FR2796954A1 - Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fusionnee a un peptide signal, sequence d'adn et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique codant pour une hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD) fusionnée à un peptide signal, un gène chimère contenant cette séquence comme séquence codante et son utilisation pour l'obtention de plantes résistantes à certains herbicides.La protéine de fusion selon l'invention est constituée par une HPPD fusionnée à son extrémité C-terminale ou N-terminale à une séquence protéique signal permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes.

Description

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Hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase fusionnée à un peptide signal, séquence d'ADN et obtention de plantes contenant un tel gène, tolérantes aux herbicides.

La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique codant pour une hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD) fusionnée à un peptide signal, un gène chimère contenant cette séquence comme séquence codante et son utilisation pour l'obtention de plantes résistantes à certains herbicides.

Les hydroxy-phényl pyruvate dioxygénases sont des enzymes qui catalysent la réaction de transformation du para-hydroxy-phényl-pyruvate (HPP) en homogentisate.

Cette réaction a lieu en présence de fer (Fe2+) en présence d'oxygène (Crouch N. P. & al., Tetrahedron, 53,20, 6993-7010,1997).

On connaît par ailleurs certaines molécules inhibitrices de cette enzyme, qui viennent se fixer à l'enzyme pour inhiber la transformation de l'HPP en homogentisate.

Certaines de ces molécules ont trouvé un emploi comme herbicides, dans la mesure où l'inhibition de la réaction dans les plantes conduit à un blanchiment des feuilles des plantes traitées, et à la mort des dites plantes (Pallett K. E. et al. 1997 Pestic. Sci. 50 83-84). De tels herbicides ayant pour cible l'HPPD décrits dans l'état de la technique sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-l,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-l-(2-SO2 CH3-4-2,3 Cl2 phényl) propane-1, 3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou encore les pyrazolinates.

Des essais pour confirmer que l'HPPD est bien la cible des dicétonitriles (DKN) et pour mettre en évidence que l'HPPD est, au moins à certaines doses, la cible unique des dicétonitriles ont été effectués en laboratoire en faisant germer des graines d'Arabidopsis sur trois types de milieux en conditions stériles in-vitro : 1 milieu Murashig et Skoog( Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for a rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15, 473-479), expérience contrôle de la germination 2 milieu MS plus DKN à la dose de 1 ppm

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3 milieu MS plus DKN à la même dose + Homogentisate à la concentration de 5 mM.

Il est très net que sur le milieu 1 la germination se fait normalement, chaque plantule développant deux cotylédons bien verts. Le développement se fait ensuite normalement. Sur le milieu 2, la germination a lieu mais la plantule qui émerge est blanche, les deux cotylédons ne présentant aucune pigmentation. Les plantules meurent ensuite en quelques jours. Sur le milieu 3, la germination se fait normalement, les cotylédons sont bien verts. Les plantules se développent mais très rapidement, la quantité d'homogentisate dans le milieu diminuant, les premiers symptômes de blanchiment apparaissent et la croissance des plantes s'arrêtent, elles finissent par mourir comme dans l'essai effectué sur le milieu n 2.

Ceci permet de confirmer que l'HPPD est bien la cible des DKN in planta et qu'elle semble être la cible unique. Ceci montre aussi que l'homogentisate est transporté du milieu de culture jusqu'au site cellulaire où il est nécessaire pour le bon fonctionnement de la cellule et la survie de la plante.

Pour rendre les plantes tolérantes aux herbicides, on dispose de trois stratégies principales, (1) la détoxification de l'herbicide par une enzyme venant transformer l'herbicide, ou son métabolite actif, en produits de dégradation non toxique, comme par exemple les enzymes de tolérance au bromoxynil ou au basta (EP 242 236, EP 337 899) ; (2) la mutation de l'enzyme cible en une enzyme fonctionnelle moins sensible à l'herbicide, ou son métabolite actif, comme par exemple les enzymes de tolérance au glyphosate (EP 293 356, Padgette S. R. & al., J. Biol. Chem., 266,33, 1991) ; ou (3) la surexpression de l'enzyme sensible, de manière à produire dans la plante des quantités suffisantes d'enzyme cible au regard des constantes cinétiques de cette enzyme vis à vis de l'herbicide de manière à avoir suffisamment d'enzyme fonctionnelle, malgré la présence de son inhibiteur.

C'est cette troisième stratégie qui a été décrite pour obtenir avec succès des plantes tolérantes aux inhibiteurs d'HPPD (WO 96/38567), étant entendu que pour la première fois une stratégie de simple surexpression de l'enzyme cible sensible (non mutée) était employée avec succès pour conférer aux plantes une tolérance à un niveau agronomique à un herbicide.

Alors que les HPPD de plantes sont des enzymes à localisation cytoplasmiques (Garcia, I., et al. 1997. Biochem. J. 325 :761-769..), il a également été montré que la

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meilleure tolérance était obtenue lorsque l'HPPD exogène était accumulée dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes.

Ces résultats montrent d'une part que l'homogentisate peut être transporté du milieu extérieur vers le site intra cellulaire où il est nécessaire pour complémenter une inhibition de l'HPPD endogène, et d'autre part que l'accumulation d'une HPPD exogène dans la cellule au niveau des plastes ou du cytoplasme permet le même type de complémentation permettant l'obtention de plantes génétiquement modifiées tolérantes aux herbicides inhibiteurs d'HPPD.

On a maintenant constaté que l'adressage d'une HPPD exogène dans d'autres compartiments cellulaires que le cytoplasme ou les plastes, permettait d'améliorer la tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD par rapport à un simple adressage cytoplasmique.

La présente invention concerne donc une protéine de fusion constituée par une HPPD fusionnée à son extrémité C-terminale ou N-terminale à une séquence protéique signal permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes (en particulier chloroplastes).

Par HPPD, on entend selon l'invention toute enzyme HPPD native, mutée ou chimère, présentant l'activité HPPD. De nombreuses HPPD sont décrites dans la littérature, notamment les notamment les HPPD de bactéries comme Pseudomonas (Ruetschi & al., Eur. J. Biochem., 205,459-466, 1992, WO 96/38567), de plantes comme d'Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834) ou de carotte (WO 96/38567, Genebank 87257), de Coccicoides (Genebank COITRP), ou de mammifères comme la souris ou le cochon.

Par HPPD mutée, on entend selon l'invention les HPPD mutées pour obtenir des propriétés de tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD améliorées par rapport à l'HPPD native correspondante. De manière avantageuse, l'HPPD mutée est une HPPD mutée dans sa partie C-terminale telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.

Par HPPD chimère, on entend une HPPD comprenant des éléments provenants de différentes HPPD, notamment les HPPD chimères décrites dans la demande de brevet WO 99/24586.

De manière avantageuse, l'HPPD est une HPPD de Pseudomonas fluorescens (WO 96/38567).

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De manière avantageuse, l'HPPD mutée comprend la mutation W336 telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.

Il est connu dans la littérature que l'ajout d'une séquence codante correspondant à un peptide supplémentaire en N-ou C-terminal de la protéine va permettre le transport de celle ci vers un autre compartiment cellulaire que le cytoplasme où l'ARNm est traduit. Ce peptide dit peptide signal ou peptide de transit selon les cas, selon sa séquence va permettre le routage vers cet autre compartiment qui peut être par exemple le plaste (membrane ou stroma), le lumen du thylakoide ou la membrane du thylakoide, vers le réticulum endoplasmique, vers la vacuole, la paroi cellulaire, les mitochondries, l'appareil de golgi, le noyau, la membrane nucléaire, sans que cela soit exhaustif
Par séquence protéique signal, on entend selon l'invention tout peptide signal ou de transit permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes (en particulier chloroplastes).

Le rôle de telles séquences protéiques sont notamment décrites dans le numéro 38 de le revue Plant molecular Biology (1998) consacré en grande partie aux transports des protéines dans les différents compartiments de la cellule végétale (Sorting of proteins to vacuoles in plant cells pp 127-144 ; the nuclear pore complex pp145-162; protein translocation into and across the chloroplastic enveloppe membranes pp 91-207 ; multiple pathways for the targeting of thylakoid proteins in chloroplasts pp 209-221 ; protein import in plants pp 311-338).

De manière avantageuse, la séquence protéique signal permet l'adressage de l'HPPD vers le compartiment vacuolaire (vacuole). De tels peptides sont largements décrits dans la littérature (Neuhaus J.M. and Rogers J.C Sorting of proteins to vacuoles in plant cellsPlant molecular Biology 38 : 127-144, 1998).

De préférence, le peptide vacuolaire de la protéine MsaCiB décrite dans J.M.

Ferullo et al (Plant Molecular Biology 33 : 1997) (SEQ ID NO 1 ou 2) que l'on sait maintenant être localisée dans la vacuole, fusionné à la partie C-terminale de l'HPPD.

De manière préférentielle, la protéine de fusion est décrite par l'identificateur de séquence n 3 ou 4 (SEQ ID NO 3 ou 4) avec sa séquence codante.

La présente invention concerne également une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'invention.

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La présente invention concerne également les séquences capables de s'hybrider de manière sélective avec la séquence d'acide nucléique ci-dessus, les séquences homologues à la séquence ci-dessus, les fragments des dites séquences, et les séquences qui diffèrent des séquences ci-dessus mais qui du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour la même protéine de fusion.

Selon la présente invention, on entend par séquence d'acide nucléique une séquence nucléotidique ou polynucléotide, pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin.

Par séquence capable de s'hybridiser de manière sélective , on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec les séquences ci-dessus à un niveau suppérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridiqtion d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présentes dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybridiser de manière sélective et les séquences définies par les séquence ID ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple , par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCI 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50 C-60 C). L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual).

Par homologue , on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion selon l'invention. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence selon l'invention et l'homologue correspondant peuvent être importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces

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modifications sont généralement et de préférence neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la protéine de fusion. Cette définition s'applique également à la séquence protéique de la protéine de fusion, les mutations étant dans ce cas au niveau des acides aminés et les degrés d'homologie étant définis par rapport à la séquence primaire de la protéine de fusion.

Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J. Mol.

Evol. 36 :290-300 ; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10).

Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont également connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le package UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Deverexu & al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395).

Par fragments , on entend selon l'invention des fragments des séquences dADN selon l'invention, c'est à dire les séquences ci-dessus pour lesquelles des parties ont été délétées mais qui conservent la fonction des dites séquences, c'est à dire la fonbction d'adressage pour le petide signal et l'activité HPPD pour la protéine HPPD.

L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'invention dans un procédé pour la transformation des plantes, comme gène marqueur ou comme séquence codante permettant de conférer à la plante une tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD. Cette séquence peut bien entendu également être utilisée en association avec d'autre (s) marqueur (s) séquence (s) pour une ou plusieurs propriétés agronomiques.

La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végétales ou les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion telle que définie précédemment.

Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production d'HPPD mutée. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de

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champignons, en particulier Aspergillus, d'un baculovirus, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.

Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.

On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.

Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes.

Promoteurs
Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 311).

De manière préférentielle, le promoteur est choisi parmi les promoteurs lumière dépendants (WO 99/25842), le promoteur d'actine de riz, les promoteurs d'histone et les

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promoteurs consitués par la fusion d'un promoteur d'histone et du premier intron de l'actine de riz (WO 99/34005).

Eléments de transcription
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec le promoteur COMTII selon l'invention, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (VMT) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.

Terminateur
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, d'origine virale, comme par exemple le terminateur du CaMV 35S, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.

La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.

Selon au autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur comprend outre le gène chimère selon l'invention au moins un deuxième gène chimère fonctionnelle dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée.

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Par exemple, si le premier gène chimère selon l'invention permet un adressage de l'HPPD dans la vacuole, le deuxième gène chimère peut être un autre gène chimère selon l'invention permettant l'adressage de l'HPPD dans le lumen du thylakoide ou la membrane du thylakoide, dans le réticulum endoplasmique,, la paroi cellulaire ou les mitochondries, ou un gène chimère tel que décrit dans l'état de la technique permetant l'adressage de l'HPPD soit dans le cytoplasme, soit dans les chloroplastes.

Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le deuxième gène chimère permet l'adressage de l'HPPD dans les chloroplastes. Il comprend outre les éléments de régulations définis ci-dessus, permettant l'expression de la séquence codante dans un organisme hôte, une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD.

Le peptide de transit permet d'adresser l'HPPD chimère dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes, la protéine de fusion étant clivée entre le peptide de transit et l'HPPD chimère au passage de la membrane des plastes. Le peptide de transit peut être simple, comme un peptide de transit d'EPSPS (décrit dans le brevet US 5,188,642) ou un peptide de transit de celui de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (ssu RuBisCO) d'une plante, éventuellement comprenant quelques acides aminés de la partie N-terminale de la ssu RuBisCO mature (EP 189 707) ou encore un peptide de transit multiple comprenant un premier peptide de transit de plante fusionné à une partie de la séquence N-terminale d'une protéine mature à localisation plastidiale, fusionnée à un deuxième peptide de transit de plante tel que décrit dans le brevet EP 508 909, et plus particulièrement le peptide de transit optimisé comprenant un peptide de transit de la ssu RuBisCO de tournesol fusionné à 22 acides aminés de l'extrémité N-terminale de la ssu RuBisCO de maïs fusionnée au peptide de transit de la ssu RuBisCO de maïs tel que décrit avec sa séquence codante dans le brevet EP 508 909.

De tels gènes chimères sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 96/38567, WO 99/25842, WO 99/24585, WO 99/24586, WO 99/34005.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur comprend outre le gène chimère selon l'invention, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt. Il peut s'agir d'un gène codant pour un marqueur de sélection comme d'un gène conférant à la plante transformée de nouvelles propriétés agronomiques, ou d'un gène d'amélioration de la

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qualité agronomique de la plante transformée.

Marqueurs de Sélection
Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.

Gènes d'intérêt
Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une résistance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies, etc. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.

Tolérance herbicide
Parmi les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, on peut citer le gène Bar conférant une tolérance au bialaphos, le gène codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible comme le glyphosate et ses sels (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2 736 926), le gène codant pour la glyphosate oxydoréductase (US 5,463,175).

Parmi les gènes codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible, on citera plus particulièrement le gène codant pour une EPSPS végétale, en particulier de maïs, présentant deux mutations 102 et 106, décrit dans la demande de brevet FR 2 736 926, dénommé ci-dessous EPSPS double mutant, ou encore le gène codant pour une EPSPS isolée d'Agrobacterium décrit par les séquences ID 2 et ID 3 du brevet US 5,633,435, dénommé ci-dessous CP4.

Dans les cas des gènes codant pour EPSPS, et plus particulièrement pour les gènes ci-dessus, la séquence codant pour ces enzymes est avantageusement précédée par une séquence codant pour un peptide de transit, en particulier pour le peptide de transit tel que défini ci-dessus.

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Résistance aux Insectes
Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).

Résistance aux Maladies
Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l'oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore les peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et WO 99/09189), la drosomicine (WO 99/02717) ou la thanatine (WO 99/24594).

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; & al., 1995).

Modification de la qualité
On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (Korit, A. A. & al., Eur. J. Biochem. (1991) 195, 329-334; WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine et/ou la méthionine excédentaire, permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant. On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines, les dits peptides ayant également une activité antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que

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les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants : l'androctonine, la drosomicine ou la thanatine.

L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins une séquence d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.

Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG. L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.

La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant un gène chimère comprenant une séquence codante pour une protéine de fusion définie ci-dessus. De préférence, le gène chimère est intégré de manière stable dans le génome de l'organisme hôte.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte, et plus particulièrement la cellule végétale, comprend outre le gène chimère selon l'invention au moins un deuxième gène chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée tel que défini ci-dessus.

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte, et plus particulièrement la cellule végétale, comprend outre le gène chimère selon l'invention, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt tel qu edéfini ci-dessus.

Les différents gènes chimères peuvent être intégrés dans le génome de l'organisme hôte par transformation au moyen d'un vecteur selon l'invention comprenant les différents

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gènes chimères tels que définis ci-dessus.

Les différents gènes chimères peuvent également être intégrés de manière stable dans le génome de l'organisme hôte par co-transformation au moyen de plusieurs vecteurs, chacun comprenant au moins un gène chimère devant être intégré dans le génome de l'organisme hôte.

La présente invention a encore pour objet les plantes transformées, dans le génome desquelles au moins un gène chimère selon l'invention est intégré de manière stable. Les plantes selon l'invention contiennent des cellules transformées telles que définies ci- dessus, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées ci-dessus. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants : US4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.

La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes transformées comprennent outre le gène chimère selon l'invention au moins un deuxième gène chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée tel que défini ci-dessus.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les plantes transformées comprennent outre le gène chimère selon l'invention, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt tel que défini ci-dessus.

Les différents gènes chimères dans les plantes transformées selon l'invention

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peuvent provenir soit de la même plante transformée parente, et dans ce cas la plante est issue d'un seul procédé de transformation/régénération avec les différents gènes chimères contenus dans un même vecteur ou par co-transformation au moyen de plusieurs vecteurs.

Elle peut également être obtenue par le croisement de plantes parentes contenant chacune au moins un gène chimère , l'une des plantes parentes comprenant au moins un gène chimère selon l'invention.

Les plantes transformées pouvant être obtenues selon l'invention peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comme par exemple le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle, etc.

L'invention a aussi pour objet un procédé de désherbage sélectif de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD notamment un herbicide définit auparavant, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.

La présente invention concerne également un procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'invention, lequel procédé consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformée avec le dit gène chimère selon l'invention.

La présente invention concerne également un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention avec un gène chimère selon l'invention lequel procédé consiste à semer les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD défini ci- dessus en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.

Dans les deux procédés ci-dessus, l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD peut être faite selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.

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Par herbicide au sens de la présente invention on entend une matière active herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par exemple un agent augmentant l'activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais safener). Les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont en particulier définis auparavant. Bien entendu, pour leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont associée de manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en agrochimie
Lorsque la plante transformée selon l'invention comprend un autre gène de tolérance à un autre herbicide (comme par exemple un gène codant pour une EPSPS mutée ou non conférant à la plante une tolérance au glyphosate), ou lorsque la plante transformée est naturellement insensible à un autre herbicides, le procédé selon l'invention peut comprendre l'application simultanée ou décalée dans le temps d'un inhibiteur d'HPPD en association avec ledit herbicide, par exemple le glyphosate.

L'invention a encore pour objet l'utilisation du gène chimère codant pour une protéine de fusion selon l'invention comme gène marqueur au cours du cycle "transformation-régénération" d'une espèce végétale et sélection sur l'herbicide ci-dessus.

Lorsque le gène chimère selon l'invention est combiné dans un même vecteur à un autre gène chimère codant pour une protéine d'intérêt conférant de nouvelles propriétés agronomiques autre qu'un gène de tolérance herbicide (résistance aux insectes, résistance aux maladies, modification de la qualité), l'application de l'herbicide inhibiteur d'HPPD sur les plantes transformées et leurs descendances, permet de sélectionner dans les champs les plantes issues d'un croisement entre une plante parente comprenant les deux gènes chimères et une plante non transformée qui auront conservé les gènes chimères.

Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.

Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley-Interscience (1989) ou dans Molecular cloning, T.Maniatis, E. F.Fritsch, J.Sambrook,1982.

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Exemple 1 : Constructions des différents gènes pour l'expression dans le tabac
A) Clone 0 : un dérivé de pRP O décrit dans le brevet WO 96/38567 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - terminateur nos. Pour obtenir le clone O. pRP 0 a été digéré par Sac I et Pvu II, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pPZP 212 préalablement digéré par Sac I et Sma I décrit dans P. Hajdukiewicz et al Plant Molecular Biology 25 : 989-994, 1994.

B) Clone Q: un dérivé de pRP Q décrit dans le brevet WO 96/38567 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - OTP - gène HPPD - terminateur nos. Pour obtenir le clone Q, pRP Q a été digéré par Sac I et Pvu II, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pPZP 212 préalablement digéré par Sac I et Sma I, pPZP 212. ,
C) Clone vacuole : le peptide vacuole utilisé dans le cadre de ce travail est celui décrit dans l'article suivant : J. M. Ferullo et al Plant Molecular Biology 33 : 1997
Peptide de transit vacuole : Ce peptide a été réalisé à l'aide de deux PCR successives.

La première est réalisée dans le but de synthétiser le peptide de transit vacuole. Les oligonucléotides choisis ont les séquence suivantes : VAC 1 : 5' AAGATCAAGG ACAAAATTCA TGGTGAAGGT GCAGATGGTG AAAAGAAAAA
GAAGAAGGAG AAGAAGAAAC ATG 3' VAC 2 : 5' ATCACTGTCA CTGCTGCTGC TATCATGGCC ATGTTCATGA CCCTCTCCAT
GTTTCTTCTT CTCCTTCTTC 3'
Ces oligonucléotides s'hybrident l'un à l'autre dans la région figurée en gras et permettent ainsi de reconstituer le peptide transit vacuole qui comporte 123 paires de bases.

La réaction a été réalisée dans un appareil PCR HYBAID avec la Taq polymerase PERKIN ELMER dans son tampon dans les conditions standards, c'est à dire pour 50 l de réaction on mélange les dNTP à 200uM, la Taq polymérase à 2,5 unités et 0,5 l de chaque oligonucléotide à 10 M. Un seul cycle PCR a été réalisé, il se compose de 5 min à 95 C puis 1 min à 64 C puis 10 min à 72 C.

La seconde PCR a servi à ajouter les sites de restriction Xcm I et Sal I nécessaire au clonage dans pRP O. Les oligonucléotides utilisés ont pour séquences :

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VAC 3:5' ACGTCCAGGT GCGTCGTGGT GTATTGACCG CCGATAAGAT CAAGGACAAA ATTC 3' VAC4:5' ACGTGTCGAC TTAATCACTG TCACTGCTGC TG 3'
Ces oligonucléotides permettent d'obtenir un fragment amplifié de 169 paires de bases. La réaction a été réalisée dans un appareil PCR HYBAID avec la Taq polymerase PERKIN ELMER dans son tampon dans les conditions standards, c'est à dire pour 50ptl de réaction on mélange les dNTP à 200uM, la Taq polymérase à 2,5 unités, 0,5 ul de chaque oligonucléotides à 10 M et lui de la première PCR . Le programme d'amplification utilisé est, 4 min à 95 C puis 35 cycles <30 sec 95 C, 30 sec 66 C, 1 min 72 C> suivi de 10 min à 72 C. n pRP O - vacuole : un dérivé de pRP 0 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - peptide de transit vacuole - terminateur nos. Pour le construire le plasmide pRP 0 a été digére par Xcm I et Sal 1 puis ligué sur le peptide transit vacuole préalablement purifié et digéré par Xcm I et Sal I. n - clone vacuole : un dérive de pRP 0 - vacuole contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - peptide de transit vacuole - terminateur nos. Pour obtenir le clone vacuole , pRP 0 - vacuole a été digéré par Sac I et Pvu II, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pPZP 212 préalablement digéré par Sac I et Sma I.

Exemple 2 : Expression d'HPPD de Pseudomonas fluorescens dans le tabac
A) Transformation du Tabac "Petit havana" pour obtention de plantes : sélection kanamycine.

Les gènes chimères décrits précédemment ont été transférés dans du tabac "Petit havana" selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n 0 508 909.

1) Transformation :
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium tumefaciens EHA 105.

2) Régénération:
La régénération du tabac "Petit havana" à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashig et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 350mg/l de céfotaxime et 200 mg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés

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sur des plants en serre et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985, Vol 227, p1229-1231) en trois étapes successives : - la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/I de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 200 mg/ml de kanamycine.

- Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose et 200 mg/ml de kanamycine, mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours.

- Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres 200 mg/ml de kanamycine et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.

La tolérance des plantes transformées est étudiée par semis sur un sol traité à l' isoxaflutole.

B) Transformation du Tabac "Petit havana" pour évaluation des construits en terme de tolérance au cours de la phase de transformation / régénération : sélection kanamycine et dicétonitrile.

1) La transformation est effectuée comme précédemment.

2) La régénération du tabac "Petit havana" à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/l de saccharose ainsi que 350mg/l de céfotaxime et 200 mg/1 de kanamycine et des doses variables de la 2-cyano-3- cyclopropyl-l-(2-méthylsulfonyl-4-trifluorométhylphényl) propan-1,3-dione, 2,5 ppm, 3,125 ppm, 3,75 ppm. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985, Vol 227, p1229-1231) en deux étapes successives : - la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/I de benzylaminopurine (BAP) pendant 19 jours et kanamycine + les doses variables d'herbicide.

- La deuxième correspond à un repiquage des disques foliaires (sur lesquels des cals et des pousses se sont formés) sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose

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contenant 0.01mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 3 jours et kanamycine + les doses variables d'herbicide ;la mesure de la tolérance est effectuée à ce moment là.

3) Mesure de la tolérance à l'herbicide des plantules in- vitro .

Les expériences sont réalisées par action de l'isoxaflutole (ou plus précisement du dicétonitrile correspondant à l'isoxaflutole) sur les pousses.

Si au cours de la transformation, des pousses apparaissent ceci signifie qu'elles ont intégrées le gène de tolérance à la kanamycine ; elles ont intégrées le gène de tolérance à la kanamycine cela signifie aussi qu'elles ont intégré le gène permettant l'expression de l'HPPD dde Pseudomonas fluorescens et sa localisation finale dans le cytoplasme, ou le chloroplaste ou encore dans la vacuole. En effet ces deux gènes ou construits sont liés sur le T-DNA. Si les pousses sont blanches cela signifie qu'elles sont issues d'une cellule qui a intégré le gène de tolérance à la kanamycine (sinon la pousse n'apparaitrait pas) et le gène de tolérance HPPD mais que celui n'est pas suffisant pour induire une tolérance à l'herbicide. Le pourcentage de plantules vertes par rapport au nombre de plantules (blanches et vertes) est donc une mesure de la tolérance induite par le gène.

Cette expérience a été réalisée en utilisant différentes concentrations d'inhibiteur d'HPPD, le RPA 202248 (qui est le dicétonitrile de l'isoxaflutole), 2,5 ppm, 3,125 ppm et 3,75 ppm. Le comptage a été effectué en comptant toutes les pousses blanches ou vertes puis toutes les pousses vertes, résultat dans le tableau ci-dessous.

Tableau récapitulatif de la tolérance induite par les différentes localisation HPPD
Localisation de l'HPPD % de pousses vertes à
2,5ppm 3,125ppm cytoplasme 3,1 3,7 chloroplates 17, 2 8,6 vacuole 10,1 9
Ces résultats confirment que l'adressage de l'HPPD dans la vacuole permet d'obtenir un pourcentage de pousses vertes voisin de celui observé pour un adressage dans les chloroplastes (en particulier à 3,125 ppm), et en tous cas supérieur au pourcentage

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obtenu avec un adressage cytoplasmique, bien que l'HPPD native soit localisée dans le cytoplsame.

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LISTE DE SEQUENCES <110> RHONE-POULENC AGRO <120> Hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase fusionnée à un peptide signal, séquence d'ADN et obtention de plantes contenant un tel gène, tolérantes aux herbicides.

<140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 120 <212> ADN <213> synthetic construct <220> <221> CDS <222> (1)..(120) <400> 1 aag atc aag gac aaa att cat ggt gaa ggt gca gat ggt gaa aag aaa 48 Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly Ala Asp Gly Glu Lys Lys
1 5 10 15 aag aag aag gag aag aag aaa cat gga gag ggt cat gaa cat ggc cat 96 Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys His Gly Glu Gly His Glu His Gly His
20 25 30 gat agc agc agc agt gac agt gat 120 Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp
35 40 <210> 2 <211> 40 <212> <213> synthetic construct <400> 2 Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly Ala Asp Gly Glu Lys Lys
1 5 10 15 Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys His Gly Glu Gly His Glu His Gly His
20 25 30 Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp
35 40 <210> 3 <211> 1194 <212> ADN <213> synthetic construct <220> <221> CDS <222> (1)..(1194) <400> 3 atg gca gat cta tac gaa aac cca atg ggc ctg atg ggc ttt gaa ttc 48 Met Ala Asp Leu Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe 1 5 10 15

<Desc/Clms Page number 22>

atc gaa ttc gcg tcg ccg acg ccg ggt acc ctg gag ccg atc ttc gag 96 Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu
20 25 30 atc atg ggc ttc acc aaa gtc gcg acc cac cgt tcc aag aac gtg cac 144 Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His
35 40 45 ctg tac cgc cag ggc gag atc aac ctg atc ctc aac aac gag ccc aac 192 Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn
50 55 60 agc atc gcc tcc tac ttt gcg gcc gaa cac ggc ccg tcg gtg tgc ggc 240 Ser Ile Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly
65 70 75 80 atg gcg ttc cgc gtg aag gac tcg caa aag gcc tac aac cgc gcc ctg 288 Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu
85 90 95 gaa ctc ggc gcc cag ccg atc cat att gac acc ggg ccg atg gaa ttg 336 Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu
100 105 110 aac ctg ccg gcg atc aag ggc atc ggc ggc gcg ccg ttg tac ctg atc 384 Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile
115 120 125 gac cgt ttc ggc gaa ggc agc tcg atc tac gac atc gac ttc gtg tac 432 Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr
130 135 140 ctc gaa ggt gtg gag cgc aat ccg gtc ggt gca ggt ctc aaa gtc atc 480 Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile 145 150 155 160 gac cac ctg acc cac aac gtc tat cgc ggc cgc atg gtc tac tgg gcc 528 Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala
165 170 175 aac ttc tac gag aaa ttg ttc aac ttc cgt gaa gcg cgt tac ttc gat 576 Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp
180 185 190 atc aag ggc gag tac acc ggc ctg act tcc aag gcc atg agt gcg ccg 624 Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro
195 200 205 gac ggc atg atc cgc atc ccg ctg aac gaa gag tcg tcc aag ggc gcg 672 Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala
210 215 220 ggg cag atc gaa gag ttc ctg atg cag ttc aac ggc gaa ggc atc cag 720 Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln 225 230 235 240 cac gtg gcg ttc ctc acc gac gac ctg gtc aag acc tgg gac gcg ttg 768 His Val Ala Phe Leu Thr Asp Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu
245 250 255 aag aaa atc ggc atg cgc ttc atg acc gcg ccg cca gac act tat tac 816 Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr
260 265 270

<Desc/Clms Page number 23>

gaa atg ctc gaa ggc cgc ctg cet gac cac ggc gag ccg gtg gat caa 864 Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asp His Gly Glu Pro Val Asp Gln
275 280 285 ctg cag gca cgc ggt atc ctg ctg gac gga tct tcc gtg gaa ggc gac 912 Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Val Glu Gly Asp
290 295 300 aaa cgc ctg ctg ctg cag atc ttc tcg gaa acc ctg atg ggc ccg gtg 960 Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val 305 310 315 320 ttc ttc gaa ttc atc cag cgc aag ggc gac gat ggg ttt ggc gag ggc 1008 Phe Phe Glu Phe Ile Gln Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Glu Gly
325 330 335 aac ttc aag gcg ctg ttc gag tcc atc gaa cgt gac cag gtg cgt cgt 1056 Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg Asp Gln Val Arg Arg
340 345 350 ggt gta ttg acc gcc gat aag atc aag gac aaa att cat ggt gaa ggt 1104 Gly Val Leu Thr Ala Asp Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly
355 360 365 gca gat ggt gaa aag aaa aag aag aag gag aag aag aaa cat gga gag 1152 Ala Asp Gly Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys His Gly Glu
370 375 380 ggt cat gaa cat ggc cat gat agc agc agc agt gac agt gat 1194 Gly His Glu His Gly His Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp 385 390 395 <210> 4 <211> 398 <212> <213> synthetic construct <400> 4 Met Ala Asp Leu Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe
1 5 10 15 Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu
20 25 30 Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His
35 40 45 Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn
50 55 60 Ser Ile Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly
65 70 75 80 Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu
85 90 95 Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu
100 105 110 Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile
115 120 125 Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr
130 135 140

<Desc/Clms Page number 24>

Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile 145 150 155 160 Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala
165 170 175 Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp
180 185 190 Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro
195 200 205 Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala
210 215 220 Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln 225 230 235 240 His Val Ala Phe Leu Thr Asp Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu
245 250 255 Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr
260 265 270 Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asp His Gly Glu Pro Val Asp Gln
275 280 285 Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Val Glu Gly Asp
290 295 300 Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val 305 310 315 320 Phe Phe Glu Phe Ile Gln Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Glu Gly
325 330 335 Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg Asp Gln Val Arg Arg
340 345 350 Gly Val Leu Thr Ala Asp Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly
355 360 365 Ala Asp Gly Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys His Gly Glu
370 375 380 Gly His Glu His Gly His Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp 385 390 395 <210> 5 <211> 73 <212> ADN <213> synthetic construct <400> 5 aagatcaagg acaaaattca tggtgaaggt gcagatggtg aaaagaaaaa gaagaaggag 60 aagaagaaac atg 73 <210> 6 <211> 70 <212> ADN <213> synthetic construct <400> 6 atcactgtca ctgctgctgc tatcatggcc atgttcatga ccctctccat gtttcttctt 60

<Desc/Clms Page number 25>

ctccttcttc 70 <210> 7 <211> 54 <212> ADN <213> synthetic construct <400> 7 acgtccaggt gcgtcgtggt gtattgaccg ccgataagat caaggacaaa attc 54 <210> 8 <211> 32 <212> ADN <213> synthetic construct <400> 8 acgtgtcgac ttaatcactg tcactgctgc tg 32

Claims (38)

REVENDICATIONS

1. Protéine de fusion constituée par une HPPD fusionnée à son extrémité C- terminale ou N-terminale à une séquence protéique signal permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes.

2. Protéine de fusion selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'HPPD est une enzyme HPPD native, mutée ou chimère, présentant l'activité HPPD.

3. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'HPPD est choisie parmi les HPPD de bactéries comme Pseudomonas, de plantes comme d'Arabidopsis ou de carotte, de Coccicoides, ou de mammifères comme la souris ou le cochon.

4. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'HPPD est une HPPD de Pseudomonas,fluorescens.

5. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'HPPD est une HPPD mutée dans sa partie C-terminale.

6. Protéine de fusion selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'HPPD mutée comprend la mutation W336.

7. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 4 , caractérisée en ce que l'HPPD est une HPPD chimère comprenant des éléments provenants de différentes HPPD.

8. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la séquence protéique signal permet l'adressage de l'HPPD vers le lumen du thylakoide ou la membrane du thylakoide, vers le réticulum endoplasmique, vers la vacuole, la paroi cellulaire, les mitochondries, l'appareil de golgi, le noyau, la membrane nucléaire.

9. Protéine de fusion selon la revendication 8, caractérisée en ce que la séquence protéique signal permet l'adressage de l'HPPD vers le compartiment vacuolaire (vacuole).

10. Protéine de fusion selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence protéique signal est décrite par la SEQ ID NO 1.

11. Protéine de fusion selon la revendication 10, caractérisée en ce que la séquence protéique signal est fusionnée à la partie C-terminale de l'HPPD.

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12. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est décrite par l'identificateur de séquence n 4 (SEQ ID NO 4).

13. Séquence d'acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 12.

14. Gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végétales ou les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon les revendications 1 à 12.

15. Gène chimère selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les cellules végétales ou les plantes.

16. Gène chimère selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique est représentée par la SEQ ID NO 3.

17. Vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère selon les revendications 14 à 16.

18. Vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16 au moins un deuxième gène chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée.

19. Vecteur selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que le deuxième gène chimère permet l'adressage de l'HPPD dans les chloroplastes, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD.

20. Vecteur selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt.

21. Organisme hôte transformé caractérisé en ce qu'ils contiennent un gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16.

22. Organisme hôte selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16 au moins un deuxième gène

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chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée.

23. Organisme hôte selon la revendication 22, caractérisé en ce que le deuxième gène chimère permet l'adressage de l'HPPD dans les chloroplastes, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD.

24. Organisme hôte selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt.

25. Organisme hôte selon l'une des revendications 21 à 24, caractérisé en ce qu'il est une cellule végétale.

26. Organisme hôte selon la revendication 25, caractérisé en ce que les cellules végétales sont choisies parmi les cellules de plantes du type monocotylédones telles que les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comme le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle.

27. Plantes transformées, dans le génome desquelles au moins un gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16 est intégré de manière stable.

28. Plante selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle contient des cellules transformées selon l'une des revendications 25 ou 26.

29. Plante selon l'une des revendications 27 ou 28, caractérisée en ce qu'elles est régénérée à partir des cellules transformées selon l'une des revendications 25 ou 26.

30. Plante transformée selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle est issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées selon la revendication 29.

31. Plante transformée selon l'une des revendications 27 à 30, caractérisée en ce qu'elle comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16, au moins un deuxième gène chimère fonctionnel, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée.

32. Plante transformée selon la revendication 31, caractérisé en ce que le deuxième gène chimère permet l'adressage de l'HPPD dans les chloroplastes, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de

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transit/HPPD.

33. Plante transformée selon l'une des revendications 27 à 32, caractérisée en ce qu'elle comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt.

34. Plante transformée selon l'une des revendications 27 à 33, caractérisée en ce qu'elle est du type monocotylédones telles que les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comme le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle.

35. Graines de plantes transformées selon l'une des revendications 27 à 34.

36. Procédé de désherbage sélectif de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'une des revendications 27 à 34, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.

37. Procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'une des revendications 27 à 35, lequel procédé consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformées.

38. Procédé de culture des plantes transformées selon l'une des revendications 27 à 34, lequel procédé consiste à semer les graines des dites plantes transformées selon la revendication 35 dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.