FR2850572A1

FR2850572A1 - USE OF VERBASCOSIDE AS A STIMULATING AGENT FOR THE SYNTHESIS OF THERMAL SHOCK PROTEINS BY SKIN CELLS

Info

Publication number: FR2850572A1
Application number: FR0301204A
Authority: FR
Inventors: Yohan Rolland; Jean Renaud Robin
Original assignee: Laboratoires de Biologie Vegetale Yves Rocher SA
Current assignee: Laboratoires de Biologie Vegetale Yves Rocher SA
Priority date: 2003-02-03
Filing date: 2003-02-03
Publication date: 2004-08-06
Anticipated expiration: 2023-02-03
Also published as: FR2850572B1; WO2004069218A1

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation cosmétique d'un phényl propanoïde glycoside, le verbascoside, comme agent d'une part de stimulation de la synthèse des protéines de choc thermique, et d'autre d'inhibition de la collagénase et de l'élastase et de stimulation des hydroxylases, par les cellules de la peau.The present invention relates to the cosmetic use of a phenyl propanoid glycoside, the verbascoside, as an agent on the one hand for stimulating the synthesis of heat shock proteins, and on the other hand for inhibiting collagenase and l elastase and stimulation of hydroxylases, by skin cells.

Description

UTILISATION DU VERBASCOSIDE COMME AGENT STIMULANT LA SYNTHÈSE DE PROTÉINES DE CHOC THERMIQUE PAR LES CELLULES DE LA PEAU. USE OF VERBASCOSIDE AS A STIMULATING AGENT FOR THE SYNTHESIS OF THERMAL SHOCK PROTEINS BY SKIN CELLS.

La présente invention concerne le domaine des compositions cosmétiques pour lutter contre le vieillissement et les agressions de la peau. Plus particulièrement l'invention se rapporte à l'utilisation cosmétique d'un phényl propanoïde glycoside, le verbascoside, comme agent d'une part de stimulation de la synthèse des protéines de choc thermique, et d'autre part d'inhibition de la collagénase et de l'élastase et de stimulation des hydroxylases, par les cellules de la peau. The present invention relates to the field of cosmetic compositions for combating aging and aggressions of the skin. More particularly the invention relates to the cosmetic use of a phenyl propanoid glycoside, the verbascoside, as an agent on the one hand for stimulating the synthesis of heat shock proteins, and on the other hand for inhibiting collagenase and elastase and stimulation of hydroxylases, by skin cells.

On désigne par phényl propanoïde glycoside un groupe de produits naturels fréquemment présents dans les plantes de l'ordre des Tubiflorales. The term “phenylpropanoid glycoside” denotes a group of natural products frequently present in plants of the order Tubiflorales.

Les phényl propanoïde glycosides sont obtenus par la jonction de 3 unités de base : - un glucose central un groupement C6-C2, souvent il s'agit du dihydroxyphényl-p-éthanol lié à la fonction hémiacétale du glucose, - un groupement C6-C3, souvent il s'agit de l'acide hydroxycinnamique, en acyl sur une des fonctions OH restantes du glucose. The phenyl propanoid glycosides are obtained by joining 3 basic units: - a central glucose, a C6-C2 group, often it is dihydroxyphenyl-p-ethanol linked to the hemiacetal function of glucose, - a C6-C3 group , often it is hydroxycinnamic acid, acyl on one of the remaining OH functions of glucose.

L'unité aromatique peut être substituée différemment. The aromatic unit can be substituted differently.

L'acide hydroxycinnamique est alors remplacé par l'acide caféique par exemple, et d'autres saccharides sont souvent liés à 1 ou 2 des hydroxyles libres du glucose central. Hydroxycinnamic acid is then replaced by caffeic acid for example, and other saccharides are often linked to 1 or 2 of the free hydroxyls of central glucose.

Le premier phényl propanoïde glycoside extrait de Verbascum sinatum a été décrit en 1963, sous le nom de verbascoside. Sa structure complète a été élucidée en 1968, The first phenylpropanoid glycoside extracted from Verbascum sinatum was described in 1963 under the name of verbascoside. Its complete structure was elucidated in 1968,

sous le nom actéoside. La similitude entre ces deux entités est maintenant établie, et l'on utilisera dans le cadre de la présente invention l'appellation originale de verbascoside. under the name actéoside. The similarity between these two entities is now established, and we will use in the context of the present invention the original designation of verbascoside.

Le verbascoside, dont la formule est représentée cidessous, présente un résidu rhamnose sur le carbone 3 du glucose. Son nom chimique complet est alors ~-(3',4'- dihydroxyphenyl)ethyl-O-[alpha]-L-rhamnopyranosyl-(1#3)- -D-(4- 0-caffeoyl)-glucopyranoside :

Verbascoside, whose formula is shown below, has a rhamnose residue on the carbon 3 of glucose. Its full chemical name is then ~ - (3 ', 4'- dihydroxyphenyl) ethyl-O- [alpha] -L-rhamnopyranosyl- (1 # 3) - -D- (4- 0-caffeoyl) -glucopyranoside:

Verbascoside = actéoside R1=R3=H ; R2=Rha
Les phényl propanoïde glycosides sont présentés par Khalil Taoubi (1992, thèse de doctorat, Institut National Polytechnique de Toulouse) comme des esters hétérosidiques de l'acide caféique (EHAC). Ces molécules sont étudiées dans les genres de la famille des Verbenaceae. Verbascoside = actoside R1 = R3 = H; R2 = Rha
Phenylpropanoid glycosides are presented by Khalil Taoubi (1992, doctoral thesis, Institut National Polytechnique de Toulouse) as heteroside esters of caffeic acid (EHAC). These molecules are studied in the genera of the Verbenaceae family.

La distribution chimiotaxonomique du verbascoside est beaucoup plus large, essentiellement dans l'ordre des Tubifloreae dans presque toutes les familles, par exemple : Acanthaceae (Acanthus sp, Crossandra sp.), Asteraceae (Echinacea sp.), Bignoniaceae (Campsis sp., Paulownia sp.), Buddlejaceae (Buddleja sp. ), Gesneriaceae (Conandron sp.), Lamiaceae (Ajuga sp., Leucoseptrum sp., Stachys sp.), Oleaceae (Forsythia sp., Fraxinus sp., Syringa sp.), Orobanchaceae (Cistanche sp., Orobanche sp.), Pedaliaceae (Harpagophytum sp., Sesamum sp. ), Plantaginaceae (Plantago The chemotaxonomic distribution of verbascoside is much wider, essentially in the order of Tubifloreae in almost all families, for example: Acanthaceae (Acanthus sp, Crossandra sp.), Asteraceae (Echinacea sp.), Bignoniaceae (Campsis sp., Paulownia sp.), Buddlejaceae (Buddleja sp.), Gesneriaceae (Conandron sp.), Lamiaceae (Ajuga sp., Leucoseptrum sp., Stachys sp.), Oleaceae (Forsythia sp., Fraxinus sp., Syringa sp.), Orobanchaceae ( Cistanche sp., Orobanche sp.), Pedaliaceae (Harpagophytum sp., Sesamum sp.), Plantaginaceae (Plantago

sp.), Scrophulariaceae (Calceolaria sp., Pedicularis sp. sp.), Scrophulariaceae (Calceolaria sp., Pedicularis sp.

Rhemannia sp., Scrophularia sp., Verbascum sp.), Verbenaceae (Clerodendron sp., Lantana sp., Lippia sp., Verbena sp.). Rhemannia sp., Scrophularia sp., Verbascum sp.), Verbenaceae (Clerodendron sp., Lantana sp., Lippia sp., Verbena sp.).

Les phényl propanoïde glycosides sont connus dans l'art antérieur pour présenter des activités thérapeutiques dans des applications anti-fongiques, anti-bactériennes, anti-virales, analgésiques. La thèse de Khalil Taoubi cidessus mentionnée étudie le rôle du verbascoside sur l'inhibition de la protéine kinase C. Cette enzyme est impliquée dans les mécanismes de transmissions de signaux cellulaires, et les inhibiteurs de PKC possèdent une puissante activité anti-mitotique, permettant de lutter contre la prolifération tumorale, l'angiogenèse tumorale, l'athérosclérose. Phenylpropanoid glycosides are known in the prior art to exhibit therapeutic activities in anti-fungal, anti-bacterial, anti-viral, analgesic applications. The thesis of Khalil Taoubi above mentioned studies the role of verbascoside on the inhibition of protein kinase C. This enzyme is involved in the mechanisms of cellular signal transmissions, and PKC inhibitors have a powerful anti-mitotic activity, allowing fight against tumor proliferation, tumor angiogenesis, atherosclerosis.

Plus récemment, des propriétés du verbascoside ont été mises en évidence pour traiter des problèmes dermatologiques. Le brevet US 6171593 décrit l'utilisation de molène (V. thapsus) pour le traitement des désordres cutanés : kératoses actiniques, kératoses séborrhéiques, prurigo, psoriasis, dermatites de contact. More recently, properties of verbascoside have been demonstrated to treat dermatological problems. US Pat. No. 6,171,593 describes the use of mullein (V. thapsus) for the treatment of skin disorders: actinic keratoses, seborrheic keratoses, prurigo, psoriasis, contact dermatitis.

Dans le domaine cosmétique, le brevet japonais JP 11171723 concerne l'application d'un extrait de Verbascum thapsus comme agent anti-oxydant pour lutter contre l'oxydation des lipides de la peau et donc son vieillissement. In the cosmetic field, Japanese patent JP 11171723 relates to the application of an extract of Verbascum thapsus as an antioxidant agent to combat the oxidation of the lipids of the skin and therefore its aging.

Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont maintenant permis à la Demanderesse de mettre en évidence des propriétés surprenantes du verbascoside, permettant de l'utiliser dans le domaine de la cosmétique notamment pour lutter contre le vieillissement de la peau. L'invention concerne tout The research carried out in the context of the invention has now enabled the Applicant to highlight surprising properties of verbascoside, making it possible to use it in the field of cosmetics, in particular for combating aging of the skin. The invention relates to everything

particulièrement l'utilisation d'un phényl propanoïde glycoside, comme le verbascoside, pour la fabrication d'une composition cosmétique ou dermatologique pour lutter contre la diminution de l'intégrité du derme et aussi contre les agressions de la peau par l'environnement, comme la température, la pollution, les UV, etc. particularly the use of a phenyl propanoid glycoside, such as the verbascoside, for the manufacture of a cosmetic or dermatological composition to fight against the reduction of the integrity of the dermis and also against the aggressions of the skin by the environment, such as temperature, pollution, UV, etc.

Tout spécialement, la Demanderesse a maintenant montré que le verbascoside était capable de stimuler la synthèse de protéines de choc thermique, et plus particulièrement des HSP 70, par les cellules de la peau et ainsi d'agir efficacement contre les agressions de cellesci par l'environnement. In particular, the Applicant has now shown that verbascoside is capable of stimulating the synthesis of heat shock proteins, and more particularly of HSP 70, by the skin cells and thus of acting effectively against the aggressions of these by the environment.

Les HSPs représentent une famille de protéines hautement conservées, naturellement présentes dans toutes les cellules des organismes vivants (hommes, animaux, plantes, bactéries). Elles sont synthétisées en réponse à une augmentation de température (d'où le nom premier de Heat Shock proteins (HSPs)) mais également en réponse à d'autres stress promoteurs de dénaturation protéique comme les métaux lourds (cadmium), l'éthanol, les analogues d'acides aminés ou les poisons métaboliques (TBT : tributyltin). HSPs represent a family of highly conserved proteins, naturally present in all cells of living organisms (humans, animals, plants, bacteria). They are synthesized in response to an increase in temperature (hence the first name of Heat Shock proteins (HSPs)) but also in response to other stress promoters of protein denaturation such as heavy metals (cadmium), ethanol, amino acid analogs or metabolic poisons (TBT: tributyltin).

D'une façon générale, les HSP reconnaîtraient des régions hydrophobes normalement enfouies au sein de la protéine, mais qui deviennent accessibles dans le cas de protéines encore non repliées ou dénaturées. Les HSP sont capables de contrôler le repliement des autres protéines, ce qu'on appelle une fonction de chaperon, dans des conditions normales, en l'absence de tout facteur de stress. Après exposition à un facteur de stress, les HSP préviennent ou corrigent la dénaturation et l'agrégation des protéines. Si la protéine est très dénaturée, l'action de chaperon peut laisser place à une action de protéase : In general, HSPs would recognize hydrophobic regions normally buried within the protein, but which become accessible in the case of proteins that are not yet folded or denatured. HSPs are able to control the folding of other proteins, called chaperone function, under normal conditions, in the absence of any stressor. After exposure to a stressor, HSPs prevent or correct the denaturation and aggregation of proteins. If the protein is very denatured, the chaperone action may give way to a protease action:

lorsque la protéine est irréparable, elle est dégradée et éliminée. when the protein is irreparable, it is degraded and eliminated.

Etant donné que l'organisme humain est un système ouvert, il est obligé d'interagir avec son environnement. Chaque interaction se somme par une rupture de l'homéostasie cellulaire (ou stress), par une recherche d'un nouvel équilibre et par une réponse adaptative générale. Since the human organism is an open system, it is forced to interact with its environment. Each interaction is summed up by a breakdown in cellular homeostasis (or stress), by a search for a new balance and by a general adaptive response.

Lors du vieillissement, la réponse adaptative au stress est fortement altérée. Chez les cellules âgées, l'expression de base ainsi que l'induction des HSP sont moins efficaces que chez les cellules jeunes. During aging, the adaptive response to stress is greatly altered. In old cells, basic expression and induction of HSP are less effective than in young cells.

Près de trente HSP ont été découvertes au cours de ces dernières années. Ces protéines sont classées en fonction de leur poids moléculaire. On distingue ainsi quatre familles : les HSP 90, les HSP 70, les HSP 60, et les petites HSP. Ainsi, dans la famille des HSP 70, on trouvera des HSP de poids moléculaire proche de 70 kDa. Nearly thirty HSPs have been discovered in recent years. These proteins are classified according to their molecular weight. There are thus four families: the HSP 90, the HSP 70, the HSP 60, and the small HSPs. Thus, in the HSP 70 family, HSPs of molecular weight close to 70 kDa will be found.

Schématiquement, on peut regrouper les HSP en 2 familles : les HSP constitutives et les HSP inductibles . Les HSP constitutives sont responsables de la conformation des protéines nouvellement synthétisées, du transport des protéines et de l'activation de leur fonction. La synthèse des HSP constitutive évolue avec l'âge, et de manière générale, tend vers une diminution dans les tissus. On note ici un intérêt à stimuler l'expression de base des HSP constitutives afin de lutter contre une évolution négative (voir résultat de l'induction des HSP 70 par le verbascoside sur les cellules en absence de stress). Schematically, we can group HSPs into 2 families: constitutive HSPs and inducible HSPs. The constituent HSPs are responsible for the conformation of newly synthesized proteins, the transport of proteins and the activation of their function. The synthesis of constitutive HSP evolves with age, and generally tends to decrease in the tissues. There is an interest here in stimulating the basic expression of the constitutive HSPs in order to combat a negative development (see result of the induction of HSPs 70 by the verbascoside on cells in the absence of stress).

Les HSP inductibles, comme leur nom l'indique, voient leur taux s'accroître après un stress. Cependant, avec l'âge, on peut constater que le temps de réponse à un stress augmente. Inducible HSPs, as their name suggests, see their rate increase after stress. However, with age, it can be seen that the response time to stress increases.

Les HSP ont quatre rôles principaux : - dès la sortie du ribosomes, elles assurent le bon repliement de la protéine en structure fonctionnelle - elles "corrigent" les protéines qui, pour une raison ou une autre (mutation, dénaturation) ont subi des dégradations - elles assistent les protéines migrant vers un autre compartiment en maintenant leur structure déroulée sans altération, le temps du passage à travers la membrane - elles assurent l'élimination des protéines dont les erreurs sont irréversibles (actions de protéases ou chaperons vers les organites de dégradation). HSPs have four main roles: - as soon as they leave the ribosomes, they ensure the proper folding of the protein into a functional structure - they "correct" proteins which, for one reason or another (mutation, denaturation) have undergone degradation - they assist the proteins migrating to another compartment while maintaining their unrolled structure without alteration, the time of passage through the membrane - they ensure the elimination of proteins whose errors are irreversible (actions of proteases or chaperones towards the organelles of degradation) .

Les protéines de choc thermique les plus étudiées sont HSC70 et HSP 70. The most studied heat shock proteins are HSC70 and HSP 70.

HSC70 représente la protéine constitutive de poids moléculaire voisin de 70 kDa. HSP 70 est la protéine inductible. HSP 70 s'exprime à un faible niveau dans les cellules non stressées. L'accroissement de l'expression HSP 70 peut être considéré comme un moyen de l'accroissement de la lutte contre la pollution environnementale. HSC70 represents the constituent protein with a molecular weight close to 70 kDa. HSP 70 is the inducible protein. HSP 70 is expressed at a low level in non-stressed cells. Increasing the expression HSP 70 can be seen as a means of increasing the fight against environmental pollution.

Ainsi, l'invention se rapporte à l'utilisation cosmétique d'un phényl propanoïde glycoside, plus particulièrement du verbascoside, comme agent stimulant la synthèse d'une protéine de choc thermique, plus particulièrement HSP 70,par les cellules de la peau, ledit agent étant incorporé dans une composition cosmétique comprenant un ou plusieurs excipients acceptables. Thus, the invention relates to the cosmetic use of a phenyl propanoid glycoside, more particularly of verbascoside, as an agent stimulating the synthesis of a heat shock protein, more particularly HSP 70, by skin cells, said agent being incorporated into a cosmetic composition comprising one or more acceptable excipients.

Les travaux réalisés dans le cadre de l'invention ont également permis à la Demanderesse de mettre en évidence des propriétés intéressantes du verbascoside pour lutter contre le vieillissement de la peau lié à la dégradation du maintien du derme. The work carried out within the framework of the invention has also enabled the Applicant to highlight advantageous properties of verbascoside for combating the aging of the skin linked to the deterioration of the maintenance of the dermis.

Le vieillissement du derme est l'altération qui provoque les modifications les plus visibles de la peau. Il dépend de deux types de mécanismes, le premier étant la réduction de la masse de macromolécules qui composent le tissu conjonctif et le second une modification de l'organisation architecturale des polymères qui assurent les propriétés mécaniques du derme. La quantité de macromolécules constitutives du conjonctif (collagènes, élastines) est la résultante des synthèses protéiques de néoformation de ces molécules et la dégradation de ces polymères par des enzymes spécifiques, les collagénases et élastases. Au cours du vieillissement de la peau, l'équilibre se modifie, les synthèses ralentissent au profit de l'augmentation des dégradations. Aging of the dermis is the alteration that causes the most visible changes in the skin. It depends on two types of mechanisms, the first being the reduction in the mass of macromolecules that make up the connective tissue and the second a change in the architectural organization of the polymers that ensure the mechanical properties of the dermis. The amount of macromolecules constituting the connective (collagens, elastins) is the result of protein syntheses of neoformation of these molecules and the degradation of these polymers by specific enzymes, collagenases and elastases. During the aging of the skin, the balance changes, syntheses slow down in favor of the increase in degradations.

La Demanderesse a maintenant montré que le verbascoside pouvait s'opposer à ces phénomènes, et donc lutter contre la dégradation du derme, donc au vieillissement de la peau. The Applicant has now shown that the verbascoside could oppose these phenomena, and therefore fight against the degradation of the dermis, therefore the aging of the skin.

Un des effets recherchés est de lutter contre les enzymes de dégradation des fibres de soutien du derme, mais aussi de stimuler la maturation du collagène par les fibroblastes, afin d'augmenter la quantité de macromolécules dans le tissu conjonctif. One of the desired effects is to fight against the enzymes which degrade the support fibers of the dermis, but also to stimulate the maturation of collagen by fibroblasts, in order to increase the quantity of macromolecules in the connective tissue.

Il a ainsi été mis en évidence l'efficacité du verbascoside à inhiber une collagénase par un modèle in vitro. L'activité de la collagénase est déterminée par hydrolyse d'un substrat spécifique et hydrosoluble, représentatif du collagène, naturellement insoluble. Le substrat est scindé en deux parties, libérant un résidu dont on suit la cinétique d'absorption à 320 nm. It has thus been demonstrated the effectiveness of verbascoside in inhibiting collagenase by an in vitro model. The activity of collagenase is determined by hydrolysis of a specific and water-soluble substrate, representative of collagen, which is naturally insoluble. The substrate is split into two parts, releasing a residue, the absorption kinetics of which are monitored at 320 nm.

L'expérimentation est validée par l'utilisation d'un témoin de référence. The experiment is validated by the use of a reference witness.

L'utilisation du verbascoside dans le milieu réactionnel diminue efficacement l'activité de la The use of verbascoside in the reaction medium effectively reduces the activity of

collagénase, préservant alors le substrat représentatif de la quantité de collagène ainsi protégé. collagenase, thus preserving the substrate representative of the amount of collagen thus protected.

De la même façon, la Demanderesse a étudié la capacité du verbascoside à inhiber l'activité de l'élastase sur un modèle in vitro. L'activité de l'élastase est déterminée sur un substrat spécifique et hydrosoluble. Le substrat réagit avec l'enzyme pour libérer le p. Nitroalinine qui absorbe à 386 nm. L'activité de l'enzyme est définie par rapport à la pente de la cinétique de libération du p. Nitroalinine. Similarly, the Applicant has studied the ability of verbascoside to inhibit the activity of elastase in an in vitro model. The activity of the elastase is determined on a specific and water-soluble substrate. The substrate reacts with the enzyme to release the p. Nitroalinine which absorbs at 386 nm. The activity of the enzyme is defined relative to the slope of the release kinetics of p. Nitroalinine.

L'utilisation du verbascoside dans le milieu réactionnel diminue de façon très importante la pente de la cinétique d'apparition du marqueur, témoin d'une efficacité mesurée d'inhibition de l'activité de l'enzyme. The use of verbascoside in the reaction medium considerably reduces the slope of the kinetics of appearance of the marker, witnessing a measured efficiency of inhibition of the activity of the enzyme.

Un autre effet recherché est d'assurer la bonne qualité du collagène néoformé, de façon à rétablir une organisation architecturale satisfaisante. On peut rechercher la capacité du verbascoside à augmenter la maturation du collagène en étudiant la matrice extracellulaire produite par des fibroblastes en cultures monocouches exposés au verbascoside. Another desired effect is to ensure the good quality of the newly formed collagen, so as to restore a satisfactory architectural organization. The ability of the verbascoside to increase the maturation of collagen can be investigated by studying the extracellular matrix produced by fibroblasts in monolayer cultures exposed to the verbascoside.

Enfin, il est connu que le collagène subit des étapes de maturation au moment de sa synthèse puis de sa sécrétion dans le milieu extracellulaire, puis lors de son assemblage en triple hélice. Une de ces maturations est l'hydroxylation des résidus proline et lysine par des enzymes cellulaires, respectivement prolyl hydroxylase et lysyl hydroxylase. La vitamine C (acide ascorbique) joue ici un rôle fondamental en dégradant le complexe Fe3±Oformé lors des réactions, qui inhibe les hydroxylases. Finally, it is known that collagen undergoes maturation stages at the time of its synthesis then of its secretion in the extracellular medium, then during its assembly in triple helix. One of these maturations is the hydroxylation of the proline and lysine residues by cellular enzymes, respectively prolyl hydroxylase and lysyl hydroxylase. Vitamin C (ascorbic acid) plays a fundamental role here by degrading the Fe3 ± Oformed complex during reactions, which inhibits hydroxylases.

L'invention concerne aussi l'utilisation du verbascoside sur cette étape de maturation, de façon à obtenir une propriété efficace sur la qualité du collagène synthétisé dans le derme. The invention also relates to the use of verbascoside on this maturation step, so as to obtain an effective property on the quality of the collagen synthesized in the dermis.

Au vu de tous ces résultats, activité anticollagénase et activité anti-élastase démontrées, activité de stimulation de la synthèse du collagène et activité de maturation du collagène, l'invention propose d'utiliser le verbascoside pour lutter contre la diminution de la quantité et de la qualité des fibres de soutien du tissu conjonctif. In view of all these results, anti-collagenase activity and anti-elastase activity demonstrated, activity of stimulating collagen synthesis and activity of collagen maturation, the invention proposes to use verbascoside to combat the decrease in the quantity and the quality of the connective tissue support fibers.

Ainsi, l'invention se rapporte à l'utilisation d'un phényl propanoïde glycoside, plus particulièrement du verbascoside, comme agent inhibant la collagénase et l'élastase et stimulant la maturation du collagène par une action sur les hydroxylase pour la préparation d'une composition cosmétique ou dermatologique destinée à lutter contre la diminution de l'intégrité du derme liée à la dégradation des fibres de soutien de la peau que sont le collagène et l'élastine. Thus, the invention relates to the use of a phenyl propanoid glycoside, more particularly of verbascoside, as an agent inhibiting collagenase and elastase and stimulating the maturation of collagen by an action on hydroxylase for the preparation of a cosmetic or dermatological composition intended to combat the decrease in the integrity of the dermis linked to the degradation of the skin's support fibers, which are collagen and elastin.

Le phényl propanoïde glycoside, plus particulièrement le verbascoside, utilisé dans le cadre de l'invention peut être sous forme de molécule pure, obtenu par synthèse chimique, par synthèse enzymatique, ou obtenu par extraction et purification à partir de plantes fraîches ou séchées. Selon une forme de réalisation avantageuse de l'invention, il peut aussi s'agir d'un extrait de plante riche en phényl propanoïde glycoside, plus particulièrement en verbascoside. Un tel extrait de matériel végétal présente une concentration en phényl propanoïde glycoside, plus particulièrement en verbascoside comprise entre environ 0,01 à 75 %, préférentiellement entre 0,1 et 50 %. The phenylpropanoid glycoside, more particularly the verbascoside, used in the context of the invention can be in the form of a pure molecule, obtained by chemical synthesis, by enzymatic synthesis, or obtained by extraction and purification from fresh or dried plants. According to an advantageous embodiment of the invention, it can also be a plant extract rich in phenyl propanoid glycoside, more particularly in verbascoside. Such an extract of plant material has a concentration of phenylpropanoid glycoside, more particularly of verbascoside of between approximately 0.01 to 75%, preferably between 0.1 and 50%.

Dans tous les cas, il peut être utilisé en tant que molécule libre, ou encapsulé, vectorisé, greffé, en vue par exemple d'améliorer sa stabilité ou sa solubilité, ou encore de diminuer l'impact couleur lié à son utilisation. In all cases, it can be used as a free molecule, or encapsulated, vectorized, grafted, in order for example to improve its stability or its solubility, or even to reduce the color impact linked to its use.

Dans le cas d'une extraction plus ou moins poussée à partir de plantes, les organes utilisés peuvent être les racines et/ou les feuilles et/ou les sommités fleuries ou la plante entière. On peut également obtenir le verbascoside à partir de cellules végétales en cultures in vitro, en suspension ou en cals. In the case of more or less extensive extraction from plants, the organs used can be the roots and / or the leaves and / or flowering tops or the whole plant. Verbascoside can also be obtained from plant cells in in vitro cultures, in suspension or in callus.

Les plantes utilisées pour l'obtention de phényl propanoïde glycoside, plus particulièrement de verbascoside sont choisies préférentiellement, sans que ce soit limitant, parmi l'ordre des Tubiflorales. The plants used to obtain phenyl propanoid glycoside, more particularly verbascoside are preferably chosen, without being limiting, from the order of Tubiflorales.

Plus précisément, on choisira des plantes disponibles à grande échelle pour répondre aux besoins industriels, parmi les genres Verbascum, Plantago, Verbena, Lippia, Fraxinus. More specifically, we will choose plants available on a large scale to meet industrial needs, from the genera Verbascum, Plantago, Verbena, Lippia, Fraxinus.

Le principal représentant du genre Verbascum est le bouillon blanc. Sous le nom bouillon blanc, on entend deux espèces officinales qui sont V. densiflorum Bertol. (syn V. thapsiforme Schrod.) et V. phlomoïdes (de la famille des Scrophulariaceae). On peut également citer la molène (V. thapsus). The main representative of the genus Verbascum is white broth. Under the name white broth, we mean two officinal species which are V. densiflorum Bertol. (syn V. thapsiforme Schrod.) and V. phlomoïdes (from the Scrophulariaceae family). We can also cite mullein (V. thapsus).

Dans le genre Plantago, 3 espèces de plantains peuvent être utilisées : P. major L., P. media L., P. lanceolata L. (famille des Plantaginaceae). On utilise la plante entière ou les feuilles. La teneur en verbascoside est d'environ 0. 2 à 4 %. In the genus Plantago, 3 plantain species can be used: P. major L., P. media L., P. lanceolata L. (family of Plantaginaceae). We use the whole plant or the leaves. The verbascoside content is approximately 0.2 to 4%.

Chez les Verbenaceae, la verveine odorante (Lippia citriodora = Aloysia tryphilla) et la verveine officinale (Verbena officinalis) sont utilisables. Toutes les parties de la plante contiennent du verbascoside, à une teneur moyenne d'environ 5 %. In Verbenaceae, verbena (Lippia citriodora = Aloysia tryphilla) and verbena (Verbena officinalis) can be used. All parts of the plant contain verbascoside, with an average content of around 5%.

Pour le frêne (Fraxinus ornus et F. excelsior famille des Oleaceae), l'écorce et les feuilles contiennent du verbascoside. Même si le verbascoside selon la présente invention peut provenir de ces deux parties de la plante, For ash (Fraxinus ornus and F. excelsior family of Oleaceae), the bark and leaves contain verbascoside. Even if the verbascoside according to the present invention can come from these two parts of the plant,

on choisira préférentiellement les feuilles, ressources renouvelables et plus écologiques, qui ont une teneur moyenne de 4 % de verbascoside. we preferentially choose leaves, renewable and more ecological resources, which have an average content of 4% of verbascoside.

L'extraction des phényl propanoïde glycosides, et en particulier du verbascoside, se fait à partir de plantes, usuellement à l'aide de solvants organiques (méthanol, et dans une moindre mesure, éthanol ou acétate d'éthyle), suivit d'une dissolution de l'extrait brut dans l'eau, éventuellement chaude, et lavage par des solvants organiques. Une étape facultative, mais qui améliore le procédé, consiste à traiter la fraction soluble dans l'eau, soit en la lyophilisant, soit en l'extrayant par du butanol, avant chromatographie. L'utilisation de gel de silice et de chloroforme - méthanol ou chloroforme méthanol - eau est très fréquente. Des méthodes douces (Sephadex LH-20 - Amersham Biosciences) qui séparent les composés glycosidiques et non glycosidiques sont recommandées. Phenylpropanoid glycosides, and in particular verbascoside, are extracted from plants, usually using organic solvents (methanol, and to a lesser extent, ethanol or ethyl acetate), followed by dissolution of the crude extract in water, possibly hot, and washing with organic solvents. An optional step, but which improves the process, consists in treating the water-soluble fraction, either by freeze-drying it, or by extracting it with butanol, before chromatography. The use of silica gel and chloroform - methanol or chloroform methanol - water is very common. Gentle methods (Sephadex LH-20 - Amersham Biosciences) that separate glycosidic and non-glycosidic compounds are recommended.

Selon le degré de pureté désiré, on peut juste reprendre l'extrait méthanolique remis à sec dans un solvant glycol-eau adapté, ou enchaîner les étapes de purification jusqu'à obtenir la molécule pure, ou réaliser toute préparation qui conduit à une pureté intermédiaire. Depending on the desired degree of purity, one can just take up the methanolic extract put back to dryness in a suitable glycol-water solvent, or chain the purification steps until obtaining the pure molecule, or carry out any preparation which leads to an intermediate purity .

Par exemple, selon un mode de réalisation particulier, on obtient le verbascoside purifié par : - broyage du végétal séché (pour les verveines, on peut avantageusement enlever l'huile essentielle par lavage à l'éther de pétrole avant extraction) et extraction sous agitation avec du méthanol ou du méthanol - eau (80-20), à température ambiante ou à chaud à reflux ; - concentration de la solution alcoolique obtenue, sous vide, et ajout d'eau. For example, according to a particular embodiment, the purified verbascoside is obtained by: - grinding the dried plant (for verbena, it is advantageous to remove the essential oil by washing with petroleum ether before extraction) and extraction with stirring with methanol or methanol - water (80-20), at room temperature or under reflux heat; - Concentration of the alcoholic solution obtained, under vacuum, and addition of water.

Le lavage peut être réalisé de 2 façons : Washing can be done in 2 ways:

- Lavage à l'acétate d' éthyle et remise à sec de la fraction ainsi extraite. Cette fraction est alors chromatographiée en phase inverse et éluée avec un gradient d'éthanol 0 à 10 %. On obtient une fraction contenant le verbascoside pur, qui peut être remise à sec. - Washing with ethyl acetate and putting the fraction thus extracted to dryness. This fraction is then chromatographed in reverse phase and eluted with a 0 to 10% ethanol gradient. A fraction containing the pure verbascoside is obtained, which can be put back to dryness.

- Lavage au n-butanol - acétate d'éthyle (5:1) et remise à sec. La chromatographie est alors réalisée sur Sephadex LH-20, avec un gradient 0-20 % d'éthanol dans l'eau. On obtient une fraction contenant le verbascoside pur, qui peut être remise à sec. - Wash with n-butanol - ethyl acetate (5: 1) and put back to dryness. Chromatography is then carried out on Sephadex LH-20, with a 0-20% gradient of ethanol in water. A fraction containing the pure verbascoside is obtained, which can be put back to dryness.

Par exemple, un procédé de préparation particulier comprend les étapes suivantes : - broyage du végétal séché (pour verveines, on peut avantageusement enlever l'huile essentielle par lavage à l'éther de pétrole avant extraction) et extraction sous agitation avec du méthanol ou du méthanol - eau (80-20), à température ambiante ou à chaud à reflux ; - concentration de la solution alcoolique obtenue, sous vide, et reprise dans l'eau ; - extraction à l'acétate d'éthyle, puis extraction au n-butanol qui est concentré sous vide ; - une première chromatographie est réalisée sur silice, éluée par un mélange chloroforme - méthanol - eau (6: 4:1) ; une seconde chromatographie est réalisée sur silice, éluée par un mélange chloroforme - méthanol - eau (7:3:0.5) ; - puis le passage sur Sephadex LH-20 avec un solvant méthanol-eau (1:1) conduit à une fraction contenant le verbascoside pur. For example, a particular preparation process comprises the following stages: grinding the dried plant (for verbena, it is advantageous to remove the essential oil by washing with petroleum ether before extraction) and extraction with stirring with methanol or methanol - water (80-20), at room temperature or under reflux hot; - Concentration of the alcoholic solution obtained, under vacuum, and taken up in water; - Extraction with ethyl acetate, then extraction with n-butanol which is concentrated under vacuum; - a first chromatography is carried out on silica, eluted with a chloroform - methanol - water mixture (6: 4: 1); a second chromatography is carried out on silica, eluted with a chloroform - methanol - water mixture (7: 3: 0.5); - then passage over Sephadex LH-20 with a methanol-water solvent (1: 1) leads to a fraction containing the pure verbascoside.

De manière avantageuse, le phényl propanoïde glycoside, plus particulièrement le verbascoside est présent dans une composition cosmétique selon l'invention à Advantageously, the phenyl propanoid glycoside, more particularly the verbascoside is present in a cosmetic composition according to the invention to

une concentration de l'ordre de 0,01 à 5 %, de préférence de 0,05 à 2%, en poids de la composition. a concentration of the order of 0.01 to 5%, preferably 0.05 to 2%, by weight of the composition.

Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes et formulations connues de l'homme du métier. The compositions according to the invention can be in any form and formulation known to a person skilled in the art.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent se rapportant aux propriétés du verbascoside et aux caractéristiques de compositions le contenant. Other advantages and characteristics of the invention will appear from the following examples relating to the properties of verbascoside and to the characteristics of compositions containing it.

Exemple 1 : Induction des HSP par le verbascoside. Example 1: Induction of HSP by verbascoside.

Cette étude a permis de mettre en évidence l'effet du verbascoside sur l'induction des gènes de stress in vitro. This study highlighted the effect of verbascoside on the induction of stress genes in vitro.

Les tests ont été réalisés sur des cellules en cultures : fibroblastes humains IMR90 jeunes et âgés. The tests were carried out on cells in cultures: young and old IMR90 human fibroblasts.

Les études montrant les effets du vieillissement sur l'expression de la HSP 70 dans les fibroblastes ont principalement été réalisés sur des fibroblastes pulmonaires humains vieillis in vitro : les IMR90, les WI38 et les MRC5. Studies showing the effects of aging on the expression of HSP 70 in fibroblasts have mainly been carried out on human pulmonary fibroblasts aged in vitro: IMR90, WI38 and MRC5.

Des travaux de Conrad et al. (Exp Cell Re, 1998. Work by Conrad et al. (Exp Cell Re, 1998.

241(2):p.404-413) ont permis de valider le modèle IMR90, en observant des effets similaires du vieillissement sur la HSP70 (diminution de l'ARN et de la protéine) dans les IMR90 vieillis in-vitro et sur des fibroblastes de peau de sujets jeunes et âgés. 241 (2): p.404-413) made it possible to validate the IMR90 model, by observing similar effects of aging on HSP70 (reduction of RNA and protein) in IMR90 aged in vitro and on skin fibroblasts of young and old subjects.

A partir de cellules jeunes ou âgées, en présence ou non de stress (métaux lourds et thermiques), on mesure l'induction de l'ARNm de la HSP70 par le verbascoside présent dans le milieu de culture. Après traitement pour créer le stress et incubation, les cellules sont lysées et les ARNm analysés par Northern blot. From young or old cells, with or without the presence of stress (heavy and thermal metals), the induction of HSP70 mRNA by the verbascoside present in the culture medium is measured. After treatment to create stress and incubation, the cells are lysed and the mRNAs analyzed by Northern blot.

L'observation des cellules en absence de stress montre que le traitement au verbascoside induit légèrement l'ARNm de la HSP70, autant pour les expositions courtes (6 h) que les expositions longues (3 fois en 7 jours). Observation of cells in the absence of stress shows that the treatment with verbascoside slightly induces the mRNA of HSP70, as much for short exposures (6 h) as long exposures (3 times in 7 days).

Cette propriété, de faible intensité dans ces conditions, permet de placer la cellule dans un environnement à teneur cytosolique légèrement plus élevée en HSP, et donc de protéger les cellules en prévention d'un éventuel stress. This property, of low intensity under these conditions, makes it possible to place the cell in an environment with a slightly higher cytosolic content in HSP, and therefore to protect the cells in prevention of possible stress.

Lorsqu'on applique un stress à l'aide de cadmium sur les cellules en cultures, on observe qu'en présence de verbascoside, les ARNm de HSP70 sont augmentés de façon très importante, dans les cellules jeunes et âgées. Le verbascoside permet donc de lutter contre le stress environnemental généré par les métaux lourds. When stress is applied with the aid of cadmium to cells in cultures, it is observed that in the presence of verbascoside, the mRNAs of HSP70 are increased very significantly, in young and old cells. Verbascoside therefore helps to combat the environmental stress generated by heavy metals.

En présence d'un choc thermique, le verbascoside induit également l'ARNm de la HSP70, spécifiquement dans les cellules jeunes. In the presence of a thermal shock, the verbascoside also induces the HSP70 mRNA, specifically in young cells.

Afin de vérifier l'induction des HSP 70 par le verbascoside sur des cellules soumises à un stress ou non, on ensemence des cellules (âgées ou jeunes) dans des flasques avec du milieu MEM complet + 5% de SVF, cultivées jusqu'à 50% de confluence. La veille de la stimulation, le milieu est remplacé par du MEM + 2% de SVF, puis à nouveau remplacé par du milieu comportant 1% de SVF pour l'expérimentation. In order to verify the induction of HSP 70 by the verbascoside on cells subjected to stress or not, cells (old or young) are seeded in flasks with complete MEM medium + 5% FCS, cultured up to 50 % of confluence. The day before stimulation, the medium is replaced by MEM + 2% of FCS, then again replaced by medium comprising 1% of FCS for the experimentation.

Le stress aux métaux lourds est réalisé avec du cadmium à 10 M. Les cellules sont incubées pendant 6 h à 37 C, puis lysées. Stress with heavy metals is carried out with cadmium at 10 M. The cells are incubated for 6 h at 37 ° C., then lysed.

Les ARN sont extraits par un mélange phénol/chloroforme, puis analysés par Northern Blot. Après migration sur gel d'agarose, les ARN sont transférés sur une membrane de nylon, puis hybridés avec des sondes The RNAs are extracted with a phenol / chloroform mixture, then analyzed by Northern Blot. After migration on agarose gel, the RNAs are transferred to a nylon membrane, then hybridized with probes

marquées au 32P spécifiques de la HSP70. Les signaux radioactifs des différentes bandes sont quantifiés par un Imager. marked with 32P specific to the HSP70. The radioactive signals of the different bands are quantified by an imager.

Dans le cas de stress, les résultats exprimés sont normalisés par rapport à l'inducteur cadmium. In the case of stress, the results expressed are normalized with respect to the cadmium inducer.

Exemple 2 : Effet du verbascoside sur la sécrétion/maturation du collagène par visualisation d'un anticorps fluorescent en utilisant la technique de microscopie confocale. Example 2: Effect of verbascoside on the secretion / maturation of collagen by visualization of a fluorescent antibody using the confocal microscopy technique.

Les cellules (fibroblastes dermiques humains normaux) sont cultivées jusqu'à confluence dans un milieu classique DMEM 10% SVF, à 37 C, 5% C02. The cells (normal human dermal fibroblasts) are cultured to confluence in a conventional DMEM 10% FCS medium, at 37 ° C., 5% CO 2.

Puis elles sont traitées par le verbascoside (à 5. Then they are processed by the verbascoside (at 5.

10-3 %) pendant 2 fois 72 heures. 10-3%) for 2 times 72 hours.

Après lavage et saturation des sites de liaison non spécifiques, les cellules sont traitées par l'anticorps polyclonal anti-collagène I. After washing and saturation of the non-specific binding sites, the cells are treated with the polyclonal anti-collagen antibody I.

On réalise ensuite les observations en microscopie confocale. Observations are then made by confocal microscopy.

- Cultures témoins :
Après marquage par un anticorps anti-collagène I et révélation par épi-fluorescence, la matrice extracellulaire des cultures témoins apparaît peu fibreuse. Le marquage du collagène est surtout localisé à l'intérieur ou associé à la surface des cellules (peu de dépôt et peu structuré en fibres). - Control cultures:
After labeling with an anti-collagen I antibody and revelation by epi-fluorescence, the extracellular matrix of the control cultures appears to be not very fibrous. The marking of collagen is mainly located inside or associated with the surface of the cells (little deposit and little structure in fibers).

- Témoin positif :
Le TGF-béta est utilisé en tant que témoin positif. - Positive control:
TGF-beta is used as a positive control.

Présent naturellement dans la peau, un de ses rôles est d'agir sur l'expression des gènes du collagène et il conduit à une forte augmentation de la synthèse de procollagène. Naturally present in the skin, one of its roles is to act on the expression of collagen genes and it leads to a sharp increase in the synthesis of procollagen.

Après traitement par le TGF-béta, le marquage du collagène est beaucoup plus intense que dans les témoins. After treatment with TGF-beta, the labeling of collagen is much more intense than in the controls.

L'observation de la matrice déposée dans les cellules traitées par le verbascoside montre une modification par rapport au témoin. D'avantage de fibres sont visibles et elles sont plus grosses et mieux organisées. The observation of the matrix deposited in the cells treated with verbascoside shows a modification compared to the control. More fibers are visible and they are larger and better organized.

Le verbascoside a également montré un effet dans les cultures déjà traitées par le TGF-béta : la matrice déposée est plus dense que le cas où les cellules sont exposées au traitement par le TGF-béta seul. Verbascoside has also shown an effect in cultures already treated with TGF-beta: the deposited matrix is denser than the case where cells are exposed to treatment with TGF-beta alone.

Tous ces éléments nous montrent que le verbascoside est important pour la sécrétion/maturation du collagène, pour l'organisation de la matrice extra-cellulaire, donc pour le maintien de l'intégrité et la qualité du derme. All these elements show us that the verbascoside is important for the secretion / maturation of collagen, for the organization of the extra-cellular matrix, therefore for the maintenance of the integrity and the quality of the dermis.

Exemple 3 Emulsion anti-ride pour le visage (composition en pourcentage). Example 3 Anti-wrinkle emulsion for the face (percentage composition).

Verbascoside 0,1% (ou extrait sec contenant 20% : 0,5%)
Eau déminéralisée qsp
Adoucissant : 0,05
Séquestrant : 0,025
Cocoate ethyl hexyl : 5
Glycols : 8
Gomme xanthane : 0,3
Huiles et cires végétales 4
Alcools gras 3,5
Silicone 5
Conservateurs 1,9
Filtres solaires 2
Talc 2
Vitamines 0,4
Parfum 0,4 Verbascoside 0.1% (or dry extract containing 20%: 0.5%)
Demineralized water qs
Softener: 0.05
Sequestering: 0.025
Cocoate ethyl hexyl: 5
Glycols: 8
Xanthan gum: 0.3
Vegetable oils and waxes 4
Fatty alcohols 3.5
Silicone 5
Preservatives 1.9
Sun filters 2
Talc 2
Vitamins 0.4
Perfume 0.4

Exemple 4 : Emulsion visage et corps (composition en pourcentage). Example 4: Face and body emulsion (percentage composition).

Verbascoside 0,1% (ou extrait sec contenant 20% : 0. 5%)
Eau déminéralisée qsp
Propylène glycol 2
Hydratant 2
Na 4 EDTA 0,025
Gélifiants 0,1
Conservateur 0,2
Antioxydant 0,1
Huiles végétales 12
Silicone 3
Triglycérides 2
Adoucissants 0,1
Epaissisant 1,5
Emulsifiants 4
Ester 7
Parfum 0,3
Ethanol 3
Silice 1Verbascoside 0.1% (or dry extract containing 20%: 0.5%)
Demineralized water qs
Propylene glycol 2
Moisturizer 2
Na 4 EDTA 0.025
0.1 gelling agents
Preservative 0.2
Antioxidant 0.1
Vegetable oils 12
Silicone 3
Triglycerides 2
Softeners 0.1
Thickener 1.5
Emulsifiers 4
Ester 7
Perfume 0.3
Ethanol 3
Silica 1

Claims

1) Cosmetic use of a phenyl propanoid glycoside as an agent stimulating the synthesis of a heat shock protein by skin cells, said agent being incorporated in a cosmetic composition comprising one or more acceptable excipients.

2) Use according to claim 1, characterized in that the phenyl propanoid glycoside is the verbascoside.

3) Use according to one of claims 1 or 2, characterized in that the heat shock protein is HSP 70.

4) Use according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the phenylpropanoid glycoside, more particularly verbascoside, is also an agent inhibiting collagenase and elastase and stimulating the maturation of collagen during its secretion by an action on hydroxylases.

5) Use according to any one of the preceding claims, characterized in that said cosmetic or dermatological composition is intended to combat the decrease in the integrity of the dermis linked to the degradation of the skin's support fibers which are collagen and elastin.

6) Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the phenylpropanoid glycoside, more particularly the verbascoside, is in the form of a pure molecule obtained by

chemical synthesis, by enzymatic synthesis, or obtained by extraction and purification from fresh or dried plants.

7) Use according to one of the preceding claims, characterized in that the phenyl propanoid glycoside, more particularly the verbascoside, is in the form of a plant extract whose concentration of phenylpropanoid glycoside, more particularly in verbascoside between about 0 , 01 to 75%, preferably between 0.1 and 50%.

8) Use according to one of claims 6 or 7, characterized in that the phenyl propanoid glycoside, more particularly the verbascoside, is in the form of a plant extract chosen from the order of Tubiflorales.

9) Use according to one of claims 6 to 8, characterized in that the phenyl propanoid glycoside, more particularly the verbascoside, is in the form of a plant extract chosen from the genera Verbascum, Plantago, Verbena, Lippia, Fraxinus.

10) Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the phenyl propanoid glycoside, more particularly the verbascoside, is free, encapsulated, vectorized, grafted.

11) Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the phenyl propanoid glycoside, more particularly the verbascoside, is present in the cosmetic composition at a concentration of the order of 0.01 to 5%, preferably of 0.05 to 2%, by weight of the composition.