HU224426B1

HU224426B1 - Trombin- és Xa-faktor-gátló hatású peptidil-arginin-aldehid-származékok, a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és alkalmazásuk

Info

Publication number: HU224426B1
Application number: HU9601525A
Authority: HU
Inventors: Sándor Bajusz; Dániel Bagdy; Éva Barabás; András Fehér; Gabriella Szabó; Györgyné Széll; Béláné dr. Véghelyi; Attila Juhász; Lászlóné Mohai; Imre Moravcsik; Gáborné Szeker; József Langó; Jánosné Lavich; Ocskay Klára Makkné; István Pallagi; Györgyné Szalkay; Istvánné Taschler
Original assignee: Gyógyszerkutató Intézet Kft.
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2005-09-28
Also published as: HUP9601525A2; HUP9601525A3

Abstract

A találmány tárgyát az (I) általános képletű új peptidil-arginin-aldehid-származékok – Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol Qjelentése Q'–O–CO– képletű acilcsoport, mely képletben Q' jelentése1–3 szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése D-ciklohexil-glicin-vagy D-ciklopentil-glicin-gyök, Pro jelentése L-prolin-gyök és Argjelentése L-arginin-gyök – és ezek szerves vagy szervetlen savvalképzett savaddíciós sói, valamint a fenti vegyületeket tartalmazógyógyszerkészítmények képezik. A találmány szerinti (I) általánosképletű vegyületek értékes gyógyászati, közelebbről véralvadást gátlóhatással rendelkeznek.

Description

(54) Trombin- és Xa-faktor-gátló hatású peptidil-arginin-aldehid-származékok, a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és alkalmazásuk

HU 224 426 Β1 (57) Kivonat

A találmány tárgyát az (I) általános képletű új peptidil-arginin-aldehid-származékok Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol

Q jelentése Q’-O-CO- képletű acilcsoport, mely képletben

Q' jelentése 1-3 szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése D-ciklohexil-glicin- vagy D-ciklopentil-glicin-gyök,

Pro jelentése L-prolin-gyök és

Arg jelentése L-arginin-gyök és ezek szerves vagy szervetlen savval képzett savaddíciós sói, valamint a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények képezik.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek értékes gyógyászati, közelebbről véralvadást gátló hatással rendelkeznek.

A leírás terjedelme 16 oldal

HU 224 426 Β1

Q jelentése Q’-O-CO- képletű acilcsoport, mely képletben

Q’ jelentése 1-3 szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése D-ciklohexil-glicin- vagy D-ciklopentil-glicin-gyök,

Pro jelentése L-prolin-gyök és

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek értékes gyógyászati, közelebbről véralvadást gátló hatással rendelkeznek, amely jelentős vérlemezke-funkciót, valamint trombózisképződést gátló hatással párosul.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek különösen értékes képviselői az alábbiak: etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid, metoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid, etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid, valamint a fenti vegyületek savaddíciós (elsősorban hidrogén-szulfát-) sói.

Definíciók

A leírásban szereplő aminosavak és szubsztituensek, valamint az ezekből felépített peptidek rövidítése megfelel a peptidkémiai irodalomban szokásos jelöléseknek.

Aminosavak: Arg=L-arginin [(2R)-2-amino-5-guanidino-pentánsav], Asp=L-aszparaginsav [(2S)-2-amino3-karboxi-propionsav], boroArg=L-boro-arginin [(1R)-1amino-4-guanidino-butil-bórsav], D-Chg=D-2-ciklohexil-glicin [(2R)-2-amino-ciklohexil-ecetsav], D-Cpg=D-2ciklopentil-glicin [(2R)-2-amino-3-ciklopentil-ecetsavj, Gla=gamma-karboxi-L-glutaminsav [(2S)-2-amino4,4-dikarboxi-vajsav], Glu=L-glutaminsav [(2S)-2-amino-4-karboxi-vajsav], Glp=L-piroglutaminsav [(5S)-2-pirrolidon-5-karbonsav], Gly=glicin (2-amino-ecetsav), D-MePhe=N-metil-3-fenil-D-alanin [(2R)-2-metil-amino-3-fenil-propionsav], D-MePhg=D-N-metil-fenil-glicin [(2R)-2-amino-2-fenil-ecetsav], Nal(1 )=3-(naftil-1 )-L-alanin [(2S)-2-amino-3-(naftil-1)-propionsav], D-Phe=3-fenil-D-alanin [(2R)-2-amino-3-fenil-propionsav], Pro=Lprolin [(2S)-pirrolidin-2-karbonsavj.

Szubsztituensek: Ac=acetil, Boc=ferc-butoxi-karbonil, Bz=benzoil, Eoc=etoxi-karbonil, Et=etil, iPoc=izopropoxi-karbonil, Me=metil, 4MeP=4-metil-pentanoil, Moc=metoxi-karbonil, pNA=p-nitro-fenil-amino, Poc=propoxi-karbonil, Tos=p-toluolszulfonil, Z=benzil-oxi-karbonil.

Peptidek és származékaik: Az aminosavrövidítések önmagukban az L-aminosavat jelölik. A D-aminosavat külön jelöljük, például a 3-fenil-D-alanin-D-Phe. Az aminosavrövidítések előtt és után álló kötőjel azt jelzi, hogy az aminocsoportról egy H-atom, illetve a karboxilcsoportról egy OH-csoport hiányzik. Ennek megfelelően az Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H jelentése etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid, a BzHe-Glu-Gly-Arg-pNA jelentése pedig benzoil-Lizoleucil-L-glutamil-glicil-L-arginin-p-nitro-anilid.

A véralvadás a szervezet védekezőmechanizmusának része. Érfalsérülés hatására indul el a folyamat, véralvadék keletkezik, hogy meggátolja az elvérzést. Emellett az ér betegsége, a vér pangása és az alvadási faktorok kóros aktiválódása is kiválthatja a véralvadást. Ilyenkor az éren belül keletkezik vérrög (trombus), ami azt részben vagy egészen eltörni, trombózis lép fel. A védekezőmechanizmus másik része a fibrinolízis. Az ebben működő enzimek végzik a véralvadék feleslegének eltávolítását, és ezek vesznek részt a trombolízisben, a trombus oldásában is.

A véralvadás folyamata egy katalizált enzimreakció-sorozat, kaszkádreakció, amelyben plazmafehérjék, az úgynevezett alvadási faktorok aktiválódnak egymás után. A faktorokat római számokkal jelölik, az aktív formára a betű utal. Néhány esetében a triviális név (is) használatos: például fibrinogén=l faktor (fi), fibrin=la faktor (fia), protrombin=ll faktor (fii) és trombin=lla faktor (flla). Az alvadás során keletkeznek szerin-proteázok (fXlla, fVlla, fXIa, fIXa, fXa és trombin), néhány gyorsító kofaktor (fVa és fVllla), és maga az alvadó anyag (fibrin). A keletkező proteázok sorában a fXa és a trombin a két utolsó. A fXa hatására képződik a trombin, ami a fibrinogén hasításával kialakítja a fibrinalvadékot.

A véralvadás korábbi mechanizmusa [R. G. MacFarlane: Natúré 202, 498 (1964); E. W. Davie és O. D. Ratnoff: Science 145, 1310 (1964)] szerint a fX aktiválása két úton, az úgynevezett belső vagy külső úton történik. Az előbbi esetben a valamilyen felületen aktiválódott fXII (fXlla) indítja el a folyamatot a fXI->fXla átalakítással, amit a fIX->flXa átalakulás követ; a fX aktiválását a fIXa végzi. A külső úton egy sejtfelszíni receptor, a szöveti faktor (TF, tissue factor) megjelenésével és a [fVIITF], illetve [fVlla-TF] komplex kialakulásával indul a folyamat. A fX aktiválását a [fVlla-TF] komplex végzi.

Az újabb eredmények szerint az élő szervezetben lejátszódó véralvadás a fentiek kombinációja [E. W. Davie és munkatársai: Biochemistry 43, 10 363 (1991)], és a fontosabb lépései az alábbiak.

1. Az érfal sérülése vagy betegsége esetén a TF a felszínre kerül, és megköt valamennyit a vérben lévő VII faktorból. A képződött [fVIITF] komplex egy alkalmas és legalább nyomnyi mennyiségben jelen lévő proteáz (például fXlla, fXa, fIXa és trombin) hatására átalakul az aktív [fVlla-TF] enzimkomplexszé, ami aktiválja a plazmában lévő IX és X faktor kis részét (keletkezik kevés fIXa és fXa), majd inaktiválódik a TFPI [Tissue Factor Pathway Inhibitor, korábbi nevén LACI (Lipoprotein-Associated Coagulation Inhibitor)] hatására, ami a plazmában a fXa és a [fVlla-TF] komplex közös inhibitora [T. J. Girard és munkatársai: Natúré, 338, 518-520 (1989)].

2. A keletkezett fIXa a X faktorral és a fVllla gyorsítómolekulával foszfolipid- (PL) felületen, Ca⁺⁺-ion je2

HU 224 426 Β1 lenlétében létrehozza az úgynevezett „tenase komplexet: [flXafVlllafXPLCa⁺⁺], amiben a fX aktiválódik, keletkezik a fXa.

3. Az eddig keletkezett fXa a protrombinnal (fii) és a fVa gyorsítómolekulával kialakítja a „tenase’’-hoz hasonló felépítésű úgynevezett protrombinázkomplexet: [fXatVafllPLCa⁺⁺j. Ebben megy végbe a protrombin->trombin átalakulás. A fV >fVa és fVIII—>fVllla átalakulást a fXa vagy a trombin tudja elvégezni.

4. A keletkezett kevés trombin átalakítja a fXI egy részét fXIa enzimmé, és aktivál valamennyit a Vili és V faktorból, hogy újabb fVllla, illetve fVa keletkezzen. Most már a fXIa végzi el a IX faktor átalakítását fIXa enzimmé. Ezzel újból elindulhat a Xáz-komplextől a trombin képződéséig vezető láncreakció. A folyamat ismétlődésével egyre több trombin keletkezik.

5. Kellően nagy trombinkoncentrációnál következik be a plazmában oldott fibrinogén részleges proteolízise, a fibrinmonomer képződése, ami előbb az úgynevezett oldható fibrinpolimerré asszociálódik, majd átalakul az oldhatatlan fibrinpolimerré. Ez utóbbi átalakulásban is szerepet játszik a trombin, mivel ennek hatására keletkezik a polimerizációt végző fXllla [L. Lorand és K. Konishi: Arch. Biochem. Biophys. 105, 58 (1964)].

Az oldhatatlan fibrinpolimer a véralvadék és a trombus egyik főkomponense, a másik összetevő a vérlemezke-aggregátum, mely ugyancsak a trombin hatására keletkezik elsősorban. A kialakuló trombus, illetve véralvadék magába zárja a folyamatban keletkezett trombin jelentős részét, ami újabb alvadási folyamatot indít el, amikor a trombus oldódása/oldása során oldatba kerül [A. K. Gash és munkatársai: Am. J. Cardiol. 57, 175 (1986)]; R. Kumar és munkatársai: Thromb. Haemost. 72, 713(1994)].

A fentiekből kitűnik a trombin kulcsszerepe a trombus képződésében. Emiatt a trombózisos betegségek gyógyításában rendkívüli jelentőséggel bírnak az olyan anyagok, melyek a trombin működését és/vagy keletkezését gátolják.

A trombózis kezelésében és megelőzésében a jelenleg legelterjedtebben és legsikeresebben alkalmazott készítmények a heparinok és a K-vitamin-antagonista kumarinok (például Syncumar és Warfarin), melyek közvetve gátolják a trombint.

A heparin katalizálja a trombin és természetes inhibitora, az antitrombin-lll (ΑΤ-III) közötti reakciót. A heparin ezen hatása azonban elmarad, ha az ΑΤ-III plazmakoncentrációja a normális 75%-ánál kisebb [R. Egbring és munkatársai: Thromb. Haemost. 42, 225 (1979)]. Nem kevésbé fontos, hogy e közvetett mechanizmussal nem gátolható az említett trombus által kötött trombin, mert a heparin-AT-lll komplex számára nem hozzáférhető [J. I. Weitz és munkatársai: J. Clin. Invest. 86, 385 (1990)]. Mindemellett a kezelés hatására kialakuló vérzéses szövődmények, és immunkórfolyamat következtében kialakuló trombembóliás esetek előfordulása sem elhanyagolható [lásd például J. M. Walenga és munkatársai: Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 2(Suppl. 1), S21-S27 (1996)].

A K-vitamin-antagonisták orálisan is adhatók. Hatásuk 16-24 óra után jelentkezik, és abban nyilvánul meg, hogy meggátolják némely alvadási faktor (például a protrombin) reaktív, Gla-tartalmú formáinak kialakulását. A terápiás hatáshoz részleges (60-70%-os) gátlás szükséges [Μ. P. Esnouf és C. V. Prowse: Biochim. Biophys. Acta 490, 471 (1977)], ami a gyógyszer megfelelő adagolásával érhető el. A K-vitamin-antagonisták alkalmazását megnehezíti a keskeny terápiás sáv, valamint a táplálék összetételétől (K-vitamin) való nagyfokú függőség és a változó egyedi érzékenység.

A trombint közvetlenül gátló első nagy hatású szintetikus anyag a D-Phe-Pro-Arg-H tripeptid-aldehid volt, amely egy reverzibilis inhibitor, és mind in vitro, mind in vivő jelentős alvadásgátló hatást mutatott [S. Bajusz és munkatársai: In: Peptides: Chemistry, Structure and Biology (R. Walter and J. Meienhofer, Eds.), Ann Arbor Publ., Ann Arbor, Michigan, USA, 1975, pp. 603-608; Int. J. Peptide Protein Rés. 12, 217 (1978)]. A D-Phe-Pro-Arg-H számos rokon vegyületét állították elő. Az elsők között volt a Boc-D-Phe-Pro-Arg-H [S. Bajusz és munkatársai: Int. J. Peptide Protein Rés. 12, 217 (1978)], valamint a klór-metil-keton-analóg (D-Phe-Pro-Arg-CH₂CI), ami irreverzíbilis inhibitornak bizonyult [C. Kettner és E. Shaw: Thromb. Rés. 14, 969 (1979)]. A továbbiak közül kiemeljük a peptid és acilvegyületei boro-arginin-analógjait (D-Phe-, Boc-D-Pheés Ac-D-Phe-Pro-boroArg), melyek a trombin hatékony reverzibilis inhibitorai [C. Kettner és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 18289 (1990)] és a Boc-D-Phe-ProArg-H egyéb analógjait, köztük a Boc-D-Chg-ProArg-H analógot [P. D. Gesellchen és R. T. Shuman: EP 0 479 489 A2 (1992)].

Kitűnt, hogy a D-Phe-Pro-Arg-H vizes oldatban hajlamos spontán átalakulásra, de a terminális aminocsoport metilezésével kapott D-MePhe-Pro-Arg-H (GYKI-14 766) már megfelelően stabil és hasonlóan hatásos vegyület [S. Bajusz és munkatársai: 4,703,036 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1987); J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)]. Kísérleti állatokban jelentősen gátolja a véralvadást és trombusképződést [D. Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 357 és 68, 125 (1992); J. V. Jackson és munkatársai: J. Pharm. Ex. Ther. 261, 546 (1992)]; a fibrinolízis enzimjeire gyakorolt gátlóhatása jelentéktelen, trombolitikumokkal együtt adva hatékonyan segíti a trombus oldódását [C. V. Jackson és munkatársai: J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 587 (1993)], amire a heparin-AT-lll komplex nem képes. A D-MePhe-Pro-Arg-H rokon vegyületeinek a szintézisére is sor került, például a D-MePhg-Pro-Arg-H előállítására [R. T. Shuman és munkatársai: J. Med. Chem. 36, 314 (1993)].

A véralvadásgátló hatást (a folyamat proteolitikus reakcióinak gátlását) az alvadási tesztekben mérik, például a trombin idő (TT-), aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT-) és protrombin idő (PT-) tesztben (E. J. W. Bovie és munkatársai: Mayo Clinic Laboratory Manual of Hemostasis; W. B. Sanuders Co., Philadelphia, 1971). A spontán alvadásban gátolt plazmát, például citrátplazmát alvadásra késztetnek, és mérik az

HU 224 426 Β1 alvadási időt. Alvadásgátlók hatására az alvadási idő megnyúlik a rendszerben működő reakció(k) gátlásával arányosan. Az alvadásgátló hatás jellemezhető például azzal az anyagkoncentrációval, aminél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik (IC₅₀). Az alvadásgátlóknak az egyes alvadási proteázokra gyakorolt hatását pedig az úgynevezett amidolitikus módszerrel mérik [R. Lottenberg és munkatársai: Methods Enzymol. 80, 341 (1981); G. Cleason: Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 411 (1994)]. Az izolált aktív faktort (például trombin vagy fXa) és ennek kromogén vagy fluorogén peptid-amid-szubsztrátját reagáltatják az inhibitor távollétében, illetve jelenlétében. Az enzimgátló hatást például az amidolízisben mért gátlási állandóval (IC₅₀) jellemzik.

A TT-tesztben a citrátplazmához adott trombin váltja ki az alvadást. A rendszerben működő trombin 22 pmol/ml, ennek gátlása mérhető jelen lévő fibrinogénen (a trombin egyik természetes szubsztrátján) plazmakomponensek jelenlétében. Az APTT- és PTtesztben az alvadási folyamat egésze zajlik. Az aktivátortól függően az úgynevezett belső, illetve külső úton aktiválódik a fX. A keletkező fXa a protrombint aktiválja trombinná, ami végül kiváltja a plazma alvadását. Az alvadási idő megnyúlik, ha az inhibitor gátolja a tesztekben működő enzimeket vagy ezek valamelyikét. Amíg a Xa faktorból legfeljebb 40 pmol/ml keletkezhet az APTT- és PT-tesztben (ennyi X faktor van jelen a két rendszerben), a trombinból kb. 150 pmol/ml (APTT), illetve 350 pmol/ml (PT) képződik [vö. B. Kaiserés munkatársai: Thromb. Rés. 65, 157 (1992)].

A D-MePhe-Pro-Arg-H (C1) esetében a TT-, APTTés PT-tesztben a kétszeres alvadási időt eredményező koncentráció 87, 622, illetve 2915 nM. Ezek az értékek és a tesztekben működő trombin mennyisége (22, 150, illetve 350 pmol/ml) hasonlóan emelkedik, ami arra utal, hogy C1 az APTT- és PT-tesztben is trombingátlóként viselkedik, és például a fXa működését nem vagy alig befolyásolja. Ezzel összhangban van, hogy C1 IC₅₀=2 nM értékkel gátolja a trombin amidolitikus hatását a Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztráton, míg a fXa amidolitikus hatását a megfelelő Bz-lle-Glu-Gly-ArgpNA szubsztráton csak kevéssé, IC₅₀=9,1 μΜ értékkel gátolja (Bajusz S. és munkatársai: nem közölt eredmények).

A véralvadás mechanizmusából következik, hogy a folyamatot nemcsak a trombin közvetlen inhibitorai, de a trombin képződését akadályozó anyagok is gátolják, például a fXa inhibitorok. Jelentős véralvadást és trombusképződést gátló hatással rendelkező fXa inhibitor például a kullancsból izolált 60 tagú polipeptid, a TÁP (Tick Anticoagulant Peptide) [L. Waxman és munkatársai: Science 248, 593 (1990); A. B. Kelly és munkatársai: Circulation 86, 1411 (1992)] és a DX-9065a (C2), egy szintetikus nempeptid: (+)-(2S)-2-[4[[(3S)-1-acetimidoil-3-pirrolidinil]-oxi]-fenil]-3-[7-amidino-2-naftil]-propionsav-hidrogén-klorid-pentahidrát [T. Hara és munkatársai: Thromb. Haemost. 71, 314 (1994); T. Yokoyama és munkatársai: Circulation 92, 485 (1995)]. Ezek az anyagok erősen gátolják a fXa amidolitikus hatását és a plazma alvadását a PT- és APTT-tesztben. Vagyis egyaránt jól gátolják a szabad és a komplexben lévő Xa faktort. Ugyanakkor - mint specifikus fXa inhibitorok - a trombint nem gátolják, a TT-tesztben nem hatnak. A fXa szintetikus peptid inhibitora például a 4MeP-Asp-Pro-Arg-H (C3) (WO 93/15756 szám alatt publikált nemzetközi bejelentés) és a Boc-D-PheNal(1)-Arg-H (C4) (WO 95/13693 szám alatt publikált nemzetközi bejelentés). A közlés szerint C3 és C4 IC₅₀=57, illetve 30 nM értékkel gátolja a fXa amidolitikus hatását a Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA szubsztráton; alvadásgátló hatásukra nincs adat. Saját méréseinkben a Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA szubsztráton is jelentős gátlóhatást mutatott C3 és C4, míg alvadásgátló hatásuk a plazma alvadási tesztekben rendkívül kicsi. Az 1. táblázat mutatja a fenti szintetikus fXa inhibitorokra közölt (C2), illetve kapott (C3-C4) aktivitási értékeket összehasonlításban a C1 trombingátló adataival.

A fenti adatokból látszik, hogy a PT- és APTT-tesztben észlelt alvadásgátló hatás C1 esetében trombingátlásra, C2-nél pedig a fXa gátlására vezethető vissza. C3 és C4 jelentős fXa-gátló hatása azonban nem jár együtt számottevő alvadásgátlással. Valószínű, hogy C3 és C4 számára nem hozzáférhető a protrombinázkomplexben lévő fXa aktív centruma, ezek a peptidek csak a szabad, oldatban lévő Xa faktort képesek gátolni.

1. táblázat

Ismert szintetikus inhibitorok Xa faktort gátló (A) és alvadásgátló (B) hatása

Inhibitor	A: IC₅₀, nM^b	6: IC₅₀, μΜ³
PT	APTT	TT
C1	9133	2,91	0,62	0,09
C2	70	0,52	0,97	NA^C
C3	64	19,32	4,59	0,87
C4	86	53,62	9,96	17,24

^a Peptidkoncentráció, melynél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik a protrombin idő (PT-), aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT-) és trombin idő (TT-) tesztben. ^b Izolált humán Xa faktorral Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton mért érték.

^c NA=nem aktív.

Újabb közlés szerint [N. A. Prager és munkatársai: Circulation 92, 962 (1995)] a trombusba/véralvadékba zárt, és az oldódás során onnan kiszabaduló alvadási enzimek közül nemcsak a trombin, de a Xa faktor is hozzájárul az újabb alvadási folyamat elindításához és fenntartásához, például a [fVII TF] komplex, illetve az V és Vili faktor aktiválása révén. Előnyös tehát, ha az alvadásgátlók a trombin mellett a Xa faktor gátlására is képesek, és különösen előnyös, ha e gátlóhatás az alvadókba zárt trombinra és Xa faktorra is kiterjed.

A találmány célja olyan új peptidszármazékok előállítása, melyek a véralvadás folyamatát az ismerteknél

HU 224 426 Β1 előnyösebben gátolják, és gátlóhatásuk orális adás esetén is megnyilvánul.

Korábbi megfigyelésünk volt, hogy a Boc-D-PhePro-Arg-H (C5) alvadásgátló hatása a TT- és APTT-tesztben ugyan kisebb, mint a C1 tripeptid-aldehi- 5 dé, de a PT-tesztben már valamivel aktívabb, és a Xa faktort pedig 10-szer kisebb ICso-értékkel gátolja, mint C1. Most meglepő módon azt találtuk, hogy C5 Boc-csoportjának Eoc-csoporttal történő helyettesítése előnyösen módosítja a peptid alvadásgátló hatását, mert az ily módon előállt Eoc-D-Phe-Pro-Arg-H (C6) mindhárom tesztben nagyobb hatású, mint a C5, továbbá a C1 aktivitását már nemcsak a PT-, de az APTT-tesztben is meghaladja, miközben Xa faktort gátló hatása a C5 Boc-peptidéhez hasonló. A Moc-D-Phe-Pro-Arg-H (C7) alvadásgátló hatása a C6 Eoc-vegyületéhez hasonló, de Xa faktort gátló hatása valamivel nagyobb. Az elmondottakat a 2. táblázat szemlélteti.

2. táblázat

R-D-Phe-Pro-Arg-H szerkezetű peptid-aldehidek alvadásgátló (A) és Xa faktort (B) gátló hatása

Peptid-aldehid		A- ιθ5ο> μΜ³		Β:
No.	R	TT	ΑΡΤΤ	PT	IC₅₀, μΜ»
C1	Me	0,09	0,62	2,93	9,13
C5	Boc	0,20	0,76	2,27	0,91
C6	Eoc	0,13	0,38	1,91	0,92
C7	Moc	0,20	0,29	1,96	0,13

^a Peptidkoncentráció, melynél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik.

^b Izolált humán Xa faktorral Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton mért érték (lásd M6. módszer).

Azt találtuk továbbá, hogy az Eoc-csoport előnyös befolyása nem korlátozódik a D-Phe-Pro-Arg-H szekvenciára, például az ismert D-Chg-Pro-Arg-H szekvencia esetén is [Boc-D-Chg-Pro-Arg-H (C8), P. D. Gesellchen és R. T. Shuman: EP 0479489 A2 (1992)] a Boc-csoportnak Eoc-csoportra való kicserélése az alvadásgátló hatást fokozza. Hasonlóan figyelemre méltó eredményeket kaptunk a D-Cpg-Pro-Arg-H szekvencia alkalmazása során is.

A fentiek alapján a találmány tárgyát az (I) általános képletű új peptidil-arginin-aldehid-származékok Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol

Q jelentése Q’-O-CO- képletű acilcsoport, mely képletben

Pro jelentése L-prolin-gyök és

A találmány tárgyát képező (I) általános képletű mely képletben Q, Q’, valamint D-Xaa, Pro és Arg jelentése a fenti - vegyületek előállításánál például úgy járunk el, hogy egy Q-D-Xaa-Pro acil-dipeptidet kondenzálunk guanidinocsoportján benzil-oxi-karbonil-csoporttal védett arginin-laktámhoz, majd a kapott védett tripeptid-laktámot Q-D-Xaa-Pro-Arg(Z)-H képletű védett tripeptid-aldehiddé redukáljuk, végül az arginin guanidinocsoportjáról a Z-csoportot hidrogenolízissel eltávolítjuk, és az (I) általános képletű peptidszármazékot valamilyen szerves vagy szervetlen savaddíciós só formájában elkülönítjük.

A kiindulási vegyületként alkalmazott új Q-D-XaaPro acil-dipeptidet például úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő D-Xaa aminosavat bázikus közegben klór-szénsav valamely Q’ alkil-észterével acilezzük, majd a kapott Q-D-Xaa acil-aminosavat L-prolinhoz kapcsoljuk.

Az L-prolinnal való kapcsoláshoz szükséges Q-D-Xaa acil-aminosavat előnyösen úgy is előállíthatjuk, hogy a DL-Xaa racém vegyületet acilezzük és metil-észterré alakítjuk, majd a kapott Q-DL-Xaa-OMe racém acil-aminosav-metil-észter enzimes hidrolízise után nyerhető Q-D-Xaa-OMe-t szappanosítjuk a kívánt Q-D-Xaa acil-aminosavvá.

A találmány tárgyát képező (I) általános képletű - mely képletben Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése a fenti - vegyületek erős véralvadásgátló hatást fejtenek ki in vitro és in vivő egyaránt, előnyös biológiai hasznosulás mellett.

Az (I) általános képletű vegyületek in vitro kifejtett véralvadásgátló hatását a protrombin idő (PT-), az aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT-) és a trombin idő (TT-) tesztben [D. Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)] határoztuk meg. Ugyancsak meghatároztuk a vegyületek fXa-gátló hatását a Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton, valamint a plazmingátló hatást az úgynevezett fibrinlemezmódszerrel [D. Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)]. A kapott eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be.

HU 224 426 Β1

3. táblázat

A Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) általános képletű új peptidszármazékok és a hasonló szerkezetű kontrollvegyület alvadásgátló (A), Xa faktort gátló (B) és plazmint gátló (C) hatása a PT-aktivitás csökkenő sorrendjében

Q-D-Xaa-Pro-Arg-H	A: IC₅₀, μΜ*	β; IC₅₀, nM^c	C: IC₅₀, μΜ«
Szám^b	Q	Xaa	PT	APTT	TT
3	Eoc	Cpg	1,15	0,36	0,40	44	83
1	Eoc	Chg	1,16	0,31	0,23	27	97
2	Moc	Chg	2,19	0,50	0,33	100	189
Kontrollvegyület
C8	Boc	Chg	2,02	0,92	0,24	22	81

^a Peptidkoncentráció, melynél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik a protrombin idő (PT-), aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT-) és trombin idő (TT-) tesztben.

^b Azonos a vegyületet leíró kiviteli példa számával, illetve kontrollvegyület (C1, C3).

^c Izolált humán Xa faktorral Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton mért érték (lásd M6. módszer).

^d Peptidkoncentráció, melynél a lízisterület a kontroll 50%-a.

Az adatokból kitűnik, hogy az 1 jelű új Eoc-származék az ismert C8 Boc-vegyületnél nagyobb antikoaguláns hatást mutat a PT- és APTT-tesztben, míg a TT-tesztben mért aktivitás és Xa faktort gátló hatás a két vegyületnél hasonló.

Az (I) általános képletű vegyületeknek a plazmaalvadékba zárt Xa faktor- és trombingátló hatását, valamint a fibringélhez kötött trombingátló hatását a 4. táblázatban mutatjuk be az 1, 2 és 3 jelű vegyület példá25 ján; a C1 és C3 esetében talált megfelelő értékeket kontrollként tüntetjük fel. A plazmaalvadékot lemezkedús humán citrátplazma rekalcinálásával, a fibringélt pedig humán fibrinogén humán trombinnal történő alvasztásával nyertük, a Xa faktor és trombin aktivitásának mérésére a Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA, illetve Tos-GlyPro-Arg-pNA szubsztrátot használtuk az M1-M3. meghatározásban (lásd a „Módszerek” című leírásrészt) ismertetett módon.

4. táblázat

A találmány szerinti 1, 2 és 3 új peptidil-arginin-aldehid, valamint C8 mint kontrollvegyület gátlóhatása (IC₅₀, μΜ) plazmaalvadékba zárt Xa faktorra és trombinra, valamint fibringélhez kötött trombinra³

Peptidil-arginin-aldehid (szám^b)	Plazmaalvadék	Fibringél
Xa faktor	trombin	trombin
Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H (1)	0,96	0,17	0,08
Moc-D-Chg-Pro-Arg-H (2)	1,39	0,61	0,27
Eoc-D-Cpg-Pro-Arg-H (3)	0,67	0,51	0,78
Kontrollvegyület
Boc-D-Chg-Pro-Arg-H (C8)	1,69	0,79	0,35

^a Az IC₅₀-értékek meghatározásánál a Xa faktor és trombin aktivitását Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA, illetve Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztráttal mértük (lásd M1-M5. módszer).

^b Azonos az új vegyületet leíró kiviteli példa számával, illetve kontrollvegyület (C8).

Az adatokból kitűnik, hogy az új vegyületek a lemezkedús humán plazmaalvadékba zárt Xa faktort és trombint, valamint a humán fibringélhez kötött trombint egyaránt mikromól alatti (nanomól nagyságrendű) IC₅₀-értékkel képesek gátolni. Az alvadókba zárt Xa faktort és trombint egyaránt kisebb IC₅₀-nel gátolta az jelű vegyület, mint C8, ami jelzi, hogy az Eoc-csoport ebből a szempontból is előnyösebb szubsztituens, mint a Boc-csoport.

Az (I) általános képletű vegyületek véralvadást és lemezkeaggregációt gátló hatását új-zélandi fehér nyulakban vizsgáltuk ex vivő a korábban leírt módon [D. Bagdy

HU 224 426 Β1 és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 357 (1992)].

A vegyületeket pufferolt fiziológiás konyhasóban oldva adtuk intravénás injekcióban (0,04-5,0 mg/kg) vagy infúzióban (0,25-5,0 mg/kg/h), illetve 0,5-6,0 mg/kg dózisban bőr alá vagy 2,5-20 mg/kg dózisban szájon át. 5 A vegyületek hatása a szájon át történő beadás után <30 perccel már kimutatható, a legnagyobb értéket a 60-180. percben éri el, és a terápiás hatás dózisfüggő módon fennmarad 3->6 órán át.

Részletesen az etoxi-karbonil-D-ciklohexil-gli- 10 cil-L-prolil-L-arginin-aldehid (1) 10 mg/kg és 5 mg/kg orális dózisnál észlelt in vivő hatását mutatjuk be az

5-6., illetve 7-8. táblázatban; ahol a C1 esetében talált megfelelő értékeket kontrollként tüntetjük fel. A vegyületek beadása után az állatok fülvénájából 30-60 percenként vett vérmintákat analizáltuk. Meghatároztuk a teljes vér alvadási idejét (WBCT), valamint a trombinnal kiváltható vérlemezke-aggregáció gátoltságának mértékét (PAI). Meghatároztuk továbbá a vérmintából nyert citrátplazma aktivált parciális tromboplasztin idejét (APTT) és trombin idejét (TT). Az APTT- és TT-értékeket az 5. és 7. táblázat, míg a WBCT- és PAI-értékeket a 6. és 8. táblázat tartalmazza.

5. táblázat

Az Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H és a D-MePhe-Pro-Arg-H véralvadásgátló hatása nyulakban 10 mg/kg orális dózisnál az APTT- és TT-tesztben relatív alvadási időkkel jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H (1)	D-MePhe-Pro-Arg-H (C1)
APTT	TT	APTT	TT
0	1,0	1,0	1,0	1,0
30	2,24±0,61	15,46±4,84	2,07±0,38	7,89±4,13
60	2,59±0,53	20,18±3,44	2,30±0,31	19,27±3,60
120	3,11±0,73	24,31±2,25	1,93±0,14	17,21 ±4,73
180	2,72±0,68	27,31±2,32	1,75±0,17	7,23±2,00
240	2,26±0,48	14,92±4,12	1,61±0,15	3,77±1,25
300	2,09±0,39	11,67+3,70	1,25+0,22	2,36±1,21
360	1,81 ±0,45	8,30±4,86	-	-

^θ A kezelt és nem kezelt állatokban mért alvadási idők hányadosa. A terápiás értékeket kiemeltük.

6. táblázat

Az Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H és a D-MePhe-Pro-Arg-H véralvadást és vérlemezke-aggregációt (PAI) gátló hatása nyulakban 10 mg/kg orális dózisnál a WBCT-tesztben talált relatív alvadási idővel, illetve a %-os gátlással jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H (1)	D-MePhe-Pro-Arg-H (R1)
WBCT	PAI (%)	WBCT	PAI (%)
0	1,0	0	1,0	0
30	1,61±0,18	81,5±14,8	1,38±0,16	89,0±7,5
60	1,77±0,20	77,0±17,0	1,49+0,13	96,5±2,2
120	1,96±0,19	99,0±1,0	1,45±0,09	100,0±0,0
180	1,69±0,14	98,0±2,0	1,25±0,08	94,0±3,7
240	1,65±0,19	88,5±11,5	1,00±0,18	81,8±14,0
300	1,71±0,18	93,0±7,0	1,09+0,06	55,0±29,3
360	1,22±0,17	72,0±25,0	-	-

^a A kezelt és nem kezelt állatokban mért alvadási idők hányadosa. A terápiás értékeket kiemeltük.

HU 224 426 Β1

7. táblázat

Az Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H és a D-MePhe-Pro-Arg-H véralvadásgátló hatása nyulakban 5 mg/kg orális dózisnál az APTT- és TT-tesztben relatív alvadási időkkel jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H (1)	D-MePhe-Pro-Arg-H (C1)
APTT	TT	APTT	TT
0	1,0	1,0	1,0	1,0
30	1,38±0,27	6,21±4,36	1,27±0,38	1,52+0,17
45	1,53±0,33	9,83±5,48	1,30+0,02	2,50±0,44
60	1,59±0,38	10,55±5,54	1,37±0,03	4,75±1,38
120	1,85±0,25	14,10±5,46	1,43±0,11	5,51±3,59
180	1,78+0,18	10,77+4,47	1,39±0,09	2,05±0,38
240	1,72±0,20	6,32±2,30	1,31±0,11	1,81 ±0,39

8. táblázat

Az Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H és a D-MePhe-Pro-Arg-H véralvadást és vérlemezke-aggregációt (PAI) gátló hatása nyulakban 5 mg/kg orális dózisnál a WBCT-tesztben talált relatív alvadási idővel, illetve a %-os gátlással jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H (1)	D-MePhe-Pro-Arg-H (C1)
WBCT	PAI (%)	WBCT	PAI (%)
0	1,0	0	1,0	0
30	1,18±0,02	63,2+13,2	1,07±0,13	52,8±14,7
45	1,23±0,09	58,2±12,0	1,26±0,07	58,4±15,6
60	1,42±0,09	73,8+16,5	1,55+0,17	54,2±11,6
120	1,69+0,10	78,4±13,5	1,45±0,21	75,2±12,3
180	1,45±0,19	88,6±17,4	1,44 ±0,08	47,5±20,9
240	1,13±0,08	91,8±7,6	1,22+0,08	32,2±16,0

A táblázatok adataiból kitűnik, hogy a hatás nagysága és tartama szempontjából egyaránt előnyösebb alvadásgátló 1, mint C1. 45

A találmány szerinti (I) vegyületeket az alábbi, trombózissal és/vagy fokozott véralvadékonysággal járó állapotok kezelésére és megelőzésére alkalmazzuk: mélyvénás trombózis, tüdőembólia, artériás trombózis, instabil angina, szívizomelhalás, pitvarfibrillá- 50 ció, valamint trombózis alapon létrejött stroke. Használhatók még érelmeszesedés esetén a koronáriaartéria és agyi artéria trombotikus megbetegedéseinek megelőzése céljából, magas rizikójú betegek sebészi profilaxisára, illetve egyéb sebészi profilaxisra. Ezen- 55 kívül alkalmazhatók trombolízis vagy perkután transzluminális angioplasztika kapcsán az újraelzáródás megelőzésére, továbbá hemodialízis esetén és nefrózisszindróma kiegészítő terápiájára, valamint a vér fokozott alvadékonyságával együtt járó kórképekben: a 60 rosszindulatú daganatos és gyulladásos megbetegedésekben (például ízületi gyulladás), valamint cukorbetegségben. Alkalmazhatók továbbá olyan esetekben, amikor az egyéb antikoagulánsok adása nem elég hatékony vagy kontraindikált: például heparin esetében antitrombin-lll hiánya vagy HIT (heprin indukálta trombocitopénia), kumarinok esetében például graviditás.

Gyógyászati célokra a jelen találmány szerinti vegyületeket és ezek gyógyászatilag elfogadható sóit alkalmazhatjuk önmagukban vagy célszerűen gyógyszerkészítmény formájában. Az ilyen készítmények szintén beletartoznak a jelen találmány oltalmi körébe.

E gyógyszerkészítmények hatóanyagként valamely (I) általános képletű vegyületnek vagy gyógyászatilag elfogadható sójának a hatás kifejtéséhez szükséges mennyiségét tartalmazzák a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott, önmagában ismert vivő-, töl8

HU 224 426 Β1 töanyagok, hígítószerek és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyagok kíséretében.

A fentieknek megfelelő vivő-, hígító-, illetve töltőanyagok például a víz, alkoholok, zselatin, laktóz, szacharóz, keményítő, pektin, magnézium-sztearát, sztearinsav, talkum, különböző állati vagy növényi olajok, valamint glikolok, például propilénglikol vagy polietilénglikol. A gyógyászati segédanyagok közé tartoznak a tartósítószerek, különböző természetes vagy szintetikus emulgeáló-, diszpergáló- vagy nedvesítőszerek, színezőanyagok, ízjavító szerek, pufferálóanyagok, szétesést elősegítő szerek és más, a hatóanyag biológiai hasznosulását elősegítő anyagok.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a szokásos formákban lehetnek. Ilyen szokásos gyógyszerformák például az orális (szájon át adagolt) készítmények (tabletta, kapszula, por, pirula, drazsé vagy granulátum), valamint a parenterális (a gyomor- és bélrendszer megkerülésével adagolt) készítmények (injekciós vagy infúziós készítmények, a végbélkúp, tapasz vagy kenőcs).

Habár a jelen találmány szerinti vegyületeknek a gyógyászati hatás kifejtéséhez szükséges dózisa a kezelendő betegek egyéni állapotától és életkorától függ, ettől függően változhat, és végső soron a kezelőorvos határozza meg; az olyan betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére, amelyben kívánatos a trombin működésének és/vagy keletkezésének gátlása, általában e vegyületeknek a testtömeg 1 kg-jára számítva körülbelül 0,01 mg és körülbelül 1000 mg közötti, és előnyösen 0,25 mg és 20 mg közötti napi orális vagy parenterális, például intravénás dózisait használhatjuk.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek trombolitikumokkal (például tPA-val vagy urokinázzal) együtt adagolva hatékonyan segíthetik elő az artériákban vagy vénákban kialakult trombusok oldódását, illetve hatékonyan gátolhatják a trombusok újraképződését. Ilyen esetekben a találmány szerinti vegyületeket a trombolitikumokkal egyidejűleg vagy a trombolitikus kezelést követően célszerű adagolni.

A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákon mutatjuk be anélkül, hogy a találmányt e példákra korlátoznánk.

A példákban megadott R_rértékeket rétegkromatográfiával határoztuk meg szilikagélen (DC-Alufolien Kieselgel 60 F₂₅4, Merck, Darmstadt) az alábbi oldószerekben:

1. Etil-acetát

2. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (480:20:6:11)

4. Kloroform-metanol (9:1)

6. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (240:20:6:11)

9. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (120:20:6:11)

10. Etil-acetát-hexán (1:1)

12. Etil-acetát-ciklohexán (9:1)

A példákban megadott kapacitásfaktor-értékeket (k') „Pharmacia LKB analytical HPLC System Two berendezéssel határoztuk meg az alábbiak szerint.

Oszlop: „VYDAC C-18 reversed phase: 10 pm, 300 Á, 4«250 mm.”

A puffer: 0,1% trifluor-ecetsav vízben.

B puffer: 0,1% trifluor-ecetsav acetonitrilben.

Az alkalmazott gradiens 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett

I: 0-5 min. 0-25% B, majd izokratikus 25% B;

II: 0-30 min. 0-60% B.

Az eluátum peptidtartalmának detektálása UV fénnyel történt 214 nm-en. A minta töménysége 1 mg/ml A puffer, az injekciós térfogat 25 pl.

A HPLC analízisnél az alkalmazott gradienst (I vagy II) a példa egyes lépéseinél a rövidítés után zárójelben adjuk meg.

Az acil-arginin-aldehidek egyensúlyi formákban léteznek: aldehid és aldehid-hidrát, valamint két amino-ciklol formában.

Ezek közül az aldehid-hidrát és egy vagy mindkét amino-ciklol külön csúcsban jelenik meg a HPLC során. Ennek megfelelően az acil-arginin-aldehideket a talált két vagy három k'-értékkel jellemezzük a példákban.

A FAB tömegspektrumok felvételénél az anyagokat m-nitro-benzil-alkoholban vagy glicerinben oldottuk. A peptidil-arginin-laktámok és peptidil-arginin-aldehidek spektrumában a molekulaion mellett az m-nitrobenzil-alkohol (NBA) oldószerrel képzett addíciós vegyület molekulaionja is megjelenik: [M+H]⁺, illetve [M+H+NBAj®. Ennek megfelelően adjuk meg a FAB tömegspektrum adatait a példákban. Az ESI pozitív ionizációs mérések VG Quattro (Fisons) típusú készüléken történtek. A mintákat 1 térfogat% hangyasavat tartalmazó 1:1 arányú acetonitril-víz elegyben oldottuk fel, majd 10 ml-es mintahurok alkalmazásával, a vivőfolyadék 15-25 ml/perc áramlási sebessége mellett áramoltattuk az ionforrásba.

A fajlagos forgatási értékeket (ja]_D) 20 °C-on mértük.

1. példa

Etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (Eoc-D-Chg-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolilNG-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

2,73 g (7 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktámot [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] szuszpendálunk 7 ml kloroformban, majd keverés és jeges hűtés mellett hozzáadunk 7 ml sósavas etil-acetátot (töménysége 0,11-0,15 g/ml). Két óra után a reakcióelegyet 13-15 ml dietil-éterrel hígítjuk, a kivált kristályos anyagot kiszűrjük, mossuk 4 ml acetonnal és 4 ml dietil-éterrel, majd éjszakán át szárítjuk vákuumexszikkátorban kálium-hidroxid mellett. A kapott N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám-klór-hidrátot feloldjuk 7 ml dimetil-formamidban, lehűtjük -20 °C-ra, és az alábbi vegyes anhidridhez adjuk.

1,96 g (6 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolint [1. példa, C) lépés] feloldunk 7 ml dimetil-formamidban, lehűtjük -20 °C-ra, és keverés közben hozzáadunk 0,68 ml (6 mmol) N-metil-morfolint, 0,79 ml (6 mmol) klór-szénsav-izobutil-észtert, majd 10 perc keverés után az N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot tartalmazó fenti dimetil-formamidos oldatot, és végül

HU 224 426 Β1

1,76 ml (12,6 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet 30 percen át -10 °C-on, majd 1 órán át 0 °C-on keverjük. Ezt követően a sókat kiszűrjük, és a szürletet hígítjuk 30 ml benzollal. A kapott oldatot mossuk 3*10 ml vízzel, 10 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal és 3*10 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott terméket 55 g Kieselgel 60-nal készített szilikagél oszlopon kromatografáljuk etil-acetátot alkalmazva eluensként. A terméket [Rf(1 )=0,52] tisztán tartalmazó frakciók egyesítése és bepárlása után kapott olajos maradékot n-hexánnal dörzsöljük el. 2,62 g (73%) cím szerinti terméket kapunk. [a]_D=-40,7° (c=0,5; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (599 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicíl-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

2,3 g (3,8 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (1. példa, 1. lépés) feloldunk 13 ml tetrahidrofuránban, és keverés közben, -50 °C alatt hozzáadunk 3,0 mmol lítium-alumínium-hidridet tetrahidrofuránban oldva. A redukció előrehaladását rétegkromatográfiával követjük etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (240:20:6:11) rendszerben, és szükség szerint adagolunk további lítium-alumínium-hidridet. A reakcióelegyhez hűtés és keverés mellett annyi hűtött 0,5 M kénsavat csepegtetünk, hogy a pH 3 legyen, majd 30 ml vízzel hígítjuk, A kapott oldatot 2*15 ml n-hexánnal kirázzuk, majd 3^χ20 ml metilén-kloriddai kivonatoljuk. A metilén-kloridos oldatokat egyesítjük, mossuk 3*15 ml vízzel, 15 ml hideg 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal és 15 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot n-hexánnal eldörzsöljük. Szűrés és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 1,8 g (76%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(2)=0,20. [a]_D=-31° (c=0,5; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (601 [M+H]⁺,

754 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklohexilglicil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

1,6 g (2,7 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (1. példa, 2. lépés) feloldunk 30 ml etanol, 3,0 ml víz és 2,7 ml 0,5 M kénsav elegyében, hozzáadunk 10 ml etanolban szuszpendált 0,20 g csontszenes palládiumkatalizátort, és 10 °C körüli hőmérsékleten hidrogénezzük. A reakció - aminek előrehaladását rétegkromatográfiával követjük - mintegy 30 perc alatt lejátszódik. A katalizátort kiszűrjük, és az oldatot 2,0-2,5 kPa nyomáson kb. 5-6 ml térfogatra töményítjük. A maradékot 20 ml vízzel hígítjuk, 7 ml metilén-kloriddai kirázzuk, majd a pH-t 3,5-re állítjuk hidroxilciklusú Dowex AG 1-X8 ioncserélő gyantával. Ezután az oldatot 24 órán át állni hagyjuk 20-22 °C-on, majd lefagyasztjuk és liofilizáljuk. 1,27 g (90%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=4,13; 4,65 és 6,17. [a]_D=-65° (c=1; vízben). A FAB tömegspektrum (467 [M+H]⁺, 620 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolin (Eoc-DChg-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklohexilglicin-diciklohexil-ammónium-só

2,41 g (16 mmol) D-ciklohexil-glicint feloldunk 8 ml 2 M nátrium-hidroxidban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés mellett egyidejűleg hozzáadunk 9 ml 2 M nátrium-hidroxidot és 1,73 ml (18 mmol) etoxi-karbonil-kloridot. A reakcióelegyet egy óra keverés után 20 ml vízzel hígítjuk, 5 ml dietil-éterrel kirázzuk, 3 M sósavval 3-as pH-ra savanyítjuk, majd 4*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat mossuk 10 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 3,2 ml (16 mmol) diciklohexil-amint. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk és levegőn szárítjuk. 4,7 g (71,5%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(2)=0,73. Olvadáspont: 149-153 °C. [a]_D=-12,8° (c=1; etanolban).

Elemzési eredmény a C23H42N2O4 (410,58) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=67,28; H%=10,31; N%=6,82. talált: C%=67,5; H%=10,6; N%=6,45.

B) lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észter

4,5 g (11 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicin-diciklohexil-ammónium-sót [1. példa, A) lépés] feloldunk 30 ml etil-acetátban és 12 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, az etil-acetátos fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson mintegy 15 ml térfogatra töményítjük. A maradék oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 2,16 g (11 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt, valamint 2,26 g (11 mmol) diciklohexil-karbodiimidet, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékként kapott 3,8 g olajat [R_f(4)=0,79] 9 mmol cím szerinti terméknek tekintjünk.

C) lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolin mmol etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicin-2,4,5triklór-fenil-észtert [1. példa, B) lépés] feloldunk 10 ml piridinben, hozzáadunk 1,15 g (10 mmol) L-prolint és

1,4 ml (10 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban, és az oldatot kirázzuk 3*5 ml dietil-éterrel. A dietil-éteres fázisokat egyesítjük, és kirázzuk 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 3 M sósavval pH=3-ra savanyítjuk, és 3x10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot izopropil-éterrel kristályosítjuk. 1,9 (65%) cím szerinti terméket kapunk.

HU 224 426 Β1

R_f(4)=0,49. Olvadáspont: 116-119 °C. [a]_D=-22,5° (c=1; etanolban). A FAB tömegspektrum (327 [M+H]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. példa

Metoxi-karbonil-D-cíklohexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (Moc-D-Chg-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Metoxi-karbonil-D-ciklohexilglicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

1,95 g (5 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 1,4 g (4,5 mmol) metoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolinból [2. példa, C) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását. A végterméket [Rf(1 )=0,38] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük, és bepárlás után a kapott olajos maradékot n-hexánnal eldörzsöljük. Ily módon 2,1 g (79%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(2)=0,61. [a]_D=-41,6° (c=0,5; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (585 [M+H]⁺, 738 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Metoxi-karbonil-D-ciklohexilglicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

1,97 g (3,37 mmol) metoxi-karbonil-D-ciklohexilglicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (2. példa, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket használva - redukálunk, azzal az eltéréssel, hogy a művelet végén az olajos végterméket ciklohexánnal dörzsöljük el. Szűrés és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 1,25 g (63,5%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,57. [a]_D=-29,8° (c=0,5; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (587 [M+H]⁺, 740 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Metoxi-karbonil-D-ciklohexilglicil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

1,1 g (1,8 mmol) metoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (2. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át. Ilyen módon 0,81 g (90%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k -3,57; 3,87 és 4,74. [a]_D=-74,8° (c=1; vízben). A FAB tömegspektrum (453 [M+H]⁺, 606 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Metoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolin (Moc-DChg-Pro) előállítása

A) lépés: Metoxi-karbonil-D-ciklohexilglicin-diciklohexil-ammónium-só

1,73 g (11 mmol) D-ciklohexil-glicint feloldunk 5,75 ml 2 M nátrium-hidroxidban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés mellett egyidejűleg hozzáadunk 7,65 ml 2 M nátrium-hidroxidot és 1,1 ml (14,3 mmol) metoxi-karbonil-kloridot. A reakcióelegyet egy óra keverés után 20 ml vízzel hígítjuk, 2*10 mi dietil-éterrel kirázzuk, szilárd kálium-hidrogén-szulfáttal 3-as pH-ra savanyítjuk, majd 4*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 2,4 ml (12 mmol) diciklohexil-amint. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk és levegőn szárítjuk. 3,4 g (78%) cím szerinti terméket kapunk. Rj(2)=0,81.

Elemzési eredmény a C₂₂H₄₀N₂O₄ (396,56) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=66,63; H%=10,17; N%=7,06. talált: C%=66,7; H%=10,15; N%=7,1.

B) lépés: Metoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észter

3,3 g (8,3 mmol) metoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicin-diciklohexil-ammónium-sót [2. példa, A) lépés] az 1. példa B) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át. A kapott 2,8 g olajat [R_f(12)=0,29] 6,7 mmol cím szerinti terméknek tekintjük.

C) lépés: Metoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolin

2,8 g (6,7 mmol) metoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észtert [2. példa, B) lépés] és 0,86 g (7,5 mmol) L-prolint az 1. példa C) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - kapcsolunk. Ily módon 1,6 g (76%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(2)=0,19. Olvadáspont: 147,5-148 °C. [a]_D=-23,3° (c=1; etanolban).

3. példa

Etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (Eoc-D-Cpg-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklopentilglicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

0,43 g (1,1 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 0,31 g (1,0 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicil-L-prolinból [3. példa, C) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - végezzük a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását. A végterméket [R_f(1 )=0,40] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot n-hexánnal eldörzsöljük és exszikkátorban szárítjuk. 0,38 g (65%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(1 )=0,40. [a]_D=-41,2° (c=1; tetrahidrofuránban). Az ESI tömegspektrum (584 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklopentilglicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

0,36 g (0,6 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (3. példa, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk, azzal az eltéréssel, hogy a

HU 224 426 Β1 művelet végén, a metilén-kloridos oldat bepárlása után kapott olajos terméket n-hexánnal kristályosítjuk. Szűrés, n-hexános mosás és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 0,2 g (55%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(6)=0,21. Az ESI tömegspektrum (587 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklopentilglicil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

0,18 g (0,3 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (3. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - alakítunk át. Ily módon 0,145 g (96%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=3,39; 3,75 és 4,6. Az ESI tömegspektrum (453 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicil-L-prolin (Eoc-D-CpgPro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicin

0,26 g (1,8 mmol) D-ciklopentil-glicint [J. T. Hill és F. W. Dunn: J. Org. Chem. 30, 1321 (1965)] az 1. példa

A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozása során a végterméket tartalmazó etil-acetátos oldat bepárlásával nyert olajat n-hexánnal kristályosítjuk, n-hexánnal mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 0,29 g (76%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 89,5-93,6 °C. R_f(6)=0,69. [a]_D=+11,5° (c=1; metanolban).

B) lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észter

0,25 g (1,16 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicint [3. példa, A) lépés] feloldunk 2,5 ml dimetil-formamidban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, majd keverés közben hozzáadunk 0,26 g (1,3 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt és 0,25 g (1,2 mmol) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet tovább keverjük 0 °C-on 30 percig és szobahőmérsékleten 3 órán át. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük és 0,5 ml dimetil-formamiddal mossuk, majd a szűrletet és mosófolyadékot bepároljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékot 1,1 mmol etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észternek [Rf(6)=0,94] tekintjük, és közvetlenül felhasználjuk a példa C) lépésében.

C) lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicil-L-prolin

A fenti B) lépésben kapott 1,1 mmol etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észtert feloldunk 3 ml dimetil-formamidban, hozzáadunk 0,14 g (1,2 mmol) L-prolint és 0,17 ml (1,2 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet 18 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezt követően 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátot adunk a reakcióelegyhez és kirázzuk 2*3 ml dietil-éterrel. Az alsó fázist 3 M sósavval pH=3-ra savanyítjuk, majd 3*5 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízzel savmentesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után bepároljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékot n-hexánnal eldörzsöljük, a csapadékot szűrjük, n-hexánnal mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 0,32 g (90%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(6)=0,47.

Kontrollvegyületek szintézise

1. szintézis

Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-arginin-aldehid(Eoc-D-Phe-Pro-Arg-H) hemiszulfát

1. lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolilN^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

2,3 g (5,8 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 1,67 g (5 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolinból [1. szintézis, C) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 1. példa 1. lépésében leírt módon végezzük arányos mennyiségű oldószereket és reagenseket alkalmazva. A végterméket [Rf(1 )=0,37] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot exszikkátorban szárítjuk. 1,18 g (60%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. A FAB tömegspektrum (607 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolilN^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

0.9 g (1,5 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (1. szintézis, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 0,33 g (36%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(1 )=0,16.

3. lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-Dalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

0,33 g (0,54 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (1. szintézis, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át. 0,26 g (92%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k-4,0; 4,45 és 5,45. A FAB tömegspektrum (475 [M+H]⁺, 628 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin (Eoc-D-Phe-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin

16.5 g (0,1 mól) 3-fenil-D-alanint az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozásánál a végterméket tartalmazó etil-acetát bepárlásával nyert olajat vákuumexszikkátorban szárítjuk. 14,6 g (55%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(9)=0,70.

B) lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-Dalanin-N-hidroxi-szukcinimid-észter

14.5 g (55,4 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanint [1. szintézis, A) lépés] és 6,4 g (56 mmol) N-hidroxi-szukci12

HU 224 426 Β1 nimidet feloldunk 60 ml tetrahidrofuránban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 11,5 g (56 mmol) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet hűtés mellett 10 órán át tovább keveijük, majd szüljük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot benzollal kristályosítjuk. A kristályokat kiszűrjük, benzollal és dietil-éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 11,3 g (60%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(10)=0,53. [a]o=+58,1° (c=1; dimetil-formamid). Elemzési eredmény a C₁₆H₁₈N₂O₆ (334,33) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=57,48; H%=5,42; N%=8,30;

talált: C%=57,4; H%=5,4; N%=8,3.

A FAB tömegspektrum (335 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

C) lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin

3,34 g (10 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-N-hidroxi-szukcinimid-észtert [1. szintézis, B) lépés] feloldunk 15 ml piridinben, hozzáadunk 1,15 g (10 mmol) L-prolint és 1,4 ml (10 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 10 órán át, majd 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban és 10 ml dietil-éterben. A vizes fázist kirázzuk 3*5 ml dietil-éterrel. A dietil-éteres fázisokat egyesítjük, és kirázzuk 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. Az olajos maradékot dietil-éterrel kristályosítjuk. A kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 2,6 g (77%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 141-143 °C. Rf(6)=0,40.

Elemzési eredmény a C₁₇H₂₂N₂O₅ (334,33) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=61,06; H%=6,63; N%=8,38;

talált: C%=61,1; H%=6,7; N%=8,1.

A FAB tömegspektrum (335 ]M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. szintézis

Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (Moc-D-Phe-Pro-Arg-H) hemiszulfát

1. lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolilN^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

4,1 g (10,5 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 2,88 g (9 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolinból [2. szintézis, C) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a nyers végtermék elkülönítését. A nyers végterméket ciklohexánból történő kristályosítással tisztítjuk. 4,65 g (86%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 72-82,7 °C. R_f(2)=0,56.

[a]_D=+72,9° (c=1, tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (593 [M+H]⁺, 746 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolilN^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

4,13 g (7 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (2. szintézis, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk, azzal az eltéréssel, hogy a művelet végén, a metilén-kloridos oldat bepárlása után kapott olajos terméket dietil-éterrel kristályosítjuk. Szűrés, dietil-éteres mosás és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 3,06 g (74%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 103-107 °C. R_f(6)=0,44. [a]_D=-69° (c=1, tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (595 [M+H]⁺, 748 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

2,68 g (4,5 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (2. szintézis, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - átalakítunk. Ily módon 2,15 g (94%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=3,3; 3,57 és 4,09. [a]_D=-87,6° (c=1, vízben). A FAB tömegspektrum (461 [M+H]⁺, 614 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin (Moc-D-PhePro) előállítása

A) lépés: Metoxi-karbonil-3fenil-D-alanin-diciklohexil-ammónium-só g (30 mmol) D-fenil-alanint feloldunk 15 ml 2 M nátrium-hidroxidban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés mellett hozzáadunk párhuzamosan 16,5 ml 2 M nátrium-hidroxidot és 2,55 ml (33 mmol) metoxi-karbonil-kloridot. A reakcióelegyet fél órán át hűtés mellett és 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a reakcióelegyet hígítjuk 40 ml vízzel, kirázzuk 10 ml dietil-éterrel, majd 3-as pH-ra savanyítjuk 3 M sósavval, és 4*20 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat 20 ml vízzel mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 60 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 6 ml (30 mmol) diciklohexil-amint. A kivált kristályokat kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk és levegőn szárítjuk. 11,5 g (28,5%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(2)=0,56. Olvadáspont: 167-170 °C. [a]_D=-37,9° (c=0,5, etanolban).

Elemzési eredmény a C₂₃H₃₆N₂O4 (404,53) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=68,28; H%=8,97; N%=6,92.

talált: C%=68,3; H%=9,15; N%=6,75.

B) lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-2,4,5-triklór-fenil-észter

11,3 g (28 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanint [2. szintézis, A) lépés] feloldunk 75 ml etil-acetátban és

HU 224 426 Β1

30,5 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, az etil-acetátos fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson mintegy 15 ml térfogatra töményítjük. A maradék oldatot 0 ’C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 5,5 g (28 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt, valamint 5,75 g (28 mmol) diciklohexil-karbodiimidet, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékként kapott olajos végterméket etanolból kristályosítjuk. Szűrés, dietil-éteres mosás és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 6,86 g (61%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 109-110’C. Rf(4)=0,84.

Elemzési eredmény a C₁₇H₁₄NO₄CI₃ (402,66) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=50,70; H%=3,50; N%=3,48;

0=26,42;

talált: C%=50,8; H%=3,2; N%=3,4;

0=26,6.

C) lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin 4,83 g (12 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-2,4,5-triklór-fenil-észtert [2. szintézis, B) lépés] feloldunk 12 ml piridinben, hozzáadunk 1,38 g (12 mmol) L-prolint és 1,68 ml (12 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 40 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban, és az oldatot kirázzuk 3*7 ml dietil-éterrel. A dietil-éteres fázisokat egyesítjük, és kirázzuk 7 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 3 M sósavval pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot dietil-éterrel kristályosítjuk, a kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 3,05 g (79%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 154-157 ’C. R_f(2)=0,47. A FAB tömegspektrum (321 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

Módszerek

M1. módszer Plazmaalvadék készítése

a) Lemezkedús plazmát (PRP) készítünk olyan módon, hogy humán vér és 3,8%-os nátrium-citrát—víz(1 /2) 9:1 arányú elegyét 240*g-n centrifugáljuk 5 percig.

b) Egy-egy reakcióedénybe 200 μΙ PRP-t teszünk, hozzáadunk 80 μΙ 40 mM-os kalcium-kloridot, és állni hagyjuk szobahőmérsékleten 1 órán át. A kialakult plazmaalvadékot 6*2 ml 0,9%-os nátrium-kloriddal mossuk enyhe keveréssel és 5 perc ülepítéssel, hogy az oldatban maradt enzimeket (Xa faktor és trombin) eltávolítsuk. A mosófolyadék trombintartalmát a következő módon határozzuk meg.

c) 400 μΙ mosófolyadékhoz 100 μΙ 1 mM-os Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztrátoldatot adunk, 30 percet inkubáljuk 37 °C-on, majd 100 μΙ 50%-os ecetsavval leállítjuk a reakciót. Az elegyből 150-150 μΙ-t teszünk egy 96 lyukú lemez (96-well microtitre plate) mélyedéseibe, és 405 nm-en meghatározzuk az extinkciós értékeket (ELISA READER SLT Laborinstrument GmbH, Austria). Eredményes mosás esetén az extinkció értéke kisebb, mint a kontroll 5%-a.

M2. módszer

Plazmaalvadékba zárt Xa faktor gátlásának meghatározása

a) A peptidinhibitorból 0,1-1,0-10 és 100 μg/ml-es oldatot készítünk 0,1 M Tris-pufferrel, mely 0,02% humán albumint tartalmaz, pH=8,5.

b) A mosófolyadék leszívása után az alvadókra (M1. módszer) teszünk 400 μΙ peptidoldatot (minden koncentrációban 3-3 párhuzamos minta), illetve kontrollként 400 μΙ puffért, és 5 percig inkubáljuk 37 °C-on. Ezt követően hozzáadunk 100 μΙ 2 mM-os Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA szubsztrátoldatot, további 30 percet inkubáljuk 37 ’C-on, majd 100 μΙ 50%-os ecetsavval leállítjuk a reakciót.

c) Minden reakcióelegyből 150-150 μΙ-t teszünk egy 96 lyukú lemez (96-well microtitre plate) mélyedéseibe, és 405 nm-en meghatározzuk az extinkciós értékeket (ELISA READER SLT Laborinstrument GmbH, Austria). A kontrolihoz viszonyított, átlagolt extinkcióértékekből grafikusan meghatározzuk az 50%-os gátláshoz szükséges peptidkoncentrációt (IC50)·

M3. módszer

Plazmaalvadékba zárt trombin gátlásának meghatározása

a) A peptidinhibitorból oldatokat készítünk az M2. módszer a) pontjában leírtak szerint.

b) A mosófolyadék leszívása után az alvadókra (M1. módszer) teszünk 400 μΙ peptidoldatot (minden koncentrációban 3-3 párhuzamos minta), illetve kontrollként 400 μΙ puffért, és 5 percig inkubáljuk 37 ’C-on. Ezt követően hozzáadunk 100 μΙ 1 mM-os Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztrátoldatot, további 30 percet inkubáljuk 37 ’C-on, majd 100 μΙ 50%-os ecetsavval leállítjuk a reakciót. A továbbiakban az M2. módszer c) pontja szerint járunk el.

M4. módszer Fibringél készítése

a) Egy-egy reakcióedénybe 200 μΙ 6 mg/ml-es humán fibrinogént (SIGMA), 25 μΙ 25 NIH E/ml-es humán trombint (SIGMA) és 40 μΙ 100 mM-os kalcium-kloridot teszünk, és állni hagyjuk 1 órán át 20-22 ’C-on. A kialakult fibringélt 3*2 ml fiziológiás konyhasóoldattal mossuk enyhe keveréssel és 5 perc ülepítéssel, hogy az oldatban maradt trombint eltávolítsuk. A mosás eredményességét az M1. módszer c) pontja szerint ellenőrizzük.

HU 224 426 Β1

M5. módszer

Fibringélhez kötött trombin gátlásának meghatározása

a) A peptidinhibitorokból 0,1-1,0-10 és 100 μρ/ηιΙ-θβ oldatot készítünk Hepes/NaCI pufferrel (0,01 M Hepes és 0,1 M nátrium-klorid, pH=7,4).

b) A továbbiakban az M3. módszer b) pontja szerint járunk el.

M6. módszer

Xa faktor gátlásának mérése oldatban 96 lyukú lemezen (96-well microtitre plate)

a) AXa faktorból (humán, SIGMA) 1,3 E/ml-es, a peptidinhibitorokból 0,1-1,0-10 és 100 pg/ml-es oldatokat készítünk foszfátpufferrel (0,1 M nátrium-foszfát és 0,05 M nátrium-klorid, pH=7,4). A Bz-lle-GluGly-Arg-pNA szubsztrátból 0,33 nM-os desztillált vizes oldatot használunk.

b) A kontroliból és minden egyes peptidoldatból 3-3 reakcióelegyet készítünk. A lemez mélyedésébe teszünk 30 μΙ peptidet, illetve kontrollként puffért, 30 μΙ Xa faktort, 90 μΙ puffért és 150 μΙ szubsztrátot, majd 10 perc múlva 405 nm-en leolvassuk az extinkcióértékeket. A továbbiakban az M2. módszer

c) pontja szerint járunk el.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. (I) általános képletű új peptidil-arginin-aldehid-származékok Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol

Q jelentése Q’-O-CO- képletű acilcsoport, mely képletben

Q’ jelentése 1-3 szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése D-ciklohexil-glicin- vagy D-ciklopentil-glicín-gyök,

Pro jelentése L-prolin-gyök és

Arg jelentése L-arginin-gyök és ezek szerves vagy szervetlen savval képzett savaddíciós sói.
2. Etoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
3. Metoxi-karbonil-D-ciklohexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
4. Etoxi-karbonil-D-ciklopentil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
5. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely (I) általános képletű vegyületet, ahol Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy ennek valamely gyógyászatilag elfogadható sóját - tartalmazza, a gyógyászatban szokásosan alkalmazott oldó-, hígító-, hordozó- és töltőanyagok kíséretében.
6. (I) általános képletű vegyületek - ahol Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése az 1. igénypontban megadott gyógyszerként való alkalmazásra.
7. (I) általános képletű vegyületek - ahol Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése az 1. igénypontban megadott - alkalmazása trombózissal és/vagy fokozott véralvadékonysággal járó állapotok kezelésére és megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.