogy leszállítsuk a zérustöltéspontjukat.
Az alumíniumkomplexek között, melyek zérustöltéspontja természetük szerint alacsonyabb mint 7,2, megemlíthetjük azokat az alumínium-foszfátokat, melyek szokásosan ismertek a vakcinaadjuvánsok területén, sőt ha kémiai szempontból nézzük, vannak sóik, melyek az alumínium-foszfátoktól eltérőek. Ezek közé tartozik például az ADJUFOS® alumínium-foszfát (gyártja SUPERFOS BIOSECTOR a/s).
Alumíniumkomplexekhez hasonló terméket nyertünk, amikor nátrium-karbonátot PBS-pufferben káliumés alumínium-szulfáttal reagáltattunk.
Ilyen komplexekkel, ahol a PRP-T akár teljesen, akár részlegesen kötődik az alumíniumkomplexekhez, megőrizhető az immunogenitás az idő folyamán.
Alternatív megoldásként a találmány szerint az is lehetséges, hogy olyan alumíniumkomplexeket alkalmazzunk, melyek zérustöltéspontja természetük szerint magasabb mint 7,2, és amelyek módosíthatók ennek a töltéspontnak a csökkentésével.
Előnyös alumíniumkomplexek azok, melyek a vakcinaadjuvánsok területén mint alumíníum-hidroxidok ismertek, sőt, ha kémiai szempontból vizsgáljuk őket, nem kizárólag alumínium-hidroxidból képződnek. Ezek közé tartozik előnyösen az ALHYDROGEL® alumíniumhidroxid (gyártja a SUPERFOS BIOSECTOR a/s), az a termék, melyet adjuvánsként alkalmaznak a D. T. Coq™ márkanevű vakcinában (PASTEUR MERIEUX S & V), még előnyösebb a Recombivax® (Merck) vakcinában adjuvánsként használt termék.
A találmány szerint ezeknek az alumíniumkomplexeknek a módosítása abból áll, hogy anionokat adunk hozzájuk. A hozzáadott anionok különböző természetűek lehetnek, azzal a feltétellel, hogy mindegyiküknek rendelkezni kell a biztonsági garanciákkal, melyek a vakcinálási célokra való alkalmazásnál szükségesek. Megállapítottuk, hogy a citrátionoknak vagy a foszfátionoknak a hozzáadása különösen jól megfelel a találmány céljainak. A foszfátionokat célszerűen egy olyan oldattal adhatjuk hozzá, amely kálium-dihidrogén-foszfátot, dinátriumhidrogén-foszfátot és nátrium-kloridot tartalmaz.
Hasonlóképpen lehetséges az is, hogy a különböző anionok kombinációját alkalmazzuk, például a foszfátionok és a karbonátionok kombinációját.
Továbbá úgy is eljárhatunk, hogy mielőtt az anionokat hozzáadjuk az alumíniumkomplexek szuszpenziójához, hozzáadjuk a PRP-T-hez, vagy a PRP-T-hez hozzáadandó anionokat előzőleg érintkezésbe hozzuk az alumíniumkomplexekkel. Az is előnyös lehet, hogy a PRPT-t a kiválasztott anionokat tartalmazó oldatban szuszpendáljuk, mielőtt azokat az adjuvánssal érintkeztetjük.
A hozzáadandó anionok mennyiségét úgy kalkuláljuk, hogy az az alkalmazott alumíniumkomplexek zérustöltéspontját megközelítőleg 7,2-nél kisebb értékre csökkentse. Ez a mennyiség tehát változik a felhasznált alumíniumkomplexek természetének, valamint azon anionok mennyiségének függvényeként, melyek az alkalmazott pufferanyagok által lehetőség szerint hozzájárulnak a töltéshez. Ennek meghatározása a területen járatos szakember számára ismert.
Az így kapott oltóanyag-kompozíció folyékony állapotban stabil, azaz azt mondhatjuk, hogy ebben a PRP-T megtartja jó immunogén tulajdonságát.
Továbbmenően azt is megállapítottuk, hogy az anionok hozzáadásának következtében a PRP-T immobilizációja az alumíniumkomplexeken csökken, ami hozzájárulhat sértetlenségének és ezáltal immunogenitásának fenntartásához.
Bár az nem előnyös a találmány értelmében, de hasonlóképpen lehetséges, hogy az anionokat olyan alumíniumkomplexekhez adjuk hozzá, melyek zérustöltéspontja természetükből eredően kisebb mint megközelítőleg 7,2. Ebben az esetben megállapítottuk, hogy a zérustöltéspont csökkenthető, és hogy a PRP-T immobilizációja az alumíniumkomplexeken hasonlóképpen csökken.
HU 223 941 Β1
Az immobilizáció kifejezésen a kapcsolódás bármely formáját értjük, amely a PRP-T-t hozzáférhetetlenné teszi az adagolásra, amikor centrifugálás után a felülúszót összegyűjtjük.
A találmány szerinti oltóanyag-kompozíció tartalmazza a PRP-T által képzett vakcinaantigént, de tartalmazhat más vakcinaantigéneket is, és különösen azokat, melyek védelmet váltanak ki a diftéria, tetanusz, szamárköhögés (celluláris vagy acelluláris) poliomyelitis, hepatitis A, hepatitis B stb. ellen. Tulajdonképpen bármely vakcinaantigén, amely kompatibilis a PRP-Tvel és az alumíniumkomplexekkel, alkalmazható a találmány szerinti oltóanyag-kompozícióban. Ezáltal olyan folyékony oltóanyag-kombinációkat nyerhetünk, amelyek lehetővé teszik, hogy egyetlen beadással vakcinázzunk több betegséggel szemben. A találmány szerinti oltóanyag-kompozíciókat különösen kisgyermekeknek történő beadáshoz adaptáltuk.
Emellett megfigyeltük, hogy egy ilyen folyékony oltóanyag-kompozíció használata az emlékeztető oltás során 12 hónapos csecsemőknél, akik 2, 4 és 6 hónapos korukban kaptak injekciót, megnöveli az antiPRP-T antitestek termelődését, különösen megemelkedett módon összehasonlítva azokkal, akiknél az emlékeztető oltást ugyanilyen körülmények között PASTEUR MERIEUX Sérums et Vaccins által védjegyzett TETRAct-HIB™ vakcinával végeztük.
1. példa
Oltóanyag-kompozíciót állítottunk elő az alábbi komponensekből kiindulva:
Tisztított tetanusz-anatoxin (PTA) 1 vakcinálóegység
Tisztított diftéria-anatoxin (PDA) 1 vakcinálóegység
Pertussissejtelegy 15 OU (opacimetrikus egység)
Mertiolát 43,75 pg
Alumínium-hidroxid (Al-ban kifejezve), ahogy az jelen van a D. T. Coq™-ben 0,3 mg
Foszfátok 30 pmol mmol-os tris-puffer, amely 8,5% szacharózt tartalmaz 0,125 ml
Injekcióhoz alkalmas víz (qsp) 0,5 ml
A foszfátionokat oldat formájában adtuk hozzá, amely kálium-dihidrogén-foszfátot, dinátrium-hidrogénfoszfátot és nátrium-kloridot tartalmazott.
2. példa
Az 1. példa szerint előállított oltóanyag-kompozíció immunogenitását kisgyerekeken teszteltük, összehasonlítva egy korábbi típusú vakcina immunogenitásával, melynek védjegyzett neve TETRAct-HIB™, és amely ugyanazokkal a vakcinavalenciákkal (antigénkomponensek) rendelkezett, azonban a liofilizált PRP-T valenciát közvetlenül az injekciózás előtt rekonstituáltuk a diftéria- és tetanusz-anatoxint, valamint a pertussissejtes keveréket tartalmazó oltóanyag-kompozícióval.
Ezt a tesztet 262 csecsemőn végeztük, akik közül 130 az 1. példa szerinti oltóanyagot, 132 pedig a kereskedelmi forgalomban lévő TETRAct-HIB™-t kapta. A vakcinák beadása a 2., 6. és 12. hónapban intramuszkulárisan történt.
Immunizálás előtt az anti-PRP antitest GMT-titere 0,2 pg/ml volt mindkét csoportban; a második injekció után 1,9 és 1,4 pg, míg a harmadik injekció után 5,9, illetve 5,8 pg-ot mértünk a találmány szerinti, illetve a technika állása szerinti vakcinára.
A második injekció után a csecsemők 98%-a (a találmány szerinti oltóanyaggal immunizálva) és 93%-a (a technika állása szerinti oltóanyaggal beoltva) 0,15 pg/ml-nél magasabb anti-PRP antitesttiterrel rendelkezett; ez a szint a harmadik injekció után azon csecsemők 100%-ában mérhető volt, akik a találmány szerinti oltóanyagot kapták, és azoknak a csecsemőknek 99%ában, akik a technika állása szerinti oltóanyagot kapták.
A harmadik injekció után az egyes oltóanyagkomponensek ellen irányuló antitestek átlagos mennyiségét az alábbi 1. táblázatban adjuk meg.
1. táblázat
|
Technika állása szerinti oltóanyag |
Találmány szerinti oltóanyag |
Diftéria (Ul/ml) |
1,35 |
1,56 |
Tetanusz (Ul/ml) |
5,1 |
4,9 |
Pertussis agglutin. titer GMT |
597 |
601 |
PRP (pg/ml) |
5,8 |
5,9 |
A 12. hónapban beadott emlékeztető injekció (booster) után a 2. táblázatban megadott antitestmennyiségeket mértük.
2. táblázat
|
Technika állása szerinti oltóanyag |
-1
Találmány szerinti oltóanyag |
Diftéria (Ul/ml) |
3,2 |
4,5 |
Tetanusz (Ul/ml) |
12,0 |
11,5 |
Pertussis agglutin. titer GMT |
2447 |
2560 |
PRP (pg/ml) |
19,4 |
32,6 |
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerint előállított oltóanyag-kombináció stabil; valójában azt az emlékeztető injekciót, melyet a 12 hónapos gyerekeknek adtunk be, 18 hónappal korábban állítottuk elő; mindemellett az eredmények azt mutatják, hogy a kombináció egyes antigénjeinek immunogenitása megmarad. Ráadásul - meglepő módon - azt találtuk, hogy a találmány szerinti oltóanyag-kompozíció emlékeztető injekciójának hatása nyilvánvalóan nagyobb, mint annak a boosternek a hatása, amelyet a technika állása szerinti, ugyanazokat a vakcinavalenciákat tartalmazó oltóanyaggal kaptunk.
3. példa
Az 1. példában leírt oltóanyag-kompozíció dózisait +4 °C-on tartottuk 18-24 hónapig, és ezután alkalmaztuk klinikai vizsgálatokban 104 gyereknél.
Az egyes oltóanyag-valenciákra kapott titereket a 3. táblázatban foglaltuk össze.
HU 223 941 Β1
3. táblázat
|
Vakcinálás
előtt |
Vakcinálás
után |
Diftéria GMT |
0,013 |
0,736 |
Tetanusz GMT |
0,181 |
3,831 |
PRP GMT (pg/ml) |
0,22 |
6,40 |
A táblázatból látható, hogy a találmány szerinti oltóanyag-kompozíció +4 °C-on történő hosszú ideig tartó tárolás után is megtartja immunogén tulajdonságát mind a PRP-T-t, mind a többi vakcinaantigént tekintve.
4. példa
Oltóanyag-kompozíciókat állítottunk elő, melyek mindegyike a PRP-T-t 20 pg PRP/ml koncentrációban tartalmazta különböző típusú és különböző zérustöltésponttal (point of zero charge=PZC) rendelkező alumíniumkomplexek jelenlétében. Az alumíniumkomplexek mennyiségét úgy választottuk meg, hogy az alumínium koncentrációja a kompozícióban 0,6 g/l legyen.
1. kompozíció: olyan alumíniumkomplexet készítettünk alumínium-hidroxiddal, mint amilyent a D. T. Coq™ vakcinában használnak (gyártó: PMsv). PZC=11,3
2. kompozíció: olyan alumíniumkomplexet készítettünk alumínium-hidroxiddal, mint amilyent a Recombivax® vakcinában használnak (gyártó: Merck). PZC=7,4
3. kompozíció: aluminiumkomplexet készítettünk alumínium-foszfáttal, melyet nátrium-klorid és trinátrium-foszfát összekeverésével kaptunk. PZC=6,2
4. kompozíció: alumíniumkomplexet állítottunk elő Alumnak nevezett termékből, melyet PBS-pufferben nátrium-karbonát és kálium-, valamint alumíniumszulfát reakciójával nyertünk. PZC=5,4
Az oltóanyag-kompozíciókat az alumíniumkomplexeket és PRP-T-t tartalmazó szuszpenziók egyszerű összekeverésével nyertük.
5. példa
Az így kapott különböző oltóanyag-kompozíciók immunogenitását egereken teszteltük.
Az immunogén stabilitásának értékelése céljából a kapott kompozíciókat öregedést gyorsító körülmények közé helyeztük, azaz 2 héten keresztül 37 °C-on tartottuk.
Az immunogenitás vizsgálatát 22-24 g-os egereken végeztük, amelyeknek szubkután 0,5 ml-es dózisokat adtunk be, melyek egyenként 2,5 pg PRP-t tartalmaztak. A beadás a nulladik és a 14. napon történt. Az egerekből a 14. és 21. napon vért vettünk, és az antitestszinteket radioimmunológiai módszerrel meghatároztuk. Az egyes vakcinakompozíciókkal kezelt egerek száma 8 volt.
A kapott eredményt akkor tekintettük kielégítőnek, ha:
- legalább az egerek 75%-ában a 21. napon a titer >0,5;
-szignifikáns különbség volt a 14. és 21. napon kapott eredmények között.
Akkor tekintettük a kapott oltóanyag-kompozíciót stabilnak, ha a gyorsított öregedés után kapott eredmények kielégítőek.
A vizsgált kompozíciókra kapott eredményeket a 4. táblázatban foglaltuk össze.
4. táblázat
|
PZC |
Immuno, teszt |
1. kompozíció |
11,3 |
Nem kielégítő |
2. kompozíció |
7,4 |
Nem kielégítő |
3. kompozíció |
6,2 |
Kielégítő |
4. kompozíció |
5,4 |
Kielégítő |
A táblázatból látható, hogy amikor az alumíniumkomplexek zérustöltéspontja (PZC) a savas tartományban van, az oltóanyag-kompozíció stabil.
6. példa
Az alumíniumkomplexeken immobilizált PRP-T százalékos mennyiségét a 4. példa szerinti minden egyes kompozíciónál kiértékeltük.
Ehhez az egyes kompozíciókat centrifugáltuk; a felülúszót összegyűjtöttük, amelyben a nem immobilizált PRP-T mennyiségét ELISA-val vagy RIA-val mértük.
A PRP-T kezdeti koncentrációja és a felülúszóban meghatározott mennyiség közötti különbség adja az immobilizált PRP-T százalékot.
A kapott eredményeket az alábbiakban adjuk meg:
1. kompozíció: 100%
2. kompozíció: 100%
3. kompozíció: 100%
4. kompozíció: 70%
7. példa
Az 1. kompozíciót foszfátionok hozzáadásával módosítottuk úgy, hogy 50 mmol/l koncentrációt kapjunk. Elvégeztük az immunogenitási tesztet egerekben az oldat gyorsított öregítése után, amely kielégítő eredményhez vezetett.
Az alumíniumkomplexeken immobilizált PRP-T százalékos mennyiségének meghatározása azt mutatta, hogy ilyen körülmények között a PRP-T-nek csak 20%-a immobilizálódott.
8. példa
Az 1. kompozíciót egyidejűleg citrátionok hozzáadásával módosítottuk úgy, hogy 200 mmol/l koncentrációt kapjunk.
Elvégeztük az immunogenitási tesztet egerekben az oldat gyorsított öregítése után, amely kielégítő eredményhez vezetett.
Az alumíniumkomplexeken immobilizált PRP-T százalékos mennyiségének meghatározása azt mutatta, hogy ilyen körülmények között a PRP-T egyáltalán nem immobilizálódott.
9. példa
A 2. kompozíciót foszfátionok hozzáadásával módosítottuk úgy, hogy 20 mmol/l koncentrációt kapjunk.
Elvégeztük az immunogenitási tesztet egerekben az oldat gyorsított öregítése után, amely kielégítő eredményhez vezetett. Az alumíniumkomplexeken immobilizált PRP-T százalékos mennyiségének meghatározá5
HU 223 941 Β1 sa azt mutatta, hogy ilyen körülmények között a PRP-T egyáltalán nem immobilizálódott.
10. példa
A 3. kompozíciót különböző mennyiségű foszfátionok hozzáadásával módosítottuk, és meghatároztuk az alumíniumkomplexeken kötött PRP-T százalékos mennyiségét.
Ha a foszfátionokat olyan mennyiségben adtuk hozzá, hogy koncentrációjuk a kompozícióban 2 mmol/l legyen, az immobilizált PRP-T mennyisége lecsökkent 10%-ra.
Ha a hozzáadott foszfátionok mennyisége a kompozícióban 4 mmol/l koncentrációt eredményezett, a PRP-T egyáltalán nem immobilizálódott.
11. példa
A 4. kompozíciót foszfátionok hozzáadásával módosítottuk úgy, hogy 60 mmol/l koncentrációt kapjunk.
Pertussis-anatoxin |
25 pg |
Pertussis F-HA |
25 pg |
Hbs fehérje (amint az jelen van a |
|
GenHevac B PASTEUR® |
|
vakcinában) |
20 pg |
Polioantigén l-es típusú |
40 U |
ll-es típusú |
8U |
lll-as típusú |
32 U |
Foszfátok |
20 pmol |
Karbonátok |
5 pmol |
50 mmol-os tris-puffer, amely |
|
42,5% szacharózt tartalmaz |
0,125 ml |
Víz injekcióhoz (qsp) |
0,5 ml |
Az ily módon készített oldat stabilitásának kiértékelésére azt 2 héten át 37 °C-on tartottuk, és ezután elvégeztük a PRP-T immunogenitási tesztjét egerekben az 5. példában leírtak szerint.
A kapott eredmények kielégítőek.
A Hbs fehérjére is elvégeztük az immunogenitási
Az alumíniumkomplexeken |
immobilizált PRP-T |
20 |
tesztet; ezt a vizsgálatot egereken végeztük, és ELISA- |
százalékos mennyiségének meghatározása azt mutat- |
|
val meghatároztuk az anti-Hbs |
antitesttitert, majd az |
ta, hogy ilyen körülmények között a PRP-T-nek 30%-a |
|
50%-os hatékony dózist (effective dose), amely kisebb |
immobilizálódott. Elvégeztük az immunogenitási tesz- |
|
lehet mint 0,970 pg Hbs fehérje, amennyiben a tesztet |
tet egerekben az oldat gyorsított öregítése után, amely |
|
is kielégítőnek tekintettük. |
|
kielégítő eredményhez vezetett. |
|
25 |
A fentiek szerint előállított és a tesztelés előtt 2 hé- |
|
|
|
tig 37 °C-on tartott oldatra kapott eredmények kielégí- |
12. példa |
|
|
tőek voltak. |
|
Oltóanyag-kompozíciót állítottunk elő az alábbi |
|
|
|
összetevőkből kiindulva: |
|
|
14. példa |
|
Alumínium-hidroxid |
|
30 |
Oltóanyag-kompozíciót állítottunk elő az alábbi |
(Al-ban kifejezve) |
0,25 mg |
|
összetevőkből kiindulva: |
|
PRP-T (PRP tömegében kifejezve) |
10 pg |
|
Alumínium-hidroxid (Al-ban kifejezve) |
PDA |
1 vakcinálóegység |
|
0, 3 mg |
|
PTA |
1 vakcinálóegység |
|
PRP-T (PRP tömegében kifejezve) 10 pg |
Foszfátok |
15 pmol |
35 |
PDA |
1 vakcinálóegység |
Polioantigén l-es típusú |
40 U |
|
PTA |
1 vakcinálóegység |
ll-es típusú |
8U |
|
Pertussis-anatoxin |
10 pg |
lll-as típusú |
32 U |
|
Pertussis F-HA |
5pg |
Pertussis-anatoxin |
25 pg |
|
Fimbria |
5pg |
Pertussis F-HA |
25 pg |
40 |
Pertactin |
3pg |
50 mmol-os tris-puffer, amely |
|
|
Hbs fehérje (amint az jelen van a |
|
42,5% szacharózt tartalmaz |
0,125 ml |
|
GenHevac B PASTEUR® |
|
Víz injekcióhoz (qsp) |
0,5 ml |
|
vakcinában) |
20 pg |
A PRP-T-hez viszonyított immunogenitási tesztet |
|
Polioantigén l-es típusú |
40 U |
egerekben végeztük az ily módon készített oldattal, va- |
45 |
ll-es típusú |
8U |
lamint egy 1 hónapig 37 °C-on tartott oldattal, egy 2 hó- |
|
lll-as típusú |
32 U |
napig 25 °C-on tartott oldattal és egy 6 hónapig 4 °C-on |
|
Foszfátok |
20 pmol |
tartott oldattal. Minden esetben kielégítő eredményeket |
|
Karbonátok |
10 pmol |
kaptunk, ami azt mutatja, hogy a PRP-T ilyen körűimé- |
|
Magnézium-klorid |
5 pmol |
nyék között stabil. |
|
50 |
50 mmol-os tris-puffer, amely |
|
|
|
|
42,5% szacharózt tartalmaz |
0,125 ml |
13. példa |
|
|
Víz injekcióhoz (qsp) |
0,5 ml |
Oltóanyag-kompozíciót állítottunk elő az alábbi összetevőkből kiindulva:
Alumínium-hidroxid (Al-ban kifejezve)
0, 3 mg
PRP-T (PRP tömegében kifejezve) 10 pg
PDA 1 vakcinálóegység
PTA 1 vakcinálóegység
A PRP-T-re vonatkoztatott immunogenitási tesztet az 5. példában leírtak szerint kiviteleztük, a Hbs fehér55 jére vonatkoztatott tesztet a 13. példában leírtak szerint végeztük, mindegyik kielégítő eredményekhez vezetett, jelezve ezáltal a találmány szerinti oltóanyagkompozíció stabilitását.