FR2804690A1 - Nouvelles famille de proteines, denommees atip, les sequences nucleiques codant pour lesdites proteines et leurs applications - Google Patents
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Abstract
Nouvelle famille de protéines humaines (hATIP), interagissant avec le récepteur AT2 de l'angiotensine. Il et possédant une fonction d'anti-oncogène. Ladite famille de protéines est donc utile pour le diagnostic des états cancéreux et précancéreux et le traitement des états cancéreux. Gène codant pour lesdites protéines, fragments dudit gène et leurs applications pour la détection et l'expression desdites protéines.Anticorps dirigés contre lesdites protéines ainsi qu'à des procédés de détection et/ou de dépistage d'un état précancéreux ou cancéreux à l'aide desdites protéines desdits anticorps et/ou des différentes séquences d'acides nucléiques.
Description
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NOUVELLE FAMILLE DE PROTEINES, DENOMMEES ATIP, LES SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR LESDITES PROTEINES ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention est relative à une nouvelle famille de protéines humaines (hATIP), interagissant avec le récepteur AT2 de l'angiotensine II et possédant une fonction d'anti-oncogène. Ladite famille de protéines est donc utile pour le diagnostic des états cancéreux et précancéreux et le traitement des états cancéreux.
La présente invention est également relative au gène codant pour lesdites protéines ainsi qu'aux transcrits et aux molécules d'ADNc codant pour lesdites protéines, à des fragments de ces différentes molécules d'acide nucléique et à leurs applications pour la détection et l'expression desdites protéines.
La présente invention est également relative à des séquences nucléiques (ADN génomique, transcrits et ADNc) ou protéiques de la famille hATIP, présentant une altération ou une mutation fonctionnelle.
La présente invention est également relative aux différentes protéines hATIP et à leurs applications.
La présente invention est, en outre, relative aux anticorps dirigés contre lesdites protéines ainsi qu'à des procédés de détection et/ou de dépistage d'un état précancéreux ou cancéreux à l'aide desdites protéines desdits anticorps et/ou des différentes séquences d'acides nucléiques.
Le récepteur AT2 de l'angiotensine II est un récepteur à sept domaines transmembranaires, qui appartient ainsi à la famille des récepteurs couplés aux protéines G. Son rôle au cours du développement et de la régénération tissulaire a récemment été démontré (Nouet et al., Trends Endocrinol.
Metabol., 2000,11,1-6). Des souris dont le gène AT2 a été invalidé, présentent des anomalies du développement du tractus urinaire dû à un défaut de l'apoptose des cellules mésenchymateuses (Nishimura et al., Molecular Cell, 1999,3, 1-10). De fait, ce récepteur exerce dans de nombreux tissus un effet
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anti-prolifératif et pro-apoptotique et ce, par le biais de l'activation de protéines tyrosine phosphatases, parmi lesquelles la tyrosine phosphatase SHP-1 (Bedecs et al., Biochem. J., 1997,325, 449-454 ; Lehtonen et al., Mol. Endocrinol., 1999,13, 1051-1060). Très récemment, un effet du récepteur AT2 sur la différenciation et la migration cellulaire a été démontré (Côté et al., J.
Biol. Chem., 1999,274,44,31686-31692).
Tous ces effets (inhibition de croissance, apoptose, différenciation et migration cellulaire) sont en accord avec le rôle prépondérant joué par le récepteur AT2 dans la croissance et le remodelage des tissus. Cependant, les mécanismes intracellulaires associés à l'activation de ce récepteur et à ses effets inhibiteurs de la croissance, restent mal connus.
Pour progresser dans la compréhension des voies de signalisation intracellulaires du récepteur AT2, des protéines interagissant avec les portions intracytoplasmiques de ce récepteur ont été recherchées.
De premières études, entreprises par la méthode du clonage par double hybride dans la levure, ont abouti à la caractérisation d'une protéine humaine apte à se lier au récepteur AT2 (SEQ ID NO:54), qui a fait l'objet d'une demande PCT/FR99/01908.
Cette protéine, dénommée maintenant hATIPl, interagit avec l'extrémité C-terminale du récepteur AT2, mais pas avec celles d'autres récepteurs de la même famille, tels que les récepteurs AT1, (32-adrénergiques ou bradykinine B2.
En interagissant avec le récepteur AT2, la protéine hATIPl joue un rôle dans les voies de signalisation du récepteur AT2 et contribue à atténuer la prolifération cellulaire induite par les facteurs de croissance.
Poursuivant leurs travaux, certains des inventeurs ont maintenant effectivement identifié de nouvelles séquences nucléiques codant pour des protéines homologues à hATIPl (famille hATIP) et interagissant avec le récepteur AT2 ainsi que des séquences génomiques comprenant le gène hATIP ou tout du moins, la majeure partie dudit gène; ils ont également
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identifié ce gène comme gène suppresseur de tumeur. L'invention concerne également l'utilisation de ces séquences pour la détection d'anomalies de l'expression ou de la séquence des protéines de la famille hATIP dans certaines lésions prolifératives et pour le traitement des cellules cancéreuses dont tout ou partie du gène hATIP a été altéré ou délété.
Un grand nombre de travaux décrivent la présence d'un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs, localisés sur le petit bras du chro- mosome 8, en position 8p21.3-p22. Tout ou partie du petit bras du chromo- some 8 est fréquemment délété ou muté dans les tumeurs du colon, du foie, du poumon, de la prostate, du sein, des ovaires, de la sphère ORL et de la ves- sie (Miyakawa et al., Oncol. Rep., 1999,6, 785-789 ; Radford et al., Genomics, 1999,60, 1-11; Yoshimoto et al., Cancer, 1999,85, 447-452). La séquence complète de l'ADN génomique (1,2 millions de nucléotides) contenu dans le segment 8p21.3-p22 a récemment été publiée dans les banques de données (Genbank n AB020859 à n AB020868). Cependant, la détermination de cette séquence ne permet ni d'identifier les séquences effectivement codantes ni ainsi de déterminer l'identité du ou des gènes suppresseurs de tumeurs.
La caractérisation de la famille de protéines hATIP a permis aux Inventeurs de déterminer la structure et l'organisation en introns/exons du gène codant pour ces protéines, situé dans la région chromosomique 8p21.3-p22.
Le gène hATIP humain est organisé en 17 exons au moins, répartis sur plus de 112 kilobases d'ADN génomique ; certains de ces exons peuvent être utilisés de façon alternative, ce qui conduit à la transcription de molécules d'ARNm différentes. Du fait de cet épissage alternatif, ces différentes molécules d'ARNm comportent différents codons ATG initiateurs de la traduction et codent par conséquent pour des protéines de séquences différentes ; les séquences codant pour différentes isoformes de protéines de la famille hATIP (hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5) ont ainsi été identifiées.
Alors que les différentes protéines de cette famille divergent
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dans leur partie N-terminale, elles présentent dans leur partie C-terminale, une zone commune qui caractérise cette famille et qui inclut la zone d'interaction avec le récepteur AT2.
La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADNc isolée, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe cons- titué par : (a) les séquences d'acide nucléique codant pour une protéine hATIP, comprenant au moins un fragment commun à toutes les protéines hATIP de séquence SEQ ID NO :11, qui correspond à la région d'interaction avec le récepteur AT2, laquelle séquence d'acide nucléique ne comprend pas la séquence SEQ ID NO:55; à l'exclusion des séquences GENBANK n AB033114 et n AL096842 ; (b) des variants alléliques de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) (c) des séquences complémentaires des séquences d'acide nucléique, telles que définies en (a) et en (b) ; et (d) des séquences homologues issues de n'importe quel mammifère.
On entend au sens de la présente invention, par séquence homologue, une séquence dont l'identité avec la séquence humaine correspondante (après alignement de séquences) varie de 80 à 99 %.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence d'ADNc, elle comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO :9, une séquence correspondant aux positions 364- 714 de la SEQ ID NO :9 et une séquence qui s'hybride en conditions stringentes (dans les conditions décrites dans Sambrook et al., 1989) avec la séquence SEQ ID NO : 9 et ses fragments.
La séquence SEQ ID NO :9 correspond à un segment de séquence nucléique commun à toutes les séquences codant pour une protéine ATIP, lequel segment inclut la séquence codant pour la région d'interaction
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avec le récepteur AT2.
Les séquences d'ADNc selon la présente invention corres- pondent aux différents ARNm, obtenus par épissage alternatif et codant res- pectivement pour les isoformes hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5.
De manière plus précise, - la séquence codant pour la protéine hATIP2 présente la séquence SEQ ID NO :1 - la séquence codant pour la protéine hATIP3 présente la séquence SEQ ID NO :3 - la séquence codant pour la protéine hATIP4 présente la séquence SEQ ID NO :5 et - la séquence codant pour la protéine hATIP5 présente la séquence SEQ ID NO :7.
Ces différentes séquences d'ADNc correspondent à des épissages alternatifs du gène hATIP; elles permettent de reconstituer l'organisation du gène en exons et introns et par conséquent d'en définir les régions codantes.
La présente invention a également pour objet un segment d'acide nucléique génomique correspondant au gène hATIP codant pour une protéine hATIP, laquelle séquence est caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : (a) une séquence qui correspond à la concaténation des positions 12 636 à 1 de la séquence Genbank n AB020865 et des positions 100 000 à 688 de la séquence Genbank n d'accession AB020864, qui code au moins pour les protéines hATIPl, hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5 (SEQ ID NO : 2, 4,6, 8 et 54) et qui comprend au moins 17 exons codants dont la lecture se fait sur le brin inverse complémentaire desdites séquences n AB020865 et n AB020864 ; à l'exclusion desdites séquences n AB020865 et n AB020864 ; (b) des variants alléliques de la séquence d'acide nucléique
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telle que définie en (a) ; (c) des mutants de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) ou en (b) qui comprennent au moins la substitution d'un nucléo- tide au niveau d'au moins l'un desdits exons; de manière préférée, ladite substitution est trouvée dans au moins un allèle de gène hATIP dans au moins une lignée de cellules tumorales et n'est pas trouvée dans une population de
100 allèles du gène hATIP de cellules normales ; (d) des séquences complémentaires aux séquences d'acide nucléique, telles que définies en (a) et en (b) et (e) des séquences homologues issues de n'importe quel mammifère.
100 allèles du gène hATIP de cellules normales ; (d) des séquences complémentaires aux séquences d'acide nucléique, telles que définies en (a) et en (b) et (e) des séquences homologues issues de n'importe quel mammifère.
De manière plus précise, lesdits exons sont répartis comme suit sur ladite séquence génomique (voir figure 4) : - exon 1 (séquence SEQ ID NO :36) : il comprend au moins 2032 bp et correspond aux positions 12651 à 10620 de la séquence AB020865 (segment 8/11) ; il code pour la partie N-terminale de hATIP3, dont le codon ATG initiateur est en position 86 de la séquence SEQ ID NO : 36 (ou 12550 de AB020865). On peut observer, dans les séquences issues de cellules d'origines différentes, une substitution C/T en position 1973 (SEQ ID NO :36) ou 10664 (AB020865) ; - exon 2 (séquence SEQ ID NO :37) : il comprend 196 bp et correspond aux positions 702 à 507 de AB020865 (segment 8/11) ; - exon 3 (séquence SEQ ID NO :38) : il comprend 61 bp et correspond aux positions 81060 à 81000 de la séquence AB020864 (segment 7/11) ; il est présent dans l'ADNc de hATIP2 (utérus) et absent dans l'ADNc de hATIP3 (cerveau) ; il peut donc être épissé de façon alternative et caractérise le transcrit hATIP2 ; - exon 4 (séquence SEQ ID NO :39) : il comprend 162 bp et correspond aux positions 80731 à 80570 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 4 bis (séquence SEQ ID NO :40) : il comprend au moins
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94 bp et correspond aux positions 78701 à 78608 de AB020864 (segment 7) ; il manque peut-être le début de l'exon ; cet exon est contenu uniquement dans la séquence codant pour hATIP5 ; il peut donc être épissé de manière alternative et caractérise le transcrit hATIP5 ; - exon 5 (séquence SEQ ID NO :41) : il comprend 135 bp et correspond aux positions 72800 à 72666 de AB020864 (segment 7/11); il contient le codon ATG initiateur de hATIP2 en position 72684 de AB020864 ou
117 de SEQ ID NO :41).
117 de SEQ ID NO :41).
- exon 6 (séquence SEQ ID NO :42) : il comprend 39 bp et correspond aux positions 70152 à 70114 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 7 (séquence SEQ ID NO :43) : il comprend 413 bp et correspond aux positions 54567 à 54155 de AB020864 (segment 7/11) ; cet exon est utilisé exclusivement par hATIPl (# épissage alternatif). ; il contient le codon ATG initiateur de hATIPl en position 54275.
- exon 8 (séquence SEQ ID NO :44) : il comprend 215 bp et correspond aux positions 41450 à 41236 de AB020864 (segment 7/11) ; on peut observer, en position 41342 de AB020864, une substitution A/C, qui donne une mutation Lys/Thr, notamment dans certaines tumeurs.
- exon 9 (séquence SEQ ID NO :45) : il comprend 67 bp et correspond aux positions 32194 à 32128 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 10 (séquence SEQ ID NO :46) : il comprend 203 bp et correspond aux positions 12951 à 12749 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 11 (séquence SEQ ID NO :47) : il comprend 106 bp et correspond aux positions 11550 à 11445 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 12 (séquence SEQ ID NO :48) : il comprend 74 bp et correspond aux positions 10382 à 10309 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 13 (séquence SEQ ID NO :49) : il comprend 96 bp et correspond aux positions 10165 à 10070 de AB020864 (segment 7/11) ; on observe une substitution G/C, en position 10141 de AB020864, qui donne une mutation Glu/Gln dans certaines tumeurs.
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- exon 14 (séquence SEQ ID NO :50) : il comprend 117 bp et correspond aux positions 6845 à 6729 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 15 (séquence SEQ ID NO :51) : il comprend 98 bp et correspond aux positions 3961 à 3864 de AB020864 (segment 7/11) et - exon 16 (séquence SEQ ID NO :52) : il comprend 2333 bp et correspond aux positions 3021 à 689 de AB020864 (segment 7/11) ; il contient le codon stop commun à toutes les protéines hATIP (TGA en position 117 de la séquence SEQ ID NO :52).
Les exons utilisés par toutes les isoformes de hATIP sont les exons 8 à 16.
La présente invention a également pour objet des fragments desdites séquences génomiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués de l'un des exons comportant à son extrémité 5' et/ou à son extrémité 3', un segment d'intron comprenant de 1 à 300 pb ; ledit fragment comprend de préférence entre 15 et 50 pb, et est inclus dans ledit segment d'intron de la séquence génomique pouvant se situer à une distance de 1 à 200 pb en amont et/ou en aval desdits exons.
De manière plus précise, lesdits fragments sont sélectionnés parmi les séquences SEQ ID NO : 56-72.
Dans ces séquences, la frontière entre intron et exon ne doit pas être considérée comme précise au nucléotide près.
La présente invention inclut également des fragments des séquences d'acide nucléique telles que définies ci-dessus et leurs séquences complémentaires (y compris les transcrits).
De préférence : - lorsque ces fragments comprennent entre 50 et 1000 pb, ils sont utiles comme sondes ; - lorsque ces fragments comprennent entre 15 et 50 pb, ils sont utiles comme amorces.
Parmi lesdits fragments, on peut notamment citer les frag-
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ments suivants :
1. des sondes : . Sonde B1260 (séquence SEQ ID NO :18) : hybride toutes les séquences codant pour une hATIP ; s'étend sur les exons 11 à 16 ; elle est obte- nue par RT-PCR avec les oligonucléotides B1249 (SEQ ID NO :21)/B1251 (SEQ
ID NO :22) ; elle permet de détecter le gène hATIP et les différentes formes de l'ARNm de hATIP par hybridation de l'ADN génomique ou de l'ARNm humain dans des conditions d'hybridation stringentes.
1. des sondes : . Sonde B1260 (séquence SEQ ID NO :18) : hybride toutes les séquences codant pour une hATIP ; s'étend sur les exons 11 à 16 ; elle est obte- nue par RT-PCR avec les oligonucléotides B1249 (SEQ ID NO :21)/B1251 (SEQ
ID NO :22) ; elle permet de détecter le gène hATIP et les différentes formes de l'ARNm de hATIP par hybridation de l'ADN génomique ou de l'ARNm humain dans des conditions d'hybridation stringentes.
. Sonde B1298 (séquence SEQ ID NO:19): spécifique de hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5 ; s'étend sur exons 4 à 6 à l'exception de l'exon 4bis ; elle est obtenue par RT-PCR avec les oligonucléotides B1264 (SEQ ID NO :23)/B1265 (SEQ ID NO :24) ; elle permet d'identifier les séquences codant pour hATIP2, hATIP 3, hATIP 4 et hATIP5, mais n'hybride pas avec la séquence hATIPl, même dans des conditions d'hybridation peu stringentes.
. Sonde de séquence SEQ ID NO :20, spécifique de hATIPl ; comprend uniquement l'exon 7 ; elle est obtenue par PCR sur ADN génomique ou par RT-PCR avec les oligonucléotides B1262 (SEQ ID NO : 25)/B1301 (SEQ ID NO :26).
2. des fragments utiles pour amplifier un segment codant pour une hATIP : a) amorces pour l'amplification de la sonde B1260 (commune à tous les hATIP) (séquence SEQ ID NO :18) : - oligonucléotide B1249 : 23-mer sens (SEQ ID NO :21), localisé dans l'exon 11 (SEQ ID NO :47) : positions 11501 à 11523 de AB020864 et - oligonucléotide B1251 : antisens (SEQ ID NO :22), localisé dans l'exon 16 (SEQ ID NO :52) : positions 2711 à 2734 de AB020864. b) amorces pour l'amplification de la sonde B1298 (spécifique de hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5) (SEQ ID NO: 19): - oligonucléotide B1264 : 21-mer sens (SEQ ID NO :23), localisé dans l'exon 4 (SEQ ID NO :39) : positions 80708-80728 de AB020864 et
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- oligonucléotide B1265 : antisens (SEQ ID NO :24), localisé dans l'exon 6 (SEQ ID NO :42) : positions 70111-70129 de AB020864. c) amorces pour l'amplification de la séquence SEQ ID NO :20, spécifique de hATIPl (amplification de l'exon 7) - oligonucléotide B1262 : 21-mer sens (SEQ ID NO :25), loca- lisé dans l'exon 7 (SEQ ID NO :43) : positions 54512-54532 de AB020864 et - oligonucléotide B1301: 19-mer antisens (SEQ ID NO :26), localisé dans l'exon 7 (SEQ ID NO :43) : positions 54158-54177 de AB020864.
3. des fragments utiles pour détecter un polymorphisme ou une mutation apparaissant dans des cellules cancéreuses : a) amplification de l'exon 8 en vue de détecter la mutation Lys/Thr (AA 56 de la séquence SEQ ID NO :2) : - oligonucléotide B1318 : 22-mer sens (SEQ ID NO :27), localisé dans l'intron précédant l'exon 8 (SEQ ID NO :64) : positions 41584-41605 de AB020864 ; - oligonucléotide B1319 : 22-mer antisens (SEQ ID NO :28), localisé dans l'intron qui suit l'exon 8 (SEQ ID NO :64) : positions 41221-41242 de AB020864.
Cette paire d'oligonucléotides produit par amplification de l'ADN génomique, un fragment de 385 bp, dans lequel une substitution A/C en position 41342 de AB020864 génère un site de restriction pour l'enzyme NIaIII : on obtient des fragments de 258 et 127 bp, si l'ADN est muté, alors qu'il n'y pas de clivage dans l'ADN sauvage : un seul fragment de 385 pb est obtenu dans ce cas. b) amplification de l'exon 13 en vue de détecter la mutation Glu/Gln (AA 250 de la séquence SEQ ID NO :2) : - oligonucléotide B1308 : 22-mer sens (SEQ ID NO :29), localisé dans l'intron précédant exon 13 (SEQ ID NO :69) : positions 10205-10226 de AB020864 ; et - oligonucléotide B1309 : 22-mer antisens (SEQ ID NO :30),
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localisé dans l'intron qui suit l'exon 13 (SEQ ID NO :69) : positions 9894-9915 de AB020864.
Cette paire d'oligonucléotides produit après amplification de l'ADN génomique, un fragment de 333 bp, dans lequel une substitution G/C en position 10141 de AB020864 (dans l'exon 13) (entraînant une mutation
Glu/Gln) génère un site de restriction pour l'enzyme Hinfl.
Glu/Gln) génère un site de restriction pour l'enzyme Hinfl.
- oligonucléotide B1310: 19-mer sens (SEQ ID N0:73), localisé dans l'intron qui précède l'exon 13 (SEQ ID NO : 69) : positions 10198-
10216 de AB020864 et - oligonucléotide B1311: 19-mer antisens (SEQ ID N0:74), localisé dans l'intron qui suit l'exon 13 (SEQ ID NO :69) : positions 9979-9997 de AB 020864.
10216 de AB020864 et - oligonucléotide B1311: 19-mer antisens (SEQ ID N0:74), localisé dans l'intron qui suit l'exon 13 (SEQ ID NO :69) : positions 9979-9997 de AB 020864.
Cette paire d'oligonucléotides produit après amplification de l'ADN génomique, un fragment de 238 pb, dans lequel une substitution G/C en position 10141 de AB020864 (dans l'exon 13) (entraînant une mutation Glu/Gln) génère un site de restriction pour l'enzyme Hinfl : on obtient trois fragments de 132,71 et 35bp, quand l'ADN est muté et deux fragments de 203 et 35 pb quand l'ADN est sauvage. c) amplification de l'exon 1 en vue de détecter la substitution C/ T (Gin/Stop) : - oligonucléotide B1314 : 22-mer sens (SEQ ID NO :31), localisé dans l'exon 1 : positions 10977-10998 de AB020865 ; et - oligonucléotide B1315 : 22-mer antisens (SEQ ID NO :32), localisé dans l'exon 2 : positions 566-587 de AB020865.
Cette paire d'oligonucléotides produit, après amplification de l'ARNm (RT-PCR), un fragment de 516 bp (SEQ ID NO :33), qu'il y a lieu de séquencer, pour détecter la substitution C/T en position 10664 de AB020865 [création d'un codon stop en position 630 de hATIP3 (SEQ ID NO :4)] et la substitution A/G en position 10987 de AB020865 [création d'un remplacement d'un résidu His en Arg en position 522 de hATIP3 (SEQ ID NO :4)].
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4. des fragments utiles pour détecter un épissage alternatif a) amplification de l'exon 3 en vue de détecter un épissage alternatif, permettant de distinguer hATIP2 de hATIP3 : - oligonucléotide B1312 : 22-mer sens (SEQ ID NO :34), loca- lisé dans l'exon 2 (SEQ ID NO :37) : positions 562-583 de AB020865 ; et - oligonucléotide B1313 : 22-mer antisens (SEQ ID NO :35), localisé dans l'exon 5 (SEQ ID NO :41) : positions 72687-72708.
Cette paire d'oligonucléotides produit, après amplification de l'ARNm (RT-PCR), un fragment de 414 bp si l' exon 3 est présent et un fragment de 354 bp si l'exon 3 est absent.
Les conditions expérimentales pour l'amplification par PCR sont similaires pour toutes les paires d'oligonucléotides : nombre de cycles : 30; température d'hybridation entre 50 C et 55 C, en présence de Taq polymérase à ADN Proméga, selon les spécifications du fournisseur.
Les différentes séquences nucléiques (ADNc, séquences génomique ou fragments de ces séquences) peuvent être obtenues par des méthodes connues, par exemple par extension d'une séquence nucléique codant pour une protéine hATIP selon l'invention par PCR ou PCR inverse ou par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle.
Ces différentes séquences d'acides nucléiques permettent, soit de déterminer le profil d'expression de l'ARNm hATIP et une éventuelle altération de ce profil dans un tissu ou un échantillon biologique, soit de mettre en évidence le gène hATIP, des variants alléliques de ce gène et une éventuelle altération de ce gène hATIP (remaniements, délétions, mutations ponctuelles) et par voie de conséquence d'évaluer l'existence d'un état cancéreux.
Les différentes séquences nucléiques définies ci-dessus constituent de bons outils de diagnostic pour la mise en évidence de cellules cancéreuses ayant muté, délété ou réarrangé le gène suppresseur de tumeurs
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correspondant (gène ATIP) et/ou de pronostic pour la mise en évidence de cellules cancéreuses par détection d'une altération des séquences ou de l'expression des produits de ce gène.
La présente invention a également pour objet un réactif de détection, constitué par au moins une séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence nucléique choisie dans le groupe constitué par le réactif de détection nucléique tel que défini ci-dessus, la séquence nucléique SEQ ID NO :53 codant pour hATIPl et les fragments d'au moins 15 pb de ladite séquence SEQ ID NO :53 pour l'évaluation, le pronostic et/ ou la détection d'un état précancéreux ou cancéreux.
Les différentes séquences d'acide nucléiques, telles que définies ci-dessus, peuvent être également avantageusement utilisées pour construire des vecteurs d'expression d'une protéine hATIP, aptes à être utilisés pour produire lesdites protéines ou en thérapie génique.
La présente invention a donc également pour objet des vecteurs, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence codant pour tout ou partie d'une protéine hATIP humaine telle que définie ci-dessus. Dans de tels vecteurs, la séquence codant pour la protéine hATIP est sous le contrôle d'éléments de contrôle de transcription et de traduction appropriés.
Ces vecteurs peuvent être obtenus et introduits dans une cellule hôte par des techniques connues.
L'invention a également pour objet une cellule hôte eucaryote ou procaryote transformée par un vecteur tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet des protéines ATIP isolées et purifiées, caractérisées en ce qu'elles sont codées par une séquence d'ADNc ou un transcrit ou un fragment d'acide nucléique génomique, tels que définis ci-dessus.
De manière plus précise, elles comprennent au moins un
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fragment commun à toutes les protéines hATIP, qui correspond à la région d'interaction avec le récepteur AT2 sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:11 et SEQ ID N0:12, lesquelles protéines ne comprennent pas la séquence SEQ ID NO :13, spécifique de hATIP1, dans leur portion N-terminale.
Lesdites protéines représentent de nouvelles isoformes interagissant avec le récepteur AT2.
De manière encore plus précise : - la protéine hATIP2 présente la séquence SEQ ID NO :2 - la protéine hATIP3 présente la séquence SEQ ID NO :4 - la protéine hATIP4 présente la séquence SEQ ID NO :6 et - la protéine hATIP5 présente la séquence SEQ ID NO :8.
Ces différentes isoformes correspondent à des épissages alternatifs du gène hATIP : - hATIPl, qui fait l'objet de la demande précitée PCT/FR99/01908, correspond au produit d'épissage des exons 7 à 16 ; - hATIP2 correspond au produit d'épissage des exons 1 à 16 à l'exception des exons 4bis et 7 ; - hATIP3 correspond au produit d'épissage des exons 1 à 16 à l'exception des exons 3, 4bis et 7; - hATIP4 correspond à un produit d'épissage identique à celui de hATIP3 ; toutefois sa partie N-terminale est plus courte du fait de la présence d'un codon stop dans l'exon 1 ; ce codon stop est dû à une substitution C/T en position 10664 de la séquence n AB020865.
- hATIP5 correspond au produit d'épissage des exons 4 bis à 16, à l'exception de l'exon 7.
De manière avantageuse, lesdites hATIP comprennent des motifs particuliers, situés dans la séquence SEQ ID NO :10, commune à toutes les protéines ATIP et contenant la séquence SEQ ID NO :11, correspondant à la région d'interaction avec le récepteur AT2; lesdits motifs participent à
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l'action spécifique desdites protéines (voir figure 2) : - motifs fermeture à leucine (leucine zipper) : L(6X) L (6X)
L(6X), en positions 214-235 et en position 266-287, en référence à la séquence
SEQ ID NO :10.
L(6X), en positions 214-235 et en position 266-287, en référence à la séquence
SEQ ID NO :10.
- domaines coiled-coil, en positions 60-116 et en positions 140-
331, en référence à la séquence SEQ ID NO : 10.
331, en référence à la séquence SEQ ID NO : 10.
Les domaines coiled-coil favorisent les interactions protéi- nes/protéines et la dimérisation. La présence d'un grand domaine coiled-coil dans les séquences communes à toutes les hATIP indique que ces protéines hATIP sont capables de s'homo-ou hétéro-dimériser, et que c'est cette propriété qui pourrait assurer leur fonction d'interaction avec le récepteur AT2, et éventuellement leur rôle de suppresseur de tumeur.
Les Inventeurs ont trouvé que dans certaines tumeurs, on observe des mutations au niveau de ladite région d'interaction avec le récepteur AT2 ; on peut trouver, par exemple la mutation E/Q (position 231 de la séquence SEQ ID NO :10) ; cette mutation est située au milieu du premier motif de fermeture à leucine et en plein milieu de la région coiled-coil.
D'autres motifs sont localisés dans des parties spécifiques des différentes protéines hATIP (voir figure 1) : . Protéine hATIPl : 2 sites consensus de N-myristylation, qui correspondent respectivement aux positions 20-25 et 30-35 de la séquence SEQ ID NO : 13 ; ce signal permet une éventuelle modification post-traductionnelle de la protéine (myristylation) qui cible la protéine à la membrane. Un tel signal pourrait permettre l'interaction de ATIP avec des protéines membranaires.
. Protéine hATIP2 : de localisation nucléaire [Nuclear Localisation Signal (NLS) ] bipartite, qui correspond aux positions 10-25 de la séquence SEQ ID NO :2 ; ce signal cible potentiellement hATIP2 dans le noyau, et pourrait permettre la dimérisation d'ATIP avec des protéines nucléaires.
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. Protéine hATIP3 : 7 sites consensus de N-myristylation (voir figure 1).
. Protéine hATIP4 : 2 sites consensus de N-myristylation.
. Protéine hATIP5 : 2 sites consensus de N-myristylation.
Ces différentes protéines ainsi que la protéine hATIPl ont une action sur la prolifération des cellules cancéreuses et trouvent notamment application pour la préparation de médicaments anticancéreux ; par exemple, la ré-introduction dans les cellules cancéreuses du gène hATIP ou de produits d'épissages appropriés du gène hATIP, permet de restaurer une prolifération normale des cellules tumorales. Tout ou partie desdites protéines peuvent également être directement utilisées dans le traitement des tumeurs.
La présente invention a également pour objet un médicament anti-tumoral, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence d'acide nucléique nue, codant pour tout ou partie d'une protéine hATIP, telle que définie ci-dessus ou un vecteur tel que défini ci-dessus, ou une celle hôte telle que définie cidessus, ou tout ou partie d'une protéine hATIP telle que définie ci-dessus.
Les protéines selon l'invention incluent également toute protéine (naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante) de n'importe quel mammifère ; elles comprennent, de manière générale, un domaine d'interaction avec le récepteur AT2 qui présente la séquence SEQ ID NO :12 et comprennent ou sont constituées : - soit par une isoforme ATIP fonctionnelle, - soit par un mutant fonctionnellement modifié d'une isoforme ATIP (présent dans des cellules cancéreuses, par exemple).
On entend par protéine fonctionnelle, une protéine qui présente une activité biologique normale (inhibition de la prolifération cellulaire et effet anti-oncogène ou suppresseur de tumeur).
On entend par mutant fonctionnellement modifié d'une protéine, un mutant qui comprend une ou plusieurs mutations qui induisent une modification substantielle de son activité. De tels mutants sont notamment
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ceux détectés dans les cellules cancéreuses.
Les mutants hATIP peuvent présenter une identité inférieure à 70% avec l'une des isoformes hATIP, telles que définies ci-dessus ; cepen- dant, l'identité des séquences non-modifiées de ces mutants, lorsqu'ils sont alignés avec les séquences des isoformes hATIP correspondantes reste élevée et peut être supérieure à 70%.
La présente invention a également pour objet des fragments des protéines telles que définies ci-dessus, comprenant au moins 12 acides aminés et notamment les fragments de séquence SEQ ID NO :10 et 12 à 17.
La présente invention a en outre pour objet des anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une protéine ATIP ou un fragment de protéine hATIP selon l'invention.
Les anticorps dirigés contre une isoforme hATIP fonctionnelle ou non ou contre la zone commune à l'ensemble des isoformes hATIP domaine peuvent ainsi être obtenus. Ils peuvent être avantageusement soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux.
De tels anticorps trouvent application comme outil de diagnostic pour la détection de cellules cancéreuses ayant muté ou délété le gène suppresseur de tumeurs correspondant (gène hATIP).
La présente invention a également pour objet un réactif de détection, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par au moins une protéine telle que définie ci-dessus, au moins un fragment de protéine tel que défini ci-dessus et au moins un anticorps tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence protéique choisie dans le groupe constitué par au moins une protéine telle que définie ci-dessus, au moins un fragment de protéine tel que défini ci-dessus ou au moins un anticorps tel que défini ci-dessus, la séquence SEQ ID NO :54, les fragments d'au moins 12 acides aminés de ladite séquence SEQ ID NO :54 et les anticorps dirigés contre ladite protéine de séquence SEQ ID NO :54 ou ses fragments pour l'évaluation, le pronostic et/ ou la détection
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d'un état précancéreux ou cancéreux.
La présente invention a également pour objet des moyens de détection et de correction d'états précancéreux ou cancéreux.
De manière plus précise, l'invention a pour objet des métho- des qui mettent en #uvre les séquences nucléiques et/ ou les séquences protéiques telles que définies ci-dessus pour l'évaluation, le diagnostic ou le pronostic d'un état précancéreux ou cancéreux.
Par exemple, l'invention a pour objet des méthodes de diagnostic d'un état cancéreux ou précancéreux chez l'homme, qui compren- nent: - soit la détection de l'expression d'un mutant fonctionnelle- ment modifié du gène hATIP, dans un échantillon d'acide nucléique, - soit la détection d'un épissage alternatif (établissement d'un profil d'expression des différents isoformes de hATIP, au niveau de l'ARNm ou des protéines), - soit la détection d'une perte d'expression de l'une ou l'autre des différentes isoformes d'hATIP au niveau de l'ARNm ou des protéines.
Les séquences nucléiques selon l'invention peuvent avantageusement être mises en oeuvre dans ces méthodes.
La présente invention a ainsi également pour objet un procédé de détection d'une délétion, d'une insertion ou d'une substitution dans le gène hATIP, pour évaluer le risque de développer un état cancéreux, qui comprend : - l'obtention d'un échantillon d'acide nucléique, et - la détection de la présence dans ledit échantillon d'acide nucléique d'une séquence d'acide nucléique codant pour un mutant hATIP, à l'aide d'au moins un réactif de détection nucléique, tel que défini ci-dessus et/ ou de la séquence nucléique SEQ ID NO :53 codant pour hATIPl et des fragments d'au moins 15 pb de ladite séquence SEQ ID NO : 53.
Selon un mode de mise en #uvre avantageux dudit procédé,
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il comprend pour ladite détection : . la mise en contact dudit échantillon d'acide nucléique avec une paire d'amorces aptes à amplifier une région dudit gène hATIP contenant éventuellement une mutation et . la détection de ladite mutation par séquençage de la séquence obtenue ou par mise en contact de ladite séquence avec au moins une enzyme de restriction appropriée et analyse des fragments obtenus par rapport à un échantillon contrôle normal.
Selon un autre mode de mise en #uvre dudit procédé, il comprend pour ladite détection : . l'isolement, à partir de l'ADN génomique d'un patient, et de l'ADN génomique d'un sujet contrôle dont le gène hATIP ne comporte aucune mutation, d'une portion du gène hATIP codant pour une protéine hATIP qui inclut l'un ou l'autre des exons tels que définis ci-dessus (SEQ ID NO :36 à 52), et . l'hybridation de la séquence génomique dudit patient et dudit sujet contrôle avec une sonde marquée spécifique de ladite portion de séquence du gène hATIP, puis . la détection directe des mésappariements et/ ou la mise en contact avec une enzyme de restriction appropriée et la séparation des fragments de restriction obtenus.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'au moins une isoforme de hATIP, à partir d'un échantillon biologique à l'aide d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, tels que définis cidessus et/ou les anticorps dirigés contre la protéine de séquence SEQ ID NO :54 ou ses fragments d'au moins 12 acides aminés.
La présente invention a également pour objet une méthode d'établissement du profil d'expression des ARNm hATIP d'un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend : - le prélèvement d'un échantillon
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- l'extraction de l'ARNm, - soit la transcription inverse (RT) dudit ARNm et les amplifi- cations successives on concomitantes des ADNc obtenus en présence d'amorces spécifiques de chaque isoforme de hATIP, puis l'analyse des pro- duits d'amplification obtenus par électrophorèse, soit l'hybridation dudit
ARNm avec une sonde spécifique, isolée à partir des séquences nucléiques telles que définies ci-dessus et - l'établissement du profil de transcription hATIP dudit échantillon.
ARNm avec une sonde spécifique, isolée à partir des séquences nucléiques telles que définies ci-dessus et - l'établissement du profil de transcription hATIP dudit échantillon.
La présente invention a également pour objet une méthode d'établissement du profil d'expression des protéines hATIP d'un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend : - le prélèvement d'un échantillon, - la mise en contact d'un lysat cellulaire extrait dudit échantillon avec des anticorps spécifiques des différentes isoformes de hATIP et - l'établissement du profil d'expression des protéines hATIP dudit échantillon, par détection des complexes formés.
L'invention a, en outre, pour objet des kits ou trousses pour la mise en #uvre des différentes méthodes selon l'invention.
Lesdits kits comprennent, de manière préférée, au moins une paire d'amorces et au moins une sonde, éventuellement marquée, tels que définis ci-dessus, et éventuellement des enzymes de restriction appropriées.
Ils peuvent être mis en #uvre, en associations avec des kits d'amplifications ; ils peuvent également inclure des contrôles négatifs et positifs, des marqueurs de taille moléculaire pour le gel d'électrophorèse, par exemple.
D'autres kits selon l'invention peuvent inclure des anticorps, éventuellement marqués, ainsi que des réactifs appropriés à la détection de complexes antigènes-anticorps. ; peuvent également inclure des contrôles positifs et négatifs.
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Les acides nucléiques selon l'invention peuvent également être utilisés dans un but thérapeutique, par exemple pour restaurer un effet suppresseur de tumeur.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre une comparaison des séquences en acides aminés : hATIPl, hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5, les sites consensus de N-myristylation sont soulignés, - la figure 2 illustre la séquence en acides aminés commune aux différentes hATIP (SEQ ID NO :10), dans laquelle les deux motifs fermeture à leucine sont indiqués en gras et les domaines coiled-coil sont soulignés, - la figure 3 illustre de façon schématique l'utilisation alternative de différents exons du gène hATIP (chromosome 8p21.-p22), permettant la production de 5 formes d'ARNm différents (hATIPl à 5) : la localisation des exons, par rapport aux séquences Genbank n AB020864 et n AB020865, est indiquée par une double flèche, les exons (3,4 bis et 7) utilisés de façon alternative sont encadrés, le début de la traduction protéique est représenté par un drapeau, et la position des codons stop est représentée par une étoile, - la figure 4 illustre la structure en introns et en exons de la séquence du gène hATIP : la localisation des différents exons est précisée par rapport aux séquences Genbank n AB020864 et n AB020865, - la figure 5 illustre l'analyse du gène hATIP par Southern blot, sur l'ADN génomique humain de cellules tumorales humaines (pistes 1- 3) ou de cellules normales de placenta humain (piste 4), après clivage avec les enzymes de restriction HindIII ou EcoRI et hybridation avec la sonde (B1260, SEQ ID NO :18), couvrant les exons 11 à 16 du gène hATIP, - la figure 6 illustre l'analyse du profil d'expression des transcrits hATIP dans des lignées cellulaires tumorales humaines de différentes
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origines : pistes 1 à 6 : colon ; piste 7 : foie ; pistes 8 et 9 : poumon ; piste 10 : sein ; pistes 11 : et 12 : ovaires et piste 13 : sphère ORL par Northern blot à l'aide de la sonde (B1260, SEQ ID NO :18), couvrant les exons 11 à 16 du gène hATIP, - la figure 7 illustre la détection, par PCR et analyse de restric- tion, de la substitution G/C en position 10141 de la séquence AB020864 (exon
13), correspondant à la mutation Glu/Gln à l'acide aminé 250 de SEQ ID
NO :2, à partir de cellules tumorales humaines : produits de PCR obtenus à partir de l'ADN sauvage avant et après clivage par l'enzyme Hinfl (pistes 1 et
2), produits de PCR obtenus à partir de l'ADN muté en position 10141, avant et après clivage par ladite enzyme (pistes 3 et 4), - la figure 8 illustre l'analyse du profil d'expression des protéines de la famille hATIP dans des lignées cellulaires tumorales humaines de différentes origines : sphère ORL (piste 1), prostate (pistes 2 et 11), colon (pistes 3, 6,10 et 13), foie (piste 4), poumon (pistes 5, 8 et 12), ovaire (pistes 7 et 9), par immunoblot à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la séquence (SEQ ID NO :10), commune aux protéines hATIP.
13), correspondant à la mutation Glu/Gln à l'acide aminé 250 de SEQ ID
NO :2, à partir de cellules tumorales humaines : produits de PCR obtenus à partir de l'ADN sauvage avant et après clivage par l'enzyme Hinfl (pistes 1 et
2), produits de PCR obtenus à partir de l'ADN muté en position 10141, avant et après clivage par ladite enzyme (pistes 3 et 4), - la figure 8 illustre l'analyse du profil d'expression des protéines de la famille hATIP dans des lignées cellulaires tumorales humaines de différentes origines : sphère ORL (piste 1), prostate (pistes 2 et 11), colon (pistes 3, 6,10 et 13), foie (piste 4), poumon (pistes 5, 8 et 12), ovaire (pistes 7 et 9), par immunoblot à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la séquence (SEQ ID NO :10), commune aux protéines hATIP.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Détection de remaniements du gène hATIP dans des cellules cancéreuses par Southern blot, sur l'ADN génomique, en utilisant la sonde B1260 (SEQ ID NO : 18). a) Matériels et méthodes
L'extraction de l'ADN génomique total, la préparation et le marquage des sondes ainsi que l'hybridation par Southern-Blot sont réalisées selon les techniques classiques décrites dans Sambrook et al., 1989. Les échantillons d'ADN génomique total, préparés à partir de lignées de cellules tumorales humaines issues de tumeurs de différentes origines (sein, sphère ORL et ovaire) ou de cellules normales issues de placenta humain, sont digérés soit
L'extraction de l'ADN génomique total, la préparation et le marquage des sondes ainsi que l'hybridation par Southern-Blot sont réalisées selon les techniques classiques décrites dans Sambrook et al., 1989. Les échantillons d'ADN génomique total, préparés à partir de lignées de cellules tumorales humaines issues de tumeurs de différentes origines (sein, sphère ORL et ovaire) ou de cellules normales issues de placenta humain, sont digérés soit
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avec HindIII ou EcoRI. Les fragments obtenus sont séparés sur gel d'agarose puis transférés sur membrane de nylon ; la membrane est hybridée avec la sonde B1260 (SEQ ID NO :18) radiomarquée, dans le tampon : 45 % forma- mide, 0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % Ficoll, 0,1 % sodium pyrophosphate, 0,01 % SDS, 0,05 mM Tris pH 7,5 et 0,9 M NaCl, à 45 C, lavée à faible stringence (2X SSC, 0,01 % SDS à 45 C, puis autoradiographiée 72 h à -
80 C. b) Résultats
L'analyse du gène hATIP à l'aide de la sonde B1260 qui cou- vre les exons 11 à 16 dudit gène (figure 5), montre un profil de restriction différent dans des lignées de cellules tumorales de différentes origines (figure : sein (piste 1), sphère ORL (piste 2) et ovaires (piste 3)), par rapport aux cellules normales contrôle (piste 4), arpès clivage avec les enzymes de restriction HindIII et EcoRI.
80 C. b) Résultats
L'analyse du gène hATIP à l'aide de la sonde B1260 qui cou- vre les exons 11 à 16 dudit gène (figure 5), montre un profil de restriction différent dans des lignées de cellules tumorales de différentes origines (figure : sein (piste 1), sphère ORL (piste 2) et ovaires (piste 3)), par rapport aux cellules normales contrôle (piste 4), arpès clivage avec les enzymes de restriction HindIII et EcoRI.
EXEMPLE 2 : Analyse du profil d'expression des transcrits du gène hATIP dans des lignées cellulaires issues de tumeurs humaines de différentes origines a) Matériels et méthodes
L'extraction des ARN, la préparation et le marquage des sondes ainsi que l'hybridation par Northern blot sont réalisées selon les techniques classiques décrites dans Sambrook et al., 1989. Environ 5 g d'ARN poly (A+) préparés à partir de lignées cellulaires tumorales humaines issues de tumeurs de différentes origines (sphère ORL, langue, ovaire, poumon, colon et foie) sont séparés sur gel d'agarose puis transférés sur membrane de nylon ; la membrane est hybridée avec la sonde B1260 (SEQ ID NO :18) radiomarquée, dans le tampon : 45 % formamide, 9 % Dextran-sulfate, 0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % Ficoll, 0,1 % sodium pyrophosphate, 0,01 % SDS, 0,05 mM Tris pH 7,5 et 0,9 M NaCl, à 45 C, lavée à faible stringence (2X SSC, 0,01 % SDS à 45 C, puis autoradiographiée 72 h à -80 C. b) Résultats
L'extraction des ARN, la préparation et le marquage des sondes ainsi que l'hybridation par Northern blot sont réalisées selon les techniques classiques décrites dans Sambrook et al., 1989. Environ 5 g d'ARN poly (A+) préparés à partir de lignées cellulaires tumorales humaines issues de tumeurs de différentes origines (sphère ORL, langue, ovaire, poumon, colon et foie) sont séparés sur gel d'agarose puis transférés sur membrane de nylon ; la membrane est hybridée avec la sonde B1260 (SEQ ID NO :18) radiomarquée, dans le tampon : 45 % formamide, 9 % Dextran-sulfate, 0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % Ficoll, 0,1 % sodium pyrophosphate, 0,01 % SDS, 0,05 mM Tris pH 7,5 et 0,9 M NaCl, à 45 C, lavée à faible stringence (2X SSC, 0,01 % SDS à 45 C, puis autoradiographiée 72 h à -80 C. b) Résultats
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La figure 6 montre, dans les cellules tumorales humaines is- sues de tumeur de différentes origines (sein, sphère ORL, ovaire, poumon, colon et foie), les différents niveaux d'expression de transcrits de 7,2kb; 5kb ;
3,5kb et 2kb ; les transcrits hATIP2, hATIP3 et hATIP4 sont contenus dans le produit d'hybridation de 7,2 kb. Les autres produits d'hybridation, qui présentent des tailles différentes, contiennent des transcrits non encore identifiés.
3,5kb et 2kb ; les transcrits hATIP2, hATIP3 et hATIP4 sont contenus dans le produit d'hybridation de 7,2 kb. Les autres produits d'hybridation, qui présentent des tailles différentes, contiennent des transcrits non encore identifiés.
EXEMPLE 3 : Amplification comparée d'un fragment de 238 pb : Détection d'une mutation sur de l'ADN génomique, par PCR et analyse de restriction. a) Matériels et méthodes
L'ADN génomique est extrait à partir des cellules tumorales comme décrit à l'exemple 1, l'amplification PCR est réalisée à l'aide de la Taq polymérase à ADN (Proméga), selon le protocole recommandé par le produc- teur, dans les conditions expérimentales suivantes : de cycles : 30 ; température d'hybridation : 55 C.
L'ADN génomique est extrait à partir des cellules tumorales comme décrit à l'exemple 1, l'amplification PCR est réalisée à l'aide de la Taq polymérase à ADN (Proméga), selon le protocole recommandé par le produc- teur, dans les conditions expérimentales suivantes : de cycles : 30 ; température d'hybridation : 55 C.
La détection de la substitution G/C en position 10141 de la séquence AB020864 (exon 13) est effectuée selon le protocole suivant : - amplification comparée d'un fragment de 238 pb de l'exon 13 à l'aide des amorces SEQ ID NO :73 et SEQ ID NO :74, dans un échantillon de cellules tumorales à analyser, et dans un échantillon de cellules normales (contrôle).
- digestion par HinfI - séparation des produits obtenus en gel d'agarose 2% : lapré- sence de deux produits de clivage (203 et 35 bp) est caractéristique d'une séquence d'ADN sauvage. La substitution G/C en position 10141 de la séquence AB020864 génère un site de restriction additionnel pour l'enzyme Hinfl. La détection de trois fragments d'ADN (132,71 et 35 bp) est caractéristique d'une séquence d'ADN muté. b) Résultats
La figure 7 montre la détection de la substitution G/C en po-
La figure 7 montre la détection de la substitution G/C en po-
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sition 10141 de la séquence AB020864 (exon 13), correspondant à la mutation Glu/Gln à l'acide aminé 250 de SEQ ID NO :2, à partir de cellules tumorales humaines. La présence de deux produits de clivage (203 et 35 bp) est caracté- ristique d'une séquence d'ADN sauvage. La détection de trois fragments d'ADN (132, 71 et 35 bp) est caractéristique d'une séquence d'ADN muté.
EXEMPLE 4 : Production d'anticorps.
1. Production d'anticorps dirigés contre toutes les protéines hATIP
Un sérum polyclonal anti-hATIP est produit chez le lapin, par injection d'une protéine de fusion comprenant la séquence SEQ ID NO :11 fusionnée à 6 résidus histidine.
Un sérum polyclonal anti-hATIP est produit chez le lapin, par injection d'une protéine de fusion comprenant la séquence SEQ ID NO :11 fusionnée à 6 résidus histidine.
Ces anticorps polyclonaux utilisés en immunoblot identifient trois polypeptides majeurs de poids moléculaires apparents : 32kDa, 64 kDa et 180 kDa, dans des lysats cellulaires issus de différentes lignées tumorales humaines (voir exemple 5).
Ces anticorps détectent aussi la présence d'un polypeptide de poids moléculaire apparent de 57 kDa, dans le lysat de certaines cellules tumorales. La détection de protéines ATIP de tailles aberrantes dans des lysats tissulaires constitue une méthode diagnostique pour le dépistage de certains cancers.
2. Production d'anticorps reconnaissant spécifiquement l'un ou l'autre membre de la famille hATIP . des anticorps spécifiques des polypeptides hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5 peuvent être obtenus par injection à des lapins d'un peptide d'au moins 12 acides aminés, comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :14 ; . des anticorps spécifiques du polypeptide hATIPl peuvent être obtenus par injection à des lapins d'un peptide d'au moins 12 acides aminés, comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :13 ; . des anticorps spécifiques du polypeptide hATIP 3 peuvent
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être obtenus par injection à des lapins d'un peptide d'au moins 12 acides aminés, comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :15.
. des anticorps spécifiques du polypeptide hATIP4 peuvent être obtenus par injection à des lapins d'un peptide d'au moins 12 acides aminés, comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :16 ; des anticorps spécifiques du polypeptide hATIP5 peuvent être obtenus par injection à des lapins d'un peptide d'au moins 12 acides aminés, comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 17.
EXEMPLE 5: Détection d'une altération de l'expression des protéines hATIP dans des cellules cancéreuses par la méthode d'immunoempreinte, mettant en #uvre des anticorps spécifiques. a) Matériels et méthodes
Les échantillons de protéines obtenus après lyse des cellules sont dosés, séparés par électrophorèse en gel de 10% polyacrylamide, en présence de SDS, puis les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose et révélées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-hATIP, selon l'exemple 4. b) Résultats
L'analyse du profil d'expression des protéines hATIP dans des lignées tumorales humaines de différentes origines, analysé par immunoblot à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-hATIP (figure 8), montre : la présence de trois polypeptides majeurs de poids moléculaires apparents : 32 kDa, 64 kDa et 180 kDa, correspondant aux protéines hATIP. De plus, la présence d'un polypeptide de poids moléculaire apparent de 57 kDa, correspondant à une protéine hATIP de taille aberrante, est aussi observée dans certaines lignées tumorales. La détection de protéines hATIP de taille aberrante dans des lysats tissulaires constitue une méthode diagnostique pour le dépistage de certains cancers.
Les échantillons de protéines obtenus après lyse des cellules sont dosés, séparés par électrophorèse en gel de 10% polyacrylamide, en présence de SDS, puis les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose et révélées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-hATIP, selon l'exemple 4. b) Résultats
L'analyse du profil d'expression des protéines hATIP dans des lignées tumorales humaines de différentes origines, analysé par immunoblot à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-hATIP (figure 8), montre : la présence de trois polypeptides majeurs de poids moléculaires apparents : 32 kDa, 64 kDa et 180 kDa, correspondant aux protéines hATIP. De plus, la présence d'un polypeptide de poids moléculaire apparent de 57 kDa, correspondant à une protéine hATIP de taille aberrante, est aussi observée dans certaines lignées tumorales. La détection de protéines hATIP de taille aberrante dans des lysats tissulaires constitue une méthode diagnostique pour le dépistage de certains cancers.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et
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d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims (27)
1 ) Séquence d'ADNc isolée, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : (a) les séquences d'acide nucléique codant pour une protéine hATIP, comprenant au moins un fragment commun à toutes les protéines hATIP de séquence SEQ ID NO :11, qui correspond à la région d'interaction avec le récepteur AT2, laquelle séquence d'acide nucléique ne comprend pas la séquence SEQ ID NO:55; à l'exclusion des séquences GENBANK n AB033114 et n AL096842 ; (b) des variants alléliques de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) ; (c) des séquences complémentaires des séquences d'acide nucléique, telles que définies en (a) et en (b) et (d) des séquences homologues issues de n'importe quel mammifère.
2 ) Séquence d'ADNc selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO : 9, une séquence correspondant aux positions 364-714 de la SEQ ID NO :9 et une séquence qui s'hybride en conditions stringentes avec la séquence SEQ ID NO : 9 et ses fragments.
3 ) Séquence selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ladite séquence présente l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :5 et SEQ ID NO :7 ou leurs séquences complémentaires.
4 ) Segment d'acide nucléique génomique correspondant au gène hATIP codant pour une protéine hATIP, laquelle séquence est caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : (a) une séquence qui correspond à la concaténation des positions 12 636 à 1 de la séquence Genbank n AB020865 et des positions 100 000 à 688 de la séquence Genbank n AB020864, laquelle séquence code au moins
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NO :2, 4,6, 8 et 54) et qui comprend au moins 17 exons codants, dont la lecture se fait sur le brin inverse complémentaire desdites séquences n AB020865 et n AB020864 ; à l'exclusion desdites séquences n AB020865 et n AB020864 ; (b) des variants alléliques de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) ; (c) des mutants de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) ou en (b) qui comprennent au moins la substitution d'un nucléotide au niveau d'au moins l'un desdits exons ; (d) des séquences complémentaires aux séquences d'acide nucléique, telles que définies en (a) et en (b) et (e) des séquences homologues issues de n'importe quel mammifère.
pour les protéines hATIPl, hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5 (SEQ ID
5 ) Fragment de la séquence génomique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 36-52 et les SEQ ID NO : 56-72.
6 ) Fragment de la séquence génomique selon la revendication 4 ou de l'ADNc selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend entre 15 pb et 1000 pb.
7 ) Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les fragments suivants : séquence SEQ ID NO :18-35.
8 ) Réactif de détection, caractérisé en ce qu'il est constitué par au moins une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9 ) Vecteur d'expression d'une protéine hATIP, caractérisé en ce qu'il contient une séquence codant pour tout ou partie d'une protéine hATIP humaine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
10 ) Cellule hôte eucaryote ou procaryote transformée par un vecteur selon la revendication 9.
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11 ) Utilisation d'une séquence nucléique choisie dans le groupe constitué par le réactif de détection nucléique selon la revendication 8, la séquence nucléique SEQ ID NO :53 codant pour hATIPl et les fragments d'au moins 15 pb de ladite séquence SEQ ID NO :53 pour l'évaluation, le pronostic et/ou la détection d'un état précancéreux ou cancéreux.
12 ) Protéine ATIP isolée et purifiée, caractérisée en ce qu'elle est codée par une séquence d'ADNc ou un transcrit ou un segment d'acide nucléique génomique, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
13 ) Protéine hATIP isolée et purifiée, selon la revendication
12, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment commun à toutes les protéines hATIP, qui correspond à la région d'interaction avec le récepteur AT2, laquelle protéine ne comprend pas la séquence SEQ ID NO :13, spécifique de hATIP1, dans sa portion N-terminale.
14 ) Protéine selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO :2, 4, 6 et 8.
15 ) Fragment d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 acides aminés.
16 ) Fragment de protéine selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les séquences suivantes : SEQ ID NO :10 et 12-17.
17 ) Anticorps, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre une protéine hATIP selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 ou un fragment de protéine hATIP selon l'une quelconque des revendications 15 et 16.
18 ) Réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par au moins une protéine hATIP selon les revendications 12 à 14, au moins un fragment de protéine selon les revendications 15 et 16 et au moins un anticorps selon la revendication 17.
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19 ) Utilisation d'une séquence protéinique choisie dans le groupe constitué par les séquences selon la revendication 18, la séquence SEQ
ID NO :54, les fragments d'au moins 12 acides aminés de ladite séquence SEQ
ID NO :54 et les anticorps dirigés contre ladite protéine de séquence SEQ ID
NO :54 ou ses fragments pour l'évaluation, le pronostic et/ ou la détection d'un état précancéreux ou cancéreux.
20 ) Procédé de détection d'une délétion, d'une insertion ou d'une substitution dans le gène hATIP, pour évaluer le risque de développer un état cancéreux, qui comprend : - l'obtention d'un échantillon d'acide nucléique, et - la détection de la présence dans ledit échantillon d'acide nucléique d'une séquence d'acide nucléique codant pour un mutant hATIP, à l'aide d'au moins un réactif selon la revendication 8, et/ou de la séquence nucléique SEQ ID NO :53 codant pour hATIPl et des fragments d'au moins 15 pb de ladite séquence SEQ ID NO : 53.
21 ) Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il inclut : (a) la mise en contact dudit échantillon d'acide nucléique avec une paire d'amorces aptes à amplifier une région dudit gène hATIP contenant éventuellement une mutation et (b) la détection de ladite mutation par séquençage de la séquence obtenue ou par mise en contact de ladite séquence obtenue avec au moins une enzyme de restriction appropriée et analyse des fragments obtenus par rapport à un échantillon contrôle normal.
22 ) Procédé selon la revendication 20 ou la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend pour ladite détection : . l'isolement, à partir de l'ADN génomique d'un patient, et de l'ADN génomique d'un sujet contrôle dont le gène hATIP ne comporte aucune mutation, d'une portion du gène hATIP codant pour une protéine hATIP qui inclut l'un ou l'autre des exons tels que définis ci-dessus (SEQ ID
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NO :36 à 52), et . l'hybridation de la séquence génomique dudit patient et dudit sujet contrôle avec une sonde marquée spécifique de ladite portion de séquence du gène hATIP, puis . la détection directe des mésappariements et/ou la mise en contact avec une enzyme de restriction appropriée et la séparation des fragments de restriction obtenus.
23 ) Procédé de détection d'au moins une isoforme de hATIP à partir d'un échantillon biologique à l'aide d'anticorps selon la revendication 17 et/ ou les anticorps dirigés contre la protéine de séquence SEQ ID NO :54 ou ses fragments d'au moins 12 acides aminés.
24 ) Méthode d'établissement du profil d'expression des ARNm hATIP d'un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend : - le prélèvement d'un échantillon - l'extraction de l'ARNm - soit la transcription inverse (RT) dudit ARNm et les amplifications successives on concomitantes des ADNc obtenus en présence d'amorces spécifiques de chaque isoforme de hATIP selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 et l'analyse des produits d'amplification obtenus par électrophorèse et/ou hybridation spécifique de l'ARNm avec une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et - l'établissement du profil de transcription hATIP dudit échantillon.
25 ) Méthode d'établissement du profil d'expression des protéines hATIP d'un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend : - le prélèvement d'un échantillon, - la mise en contact d'un lysat cellulaire extrait dudit échantillon avec des anticorps spécifiques des différentes isoformes de hATIP, tels
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que définis à la revendication 17 et - l'établissement du profil d'expression des protéines hATIP dudit échantillon, par détection des complexes formés.
26 ) Kits ou trousses pour la mise en #uvre des différentes méthodes selon l'une quelconque des revendications 20 à 25.
27 ) Médicament anti-tumoral, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence nue selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou incluse dans un vecteur selon la revendication 9 ou une cellule hôte selon la revendication 10 ou tout ou partie d'une protéine hATIP selon les revendications 12 à 16.
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