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FR2848568A1 - Gene chimere permettant l'expression d'une hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase dans les plastes et plantes transplastomiques contenant un tel gene tolerantes aux herbicides - Google Patents

Gene chimere permettant l'expression d'une hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase dans les plastes et plantes transplastomiques contenant un tel gene tolerantes aux herbicides Download PDF

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FR2848568A1
FR2848568A1 FR0215975A FR0215975A FR2848568A1 FR 2848568 A1 FR2848568 A1 FR 2848568A1 FR 0215975 A FR0215975 A FR 0215975A FR 0215975 A FR0215975 A FR 0215975A FR 2848568 A1 FR2848568 A1 FR 2848568A1
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FR
France
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hppd
plants
chimeric gene
plant
transplastomic
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Ghislaine Tissot
Jean Pierre Wisniewski
Jean Marc Ferullo
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Rhobio SA
Original Assignee
Rhobio SA
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Abstract

La présente invention a pour objet des plantes transplastomiques présentant une tolérance améliorée aux herbicides inhibiteurs de l'hydroxyphényl pyruvate dioxygenase, une méthode d'obtention de telles plantes ainsi que les vecteurs utilisés.

Description

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Gène chimère permettant l'expression d'une Hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase dans les plastes et plantes transplastomiques contenant un tel gène tolérantes aux herbicides.
La présente invention a pour objet des plantes transplastomiques présentant une tolérance améliorée aux herbicides inhibiteurs de l'hydroxyphényl pyruvate dioxygenase, une méthode d'obtention de telles plantes ainsi que les vecteurs utilisés. L'invention a également pour objet un procédé de traitement des plantes transplastomiques dans lequel on applique un inhibiteur de l'HPPD pour éliminer les mauvaises herbes.
Les hydroxy-phényl pyruvate dioxygénases (HPPD) sont des enzymes qui catalysent la réaction de transformation du para-hydroxy-phényl-pyruvate (HPP) en homogentisate.
Cette réaction a lieu en présence de fer (Fe2+) en présence d'oxygène (Crouch N. P. & al., Tetrahedron, 53,20, 6993-7010,1997).
Par HPPD, on entend selon l'invention toute enzyme HPPD native, mutée ou chimère, présentant l'activité HPPD. De nombreuses HPPD sont décrites dans la littérature, notamment les HPPD de bactéries comme Pseudomonas (Rüetschi & al., Eur. J. Biochem., 205,459-466, 1992, WO 96/38567), de plantes comme d'Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834) ou de carotte (WO 96/38567, Genebank 87257), de Coccicoides (Genebank COITRP) ou de mammifères comme l'homme, la souris ou le cochon.
Par HPPD mutée, on entend selon l'invention les HPPD mutées pour obtenir des propriétés de tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD améliorées par rapport à l'HPPD native correspondante. De manière avantageuse, l'HPPD mutée est une HPPD mutée dans sa partie C-terminale telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585. De manière avantageuse, l'HPPD mutée comprend la mutation W336 telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.
Par HPPD chimère, on entend une HPPD comprenant des éléments provenant de différentes HPPD, notamment les HPPD chimères décrites dans la demande de brevet WO 99/24586.
De manière avantageuse, l'HPPD est une HPPD de Pseudomonas fluorescens (WO
96/38567).
On connaît par ailleurs certaines molécules inhibitrices de cette enzyme, qui viennent se fixer à l'enzyme pour inhiber la transformation de l'HPP en homogentisate. Certaines de
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ces molécules ont trouvé un emploi comme herbicides, dans la mesure où l'inhibition de la réaction dans les plantes conduit à un blanchiment des feuilles des plantes traitées, et à la mort desdites plantes (Pallett K. E. et al. 1997 Pestic. Sci. 50 83-84). De tels herbicides ayant pour cible l'HPPD décrits dans l'état de la technique sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole (IFT), herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles ou DKN (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-2,3 Cl2 phényl) propane-1,3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou la mésotrione ou encore les pyrazolinates.
Pour rendre les plantes tolérantes aux herbicides, on dispose de trois stratégies principales, (1) la détoxification de l'herbicide par une enzyme venant transformer l'herbicide, ou son métabolite actif, en produits de dégradation non toxiques, comme par exemple les enzymes de tolérance au bromoxynil ou au basta (EP 242 236, EP 337 899) ; (2)la mutation de l'enzyme cible en une enzyme fonctionnelle moins sensible à l'herbicide ou son métabolite actif, comme par exemple les enzymes de tolérance au glyphosate (EP 293 356, Padgette S. R. & al., J Biol. Chem., 266, 33, 1991, FR2 736 926); ou (3) la surexpression de l'enzyme sensible, de manière à produire dans la plante des quantités suffisantes d'enzyme cible au regard des constantes cinétiques de cette enzyme vis à vis de l'herbicide de manière à avoir suffisamment d'enzyme fonctionnelle, malgré la présence de son inhibiteur.
C'est cette troisième stratégie qui a été décrite pour obtenir avec succès des plantes tolérantes aux inhibiteurs d'HPPD (WO 96/38567), étant entendu que pour la première fois une stratégie de simple surexpression de l'enzyme cible sensible était employée avec succès pour conférer aux plantes une tolérance à un niveau agronomique à un herbicide. Un niveau agronomique de tolérance aux inhibiteurs d'HPPD a également été obtenu avec des HPPD chimères (WO 99/24586), et même amélioré avec des HPPD mutées dans leur parties terminales (WO 99/24586).
Alors que les HPPD de plantes sont des enzymes à localisation cytoplasmique (Garcia, I., et al. 1997. Biochem. J. 325: 761-769. ), il a également été montré que la meilleure tolérance était obtenue lorsque l'HPPD exogène était accumulée dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes. Ainsi, l'adressage de l'HPPD vers les chloroplastes a été réalisée à l'aide d'un construit comprenant un peptide de transit optimisé (OTP, EP 508 909) qui permet d'adresser le construit vers le chloroplaste, lui-même suivi de la région codante
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du gène hppd de Pseudomonas fluorescens à son tour suivie du terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens (WO 96/38567).
Différentes cassettes d'expression susceptible d'améliorer le niveau de tolérance des plantes transformées ont été décrites avec différents éléments de régulations, et notament des promoteurs dits lumière dépendants (WO 99/25842) ou pour les plantes monocotylédones avec une séquence de régulation promotrice comprenant la combinaisoin du promoteur H3C4 d'histone de maïs et du premier intron de l'actine de riz (WO 99/34005).
Ces résultats montrent d'une part que l'homogentisate peut être transporté du milieu extérieur vers le site intra cellulaire où il est nécessaire pour complémenter une inhibition de l'HPPD endogène, et d'autre part que l'accumulation d'une HPPD exogène dans la cellule au niveau des plastes ou du cytoplasme permettant l'obtention de plantes génétiquement modifiées tolérantes aux herbicides inhibiteurs d'HPPD. Cependant, une meilleure tolérance au DKN a été observée chez les plantes exprimant l'HPPD dans les plastes
Un autre moyen d'obtention de plantes exprimant l'HPPD dans les plastes est la transformation directe des plastes. En effet, la transformation des plastes présente de nombreux avantages parmi lesquels on peut citer : - La transformation des plastes, par laquelle les gènes sont insérés par une double recombinaison homologue dans une ou toutes les copies multiples du génome plastidial circulaire (ou plastome) présent dans chaque cellule présente de cibler précisément la région du plastome où l'on souhaite intégrer le gène d'intérêt, grâce à des séquences plastidiales positionnées de part et d'autre du transgène sur le vecteur de transformation. Ce ciblage précis évite l'effet dit de position observé fréquemment en transgenèse nucléaire.
- L'obtention d'un très grand nombre de copies du transgène par cellule. En effet, selon le stade de développement, une cellule de feuille peut contenir jusqu'à 10
000 copies d'un petit génome circulaire de 120 à 160 kilobases, chaque molécule portant une large séquence répétée. Les cellules de plantes peuvent donc être manipulées de manière à contenir 20 000 copies d'un gène d'intérêt.
Ceci conduit à des niveaux d'expression élevés, les produits des transgènes pouvant présenter plus de 40% des protéines solubles totales (De Cosa et al., 2001).
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La transformation plastidiale présente l'autre avantage de permettre le contrôle de la dispersion des transgènes dans l'environnement, les traits codés au niveau des plastes ne sont pas transmissibles via le pollen, donc les risques potentiels de transmission du transgène aux espèces sauvages est évité.
La technologie de transformation des plastes est clairement décrite dans les documents suivants: les brevets américains U. S. Pat. No 5,451,513; 5,545,817 , 5,545,818 et 5,576,198, les demandes de brevet internationales WO 95/16783 et WO 97/32977 ainsi que dans l'article McBride et al., 1994. La transformation des plastes par biolistique a été réalisée initialement dans l'algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii (Boynton et al., 1988) et cette approche a été étendue au tabac (Svab et al., 1990).
La technique classique de transformation de plastes implique le bombardement de feuilles à l'aide de micro-projectiles sur lesquels est fixé l'ADN (Svab et al., 1993, U. S. Patent Ser. No. 6,376,744).
A l'heure actuelle, la transformation stable des plastes des végétaux supérieurs est pratiquée de manière courante seulement chez le tabac, N. tabacum (Svab et Maliga, 1990 ; Svab et al., 1993). Quelques progrès récents ont néanmoins été réalisés avec la transformation des plastes de riz (Khan et Maligna, 1999), Arabidopsis thaliana (Sikdar et al., 1998), la pomme de terre (Sidorov et al., 1999), le colza (Chaudhun et al., 1999) et la tomate (Ruf et al., 2001). Des plantes transplastomiques fertiles ont été obtenues dans le cas du tabac, de la tomate et de la pomme de terre.
L'utilisation de la transformation directe des plastes a été utilisée pour obtenir un bon niveau de tolérance à des herbicides ou de résistance aux insectes ou encore pour la production de protéines en grande quantité. Ainsi, la surexpression à partir du plastome de tabac de gènes de tolérance à des herbicides tels que le glyphosate (Daniell, 1998 ; W099/10513; Ye et al , 2000 ; WO 01/04331, WO 01/04327), ou la phosphinothricine (Basta) (Lutz et al., 2001), confère une excellente tolérance à ces herbicides. D'autres applications ont conduit à l'obtention de plantes transplastomiques tolérantes aux insectes ou surproduisant des protéines thérapeutiques (McBride et al., 1995 ; US Patent 5,451,513; Staub et al. (2000) ; W099/10513).
Cependant, aucun des travaux décrits dans l'art antérieur n'a permis de montrer que l'expression d'un gène de tolérance à un herbicide au niveau du plastome permettait d'obtenir une tolérance accrue par rapport à une expression nucléaire de ce même gène. Le
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document WO 01/04327, décrit une technique de transformation des plastes ainsi que des plantes transplatomiques exprimant le gène de tolérance au glyphosate (EPSPS). Les résultats présentés dans ce document attestent d'une tolérance herbicide similaire pour les plantes transformées au niveau nucléaire et plastidial.
Les références bibliographiques citées précédement sont intégrées par référence à la présente demande de brevet, en particulier les références bibliographiques définissant les séquences d'acide nucléique codant pour des HPPD natives, chimères ou mutées, éventuellement combinées avec un peptide signal ou peptide de transit.
Description des figures Figure 1 : Carte du plasmide pCLT111 Figure 2 : du plasmide pCLT129 Figure 3 : Carte du plasmide pCH43 Description détaillée de l'invention
La présente invention a pour objet un gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire lequel comprend, liés entre eux de manière fonctionnelle dans le sens de la transcription une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les plastes, une séquence codante hétérologue codant pour une hydroxyphenyl-pyruvate dioxygenase (HPPD) et un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales.
De manière préférée, l'HPPD est choisie parmi les HPPD natives, mutées ou chimères.
De manière encore plus préférée, la séquence codant pour l'HPPD est issue de Pseudomonas fluorescens.
Selon un aspect de l'invention la séquence codant pour l'HPPD est issue de Synechocystis.
Dans un autre aspect de l'invention, la séquence codant pour l'HPPD peut être d'origine végétale et notamment, elle peut être issue d'Arabidopsis, d'une Ombellifère et plus particulièrement de Daucus carotta. Selon un aspect encore différent, la séquence codant pour l'HPPD peut être issue de Zea maïs.
L'invention concerne également gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire comprenant la séquence codant pour une HPPD ainsi qu'au moins un autre gène chimère élémentaire comprenant, liés entre de manière opérationnelle dans le sens de la transcription une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les plastes, une
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séquence codant pour un marqueur de sélection, un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales.
L'expression "liés entre eux de manière opérationnelle" signifie que lesdits éléments du gène chimère élémentaire sont liés entre eux de manière à ce que leur fonctionnement soit coordonné et permettent l'expression de la séquence codante. A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'assurer l'expression de ladite séquence codante. La construction du gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Le choix des éléments régulateurs constituant le gène chimère est essentiellement fonction de la plante et du type de plaste dans lesquelles ils doivent fonctionner, et l'homme du métier est capable de sélectionner des éléments régulateurs fonctionnels dans une plante donnée.
Parmi les promoteurs fonctionnels dans les plastes de cellules végétales, on peut noter à titre d'exemple le promoteur du gène psbA, codant pour la protéine D1 du PSII (Staub et al., 1993, EMBO Journal 12 (2): 601-606), ou le promoteur constitutif de l'opéron des ARN ribosomaux, Prrn (Staub et al., 1992, Plant Cell 4 : 39-45). D'une manière générale, tout promoteur issu d'un gène de plastome de plantes ou d'un gène de bactérie conviendra, et l'homme du métier saura faire le choix adéquat parmi les différents promoteurs disponibles de manière à obtenir un mode d'expression désiré (constitutif ou inductible). Un promoteur préféré selon l'invention est constitué du promoteur Prrn de Tabac associé à une portion 5' de la région 5' non-traduite du gène rbcL de tabac (Svab et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.
90 : 913-917).
De façon encore plus préférentielle, le promoteur correspond au promoteur lumière dépendant le promoteur du gène psbA, codant pour la protéine D1 du PSII (Staub et al., 1993, EMBO Journal 12 (2): 601-606).
Le marqueur de sélection permet de sélectionner les plastes et les cellules effectivement transformées, c'est-à-dire celles ayant incorporé le(s) gène(s) chimérique (s) dans leur plastome. Il permet également d'obtenir des plantes transplastomiques fertiles à l'état d'homoplasmie. Parmi les gènes utilisables codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer des gènes de résistance aux antibiotiques spectinomycine-streptomycine et kanamycine tel que, par exemple, les gènes chimériques aadA codant une aminoglycoside
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3"-adenyltransférase (Svab et al., 1993) et neo codant une néomycine phosphotransférase (Carrer et al., 1993) respectivement, mais également un gène de tolérance au bétaïne aldéhyde tel que le gène codant la bétaïne aldéhyde déshydrogénase (Daniell et al., 2001), mais aussi des gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18 (4):1062) pourla tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyphosate. On peut également utiliser des gènes rapporteurs codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS (ssglucuronidase) (Staub et al., 1993) ou la GFP (green fluorescent protein) (Sidorov et al., 199), des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, WO 97/04103 et WO 01/64023.
De manière préférentielle, le gène codant pour un marqueur de sélection est le gène aadA codant pour une amino glycoside 3"-adényltransférase conférant la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine (Svab et al., 1993).
Parmi les terminateurs fonctionnels dans les plastes de cellules végétales, on peut noter à titre d'exemple le terminateur du gène psbA, du gène rbcL codant pour la large sousunité de la Rubisco, du gène rps16 codant une protéine ribosomale de tabac (Shinozaki et al., 1986; Staub et al., 1993).
L'invention concerne également un vecteur de transformation adapté à la transformation des plastes de plante caractérisé en ce qu'il comprend deux régions de recombinaison homologue du plastome de la plante, encadrant au moins un gène chimère selon l'invention.
Ces régions, situées en amont (RRHG) et en aval (RRHD) du(des) gène(s) chimère(s) élémentaires, permettent la double recombinaison homologue avec une région intergénique du plastome qui comprend les régions contigües RRHG et RRHD.
De façon préférentielle, les deux régions de recombinaison homologues selon l'invention correspondent à des séquences contigües permettant l'intégration du gène chimère dans une région intergénique du plastome. Dans un mode de réalisation particulier, cette région correspond à la région de l'opéron des ARN ribosomiques du plastome. Dans un autre mode de réalisation particulier, cette région intergénique comprend l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la Rubisco, et que l'autre séquence homologue
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comprend à l'extrémité du gène 5' accD, codant pour une sous unité de l'acétyl-CoAcarboxylase. Et plus particulièrement, cette région intergénique comprend l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la Rubisco correspondant aux nucléotides 57755 à 59297 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana et que l'autre séquence homologue comprend l'extrémité 5' du gène accD correspondant aux nucléotides 59298 à 60526 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention des plantes transplastomiques tolérantes aux inhibiteurs de l'HPPD, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : transformation des cellules avec un vecteur selon l'invention, sélection des cellules comprenant des plastes transformés, régénérations des plantes à partir des cellules transformées.
Par "transplastornique", on entend selon l'invention des plantes ayant intégré de manière stable dans leur plastome un gène chimère fonctionnel dans les plastes, en particulier dans les chioroplastes. Le plastome est constitué par le génome des organites cellulaires autres que la noyau, en particulier le génome des chloroplastes.
La transformation des cellules peut s'effectuer par toute méthode de transformation de cellules végétales. Parmi les méthodes de transformation utilisables pour obtenir cellules transformées selon l'invention, une de celles-ci consiste à mettre les cellules ou tissus des plantes à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et du vecteur de transformation (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115 ; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70 (4), 503-517).L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules ou tissus à transformer et les vecteurs à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Une autre méthode consiste à injecter directement les vecteurs dans les cellules ou les tissus par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136). La transformation de cellules ou tissus végétaux peut également se faire à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem.
6,143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23(3):315-330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16 :357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci 4(1), 24-28) génétiquement modifiés permettant ainsi l'adressage du T-DNA spécifiquement vers les plastes. De manière préférentielle, la transformation de cellules ou tissus végétaux par
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Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. (1996, Nat.
Biotechnol. 14 (6), 745-750).
Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, la méthode dite de bombardement de particules ou biolistique sera utilisée. Elle consiste à bombarder les tissus avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs selon l'invention (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24), 9692-9696;Klein et al., 1992, Biotechnology 10 (3), 286-291 ; US Patent No. 4,945,050).
La sélection des cellules transformées peut être réalisée à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD et/ou d'un autre marqueur de sélection. L'application desdits produits pouvant être faite de manière conjointe ou séquentielle. De façon préférée, la sélection est pratiquée en présente d'un inhibiteur de l'HPPD et de streptomycine et/ou de spectinomycine.
Le procédé d'obtention de plantes transplastomiques tolérantes aux inhibiteurs de l'HPPD selon l'invention peut comporter une étape de sélection supplémentaire intervenant sur les plantes régénérées.
L'invention a également pour objet une cellule végétale transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD, caractérisée en ce qu'elle comprend un gène chimère comprenant au moins une séquence codant pour une HPPD et éventuellement une séquence codante hétérologue codant pour un marqueur de sélection.
L'invention concerne une plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD, caractérisée en ce qu'elle est régénérée à partir des cellules transformées telles que définies ci-dessus.
L'invention concerne également une plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comprenant un gène chimère comprenant au moins une séquence codant pour une HPPD.
Une plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'invention comprend un gène chimère comprenant une séquence codant pour une HPPD ainsi qu'une séquence codant pour un marqueur de sélection, est un autre objet de la présente invention.
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Les plantes transpiastomiques hétéroplasmiques tolérantes aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'invention constituent un aspect de l'invention. Par "hétéroplasmique", il faut comprendre un état selon lequel les cellules contiennent une population mixte de différents génomes plastidiaux à l'intérieur d'un plaste ou une population de plastes contenus dans des cellules ou tissus de plantes.
Les plantes transplastomiques homoplasmiques tolérantes aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'invention constituent un autre aspect de l'invention. L'état d'homoplasmie correspond à un état selon lequel toutes les cellules contiennent une population de plastome identique. Selon l'invention, des plantes transplastomiques sont à l'état d'homoplasmie lorsque toutes leurs cellules ne contiennent que des copies de plastome transformés, et plus aucun plastomes non-transformés. Cet état est généralement obtenu par sélection des copies de plastome ayant intégré la gène chimère, notamment grâce à l'association de ladite gène chimère avec un gène codant pour un marqueur de sélection. Les plastomes n'ayant pas intégré le marqueur de sélection sont alors éliminés lorsque les tissus transformés sont mis en contact avec l'agent de sélection correspondant.
Les plantes transplastomiques tolérantes aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'invention peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales dont le blé, la canne à sucre, le riz et le mais ou dicotylédones comme le tabac, le soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle, etc.
L'invention comprend également des parties des plantes transplastomiques, et la descendance de ces plantes. On entend par "parties", tout organe de ces plantes, qu'il soit aérien ou souterrain. Les organes aériens sont les tiges, les feuilles, et les fleurs comprenant les organes reproducteurs mâles et femelles. Les organes souterrains sont principalement les racines, mais ils peuvent également être des tubercules. Par "descendance", on entend principalement les graines contenant les embryons issus de la reproduction de ces plantes entre-elles. Par extension, le terme "descendance" s'applique à toutes les graines formées à chaque nouvelle génération issue de croisements dont au moins un des parents est une plante transformée selon l'invention. Une descendance peut également être obtenue par multiplication végétative desdites plantes transformées. Les graines selon l'invention peuvent être enrobées d'une composition agrochimique comprenant au moins un produit actif possédant une activité sélectionnée parmi les activités fongicide, herbicide, insecticide, nématicide, bactéricide ou virucide.
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L'invention a aussi pour objet un procédé de désherbage sélectif de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD notamment un herbicide définit auparavant, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transplastomiques selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.
La présente invention concerne également un procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'invention, lequel procédé consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transplastomiques selon l'invention.
La présente invention concerne également un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention avec un gène chimère selon l'invention lequel procédé consiste à semer les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD défini cidessus en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
Par sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées , on entend selon l'invention que les plantes comprenant la cassette d'expression selon l'invention, soumises à une application d'une dose d'herbicide toxique pour les mauvaises herbes, présentent une phytotoxicité légère ou nulle. Par dose toxique pour les mauvaises herbes, on entend selon l'invention une dose d'application de l'herbicide pour laquelle les mauvaises herbes sont tuées. Par phytotoxicité légère on etend selon l'invention un pourcentage de feuilles blanchies inférieur à 25%, préférentiellement inférieur à 10%, plus préférentiellement inférieur à 5%. Il est entendu également selon la présente invention que l'application de la même dose toxique sur une plante autrement comparable non transformée, c'est à dire ne comprenant pas la cassette d'expression selon l'invention, conduirait à observer sur ladite plante des symtomes de phytotoxicité suppérieurs à ceux observés pour la plante transformée comprenant la cassette d'expression selon l'invention.
Dans les deux procédés ci-dessus, l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD peut être faite selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.
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Par herbicide au sens de la présente invention on entend une matière active herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par exemple un agent augmentant l'activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais safener). Les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont en particulier définis auparavant. Bien entendu, pour leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont associée de manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en agrochimie.
Les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont choisis parmi les isoxazoles en particulier l'isoxaflutole, les dicétonitriles en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CHg-4-2,3 CI2 phényl) propane-1,3-dione, les tricétones, en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou les pyrazolinates.
Les techniques de biologie moléculaire sont décrites dans Ausubel (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc. (1994) : Maniatis T., Fritsch E. F. and Sambrook J. Molecular Cloning . A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Les réactions de PCR sont réalisées dans un appareil Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9600. Les réactions d'amplification pour chaque échantillon sont effectuées au cours de 30 cycles comportant différentes étapes : une étape de dénaturation à 94 C pendant une minute, une étape d'appariement de 45 secondes à une température de 50à 60 C, en fonction des amorces utilisées et une étape d'élongation à 72 C de 1 à 2 minutes selon la taille des produits PCR à amplifier. Ces cycles ont précédés d'une période de dénaturation à 94 C durant 5 minutes et suivis d'une période d'élongation finale de 5 minutes à 72 C. Une température de 4 C est appliquée après 30 cycles. Les produits PCR sont séparés sur gel d'agarose.
La position des différents fragments d'ADN issus du plastome de Nicotiana tabacum est indiquée conformément à la numérotation proposée par Shinozki et al., 1986 et repris dans Genebank sous le numéro d'accession Z00044).
L'invention sera plus particulièrement illustrée par les exemples qui suivent, étant entendu que ces exemples ne sont pas limitatifs.
Exemple 1: Construction des vecteurs pCLT111 et pCLT129, utiles à la production de plantes transplastomiques surexprimant l'hppd
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Les deux plasmides pCLT111 et pCLT129 contiennent deux gènes chimères élémentaires adjacents, nommées "AADA" et "HPPD", encadrées par deux fragments d'ADN, "RRHD" (Région de Recombinaison Homologue Droite) et "RRHG" (Région de Recombinaison Homologue Gauche), facilitant l'intégration du gène chimère dans le génome plastidial. Pour les deux plasmides, le fragment RRHG (nucléotides 57755 à 59297 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana) correspond à l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la Rubisco, et le fragment RRHD (nucléotides 59298 à 60526 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana) correspond à l'extrémité 5' du gène accD, codant pour une sous-unité de l'acétyl-CoA-carboxylase.
Le gène chimère élémentaire AADA ("AADA-111", SEQ ID No 1) du plasmide pCLT111 (issu d'un plasmide pBS11SK, Stratagène) est un gène chimérique composé, de 5' en 3', du promoteur de l'opéron des ARN ribosomiques ("Prrn", nucléotides 102 561 à 102 677 du plastome de N. tabacum), d'une portion de la région 5' transcrite et non traduite du gène rbcL ("5'rbcL", nucléotides 57 569 à 57 584 du plastome de N. tabacum), de la séquence codante du gène aadA dont le produit confère la résistance à la spectinomycine (Svab and Maliga, 1993), et du terminateur du gène psbA ("3'psbA", nucléotides 146 à 533 du plastome de N. tahacum, c.v. Petit Havana). Le gène chimère élémentaire "HPPD" du plasmide pCLT111 ("HPPD-111", SEQ ID No 5) est un gène chimérique composé, de 5' en 3', du promoteur du gène psbA ("PpsbA ", nucléotides 1596 à 1819 du plastome de N. tabacum, cv PBD6), de la séquence codante du gène hppd de Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO 1 de la demande de brevet WO 98/02562), et du terminateur du gène rbcL ("3'rbcL", nucléotides 59 036 à 59 246 du plastome de N. tabacum, cv PBD6). Les deux gènes chimères élémentaires sont dans la même orientation et le gène chimère élémentaire "HPPD" est en 5' du gène chimère élémentaire "AADA", de telle sorte que le gène hppd se trouve flanqué de deux séquences identiques 3'rbcL en répétition directe (présentes sur RRHG et dans la cassette HPPD-111) (Figure 1).
Le gène chimère élémentaire "AADA" (AADA-129, SEQ ID No. 3) du plasmide pCLT129 (issu d'un plasmide pBS11SK, Stratagène) est composée, de 5' en 3', du promoteur Prrn, d'une portion de la région 5' transcrite et non traduite du gène rbcL ("5'rbcL", nucléotides 57 569 à 57 584 du plastome de N. tabacum), de la séquence codante du gène aadA et du terminateur 3'rbcL. Le gène chimère élémentaire HPPD du plasmide pCLT129 (HPPD-129, SEQ ID No 7) est composée de 5' en 3', du promoteur Prrn, d'une portion de la région 5' transcrite et non traduite du gène rbcL ("5'rbcL", nucléotides 57 569 à 57 584 du plastome de N. tabacum), de la séquence codante du gène hppd de P. fluorescens (identique à cette du gène chimère élémentaire HPPD-111) et du terminateur 3'psbA. Les deux cassettes sont dans la même orientation et la cassette AADA-129 est en 5' de la
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cassette HPPD-129 de telle sorte que le gène aadA se trouve flanqué de deux séquences quasi-identiques, 3'rbcL-Prrn, les deux séquences différant uniquement au niveau de la jonction entre 3'rbcL et Prrn (Figure 2).
Exemple 2: Transformation par biolistiaue des génomes plastidiaux de tabac.
Des plants de Nicotiana tabacum c. v. 'PBD6' sont cultivés en conditions stériles sur un milieu MS (Murashige T. and Skoog F., 1962) (Sigma M-5519 à 4,4 g/l) et saccharose (30 g/l). Des feuilles de 3 à 5 cm sont bombardées sur leur face inférieure en utilisant un canon construit au laboratoire d'après celui décrit par Finer et al. (1992), le "PIG" (Particule Inflow Gun). Les micro-projectiles de tungstène (particules M17 de 1 m) sont complexés à l'ADN (pCLT111 ou pCL129, 5 g/ tir) en présence de CaCl2 (0,8 à 1 M) et de spermidine (14 à 16 mM). Les feuilles bombardées sont ensuite placées de manière à disposer la face inférieure sur un milieu MS supplémenté avec 0,05 mg/l d'acide a-naphtalène acétique (ANA; Sigma), 2 mg/l de 6-benzylam:nopurine (BAP; Sigma), 30 g/l de saccharose et 7g/l de phytagar (milieu MS 0,05-2). Deux à trois jours après le bombardement les feuilles bombardées sont découpées en carré de 5 mm de côtés et placées, toujours face inférieure sur un milieu MS 0,05-2 contenant 500 mg/l de spectinomycine dihydrochloride (et/ou différentes concentrations de DKN). Les cals et les pousses résistants à la spectinomycine (et/ou au DKN) sont régénérées sur le même milieu et sont enracinés sur un milieu contenant MS à demi force, 15 g/l de saccharose et 500 mg/l de spectinomycine (et/ou différentes concentrations de DKN) pour obtenir les plantes TO ( correspondant à un premier cycle de régénération appelé R1). De manière à approcher un état d'homoplasmie, un deuxième cycle de régénération est réalisé sur un milieu MS 0,05-2 contenant de la spectinomycine (500 mg/I) et du DKN (1 ppm). Les pousses régénérées (appelées événements R2) sont enracinées et les plantes (TO) transférées en serre. Les premières générations de graines sont des générations T1.
Deux séries indépendantes de bombardements de feuilles de tabac avec pCLT111, CLT111- 1 et CLT111-2 ont été effectuées en utilisant respectivement comme agents de sélection soit uniquement la spectinomycine (500 mg/l), soit un mélange de spectinomycine (300 mg/I) de DKN (0,5 ppm).
Exemple 3: Identification des lignées transplastomiaues CLT111 et CLT129.
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Le criblage des lignées transplastomiques parmi les événements tolérants à la spectinomycine et à la spectinomycine et DKN a été réalisé par PCR à l'aide d'amorces spécifiques permettant de détecter l'intégration des cassettes d'expression dans le plastome, à l'aide d'une amorce qui s'hybride dans le génome plastidial natif, adjacent au point d'intégration et d'une amorce qui s'hybride sur l'un des transgènes (hppd ou aadA). Nous avons choisi les amorces suivantes: ORBCL52 (5'-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3') (SEQ ID No 9) et RHPP1 (5'-gagccgatcttcgagatca-3') (SEQ ID No 10)qui s'hybrident respectivement sur le plastome au niveau du gène rbcL (nucléotides 57595 à 57620, à l'extérieur de RRHG) et sur le gène hppd. Un amplicon de 2026 pb sera caractéristique d'un événement transplatomique CLT111, tandis qu'un amplicon de 3106 pb est attendu pour les événements transplastomiques CLT129. Nous avons constaté que 15% des cals régénérés sur spectinomycine au cours de la transformation CLT111-1 se sont révélés transplastomiques, tandis qu'au cours de la transformation CLT111-2, 28% des cals se développant sur la double sélection spectinomycine+DKN étaient transplastomiques. Nous en concluons qu'une double sélection antibiotique+herbicide favorise une augmentation de la fréquence de transformation plastidiale et une diminution de faux positifs par comparaison avec une sélection simple sur antibiotique.
La nature transplastoniique des différents événements de transformation a été confirmée en effectuant une analyse de type Southern Blot sur l'ADN de ces événements et de leur descendance. L'ADN de feuilles de tabacs issus des transformations avec les plasmides pCLT111 et pCLT129 a été extrait et digéré à l'aide des enzymes de restriction Ncol et Hind/II. L'ADN de tabac sauvage (WT) a été extrait et digéré à l'aide des mêmes enzymes.
A l'exception de la lignée 4 issue de la transformation CLT111-1, toutes les lignées analysées présentent les profils attendus : la sonde HPPD révèle la présence d'une bande à 1298 pb dans le cas des lignées CLT111 et à 6074 pb dans le cas des lignées CLT129, aucune bande n'étant présente sur le contrôle non transformé. La sonde RRHG révèle la bande à 6429 pb correspondant au plastome sauvage sur le contrôle non transformé, et une bande majoritaire à 2085 pb dans les événements CLT111, 1863 pb dans les événements CLT129, caractéristique de l'intégration du transgène entre RRHG et RRHD. Toutefois, la présence d'une bande de faible intensité à 6429 pb indique qu'une partie des plastomes n'ont pas intégré le transgène: toutes les lignées sont dans un état dit d'hétéroplasmie.
La transmission des transgènes à la descendance de ces événements transplastomiques a été vérifiée en testant la présence du marqueur AADA par semis sur un milieu de germination contenant de la spectinomycine. La résistance à l'antibiotique s'est
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retrouvée dans 100% des graines semées. L'analyse par southern blot de l'ADN des descendants révèle un profil strictement identique à celui des plantes régénérées. En particulier, l'état héteroplasmique s'est transmis sans modification sensible du ratio plastome sauvage/plastome transformé, si on se fonde sur l'intensité relative des bandes à 2085 et 6429 pb (événements CLT-111), ou des bandes à 1863 et 6429 pb (événements CLT-129).
L'uniformité du phénotype de ces plantes, toutes parfaitement insensibles à la spectinomycine, confirme aussi l'absence de variation du niveau d'expression entre les différentes lignées, un phénomène couramment observé en transformation nucléaire attribué à "l'effet de position".
Exemple 4: Tolérance des lignées transplastomiques à un herbicide inhibiteur de l'hppd
Cinq cent graines environ des graines T1 issues des événements de transformation CLT111-1 ou CLT111-2 sont semées sur des milieux de germination MS à demi force en présence de DKN à différentes concentrations (1,5, 10,20, 40 ppm). Des graines de tabac sauvage et la lignée pCH43-4 ont été semées sur ces différents milieux pour permettre une comparaison de tolérance au DKN entre les événements transplastomiques, nucléaires et sauvages.
L'événement pCH43-4 provient d'une transformation nucléaire avec un gène chimère comprenant : un promoteur CsVMV (W097/48819) défini dans la présente demande par l'identifiant de séquence SEQ ID No 11, un peptide transit (OTP) (EP 508 909), une séquence codante codant pour une HPPD (SEQ ID No 1 de la demande de brevet WO 96/38567) et le terminateur nos d'Agrobactérium tumefaciens, présents dans le vecteur pCH43D (Figure 3). L'HPPD produite dans le cytosol est ensuite adressée dans les plastes grâce à au peptide de transit. L'événement pCH43-4 présente un excellent niveau de tolérance à l'isoxaflutole (5-cyclopropylisoxazole-4yl é mésyl-4-trifluoprométhylphényl cétone ou IFT) aux doses agronomiques.
Toutes les plantes issues de ces graines se sont développées normalement jusqu'à une dose de 10 ppm 2-cyclopropyl-3-2-mésyl-4-trifluorométhylphenyl-3-oxopropanenitrile (DKN), alors qu'à cette dose, les plantes de la lignée nucléaire pCH43-4 présentent d'importants symptômes de phytotoxicité. De plus, certaines lignées CLT111 ont montré une tolérance parfaite jusqu'à 40 ppm DKN.
Des tests de tolérance à l'IFT en traitement de pré-émergence ont aussi réalisés en serre. Environ 500 graines T1 des événements CLT111 ont été semées dans des barquettes de vermiculite puis traités par pulvérisation d'une solution d'IFT à 200 g/ha. Dans ces
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conditions, le contrôle pCH43-4 présente de fort symptomes de phytotoxicité , tandis que plusieurs événements transplastomiques n'ont présenté aucun symptôme.
Exemple 5 : Comparaison de l'efficacité des promoteurs Prrn et PpbsA Afin de vérifier l'effet de la séquence promotrice placée en amont du gène hppd sur le niveau de tolérance herbicide des plantes transplastomiques, l'expérience suivante a été réalisée.
Des morceaux de feuilles issues des événements CLT111 et CLT129 ont été placés sur un milieu de régénérations contenant 1 ppm DKN. A cette dose, toutes les pousses régénéres à partir de l'évenement CLT111 sont vertes au contraire des pousses CLT129 qui ne sont pas toutes tolérantes au DKN (mélange de pousses vertes et blanches pour un même événement).
On en conclut que l'utilisation d'un promoteur spécifique des chloroplastes ou spécifique des chloroplastes et inductble par la lumière tel que PpsbA est particulièrement appropriée à l'élaboration de plantes tolérantes aux inhibiteurs de l'HPPD.
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Claims (47)

  1. REVENDICATIONS 1.Gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire lequel comprend, liés entre eux de manière fonctionnelle dans le sens de la transcription : - une séquence de régulation promotrice opérationnelle dans les plastes, - une séquence codant pour une hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase (HPPD), - un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales
  2. 2. Gène chimère selon la revendication 1 caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice permet une expression constitutive.
  3. 3. Gène chimère selon la revendication 1 caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice permet une expression dans les tissus photosynthétiques.
  4. 4. Gène chimère selon la revendication 3 caractérisé en en ce que la séquence promotrice est représentée par le promoteur PpsbA.
  5. 5. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que la séquence codante pour une HPPD est choisie parmi les HPPD natives, mutées ou chimères.
  6. 6. Gène chimère selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue de Pseudomonas sp.
  7. 7. Gène chimère selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue de Pseudomonas fluorescens.
  8. 8. Gène chimère selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue de Synechocystis.
  9. 9. Gène chimère selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est d'origine végétale.
  10. 10. Gène chimère selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue d'Arabidopsis.
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  11. 11 Gène chimère selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue d'une Ombellifère.
  12. 12. Gène chimère selon la revendication 11, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue de Daucus carotta.
  13. 13. Gène chimère selon la revendication 11, caractérisée en ce que séquence codante codant pour une HPPD est issue de Zea maïs.
  14. 14. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 13 comprenant en outre un deuxième gène chimère élémentaire comprenant, liés entre eux de manière opérationnelle dans le sens de la transcription : - une séquence de régulation promotrice opérationnelle dans les plastes, - une séquence codant pour un marqueur de sélection, - un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales.
  15. 15. Gène chimère selon la revendication 14 caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice du deuxième gène chimère permet une expression constitutive.
  16. 16. Gène chimère selon la revendication 15 caractérisé en ce que la séquence promotrice est représenté par le promoteur Prrn,
  17. 17. Gène chimère selon la revendication 14, caractérisée en ce que la séquence codante code pour une amino glycoside 3"-adényltransférase.
  18. 18. Vecteur de transformation adapté à la transformation des plastes de plante caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux séquences homologues d'une région du plastome de la plante à transformer, lesdites séquences homologues encadrant au moins un gène chimère selon les revendications 1 à 13.
  19. 19. Vecteur de transformation adapté à la transformation des plastes de plante caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux séquences homologues d'une région du plastome de la plante à transformer, lesdites séquences homologues encadrant au moins gène chimère selon les revendications 14 à 17.
  20. 20. Vecteur selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que les deux séquences homologues d'une région du plastome de la plante à transformer
    <Desc/Clms Page number 22>
    correspondent à des séquences contigües permettant l'intégration du gène chimère dans une région intergénique de plastome.
  21. 21. Vecteur selon la revendication 20, caractérisé en ce que ladite région correspond à la région de l'opéron des ARN ribosomiques du plastome.
  22. 22. Vecteur selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'une des deux séquences homologues comprend l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la
    Rubisco, et que l'autre séquence homologue comprend l'extrémité du gène 5' accD, codant pour une sous unité de l'acétyl-CoA-carboxylase.
  23. 23. Vecteur selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'une des deux séquences homologues comprend l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la
    Rubisco correspondant aux nucléotides 57755 à 59297 du plastome de N. tabacum, cv.
    Havana.
    Petit Havana et que l'autre séquence homologue comprend l'extrémité 5' du gène accD correspondant aux nucléotides 59298 à 60526 du plastome de N. tabacum, cv. Petit
  24. 24. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques comprenant au moins les étapes suivantes : transformation de cellules végétales avec un vecteur adapté à la transformation des plastes, - sélection des cellules comprenant les plastes transformés, - régénération de plantes transplastomiques à partir des cellules transformées, caractérisé en ce que le vecteur adapté à la transformation des plastes est un vecteur selon l'une des revendications 18,20 à 23.
  25. 25. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 24 caractérisé en ce que la transformation des cellules est effectuée par biolistique.
  26. 26. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques comprenant au moins les étapes suivantes : - transformation de cellules végétales avec un vecteur adapté à la transformation des plastes, - sélection des cellules comprenant les plastes transformés, régénération de plantes transplastomiques à partir des cellules transformées,
    <Desc/Clms Page number 23>
    caractérisé en ce que le vecteur adapté à la transformation des plastes est un vecteur selon l'une des revendications 19 à 23.
  27. 27. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 26 caractérisé en ce que la transformation des cellules est effectuée par biolistique.
  28. 28. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon l'une des revendications 24 à 27 caractérisé en ce que la sélection des plantes transformées est réalisée à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD.
  29. 29. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon l'une des revendications 26 ou
    27 dans lequel la sélection des cellules transformées est réalisée avec un inhibiteur de l'HPPD associé à un autre agent de sélection.
  30. 30. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 29 dans lequel on applique de façon simultanée un inhibiteur de l'HPPD et de la spectinomycine.
  31. 31. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 29 dans lequel on applique de façon simultanée un inhibiteur de l'HPPD et de la streptomycine.
  32. 32. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 29 dans lequel on applique de façon simultanée un inhibiteur de l'HPPD, de la spectinomycine et de la streptomycine.
  33. 33. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon l'une des revendications 26 ou
    27 comprenant en outre une étape de sélection supplémentaire effectuée sur les plantes régénérées.
  34. 34. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 33 caractérisé en ce que l'étape de sélection supplémentaire consiste en l'application d'un inhibiteur de l'HPPD.
  35. 35. Cellule végétale transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un gène chimère selon l'une des revendications 1 ou 14.
    <Desc/Clms Page number 24>
  36. 36. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD, caractérisée en ce qu'elle est régénérée à partir des cellules transformées selon la revendication 35.
  37. 37. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comprenant un gène chimère selon la revendication 1.
  38. 38. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comprenant un gène chimère selon la revendication 14.
  39. 39. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon les revendications 36 à 38 caractérisée en ce que la plante est hétéroplasmique.
  40. 40. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon les revendications 36 à 38 caractérisée en ce que la plante est homoplasmique.
  41. 41. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'une quelconque des revendications 36 à 40 caractérisée en ce qu'elle est du type monocotylédones telles que les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comine le tabac, le soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle.
  42. 42. Graine de plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'une des revendications 36 à 41.
  43. 43. Procédé de désherbage sélectif de plantes à l'aide d'un herbicide inhibiteur de l'HPPD, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes selon l'une des revendications 36 à 41.
  44. 44. Procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines selon la revendication 42 ou des plantes transplastomiques selon l'une des revendications 36 à 41, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformée avec le dit gène chimère selon l'une des renvendications 1 ou 14.
  45. 45. Procédé de culture des plantes transplastomiques selon l'une des revendications 36 à
    41, caractérisé en ce qu'il consiste à semer les graines des dites plantes dans une
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    surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
  46. 46. Procédé selon l'une des revendications 44 ou 45, caractérisé en ce que l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD est faite en présemis, en prélevée et/ou en postlevée de la culture.
  47. 47. Procédé selon l'une des revendications 43 à 46, caractérisé en ce que les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont choisis parmi les isoxazoles en particulier l'isoxaflutole, les dicétonitriles en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-2,3 CI2 phényl) propane-
    1,3-dione, les tricétones, en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou les pyrazolinates.
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