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EP1254225A2 - Nouvelle famille de proteines, denommees atip, les sequences nucleiques codant pour lesdites proteines et leurs applications - Google Patents

Nouvelle famille de proteines, denommees atip, les sequences nucleiques codant pour lesdites proteines et leurs applications

Info

Publication number
EP1254225A2
EP1254225A2 EP01907725A EP01907725A EP1254225A2 EP 1254225 A2 EP1254225 A2 EP 1254225A2 EP 01907725 A EP01907725 A EP 01907725A EP 01907725 A EP01907725 A EP 01907725A EP 1254225 A2 EP1254225 A2 EP 1254225A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
hatip
seq
protein
sequences
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01907725A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Clara Nahmias
Arthur Donny Strosberg
Sandrine Nouet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NAHMIAS, CLARA
Strosberg Arthur Donny
Original Assignee
Strosberg Arthur Donny
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Strosberg Arthur Donny, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Strosberg Arthur Donny
Publication of EP1254225A2 publication Critical patent/EP1254225A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a new family of human proteins (hATIP), interacting with the angiotensin II AT2 receptor and having an anti-oncogenic function. Said family of proteins is therefore useful for the diagnosis of cancerous and precancerous states and the treatment of cancerous states.
  • hATIP human proteins
  • the present invention also relates to the gene coding for said proteins as well as to transcripts and cDNA molecules coding for said proteins, to fragments of these different nucleic acid molecules and to their applications for detection and expression. of said proteins.
  • the present invention also relates to nucleic sequences (genetic DNA, transcribed and cDNA) or proteins of the hATIP family, having an alteration or a functional mutation.
  • the present invention also relates to the various hATIP proteins and to their applications.
  • the present invention further relates to antibodies directed against said proteins as well as to methods of detecting and / or screening for a precancerous or cancerous state using said proteins of said antibodies and / or of the different sequences of 'nucleic acids.
  • the angiotensin II AT2 receptor is a receptor with seven transmembrane domains, which thus belongs to the family of receptors coupled to G proteins. Its role during tissue development and regeneration has recently been demonstrated (Nouet et al., Trends Endocrinol. Metabol., 2000, 11, 1-6). Mice whose AT2 gene has been disabled have abnormalities in the development of the urinary tract due to a defect in apoptosis of the mesenchymal cells (Nishimura et al., Molecular Cell, 1999, 3, 1-10).
  • this receptor has an effect in many tissues anti-proliferative and pro-apoptotic, through the activation of protein tyrosine phosphatases, including tyrosine phosphatase SHP-1 (Bedecs et al., Biochem. J., 1997, 325, 449-454; Lehtonen et al., Mol. Endocrinol., 1999, 13, 1051-1060). Very recently, an effect of the AT2 receptor on cell differentiation and migration has been demonstrated (Côté et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 44, 31686-31692).
  • This protein now called hATIPl, interacts with the C-terminal end of the AT2 receptor, but not with those of other receptors of the same family, such as the ATI, ⁇ 2-adrenergic or bradykinin B2 receptors.
  • the hATIPl protein plays a role in the signaling pathways of the AT2 receptor and contributes to attenuating the cell proliferation induced by growth factors.
  • hATIP1 family hATIP
  • genomic sequences comprising the hATIP gene or at least most of said uncomfortable ; they also iden- tified this gene as a tumor suppressor gene.
  • the invention also relates to the use of these sequences for the detection of abnormalities in the expression or of the sequence of the proteins of the hATIP family in certain proliferative lesions and for the treatment of cancer cells including all or part of the hATIP a gene. been altered or deleted.
  • the characterization of the hATIP protein family has enabled the inventors to determine the structure and organization into introns / exons of the gene coding for these proteins, located in the chromosomal region 8p21.3-p22.
  • the human hATIP gene is organized into at least 17 exons, distributed over more than 112 kilobases of genomic DNA; some of these exons can be used alternately, which leads to transcription of different mRNA molecules. Due to this alternative splicing, these different mRNA molecules have different translation initiating ATG codons and therefore code for proteins of different sequences; the sequences coding for different isoforms of proteins of the hATIP family (hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIP5 and hATIP ⁇ ) were thus identified. While the different proteins of this family diverge in their N-terminal part, they present in their C-terminal part, a common zone which characterizes this family and which includes the zone of interaction with the AT2 receptor.
  • the subject of the present invention is therefore an isolated cDNA sequence, characterized in that it is selected from the group consisting of:
  • nucleic acid sequences coding for an hATIP protein comprising at least one fragment common to all the hATIP proteins of sequence SEQ ID NO: 11, which corresponds to the region of interaction with the AT2 receptor, which sequence d the nucleic acid does not include the sequence SEQ ID NO: 55; excluding GENBANK sequences no AB033114 and no AL096842;
  • homologous sequences from any mammal.
  • homologous sequence means a sequence whose identity with the corresponding human sequence (after alignment of sequences) varies from 80 to 99%.
  • said cDNA sequence comprises a sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 9, a sequence corresponding to positions 364-714 of SEQ ID NO: 9 and a sequence which hybridizes under stringent conditions (under the conditions described in Sambrook et al., 1989) with the sequence SEQ ID NO: 9 and its fragments.
  • sequence SEQ ID NO: 9 corresponds to a segment of nucleic sequence common to all the sequences coding for a protein ATIP, which segment includes the sequence coding for the region of interaction with the AT2 receptor.
  • the cDNA sequences according to the present invention correspond to the various mRNAs, obtained by alternative splicing and coding respectively for the isoforms hATIP2, hATIP3, hATIP4 and hATIP5.
  • sequence coding for the hATIP2 protein has the sequence SEQ ID NO: 1
  • sequence coding for the protein hATIP3 has the sequence SEQ ID NO: 3 or the sequence SEQ ID NO: 80 comprising said sequence SEQ ID NO: 3 and in 5 ′ of said sequence, a complementary fragment of 138 nucleotides (SEQ ID NO : 75), as shown in Figure 11.
  • sequence coding for the hATIP4 protein has the sequence SEQ ID NO: 5
  • sequence coding for the hATIP5 protein has the sequence SEQ ID NO: 7 and
  • sequence coding for the hATIP6 protein has the sequence SEQ ID NO. 77 (the open reading phase corresponds to nucleotides 31-3678 of the sequence SEQ ID NO: 77 presented in FIG. 12)
  • SEQ ID NO. 77 the open reading phase corresponds to nucleotides 31-3678 of the sequence SEQ ID NO: 77 presented in FIG. 12
  • These different cDNA sequences correspond to alternative splices of the hATIP gene; they make it possible to reconstitute the organization of the gene into exons and introns and therefore to define the coding regions.
  • the present invention also relates to a genomic nucleic acid segment corresponding to the hATIP gene coding for an hATIP protein, which sequence is characterized in that it is selected from the group consisting of:
  • exons are distributed as follows over said genomic sequence (see FIG. 4): - exon 1: it comprises at least 2032 bp which correspond to positions 12651 to 10620 of the sequence AB020865 (segment 8/11); for example it comprises 2121 bp (SEQ ID NO: 82) comprising the sequence SEQ ID NO: 36 and in 5 ′ of said sequence SEQ ID NO: 36, an additional fragment of 89 nucleotides (SEQ ID NO: 79, presented in the Figure 13); this exon codes for the N-terminal part of hATIP3 or of hATIP ⁇ , the initiator ATG codon of which is either in position 31 of the sequence SEQ ID NO: 77 or 80 or 12710 of AB020865, or in position 101 of the sequence 36 or 12550 from AB020865.
  • sequence SEQ ID NO: 38 it comprises 61 bp and corresponds to positions 81060 to 81000 of the sequence AB020864 (segment 7/11); it is present in the cDNA of hATIP2 (uterus) and absent in the cDNA of hATIP3 (brain); it can therefore be spliced alternately and characterizes the hATIP2 transcript;
  • sequence SEQ ID NO: 39 it comprises 162 bp and corresponds to positions 80731 to 80570 of AB020864 (segment 7/11).
  • exon 4 bis (sequence SEQ ID NO: 40): it comprises at least 94 bp and corresponds to positions 78701 to 78608 of AB020864 (segment 7); perhaps the beginning of the exon is missing; this exon is contained only in the sequence encoding hATIP5; it can therefore be spliced alternately and characterizes the hATIP5 transcript;
  • sequence SEQ ID NO: 41 it comprises 135 bp and corresponds to positions 72800 to 72666 of AB020864 (segment 7/11); it contains the ATG codon initiating hATIP2 in position 72684 of AB020864 or 117 of SEQ ID NO: 41).
  • sequence SEQ ID NO: 42 it comprises 39 bp and corresponds to positions 70152 . to 70114 from AB020864 (segment 7/11); a number of mutations are observed in tumor cells or tissues (see example 8).
  • - exon 7 (sequence SEQ ID NO: 43): it comprises 413 bp and corresponds to positions 54567 to 54155 of AB020864 (segment 7/11); this exon is used exclusively by hATIPl (- »alternative splicing). ; it contains the ATG codon initiating hATIPl at position 54275; a number of mutations are observed in tumor cells or tissues (see example 8).
  • - exon 8 (sequence SEQ ID NO: 44): it comprises 215 bp and corresponds to positions 41450 to 41236 of AB020864 (segment 7/11); one can observe, in position 41342 of AB020864, an A / C substitution, which gives a Lys / Thr mutation, in particular in certain tumors (see example 8).
  • - exon 9 (sequence SEQ ID NO: 45): it comprises 67 bp and corresponds to positions 32194 to 32128 of AB020864 (segment 7/11).
  • sequence SEQ ID NO: 46 it comprises 203 bp and corresponds to positions 12951 to 12749 of AB020864 (segment 7/11); a number of mutations are observed in tumor cells or tissues (see example 8).
  • sequence SEQ ID NO: 47 it comprises 106 bp and corresponds to positions 11550 to 11445 of AB020864 (segment 7/11).
  • sequence SEQ ID NO: 48 it comprises 74 bp and corresponds to positions 10382 to 10309 of AB020864 (segment 7/11); a number of mutations are observed in tumor cells or tissues (see example 8).
  • sequence SEQ ID NO: 49 it comprises 96 bp and corresponds to positions 10165 to 10070 of AB020864 (segment 7/11); a G / C substitution is observed, in position 10141 of AB020864, which gives a Glu / Gin mutation in certain tumors (see also example 8).
  • sequence SEQ ID NO: 50 it comprises 117 bp and corresponds to positions 6845 to 6729 of AB020864 (segment 7/11); a number of mutations are observed in tumor cells or tissues (see example 8).
  • sequence SEQ ID NO: 51 it comprises 98 bp and corresponds to positions 3961 to 3864 of AB020864 (segment 7/11) and
  • sequence SEQ ID NO: 52 it comprises 2333 bp and corresponds to positions 3021 to 689 of AB020864 (segment 7/11); it contains the stop codon common to all the hATIP proteins (TGA in position 117 of the sequence SEQ ID NO: 52); a number of mutations are observed in tumor cells or tissues (see example 8).
  • the exons used by all the isoforms of hATIP are exons 8 to 16.
  • the present invention also relates to fragments said genomic sequences, characterized in that they consist of one of the exons comprising at its 5 'end and / or at its 3 end, an intron segment comprising from 1 to 300 bp; said fragment preferably comprises between 15 and 50 bp, and is included in said intron segment of the genomic sequence which can be located at a distance of 1 to 200 bp upstream and / or downstream of said exons.
  • said fragments are selected from the sequences SEQ ID NO: 56-72.
  • the present invention also includes fragments of the nucleic acid sequences as defined above and their complementary sequences (including the transcripts). Preferably: - when these fragments comprise between 50 and 1000 bp, they are useful as probes;
  • Probe B1260 hybridizes all the sequences coding for an hATIP; extends over exons 11 to 16; it is obtained by RT-PCR with the oligonucleotides B1249 (SEQ ID NO: 21) / B1251 (SEQ ID NO: 22); it makes it possible to detect the hATIP gene and the various forms of the hATIP mRNA by hybridization of the genomic DNA or of the human mRNA under stringent hybridization conditions.
  • Probe B1298 (sequence SEQ ID NO: 19): specific for hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIP5 and hATIP ⁇ ; extends over exons 4 to 6 with the exception of exon 4bis; it is obtained by RT-PCR with oligo- nucleotides B1264 (SEQ ID NO: 23) / B1265 (SEQ ID NO: 24); it makes it possible to identify the sequences coding for hATIP2, hATIP 3, hATIP 4, hATIP 5 and hATIP 6, but does not hybridize with the hATIP1 sequence, even under poorly stringent hybridization conditions. .
  • fragments useful for amplifying a segment coding for an hATIP a) primers for the amplification of the B1260 probe (common to all hATIPs) (sequence SEQ ID NO: 18):
  • - oligonucleotide B1249 23-mer sense (SEQ ID NO: 21), located in exon 11 (SEQ ID NO AT): positions 11501 to 11523 of AB020864 and - oligonucleotide B1251: 24-mer antisense (SEQ ID NO: 22 ), located in exon 16 (SEQ ID NO: 52): positions 2711 to 2734 of AB020864.
  • primers for the amplification of the B1298 probe specific for hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIP5 and hATIP ⁇
  • - oligonucleotide B1264 21-mer sense (SEQ ID NO: 23), located in exon 4 (SEQ ID NO: 39): positions 80708-80728 of AB020864 and
  • - oligonucleotide B1265 19-mer antisense (SEQ ID NO: 24), located in exon 6 (SEQ ID NO: 42): positions 70111-70129 of AB020864.
  • - oligonucleotide B1301 19-mer antisense (SEQ ID NO: 26), located in exon 7 (SEQ ID NO: 43): positions 54158-54177 of AB020864.
  • fragments useful for detecting a polymorphism or a mutation appearing in cancer cells a) amplification of exon 8 in order to detect the Lys / Thr mutation (AA 56 of the sequence SEQ ID NO: 2): - oligonucleotide B1318: 22-mer sens (SEQ ID NO: 27), located in the intron preceding exon 8 (SEQ ID NO: 64): positions 41584-41605 of AB020864; and
  • oligonucleotide B1319 22-antisense (SEQ ID NO: 28), located in the intron following exon 8 (SEQ ID NO: 64): positions 41221-41242 of AB020864.
  • - oligonucleotide B1308 22-mer sense (SEQ ID NO: 29), located in the intron preceding exon 13 (SEQ ID NO: 69): positions 10205-10226 of AB020864; and
  • oligonucleotide B1309 22-antisense (SEQ ID NO: 30), located in the intron following exon 13 (SEQ ID NO: 69): positions 9894-9915 of AB020864.
  • This pair of oligonucleotides produced after amplification of genomic DNA, a 333 bp fragment, in which a G / C substitution at position 10141 of AB020864 (in exon 13) (resulting in a Glu / Gin mutation) generates a site restriction for the enzyme Hinfl.
  • - oligonucleotide B1310 19-mer sense (SEQ ID NO: 73), located in the intron which precedes exon 13 (SEQ ID NO: 69): positions 10198- 10216 from AB020864 and
  • oligonucleotide B1311 19-mer antisense (SEQ ID NO: 74), located in the intron following exon 13 (SEQ ID NO: 69): positions 9979-9997 of AB 020864.
  • amplification of exon 1 in order to detect the C / T substitution (Gin / Stop):
  • - oligonucleotide B1314 22-mer sense (SEQ ID NO: 31), located in exon 1: positions 10977-10998 of AB020865; and - oligonucleotide B1315: 22-antisense (SEQ ID NO: 32), located in exon 2: positions 566-587 of AB020865.
  • This pair of oligonucleotides produces, after amplification of the mRNA (RT-PCR), a fragment of 516 bp (SEQ ID NO: 33), which should be sequenced, to detect the C / T substitution in position 10664 of AB020865 [creation of a stop codon in position 630 of hATIP3 (SEQ ID NO: 4)] and the substitution A / G in position 10987 of AB020865 [creation of a replacement of a His residue in Arg in position 522 of hATIP3 (SEQ ID NO: 4)].
  • fragments useful for detecting alternative splicing a) amplification of exon 3 with a view to detecting alternative splicing, making it possible to distinguish hATIP2 from hATIP3 and hATIP ⁇ :
  • - oligonucleotide B1312 22-mer sense (SEQ ID NO: 34), located in exon 2 (SEQ ID NO: 37): positions 562-583 of AB020865; and
  • oligonucleotide B1313 22-antisense (SEQ ID NO: 35), located in exon 5 (SEQ ID NO: 41): positions 72687-72708.
  • This pair of oligonucleotides produced, after amplification of mRNA (RT-PCR), a 414 bp fragment if exon 3 is present and a 354 bp fragment if exon 3 is absent.
  • the experimental conditions for amplification by PCR are similar for all the pairs of oligonucleotides: number of cycles: 30; hybridization temperature between 50 ° C. and 55 ° C., in the presence of Taq polymerase with Proméga DNA, according to the supplier's specifications.
  • the sense primer is an oligonucleotide of 25 bp corresponding to the sequence between -100 bp and -200 bp in 5 'of the mutation and the antisense primer is a 25 bp oligonucleotide corresponding to a sequence located between + 100 bp and + 200 bp in 3' of the mutation, on the complementary reverse strand.
  • a 200 to 400 bp fragment is obtained which can be sequenced in order to detect the mutation.
  • the different nucleic sequences can be obtained by known methods, for example by extension of a nucleic sequence coding for an hATIP protein according to the invention by PCR or reverse PCR or by screening for genomic DNA banks by hybridization with a homologous probe, or by total or partial chemical synthesis.
  • nucleic acid sequences make it possible either to determine the expression profile of the hATIP mRNA and a possible alteration of this profile in a tissue or a biological sample, or to highlight the hATIP gene, allelic variants of this gene and a possible alteration of this hATIP gene (changes, deletions, point mutations) and consequently assess the existence of a cancerous state.
  • the different nucleic acid sequences defined above constitute good diagnostic tools for the detection of cancer cells which have mutated, deleted or rearranged the tumor suppressor gene. correspondent (ATIP gene) and / or prognosis for the detection of cancer cells by detection of an alteration of the sequences or of the expression of the products of this gene.
  • the present invention also relates to a detection reagent, consisting of at least one nucleic acid sequence as defined above.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic sequence chosen from the group consisting of the nucleic detection reagent as defined above, the nucleic sequence SEQ ID NO: 53 coding for hATIPl and the fragments of minus 15 bp of said sequence SEQ ID NO: 53 for the evaluation, prognosis and / or detection of a precancerous or cancerous state.
  • nucleic acid sequences as defined above, can also be advantageously used to construct expression vectors of an hATIP protein, capable of being used to produce said proteins or in gene therapy.
  • the present invention therefore also relates to vectors, characterized in that they contain a sequence coding for all or part of a human hATIP protein as defined above.
  • the sequence encoding the hATIP protein is under the control of appropriate transcription and translation control elements.
  • vectors can be obtained and introduced into a host cell by known techniques.
  • the invention also relates to a eukaryotic or prokaryotic host cell transformed with a vector as defined above.
  • the present invention also relates to isolated and purified ATIP proteins, characterized in that they are coded by a cDNA sequence or a transcript or a fragment of genomic nucleic acid, as defined above. More specifically, they include at least one fragment common to all hATIP proteins, which corresponds to the region of interaction with the AT2 receptor selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, which proteins do not include the sequence SEQ ID NO : 13, specific to hATIPl, in their N-terminal portion.
  • Said proteins represent new isoforms interacting with the AT2 receptor.
  • the hATIP2 protein has the sequence SEQ ID NO: 2 - the hATIP3 protein has the sequence SEQ ID NO: 4 or the sequence SEQ ID NO: 81 corresponding to SEQ ID NO: 4 added to its N-terminal end of a 53 amino acid sequence (SEQ ID NO: 76), as shown in Figure 11.
  • the hATIP4 protein has the sequence SEQ ID NO: 6
  • the hATIP5 protein has the sequence SEQ ID NO: 8 and
  • the protein hATIP ⁇ has the sequence SEQ ID NO: 78 ( Figure 12).
  • PCT / FR99 / 01908 corresponds to the splicing product of exons 7 to 16.
  • - hATIP2 corresponds to the splicing product of exons 1 to 16 with the exception of exons 4bis and 7;
  • - hATIP3 corresponds to the splicing product of exons 1 to 16 with the exception of exons 3, 4bis and 7;
  • - hATIP4 corresponds to a splicing product identical to that of hATIP3; however its N-terminal part is shorter due to the presence of a stop codon in exon 1; this stop codon is due to a C / T substitution at position 10664 of the sequence No. AB020865.
  • - hATIP5 corresponds to the splicing product of exons 4 bis to 16, with the exception of exon 7.
  • - hATIP ⁇ corresponds to the splicing product of exons 1 to 16 with the exception of exons 3, 4, 4bis and 7.
  • said hATIPs comprise particular motifs, located in the sequence SEQ ID NO: 10, common to all the ATIP proteins and containing the sequence SEQ ID NO: 11, corresponding to the region of interaction with the AT2 receptor; said patterns participate in the specific action of said proteins (see FIG. 2):
  • the coiled-coil domains favor protein / protein interactions and dimerization.
  • the presence of a large coiled-coil domain in the sequences common to all hATIPs indicates that these hATIP proteins are capable of homo-or hetero-dimerization, and that it is this property which could ensure their interaction function. with the AT2 receptor, and possibly their role as tumor suppressors.
  • the inventors have found that in certain tumors, mutations are observed at the level of said region of interaction with the AT2 receptor; we can find, for example, the E / Q mutation (position 231 of the sequence SEQ ID NO: 10); this mutation is located in the middle of the first leucine closure motif and in the middle of the coiled-coil region.
  • Other motifs are located in specific parts of the various hATIP proteins (see FIG. 1):
  • HATIPl protein 2 consensus N-myristylation sites, which correspond respectively to positions 20-25 and 30-35 of the sequence SEQ ID NO: 13; this signal allows a possible post-translational modification of the protein (myristylation) which targets the protein at the membrane. Such signal could allow the interaction of ATIP with membrane proteins.
  • HATIP2 protein nuclear localization signal [Nuclear
  • NLS Signal Location
  • HATIP3 protein 7 consensus N-myristylation sites (see Figure 1).
  • HATIP4 protein 2 consensus N-myristylation sites.
  • HATIP5 protein 2 consensus N-myristylation sites. These different proteins as well as the hATIPl protein have an action on the proliferation of cancer cells and find application in particular for the preparation of anticancer drugs; for example, re-introduction into cancer cells of the hATIP gene or of appropriate splicing products of the hATIP gene makes it possible to restore normal proliferation of tumor cells. All or part of said proteins can also be directly used in the treatment of tumors.
  • the present invention also relates to an anti-tumor medicament, characterized in that it includes a naked nucleic acid sequence, coding for all or part of an hATIP protein, as defined above or a vector such as defined above, or a host one as defined above, or all or part of an hATIP protein as defined above.
  • the proteins according to the invention also include any protein (natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant) from any mammal; they generally include an interaction domain with the AT2 receptor which has the sequence SEQ ID NO: 12 and include or consist of:
  • the term “functional protein” is intended to mean a protein which exhibits normal biological activity (inhibition of cell proliferation and anti-oncogenic or tumor suppressor effect).
  • the term “functionally modified mutant of a protein” is intended to mean a mutant which comprises one or more mutations which induce a substantial modification of its activity. Such mutants are in particular those detected in cancer cells.
  • the hATIP mutants can have an identity of less than 70% with one of the hATIP isoforms, as defined above; however, the identity of the unmodified sequences of these mutants, when aligned with the sequences of the corresponding hATIP isoforms remains high and may be greater than 70%.
  • the present invention also relates to fragments of the proteins as defined above, comprising at least 12 amino acids and in particular the fragments of sequence SEQ ID NO: 10 and 12 to 17.
  • sequences SEQ ID NO: 13, 15 and 17 are specific to hATIP 1, hATIP 3 and hATIP 6 and hATIP 5 respectively.
  • the present invention further relates to antibodies, characterized in that they are directed against an ATIP protein or a fragment of hATIP protein according to the invention.
  • Antibodies directed against a functional or non-functional hATIP isoform or against the zone common to all of the hATIP domain isoforms can thus be obtained. They can advantageously be either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • Such antibodies find application as a diagnostic tool for the detection of cancer cells which have mutated or deleted the corresponding tumor suppressor gene (hATIP gene).
  • the present invention also relates to a detection reagent, characterized in that it is selected from the group consisting of at at least one protein as defined above, at least one protein fragment as defined above and at least one antibody as defined above.
  • the present invention also relates to the use of a protein sequence chosen from the group consisting of at least one protein as defined above, at least one protein fragment as defined above or at least one antibody such as defined above, the sequence SEQ ID NO: 54, the fragments of at least 12 amino acids of said sequence SEQ ID NO: 54 and the antibodies directed against said protein of sequence SEQ ID NO: 54 or its fragments for l 'evaluation, prognosis and / or detection of a precancerous or cancerous state.
  • the present invention also relates to means for detecting and correcting precancerous or cancerous states.
  • the invention relates to methods which implement the nucleic acid sequences and / or the protein sequences as defined above for the evaluation, diagnosis or prognosis of a precancerous or cancerous state.
  • the subject of the invention is methods of diagnosing a cancerous or precancerous state in humans, which comprise: either the detection of the expression of a functionally modified mutant of the hATIP gene, in a nucleic acid sample,
  • nucleic acid sequences according to the invention can advantageously be used in these methods.
  • the present invention thus also relates to a method for detecting a deletion, an insertion or a substitution in the hATIP gene, to assess the risk of developing a cancerous condition, which includes:
  • nucleic acid sample of a nucleic acid sequence coding for an hATIP mutant using at least one nucleic detection reagent, as defined above and / or of the nucleic sequence SEQ ID NO: 53 coding for hATIPl and fragments of at least 15 bp of said sequence SEQ ID NO: 53.
  • detecting said mutation by sequencing the sequence obtained or by bringing said sequence into contact with at least one appropriate restriction enzyme and analysis of the fragments obtained with respect to a normal control sample.
  • said method comprises for said detection:. the isolation, from the genomic DNA of a patient, and the genomic DNA of a control subject whose hATIP gene contains no mutation, of a portion of the hATIP gene coding for an hATIP protein which includes either of the exons as defined above (SEQ ID NO: 36 to 52), and. hybridization of the genomic sequence of said patient and of said control subject with a labeled probe specific for said portion of sequence of the hATIP gene, then
  • the present invention also relates to a method for detecting at least one isoform of hATIP, from a biological sample using polyclonal or monoclonal antibodies, as defined above and / or the directed antibodies. against the protein of sequence SEQ ID NO: 54 or its fragments of at least 12 amino acids.
  • the present invention also relates to a method for establishing the expression profile of the hATIP mRNAs of a biological sample, characterized in that it comprises:
  • the present invention also relates to a method for establishing the expression profile of the hATIP proteins of a biological sample, characterized in that it comprises:
  • the invention also relates to kits or kits for implementing the various methods according to the invention.
  • kits preferably comprise at least one pair of primers and at least one optionally labeled probe, such as defined above, and optionally appropriate restriction enzymes.
  • They can be implemented, in association with amplification kits; they can also include negative and positive controls, molecular size markers for the electrophoresis gel, for example.
  • kits according to the invention can include antibodies, optionally labeled, as well as reagents suitable for the detection of antigen-antibody complexes. ; they can also include positive and negative controls.
  • the nucleic acids according to the invention can also be used for therapeutic purposes, for example to restore a tumor suppressor effect.
  • FIG. 1 illustrates a comparison of the amino acid sequences: hATIP1, hATIP2, hATIP3, hATIP4 and hATIP5, the consensus sites of N-myristylation are underlined,
  • FIG. 2 illustrates the amino acid sequence common to the various hATIPs (SEQ ID NO: 10), in which the two leucine closure motifs are indicated in bold and the coiled-coil domains are underlined,
  • FIG. 3 schematically illustrates the alternative use of different exons of the hATIP gene (chromosome 8 ⁇ 21.-p22), allowing the production of 5 different forms of mRNA (hATIPl to 5): the localization of the exons, relative to the Genbank sequences n ° AB020864 and n ° AB020865, is indicated by a double arrow, the exons (3, 4 bis and 7) alternatively used are framed, the start of protein translation is represented by a flag, and the position of the stop codons is represented by a star,
  • FIG. 4 illustrates the intron and exon structure of the sequence of the hATIP gene: the location of the different exons is specified with respect to the Genbank sequences n ° AB020864 and n ° AB020865,
  • FIG. 5 illustrates the analysis of the hATIP gene by Southern blot, on the human genomic DNA of human tumor cells (MCF-7,
  • FIG. 6 illustrates the analysis of the expression profile of the hATIP transcripts in human tumor cell lines of different origins.
  • FIG. 7 illustrates the detection, by PCR and restriction analysis, of the G / C substitution at position 10141 of the sequence AB020864 (exon 13), corresponding to the Glu / Gin mutation at amino acid 250 of SEQ ID NO : 2, from human tumor cells: PCR products obtained from wild DNA before and after cleavage by the enzyme Hinfl (lanes 1 and 2), PCR products obtained from DNA mutated in position 10141, before and after cleavage by said enzyme (lanes 3 and 4),
  • FIG. 8 illustrates the analysis of the expression profile of proteins of the hATIP family in human tumor cell lines of different origins: ENT sphere (track 1), prostate (tracks 2 and 11), colon (tracks 3, 6, 10 and 13), liver (track 4), lung (tracks 5, 8 and 12), ovary (tracks 7 and 9), by immunoblot using a rabbit polyclonal antibody directed against the sequence (SEQ ID NO: 10), common to the hATIP proteins, - Figure 9 illustrates the inhibitory role of the protein encoded by the cDNA hATIP2 (SEQ ID NO: 1) in the proliferation of CAL33 tumor cells from the ENT sphere, in the presence of 2.5% fetal calf serum.
  • FIG. 10 illustrates the property of homo- and hetero-dimerization of the proteins hATIPl and hATIP2, revealed by transient co-transfection of the corresponding labeled cDNAs (Myc and HA), in COS cells, followed by a immunoprecipitation and immunoblot analysis using antibodies specific to the Myc and HA labels.
  • FIG. 11 shows the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 80) and protein sequence (SEQ ID NO: 81) complete with hATIP3; the additional nucleic and protein sequences corresponding respectively to the sequences SEQ ID NO: 75 and SEQ ID NO: 76 are underlined.
  • FIG. 12 shows the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 77) and protein (SEQ ID NO: 78) of hATIP ⁇ .
  • the extraction of total genomic DNA, the preparation and labeling of the probes as well as the hybridization by Southern-Blot are carried out according to the conventional techniques described in Sambrook et al., 1989.
  • the samples filions of total genomic DNA, prepared from human tumor cell lines derived from tumors of different origins (breast, ENT sphere and ovary) or normal cells derived from human placenta, are digested with either HindIII or EcoRI.
  • the fragments obtained are separated on agarose gel and then transferred to a nylon membrane; the membrane is hybridized with the radiolabelled probe B1260 (SEQ ID NO: 18), in the buffer: 45% formamide, 0.2% BSA, 0.2% polyvinyl pyrrolidone, 0.2% Ficoll, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.01% SDS, 0.05 mM Tris pH 7.5 and 0.9 M NaCl, at 45 ° C, washed at low stringency (2X SSC, 0.01% SDS at 45 ° C, then autoradiographed 72 h at - 80 ° C.
  • B1260 SEQ ID NO: 18
  • EXAMPLE 2 Analysis of the expression profile of the transcripts of the hATIP gene in cell lines derived from human tumors of different origins a) Materials and methods
  • RNA prepared from human tumor cell lines derived from tumors of different origins: colon (HT29, SW48), ENT sphere (CAL33), liver (HepG2), lung (SK-MES, 460M, A549, ludlu), prostate (DU1215, LWL- cap) , ovary (Igrovl), and breast (MCF-7), are separated on agarose gel and then transferred to a nylon membrane; the membrane is hybridized with the B1260 probe comprising exons 11 to 16 (SEQ ID NO: 18) (top panel), or with the B1299 probe comprising exons 4, 5, 6 (SEQ ID NO: 19) (bottom panel).
  • Each of the probes is radiolabelled, then hybridized with the membrane in the buffer: 45% formamide, 9% Dextran-sulfate, 0.2% BSA, 0.2% polyvinyl pyrrolidone, 0.2% Ficoll, 0.1% sodium pyrophosphate , 0.01% SDS, 0.05 mM Tris pH 7.5 and 0.9 M NaCl, at 45 ° C, washed at low stringency (2X SSC, 0.01% SDS at 45 ° C), then autoradiographed 72 h at -80 ° C.
  • Figure 6 shows, in human tumor cells originating from tumors of different origins: colon (HT29, SW48), ENT sphere (CAL33), liver (HepG2), lung (SK-MES, 460M, A549, ludlu), prostate ( DU1215, LWL-cap), ovary (Igrovl), and breast (MCF-7), different expression levels of transcripts of 7 kb, 5 kb, 3.5 kb and 2 kb, revealed by the B1260 probe common to all hATIP sequences.
  • the transcripts hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIP ⁇ , specifically revealed by the B1299 probe, are contained in the 7 kb hybridization product.
  • transcripts are completely absent in the LWL-cap prostate tumor line. Due to the length of the corresponding cDNA, the hATIPl transcript must be contained in the 2 kb hybridization product, which is also absent in the LWL-cap line. The other hybridization products, with sizes of 5 kb, and 3.5 kb, contain transcripts which have not yet been identified.
  • the genomic DNA is extracted from the tumor cells as described in Example 1, the PCR amplification is carried out using DNA Taq polymerase (Proméga), according to the protocol recommended by the producer, under the conditions following experimental: number of cycles: 30; hybridization temperature: 55 ° C.
  • the detection of the G / C substitution in position 10141 of the sequence AB020864 (exon 13) is carried out according to the following protocol: - comparative amplification of a 238 bp fragment of exon 13 using the primers SEQ ID NO: 73 and SEQ ID NO: 74, in a sample of tumor cells to be analyzed, and in a sample of normal cells ( control). - Hinfl digestion
  • FIG. 7 shows the detection of the G / C substitution at position 10141 of the sequence AB020864 (exon 13), corresponding to the Glu / Gin mutation at amino acid 250 of SEQ ID NO: 2, from human tumor cells .
  • the presence of two cleavage products (203 and 35 bp) is characteristic of a wild-type DNA sequence.
  • the detection of three DNA fragments (132, 71 and 35 bp) is characteristic of a mutated DNA sequence.
  • EXAMPLE 4 Production of antibodies. 1. Production of antibodies to all hATIP proteins
  • An anti-hATIP polyclonal serum is produced in rabbits by injection of a fusion protein comprising the sequence SEQ ID NO: 11 fused to 6 histidine residues.
  • These polyclonal antibodies used in immunoblotting identify three major polypeptides of apparent molecular weight: 32kDa, 64 kDa and 180 kDa, in cell lysates from different human tumor lines (see Example 5).
  • These antibodies also detect the presence of a polypeptide of apparent molecular weight of 57 kDa, in the lysate of certain cells. tumor.
  • the detection of ATIP proteins of outliers in tissue lysates is a diagnostic method for the screening of certain cancers.
  • antibodies specific for the polypeptides hATIP2, hATIP3, hATIP4 and hATIP5 can be obtained by injection into rabbits of a peptide of at least 12 amino acids, comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 14; . antibodies specific for the hATIPl polypeptide can be obtained by injection into rabbits of a peptide of at least 12 amino acids, comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 13;
  • antibodies specific for the hATIP3 or hATIP ⁇ polypeptide can be obtained by injection into rabbits of a peptide of at least 12 amino acids, comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 15.
  • antibodies specific for the hATIP5 polypeptide can be obtained by injection into rabbits of a peptide of at least 12 amino acids, comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 17.
  • EXAMPLE 5 Detection of an alteration in the expression of hATIP proteins in cancer cells by the immunoblot method, using specific antibodies.
  • the protein samples obtained after cell lysis are assayed, separated by electrophoresis in 10% polyacrylamide gel, in the presence of SDS, then the proteins are transferred onto a nitrocellulose membrane and revealed using an antibody.
  • polyclonal anti-hATIP according to the example
  • FIG. 8 Analysis of the expression profile of hATIP proteins in human tumor lines of different origins, analyzed by immuno- blot using a polyclonal anti-hATIP antibody (FIG. 8), shows: the presence of three major polypeptides of apparent molecular weight: 32 kDa, 64 kDa and 180 kDa, corresponding to the hATIP proteins. In addition, the presence of an apparent molecular weight polypeptide of 57 kDa, corresponding to an aberrant size hATIP protein, is also observed in certain tumor lines. The detection of aberrant-sized hATIP proteins in tissue lysates is a diagnostic method for the detection of certain cancers.
  • the CAL33 tumor cells are transfected with the hATIP2 cDNA (SEQ ID NO: 1) inserted into the expression vector ⁇ cDNA3 which comprises a gene for resistance to neomycin.
  • the transfected (CAL33-2C) or non-transfected (CAL33-WT) cells are seeded at the density of 0.2 million cells per well of 6-well plates, in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) culture medium comprising 1 g / 1 glucose and 10% fetal calf serum (SVF). The cells are then weaned overnight, then grown in DMEM lg / l glucose medium, in the presence of 2.5% FCS. After 24 or 48 hours of culture, the cells are detached and counted with the hematimeter.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • EXAMPLE 7 Homo- and hetero-dimerization of the proteins hATIPl and hATIP2
  • the proteins of the ATIP family are characterized by the presence in their carboxy-teral portion of several coiled-coil regions, known to promote protein-protein interactions. These coiled-coil motifs are precisely contained in the field of interaction of the ATIP proteins with the AT2 receptor for angiotensin II.
  • the role of the ATIP proteins, by forming homo- and heterodimers through these coiled-coil domains, would be to allow the dimerization of the AT2 receptors and thereby regulate their function. Indeed, it is increasingly well established that the dimerization of receptors with seven transmembrane domains plays a fundamental role in their activation.
  • COS cells are co-transfected with pcDNA3 plasmids containing the hATIPl or hATIP2 cDNA fused in phase with the HA epitope (hemagglutinin) or with the Myc epitope, placed at the N-terminal. After 48 hours of expression in culture, the COS cells are lysed and immunoprecipitated using anti-Myc monoclonal antibodies. The immunoprecipitated complexes are subjected to electrophoresis (SDS-PAGE), transferred onto a nitrocellulose membrane, and analyzed by immunoblotting using anti-HA or anti-ATIP polyclonal rabbit antibodies. After incubation with a second antibody (anti-rabbit) coupled to peroxidase, the immunocomplexes are revealed by chemiluminescence.
  • SDS-PAGE electrophoresis
  • the Myc-hATIPl and Myc-hATIP2 polypeptides expressed in COS cells are correctly immunoprecipitated by the anti-Myc monoclonal antibodies (FIG. 10, lanes 2, 3 and 7) and migrate on SDS gel at the expected size: 50 kDa for hATIPl and 55 kDa for hATIP2.
  • Homodimerization of hATIPl is revealed in cells co-transfected with Myc-hATIPl and HA-hATIPl, by immunoprecipitation with the anti-Myc antibody and immunoblotting with the anti-HA antibodies (lane 6).

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Abstract

Nouvelle famille de protéines humaines (hATIP), interagis-sant avec le récepteur AT2 de l'angiotensine II et possédant une fonction d'anti-oncogène. Ladite famille de protéines est donc utile pour le diagnostic des états cancéreux et précancéreux et le traitement des états cancéreux. Gène codant pour lesdites protéines, fragments dudit gène et leurs applications pour la détection et l'expression desdites protéines. Anticorps dirigés contre lesdites protéines ainsi qu'à des procédés de détection et/ou de dépistage d'un état précancéreux ou cancéreux à l'aide desdites protéi nes desdits anticorps et/ou des différentes séquences d'acides nucléiques.

Description

NOUVELLE FAMILLE DE PROTEINES, DENOMMEES ATIP, LES SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR LESDITES PROTEINES ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention est relative à une nouvelle famille de protéines humaines (hATIP), interagissant avec le récepteur AT2 de l'angiotensine II et possédant une fonction d'anti-oncogène. Ladite famille de protéines est donc utile pour le diagnostic des états cancéreux et précancéreux et le traitement des états cancéreux.
La présente invention est également relative au gène codant pour lesdites protéines ainsi qu'aux transcrits et aux molécules d'ADNc codant pour lesdites protéines, à des fragments de ces différentes molécules d'acide nucléique et à leurs applications pour la détection et l'expression desdites protéines.
La présente invention est également relative à des séquences nucléiques (ADN géno ique, transcrits et ADNc) ou protéiques de la famille hATIP, présentant une altération ou une mutation fonctionnelle.
La présente invention est également relative aux différentes protéines hATIP et à leurs applications.
La présente invention est, en outre, relative aux anticorps dirigés contre lesdites protéines ainsi qu'à des procédés de détection et/ ou de dépistage d'un état précancéreux ou cancéreux à l'aide desdites protéines desdits anticorps et/ ou des différentes séquences d'acides nucléiques.
Le récepteur AT2 de l'angiotensine II est un récepteur à sept domaines transmembranaires, qui appartient ainsi à la famille des récepteurs couplés aux protéines G. Son rôle au cours du développement et de la régénération tissulaire a récemment été démontré (Nouet et al., Trends Endocrinol. Metabol., 2000, 11, 1-6). Des souris dont le gène AT2 a été invalidé, présentent des anomalies du développement du tractus urinaire dû à un défaut de l'apoptose des cellules mésenchymateuses (Nishimura et al., Molecular Cell, 1999, 3, 1-10). De fait, ce récepteur exerce dans de nombreux tissus un effet anti-prolifératif et pro-apoptotique et ce, par le biais de l'activation de protéines tyrosine phosphatases, parmi lesquelles la tyrosine phosphatase SHP-1 (Bedecs et al., Biochem. J., 1997, 325, 449-454 ; Lehtonen et al., Mol. Endocrinol., 1999, 13, 1051-1060). Très récemment, un effet du récepteur AT2 sur la différenciation et la migration cellulaire a été démontré (Côté et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 44, 31686-31692).
Tous ces effets (inhibition de croissance, apoptose, différenciation et migration cellulaire) sont en accord avec le rôle prépondérant joué par le récepteur AT2 dans la croissance et le remodelage des tissus. Cependant, les mécanismes intracellulaires associés à l'activation de ce récepteur et à ses effets inhibiteurs de la croissance, restent mal connus.
Pour progresser dans la compréhension des voies de signalisation intracellulaires du récepteur AT2, des protéines interagissant avec les portions intracytoplasmiques de ce récepteur ont été recherchées. De premières études, entreprises par la méthode du clonage par double hybride dans la levure, ont abouti à la caractérisation d'une protéine humaine apte à se lier au récepteur AT2 (SEQ ID NO:54), qui a fait l'objet d'une demande PCT/FR99/01908.
Cette protéine, dénommée maintenant hATIPl, interagit avec l'extrémité C-terminale du récepteur AT2, mais pas avec celles d'autres récepteurs de la même famille, tels que les récepteurs ATI, β2-adrénergiques ou bradykinine B2.
En interagissant avec le récepteur AT2, la protéine hATIPl joue un rôle dans les voies de signalisation du récepteur AT2 et contribue à atténuer la prolifération cellulaire induite par les facteurs de croissance.
Poursuivant leurs travaux, certains des inventeurs ont maintenant effectivement identifié de nouvelles séquences nucléiques codant pour des protéines homologues à hATIPl (famille hATIP) et interagissant avec le récepteur AT2 ainsi que des séquences génomiques comprenant le gène hATIP ou tout du moins, la majeure partie dudit gène ; ils ont également iden- tifié ce gène comme gène suppresseur de tumeur. L'invention concerne également l'utilisation de ces séquences pour la détection d'anomalies de l'expression ou de la séquence des protéines de la famille hATIP dans certaines lésions prolifératives et pour le traitement des cellules cancéreuses dont tout ou partie du gène hATIP a été altéré ou délété.
Un grand nombre de travaux décrivent la présence d'un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs, localisés sur le petit bras du chromosome 8, en position 8p21.3-p22. Tout ou partie du petit bras du chromosome 8 est fréquemment délété ou muté dans les tumeurs du colon, du foie, du poumon, de la prostate, du sein, des ovaires, de la sphère ORL et de la vessie (Miyakawa et al., Oncol. Rep., 1999, 6, 785-789 ; Radford et al., Genomics, 1999, 60, 1-11 ; Yoshimoto et al., Cancer, 1999, 85, 447-452). La séquence complète de l'ADN génomique (1,2 millions de nucléotides) contenu dans le segment 8p21.3-p22 a récemment été publiée dans les banques de données (Genbank n°AB020859 à n°AB020868). Cependant, la détermination de cette séquence ne permet ni d'identifier les séquences effectivement codantes ni ainsi de déterminer l'identité du ou des gènes suppresseurs de tumeurs.
La caractérisation de la famille de protéines hATIP a permis aux Inventeurs de déterminer la structure et l'organisation en introns/exons du gène codant pour ces protéines, situé dans la région chromosomique 8p21.3-p22.
Le gène hATIP humain est organisé en 17 exons au moins, répartis sur plus de 112 kilobases d'ADN génomique ; certains de ces exons peuvent être utilisés de façon alternative, ce qui conduit à la transcription de molécules d'ARNm différentes. Du fait de cet épissage alternatif, ces différentes molécules d'ARNm comportent différents codons ATG initiateurs de la traduction et codent par conséquent pour des protéines de séquences différentes ; les séquences codant pour différentes isoformes de protéines de la famille hATIP (hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIP5 et hATIPό) ont ainsi été identifiées. Alors que les différentes protéines de cette famille divergent dans leur partie N-terminale, elles présentent dans leur partie C-terminale, une zone commune qui caractérise cette famille et qui inclut la zone d'interaction avec le récepteur AT2. La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADNc isolée, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par :
(a) les séquences d'acide nucléique codant pour une protéine hATIP, comprenant au moins un fragment commun à toutes les protéines hATIP de séquence SEQ ID NO :11, qui correspond à la région d'interaction avec le récepteur AT2, laquelle séquence d'acide nucléique ne comprend pas la séquence SEQ ID NO :55 ; à l'exclusion des séquences GENBANK n°AB033114 et n° AL096842 ;
(b) des variants alléliques de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a)
(c) des séquences complémentaires des séquences d'acide nucléique, telles que définies en (a) et en (b) ; et
(d) des séquences homologues issues de n'importe quel mammifère. On entend au sens de la présente invention, par séquence homologue, une séquence dont l'identité avec la séquence humaine correspondante (après alignement de séquences) varie de 80 à 99 %.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence d'ADNc, elle comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO :9, une séquence correspondant aux positions 364- 714 de la SEQ ID NO :9 et une séquence qui s'hybride en conditions strin- gentes (dans les conditions décrites dans Sambrook et al., 1989) avec la séquence SEQ ID NO :9 et ses fragments.
La séquence SEQ ID NO :9 correspond à un segment de séquence nucléique commun à toutes les séquences codant pour une protéine ATIP, lequel segment inclut la séquence codant pour la région d'interaction avec le récepteur AT2.
Les séquences d'ADNc selon la présente invention correspondent aux différents ARNm, obtenus par épissage alternatif et codant res- pectivement pour les isoformes hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5.
De manière plus précise,
- la séquence codant pour la protéine hATIP2 présente la séquence SEQ ID NO :1
- la séquence codant pour la protéine hATIP3 présente la séquence SEQ ID NO :3 ou la séquence SEQ ID NO :80 comprenant ladite séquence SEQ ID NO :3 et en 5' de ladite séquence, un fragment complémentaire de 138 nucléotides (SEQ ID NO :75), comme présenté à la figure 11.
- la séquence codant pour la protéine hATIP4 présente la séquence SEQ ID NO :5, - la séquence codant pour la protéine hATIP5 présente la séquence SEQ ID NO :7 et
- la séquence codant pour la protéine hATIP6 présente la séquence SEQ ID NO .77 (la phase ouverte de lecture correspond aux nucléotides 31-3678 de la séquence SEQ ID NO :77 présentée à la figure 12) Ces différentes séquences d'ADNc correspondent à des épis- sages alternatifs du gène hATIP ; elles permettent de reconstituer l'organisation du gène en exons et introns et par conséquent d'en définir les régions codantes.
La présente invention a également pour objet un segment d'acide nucléique génomique correspondant au gène hATIP codant pour une protéine hATIP, laquelle séquence est caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par :
(a) une séquence qui correspond à la concaténation des positions 12636 à 1 de la séquence Genbank n° AB020865 et des positions 100 000 à 688 de la séquence Genbank n° d'accession AB020864, qui code au moins pour les protéines hATIPl, hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIP5 et hATIPό (SEQ ID NO :2, 4, 6, 8, 54, 78 (figure 12) et 81 (figure 11)) et qui comprend au moins 17 exons codants dont la lecture se fait sur le brin inverse complémentaire desdites séquences n°AB020865 et n°AB020864 ; à l'exclusion desdites séquen- ces n°AB020865 et n°AB020864 ;
(b) des variants alléliques de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) ;
(c) des mutants de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) ou en (b) qui comprennent au moins la substitution d'un nucléo- tide au niveau d'au moins l'un desdits exons ; de manière préférée, ladite substitution est trouvée dans au moins un allèle de gène hATIP dans au moins une lignée de cellules tumorales et n'est pas trouvée dans une population de 100 allèles du gène hATIP de cellules normales ;
(d) des séquences complémentaires aux séquences d'acide nucléique, telles que définies en (a) et en (b) et
(e) des séquences homologues issues de n'importe quel mammifère.
De manière plus précise, lesdits exons sont répartis comme suit sur ladite séquence génomique (voir figure 4) : - exon 1: il comprend au moins 2032 pb qui correspondent aux positions 12651 à 10620 de la séquence AB020865 (segment 8/11) ; par exemple il comprend 2121 pb (SEQ ID NO :82) comprenant la séquence SEQ ID NO :36 et en 5' de ladite séquence SEQ ID NO :36, un fragment additionnel de 89 nucléotides (SEQ ID NO :79, présentée à la figure 13); cet exon code pour la partie N-terminale de hATIP3 ou de hATIPό, dont le codon ATG initiateur est soit en position 31 de la séquence SEQ ID NO :77 ou 80 ou 12710 de AB020865, soit en position 101 de la séquence 36 ou 12550 de AB020865. On peut observer, dans les séquences issues de cellules d'origines différentes, une substitution C/T en position 1973 (SEQ ID NO :36) ou 10664 (AB020865) ; - exon 2 (séquence SEQ ID NO :37) : il comprend 196 pb et correspond aux positions 702 à 507 de AB020865 (segment 8/11) ;
- exon 3 (séquence SEQ ID NO :38) : il comprend 61 pb et correspond aux positions 81060 à 81000 de la séquence AB020864 (segment 7/11) ; il est présent dans l'ADNc de hATIP2 (utérus) et absent dans l'ADNc de hATIP3 (cerveau) ; il peut donc être épissé de façon alternative et caractérise le transcrit hATIP2 ;
- exon 4 (séquence SEQ ID NO :39) : il comprend 162 pb et correspond aux positions 80731 à 80570 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 4 bis (séquence SEQ ID NO :40) : il comprend au moins 94 pb et correspond aux positions 78701 à 78608 de AB020864 (segment 7) ; il manque peut-être le début de l'exon ; cet exon est contenu uniquement dans la séquence codant pour hATIP5 ; il peut donc être épissé de manière alternative et caractérise le transcrit hATIP5 ;
- exon 5 (séquence SEQ ID NO :41) : il comprend 135 pb et correspond aux positions 72800 à 72666 de AB020864 (segment 7/11) ; il contient le codon ATG initiateur de hATIP2 en position 72684 de AB020864 ou 117 de SEQ ID NO :41).
- exon 6 (séquence SEQ ID NO :42) : il comprend 39 pb et correspond aux positions 70152. à 70114 de AB020864 (segment 7/11) ; on observe un certain nombre de mutations dans des cellules ou tissus tumoraux (voir exemple 8).
- exon 7 (séquence SEQ ID NO :43) : il comprend 413 pb et correspond aux positions 54567 à 54155 de AB020864 (segment 7/11) ; cet exon est utilisé exclusivement par hATIPl (-» épissage alternatif). ; il contient le codon ATG initiateur de hATIPl en position 54275 ; on observe un certain nombre de mutations dans des cellules ou tissus tumoraux (voir exemple 8).
- exon 8 (séquence SEQ ID NO :44) : il comprend 215 pb et correspond aux positions 41450 à 41236 de AB020864 (segment 7/11) ; on peut observer, en position 41342 de AB020864, une substitution A/C, qui donne une mutation Lys/Thr, notamment dans certaines tumeurs (voir exemple 8). - exon 9 (séquence SEQ ID NO :45) : il comprend 67 pb et correspond aux positions 32194 à 32128 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 10 (séquence SEQ ID NO :46) : il comprend 203 pb et correspond aux positions 12951 à 12749 de AB020864 (segment 7/11) ; on observe un certain nombre de mutations dans des cellules ou tissus tumoraux (voir exemple 8).
- exon 11 (séquence SEQ ID NO :47) : il comprend 106 pb et correspond aux positions 11550 à 11445 de AB020864 (segment 7/11).
- exon 12 (séquence SEQ ID NO :48) : il comprend 74 pb et correspond aux positions 10382 à 10309 de AB020864 (segment 7/11) ; on observe un certain nombre de mutations dans des cellules ou tissus tumoraux (voir exemple 8).
- exon 13 (séquence SEQ ID NO :49) : il comprend 96 pb et correspond aux positions 10165 à 10070 de AB020864 (segment 7/11) ; on observe une substitution G/C, en position 10141 de AB020864, qui donne une mutation Glu/Gin dans certaines tumeurs (voir également exemple 8).
- exon 14 (séquence SEQ ID NO :50) : il comprend 117 pb et correspond aux positions 6845 à 6729 de AB020864 (segment 7/11) ; on observe un certain nombre de mutations dans des cellules ou tissus tumoraux (voir exemple 8).
- exon 15 (séquence SEQ ID NO :51) : il comprend 98 pb et correspond aux positions 3961 à 3864 de AB020864 (segment 7/11) et
- exon 16 (séquence SEQ ID NO :52) : il comprend 2333 pb et correspond aux positions 3021 à 689 de AB020864 (segment 7/11) ; il contient le codon stop commun à toutes les protéines hATIP (TGA en position 117 de la séquence SEQ ID NO :52) ; on observe un certain nombre de mutations dans des cellules ou tissus tumoraux (voir exemple 8).
Les exons utilisés par toutes les isoformes de hATIP sont les exons 8 à 16. La présente invention a également pour objet des fragments desdites séquences génomiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués de l'un des exons comportant à son extrémité 5' et/ ou à son extrémité 3 , un segment d'intron comprenant de 1 à 300 pb ; ledit fragment comprend de préférence entre 15 et 50 pb, et est inclus dans ledit segment d'intron de la séquence génomique pouvant se situer à une distance de 1 à 200 pb en amont et/ ou en aval desdits exons.
De manière plus précise, lesdits fragments sont sélectionnés parmi les séquences SEQ ID NO :56-72.
Dans ces séquences, la frontière entre intron et exon ne doit pas être considérée comme précise au nucléotide près.
La présente invention inclut également des fragments des séquences d'acide nucléique telles que définies ci-dessus et leurs séquences complémentaires (y compris les transcrits). De préférence : - lorsque ces fragments comprennent entre 50 et 1 000 pb, ils sont utiles comme sondes ;
- lorsque ces fragments comprennent entre 15 et 50 pb, ils sont utiles comme amorces.
Parmi lesdits fragments, on peut notamment citer les frag- ments suivants :
1. des sondes :
. Sonde B1260 (séquence SEQ ID NO :18) : hybride toutes les séquences codant pour une hATIP ; s'étend sur les exons 11 à 16 ; elle est obtenue par RT-PCR avec les oligonucléotides B1249 (SEQ ID NO :21)/B1251 (SEQ ID NO :22) ; elle permet de détecter le gène hATIP et les différentes formes de l'ARNm de hATIP par hybridation de l'ADN génomique ou de l'ARNm humain dans des conditions d'hybridation stringentes.
. Sonde B1298 (séquence SEQ ID NO :19) : spécifique de hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIP5 et hATIPό ; s'étend sur exons 4 à 6 à l'exception de l'exon 4bis ; elle est obtenue par RT-PCR avec les oligo- nucléotides B1264 (SEQ ID NO :23)/B1265 (SEQ ID NO :24) ; elle permet d'identifier les séquences codant pour hATIP2, hATIP 3, hATIP 4, hATIP 5 et hATIP 6, mais n'hybride pas avec la séquence hATIPl, même dans des conditions d'hybridation peu stringentes. . Sonde de séquence SEQ ID NO :20, spécifique de hATIPl ; comprend uniquement l'exon 7 ; elle est obtenue par PCR sur ADN génomique ou par RT-PCR avec les oligonucléotides B1262 (SEQ ID NO :25)/B1301 (SEQ ID NO :26).
2. des fragments utiles pour amplifier un segment codant pour une hATIP : a) amorces pour l'amplification de la sonde B1260 (commune à tous les hATIP) (séquence SEQ ID NO :18) :
- oligonucléotide B1249 : 23-mer sens (SEQ ID NO :21), localisé dans l'exon 11 (SEQ ID NO AT) : positions 11501 à 11523 de AB020864 et - oligonucléotide B1251 : 24-mer antisens (SEQ ID NO :22), localisé dans l'exon 16 (SEQ ID NO :52) : positions 2711 à 2734 de AB020864. b) amorces pour l'amplification de la sonde B1298 (spécifique de hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIP5 et hATIPό) (SEQ ID NO : 19) :
- oligonucléotide B1264 : 21-mer sens (SEQ ID NO :23), loca- lise dans l'exon 4 (SEQ ID NO :39) : positions 80708-80728 de AB020864 et
- oligonucléotide B1265 : 19-mer antisens (SEQ ID NO :24), localisé dans l'exon 6 (SEQ ID NO :42) : positions 70111-70129 de AB020864. c) amorces pour l'amplification de la séquence SEQ ID NO :20, spécifique de hATIPl (amplification de l'exon 7) - oligonucléotide B1262 : 21-mer sens (SEQ ID NO :25), localisé dans l'exon 7 (SEQ ID NO :43) : positions 54512-54532 de AB020864 et
- oligonucléotide B1301 : 19-mer antisens (SEQ ID NO :26), localisé dans l'exon 7 (SEQ ID NO :43) : positions 54158-54177 de AB020864. 3. des fragments utiles pour détecter un polymorphisme ou une mutation apparaissant dans des cellules cancéreuses : a) amplification de l'exon 8 en vue de détecter la mutation Lys/Thr (AA 56 de la séquence SEQ ID NO :2) : - oligonucléotide B1318 : 22-mer sens (SEQ ID NO :27), localisé dans l'intron précédant l'exon 8 (SEQ ID NO :64) : positions 41584-41605 de AB020864 ; et
- oligonucléotide B1319 : 22-mer antisens (SEQ ID NO :28), localisé dans l'intron qui suit l'exon 8 (SEQ ID NO :64) : positions 41221-41242 de AB020864.
Cette paire d' ligonucléotides produit par amplification de l'ADN génomique, un fragment de 385 pb, dans lequel une substitution A/C en position 41342 de AB020864 génère un site de restriction pour l'enzyme NlalII : on obtient des fragments de 258 et 127 pb, si l'ADN est muté, alors qu'il n'y pas de clivage dans l'ADN sauvage : un seul fragment de 385 pb est obtenu dans ce cas. b) amplification de l'exon 13 en vue de détecter la mutation Glu/ Gin (AA 250 de la séquence SEQ ID NO :2) :
- oligonucléotide B1308 : 22-mer sens (SEQ ID NO :29), loca- lise dans l'intron précédant exon 13 (SEQ ID NO :69) : positions 10205-10226 de AB020864 ; et
- oligonucléotide B1309 : 22-mer antisens (SEQ ID NO :30), localisé dans l'intron qui suit l'exon 13 (SEQ ID NO :69) : positions 9894-9915 de AB020864. Cette paire d'oligonucléotides produit après amplification de l'ADN génomique, un fragment de 333 pb, dans lequel une substitution G/C en position 10141 de AB020864 (dans l'exon 13) (entraînant une mutation Glu/ Gin) génère un site de restriction pour l'enzyme Hinfl.
- oligonucléotide B1310 : 19-mer sens (SEQ ID NO :73), loca- lise dans l'intron qui précède l'exon 13 (SEQ ID NO : 69) : positions 10198- 10216 de AB020864 et
- oligonucléotide B1311 : 19-mer antisens (SEQ ID NO :74), localisé dans l'intron qui suit l'exon 13 (SEQ ID NO :69) : positions 9979-9997 de AB 020864. Cette paire d' oligonucléotides produit après amplification de l'ADN génomique, un fragment de 238 pb, dans lequel une substitution G/C en position 10141 de AB020864 (dans l'exon 13) (entraînant une mutation Glu/ Gin) génère un site de restriction pour l'enzyme Hinfl : on obtient trois fragments de 132, 71 et 35 pb, quand l'ADN est muté et deux fragments de 203 et 35 pb quand l'ADN est sauvage. c) amplification de l'exon 1 en vue de détecter la substitution C/T (Gin/Stop) :
- oligonucléotide B1314 : 22-mer sens (SEQ ID NO :31), localisé dans l'exon 1 : positions 10977-10998 de AB020865 ; et - oligonucléotide B1315 : 22-mer antisens (SEQ ID NO :32), localisé dans l'exon 2 : positions 566-587 de AB020865.
Cette paire d'oligonucléotides produit, après amplification de l'ARNm (RT-PCR), un fragment de 516 pb (SEQ ID NO :33), qu'il y a lieu de séquencer, pour détecter la substitution C/T en position 10664 de AB020865 [création d'un codon stop en position 630 de hATIP3 (SEQ ID NO :4)] et la substitution A/G en position 10987 de AB020865 [création d'un remplacement d'un résidu His en Arg en position 522 de hATIP3 (SEQ ID NO :4)].
4. des fragments utiles pour détecter un épissage alternatif a) amplification de l'exon 3 en vue de détecter un épissage alternatif, permettant de distinguer hATIP2 de hATIP3 et hATIPό :
- oligonucléotide B1312 : 22-mer sens (SEQ ID NO :34), localisé dans l'exon 2 (SEQ ID NO :37) : positions 562-583 de AB020865 ; et
- oligonucléotide B1313 : 22-mer antisens (SEQ ID NO :35), localisé dans l'exon 5 (SEQ ID NO :41) : positions 72687-72708. Cette paire d'oligonucléotides produit, après amplification de l'ARNm (RT-PCR), un fragment de 414 pb si l'exon 3 est présent et un fragment de 354 pb si l'exon 3 est absent.
Les conditions expérimentales pour l'amplification par PCR sont similaires pour toutes les paires d'oligonucléotides : nombre de cycles : 30 ; température d'hybridation entre 50°C et 55°C, en présence de Taq poly- mérase à ADN Proméga, selon les spécifications du fournisseur.
D'autres paires d'oligonucléotides peuvent être mises en œuvre pour détecter les différentes mutations décrites ci-après à l'exemple 8. Par exemple, l'amorce sens est un oligonucléotide de 25 pb correspondant à la séquence située entre -100 pb et -200 pb en 5' de la mutation et l'amorce antisens est un oligonucléotide de 25 pb correspondant à une séquence située entre + 100 pb et + 200 pb en 3' de la mutation, sur le brin inverse complémentaire. Après amplification de l'ADN génomique par PCR à l'aide de ces 2 amorces, on obtient un fragment de 200 à 400 pb qui peut être séquence afin de détecter la mutation.
Les différentes séquences nucléiques (ADNc, séquences génomique ou fragments de ces séquences) peuvent être obtenues par des méthodes connues, par exemple par extension d'une séquence nucléique codant pour une protéine hATIP selon l'invention par PCR ou PCR inverse ou par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle.
Ces différentes séquences d'acides nucléiques permettent, soit de déterminer le profil d'expression de l'ARNm hATIP et une éventuelle altération de ce profil dans un tissu ou un échantillon biologique, soit de mettre en évidence le gène hATIP, des variants alléliques de ce gène et une éventuelle altération de ce gène hATIP (remaniements, délétions, mutations ponctuelles) et par voie de conséquence d'évaluer l'existence d'un état cancéreux.
Les différentes séquences nucléiques définies ci-dessus constituent de bons outils de diagnostic pour la mise en évidence de cellules cancé- reuses ayant muté, délété ou réarrangé le gène suppresseur de tumeurs correspondant (gène ATIP) et/ ou de pronostic pour la mise en évidence de cellules cancéreuses par détection d'une altération des séquences ou de l'expression des produits de ce gène.
La présente invention a également pour objet un réactif de détection, constitué par au moins une séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence nucléique choisie dans le groupe constitué par le réactif de détection nucléique tel que défini ci-dessus, la séquence nucléique SEQ ID NO :53 codant pour hATIPl et les fragments d'au moins 15 pb de ladite séquence SEQ ID NO :53 pour l'évaluation, le pronostic et/ ou la détection d'un état précancéreux ou cancéreux.
Les différentes séquences d'acide nucléiques, telles que définies ci-dessus, peuvent être également avantageusement utilisées pour construire des vecteurs d'expression d'une protéine hATIP, aptes à être utilisés pour produire lesdites protéines ou en thérapie génique.
La présente invention a donc également pour objet des vecteurs, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence codant pour tout ou partie d'une protéine hATIP humaine telle que définie ci-dessus. Dans de tels vecteurs, la séquence codant pour la protéine hATIP est sous le contrôle d'éléments de contrôle de transcription et de traduction appropriés.
Ces vecteurs peuvent être obtenus et introduits dans une cellule hôte par des techniques connues.
L'invention a également pour objet une cellule hôte eucaryote ou procaryote transformée par un vecteur tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet des protéines ATIP isolées et purifiées, caractérisées en ce qu'elles sont codées par une séquence d'ADNc ou un transcrit ou un fragment d'acide nucléique génomique, tels que définis ci-dessus. De manière plus précise, elles comprennent au moins un fragment commun à toutes les protéines hATIP, qui correspond à la région d'interaction avec le récepteur AT2 sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO :11 et SEQ ID NO :12, lesquelles protéines ne comprennent pas la séquence SEQ ID NO :13, spécifique de hATIPl, dans leur portion N-terminale.
Lesdites protéines représentent de nouvelles isoformes interagissant avec le récepteur AT2.
De manière encore plus précise :
- la protéine hATIP2 présente la séquence SEQ ID NO :2 - la protéine hATIP3 présente la séquence SEQ ID NO :4 ou la séquence SEQ ID NO :81 correspondant à la SEQ ID NO :4 additionnée à son extrémité N-terminale d'un séquence de 53 acides aminés (SEQ ID NO :76), comme présenté à la figure 11.
- la protéine hATIP4 présente la séquence SEQ ID NO :6 - la protéine hATIP5 présente la séquence SEQ ID NO :8 et
- la protéine hATIPό présente la séquence SEQ ID NO :78 (figure 12).
Ces différentes isoformes correspondent à des épissages alternatifs du gène hATIP : - hATIPl, qui fait l'objet de la demande précitée
PCT/ FR99/ 01908, correspond au produit d'épissage des exons 7 à 16 ;
- hATIP2 correspond au produit d'épissage des exons 1 à 16 à l'exception des exons 4bis et 7 ;
- hATIP3 correspond au produit d'épissage des exons 1 à 16 à l'exception des exons 3, 4bis et 7 ;
- hATIP4 correspond à un produit d'épissage identique à celui de hATIP3 ; toutefois sa partie N-terminale est plus courte du fait de la présence d'un codon stop dans l'exon 1 ; ce codon stop est dû à une substitution C/T en position 10664 de la séquence n°AB020865. - hATIP5 correspond au produit d'épissage des exons 4 bis à 16, à l'exception de l'exon 7.
- hATIPό correspond au produit d'épissage des exons 1 à 16 à l'exception des exons 3, 4, 4bis et 7.
De manière avantageuse, lesdites hATIP comprennent des motifs particuliers, situés dans la séquence SEQ ID NO :10, commune à toutes les protéines ATIP et contenant la séquence SEQ ID NO :11, correspondant à la région d'interaction avec le récepteur AT2 ; lesdits motifs participent à l'action spécifique desdites protéines (voir figure 2) :
- motifs « fermeture à leucine » (leucine zipper) : L (6X) L (6X) L(6X), en positions 214-235 et en position 266-287, en référence à la séquence
SEQ ID NO :10.
- domaines coiled-coil, en positions 60-116 et en positions 140- 331, en référence à la séquence SEQ ID NO :10.
Les domaines coiled-coil favorisent les interactions protéi- nés/ protéines et la dimérisation. La présence d'un grand domaine coiled-coil dans les séquences communes à toutes les hATIP indique que ces protéines hATIP sont capables de s'homo-ou hétéro-dimériser, et que c'est cette propriété qui pourrait assurer leur fonction d'interaction avec le récepteur AT2, et éventuellement leur rôle de suppresseur de tumeur. Les Inventeurs ont trouvé que dans certaines tumeurs, on observe des mutations au niveau de ladite région d'interaction avec le récepteur AT2 ; on peut trouver, par exemple la mutation E/Q (position 231 de la séquence SEQ ID NO :10) ; cette mutation est située au milieu du premier motif de fermeture à leucine et en plein milieu de la région coiled-coil. D'autres motifs sont localisés dans des parties spécifiques des différentes protéines hATIP (voir figure 1) :
. Protéine hATIPl : 2 sites consensus de N-myristylation, qui correspondent respectivement aux positions 20-25 et 30-35 de la séquence SEQ ID NO :13 ; ce signal permet une éventuelle modification post-traductionnelle de la protéine (myristylation) qui cible la protéine à la membrane. Un tel signal pourrait permettre l'interaction de ATIP avec des protéines membra- naires.
. Protéine hATIP2 : signal de localisation nucléaire [Nuclear
Localisation Signal (NLS)] bipartite, qui correspond aux positions 10-25 de la séquence SEQ ID NO :2 ; ce signal cible potentiellement hATIP2 dans le noyau, et pourrait permettre la dimérisation d'ATIP avec des protéines nucléaires.
. Protéine hATIP3 : 7 sites consensus de N-myristylation (voir figure 1). . Protéine hATIP4 : 2 sites consensus de N-myristylation.
. Protéine hATIP5 : 2 sites consensus de N-myristylation. Ces différentes protéines ainsi que la protéine hATIPl ont une action sur la prolifération des cellules cancéreuses et trouvent notamment application pour la préparation de médicaments anticancéreux ; par exemple, la ré-introduction dans les cellules cancéreuses du gène hATIP ou de produits d'épissages appropriés du gène hATIP, permet de restaurer une prolifération normale des cellules tumorales. Tout ou partie desdites protéines peuvent également être directement utilisées dans le traitement des tumeurs.
La présente invention a également pour objet un médicament anti-tumoral, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence d'acide nucléique nue, codant pour tout ou partie d'une protéine hATIP, telle que définie ci-dessus ou un vecteur tel que défini ci-dessus, ou une celle hôte telle que définie ci- dessus, ou tout ou partie d'une protéine hATIP telle que définie ci-dessus.
Les protéines selon l'invention incluent également toute pro- téine (naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante) de n'importe quel mammifère ; elles comprennent, de manière générale, un domaine d'interaction avec le récepteur AT2 qui présente la séquence SEQ ID NO :12 et comprennent ou sont constituées :
- soit par une isoforme ATIP fonctionnelle, - soit par un mutant fonctionnellement modifié d'une iso- forme ATIP (présent dans des cellules cancéreuses, par exemple).
On entend par protéine fonctionnelle, une protéine qui présente une activité biologique normale (inhibition de la prolifération cellulaire et effet anti-oncogène ou suppresseur de tumeur). On entend par mutant fonctionnellement modifié d'une protéine, un mutant qui comprend une ou plusieurs mutations qui induisent une modification substantielle de son activité. De tels mutants sont notamment ceux détectés dans les cellules cancéreuses.
Les mutants hATIP peuvent présenter une identité inférieure à 70% avec l'une des isoformes hATIP, telles que définies ci-dessus ; cependant, l'identité des séquences non-modifiées de ces mutants, lorsqu'ils sont alignés avec les séquences des isoformes hATIP correspondantes reste élevée et peut être supérieure à 70%.
La présente invention a également pour objet des fragments des protéines telles que définies ci-dessus, comprenant au moins 12 acides aminés et notamment les fragments de séquence SEQ ID NO :10 et 12 à 17.
Les séquences SEQ ID NO :13, 15 et 17 sont spécifiques respectivement de hATIP 1, hATIP 3 et hATIP 6 et hATIP 5.
La présente invention a en outre pour objet des anticorps, ca- ractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une protéine ATIP ou un fragment de protéine hATIP selon l'invention.
Les anticorps dirigés contre une isoforme hATIP fonctionnelle ou non ou contre la zone commune à l'ensemble des isoformes hATIP domaine peuvent ainsi être obtenus. Ils peuvent être avantageusement soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux.
De tels anticorps trouvent application comme outil de diagnostic pour la détection de cellules cancéreuses ayant muté ou délété le gène suppresseur de tumeurs correspondant (gène hATIP).
La présente invention a également pour objet un réactif de dé- tection, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par au moins une protéine telle que définie ci-dessus, au moins un fragment de protéine tel que défini ci-dessus et au moins un anticorps tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence protéique choisie dans le groupe constitué par au moins une protéine telle que définie ci-dessus, au moins un fragment de protéine tel que défini ci-dessus ou au moins un anticorps tel que défini ci-dessus, la séquence SEQ ID NO :54, les fragments d'au moins 12 acides aminés de ladite séquence SEQ ID NO :54 et les anticorps dirigés contre ladite protéine de séquence SEQ ID NO :54 ou ses fragments pour l'évaluation, le pronostic et/ ou la détection d'un état précancéreux ou cancéreux.
La présente invention a également pour objet des moyens de détection et de correction d'états précancéreux ou cancéreux.
De manière plus précise, l'invention a pour objet des méthodes qui mettent en œuvre les séquences nucléiques et/ ou les séquences protéiques telles que définies ci-dessus pour l'évaluation, le diagnostic ou le pronostic d'un état précancéreux ou cancéreux.
Par exemple, l'invention a pour objet des méthodes de diagnostic d'un état cancéreux ou précancéreux chez l'homme, qui comprennent : - soit la détection de l'expression d'un mutant fonctionnelle- ment modifié du gène hATIP, dans un échantillon d'acide nucléique,
- soit la détection d'un épissage alternatif (établissement d'un profil d'expression des différents isoformes de hATIP, au niveau de l'ARNm ou des protéines), - soit la détection d'une perte d'expression de l'une ou l'autre des différentes isoformes d'hATIP au niveau de l'ARNm ou des protéines.
Les séquences nucléiques selon l'invention peuvent avantageusement être mises en œuvre dans ces méthodes.
La présente invention a ainsi également pour objet un procédé de détection d'une délétion, d'une insertion ou d'une substitution dans le gène hATIP, pour évaluer le risque de développer un état cancéreux, qui comprend :
- l'obtention d'un échantillon d'acide nucléique, et
- la détection de la présence dans ledit échantillon d'acide nucléique d'une séquence d'acide nucléique codant pour un mutant hATIP, à l'aide d'au moins un réactif de détection nucléique, tel que défini ci-dessus et/ ou de la séquence nucléique SEQ ID NO :53 codant pour hATIPl et des fragments d'au moins 15 pb de ladite séquence SEQ ID NO :53.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, il comprend pour ladite détection :
. la mise en contact dudit échantillon d'acide nucléique avec une paire d'amorces aptes à amplifier une région dudit gène hATIP contenant éventuellement une mutation et
. la détection de ladite mutation par séquençage de la séquence obtenue ou par mise en contact de ladite séquence avec au moins une enzyme de restriction appropriée et analyse des fragments obtenus par rapport à un échantillon contrôle normal.
Selon un autre mode de mise en œuvre dudit procédé, il comprend pour ladite détection : . l'isolement, à partir de l'ADN génomique d'un patient, et de l'ADN génomique d'un sujet contrôle dont le gène hATIP ne comporte aucune mutation, d'une portion du gène hATIP codant pour une protéine hATIP qui inclut l'un ou l'autre des exons tels que définis ci-dessus (SEQ ID NO :36 à 52), et . l'hybridation de la séquence génomique dudit patient et dudit sujet contrôle avec une sonde marquée spécifique de ladite portion de séquence du gène hATIP, puis
. la détection directe des mésappariements et/ ou la mise en contact avec une enzyme de restriction appropriée et la séparation des frag- ments de restriction obtenus. La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'au moins une isoforme de hATIP, à partir d'un échantillon biologique à l'aide d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, tels que définis ci- dessus et/ ou les anticorps dirigés contre la protéine de séquence SEQ ID NO :54 ou ses fragments d'au moins 12 acides aminés.
La présente invention a également pour objet une méthode d'établissement du profil d'expression des ARNm hATIP d'un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- le prélèvement d'un échantillon - l'extraction de l'ARNm,
- soit la transcription inverse (RT) dudit ARNm et les amplifications successives on concomitantes des ADNc obtenus en présence d'amorces spécifiques de chaque isoforme de hATIP, puis l'analyse des produits d'amplification obtenus par électrophorèse, soit l'hybridation dudit ARNm avec une sonde spécifique, isolée à partir des séquences nucléiques telles que définies ci-dessus et
- l'établissement du profil de transcription hATIP dudit échantillon.
La présente invention a également pour objet une méthode d'établissement du profil d'expression des protéines hATIP d'un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- le prélèvement d'un échantillon,
- la mise en contact d'un lysat cellulaire extrait dudit échantillon avec des anticorps spécifiques des différentes isoformes de hATIP et - l'établissement du profil d'expression des protéines hATIP dudit échantillon, par détection des complexes formés.
L'invention a, en outre, pour objet des kits ou trousses pour la mise en œuvre des différentes méthodes selon l'invention.
Lesdits kits comprennent, de manière préférée, au moins une paire d'amorces et au moins une sonde, éventuellement marquée, tels que définis ci-dessus, et éventuellement des enzymes de restriction appropriées.
Ils peuvent être mis en œuvre, en associations avec des kits d'amplifications ; ils peuvent également inclure des contrôles négatifs et positifs, des marqueurs de taille moléculaire pour le gel d' électrophorèse, par exemple.
D'autres kits selon l'invention peuvent inclure des anticorps, éventuellement marqués, ainsi que des réactifs appropriés à la détection de complexes antigènes-anticorps. ; ils peuvent également inclure des contrôles positifs et négatifs. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent également être utilisés dans un but thérapeutique, par exemple pour restaurer un effet suppresseur de tumeur.
Le Tableau ci-après établit les correspondances entre les numéros des séquences telles qu'elles apparaissent dans la liste de séquences et le nom des différentes séquences.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre une comparaison des séquences en acides aminés : hATIPl, hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5, les sites consensus de N-myristylation sont soulignés,
- la figure 2 illustre la séquence en acides aminés commune aux différentes hATIP (SEQ ID NO :10), dans laquelle les deux motifs fermeture à leucine sont indiqués en gras et les domaines coiled-coil sont soulignés,
- la figure 3 illustre de façon schématique l'utilisation alternative de différents exons du gène hATIP (chromosome 8ρ21.-p22), permettant la production de 5 formes d'ARNm différents (hATIPl à 5) : la localisation des exons, par rapport aux séquences Genbank n°AB020864 et n°AB020865, est indiquée par une double flèche, les exons (3, 4 bis et 7) utilisés de façon alternative sont encadrés, le début de la traduction protéique est représenté par un drapeau, et la position des codons stop est représentée par une étoile,
- la figure 4 illustre la structure en introns et en exons de la séquence du gène hATIP : la localisation des différents exons est précisée par rapport aux séquences Genbank n°AB020864 et n°AB020865,
- la figure 5 illustre l'analyse du gène hATIP par Southern blot, sur l'ADN génomique humain de cellules tumorales humaines (MCF-7,
CAL33, Igrovl : pistes 1-3) ou de cellules normales de placenta humain (piste 4), après clivage avec les enzymes de restriction HindIII ou EcoRI et hybridation avec la sonde (B1260, SEQ ID NO :18), couvrant les exons 11 à 16 du gène hATIP, - la figure 6 illustre l'analyse du profil d'expression des transcrits hATIP dans des lignées cellulaires tumorales humaines de différentes origines .colon (HT29, SW48), sphère ORL (CAL33), foie (HepG2), poumon (SK-MES, 460M, A549, ludlu), prostate (DU1215, LWL-cap), ovaire (Igrovl), et sein (MCF-7), par Northern blot à l'aide des sondes B1260 (SEQ ID NO : 18) couvrant les exons 11 à 16 du gène hATIP, et B1298 (SEQ ID NO : 19) couvrant les exons 4, 5 et 6 du gène hATIP,
- la figure 7 illustre la détection, par PCR et analyse de restriction, de la substitution G/C en position 10141 de la séquence AB020864 (exon 13), correspondant à la mutation Glu/ Gin à l'acide aminé 250 de SEQ ID NO :2, à partir de cellules tumorales humaines : produits de PCR obtenus à partir de l'ADN sauvage avant et après clivage par l'enzyme Hinfl (pistes 1 et 2), produits de PCR obtenus à partir de l'ADN muté en position 10141, avant et après clivage par ladite enzyme (pistes 3 et 4),
- la figure 8 illustre l'analyse du profil d'expression des pro- téines de la famille hATIP dans des lignées cellulaires tumorales humaines de différentes origines : sphère ORL (piste 1), prostate (pistes 2 et 11), colon (pistes 3, 6, 10 et 13), foie (piste 4), poumon (pistes 5, 8 et 12), ovaire (pistes 7 et 9), par immunoblot à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la séquence (SEQ ID NO :10), commune aux protéines hATIP, - la figure 9 illustre le rôle inhibiteur de la protéine codée par l'ADNc hATIP2 (SEQ ID NO : 1) dans la prolifération des cellules tumorales CAL33 issues de la sphère ORL, en présence de sérum de veau fœtal à 2, 5%.
- la figure 10 illustre la propriété d'homo- et d'hétéro-diméri- sation des protéines hATIPl et hATIP2, révélée par co-transfection transitoire des ADNc correspondant étiquetés (Myc et HA), dans des cellules COS, suivie d'une analyse par immunoprécipitation et immunoempreinte à l'aide d'anticorps spécifiques des étiquettes Myc et HA.
- la figure 11 représente la séquence nucléique (SEQ ID NO :80) et protéique (SEQ ID NO :81) complète de hATIP3 ; les séquences nucléiques et protéiques additionnelles correspondant respectivement aux séquences SEQ ID NO :75 et SEQ ID NO :76 sont soulignées.
- la figure 12 représente la séquence nucléique (SEQ ID NO :77) et protéique (SEQ ID NO :78) de hATIPό.
- la figure 13 représente la séquence en 5' de l'exon 1 (SEQ ID NO :79).
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Détection de remaniements du gène hATIP dans des cellules cancéreuses par Southern blot, sur l'ADN génomique, en utilisant la sonde B1260 (SEQ ID NO :18). a) Matériels et méthodes
L'extraction de l'ADN génomique total, la préparation et le marquage des sondes ainsi que l'hybridation par Southern-Blot sont réalisées selon les techniques classiques décrites dans Sambrook et al., 1989. Les échan- filions d'ADN génomique total, préparés à partir de lignées de cellules tumorales humaines issues de tumeurs de différentes origines (sein, sphère ORL et ovaire) ou de cellules normales issues de placenta humain, sont digérés soit avec HindIII ou EcoRI. Les fragments obtenus sont séparés sur gel d'agarose puis transférés sur membrane de nylon ; la membrane est hybridée avec la sonde B1260 (SEQ ID NO :18) radiomarquée, dans le tampon : 45 % forma- mide, 0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % Ficoll, 0,1 % sodium pyrophosphate, 0,01 % SDS, 0,05 mM Tris pH 7,5 et 0,9 M NaCl, à 45°C, lavée à faible stringence (2X SSC, 0,01 % SDS à 45°C, puis autoradiographiée 72 h à - 80°C. b) Résultats
L'analyse du gène hATIP à l'aide de la sonde B1260 qui couvre les exons 11 à 16 dudit gène (figure 5), montre un profil de restriction différent dans des lignées de cellules tumorales de différentes origines : MCF-7 (sein, piste 1), CAL33 (sphère ORL, piste 2), IgrOvl (ovaire, piste 3) et dans un tissu normal contrôle (placenta, piste 4), après clivage avec les enzymes de restriction HindIII et EcoRI.
EXEMPLE 2 : Analyse du profil d'expression des transcrits du gène hATIP dans des lignées cellulaires issues de tumeurs humaines de différentes ori- gines a) Matériels et méthodes
L'extraction des ARN, la préparation et le marquage des sondes ainsi que l'hybridation par Northern blot sont réalisées selon les techniques classiques décrites dans Sambrook et al., 1989. Environ 5 μg d'ARN poly (A+) préparés à partir de lignées cellulaires tumorales humaines issues de tumeurs de différentes origines : colon (HT29, SW48), sphère ORL (CAL33), foie (HepG2), poumon (SK-MES, 460M, A549, ludlu), prostate (DU1215, LWL- cap), ovaire (Igrovl), et sein (MCF-7), sont séparés sur gel d'agarose puis transférés sur membrane de nylon ; la membrane est hybridée avec la sonde B1260 comprenant les exons 11 à 16 (SEQ ID NO : 18) (panneau du haut), ou avec la sonde B1299 comprenant les exons 4, 5, 6 (SEQ ID NO : 19) (panneau du bas). Chacune des sondes est radiomarquée, puis hybridée avec la membrane dans le tampon : 45 % formamide, 9 % Dextran-sulfate, 0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % Ficoll, 0,1 % sodium pyrophosphate, 0,01 % SDS, 0,05 mM Tris pH 7,5 et 0,9 M NaCl, à 45°C, lavée à faible stringence (2X SSC, 0,01 % SDS à 45°C), puis autoradiographiée 72 h à -80°C. b) Résultats
La figure 6 montre, dans les cellules tumorales humaines issues de tumeurs de différentes origines : colon (HT29, SW48), sphère ORL (CAL33), foie (HepG2), poumon (SK-MES, 460M, A549, ludlu), prostate (DU1215, LWL-cap), ovaire (Igrovl), et sein (MCF-7), différents niveaux d'expression de transcrits de 7 kb, 5 kb, 3,5 kb et 2 kb, révélés par la sonde B1260 commune à toutes les séquences hATIP. Les transcrits hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIPό, spécifiquement révélés par la sonde B1299, sont contenus dans le produit d'hybridation de 7 kb. Ces transcrits sont complètement absents dans la lignée tumorale de prostate LWL-cap. De par la longueur de l'ADNc correspondant, le transcrit hATIPl doit être contenu dans le produit d'hybridation de 2 kb, qui est également absent dans la lignée LWL-cap. Les autres produits d'hybridation, aux tailles de 5 kb, et 3,5 kb, contiennent des transcrits encore non identifiés.
EXEMPLE 3 : Amplification comparée d'un fragment de 238 pb : Détection d'une mutation sur de l'ADN génomique, par PCR et analyse de restriction. a) Matériels et méthodes
L'ADN génomique est extrait à partir des cellules tumorales comme décrit à l'exemple 1, l'amplification PCR est réalisée à l'aide de la Taq polymérase à ADN (Proméga), selon le protocole recommandé par le producteur, dans les conditions expérimentales suivantes: nombre de cycles : 30 ; température d'hybridation : 55°C.
La détection de la substitution G/C en position 10141 de la séquence AB020864 (exon 13) est effectuée selon le protocole suivant : - amplification comparée d'un fragment de 238 pb de l'exon 13 à l'aide des amorces SEQ ID NO :73 et SEQ ID NO :74, dans un échantillon de cellules tumorales à analyser, et dans un échantillon de cellules normales (contrôle). - digestion par Hinfl
- séparation des produits obtenus en gel d'agarose 2% : la présence de deux produits de clivage (203 et 35 pb) est caractéristique d'une séquence d'ADN sauvage. La substitution G/C en position 10141 de la séquence AB020864 génère un site de restriction additionnel pour l'enzyme Hinfl. La détection de trois fragments d'ADN (132, 71 et 35 pb) est caractéristique d'une séquence d'ADN muté. b) Résultats
La figure 7 montre la détection de la substitution G/C en position 10141 de la séquence AB020864 (exon 13), correspondant à la mutation Glu/ Gin à l'acide aminé 250 de SEQ ID NO :2, à partir de cellules tumorales humaines. La présence de deux produits de clivage (203 et 35 pb) est caractéristique d'une séquence d'ADN sauvage. La détection de trois fragments d'ADN (132, 71 et 35 pb) est caractéristique d'une séquence d'ADN muté. EXEMPLE 4 : Production d'anticorps. 1. Production d'anticorps dirigés contre toutes les protéines hATIP
Un sérum polyclonal anti-hATIP est produit chez le lapin, par injection d'une protéine de fusion comprenant la séquence SEQ ID NO :11 fusionnée à 6 résidus histidine. Ces anticorps polyclonaux utilisés en immunoblot identifient trois polypeptides majeurs de poids moléculaires apparents : 32kDa, 64 kDa et 180 kDa, dans des lysats cellulaires issus de différentes lignées tumorales humaines (voir exemple 5).
Ces anticorps détectent aussi la présence d'un polypeptide de poids moléculaire apparent de 57 kDa, dans le lysat de certaines cellules tumorales. La détection de protéines ATIP de tailles aberrantes dans des lysats tissulaires constitue une méthode diagnostique pour le dépistage de certains cancers.
2. Production d'anticorps reconnaissant spécifiquement l'un ou l'autre membre de la famille hATIP
. des anticorps spécifiques des polypeptides hATIP2, hATIP3, hATIP4 et hATIP5 peuvent être obtenus par injection à des lapins d'un peptide d'au moins 12 acides aminés, comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :14 ; . des anticorps spécifiques du polypeptide hATIPl peuvent être obtenus par injection à des lapins d'un peptide d'au moins 12 acides aminés, comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :13 ;
. des anticorps spécifiques du polypeptide hATIP3 ou hATIPό peuvent être obtenus par injection à des lapins d'un peptide d'au moins 12 acides aminés, comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :15.
. des anticorps spécifiques du polypeptide hATIP5 peuvent être obtenus par injection à des lapins d'un peptide d'au moins 12 acides aminés, comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :17. EXEMPLE 5 : Détection d'une altération de l'expression des protéines hATIP dans des cellules cancéreuses par la méthode d'immunoempreinte, mettant en œuvre des anticorps spécifiques. a) Matériels et méthodes
Les échantillons de protéines obtenus après lyse des cellules sont dosés, séparés par électrophorèse en gel de 10% polyacrylamide, en pré- sence de SDS, puis les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellu- lose et révélées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-hATIP, selon l'exemple
4. b) Résultats
L'analyse du profil d'expression des protéines hATIP dans des lignées tumorales humaines de différentes origines, analysé par immuno- blot à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-hATIP (figure 8), montre : la présence de trois polypeptides majeurs de poids moléculaires apparents : 32 kDa, 64 kDa et 180 kDa, correspondant aux protéines hATIP. De plus, la présence d'un polypeptide de poids moléculaire apparent de 57 kDa, correspondant à une protéine hATIP de taille aberrante, est aussi observée dans certaines lignées tumorales. La détection de protéines hATIP de taille aberrante dans des lysats tissulaires constitue une méthode diagnostique pour le dépistage de certains cancers.
EXEMPLE 6 : Inhibition de croissance des cellules tumorales surexprimant la protéine hATIP2. a) Matériels et méthodes
Les cellules tumorales CAL33 sont transfectées avec l'ADNc hATIP2 (SEQ ID NO :1) inséré dans le vecteur d'expression ρcDNA3 qui comprend un gène de résistance à la néomycine. Un clone résistant au G418 (CAL33-2C), exprimant des taux détectables de protéine hATIP2, a été sélectionné. Les cellules transfectées (CAL33-2C) ou non transfectées (CAL33-WT) sont ensemencées à la densité de 0,2 millions de cellules par puits de plaques 6 puits, dans le milieu de culture Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) comprenant 1 g/1 de glucose et 10% de sérum de veau fœtal (SVF). Les cellules sont alors sevrées pendant une nuit, puis mises à pousser dans le milieu DMEM lg/1 de glucose, en présence de 2,5% SVF. Après 24h ou 48h de culture, les cellules sont décollées et comptées à l'hématimètre. b) Résultats
On observe une inhibition de la croissance des cellules CAL33-2C surexprimant la protéine hATIP2 par rapport aux cellules non transfectées (CAL33 WT) (Figure 9). En présence de 2,5% SVF, l'inhibition de la croissance est d'environ 30% à 24h et 37% à 48h.
EXEMPLE 7 : Homo- et hétéro-dimérisation des protéines hATIPl et hATIP2 Les protéines de la famille ATIP sont caractérisées par la présence dans leur portion carboxy-ter inale de plusieurs régions coiled-coil, connues pour favoriser les interactions protéine-protéine. Ces motifs coiled- coil sont précisément contenus dans le domaine d'interaction des protéines ATIP avec le récepteur AT2 de l'angiotensine II. Le rôle des protéines ATIP, en formant des homo- et des hétérodimères par le biais de ces domaines coiled-coil, serait de permettre la dimérisation des récepteurs AT2 et par là- même de réguler leur fonction. En effet, il est de mieux en mieux établi que la dimérisation des récepteurs à sept domaines transmembranaires joue un rôle fondamental dans leur activation. a) Matériel et Méthodes
Des cellules COS sont co-transfectées avec des plasmides pcDNA3 contenant l'ADNc hATIPl ou hATIP2 fusionné en phase avec l'épitope HA (hémagglutinine) ou avec l'épitope Myc, placés en N-terminal. Après 48h d'expression en culture, les cellules COS sont lysées et immuno- précipitées à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-Myc. Les complexes immunoprécipités sont soumis à électrophorèse (SDS-PAGE), transférés sur membrane de nitrocellulose, et analysés par immunoempreinte à l'aide d'anticorps polyclonaux de lapin anti-HA ou anti-ATIP. Après incubation avec un second anticorps (anti-lapin) couplé à la peroxydase, les immuno- complexes sont révélés par chemiluminescence. b) Résultats
Les polypeptides Myc-hATIPl et Myc-hATIP2 exprimés dans les cellules COS sont correctement immunoprécipités par les anticorps monoclonaux anti-Myc (Figure 10, pistes 2, 3 et 7) et migrent sur gel SDS à la taille attendue : 50 kDa pour hATIPl et 55 kDa pour hATIP2. L'homodimérisation de hATIPl est révélée dans les cellules co-transfectées avec Myc-hATIPl et HA-hATIPl, par immunoprécipitation avec l'anticorps anti-Myc et immunoempreinte avec les anticorps anti-HA (piste 6). L'homodimérisation de hATIP2 est révélée de la même manière dans les cellules COS co-transfec- tées avec les plasmides Myc-hATIP2 et HA-hATIP2 (piste 9). L'hétérodimérisation entre hATIPl et hATIP2 est révélée dans les cellules COS co-transfectées avec les plasmides Myc-hATIP2 et HA-hATIPl (piste 4). EXEMPLE 8 : Polymorphismes et mutations du gène hATIP dans des lignées de cellules et tissus tumoraux Polymorphismes non-conservatifs et mutations Substitution Position sur AB020865 exon AA (SEQID NO 4=hATIP3) lignée/tumeur
Cag/Aag 12487 1 22 (Gin/Lys) T4 (20) Tgt/Cgt 12269 1 95 (Cys/Arg) Genbank AB020865
aCg/aTg 11437 1 372 (T r/Met) ADN normal (hz) , HepG2 , L29 (MEK) aAa/aCa 11353 1 400 (Lys/Thr) L12 (HCC36) , L16 (HepG2) , L24 (HuH7) , L29 (MEK) , L41 (SNU182) , L44 (SNU387), L46 (SNU423), L51 (TFK1) , T5 (23), T21 (BEAU) , CAL166 Gca/Tca 11024 1 510 (Ala/Ser) L2 (BEL7404) cAt/cGt 10987 1 522 (His/Arg) A549 Caa/Taa 10664 1 630 (Gin/Stop) Genbank AB033114
Position sur AB020864 aG/gt→aT/gt 70153 6 site d'épissage L48 (SNU475) Aat/Cat 70120 6 820 (Asn/His) T12 (95)
G/A 54423 7 5' ncs 41% des lignées hépatiques,
5% des tumeurs hépatiques,
CAL33, CAL27,
A549
aAa/aCa 41342 8 858 (Lys/Thr) CAL33,
T3 (11),
T20 (176) ,
4% de 184 allèles
Gaa/Aaa 12787 10 971 (Glu/Lys) Human lung cDNA atT/atG 10378 12 1020 (Ile/Met) LWLCap Gaa/Caa 10141 13 1052 (Glu/Gin) CAL33, T3 (11), T4 (20), T20 (176) , 2% de 142 allèles aAt/aGt 10155 13 1047 (Asn/Ser) LWLCap aGa/aTa 10092 13 1068 (Arg/Ile) LWLCap
Aga/Gga 10087 13 1070 (Arg/Gly) LWLCap
Ttg/Gtg 10072 13 1075 (Leu/Val) LWLCap
Atc/Gtc 6755 14 1106 (Ile/Val) LWLCap cAg/cGg 3019 16 1148 (Gln/Arg) CAL165 ttG/ttC 2861 16 1200 (Leu/Phe) LWLCap
Polymorphismes conservatifs : substitution position sur AB020865 exon AA (SEQID NO 4 =hATIP3) lignée/tumeur
CtA/ctG 12240 104 (Leu) Genbank AB020865 gaA/gaG 12033 173 (Glu) 44% des lignées hépatiques, 46% des tumeurs hépatiques, CAL165, CAL27 ccT/ccC 11280 424 (Pro) 50% des lignées hépatiques, 42% des tumeurs hépatiques, CAL166, CAL165, CCL247, DU1215, Genbank AB020865
Position sur AB020864
C/G 54418 5' non-codante 33% des lignées hépatiques,
36% des tumeurs hépatiques,
CAL165, HT29,
MCF7,
Genbank AB020865 acA/acG 41398 839 (Thr) 80% des lignées hépatiques, 54% des tumeurs hépatiques, CAL165, A549, ludlu, CAL166, SW480, SK-MES, 460M, Igrovl, CAL60, DU1215, ADN normal (hz) , Human lung cDNA Library acG/acA 41356 853 (Thr) L10 (HA22T-VGH) , L39 (Sk-Hepl) , T24 (RAO) gaG/gaA 12776 10 974 (Glu) 21% des lignées hépatiques, 17% des tumeurs hépatiques, CAL33 gaA/gaG 10381 12 1019 (Glu) T5 (23) tcG/tcC 2985 16 1159 (Ser) HepG2 agA/agG 2810 16 1217 (Arg) myomètre
C/G 2803 16 3' non-codante SW480, A549, ludlu, 460M, Igrovl, CAL33, ORL3, DU1215
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente in- vention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Séquence d'ADNc isolée, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par :
(a) les séquences d'acide nucléique codant pour une protéine hATIP, comprenant au moins un fragment commun à toutes les protéines hATIP de séquence SEQ ID NO :11, qui correspond à la région d'interaction avec le récepteur AT2, laquelle séquence d'acide nucléique ne comprend pas la séquence SEQ ID NO :55 ; à l'exclusion des séquences GENBANK n°AB033114 et n°AL096842 ; (b) des variants alléliques de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) ;
(c) des séquences complémentaires des séquences d'acide nucléique, telles que définies en (a) et en (b) et
(d) des séquences homologues issues de n'importe quel mammifère.
2°) Séquence d'ADNc selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO :9, une séquence correspondant aux positions 364-714 de la SEQ ID NO :9 et une séquence qui s'hybride en conditions stringentes avec la séquence SEQ ID NO :9 et ses fragments.
3°) Séquence selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ladite séquence présente l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :77 et SEQ ID NO :80 ou leurs séquences complémentaires. 4°) Segment d'acide nucléique génomique correspondant au gène hATIP codant pour une protéine hATIP, laquelle séquence est caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par :
(a) une séquence qui correspond à la concaténation des positions 12636 à 1 de la séquence Genbank n°AB020865 et des positions 100 000 à 688 de la séquence Genbank n°AB020864, laquelle séquence code au moins pour les protéines hATIPl, hATIP2, hATIP3, hATIP4, hATIP5 et hATIPό (SEQ ID NO :2, 4, 6, 8, 54, 78 et 81) et qui comprend au moins 17 exons codants, dont la lecture se fait sur le brin inverse complémentaire desdites séquences n°AB020865 et n° AB020864 ; à l'exclusion desdites séquences n°AB020865 et n°AB020864 ;
(b) des variants alléliques de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) ;
(c) des mutants de la séquence d'acide nucléique telle que définie en (a) ou en (b) qui comprennent au moins la substitution d'un nucléo- tide au niveau d'au moins l'un desdits exons ;
(d) des séquences complémentaires aux séquences d'acide nucléique, telles que définies en (a) et en (b) et
(e) des séquences homologues issues de n'importe quel mammifère. 5°) Fragment de la séquence génomique selon la revendication
4, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO :36-52 et les SEQ ID NO :56-72.
6°) Fragment de la séquence génomique selon la revendication 4 ou de l'ADNc selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend entre 15 pb et 1 000 pb.
7°) Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les fragments suivants : séquence SEQ ID NO :18-35.
8°) Réactif de détection, caractérisé en ce qu'il est constitué par au moins une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7.
9°) Vecteur d'expression d'une protéine hATIP, caractérisé en ce qu'il contient une séquence codant pour tout ou partie d'une protéine hATIP humaine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
10°) Cellule hôte eucaryote ou procaryote transformée par un vecteur selon la revendication 9. 11°) Utilisation d'une séquence nucléique choisie dans le groupe constitué par le réactif de détection nucléique selon la revendication 8, la séquence nucléique SEQ ID NO :53 codant pour hATIPl et les fragments d'au moins 15 pb de ladite séquence SEQ ID NO :53 pour l'évaluation, le pronostic et/ ou la détection d'un état précancéreux ou cancéreux.
12°) Protéine ATIP isolée et purifiée, caractérisée en ce qu'elle est codée par une séquence d'ADNc ou un transcrit ou un segment d'acide nucléique génomique, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
13°) Protéine hATIP isolée et purifiée, selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment commun à toutes les protéines hATIP, qui correspond à la région d'interaction avec le récepteur AT2, laquelle protéine ne comprend pas la séquence SEQ ID NO :13, spécifique de hATIPl, dans sa portion N-terminale.
14°) Protéine selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 78 et 81.
15°) Fragment d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 acides aminés. 16°) Fragment de protéine selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les séquences suivantes : SEQ ID NO :10 et 12-17.
17°) Anticorps, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre une protéine hATIP selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 ou un fragment de protéine hATIP selon l'une quelconque des revendications 15 et 16.
18°) Réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par au moins une protéine hATIP selon les revendications 12 à 14, au moins un fragment de protéine selon les revendica- tions 15 et 16 et au moins un anticorps selon la revendication 17. 19°) Utilisation d'une séquence protéinique choisie dans le groupe constitué par les séquences selon la revendication 18, la séquence SEQ ID NO :54, les fragments d'au moins 12 acides aminés de ladite séquence SEQ ID NO :54 et les anticorps dirigés contre ladite protéine de séquence SEQ ID NO :54 ou ses fragments pour l'évaluation, le pronostic et/ ou la détection d'un état précancéreux ou cancéreux.
20°) Procédé de détection d'une délétion, d'une insertion ou d'une substitution dans le gène hATIP, pour évaluer le risque de développer un état cancéreux, qui comprend : - l'obtention d'un échantillon d'acide nucléique, et
- la détection de la présence dans ledit échantillon d'acide nucléique d'une séquence d'acide nucléique codant pour un mutant hATIP, à l'aide d'au moins un réactif selon la revendication 8, et/ ou de la séquence nucléique SEQ ID NO :53 codant pour hATIPl et des fragments d'au moins 15 pb de ladite séquence SEQ ID NO :53.
21°) Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il inclut :
(a) la mise en contact dudit échantillon d'acide nucléique avec une paire d'amorces aptes à amplifier une région dudit gène hATIP contenant éventuellement une mutation et
(b) la détection de ladite mutation par séquençage de la séquence obtenue ou par mise en contact de ladite séquence obtenue avec au moins une enzyme de restriction appropriée et analyse des fragments obtenus par rapport à un échantillon contrôle normal. 22°) Procédé selon la revendication 20 ou la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend pour ladite détection :
. l'isolement, à partir de l'ADN génomique d'un patient, et de l'ADN génomique d'un sujet contrôle dont le gène hATIP ne comporte aucune mutation, d'une portion du gène hATIP codant pour une protéine hATIP qui inclut l'un ou l'autre des exons tels que définis ci-dessus (SEQ ID NO :36 à 52), et
. l'hybridation de la séquence génomique dudit patient et dudit sujet contrôle avec une sonde marquée spécifique de ladite portion de séquence du gène hATIP, puis . la détection directe des mésappariements et/ ou la mise en contact avec une enzyme de restriction appropriée et la séparation des fragments de restriction obtenus.
23°) Procédé de détection d'au moins une isoforme de hATIP à partir d'un échantillon biologique à l'aide d'anticorps selon la revendication 17 et/ ou les anticorps dirigés contre la protéine de séquence SEQ ID NO :54 ou ses fragments d'au moins 12 acides aminés.
24°) Méthode d'établissement du profil d'expression des ARNm hATIP d'un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend : - le prélèvement d'un échantillon
- l'extraction de l'ARNm
- soit la transcription inverse (RT) dudit ARNm et les amplifications successives on concomitantes des ADNc obtenus en présence d'amorces spécifiques de chaque isoforme de hATIP selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 et l'analyse des produits d'amplification obtenus par électrophorèse et/ ou hybridation spécifique de l'ARNm avec une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et
- l'établissement du profil de transcription hATIP dudit échantillon. 25°) Méthode d'établissement du profil d'expression des protéines hATIP d'un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- le prélèvement d'un échantillon,
- la mise en contact d'un lysat cellulaire extrait dudit échan- tillon avec des anticorps spécifiques des différentes isoformes de hATIP, tels que définis à la revendication 17 et
- l'établissement du profil d'expression des protéines hATIP dudit échantillon, par détection des complexes formés.
26°) Kits ou trousses pour la mise en œuvre des différentes méthodes selon l'une quelconque des revendications 20 à 25.
27°) Médicament anti-tumoral, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence nue selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou incluse dans un vecteur selon la revendication 9 ou une cellule hôte selon la revendication 10 ou tout ou partie d'une protéine hATIP selon les revendications 12 à 16.
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