HU204562B - Process for producing recombinant dns-sequency codin human proapolypo-protein a-i, expressing vector containing them, transformed hoste celle and human proapolypoprotein a-i - Google Patents
Process for producing recombinant dns-sequency codin human proapolypo-protein a-i, expressing vector containing them, transformed hoste celle and human proapolypoprotein a-i Download PDFInfo
- Publication number
- HU204562B HU204562B HU882707A HU270788A HU204562B HU 204562 B HU204562 B HU 204562B HU 882707 A HU882707 A HU 882707A HU 270788 A HU270788 A HU 270788A HU 204562 B HU204562 B HU 204562B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- human
- sequence
- dna sequence
- dna
- proapo
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
A találmány a humán proapolipoprotein A-I-et kódoló, új rekombináns DNS-szekvencia előállítására, klónozására, a fenti DNS-szekvenciát tartalmazó expressziős vektor előállítására, a fenti expressziős vektorral gazdasejtek transzformálására, és a fenti új rekombináns 5 DNS-szekvenciák, vektorok és transzfonnánsok alkalmazásával humán proapolipoprotein A-I előállítására vonatkozik.
A humán apolipoprotein A-I (továbbiakban apó A-I) a nagy sűrűségű lipoproteinek (továbbiakban HDL) és 1 0 a nyirok-chylomicronok fő proteinkomponensét képezik. Az apó A-I elsődlegesen a májban és a vékonybélben szintetizálódik. Afenti szervekben az apó A-I prekurzor protein (preproapo A-I) formájában keletkezik.
A prepeptid transzlációval egyidejű hasítása intracellu- 15 Iárisan megy végbe, és a proapo A-I a plazmába és a nyirokba választódik ki.
A proapo A-I az apó A-I ammoterminális végéhez kapcsolódva egy hat aminosavból álló szekvenciát (Aig-His-Phe-Tip-Gln-GIn) tartalmaz. Az érrendszerbe 20 kerülve a proapo A-I-et egy specifikus proteolitikus enzim, az apó A-Ipropeptidáz in vivő hasítja, a hasítás eredményeként érett apó A-I keletkezik.
Az érett apó A-I egy egyszerű, nem glükoziláltpolipepíid, amely ismerten 243 amihosavmaradékot tártál- 25 máz {H. B. Brewer és munkatársai: Biochem. Biophys.
Rés. Commun. 80,623-630 (1978)]; és egy plazmaenzim, a lecitin-koleszterin-acil-transzferáz kofaktoraként szolgál, amely a plazmában a legtöbb koleszterinészter képződéséért felelős. Az apolipoprotein szeike- 30 zetének vagy bioszintézisének hibái a plazma Iipidtranszport-rendszerrendellenességeit és a szívkoszorúér-betegségek kifejlődését eredményezhetik. Az apó A-I és a HDL alacsony plazmaszintje bizonyítottan nagy rizikófaktort jelent a szívrohamok (miokardiális 35 infarktus) vagy más atherosclerosisos érrendszeri betegségek megjelenésében. Az apó A-I-et kódoló génben jelentkező mutációk közelebbről a csökkent HDLszmífel és a korai szívkoszorúér-betegségekkel vannak összefüggésben. 40
Az apó A-I és a HDL azok a fő komponensek, amelyek részt vesznek a koleszterin transzportjában a perifériás szövetekből (artériákból) a májba (úgynevezett fordított koleszteriníranszport), a szervezetből való kiürítés céljából. Mivel a koleszterin artériákban való 45 felszaporodása az atherosclerosis legbiztosabb jele és legfontosabb folyamata, a fordított koleszterintranszport serkentése az apó A-I alkalmazásával késleltetheti vagy megfordíthatja az atherosclerotikus folyamatot, és így csökkentheti a szívrohamok előfordulását. 50 A proapo A-I apó A-I-gyé való átalakulása (úgynevezett érése) kvantítatíven és extracellulárisan játszódhat le, a vérben való, 12 óránál kevesebb tartózkodási idő alatt Mivel a proapo A-I a fő, ha nem egyetlen prekurzora az érett apó A-I-nek, csökkent HDL-szintek 55 - például öröklött vagy szerzett hiány - esetén helyettesítéses terápiában alkalmazható. Az apó A-I általános terápiás alkalmazhatósága miatt olyan eljárásokat kellett találni, amelyek segítségével az apó A-I nagy mennyiségben előállítható. Az apó A-I előállításának 60 szokásos módja a vérplazmából való tisztítás. Számos közlemény szerint [P. Cheung és L. Chan: Nucleic Acid Rés. 11,3703-3715 (1983); Seilhamer és munkatársak DNA 3, 309-317 (1984); és 96 998/86 számú ‘ japán szabadalmi leírás] a preproapo A-I-et kódoló komplementer DNS ismert géntechnológiai eljárásokkal előállítható. R. Lorenzetti és munkatársai [FEBS Lett. 194, 343-346 (1986)] kimutatták, hogy az apó A-I E.coliban, mint β-galaktozídázzal alkotott, nemhasadó, fuzionált protein fejeződik ki. Azonban az érett apó A-I nem füzionált proteinként való kifejezésére irányuló kísérletek sikertelenek voltak.
A fent említett 96 998/86 számú japán szabadalmi leírásban ismertették egy humán apolipoprotein A-Iszerű protein kifejezését E.coliban, amelyet előzőleg a tac-promotor kontrollja alatti apó A-I struktúigént tartalmazó pHAIE-I plazmiddal transzformáltak. A struktúrgén azonban nem teljes, egy ATG transzlációs inicíálő kodon után a +4-+243 aminosavszekvenciát kódoló kodonokat tartalmazza. Ennek következtében az expressziós termék N-terminális metíonint tartalmaz az ATG-kodonnak megfelelően -, ami a terápiás alkalmazás során mellékhatásokat okozhat.
J. B. Mallory és munkatársai [J. Bioi. Chem. 262, 4241-4247 (1987); WO 86/04 920 és WO 87/02 062 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés] ismertették a humán apolipoprotein A-I expresszióját kínai hörcsög petefészeksejtben (állati sejttenyészetben). Az alkalmazott konstruktum a teljes humán preproapolipoprotein A-I gént tartalmazta. A kínai hörcsög petefészeksejtek úgy tűnik, hogy átalakítják a proapoformát érett apoformává, mivel a kiürített apó A-I-nek csak 5-10%-a van proapo A-I formában, a többi érett apó A-I protein formájában van. A rendszer hozama azonban viszonylag alacsony, mivel 0,5540® sejt csak 25-30 pg/ml apó A-I-et űrit ki, 24 óra alatt.
A WO 87/02 062 számú nemzetközi szabadalmi leírásban néhány példában ismertetik a humán apolipoprotein A-I kifejeződését más gazdasejtben - például E.coliban (bakteriális gazdasejt) és S.cerevisiae-ben (élesztősejt). A felhasznált konstrumok egyike sem tartalmazza azonban a proapoforma genetikai információját, és a kapott protein nem azonos a humán proapolipoprotein A-I-gyel.
A találmány célja a humán proapolipoprotein A-I rekombináns DNS-technikával való előállítására szolgáló eljárás kidolgozása volt, amellyel olyan érett proapo A-I protein állíthatő elő, amely a specifikus proteolitikus apó A-Ipropeptidáz enzimmel hasítható.
A leírásban érett proapo A-I alatt nemcsak a humán proapo A-I-et magát értjük, hanem a megfelelőproteint is, amely a szekvencia előtt első aminosavként metionint tartalmaz, az expressziós vektor konstruktumban lévő ATG transzlációs iniciálé kodon következtében.
A találmány a humán proapo A-I-et kódoló DNSszekvenciát tartalmazó klónozó konstruktumok és expressziős vektorok előállítására is vonatkozik, amelyek lehetővé teszik az érett humán proapo A-I protein, valamint Met-, fuzionált vagy szignál N-terminális konjugátumainak felerősítését, és ezáltal kifejeződését.
HU 204 562 Β
A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti vektorokat tartalmazó, és ezáltal humán proapo A-I polipeptid termelésére képes, genetikailag megváltoztatott élő sejttenyészetek vagy mikroorganizmusok előállítására.
A találmány tárgya továbbá eljárás humán proapo A-I előállítására, olyan fizikai állapotban, amely különbözik a természetes környezetből vagy forrásból izolált, vagy abban található proapo ΑΊ-től, amennyiben a találmány szerinti eljárással előállított humán proapo A-I lényegében nem tartalmazza a szokásos endogén proteineket vagy más természetes kísérőanyagokat.
A találmány szerinti, humán proapo A-I rekombináns DNS-ének előállítására szolgáló eljárást nem kívánjuk semmiféle szempontból korlátozni pusztán a példákban ismertetett specifikus megoldásokra.
A találmány egyik fő jellemzője olyan protein előállítása, amely az érett, humán proapo A-I-ből áll, vagy azt tartalmazza, és így in vitro és in vivő érett, humán apó A-I-gyé alakítható, az apó A-I propeptidáz proteolitikus hatását felhasználva. Gyógyászati célra a kapott humán proapo A-I terméket magát alkalmazhatjuk, beleértve a Met-proapo A-I-et is, ha a metioninmaradék jelenléte gyógyászati szempontból elfogadható, mivel a fenti termék természetes módon, a véráramban természetes körülmények között előforduló propeptidáz hatására megfelelő módon érett, humán apó A-I-gyé alakul. Kívánt esetben a humán proapo A-I-gyet olyan mikroorganizmusban vagy sejttenyészetben is termelhetjük, amely képes az N-terminális metionin eltávolítására, és így ezekben a tenyészetekben a humán proapo A-I termék aminoterminális metionin nélküli formában keletkezik. A humán proapo A-I terméket - tekintet nélkül arra, hogy az tartalmaz-e aminoterminális metioninmaradékot - in vitro is elhasíthatjuk érett, humán apó A-I-gyé, amelyet azután gyógyászati célra használhatunk fel. Ugyanez érvényes a proapo A-I fúziós vagy szignál N-terminális konjugátumaira is: a hasítás eredményeként N-terminális metionint nem tartalmazó, autentikus humán apó A-I keletkezik.
A találmány másik fő jellemzője, hogy legalább a humán proapo A-I molekula egy részét kódoló olyan módosított kódolószekvenciát használunk, amelynek transzlációs hatásfoka a csökkent mértékű, vagy kiküszöbölt hajtűképződés (hairpin formation) miatt jobb. Lehetséges, hogy R. Lorenzetti és munkatársai [FEBS Lett. 194, 343-346 (1986)] azért nem voltak képesek kimutatni a nemfuzionált érett apó A-I protein kifejeződését, mivel az általuk készített DNS-molekula érzékeny volt a hajtűhurok kialakulására, amelynek eredményeként az expresszió nem volt megfelelő mértékű. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy megfelelő mértékű expressziót biztosíthatunk a humán proapo A-I -6—1-14 aminosavszekvenciáját kódoló szekvenciában néhány kodon megfelelő módosításával. Megfelelő módosítás alatt azt értjük, hogy a természetes kodonok némelyikét alternatív kodonnál, azaz olyan kodonnál helyettesítjük, amely a genetikus kód szerint ugyanazt az aminosavat kódolja; továbbá azt jelenti, hogy a módosítások összességükben a hajtűképződés csökkenését, vagy éppen elmaradását eredményezik. Meg kell jegyeznünk, hogy a DNS-szekvencia módosítása nem befolyásolja a propeptidáz hasítási hely természetét, mivel a propeptidáz által felismert aminosavszekvencia megőrződik a konstruktumban.
Proteinszinten a találmány szerinti eljárás humán proapo A-I előállítására vonatkozik, genetikusán megváltoztatott sejttenyészet vagy mikroorganizmus segítségével. A fenti humán proapo A-I érett proapo A-I formában, metioninmaradékkal kezdődő érett proapo A-I formájában, fuzionált protein formájában - például fuzionált β-galaktozidáz-proapo A-I protein formájában-és preproapo AI termék formájában lehet. A tennék lényegében mentes a szokásos endogén proteinektől és más természetes anyagoktól, amelyek a természetes forrásból (vérplazmából) izolált protein kísérői. Az eljárásban használt sejttenyészet vagy mikroorganizmus nem korlátozódik specifikus sejtvonalakra vagy mikroorganizmusokra; mind prokariota, mind eukarióta sejtek használhatók, beleértve az állati és emberi sejtvonalakat is. Szemléltetés céljából a leírás példáiban az E.coli baktériumban - mint prokariotasejtben -, és a Saccharomyces cerevisiae élesztősejtben, valamint baculovírussal fertőzött rovarsejtekben mint eukariotasejtekben - való kifejeződését ismertetjük.
A találmány szerinti eljárással előállított humán proapo A-I propeptidázos kezelésével előállíthatjuk a humán apó A-I-et. A fenti humán apó A-I azonos az érett humán apó A-I autentikus formájával, és nem tartalmaz aminoterminális végén metioninmaradékot.
A humán proapo A-I-et és/vagy humán apó A-I-et gyógyászati készítmények hatóanyagaként használhatjuk. A gyógyászati készítmények a hatóanyagon kívül legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, hígítóanyagot vagy egyéb segédanyagot tartalmaznak, amelyeket a gyógyászati készítmények előállításánál szokásos megfontolások alapján választunk meg.
DNS-szinten a találmány szerinti eljárás a humán proapo A-I-et kódoló olyan rekombináns DNS-szekvencia előállítására vonatkozik, amelyben a természetes kódolószekvencia egy része a hajtűképződés csökkentésére vagy kiküszöbölésére ugyanazon aminosavakat kódoló, de eltérő nukleotidszekvenciából álló DNS-fragmenssel helyettesítjük, oly módon, hogy a proapo A-I -6-+14 aminosavjait kódoló természetes kódolószekvenciát helyettesítjük az alábbi szekvenciával (csak az egyik szálat mutatjuk be):
’-ATGAGACATITCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTGCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG-3’ a fenti szekvencia egy pótlólagos ATG transzlációs iniciáló kodont, és a -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 és +14 aminosavakat kódoló módosított kodonokat tartalmaz.
DNS-szinten a találmány szerinti eljárás replikálható klónozó vektorok és expressziős vektorok előállítására is vonatkozik, amelyek a humán proapo A-I-et kódoló fenti rekombináns DNS-szekvenciát tartalmazzák. A találmány szerinti eljárás különösen a pULB9291, pULB9292, pULB9296, pULB9299, pNIV1612 és pNIV1613 rekombináns plazmidok előállítására vonatkozik, amelyek megszerkesztését a leírásban ismertetjük.
HU 204562 Β
ApULB9291 és pULB9292plazmidok tartalmazzák a módosított proapo A-I szerkezeti gént, amelyet egy ATG-kodon elóz meg, és a lambda-fág Pl promotor kontrollja alatt áll. Ezek a plazmidok megfelelő expressziós vektort jelentenek az E.coli számára, és a humán proapo A-I szintézisét irányítják, amelyet a propeptidáz érett humán apó A-I-gyé tud hasítani.
A pULB9296 plazmid E.coliba építve β-galaktozidázből és humán proapo A-I-ból álló fuzionált protein kifejeződését irányítja, az E.coli Iac-promotorrégió kontrollja alatt. Mivel a fuzionált protein is tartalmazza a propeptidáz hasítási szekvenciáh humán apó A-I-gyé alakítható hasítással.
ApULB9299 plazmidélesztő számára jelent megfelelő expressziős vektort, és az élesztőben való megfe- 1 lelő kifejeződés biztosítására ARG3 promotort és transzkripciós terminátoirégiót tartalmaz. Az így kapott humán proapo A-I tennék propeptídázzal szintén autentikus érett humán apó A-I-gyé hasítható.
A pNIV1612 plazmid az E.colí ompA-protein szig- 2 nálpeptidjéhez fuzionálva tartalmazza a proapo A-I szerkezeti gént, és az Ipp (lipoprotein) promotor és a lac-promotoroperátor kontrollja alatt áll. A fenti konstruktumban az ompA-szignálpeptidet kódoló szekvencia megelőzi az ATG transzlációs inicíálő kodon nélkffi- 2 li, proapo A-I-et kódoló szekvenciát. A plazmid megfelelő szekréciós vektort jelent E.coliban, és a humán proapo A-I szintézisét irányítja, amely az N-tenninális metionin nélkül ürül a periplazmába.
A pNIV1613 plazmid egy transzfervektor a humán 3 proapo A-I cDNS-szekvencia bevitelére baculovírusba. Tartalmazza a baculovírus polihedrin promotorát, és a proapo A-I szerkezeti gént, beleértve az ATG transzlációs űnciáló kodont is. A vad típusú baculovírussal (Autographa califomia nuclear polyhedrosis vírus, 3! AcNPV) összekapcsolva a pNIV1613 irányítja a rovarsejtekben végbemenő poszttranszlációs módosításokkal eltávolítható.
A találmány szerinti eljárás a fenti klónozó vektorral vagy expressziós vektorral transzformáit sejttenyésze- 4( tek és mikroorganizmusok előállítására is vonatkozik, közelebbről olyan, transzformált sejttenyészetek és mikroorganizmusok előállítására, amelyek képesek humán proapo A-I termelésére. A „transzformált” kifejezés alatt itt „genetikailag módosított”-at értünk, és nem 4£ a szűkebb, „bakteriális transzformálás” kifejezést. Az alkalmazott vektortól és a választott gazdasejttől függően bármely géntechnológiai eljárás alkalmazható, amellyel a kívánt genetikai módosítás végrehajtható, például transzfekció, transzdukciő stb. A találmány 50 szerinti eljárással előállított sejttenyészeteket és mikroorganizmusokat ipari méretekben alkalmazhatjuk humán proapolipoprotein A-I fermentációs előállítására.
A találmány szerinti eljárásban többek között E.coli K12 MM 294 törzset (endoA thi-, hsdR, supE) használunk; ez a törzs szabadon hozzáférhető az American Type Culture Collection-nél (letétbe helyezés dátuma: 1981.07.20; száma: ATCC 33 625). Azonban használhatunk más mikroorganizmus-törzseket is, például ismert E.coli törzseket, így E.coli B-t, E.coli«1776-ot (ATCC 31 537, korlátozás nélkül letétbe helyezve
1979. 07. 03-án), E.coli AR58-an N 99-et (ATCC 33
956), cHI·, cl 857, bio, lambdahiányos delta H funkciós származékokat, amelyeket a PL-PHARMACIA hoz forgalomba [J. E. Mott és munkatársai: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82, 88-92 (1985); G. Devare és munkatársai: Cell, 36,43-49 (1984)]; E.coü JMlOl-et (ΑΓCC 33 876; letétbe helyezés napja: 1982. 05. 10.) [J. Messing és munkatársai: Nueleic Acids Res. 9, 309[ 0 321 (1981)], vagy E.coli JA221-et (Ipp', hdsM+, trpE5, leuB6, lacY, recAPF’, laqH, lac+, pro+) [J. Ghrayeb és munkatársai: EMBO J., 3, 2437-2442 (1984)], vagy egyéb, ismert törzsgyűjteményekben, például az American Type Culture Collection-nél (ATCC) letétbe hely5 zett és a köz számára hozzáférhető mikroorganizmustörzseket. Ilyen törzsek például a Bacillusok, például a Bacillus subtilis és egyéb Enterobacteriaceae-k, többek között a Salmonella typhimurium és Serratia marcescens, amelyek felhasználják a plazmidokat, úgy, hogy azok bennük replikálódni képesek, és heterológ génszekvenciát tudnak kifejezni.
A baktériumokban, például E.coliban használható expressziős plazmidok rendszerint pBR322 plazmidból, mint vektorból (ATCC 37 017) származtathatók, oly módon, hogy a heterológ génszekvenciát megfelelő transzlációs start és stop jelekkel együtt megfelelően beillesztjük a plazmidba, funkcionális promotorral működőképes leolvasőrendszert biztosítva, a közönséges yagy szintetikusan kialakított restrikciós helyek segít3 ségével. A vektor egy vagy több fenotípusos szelekciós jellemző gént fog hordozni, és a gazdasejtben való sokszorozódás biztosítására egy replikációs kezdetet. A heterológ beillesztett DNS-szekvenciát úgy is csatlakoztathatjuk, hogy például egy lac-rendszer génből ) származtatható fuzionált preszekvenciával együtt fejeződjön ki.
A baculovírus expressziős vektorokat, például a pAcYMl-et [Y. Matsuura és munkatársai: J. Gén. Vírol. 68,1233-1250 (1987)] és a vad típusú baculovírust (AuI tographa califomia nuclear polydedrosis vírus, AcNPV) ma már széles körben alkalmazzák, a szakirodalomban részletesen ismertetik ezeket, és például a Texas Agricultural Experiment Síation-tól beszerezhetők.
A találmány szerinti eljárásban különféle rovarsejteket is használhatunk gazdasejtként az ezekkel összeférhető expressziós vektorok számára, például Spodoptera frugiperda Sf9 sejteket [M. D. Summer és G. E. Smith:
A Manual of Methods fór Baculovírus Vectors and Insect cell culture Procedures, Texas University, College Síatíon (1987); ATCC CRL1711].
A találmány szerinti eljárásban különféle élesztőtörzseket is használhatunk gazdasejtként az ezekkel öszszeférhető expressziós vektorok—például YRp7 [D. T. Stinchcomb és munkatársai: Natúré, 282, 39-43 (1979)] - számára, amelyek mind E.coliban, mind élesztőben, különösen Saccharomyces cerevisiae-ben képesek szelektálódni és replikálódni. Élesztőtörzsként például RH218-at [G. Miozzari és munkatársai: J. Bacteriol. 134, 48-59 (1987)] használhatunk, amelyet korlátozás nélkül helyeztek letétbe az ATCC-nél (letéti
HU 204562 Β száma: 44 076); továbbá 10S44c törzset [T. Cabezon és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 65946598 (1984)], amely leu2-3, leu2-112, pep4-3 genotípussal rendelkezik [M. Hoylaerts és munkatársai: FEBS Lett. 204,83-87 (1986)].
Heterológ gén - például a humán proapo A-I-et kódoló cDNS - kifejezésére élesztőben, egy négy komponenst tartalmazó plazmidvektort kell szerkeszteni.
Az első komponens az a rész, amely mind E.coliban, mind élesztőben biztosítja a transzformálást, és így mindegyik organizmus számára szelektálható gént kell tartalmaznia. Ez lehet például az E.coliból származó ampicillin-rezisztencia-gén (rövidítve AmpA) és az élesztőből származó leu2 gén. A fenti komponensnek egy replikációs origót is tartalmaznia kell mindkét mikroorganizmus számára, hogy a plazmid-DNS mindkét organizmusban fennmaradjon. Ez például a pBR322ből származó E.coli origó, és az élesztő III. kromoszómájából származó arsl origó, vagy a 2 μ-cirkuláris DNS-ből származó replikációs origó lehet.
A plazmid második komponense egy erősen kifejeződő élesztőgénből származó 5’-határoló szekvencia, egy 3’-végen lévő szerkezeti gén transzkripciójának elősegítésére. A fenti 5’-határoló szekvencia (5’-flanking sequence) TDH3 és ARG3 élesztőgénekből származhat. A fragmentumot úgy szerkeszthetjük meg, hogy a TDH3 vagy ARG3 szerkezeti szekvenciákat eltávolítjuk, és egy alternatív restrikciós helyeket például Ncol vagy BamHI helyet - tartalmazó szekvenciával helyettesítjük, a fenti 5’-határoló szekvenciának a szerkezeti génhez való kapcsolására alkalmas kapcsolással. A plazmid harmadik komponense egy szerkezeti gén, amelyet úgy szerkesztünk meg, hogy az mind egy ATG transzlációs start jelet, mind egy transzlációs stop jelet tartalmazzon.
A negyedik komponens egy élesztőgén 3’-határoló szekvenciáját tartalmazó élesztő DNS-szekvencia, amely megfelelő jeleket tartalmaz a transzkripció befejezésére és a poliadenilációra. Például a humán proapo A-I élesztőben való képződését irányító plazmidokat úgy szerkeszthetjük meg, hogy a humán proapo A-I polipeptidet kódoló génfragmentumokat a pRIT 10 774 expressziós plazmid BamHI helyére illesztjük, a 151 102 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett módon.
Az ábrákat az alábbiakban ismertetjük.
Az 1. A és B ábrán a humán preproapo A-I nukleotidés aminosavszekvenciája látható. A humán preproapo A-I mRNS nukleotidszekvenciáját a pULB1609 cDNS-klón DNS-szekvenciájának analízisével határoztuk meg. A szignálpeptid, a propeptid és az érett apó A-I polipeptid válható aminosavszekvenciáját az apó A-I protein első aminosavmaradékától kezdődően mutatjuk be és számozzuk. A klón izolálására használt szintetikus DNS-mintának megfelelő régiót aláhúztuk.
Az aminosavak egybetús rövidítési az alábbiak:
A-alanin, C-cisztein, D-aszparaginsav, E-glutaminsav, F-fenil-alanin, G-glicin, H-hisztidin, I-izoleucin, K-lizin, L-leucin, M-metionin, N-aszparagin,
P-prolin, Q-glutamin, R-arginin, S-szerin, T-treonin, V-=valin, W=triptofán és Y=tirozin.
A 2. ábrán látható az érett apó A-I polipeptid első 14 aminosavját és propeptid 6 aminosavját az ATG iniciáló kodonnal együtt kódoló DNS-szekvencia szerkesztéséhez szükséges oligonukleotid-adapter. A nyilak a 65/61 bázispárt tartalmazó Nco-Ball fragmentum szintetizálásához használt oligonukleotidokat jelzik.
A 3. ábra a Pl lambda-regulátonégiót és proapo A-I nukleotidszekvenciát hordozó pULB9291 szerkezetét mutatja.
A 4. ábrán látható az E.coli lac-promotort és egy fuzionált β-galaktozidáz-proapo A-I nukleotidszekvenciát hordozó pULB9296 szerkezete.
Az 5. ábra az élesztő ARG3 regulátorrégiót és a proapo A-I nukleotidszekvenciát hordozó pULB9299 szerkezetét mutatja.
A 6.A, B és C ábra mutatja a lac- és lpp-regulátorrégiókat, az ompA-szignálpeptidet kódoló szekvenciát és a proapo A-I nukleotidszekvenciát hordozó pNIV1612 szerkezetét.
A 7. ábrán látható a polihedringén regulátorrégiót és a proapo A-I nukleotidszekvenciát hordozó pNIV1613 szerkezete.
A találmányt közelebbről az alábbiakban ismertetjük.
RNS preparálása
Emberi májból preparáljuk az összes RNS-t guanidium-kloridos eljárással [R. A. Cox: Methods Enzymol. ΧΠ, B. rész, 120-129. oldal (1986)]. A kapott összRNS-t ezután oligo(dT)-cellulóz-oszlopon átfolyatva kapjuk az összes poliA+RNS-t [T. Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) 1982]. 10 g emberi májból 200 pg poliA+RNS-t kapunk.
Komplementer DNS (cDNS) in vitro szintézise
0,1-5 pg össz-poliA+RNS-t tartalmazó reakcióelegyben, primerként közelítőleg 1 pg oligo(dT)i2-is-at (Boehringer) használva játszatjuk le a reverz transzkripciós reakciót. A kapott egyszálú cDNS-t ezután ugyanezen reverz transzkriptáz enzimmel alakítjuk kettős szálú DNSsé (cDNSds). A cDNSds-készrtményt - rendszerint 1 pgot - Sl-nukleázzal kezelve alakítjuk ki a ragadós végű (bluntended) fragmenseket. A fenti eljárást részletesen például Maniatis és munkatársai ismertetik fent idézett munkájukban. A cDNSds-t ezután oligo(dC)-farokkal látjuk el, L. Villa-Komaroff és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3727-3731 (1978) eljárása szerint. Rendszerint 100 ng cDNSds-t kezelünk a terminális dezoxinukleotidil-transzferáz enzimmel. Általában 15 bázis hosszúságú szakaszokkal toldjuk meg a cDNSds-molekula 3’-végét.
Oligo(dC)-végíi cDNSds klónozása pBR322 plazmidvektorba
A pBR322 plazmid-DNS-t Pstl enzimmel linearizáljuk, és oligo(dG)-farokkal látjuk el, R. M. Lawn és munkatársai [Nucleic Acid Rés. 9, 6103-6114 (1981)] módszere szerint. Az oligo(dC)-végű cDNSds-t oli5
HU 204 562 Β go(dG)-véj*űpBR322 DNS-sel elegyítjük, ekvimoláris arányban. Általában 50 gg elegyet temperálunk, a plazmid recirkularizálására. A rekciókörülmények például R. M. Lawn és munkatársai fent idézett munkájából ismertek. A temperált elegyet ezután a megfelelő E.coli sejtek (MM294 törzs) transzformálására használjuk, R. M. Lawn és munkatársai fent idézett munkájában leírtak szerint. A tetraciklin jelenlétében való tenyésztés alapján szelektálva néhány száz transzformánst kapunk, a fenti antibiotikummal szembeni rezisztencia a plazmidnak köszönhető. A transzformánsok ampicillinnel szembeni érzékenységét is megvizsgáljuk. Az érzékenynek talált transzformánsok hamis plazmidot tartalmaznak, mivel az idegen DNS beillesztése a vektorba inaktiválja az ampicillingént.
cDNS-génkészlet vizsgálata
Az E.coli transzformánsokat 5’-végen 32P-raI jelzett, az apó A-I gén egy fragmensének megfelelő szintetikus oligonuHeotíddal vizsgáljuk. A humán apó A-I nukleotidszekvenciája ismert [lásd P, Cheung és L. Chan fent idézett munkáját, és J. J. Seilhamer és munkatársai fent idézett munkáját], ezért célszerűen kémiailag szintetizálunk N. D. Sinha és munkatársai [Nucleic Acids Rés. 12,4539-4557 (1984)] módszere í szerint egy 22 bázis hosszúságú oligonuHeotid-mintát, amely a gén 5’-végének felel meg. A választott szekvencia az alábbi.'
5’-GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCG-3’.
A szintetikus oligonukleotidot 5’-végén foszforilez- í zük, T4 polinukleotid-kinázt (P-L Biochemicals) és (gamma-32P/AIP-t használva, a hibridizációs kísérlet előtt. A radioaktív jelzés és a híbridizálás körülményei ismertek, például részletesen T. Maniatis és munkatársai ismertetik fent idézett munkájukban, vagy A. Bol- 2 len és munkatársai [DNA2,255-264 (1983)].
Expressziós plazmidok szerkesztése A DNS-preparátumok előállítása, a DNS-fragmentumok izolálása, valamint a restrikciós enzimanalízis és a 4 fragmensek ligálásának körülményei ismertek, például R. M. Lawn és munkatársai, és T. Cabezon és munkatársai fent idézett munkájából. Az expressziós vektor promotorát és a gén 5’-végét összekötő fragmentumok szintézisét az alábbiakban ismertetjük. 4
Ncol-Ball fragmentum szintézise A 65/61 bázispárttól álló Nco-Ball fragmentum szintéziséhez használt 35-mer, 30-mer, 18-mer és 43mer oligonukleotidok szerkesztését elvileg a 2. ábrán 51 részletesen ismertettük. A 30-mer és 18-mer szintetikus fragmentumokat 5’-végükön polinuHeotid-kináz (P-L Biochemicals) alkalmazásával foszforilezzük.
Az egyes oligonukleotidok 1 gg-ját - beleértve a foszforilezetlen 35-mert és 43-mert is - 3 percen 5í keresztül 95 ’C-on együtt melegítjük, 300 mmól/1 koncentrációjú nátrium-acetát-pufferben (pH 7,0), majd lassan 4 °C-ra hagyjuk hűlni. A hőkezelési reakciót magát az expressziős plazmidok szerkesztésére szolgáló klónozó eljárásban használjuk. 6C
DNS-szekvenciaanalízis
A DNS-szekvencia meghatározását A. M. Maxam és W. Gilbert [Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 74,560-564 (1977)] és F. Sanger és munkatársai [Proc. Natl. Acad. ί Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] módszere szerint végezzük.
Proteinanalízis
A pULB9291, pULB9296, illetve pULB9299, hu) mán proapo A-I expressziős plazmidokat hordozó, transzformált E.coli AR58, JM101, illetve 10S44c élesztőtörzsek fermentálásának különböző időpontjaiban vesszük az 1 ODóm egység sejttömeget tartalmazó mintákat. Minden egyes mintát 2% nátrium-dodecil> szulfátot (SDS-t), 6 mól/l karbamidot, 10% glicerint és 5% 2-merkapto-etanoIt tartalmazó 50 mmól/1 koncentrációjú Trisz-HCl-pufferben újraszuszpendálunk, és 3 percen keresztül forralunk. A mintákat poli(akrilamid)gélen [U. K. Laemmli: Natúré, 227 680-685 (1970)] l elektroforetizáljuk. Az összproteint Comassie Brilliant
Blue festéssel tesszük láthatóvá, és a keletkezett humán proapo Á-I-et Western biot analízissel (A. Bollen és munkatársai fent idézett munkája) azonosítjuk.
Rekombináns vektorok szerkesztése a humán proapo A-I kifejezésére baktérium-, élesztő- és baculovírussalfertőzött rovarsejtekben 1) Kezdő cDNS-klón humán preproapo A-I-hez: pULB1609 (Lábra)
A humán máj poliA+RNS-nek megfelelő cDNSdsnek a pBR322Pstl helyére klónozásával kapott néhány száz transzformánst a fent ismertetett szintetikus 22mer apó A-I mintával szűrővizsgálatnak vetjük alá. A vizsgálat során egy Hón erős hibridizációs jelet adott. Ezt a Hónt - amelyet a pUBL1609-nek jelöltünk visszanyerjük, és a rekombináns plazmidban jelen levő beillesztett DNS-fragmentumot DNS-szekvenciaanalízissel jellemeztük. Hossza 878 bázispár (bp), és a teljes hosszúságú preproapo A-I-et kódolja. Amint az 1. ábrán látható, a Hőnozott cDNS-fragmentum 5’- és 3’nemkódolő régiókat hordoz (19, illetve 55 bázispár), az 54 bázispárból álló szekvencia kódolja a prekurzor peptidet (24 - 7. aminosav), a 18 bázispárból álló szekvencia kódolja a propeptidet (6 -1. aminosav) és a 732 bázispárból álló szekvencia kódolja az érett apó A-I-et (1 — 243. aminosav), beleértve a transzlációs stopkodont is. A DNS-szekvenciából következtetett aminosavszekvencia tökéletes összhangban van a protein analízisével kapott aminosavszekvenciával, és a függetlenül izolált preproapo A-I-et kódoló cDNSHőnnal [W. C. Barker és munkatársai: Comp. Biochem. Physiol. 57B; 309-315 (1977); 96 998/86 számú japán szabadalmi leírás; valamint P. Cheung és L. Chan és J. J. Seilhamer és munkatársai fenti idézett munkái].
2) Humán proapo A-I cDNS-szekvenciát tartalmazó bakteriális expressziós vektor szerkesztése: pULB9291(2.és3.ábra)
A humán proapo A-I-et termelőpULB9291 plazmidot úgy szerkesztjük meg, hogy a pULB16Q9 Hónból szár6
HU 204562 Β mazó egy szegmenst a szabályozható Pl lambda-promotor mögé helyezünk (3. ábra). Az expressziós plazmid szerkesztéséhez szükség van az Ncol hasítási helyet, egy ATG transzlációs iniciálé kodont és a humán proapo A-I szerkezeti génnek a protein aminoterminális végén lévő aminosavakat kódoló nukleotidszekvenciáját az első egyetlen Ball restrikciós helytől felfelé tartalmazó DNSfragmentumok (2. ábra) szintézisére.
Ezt az adaptert kémiai úton szintetizáljuk, N. D. Sinha és munkatársai fent idézett munkájából ismert eljárással. Négy szintetikus oligonukleotidot állítunk elő, amelyek hőkezelés után kódolják az ATG transzlációs iniciálé kodonnak megfelelő metionint, a propeptidnek megfelelő 6 aminosavat és az érett humán apó A-I első 14 aminosavját (2. ábra). A szintetikus adaptert úgy tervezzük, hogy a gén 5’-végén minimális mértékben alakuljon ki a szekunder szerkezet. Ennek érdekében a kodonokat úgy választjuk meg, hogy azok a természetes kodonoktól eltérően kódolják a pULB1609 cDNS-klónban lévő -6., -1., 1., 3., 4., 5., 6., 7., 10., 11. és 14. aminosavakat.
A fenti szintetikus adaptert egy pULB 1609-ből származó, 744 bázispárból álló DNS-fragmensnek a pULB1221 expressziós plazmidban lévő Pl lambdapromotorhoz való csatlakoztatására használjuk.
ApULB1221 expressziós vektor szerkesztését a 186 643 számú európai szabadalmi leírásban ismertetik. A szerkesztés három fő lépésből áll, és pCQV2 plazmidból indul ki. A pCQV2 plazmidot C. Queen ismertette [J. Mól. Appl. Génét. 2, 1-10 (1983)], és szabadon hozzáférhető.
A fenti vektor használata nem kötelező, bármely más vektor is alkalmazható, amelyben van egy promotor és attól a 3’-vég felé egy megfelelő Ncol hely. Közelítőleg 0,1 pg fent ismertetett, hőkezelt szintetikus fragmentumot közelítőleg 1 gg pULB 1609-ből származó, 744 bázispárból álló Ball-PstI fragmentumhoz és közelítőleg 1 gg Ncol-gyel és Ball-gyel hasított pULB 1221 vektorhoz kötünk, T4 DNS-ligáz segítségével. A ligálás előtt a 744 bázispárból álló Ball-PstI fragmentumot T4 DNS-polimerázzal kezeljük, hogy a kinyúló 3’-véget „ragadóssá” tegyük; ez az eljárás a szakirodalomból jól ismert, részletesen T. Maniatis és munkatársai ismertetik fent idézett munkájukban.
A megszerkesztett plazmidokat E.coli AR58 kompetens sejtekben egyszer felerősítjük, majd restrikciós helyanalízissel és a szintetikus szakasz és a csatlakozási helyek DNS-szekvenciaanalízisével jellemezzük. Egy rekombináns plazmid, a pULB9291 kielégített minden követelményt, mivel fragmentumai a megfelelő rendben és orientációban voltak, ezt a plazmidot használjuk az expresszió vizsgálatára.
3) fi-galaktozidáznak és humán proapo A-I-nek megfelelő fuzionált szekvenciát tartalmazó bakteriális expressziós vektor szerkesztése: pULB9296 (4. ábra)
A fenti szerkesztés során a humán proapo A-I-et kódoló DNS-szekvenciát a 3’-vég felé, megfelelő leolvasási rendszert biztosítva a β-galaktozidázt kódoló
DNS-szekvenciához fuzionáljuk. A β-galaktozidázt kódoló gén egy szabadon hozzáférhető E.coli expressziós vektorban, a pUR288-ban [U. Ruther és B. MullerHill: EMBO J. 2,1791-1794 (1983)] van jelen, amely egy kielégítően indukálható lac-promotort és a β-galaktozidáz szekvenciában megfelelő restrikciós helyeket hordoz. A megfelelő rekombináns plazmidot a 4. ábrán látható módon szerkesztjük meg. Először a pUR288 plazmid-DNS-t BamHI-gyel hasítjuk, T4 DNS-polimerázzal kezeljük, majd ismét hasítjuk Sallgyel. Második lépésben előállítunk egy 805 bázispárból álló DNS-fragmentumot, oly módon, hogy pULB9291-et egymást követően KpnI-gyel hasítunk, T4 DNS-polimerázzal kezelünk, majd SalI-gyel hasítunk. A két fragmentumot ekvimoláris arányban T4 DNS-ligáz segítségével összekötjük, és a kapott plazmidokat használjuk a megfelelő E.coli törzs, a JM101 transzformálására. A fenti E.coli törzs széles körben, szabadon hozzáférhető, letétbe helyezési száma: ATCC 33 876, dátuma: 1982.05.10.)
A transzformált sejteket restrikciós analízissel ellenőrizzük a humán proapo A-I szekvencia β-galaktozidáz-génhez való helyes orientációja és a két szekvencia csatlakozási helyénél egy BamHl hasítási hely helyreállása szempontjából. Ez azt jelenti, hogy a humán proapo A-I szekvencia 3’-vég felé van fuzionálva a β-galaktozidáz-szekvenciához, a megfelelő leolvasási rendben. Az egyik transzfonnáns, a pULB9296, minden követelménynek megfelelt, és ezt használtuk az expressziós vizsgálatokban.
4) Humán proapo A-I cDNS-szekvenciát hordozó élesztő expressziós plazmid szerkesztése: pULB9299 (5. ábra)
A fenti szerkesztés során a humán proapo A-I-et kódoló cDNS-szekvenciát az élesztő expressziós plazmidban lévő promotor- és terminátorjelek közé klónozzuk. A kísérlethez a pRIT 10 774 élesztő expressziós vektort választottuk. A pRIT 10 774 expressziós plazmid szekesztését a 151 102 számú európai szabadalmi leírás ismerteti. A fenti plazmidot egyrészt a pRIT 10749 plazmidból - amelyet a Budapesti Egyezmény szerint helyeztek letétbe az ATCC-nél 39 133 szám alatt -, másrészt az YEpl3 E.coliban és S.cerevisiaeben is replikálódni képes vektorból (E.coli-S.cerevisiae shuttle vektor) kiindulva szerkesztjük meg, az utóbbi plazmidot J. R. Broach és munkatársai ismertették [Gene 8, 121-133 (1979)], és az ATCC-nél van letétbe helyezve, száma ATCC 37 115. A pRIT 10 774 vektor mind E.coliban, mind élesztőben képes replikálódni, és omitin-karbamoil-transzferáz (ARG3) promotort, valamint egy egyedüli BamHl restrikciós hellyel elválasztott transzkripciós terminátort hordoz, amely restrikciós hely alkalmas egy saját ATG transzlációs iniciálé kodont tartalmazó idegen DNS beillesztésére. Ezenkívül a vektor élesztő 2 μ-szekvenciákat, élesztőben való szelekcióra alkalmas metabolikus maikereket és E.coliban való szelekcióra alkalmas jelző AmpA szelekciós markért is tartalmaz. Nemcsak ez az egyetlen vektor, amely a humán proapo A-I élesztőben való expresszió7
HU 204562 Β jára alkalmazható, bármely más, regulátoqeleket hordozó élesztővektor is alkalmazható, hasonló eredménnyel. A szerkesztést - amelyet az 5, ábra szemléltet - az alábbiak szerint végezzük.
ApRTT 10 744 plazmidot BamHl enzimmel linearizáljuk, és T4DNS-polimerázzaI kezeljük. A 810 bázispárból álló DNS-fragmentumot pULB929I-ből származtatjuk, olymódon, hogy a pULB9291-etAsp718 és Sáli enzimmel emésztjük, majd T4 DNS-polimerázzal kezeljük. A fenti fragmentum kódolja a humán proapo A-I-et, és ATG transzlációs iniciálé kodont is tartalmaz. A fenti módon, kapott két fragmentumot ekvimoláris arányban T4 DNS-ligáz segítségével összekötjük, és az elegyet használjuk a megfelelő E.coli MM294 Sejtek transzformálására. A transzformánsokat restrikciós analízissel ellenőrizzük a proapo A-I DNS-szekvencia ARG3 promotorszekvenciához való megfelelő orientációja szempontjából. A rekombináns plazmidot hordozó egyik transzformáns, apULB9299, megfelel a fenti feltételeknek. A pULB9299 plazmidot E.coliban felerősítjük, és Saccharomyces cerevisiae 10S44c (pep4-3, Ieu2-3, Ieu2-112) élesztőszferoplasztok (T. Cabezon és munkatársai fent idézett munkája) transzformálására használjuk. Az élesztőtranszformánsokat ezután megvizsgáljuk a humán proapo A-I expressziója 25 szempontjából.
5) Humán proapo Á.-I cDNS-szckvenciát tartalmazó bakteriális szekréciós vektor szerkesztése: pNIVI6l2 (6A, B és Cábra) 30
Afenti szerkesztés során a humán proapo A-I-et kódoló DNS- szekvenciát a 3'-vég felé, megfelelő leolvasási rendben fuzionáljuk az E.coli Gmpa protein szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciához. A kísérlethez a ρΙΝ-ΠΓompA-2 szekréciós vektort [J. Ghrayeb és munkatársai: 35 EMBO J. 3,2437-2442 (1984)] választottuk ki. A fenő vektor és gazdasejtje, az E.coli JA221 kérésre beszerezhetők a New York-i Állami Egyetem Biokémiai tanszékéről (Department of Biochemistry of the State University of New York, Stony Brook). 40
A szekréciós vektor egy erős Ipp (lipoprotein) promotort, egy lac-promotoroperátor fragmentumot, a lacrepresszor IacI szekvenciáját és megfelelő restrikciós helyeket hordoz közvetlenül az ompA-szignálpeptidet kódoló szekvencia után. A megfelelő rekombináns plazmidot a 6.A, B és C ábrán látható módon szerkesztjük meg.
Először a pIN-IH-ompA-2 szekréciós vektort linearizáljuk EcoRI-gyel, és T4 DNS-polimerázzal kezeljük. Másodiklépésben a pULB929l-ből egy 805 bázispárt tartalmazó DSN-ffagmentumot készítünk, oly módon, hogy a fenti plazmidot KpnI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük, majd T4 DNS-polimerázzal kezeljük. A fenti fragmentum, kódolja a humán proapo A-I-et, és ATG transzlációs iniciáló kodont is tartalmaz. A fenti módon kapott két fragmentumot ekvimoláris arányban T4DNS-ligázzal összekapcsoljuk, és az elegyet 20 mg/1 triptofánt, 20 mg/1 leucint, 2 g/I laktózt és 50 mg/1 ampicillint tartalmazó M9 tápközegben (J. H. Miller: „Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972,431. oldal) tenyésztett E.coli JA221 sejtek transzformálására használjuk.
A transzformánsokat ampicillin-rezisztenciájuk szempontjából szelektáljuk, és egy szintetikus 18-mer oligonukleotiddal - amely azonos az adapter szintézisére használt oligonukleotiddal (2. ábra) - szűrjük. A kiválasztott transzformánsokat restrikciós analízissel ellenőrizzük, a proapo A-I DNS-szekvenciának a szekréciós vektorban lévő szignálpeptidet kódoló DNSszekvenciához való helyes orientációja szempontjából (helyreállított AcoRI hely a két szekvencia csatlakozásánál).
A rekombináns plazmidot hordozó egyik transzformáns megfelelt a fenti feltételnek. Az alábbi nukleotidszekvenciában aláhúzott extraszekvenciát, amely a linkemek felel meg, a szerkesztést követően oligonukleotid-irányított helyspecifikus mutagenezissel távolítjuk el:
5’ GTA GCG GAG GCC GCTGA/ Val Alá Gin Alá Alá Glu
A fenti célra az alábbi 24-mer oligonukleotidot szintetizáljuk:
szignálpeptid —>e-proapo A-1
5’ GTA GCG GAG GCC AGA CAT TTC TGG 3 ’
Val Alá Gin Alá Arg His Phe Trp, amelyből hiányzik a 12 extra bázis, és ezt használjuk a 12 bázisból álló linkerszekvencia eltávolítására. AmutagenezistAmersham-rendszerben végezzük. A fenti rendszer F. Eckstern és munkatársai [Nucleic Acids Rés. 13,8765-8785 (1985)1 módszerén alapul. A módszer magas plakkhozamot ad, és a legmagasabb elérhető hatékonyságot biztosítja, amely 95% is lehet. Első lépésben a mutagenizálni kívánt DNS-régiót egy M13 vektorba klónozzuk. Ehhez a proapo A-I gént hordozó rekombináns pIN-IH-ompA-2 plazmid XbalATGAGA CAT TTA TGG 3’
Met Arg His Phe Trp as-6
Ball DNS-fragmentumát az Xbal-gyel és HindH-vel hasított M13mpl9 vektorba illesztjük. Az M13mpl9 vektor kereskedelmi forgalomban kapható (Amersham, Buckinghamshire, Nagy-Britannia). Ezután a mutagén 24-mer oligonukleotidot az egyszálú templáttal hókezeljük, és a DNS-polimeráz Klenow-fragmensével meghosszabbítjuk, T4 DNS-ligáz jelenlétében, ily módon mutáns heteroduplexeket kapunk.
A nem mutáns szál szelektív elválasztását úgy tesz55 szűk lehetővé, hogy az in vitro szintézis során a mutáns szálba egy tíonukleotídot építünk be, és foszforotionátotnem tartalmazó szálat NCil-gyel bevágjuk. Az ilyen bevágások az exonukleáz IH számára megfelelő helyet alkotnak, és ez lebontja a nem mutáns szálat. A mutáns szálat ezután templátként használjuk a kettős szálú
HU 204 562 Β cirkuláris molekula rekonstruálására, ily módon homoduplex mutáns molekulát kapunk.
A mutagenezist úgy ellenőrizzük, hogy a szignálpeptid és a proapo A-I gén kezdetének kapcsolódási helyén meghatározzuk a nukleotidszekvenciát.
A pNIV1612 rekombináns plazmidot úgy rekonstruáljuk, hogy a pIN-II-ompA-2 vektor Xbal-HindHI fragmentumát a 12 extra bázis már nem tartalmazó Xbal-Ball DNS-fragmentummal és a proapo A-I gén Ball-HindlII fragmentumával ligáljuk. A fenti három fragmentumot T4 DNS-ligáz segítségével kötjük össze, és a kapott elegyet használjuk az E.coli JA221 sejtek transzformálására, a fent ismertetett módon. A transzformánsokat ampicillin-rezisztenciájuk alapján szelektáljuk, és a fent ismertetett 18-mer oligonukleotiddal szűrjük. A transzformánsok egyike, a pNIV1612 hordozza a rekombináns plazmidot. A végső szerkezetben az ompA-szignálpeptidet kódoló szekvencia megelőzi a teljes, ATG-kodont nem tartalmazó proapo A-I szekvenciát (6.A, B és C ábra). Az E.coli transzformánsokat ezután megvizsgáljuk a humán proapo A-I kifejezése szempontjából.
6) Transzfervektor szerkesztése a humán proapo
A-l cDNS-szekvencia baculovírusába való bevitelére: pNIV1613 (7. ábra)
A humán proapo A-I DNS-szekvenciát hordozó pNIV1613 plazmidot úgy szerkesztjük meg, hogy egy pULB9291 kiónból származó szegmenst a baculovírus polihedringén promotorától 3’ irányban beillesztünk. A pAcRPő Baculovírus transzfervektort [Y. Matsuura és munkatársai: J. Gén. Virol. 67, 1515-1529 (1985)] használjuk a fenti kísérletben, amely az Ottawai Egyetem Mikrobiológiai és Immunológiai tanszékéről (Department of Microbiology and Immunology of the University of Ottawa) szerezhető be. A plazmid az 5’-vezetőszekvenciában a -7 nukleotidtól felfelé tartalmazza a polihedringén-promotort; nincs benne polihedrin ATGkodon, és hiányzik a polihedrinkódoló szekvencia első 170 nukleotidja. A használható BamHI hely a -7 nukleotidtól a 3’-vég felé helyezkedik el. A szerkesztést a 7. ábrán szemléltetjük, és az alábbiak szerint végezzük.
A pAcRPő plazmid-DNS-t BamHI-gyel linearizáljuk. Másrészt a pULB9291-ből egy 810 bázispárból álló DNS-fragmentumot készítünk, oly módon, hogy a plazmidot Asp718 és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük. A fenti fragmentum kódolja a humán proapo A-I-et, és tartalmazza az ATG transzlációs iniciáló kodont is. A fenti két fragmentumot ekvimoláris arányban T4 DNS-polimerázzal kezeljük, és T4 DNS-ligázzal ligáljuk, majd az elegyet E.coli AR58 sejtek transzformálására használjuk. A transzformánsokat ampicillin-rezisztenciára szelektáljuk, és egy 32P-jelzett szintetikus 35-mer oligonukleotiddal (l'ásd 2. ábra) szűq'ük, amely a proapo A-I DNS-szekvencia egy részének felel meg, majd restrikciós analízissel ellenőrizzük a proapo A-I DNS-szekvencia polihedringén-promotorhoz való helyes orientációját. A rekombináns plazmidot hordozó egyik transzformáns, a pNIV1613 megfelel e feltételnek, és ezt használjuk az expressziós kísérletekben.
7) Humán proapo A-I előállítása transzformált mikroorganizmussal
A pULB9291-gyel, illetve pULB9296-tal transzformáit E.coli AR58, illetve E.coli JM101 törzset 20 ml, 50 pg/ml ampicillinnel kiegészített komplett tápközegben (LB-tápközeg, T. Maniatis és munkatársai fent idézett munkájának kísérleti része) tenyésztjük, míg a tenyészet optikai sűrűsége 630 nm-en (OD^o) eléri a 0,6 értéket.
A pULB9291 esetén a Pl lambda-promotort úgy induláljuk, hogy a tenyésztési hőmérsékletet az eredeti 30 °C-os értékről 42 ’C-ra emeljük, a Pl lambda-promotor represszorának inaktiválása céljából [M. Rosenberg és munkatársai: Methods Enzymol. 101,123-138 (1983)]. Az indukálást 20 percen keresztül végezzük.
A pULB9296 esetén a lac-promotort úgy indukáljuk, hogy a 37 ’C-on tartott tenyészethez 1 mmól/1 végkoncentrációban IPTG kémiai indukálószert (izopropil-βD-tiogalaktozidázt) adunk (L. Lorenzetti és munkatársai fent idézett munkája). Az indukálást 60 percen keresztül végezzük.
Másrészt a pULB9299-cel transzformált 10S44c élesztősejteket 20 ml, 1% glükózzal kiegészített, élesztő-nitrogén-alapú tápközegben (Difco) tenyésztjük, míg a tenyészet OD^o értéke 0,3 lesz. Nem szükséges indukálást alkalmazni, mivel ebben az esetben az expresszió jelentős mértékű.
A fenti módon kapott tenyészetek 1 ml-ét 15 000 gmal 5 percen keresztül centrifugáljuk. A kapott sejtüledéket forró nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) lizáljuk, az alábbiak szerint. A sejteket 50 pl SDS-pufferben (50 mmól/1 Trisz-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 6 mól/1 karbamid, 5% 2-merkapto-etanol és 10% glicerin) újraszuszpendáljuk és 3 percen keresztül 100 ’C-on melegítjük. Az extraktumot ezután 10 percen keresztül 15 000 g-mal centrifugáljuk. A mintákat ezt követően 15% vagy 7,5% SDS-poIi(akriIamid)-géIlemezen elektroforetizáljuk, denaturáló körülmények között (U. K. Laemmli fent idézett munkája).
Az elektroforézist követően a poli(akrilamid)-géllemezt gyorsan 40 ml desztillált vízzel, és 40 ml 50 mmól/1 koncentrációjú nátrium-foszfát-pufferrel (pH 7,5) mossuk. A proteineket ezután elektromos úton, 2 órán keresztül 60 V-os 15 A-es árammal, ugyanezen pufferben nitrocellulóz-lapokra visszük át (T. Cabezon és munkatársai fent idézett munkája). A nitrocellulóz-lapokat 50 mmól/1 koncentrációjú nátrium-foszfát-pufferben (pH 7,5) 1% albuminnal telítjük, majd egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, 1/500-as hígítású nyúl antihumán apó A-I szérum [és a pULB9296 esetén egér anti-βgalaktozidáz-monoklonális antitest (Promega Coiporation, Madison, USA)] jelenlétében, a fenti, de albumin nélküli pufferben.
A lapokat ötször 40 ml fenti foszfátpufferrel mossuk, majd peroxidázzal jelzett kecske antinyúl (vagy antiegér) szérummal (10 pg/ml) inkubáljuk, 40 ml foszfátpufferben. A lapokat 4 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd ismét ötször 40 ml foszfátpufferrel mossuk, végül 50 ml kromogén szubsztrátoldat (10 mg diamino-benzidin, 100 pl karbamid-peroxid
HU 204562 Β (10%), 100 mmól/1 Trisz-HCl, pH 7,6) hozzáadásával előhívjuk. Egyetlen, az antihumán apó A-I antitesttel reagáló terméket találunk a pULB9291 és pULB9299 esetében. A termék molekulatömege egyezik a standard, természetes apó A-I-ével. ApULB9296 esetében az antihumán apó A-I szérummal és anti-P-galaktozidáz-szérummal reagáló fuzionált polipeptidet találunk, a β-galaktozidáz-szérummal reagáló fuzionált polipeptidet találunk, a β-galaktozidáz és a proapo A-I polipeptidek molekulatömege összegének (144 kD) megfelelő várt értéknél. A móltömeget egy kalibrációs görbe segítségével állapítjuk meg, amelyet a sejtextraktum futtatására használt géllel azonos gélen ismert molekulatömegú standard anyagok mozgása alapján vettünk fel.
Másik kísérletben a pNIV1612-vel transzformált
E.coli JA221 törzset 20 ml, 50 pg/ml ampcillinnel kiegészített komplett tápközegben (LB-íápközeg, T. Maniatis fent idézett munkája) tenyésztjük, míg a tenyészet OÜ630 értéke eléri, a 0,6-ot. A lac-promotort úgy indukáljuk, hogy a 37 °C-on inkubált tenyészethez kémiai indukálószerként IPTG-t (izopropil-p-D-tiogalaktozidot) adunk, 2 mmól/1 végkoncentráciőban. Az indukálást 60 percen keresztül folytatjuk. A tenyészetből 1 ml-es alikvotokat veszünk, és 15 OOOg-mal 5 percen keresztül centrifugáljuk. A kapott sejtüledéket a periplazma-frakciő felszabadítására enyhe ozmotikus sokknak tesszük ki [D. KosHand és D. Botstein: Cell 20, 749-760 (1980)]. A felszabadult frakciót a fenti SDSpufferben - karbamid nélkül - űjraszuszpendáljuk, forraljuk, centrifugáljuk és 12,5% SDS-t tartalmazó poIi(akrilamid)-gélen elektroforetizáljuk, majd úgynevezett Western biot módszerrel [H. Taobin, T. Stachelin,
J. Gordon: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979)] analizáljuk. A szintetizált proapo A-I egy frakciója vizsgálataink szerint a sejtben van, és nem a periplazmában. Ez vagy annak a következménye, hogy a proapo A-I egy része nem ürül ki, vagy azé, hogy az ozmotikus sokk hatékonysága nem optimális. Aproapo A-I fő tömege vizsgálataink szerint a közegbe kerül az ozmotikus sokk után, jelezvén, hogy a sejtek a proteint kiválasztották.
8) Humán proapo A-I előállítása baculovírussal fertőzött rovarsejtekkel
A pNIVI613 rekombináns plazmidot a vad típusú baculovírussal együtt használjuk a Spodoptera frugíperda sejttenyészet (ATCC CRL 1711) együttes fertőzésére. A polihedrinhiányos rekombináns vírusokra végzett szűréssel rekombinás plakkokat kapunk. A í plakkból tisztított rekombináns vírust használjuk a rovarsejtek fertőzésére. A fenti eljárás ismert, például M.
D. Summers és G. E. Smith munkájából [„AMannual of Methods fór Baculovfrus Vectors and Insect cell culture Procedures”, Texas University, College Station £ (1987)].
A rekombináns vírust Western biot analízissel és 12,5% SDS-t tartalmazó poli(akril-amid)-gél-elektroforézissel vizsgáljuk a proapo A-I termelés szempontjából, miután a sejteket RIPA-pufferrel [0,05 mól/1 Tris-HCl 6 puffer, pH 7,2 0,15 mól/I NaCl, 1% Triton X100, 0,1%
SDS, 0,1% nátrium-dezoxi-kolátés 1 mmól/1 fenil-metilszulfonil-fluorid (PMSF)] és forró nátrium-dodecil-szulfáttal végzett kezeléssel feltártuk.
Egyetlen, antihumán apó A-I antitesttel reagáló terméket kapunk. Molekulatömege azonos a standard, természetes apó Á-I-ével, és a kifejezett protein az összproteintartalom fő tömegét képezi. A proapo Á-I koncentrációja - egyszerű radiális immundiffúzióval mérve [G. Mancini 10 és munkatársai: hnmunochem. 2,235-254 (1965)] közelítőleg 100 mg proapo A-Miter tenyészet
9) Humán proapo A-I keletkezése a citoplazmában,
E.coliban, meghatározott minimál tápközeget 15 használva
A humán proapo A-I citoplazmában való képződését minimál tápközegben tenyésztett E.coliban pULB9292 plazmidot használva viszgáljuk. A pULB9292 plazmidot úgy szerkesztjük meg, hogy a pULB9291 plazmid 20 PL Iambda-promotort kódoló EcoRI-NcoI fragmensét a pOTS-plazmid ugyanezen EcoRI-NcoI fragmensére cseréljük ki [M. Rosenberg és munkatársai: Methods Enzymol. 101,123-138 (1983)]. ApOTS-vektorEcoRI-NcoI fragmentuma [G. Devare és munkatársai: 25 Cell, 36,43-49 (1984)] a lambda-fág megfelelően szabályozható PLpromotorát is tartalmazza.
A pULB9292-vel transzformáit E.coli AR58 törzset 20 ml meghatározott minimál tápközegben tenyésztünk. A minimál tápközeg összetétele: Éterenként 3 g 30 Na2HPO4«2H2O, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, 1 g NILC1, 1,37 mmól/Ί MgSO4«7H2O, 29,5 gmólri FeCl3-6H2O, 236 pmól/l MnSO4«H2O, 10 g glükóz, 1 mg Bi-vitamin, 50 mg ampiciiiin, 1/20 hígitású (térfogaí/térfogat) LB-tápközeg.
A sejteket a fenti tápkőzegben az ODoo-0,5 érték eléréséig tenyésztjük. A Pl promotor indukálását úgy végezzük, hogy a kezdeti 30 °C-os tenyésztési hőmérsékletet 42 °C-ra növeljük, ezáltal inaktiváljuk a Pl lambda-promotor represszorát (M. Rosenberg és mun40 katársai fent idézett munkája). Az indukálást 60 percen keresztül folytatjuk. A tenyészetből vett 1 ml mintákat French-féle présen átszűrjük, vagy 15 000 g-mal 5 percen keresztül centrifugáljuk. A kapott teljes sejtextraktumot vagy sejtüledéket forró SDS-sel kezeljük, a 7) pontban leírtak szerint.
Elektroforézis és Western biot analízis után egyetlen, antihumán apó A-I antitesttel reagáló terméket kapunk. Molekulatömege azonos a standard, természetes apó A-I-ével. A fenti minimál tápkőzegben kifejeződött proapoEpoprotein A-I mennyisége az összprotein-tartalom 13,5%-át adja, azaz a proapo A-I becsűit értéke a tenyészet 1 Éterében kb. 270 mg.
10) Transzformált mikroorganizmusokkal előállított humán proapo A-I izolálása, tisztítása és jellemzése 10.1 Izolálás és tisztítás
A rekombináns proapo A-I nyers extraktumát 4000g-mal 15 percen keresztül centrifugáljuk, majd az üledéket eldobjuk. A felülúszőt 100 000 g-mal 2 órán keresztül centrifugáljuk. A kapott üledéket mini10
HU 204562 Β mális térfogatú TEN100 pufferben (20 mmól/1 Trisz-HCl, pH 7,5, 1 mmól/1 EDTA, 100 mmól/1 NaCl, 1,75 pg/ml PMSF és 100 pg/ml nátrium-mertiolát {[(o-karboxi-fenil)-tio]-etil-higany(II)-nátriumsó) újraszuszpendáljuk, és az így kapott szuszpenzió térfogatát, valamint a felülúszó térfogatát külön-külön az eredeti extraktum térfogatának megfelelő értékre állítjuk be ugyanezzel a pufferrel. Ezután a proteint növekvő koncentrációban izopropil-alkohol hozzáadásával mindkét szuszpenziőból kicsapjuk. Az egyes szuszpenziók kicsapódott proteinfrakcióit, amelyek a humán apó A-I-hez hasonló immunreaktivitás túlnyomó részét tartalmazzák, radiális immundiffúziós módszerrel mutatjuk ki (G. Mancini és munkatársai fent idézett munkája), kereskedelmi forgalomban lévő apó A-I standard készítményt használva. Az így kapott egyes frakciókat Sephacryl S200zal töltött oszlopon kromatográfiásan továbbtisztítjuk, az eluálást a fenti pufferrel végezzük. 0,9 ml-es frakciókat szedünk, és minden egyes frakcióban meghatározzuk az apó A-I immunreakciót mutató protein mennyiségét, radiális immundiffúziós eljárással. Az egyes frakciókban az eluálódott protein molekulatömegét úgy határozzuk meg, hogy az oszlopot ismert molekulatőmegű standardokkal - például aldolázzal, marhaszérum-albuminnal, ovalbuminnal, kimotripszinnel és citokrom C2-vel kalibráljuk, azonos körülmények között.
A proapo A-I tisztasága az összprotein 1 mg-jára vonatkoztatva a rekombináns proapo A-I-et tartalmazó fő frakciókban - amelyet a szokásos módon előállított apó A-I-gyel azonos immunreaktivitást mutató protein mg-jában adunk meg - közelítőleg 95%.
10.2 Jellemzés
10.2.1 Rekombináns proapo A-I fizikai tulajdonságai
A 100 000 g-mal végzett centrifugálással kapott üledékből (lásd 10.1) és felűlúszóból izolált és tisztított rekombináns proapo A-I izoelektromos fókuszálással vizsgálva [N. Catsimpoolas: Anal. Biochem. 26,54-62 (1969)], pH 4 és pH 6 között változó önkifejlesztő gradienst alkalmazva, egyetlen sávot mutat, amelynek megközelítő izoelektromos pontja 4,95.
A humán plazma apó A-I tapasztalatok szerint kissé erősebben savas jellegű, ennek közelítőleg 4,75 az izoelektromos pontja.
A rekombináns proapo A-I és a plazma apó A-I izoelektromos pontjai között mutatkozó 0,2 pH-egységnyi eltérés jól egyezik a plazma apó A-I és plazma proapo A-I izoelektromos pontja közötti ismert különbséggel, amely 0,17 [G. L. Mills és munkatársai: Láb. Tech. Biochem. Mól. Bioi. 14,244-245 (1984)]. A molekulatömeget tekintve, mind az üledékből, mind a felűlúszóból izolált proapo A-I egyetlen polipeptidlánccal rendelkezik, amelynek molekulatömege azonos, és értéke 29,9± 1,4 kD. A humán plazma eredetű apó A-I valamivel kisebb, molekulatömege 29,3±1,3 kD.
10.2.2 Rekombináns proapo A-I pepiid térképezése
BNSP-szkatollal
A 3-bróm-3-metil-2-[(2-nitro-fenil)-tio]-3H-indollal (BNSP-szkatollal) való kémiai hasítást A. Fontana [Methods Enzymol. 25, 419-423 (1972)] módszere szerint végezzük. 5-10 gg tisztított proteinkészítményt 100 μΐ 0,15 térfogat%-os, 50 térfogat%-os vizes ecetsavval készült fenololdatban oldunk. Ezután hozzáadunk 50 μΐ-t 4,8 mg BNSP-szkatol 1 ml jégecettel készült oldatából, és az elegyet 25 ’C-on 72 órán keresztül inkubáljuk. Ezután hozzáadunk 50 gl 2-merkapto-etanolt, és az elegyet 37 ’C-on 5 órán keresztül másodszor is inkubáljuk. A mintát bepároljuk, 100 μΐ vízben újraoldjuk, háromszor 200 μΐ etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázisokat eldobjuk, a vizes fázisokat liofilizáljuk és SDS-poli(akrilamid)-gélelektroforetikus eljárással analizáljuk.
A BNSP-szkatollal végzett kémiai hasítás esetén az apó A-I fragmentumok száma és mérete többé-kevésbé előre látható, mivel az alkalmazott körülmények között a BNSP-szkatol a triptofánmaradékok után szelektíven hasítja a pepiidet. Minden egyes hasítási helynél 100%-os hatékonyságot feltételezve, a legnagyobb fragmentum várhatóan egy 15,4 kD méretű C-terminális fragmens. A többi fragmentumok molekulatömege 0,5 és 5,3 kD között változik, ezért túl kicsik ahhoz, hogy azokat ki lehessen mutatni.
Nem tökéletes hasítás esetén a 15,4 kD méretű fragmentum az N-terminális vég felé „meghosszabbodik”, és 20,7 kD, 23,1 kD és 27,6 kD méretű fragmentumokat kapunk. A fenti előre várható eredmények igen jól egyeznek a humán plazma apó A-I esetén kapott eredményekkel, valamint a különféle tisztított rekombináns proapo A-I készítmények esetén kapott eredményekkel.
Claims (12)
1. Eljárás humán proapolipoprotein A-I-et kódoló rekombináns DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy az emberi proapolipoprotein A-I +15-től +243-ig terjedő aminosavait kódoló természetes eredetű szekvenciát 3’ irányban ligáljuk egy szintetikus DNSfragmentumhoz, amelynek nukleotidszekvenciája a következő:
5 ’-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG-3’.
2. Eljárás replikálható klónozó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a vektorba egy 1. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns DNS-szekvenciát illesztünk be.
3. Eljárás expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a vektorba egy 1. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns DNS-szekvenciát illesztünk, kívánt esetben heterológ fehérjét kódoló DNS-sel fuzionálva, működőképesen kötve regulátor DNS-szekvenciákhoz, és transzlációs start- és stopjelekkel határolva.
HU 204562 Β
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy regulátor DNS-szekvenciaként lambda-fág Pl promotort illesztünk a vektorba.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-szekvenciaként a β-galaktozidáz DNS-szekvenciájához 3’ irányban fuzionált humán proapolipoprotein A-I DNS-szekvenciát, és regulátor DNS-szekvenciaként egy lac-promotorrégiőt tartalmazó DNS-szekvenciát illesztünk a vektorba.
6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy regulátor DNS-szekvenciaként élesztő ARG3 promotor és transzkripciós teiminátoirégiókat tartalmazó DNS-szekvenciát illesztünk a vektorba.
7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-szekvenciaként az E.coli Ompa-protein szignálpeptid DNS-szekvenciájához 3 ’ irányban fuzionált proapolipoprotein A-I DNS-szekvenciát, és regulátor DNS-szekvenciaként az lpp-promotor és lac-promotoroperátor régiókat tartalmazó DNS-szekvenciát illesztünk a vektorba.
8. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy regulátor DNS-szekvenciaként a baculovírus polihedringén promotonégióját tartalmazó DNS-szekvenciát illesztünk a vektorba.
9. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns plazmádként pULB9291-et, pULB9292-t, pULB9296-ot, pULB9299-et, pNIV1612-t vagy pNTV16l3-at állítunk elő.
10. Eljárás transzformált sejtvonal vagy mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy a transzformálást a 3. igénypont szerint előállított expressziós vektorral végezzük.
11. A10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformálást a 9. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns plazmiddal végezzük
12. Eljárás humán proapolipoprotein A-I előállítására, azzal jellemezve, hogy a 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárással előállított transzformált sejtet vagy mikroorganizmust megfelelő körülmények között tenyésztjük, és az így képződött humán proapolipoprotein
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB878712540A GB8712540D0 (en) | 1987-05-28 | 1987-05-28 | Expression of human proapolipoprotein a-i |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT47153A HUT47153A (en) | 1989-01-30 |
| HU204562B true HU204562B (en) | 1992-01-28 |
Family
ID=10618034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU882707A HU204562B (en) | 1987-05-28 | 1988-05-27 | Process for producing recombinant dns-sequency codin human proapolypo-protein a-i, expressing vector containing them, transformed hoste celle and human proapolypoprotein a-i |
Country Status (33)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5059528A (hu) |
| EP (1) | EP0293357B1 (hu) |
| JP (1) | JP2634193B2 (hu) |
| KR (1) | KR970000808B1 (hu) |
| CN (1) | CN1031892C (hu) |
| AT (1) | ATE89006T1 (hu) |
| AU (1) | AU615654B2 (hu) |
| CA (1) | CA1323851C (hu) |
| CY (1) | CY1809A (hu) |
| CZ (1) | CZ283648B6 (hu) |
| DD (1) | DD291093A5 (hu) |
| DE (1) | DE3880739T2 (hu) |
| DK (1) | DK175686B1 (hu) |
| EG (1) | EG19101A (hu) |
| ES (1) | ES2054878T3 (hu) |
| FI (1) | FI100056B (hu) |
| GB (1) | GB8712540D0 (hu) |
| HK (1) | HK137794A (hu) |
| HU (1) | HU204562B (hu) |
| IE (1) | IE62422B1 (hu) |
| IL (1) | IL86480A (hu) |
| LT (1) | LT3600B (hu) |
| LV (1) | LV5288A3 (hu) |
| NO (1) | NO179253C (hu) |
| NZ (1) | NZ224808A (hu) |
| PL (1) | PL158064B1 (hu) |
| PT (1) | PT87562B (hu) |
| RU (1) | RU2009198C1 (hu) |
| SG (1) | SG131594G (hu) |
| SK (1) | SK363888A3 (hu) |
| SU (1) | SU1834904A3 (hu) |
| UA (1) | UA19765A (hu) |
| ZA (1) | ZA883824B (hu) |
Families Citing this family (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU587989B2 (en) * | 1984-10-16 | 1989-09-07 | Mitsubishi Chemical Corporation | DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins |
| JP2606228B2 (ja) * | 1987-09-18 | 1997-04-30 | 三菱化学株式会社 | ヒトプロアポリポプロテインａ−ｉ様蛋白の産生法 |
| DE68917379T2 (de) * | 1988-05-31 | 1994-12-01 | Mitsubishi Chem Ind | Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die ähnlich dem natürlich-menschlichen Apolipoprotein-E sind. |
| US5846799A (en) * | 1988-06-14 | 1998-12-08 | La Region Wallone | Human myeloperoxidase and its therapeutic application |
| US5460961A (en) * | 1988-06-14 | 1995-10-24 | La Region Wallonne | Human myeloperoxidase and its therapeutic application |
| IT1229996B (it) * | 1989-04-20 | 1991-09-20 | Cesare Sirtori | Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine. |
| DK0574402T3 (da) * | 1990-11-26 | 1998-05-18 | Chiron Corp | Ekspression af PACE i værtsceller og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| US5844097A (en) * | 1990-11-30 | 1998-12-01 | Monoclonetics International, Inc. | Methods for the diagnosis of peripheral nerve damage |
| DK0559795T3 (da) * | 1990-11-30 | 1996-01-29 | Monoclonetics Int | Fremgangsmåder til diagnosticering af kroniske smerter i lænderegionen og halshvrivelsøjlen |
| SE9500778D0 (sv) * | 1995-03-03 | 1995-03-03 | Pharmacia Ab | Process for producing a protein |
| US5994061A (en) * | 1995-09-29 | 1999-11-30 | Queen's University At Kingston | DNA constructs and methods for screening for increased expression of human apo AI gene |
| SE9603068D0 (sv) | 1996-08-23 | 1996-08-23 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
| SE9603303D0 (sv) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
| SE9603304D0 (sv) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a compound |
| KR100330355B1 (ko) * | 1999-06-04 | 2002-04-01 | 장인순 | 회전유동발생 날개를 가진 덕트형 핵연료 집합체 지지격자 |
| US20040047853A1 (en) * | 2000-06-09 | 2004-03-11 | Dahl Soren W | Purified proenzyme of dipeptidyl peptidase i (pro-dppi) |
| WO2002048333A2 (en) * | 2000-12-12 | 2002-06-20 | Lexicon Genetics Incorporated | Novel human kinases and uses thereof |
| KR100560102B1 (ko) * | 2004-06-25 | 2006-03-13 | 한국생명공학연구원 | 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제 |
| US7427662B2 (en) * | 2005-02-01 | 2008-09-23 | Baord Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Inhibition of angiogenesis and destruction of angiogenic vessels by apolipoprotein A-I and high density lipoprotein |
| US8206750B2 (en) | 2005-03-24 | 2012-06-26 | Cerenis Therapeutics Holding S.A. | Charged lipoprotein complexes and their uses |
| KR20080049066A (ko) * | 2005-08-26 | 2008-06-03 | 세레니스 쎄라퓨틱스 홀딩 에스에이 | 유산균에서의 아포지단백질 유전자 생성물의 생성을 위한조성물 및 방법 |
| US20080293102A1 (en) * | 2007-02-28 | 2008-11-27 | Cerenis Therapeutics Holding, S.A. | Compositions and methods for producing apolipoprotein |
| CN102239260B (zh) * | 2008-10-03 | 2017-04-12 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对载脂蛋白‑a1的天然反义转录物治疗载脂蛋白‑a1相关疾病 |
| EP3284482B1 (en) | 2008-11-10 | 2020-06-03 | Arbutus Biopharma Corporation | Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
| CA2751342C (en) | 2009-01-29 | 2019-05-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid |
| CN104922699B (zh) | 2009-03-12 | 2020-07-24 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 脂质配制的组合物以及用于抑制Eg5和VEGF基因表达的方法 |
| NZ621981A (en) | 2009-05-05 | 2015-09-25 | Tekmira Pharmaceuticals Corp | Lipid compositions |
| CN102459596B (zh) | 2009-05-06 | 2016-09-07 | 库尔纳公司 | 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病 |
| CA3014827A1 (en) | 2009-06-10 | 2010-12-16 | Jianxin Chen | Improved cationic lipid of formula i |
| AP2015008874A0 (en) | 2009-08-14 | 2015-11-30 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus |
| US10894098B2 (en) | 2012-04-09 | 2021-01-19 | Signablok, Inc. | Methods and compositions for targeted imaging |
| WO2011044545A2 (en) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Sigalov Alexander B | Methods and compositions for targeted imaging |
| EP2509636B1 (en) | 2009-12-07 | 2017-07-19 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions for nucleic acid delivery |
| EP2512449B1 (en) | 2009-12-18 | 2019-08-07 | The University of British Columbia | Methods and compositions for delivery of nucleic acids |
| WO2011139911A2 (en) | 2010-04-29 | 2011-11-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated single stranded rna |
| US20130137628A1 (en) | 2010-05-11 | 2013-05-30 | Esperion Therapeutics, Inc. | Dimeric Oxidation-Resistant Apolipoprotein A1 Variants |
| EP2575764B1 (en) | 2010-06-03 | 2017-04-19 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Biodegradable lipids for the delivery of active agents |
| WO2012016188A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
| US20130323269A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-12-05 | Muthiah Manoharan | Methods and compositions for delivery of active agents |
| WO2012064824A1 (en) | 2010-11-09 | 2012-05-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes |
| WO2012099755A1 (en) | 2011-01-11 | 2012-07-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Pegylated lipids and their use for drug delivery |
| KR20140053848A (ko) | 2011-02-07 | 2014-05-08 | 세레니스 쎄라퓨틱스 홀딩 에스에이 | 지단백질 복합체 및 그의 제조 및 용도 |
| CA2849476A1 (en) | 2011-09-27 | 2013-04-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Di-aliphatic substituted pegylated lipids |
| US9610324B2 (en) * | 2012-07-11 | 2017-04-04 | Esperion Therapeutics, Inc. | Apolipoprotein mixtures |
| HUE050394T2 (hu) * | 2013-05-01 | 2020-11-30 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Apolipoprotein(a) expressziójának módosítására szolgáló eljárások és készítmények |
| EP2853259A1 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-01 | Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) | Reconstituted high density lipoproteins composition and uses thereof |
| AU2015260929A1 (en) | 2014-05-02 | 2016-12-15 | Cerenis Therapeutics Holding Sa | HDL therapy markers |
| US11492616B2 (en) * | 2016-10-27 | 2022-11-08 | Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences | Method for modifying amino acid attenuator and use of same in production |
| EP3668600B1 (en) | 2017-08-10 | 2024-05-15 | Abionyx Pharma SA | Cargomers |
| WO2019030575A1 (en) | 2017-08-10 | 2019-02-14 | Cerenis Therapeutics Holding | APOMÈRES |
| US11081113B2 (en) | 2018-08-24 | 2021-08-03 | Bright Marbles, Inc. | Idea scoring for creativity tool selection |
| US11164065B2 (en) | 2018-08-24 | 2021-11-02 | Bright Marbles, Inc. | Ideation virtual assistant tools |
| US11461863B2 (en) | 2018-08-24 | 2022-10-04 | Bright Marbles, Inc. | Idea assessment and landscape mapping |
| US11189267B2 (en) | 2018-08-24 | 2021-11-30 | Bright Marbles, Inc. | Intelligence-driven virtual assistant for automated idea documentation |
| MX2022012969A (es) | 2020-04-16 | 2022-11-09 | Abionyx Pharma Sa | Metodos para el tratamiento de condiciones agudas usando complejos basados en proteinas de union a lipidos. |
| JP2023543498A (ja) | 2020-10-01 | 2023-10-16 | アビオニクス ファーマ エスエー | 脂質結合タンパク質ベースの複合体を使用した、眼疾患を治療するための方法 |
| IL307670A (en) | 2021-04-15 | 2023-12-01 | Abionyx Pharma Sa | Use of lipid-binding protein-based complexes in organ preservation solutions |
| WO2023194797A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating eye diseases using lipid binding protein-based complexes |
| WO2023194798A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating leukocytosis, endothelial dysfunction and carditis using lipid binding protein-based complexes |
| WO2023237935A2 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating acute conditions using lipid binding protein-based complexes |
| WO2023237927A2 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating hyperinflammatory conditions using lipid binding protein -based complexes |
| WO2024150064A1 (en) | 2023-01-13 | 2024-07-18 | Abionyx Pharma Sa | Lipid binding protein molecule therapy |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU587989B2 (en) * | 1984-10-16 | 1989-09-07 | Mitsubishi Chemical Corporation | DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins |
| JPS6198998A (ja) | 1984-10-18 | 1986-05-17 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 電動送風機 |
| BE901119A (fr) | 1984-11-23 | 1985-03-15 | Wallone Region | Procede de preparation de plasmides vecteurs capables de transformer un hote bacterien escherichia coli et d'y promouvoir et controler l'expression d'un adn heterologue. |
| WO1986004920A1 (en) | 1985-02-13 | 1986-08-28 | Biotechnology Research Partners, Limited | Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system |
| GB8507833D0 (en) * | 1985-03-26 | 1985-05-01 | Biogen Nv | Production of human somatomedin c |
| WO1987002062A1 (en) | 1985-10-04 | 1987-04-09 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Recombinant apolipoproteins and methods |
| GB8625435D0 (en) * | 1986-10-23 | 1986-11-26 | Erba Farmitalia | Human apolipoprotein ai |
| WO1988003175A1 (en) * | 1986-10-29 | 1988-05-05 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Apoai-ciii-aiv, apoaii, apob, apoci, and ldl receptor polymorphisms for genetic fingerprinting and predictive of atherosclerosis |
-
1987
- 1987-05-28 GB GB878712540A patent/GB8712540D0/en active Pending
-
1988
- 1988-05-16 CA CA000566894A patent/CA1323851C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-24 ES ES88870095T patent/ES2054878T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-24 AT AT88870095T patent/ATE89006T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-05-24 DE DE8888870095T patent/DE3880739T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-24 PT PT87562A patent/PT87562B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-05-24 EP EP88870095A patent/EP0293357B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-24 IL IL86480A patent/IL86480A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-05-25 FI FI882456A patent/FI100056B/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-05-26 DD DD88316110A patent/DD291093A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-05-26 EG EG28288A patent/EG19101A/xx active
- 1988-05-26 SU SU884356123A patent/SU1834904A3/ru active
- 1988-05-26 NZ NZ224808A patent/NZ224808A/en unknown
- 1988-05-26 US US07/198,830 patent/US5059528A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-26 UA UA4613079A patent/UA19765A/uk unknown
- 1988-05-26 PL PL1988272698A patent/PL158064B1/pl unknown
- 1988-05-27 DK DK198802896A patent/DK175686B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-05-27 CN CN88103118A patent/CN1031892C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-27 ZA ZA883824A patent/ZA883824B/xx unknown
- 1988-05-27 AU AU16723/88A patent/AU615654B2/en not_active Ceased
- 1988-05-27 IE IE159788A patent/IE62422B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-05-27 SK SK3638-88A patent/SK363888A3/sk unknown
- 1988-05-27 CZ CS883638A patent/CZ283648B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1988-05-27 JP JP63130033A patent/JP2634193B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-27 HU HU882707A patent/HU204562B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-05-27 NO NO882341A patent/NO179253C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-05-28 KR KR88006286A patent/KR970000808B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-12-20 RU SU884613079A patent/RU2009198C1/ru active
-
1993
- 1993-06-01 LV LV930445A patent/LV5288A3/xx unknown
- 1993-08-03 LT LTIP828A patent/LT3600B/lt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-12 SG SG131594A patent/SG131594G/en unknown
- 1994-12-08 HK HK137794A patent/HK137794A/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-10-20 CY CY180995A patent/CY1809A/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU204562B (en) | Process for producing recombinant dns-sequency codin human proapolypo-protein a-i, expressing vector containing them, transformed hoste celle and human proapolypoprotein a-i | |
| KR920007666B1 (ko) | 변형된 섬유소 용해제의 제조방법 | |
| JP3014007B2 (ja) | 組み換えヒト・インターロイキン―１インヒビターの生産 | |
| KR100361997B1 (ko) | 안정한살균/투과성-증가단백질산물및그것을포함하는제약학적조성물 | |
| JP2004166709A (ja) | 増加した生物学的活性を有する短縮型ケラチノサイト増殖因子（ｋｇｆ） | |
| HUT61049A (en) | Process for producing polypeptides | |
| JPH1121252A (ja) | アルツハイマーアミロイドポリペプチドを使用した薬学的組成物および処置方法 | |
| JPH1057061A (ja) | タンパク質の代謝的安定性の調節方法 | |
| JPH07138292A (ja) | マウス白血病抑制因子 | |
| FI106471B (fi) | Menetelmä polypeptidien valmistamiseksi, polypeptidejä koodaava DNA-sekvenssi, ilmentämisvektori ja isäntäsolu | |
| DE3751169T2 (de) | Zusammensetzungen und Verfahren zur Synthese und Analyse von Enkephalinase. | |
| JPH08503858A (ja) | 生物活性ポリペプチド融合ダイマー | |
| FR2564106A1 (fr) | Vecteurs d'expression du facteur ix, cellules transformees par ces vecteurs et procede de preparation du facteur ix. | |
| US5451659A (en) | Polypeptide, DNA fragment encoding the same, drug composition containing the same and process for producing the same | |
| JPH07504818A (ja) | 細胞内ｐａｃｅ４およびｐａｃｅ４．１遺伝子ならびにポリペプチドに関する組成物および方法 | |
| JPH10262668A (ja) | 血管形成誘導因子をコードするタンパク質コード配列を包含するｄｎａ配列 | |
| US5710033A (en) | Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms | |
| JPH05236962A (ja) | 新規酵素及びそれをコードするｄｎａ | |
| JPS61149089A (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| RU2106408C1 (ru) | Аналог гирудина, днк, вектор, способ получения аналога гирудина | |
| WO1994019462A1 (fr) | Facteurs de croissance de la famille de l'harp, procede d'obtention et applications | |
| JPH06321989A (ja) | 新規ポリペプチド、新規ｄｎａおよび医薬組成物 | |
| JPH0625289A (ja) | 新規ポリペプチド、新規ｄｎａ、医薬組成物およびポリペプチドの製造方法 | |
| Moguilevsky et al. | Recombinant Human Proapolipoprotein AI: Experimental Strategies for the Production of an Authentic Molecule | |
| JPH08291193A (ja) | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドを含有する医薬組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: MINISTERE DE LA REGION WALLONNE, BE |
|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |