FR2629460A1 - PF16 peptides from an HIV retrovirus - process for synthesising these peptides - their use in diagnosis - Google Patents
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Abstract
Description
PEPTIDES PF16 D'UN RETROVIRUS HIV - PROCEDE DE SYNTHESE
DE CES PEPTIDES - LEUR UTILISATION POUR LE DIAGNOSTIC
L'invention concerne des peptides ayant des propriétés immunologiques, le cas échéant immunogènes, en commun avec la protéine F d'un rétrovirus capable de provoquer chez l'homme des syndrômes de lymphadénopathies (SLA) susceptibles d'entre relayés par un syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA).PF16 PEPTIDES OF AN HIV RETROVIRUS - SYNTHESIS METHOD
OF THESE PEPTIDES - THEIR USE FOR DIAGNOSIS
The invention relates to peptides having immunological properties, where appropriate immunogenic, in common with the F protein of a retrovirus capable of causing in humans lymphadenopathy syndromes (ALS) capable of being relayed by a syndrome of acquired immunodeficiency (AIDS).
Jusqu'à présent, plusieurs rétrovirus ayant une responsabilité dans le développement dlun SLA ou d'un SIDA, ont été isolés et caractérisés. Ainsi un premier virus dénommé LAV-1 ou HIV-1 a été isolé et décrit dans la demande de brevet ,B.83/24.800 et une demande EP.84/401.834 du 14/09/84. Ce virus a également été décrit par F.Barre Sinoussi et al. dans Science, 220 n 45-99, 20, pages 868-871. So far, several retroviruses with responsibility for the development of ALS or AIDS have been isolated and characterized. Thus a first virus called LAV-1 or HIV-1 has been isolated and described in the patent application, B.83 / 24,800 and an application EP.84 / 401.834 of 14/09/84. This virus has also been described by F. Barre Sinoussi et al. in Science, 220, 45-99, 20, pages 868-871.
Des variants de ce virus HIV-1 désignés par
LAV ELI et LAV MAL, ont également été isolés, caractérisés et décrits dans la demande de brevet EP. 84/- 401.834. Variants of this HIV-1 virus designated by
LAV ELI and LAV MAL, have also been isolated, characterized and described in the EP patent application. 84 / - 401.834.
L'isolement et la caractérisation de rétro- virus appartenant a une classe distincte et n'ayant qu'une parenté immunologique réduite avec les précédents, ont été décrits dans la demande de brevet européen n' 87/400.151.4 publiée sous le n 239.425. Ces rétrovirus qui ont été regroupés sous la désignation
HIV-2, ont été isolés chez plusieurs malades africains présentant des symptômes d'une lymphadénopathie ou d'un
SIDA.The isolation and characterization of retro-viruses belonging to a distinct class and having only a reduced immunological relationship with the previous ones, have been described in European Patent Application No. 87 / 400.151.4 published under No. 239,425. . These retroviruses that have been grouped under the designation
HIV-2, have been isolated from several African patients with symptoms of lymphadenopathy or
AIDS.
L'étude de ces rétrovirus HIV-1 et HIV-2 a conduit à l'obtention de leurs séquences d'ADN complé- mentaires puis à la caractérisation des séquences nu cléotidíques spécifiques codant pour d'autres protéines que celles décrites précédemment, notamment pour la protéine F de HIV-1 décrite dans la publication Bruno
Guy et al. Nature 1987 vol. 33 p. 266 à 269.The study of these retroviruses HIV-1 and HIV-2 led to the obtaining of their complementary DNA sequences and then to the characterization of the specific nucleotide sequences coding for other proteins than those described above, especially for the HIV-1 F protein described in the Bruno publication
Guy et al. Nature 1987 vol. 33 p. 266-269.
On connaissait les propriétés antigéniques de la protéine F vis-à-vis d'anticorps contenus dans un sérum de patient infecté par un rétrovirus capable de provoquer un SLA ou un SIDA et plus particulièrement vis-à-vis d'anticorps dirigés contre cette protéine F. The antigenic properties of the F protein with respect to antibodies contained in a serum of a patient infected with a retrovirus capable of causing ALS or AIDS and more particularly with respect to antibodies directed against this protein were known. F.
Les inventeurs ont constaté que certaines séquences peptidiques sélectionnées à partir de la séquence connue de la protéine F, pour différents isolats de rétrovirus HIV-1 ou HIV-2, présentent un intérêt particulier pour la détection d'une infection par l'un des rétrovirus décrits plus haut. The inventors have found that certain peptide sequences selected from the known sequence of the F protein, for different isolates of HIV-1 or HIV-2 retrovirus, are of particular interest for the detection of an infection by one of the retroviruses. described above.
De façon tout à fait intéressante les inventeurs ont remarqué que certains peptides de la protéine
F (encore désignés par PF) sont reconnus par des anticorps induits dans un hôte infecté par un rétrovirus du type HIV à un stade très précoce de l'infection par le virus.In a very interesting way, the inventors have noticed that certain peptides of the protein
F (also referred to as PF) are recognized by antibodies induced in a host infected with an HIV-type retrovirus at a very early stage of infection with the virus.
Cette observation démontre s'il en est besoin l'intérêt que peuvent représenter de tels peptides pour la détection à un stade précoce d'une infection chez l'homme par un rétrovirus des classes HIV-1 ou HIV-2. This observation demonstrates the need for these peptides to be of interest for the detection at an early stage of infection in humans by a retrovirus of classes HIV-1 or HIV-2.
L'invention concerne à cet égard des peptides de la protéine F d'un rétrovirus capable de provoquer un
SLA ou un SIDA, qui présentent des propriétés immunologiques, en commun avec celles de cette protéine F et qui ont la capacité d'être reconnus par des anticorps contre cette protéine, présents dans un échantillon biologique, notamment un tissu ou un liquide biologique, d'un hôte infecté par un rétrovirus HIV notamment de la classe
HIV-1 ou de la classe HIV-2.In this respect, peptides of the F protein of a retrovirus capable of causing a
ALS or AIDS, which have immunological properties, in common with those of this F protein and which have the capacity to be recognized by antibodies against this protein, present in a biological sample, in particular a tissue or a biological fluid, a host infected with an HIV retrovirus in particular of the class
HIV-1 or class HIV-2.
L'invention vise en outre des peptides de la protéine F d'un rétrovirus HIV-1 ou HIV-2, ayant des propriétés immunogènes, ou susceptibles d'être rendus immunogènes in vivo. The invention further provides peptides of the F protein of an HIV-1 or HIV-2 retrovirus, having immunogenic properties, or capable of being rendered immunogenic in vivo.
Les peptides de l'invention peuvent être obtenus par isolement à partir de la séquence complète de la protéine F d'un rétrovirus déterminé ou encore par synthèse chimique. The peptides of the invention can be obtained by isolation from the complete sequence of the F protein of a specific retrovirus or by chemical synthesis.
La figure 1 représente la séquence peptidique de la protéine F pour deux isolats, correspondant l'un au rétrovirus HIV-2, l'autre au rétrovirus HIV-1. Les correspondances entre les acides aminés et leur code à une lettre sont les suivantes
M Méthionine L Leucine
I Isoleucine
V Valine
F Phénylalanine
S Sérine
P Proline
T Thréonine
A Alanine
Y Tyrosine
H Histidine
Q Glutamine
N Asparagine
K Lysine
D Acide Aspartique
E Acide glutamique
C Cystéine
W Tryptophane
R Arginine
G Glycine
Les peptides de l'invention, obtenus éventuellement après modification de l'enchainement d'acides aminés, à partir d'un isolat d'un rétrovirus ou encore obtenus par synthèse sont tels qu'ils présentent une parenté de séquence ou (homologie) avec la séquence peptidique correspondante de la région C-terminale de la protéine F d'un rétrovirus de la classe HIV-1 ou/et d'un rétrovirus de la classe HIV-2, suffisante pour que les propriétés immunologiques de cette séquence vis-à-vis des anticorps formés dans un milieu biologique (notamment un sérum) d'un hôte infecté par l'un ou l'autre des virus HIV-1 ou HIV-2 soient conservées.FIG. 1 represents the peptide sequence of the F protein for two isolates, one corresponding to the HIV-2 retrovirus and the other to the HIV-1 retrovirus. Matches between amino acids and their one-letter code are as follows
M Methionine L Leucine
I Isoleucine
V Valine
Phenylalanine
S Serine
P Proline
T Threonine
Alanine
Y Tyrosine
Histidine
Q Glutamine
N Asparagine
K Lysine
Aspartic Acid
E Glutamic acid
Cysteine
W Tryptophan
R Arginine
Glycine
The peptides of the invention, obtained optionally after modification of the amino acid sequence, from an isolate of a retrovirus or else obtained by synthesis, are such that they have a kinship of sequence or (homology) with the corresponding peptide sequence of the C-terminal region of the F protein of a retrovirus of class HIV-1 or / and of a retrovirus of class HIV-2, sufficient for the immunological properties of this sequence to antibodies formed in a biological medium (in particular a serum) of a host infected with one or the other of the HIV-1 or HIV-2 viruses are preserved.
A cet égard, les peptides selon l'invention, capables de former un complexe immunologique avec des anticorps anti-protéine F d'un retrovirus susceptible de provoquer un SLA ou un SIDA, sont caractérisés en ce qu'ils comportent au plus 40 aminoacides et possèdent une séquence correspondant à la partie C-terminale de la protéine F d'un rétrovirus HIV ou à une variante de cette séquence néanmoins telle qu'elle soit immunologiquement reconnue par des anticorps anti-protéine F de rétrovirus HIV. In this respect, the peptides according to the invention, capable of forming an immunological complex with antibodies to F protein of a retrovirus capable of causing ALS or AIDS, are characterized in that they contain at most 40 amino acids and have a sequence corresponding to the C-terminal part of the F protein of an HIV retrovirus or to a variant of this sequence nevertheless as it is immunologically recognized by anti-F protein antibodies of HIV retrovirus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide est sélectionné en fonction de sa capacité à être reconnu par des anticorps anti-protéine
F d'un hôte infecté spécifiquement par l'un ou l'autre des rétrovirus HIV-1 ou HIV-2.In another embodiment of the invention, the peptide is selected according to its ability to be recognized by anti-protein antibodies
F of a host specifically infected with either HIV-1 or HIV-2 retrovirus.
Un premier peptide conforme à l'invention est caractérisé par tout ou partie de la formule
XGM-D-E--VL-W-F-S-LA--H-ARE-HPE--K-CZ dans laquelle - les tirets "-" figurent des acides aminés variables choisis de manière à ce que le peptide final conserve sa capacité à être reconnu par des anticorps formés lors d'une infection par l'un des rétrovirus précédents.A first peptide according to the invention is characterized by all or part of the formula
XGM-DE-VL-WFS-LA-H-ARE-HPE-K-CZ in which - the dashes "-" are variable amino acids selected so that the final peptide retains its ability to be recognized by antibodies formed during infection with one of the previous retroviruses.
- les groupes X représentent soit un groupe NH2 libre ou amidé, notamment par un ou deux groupes alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone, soit un groupe peptidique comprenant de 1 à 5 aminoacides, dont l'amino-acide N-terminal présente lui-même un groupe NH2 libre ou amidé comme précédemment indiqué, et les groupes Z représentent, soit un groupe -OH libre ou alcoxyle et contenant alors un groupe alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone, soit un.groupe peptidique comprenant de i à 5 aminoacides, dont l'aminoacide Cterminal présente lui-même un groupe -OH libre ou alcoxyle, comme précédemment indiqué, les groupes de 1 à 5 acides aminés le cas échéant contenus dans X ou Z ou dans les deux à la fois ainsi que les acides aminés remplaçant les tirets étant tels, que leur présence n'est pas incompatible avec les propriétés immunologiques, le cas échéant immunogènes, des peptides formés, notamment leur capacité à être reconnus par des sérums humains contenant des anticorps contre la protéine F d'un rétrovirus HIV-1 et plus particulièrement des anticorps monospécifiques contre le peptide ci-dessus.the X groups represent either a free or amide NH 2 group, in particular by one or two alkyl groups comprising from 1 to 5 carbon atoms, or a peptide group comprising from 1 to 5 amino acids, of which the N-terminal amino acid is present; itself a free NH 2 or amide group as previously indicated, and the Z groups represent either a free -OH group or alkoxyl and then containing an alkyl group comprising 1 to 5 carbon atoms, or a peptide group comprising i with 5 amino acids, whose amino acid Cterminal itself has a free -OH group or alkoxyl, as previously indicated, the groups of 1 to 5 amino acids where appropriate contained in X or Z or both at once as well as the amino acids replacing the dashes being such that their presence is not incompatible with the immunological properties, where appropriate immunogenic, peptides formed, especially their ability to be recognized by hum sera thus containing antibodies against the F protein of an HIV-1 retrovirus and more particularly monospecific antibodies against the above peptide.
Des peptides préférés répondant à la structure précédente sont les suivants
XGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNCZ XGMEDAEKEVLVWRFDSKLAFHHMARELHPEYYKDCZ
XGMEDAEREVLKWKFDSSLALRHRAREQHPEYYKDCZ
XGMEDPERQVLKWRFNSRLAFEHKAREMHPEFYKNZ
Des peptides particulièrement préférés sont donnés par les enchainements d'acides aminés suivants
GMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC GMEDAEKEYLYWRFDSKLAFHHMARELHPEYYRDC
GMEDAEREVLKWKFDSSLALRHRAREQHPEYYKDC
GMEDPERQVLKWRFNSRLAFEHKAREMHPEFYKN
D'autres peptides conformes à l'invention sont aptes à etre reconnus par des anticorps formés chez un hôte infecté par un rétrovirus de la classe HIV-2 et sont caractérisés en ce qu'ils présentent des propriétés immunologiques, le cas échéant immunogènes, en commun avec la séquence suivante
XKFDDPHGETLVWEFDPLLAYSYEAFIRYPEEFGHKZ dans laquelle X et Z ont des significations analogues aux précédentes à condition toutefois que leur choix permette la conservation de la capacité du peptide ci-dessus à être reconnu par des sérums humains contenant des anticorps contre la protéine F d'un rétrovirus HIV-2.Preferred peptides corresponding to the above structure are as follows
XGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNCZ XGMEDAEKEVLVWRFDSKLAFHHMARELHPEYYKDCZ
XGMEDAEREVLKWKFDSSLALRHRAREQHPEYYKDCZ
XGMEDPERQVLKWRFNSRLAFEHKAREMHPEFYKNZ
Particularly preferred peptides are given by the following amino acid sequences
GMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC GMEDAEKEYLYWRFDSKLAFHHMARELHPEYYRDC
GMEDAEREVLKWKFDSSLALRHRAREQHPEYYKDC
GMEDPERQVLKWRFNSRLAFEHKAREMHPEFYKN
Other peptides according to the invention are able to be recognized by antibodies formed in a host infected with a retrovirus class HIV-2 and are characterized in that they have immunological properties, where appropriate immunogenic, in vitro. common with the following sequence
XKFDDPHGETLVWEFDPLLAYSYEAFIRYPEEFGHKZ wherein X and Z have similar meanings to the above provided however that their choice allows the conservation of the ability of the above peptide to be recognized by human sera containing antibodies against the F protein of an HIV-2 retrovirus .
D'autres modifications des différentes séquences d'acides aminés décrites pour la composition des peptides de l'invention, éventuellement des délétions au niveau de certains acides aminés peuvent etre envisagées dès lors que la séquence modifiée formée reste capable d'être reconnue par des anticorps présents dans un milieu biologique, notamment un sérum humain à la suite d'une infection par un rétrovirus susceptible de provoquer un SLA ou un SIDA. Other modifications of the various amino acid sequences described for the composition of the peptides of the invention, possibly deletions at the level of certain amino acids, may be envisaged provided that the modified sequence formed remains capable of being recognized by antibodies. present in a biological medium, including human serum following infection with a retrovirus that may cause ALS or AIDS.
On- peut notamment mettre en oeuvre une partie seulement des peptides précédemment décrits dans la mesure où une séquence de plus petite taille formée conserve des propriétés immunologiques, le cas échéant immunogènes, vis-à-vis des anticorps contre la protéine
F d'un rétrovirus HIV.In particular, only a part of the peptides described above can be used, insofar as a smaller sized sequence formed retains immunological, possibly immunogenic, properties with respect to the antibodies against the protein.
F of an HIV retrovirus.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les peptides ci-dessus sont mis en oeuvre dans des mélanges capables d'être reconnus par des anticorps présents lors d'une infection par un rétrovirus de la classe HIV-1. In a particular embodiment of the invention, the above peptides are used in mixtures capable of being recognized by antibodies present during infection with a retrovirus of class HIV-1.
On peut également réaliser des mélanges de peptides reconnus par des anticorps dirigés contre un rétrovirus du type HIV-1 d'une part et des- peptides reconnus par un rétrovirus du type HIV-2 d'autre part. It is also possible to make mixtures of peptides recognized by antibodies directed against a retrovirus of the HIV-1 type on the one hand and peptides recognized by a retrovirus of the HIV-2 type on the other hand.
L'invention a trait également à des composi tions comprenant de tels peptides seuls ou en mélange avec d'autres protéines ou peptides codés par le génome d'un rétrovirus capable de causer un SLA ou un SIDA et à leur utilisation dans un procédé de détection invitro dans un échantillon biologique, de l'infection par un rétrovirus du type HIV-1 ou HIV-2. The invention also relates to compositions comprising such peptides alone or in admixture with other proteins or peptides encoded by the genome of a retrovirus capable of causing ALS or AIDS and their use in a detection method. invitro in a biological sample, infection with a retrovirus type HIV-1 or HIV-2.
L'invention est également relative à la synthèse des peptides intéressants de la protéine F. The invention also relates to the synthesis of the interesting peptides of the F protein.
Un principe de synthèse est par exemple de mettre en présence une phase solide dans laquelle s assemble la séquence du peptide et une phase liquide contenant solvants et réactifs. A chaque étape la séparation entre le peptide en croissance et les réactifs se fait par simples filtrations et lavages. A principle of synthesis is for example to bring into contact a solid phase in which assembles the peptide sequence and a liquid phase containing solvents and reagents. At each stage the separation between the growing peptide and the reagents is by simple filtrations and washes.
Initialement r le support solide qui porte un groupement réactif réagit avec le carboxyle d'un acide aminé introduit avec son -NH2 bloqué (protégé par exemple par le t-butyloxy carbonyle), pour établir une liaison covalente. Après déprotection de la fonction aminée (par exemple en lavant avec un acide tel que l'acide trifluoroacétique), un deuxième acide aminé protégé est introduit pour former par couplage la première liaison peptidique. Le deuxième acide aminé, qui fournit le deuxième amino-acyle de la séquence, est couplé à partir du résidu amino-acyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du premier acide aminé
C-terminal de la chaine. De préférence la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée r par exemple par dicyclohexylcarbodiimide.Par une suite de réactions, déprotections et couplages, la synthèse progresse du résidu C- vers le résidu N- terminal. Lorsque la séquence voulue a été assemblée le peptide est décroché de la phase solide, par une réaction spécifique de coupure de la liaison peptide-résine établie initialement. Le protocole détaillé de cette synthèse est décrit dans l'exemple 1.Initially, the solid support which carries a reactive group reacts with the carboxyl of an amino acid introduced with its blocked -NH 2 (protected for example by t-butyloxycarbonyl), to establish a covalent bond. After deprotection of the amino function (for example by washing with an acid such as trifluoroacetic acid), a second protected amino acid is introduced to form by coupling the first peptide bond. The second amino acid, which provides the second amino-acyl of the sequence, is coupled from the C-terminal amino-acyl residue to the deprotected amine function of the first amino acid.
C-terminal of the chain. Preferably, the carboxyl function of this second amino acid is activated by, for example, dicyclohexylcarbodiimide. In a series of reactions, deprotections and couplings, the synthesis progresses from the residue C- to the N-terminal residue. When the desired sequence has been assembled, the peptide is removed from the solid phase by a specific cleavage reaction of the peptide-resin bond initially established. The detailed protocol of this synthesis is described in Example 1.
Le procédé de synthèse d'un peptide conforme à ce qui est décrit plus haut est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a/ mise en contact d'un support solide portant un groupement réactif apte à réagir avec une fonction carboxyle, avec le premier acide aminé C-terminal de la chaine à synthétiser, protégé au niveau de la fonction amine devant ultérieurement intervenir dans le couplage avec un autre acide aminé, pour éviter l'auto-condensation
b/ déprotection de la fonction amine de l'acide aminé précédemment fixé
c/ couplage de la fonction amine déprotégée de l'acide aminé à l'issue de l'étape b/ avec la fonction carboxyle d'un deuxième acide aminé, protégé au niveau de sa fonction amine et qui fournit le deuxième résidu aminoacyle alors couplé au résidu aminoacyle C-terminal du peptide à synthétiser
d/ déprotection de la fonction amine du deuxième acide aminé ajouté et répétition des étapes c/ de couplage et d/ de protection, successivement avec les acides aminés correspondant respectivement aux résidus aminoacyle successifs jusqu'à aboutir au résidu aminoacyle N-terminal dudit peptide
e/ séparation du peptide formé, par traitement de la phase solide portant le peptide synthétisé, notamment. au moyen de l'acide fluorhydrique, une fois obtenu l'acide-aminé N-terminal
f/ récupération de la séquence peptidique à partir de la solution.The method for synthesizing a peptide according to the above is characterized in that it comprises the following steps
a / bringing into contact a solid support carrying a reactive group capable of reacting with a carboxyl function, with the first C-terminal amino acid of the chain to be synthesized, protected at the level of the amine function which must subsequently be involved in the coupling with another amino acid, to avoid self-condensation
b / deprotection of the amine function of the amino acid previously fixed
c / coupling of the deprotected amine function of the amino acid at the end of step b / with the carboxyl function of a second amino acid, protected at its amine function and which provides the second aminoacyl residue then coupled to the C-terminal aminoacyl residue of the peptide to be synthesized
d / deprotection of the amine function of the second amino acid added and repetition of the c / coupling and d / protection stages, successively with the amino acids respectively corresponding to the successive aminoacyl residues until they reach the N-terminal aminoacyl residue of said peptide
e / separation of the peptide formed, by treatment of the solid phase carrying the synthesized peptide, in particular. by means of hydrofluoric acid, once obtained the N-terminal amino acid
f / recovery of the peptide sequence from the solution.
Dans un mode de réalisation préféré du procédé précédent, l'étape b/ de déprotection est suivie par une étape de neutralisation destinée à rendre la fonction amine nucléophile. In a preferred embodiment of the preceding method, the deprotection step b / is followed by a neutralization step intended to render the nucleophilic amine function.
Dans un autre mode de réalisation particulier, on peut encore avoir recours à une seconde étape de couplage réalisée après lavage et neutralisation du peptide obtenu à l'issue de l'étape c/, au moyen d'un agent de couplage, afin de permettre la réaction des fonctions amine qui n'avaient pas réagi lors du premier couplage. In another particular embodiment, it is possible to resort to a second coupling step carried out after washing and neutralization of the peptide obtained at the end of step c /, by means of a coupling agent, in order to allow the reaction of the amine functions which had not reacted during the first coupling.
Pour certains acides aminés tels que le triptophane ou la cystéine, la déprotection des fonctions réactives sera obtenue après la séparation du peptide, de la résine respectivement au moyen d'une base ou avec un traitement avec l'acétate mercurique. For certain amino acids such as triptophane or cysteine, the deprotection of the reactive functions will be obtained after the separation of the peptide, of the resin respectively by means of a base or with a treatment with mercuric acetate.
Il est entendu que le procédé de synthèse des peptides selon l'invention n'est pas limité au procédé précédemment décrit mais englobe au contraire toutes les variantes dans la mesure où la séquence peptidique ainsi synthétisée conserve les propriétés immunologiques souhaitées. It is understood that the process for synthesizing the peptides according to the invention is not limited to the process previously described but on the contrary covers all the variants insofar as the peptide sequence thus synthesized retains the desired immunological properties.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrit par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé "Méthode der Organischen Chemie" (Méthode de la
Chimie Organique) édité par E. Wunsch, vol. 15-1 et Il,
THIEME, Stuttgart 1974.According to another embodiment of the invention, use will be made of the homogeneous solution synthesis technique described by HOUBENWEYL in the work entitled "Method of Organizing Chemistry" (Method of the
Organic Chemistry) edited by E. Wunsch, vol. 15-1 and He,
THIEME, Stuttgart 1974.
Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides.En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la 1-éthyl-3-(3-diméthyl-amino- propyl)-carbodiimide. Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront par exemple protégées par des groupes t-butylester. This method of synthesis consists in successively condensing successively the successive aminoacyls in the required order, or in condensing aminoacyls and previously formed fragments already containing several aminoacyls in the appropriate order, or several previously prepared fragments. , it being understood that care has to be taken to protect in advance all the reactive functions borne by these aminoacyls or fragments, with the exception of the amine functions of one and the carboxyls of the other or vice versa, which are normally required to intervene in the formation of peptide bonds, especially after activation of the carboxyl function, according to methods well known in the synthesis of peptides. As a variant, it may be possible to resort to coupling reactions involving conventional coupling reagents, such as carbodiimide, such as, for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide. When the aminoacyl used has an additional acidic function (especially in the case of glutamic acid), these functions will for example be protected by t-butyl ester groups.
L'invention est également relative à un procédé de détection in vitro d'une infection par un rétrovirus susceptible de provoquer un SLA ou SIDA, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a) la mise en contact d'au moins un peptide selon l'invention avec un échantillon biologique à tester, susceptible de contenir des anticorps contre la protéine F d'un rétrovirus HIV ci-dessus, dans des conditions permettant la formation d'un complexe immunologique peptide-anticorps,
b) la détection du complexe immunologique formé.The invention also relates to a method for the in vitro detection of an infection with a retrovirus capable of causing ALS or AIDS, characterized in that it comprises the following steps
a) bringing at least one peptide according to the invention into contact with a biological sample to be tested, capable of containing antibodies against the F protein of an HIV retrovirus above, under conditions allowing the formation of a immunological peptide-antibody complex,
b) the detection of the immunological complex formed.
Pour réaliser la détection du complexe immunologique peptide-anticorps et ainsi faire le diagnostic de l'infection, on pourra par exemple avoir recours à un dosage radioimmunologique. On peut également avoir recours à une méthode d'immunoenzymologie telle que la méthode ELISA. To carry out the detection of the peptide-antibody immunological complex and thus make the diagnosis of the infection, it will be possible, for example, to resort to a radioimmunological assay. It is also possible to use an immunoenzymology method such as the ELISA method.
Dans un premier mode de réalisation du test de détection d'une infection par un rétrovirus capable de provoquer un SLA. ou un SIDA, le peptide mis en oeuvre pour effectuer le diagnostic de la présence d'anticorps anti-protéine F est reconnu spécifiquement par un rétrovirus HIV-1. In a first embodiment of the test for detecting a retrovirus infection capable of causing ALS. or AIDS, the peptide used to perform the diagnosis of the presence of anti-F protein antibody is specifically recognized by an HIV-1 retrovirus.
Dans un deuxième mode de réalisation de ce test de détection, le peptide mis en oeuvre est reconnu spécifiquement par un rétrovirus HIV-2. In a second embodiment of this detection test, the peptide used is specifically recognized by an HIV-2 retrovirus.
Dans un autre mode de réalisation de ce test, on choisit de mettre en oeuvre un mélange de peptides reconnaissant d'une part des anticorps formés contre la protéine F d'un rétrovirus HIV-1 et tes peptides reconnaissant d'autre part des anticorps formés contre la protéine F d'un rétrovirus HIV-2. On peut ainsi réaliser un diagnostic non spécifique d'une infection par l'un ou l'autre des rétrovirus HIV-1 ou HIV-2. In another embodiment of this test, it is chosen to use a mixture of peptides recognizing, on the one hand, antibodies formed against the F protein of an HIV-1 retrovirus and the peptides recognizing, on the other hand, antibodies formed. against the F protein of an HIV-2 retrovirus. It is thus possible to perform a non-specific diagnosis of an infection with one or the other of the HIV-1 or HIV-2 retroviruses.
Pour effectuer le diagnostic le peptide pourra avantageusement etre fixé sur une plaque ELISA. To carry out the diagnosis, the peptide may advantageously be fixed on an ELISA plate.
L'invention concerne aussi l'utilisation des peptides de la protéine F, pour purifier des anticorps monospécifiques contre la protéine F. The invention also relates to the use of the peptides of the F protein, for purifying monospecific antibodies against the F protein.
Pour effectuer une telle purification, par exemple par chromatographie d'affinité, on peut opérer comme suit : - fixation des peptides utilisés pour la purification sur un support, - passage sur ce support d'une solution contenant les anticorps que l'on cherche à purifier pour les amener au contact des peptides fixés, dans des conditions permet tant la formation d'un complexe immunologique peptide- anticorps ladite solution peut être un sérum polyclonal, un surnageant ou encore un ascite contenant des anticorps monoclonaux, - élimination des constituants n'ayant pas réagi, - récupération des anticorps monospécifiques dirigés contre la protéine F. To carry out such a purification, for example by affinity chromatography, one can operate as follows: - fixation of the peptides used for the purification on a support, - passage on this support of a solution containing the antibodies that one seeks to purifying to bring them into contact with the fixed peptides, under conditions allowing the formation of a peptide-antibody immunological complex, said solution may be a polyclonal serum, a supernatant or an ascite containing monoclonal antibodies, elimination of the constituents unreacted, - recovery of monospecific antibodies to F protein.
L'invention concerne donc les anticorps monospécífiques dirigés contre la protéine F, caractérisés en ce qu'ils sont reconnus par un ou plusieurs peptides précédemment décrits. The invention therefore relates to monospecific antibodies directed against the F protein, characterized in that they are recognized by one or more peptides previously described.
L'invention concerne également un kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par un rétrovirus capable de provoquer un SLA ou un SIDA, caractérisé en ce qu'il comprend :
- un peptide conforme à l'invention, ou un mélange de ces peptides
- les réactifs pour la constitution d'un milieu, notamment une solution tamponnée, propice à la formation d'une réaction immunologique entre le ou les peptides et les anticorps éventuellement présents dans un échantillon biologique
- un ou plusieurs réactifs éventuellement marqué(s) aptes(s) à réagir avec le ou lesdits peptides pour la détection du complexe peptide-anticorps formé
- le cas échéant, un milieu biologique de référence, tel qu'un sérum, semblable au milieu biologique provenant de la personne éventuellement infectée avec un rétrovirus HIV et dépourvu d'anticorps reconnaissant les susdits peptides.The invention also relates to a kit for the in vitro diagnosis of a retrovirus infection capable of causing ALS or AIDS, characterized in that it comprises:
a peptide according to the invention, or a mixture of these peptides
the reagents for the constitution of a medium, in particular a buffered solution, suitable for the formation of an immunological reaction between the peptide (s) and the antibodies possibly present in a biological sample
one or more optionally labeled reagents capable of reacting with said peptide (s) for the detection of the peptide-antibody complex formed
if necessary, a reference biological medium, such as a serum, similar to the biological medium from the person possibly infected with an HIV retrovirus and devoid of antibodies recognizing the aforesaid peptides.
Les exemples qui suivent illustrent la synthèse des peptides selon l'invention et leur utilisation dans un test de diagnostic de la présence d'anticorps anti-protéine F contenus dans des sérums humains connus pour avoir été infectés par un virus HIV-1. The examples which follow illustrate the synthesis of the peptides according to the invention and their use in a diagnostic test for the presence of anti-F protein antibodies contained in human sera known to have been infected with an HIV-1 virus.
D'autres caractéristiques apparaissent dans les figures. Other features appear in the figures.
- la figure 1 représente l'alignement des séquences d'acides aminés de la protéine F pour les isolats ROD.P de HIV-2 et LAV.P de HIV-1.FIG. 1 shows the alignment of the amino acid sequences of the F protein for the HIV-2 HIV-2 ROD.P and HIV-1 LAV.P isolates.
- la figure 2 représente les relations entre le rendement global d'incorporation des acides aminés et la pureté des produits obtenus par synthèse en phase solide (d'après Wang, S.S., 1972).FIG. 2 represents the relationships between the overall efficiency of amino acid incorporation and the purity of the products obtained by solid phase synthesis (from Wang, S.S., 1972).
EXEMPLE 1
SYNTHESE, PURIFICATION ET CARACTERISATION DES PEPTIDES
1/ Nature du support solide
Pour la réalisation de la synthèse, un bon support solide est choisi de façon à répondre aux conditions suivantes - être insoluble dans les solvants et réactifs de la phase liquide - être inerte vis-à-vis des réactifs de la synthèse - être suffisamment stable physiquement pour être agité et subir les filtrations - assurer une excellente diffusion des réactifs pour ne pas ralentir la cinétique d'un facteur trop important comparé à celle des réactions en solution.EXAMPLE 1
SYNTHESIS, PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF PEPTIDES
1 / Nature of the solid support
For the realization of the synthesis, a good solid support is chosen so as to meet the following conditions - to be insoluble in the solvents and reagents of the liquid phase - to be inert with respect to the reagents of the synthesis - to be sufficiently physically stable to be agitated and to undergo filtrations - to ensure an excellent diffusion of the reagents not to slow the kinetics of a factor too important compared to that of the reactions in solution.
Deux sortes de résines ont été utilisées pour les besoins de la synthèse - une résine obtenue par copolymérisation de styrène en présence de 1% de divinylbenzène, dont la fonction réactive est le groupement benzydrylamine (-O-CHO-NH2); avec une substitution de 0,2 mmole NH2/g de résine - une résine polyacrylamide macroporeuse dont la fonction réactive est le groupement amino méthyl (-CH2-NH2) à 0,5 ou 0,7 mmole NH2ig). Two kinds of resins have been used for the purposes of synthesis - a resin obtained by copolymerization of styrene in the presence of 1% divinylbenzene, whose reactive function is the benzydrylamine group (-O-CHO-NH2); with a substitution of 0.2 mmol NH 2 / g of resin - a macroporous polyacrylamide resin whose reactive function is the amino methyl group (-CH 2 -NH 2) at 0.5 or 0.7 mmol NH 2 g).
2/ Nature des acides aminés a/ Protection des groupements aminés. 2 / Nature of amino acids a / Protection of amino groups.
La fonction a-NH2 de l'acide aminé ajouté a été protégée pour éviter la réaction d'auto-condensation des acides aminés. Le groupement protecteur utilisé pour cette synthèse est le tertiobutyloxycarbonyle (Boc) qui est éliminé par l'acide trifluoroacétique (TFA) 30 dans le dichlorométhane (DCM).
b/ Protection des groupements fonctionnels latéraux.b / Protection of lateral functional groups.
Contrairement à une protection temporaire des fonctions aminés, les fonctions portées par les chaines latérales doivent être maintenues protégées durant toute la synthèse et, par conséquent, les protections doivent être non labiles en milieu TFA 30%. Par contre, elles. seront déprotégées, en général, par le réactif utilisé pour couper la liaison peptide-résine, l'acide fluorhydrique. Les différents groupements protecteurs correspondant aux acides aminés utilisés sont représentés dans le tableau 1.
<tb><Tb>
<SEP> Fonction~prote gee <SEP> l <SEP> Groupement <SEP> protecteur
<tb> <SEP> CI\
<tb> Ot' <SEP> de <SEP> la <SEP> tyrosine <SEP> 1 <SEP> 2,(8-dichlorobensyl
<tb> OH <SEP> dc <SEP> a <SEP> tyrosine <SEP> 1
<tb> <SEP> 1 <SEP> CI,
<tb> OH <SEP> de <SEP> la <SEP> thréonine <SEP> t
<tb> OH <SEP> dc <SEP> la <SEP> serine <SEP> t
<tb> <SEP> benzyl <SEP> -C <SEP> H <SEP> t
<SEP> t <SEP> 2
<tb> <SEP> - <SEP> COH <SEP> de <SEP> 1 <SEP> aspartatel'aspartate <SEP> t
<tb> <SEP> - <SEP> COOH <SEP> du <SEP> lutamate <SEP> /
<tb> <SEP> - <SEP> COOH <SEP> du <SEP> 61utamate
<tb> <SEP> CH3
<tb> SH <SEP> de <SEP> la <SEP> cystéine <SEP> t <SEP> t.<SEP> butylmercapto <SEP> - <SEP> S <SEP> - <SEP> t <SEP> CH
<tb> <SEP> t <SEP> CH3
<tb> itid:ole <SEP> de <SEP> l'histidine <SEP> 1} <SEP> tosyl <SEP> - <SEP> S <SEP> < <SEP> CH3
<tb> <SEP> -NH <SEP> de <SEP> l <SEP> arginine <SEP> j
<tb> <SEP> t <SEP> o
<tb> <SEP> I <SEP> Il <SEP>
<tb> <SEP> de <SEP> de <SEP> la <SEP> lysine <SEP> bentyloxycarbonyl <SEP> -c <SEP> -O-CH
<tb> t <SEP> du <SEP> rryptophane <SEP> r
<tb> Indole <SEP> du <SEP> Tryptophane <SEP> | <SEP> foreyl
<tb>
Tablcau 1 : Protection des fonctions tertiaires des acides utilisés
dans nos svnthéses. <SEP> Protected Function <SEP><SEP> Grouping <SEP> Protector
<tb><SEP> CI \
<tb> Ot '<SEP> of <SEP><SEP> tyrosine <SEP> 1 <SEP> 2, (8-dichlorobensyl)
<tb> OH <SEP> dc <SEP> a <SEP> tyrosine <SEP> 1
<tb><SEP> 1 <SEP> CI,
<tb> OH <SEP> of <SEP><SEP> Threonine <SEP> t
<tb> OH <SEP> dc <SEP><SEP> serine <SEP> t
<tb><SEP> benzyl <SEP> -C <SEP> H <SEP> t
<SEP> t <SEP> 2
<tb><SEP> - <SEP> COH <SEP> of <SEP> 1 <SEP>aspartatel'aspartate<SEP> t
<tb><SEP> - <SEP> COOH <SEP> of the <SEP> lutamate <SEP> /
<tb><SEP> - <SEP> COOH <SEP> of <SEP> 61utamate
<tb><SEP> CH3
<tb> SH <SEP> of <SEP><SEP> cysteine <SEP> t <SEP> t. <SEP> butylmercapto <SEP> - <SEP> S <SEP> - <SEP> t <SEP> CH
<tb><SEP> t <SEP> CH3
<tb> itid: ole <SEP> of <SEP> histidine <SEP> 1} <SEP> tosyl <SEP> - <SEP> S <SEP><SEP> CH3
<tb><SEP> -NH <SEP> of <SEP> l <SEP> arginine <SEP> j
<tb><SEP> t <SEP> o
<tb><SEP> I <SEP> It <SEP>
<tb><SEP> of <SEP> of <SEP><SEP> lysine <SEP> bentyloxycarbonyl <SEP> -c <SEP> -O-CH
<tb> t <SEP> of <SEP> rryptophan <SEP> r
<tb> Indole <SEP> of <SEP> Tryptophan <SEP> | <SEP> foreyl
<Tb>
Table 1: Tertiary Function Protection of Acids Used
in our svnthéses.
3/ DisPositif exPérimenta
L'assemblage des peptides a été réalisé automatiquement dans un synthétiseur (APPLIED BIOSYSTEMS (marque déposée) Peptides Synthétiseur modèle 430A) suivant la méthode générale décrite par MERRIFIELD.3 / DisPositive exPerimenta
The assembly of the peptides was carried out automatically in a synthesizer (APPLIED BIOSYSTEMS (registered trademark) Peptides Synthesizer model 430A) according to the general method described by MERRIFIELD.
4/ Protocole d'incorPoration d'un résidu
Le protocole expérimental permettant d'effectuer un cycle de synthèse comporte les étapes suivantes a/ - DéProtectlon des fonctions aminées
Elle est obtenue après 2 prétraitements de 2 minutes suivis d'un traitement de 30 minutes avec 30% de
TFA/CH2Cl2. Les conditions utilisées sont normalement suffisantes pour éliminer complètement les groupements
Boc protecteurs des fonctions a-NH2, bl - Lavaqe
Les produits déprotégés ont été lavés 5 fois 2 minutes avec CH2Cl2.4 / Protocol for incorporating a residue
The experimental protocol for carrying out a synthesis cycle comprises the following steps a / - Deprotectlon of the amino functions
It is obtained after two 2-minute pretreatments followed by a 30-minute treatment with 30%
TFA / CH2Cl2. The conditions used are normally sufficient to completely eliminate the clumps
Boc protectors of functions a-NH2, bl - Lavaqe
The deprotected products were washed 5 times 2 minutes with CH 2 Cl 2.
c/ - Neutralisation
Nécessaire pour désioniser l'amine a-NH2 du peptide sur la résine et la rendre nucléophile pour participer à la réaction de couplage, la neutralisation est obtenue par 2 prétraitements de 2 minutes suivis d'un traitement de 10 minutes avec 5% de DIEA/CH2Cl2 (le
DIEA étant le Di-Isopropyl-Ethyl-Amine).c / - Neutralization
Necessary for deionizing the α-NH 2 amine of the peptide on the resin and rendering it nucleophilic to participate in the coupling reaction, the neutralization is obtained by two 2-minute pretreatments followed by a 10-minute treatment with 5% DIEA / CH2Cl2 (the
DIEA being Di-Isopropyl-Ethyl-Amine).
d/ - Premier couplage
Le premier couple est réalisé dans un excès (3 fois) de Boc acide aminé (aa) et du dicyclohexylcarbodiimide (DCC) dans CH2Cl2 (2 heures). Lors du couplage dont le mécanisme est représenté ci-après, une réaction secondaire donne un dérivé uréique non réactif qui dépend de la nature du solvant.d / - First coupling
The first couple is made in an excess (3 times) of Boc amino acid (aa) and dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in CH2Cl2 (2 hours). During the coupling, the mechanism of which is shown below, a secondary reaction gives a nonreactive urea derivative which depends on the nature of the solvent.
Cette réaction est assez faible dans le dichlorométhane et elle est contrebalancée par l'utilisation d'un excès de réactifs'(DCC et Boc-a.a).
produit de couplage
coupling product
dicyclohexyl urée
Mécanisme de couplage par le dicyclohexylcarbanide. dicyclohexyl urea
Mechanism of coupling by dicyclohexylcarbanide.
e/ - Lavaqe . e / - Lavaqe.
On lave le produit de réaction 5 fois, 2 minutes avec CH2Cl2. The reaction product is washed 5 times, 2 minutes with CH 2 Cl 2.
f/ - Nouvelle neutralisation
Pour réaliser cette nouvelle neutralisation, on fait 2 prétraitements de 2 minutes suivis d'un traitement de 10 minutes avec 5% de DIEA/CH2Cl2.f / - New neutralization
To carry out this new neutralization, two 2-minute pretreatments followed by a 10-minute treatment with 5% DIEA / CH 2 Cl 2 are carried out.
Cette nouvelle neutralisation permet l'activation des amines qui auraient échappé au premier traitement basique. This new neutralization allows the activation of amines that would have escaped the first basic treatment.
g/ - Lavage
On lave le produit 5 fois 2 minutes avec
CH2Cl2 et 1 fois 2 minutes avec la diméthylformamide (DMF).g / - Wash
The product is washed 5 times 2 minutes with
CH 2 Cl 2 and 1 time 2 minutes with dimethylformamide (DMF).
h/ - 2ème couplage
Ce deuxième couplage fait intervenir comme réactif l'ester de benzotriazole du Boc acide aminé 1,5 fois en excès dans la DMF (1 heure).h / - 2nd coupling
This second coupling involves as reagent the benzotriazole ester of Boc amino acid 1.5 times in excess in DMF (1 hour).
L'ester de benzotriazole du Boc (aa) est préparé extemporanément comme suit - on prépare un mélange équimoléculaire de DCC et d'hydroxybenzotriazole (HOBt) dans la diméthylformamide (DMF) et on laisse incuber pendant dix minutes à O'C. The benzotriazole ester of Boc (aa) is prepared extemporaneously as follows - an equimolar mixture of DCC and hydroxybenzotriazole (HOBt) in dimethylformamide (DMF) is prepared and incubated for 10 minutes at 0 ° C.
Puis, le Boc acide aminé est ajouté et la réaction est poursuivie à OsC pendant dix minutes. L'ester de benzotriazole du Boc acide aminé ainsi formé est ajouté dans le vase à réaction.Then, the Boc amino acid is added and the reaction is continued at OsC for ten minutes. The benzotriazole ester of the Boc amino acid thus formed is added to the reaction vessel.
i/ - Lavaae
On a à nouveau lavé le produit 5 fois 2 minutes avec CH2Cl2.i / - Lavaae
The product was washed again 5 times for 2 minutes with CH 2 Cl 2.
5/ Contrôles analvtiaues en cours de svnthèse:
Du fait que la synthèse se déroule sans purification des intermédiaires, il est impératif de contrôler que les réactions de couplages sont complètes.5 / Analgesical checks during the course of the test:
Since the synthesis proceeds without purification of the intermediates, it is imperative to check that the coupling reactions are complete.
Le diagramme de la figure 2 montre l'importance d'avoir des couplages complets pour la synthèse des grandes séquences bien en effet si l'on synthétise un peptide de 40 résidus avec un rendement global (déprQtection, neutralisation et couplage) de 98S, on obtient un mélange contenant 46% du peptide voulu et 54% de différents peptides plus petits. Si le rendement est de 99% en moyenne par étape le peptide entier sera présent à 67%.The diagram of FIG. 2 shows the importance of having complete couplings for the synthesis of large sequences, indeed indeed if a peptide of 40 residues is synthesized with an overall yield (deprotection, neutralization and coupling) of 98S, obtain a mixture containing 46% of the desired peptide and 54% of different smaller peptides. If the yield is 99% on average per step the whole peptide will be present at 67%.
Si le rendement est de 99,5 le peptide voulu représentera alors 82% et seulement 18% de mélanges de peptides plus petits.If the yield is 99.5 the desired peptide will then represent 82% and only 18% smaller peptide mixtures.
Pour vérifier la bonne réalisation du couplage, trois tests de couplages peuventêtre mis en oeuvre - Test à la ninhydrine (Kaiser, et coll.,1970) : on prélève une partie aliquote de peptidyl-résine (environ 1Omg) qu'on lave bien à l'éthanol dans des petits tubes en verre. Après centrifugation et élimination de l'éthanol, on ajoute une solution de nînhydrine et on laisse réagir pendant 5 minutes à 95 C. To verify the good performance of the coupling, three coupling tests can be carried out - Ninhydrin test (Kaiser, et al., 1970): an aliquot of peptidyl-resin (approximately 10 mg) is sampled and washed well. ethanol in small glass tubes. After centrifugation and removal of the ethanol, a solution of nînhydrin is added and allowed to react for 5 minutes at 95 C.
L'apparition d'une coloration bleue (test positif) signifie un couplage incomplet. Si la couleur de la résine ne change pas le couplage a eu lieu au moins à 99%. The appearance of a blue color (positive test) means incomplete coupling. If the color of the resin does not change the coupling occurred at least 99%.
- Test à la fluorescamine (Felix et Jimenez, 1973) : un peu plus sensible que celui à la ninhydrine, il permet de détecter moins de 1% de NH2 libre. Une partie aliquote de peptidyl-résine (10 à 20mg) est lavée successivement au DCM, à l'éthanol et au DIEA 5% dans le DCM puis on ajoute la fluorescamine. La réaction a lieu dans un milieu basique (DIEA 5% pendant 10 minutes. Après lavage et sèchage, on regarde la résine sous une lampe
UV à une longueur d'onde de 366nm. L'apparition d'une fluorescence signifie la présence de NH2 libres.- Fluorescamine test (Felix and Jimenez, 1973): a little more sensitive than that to ninhydrin, it can detect less than 1% of free NH2. An aliquot of peptidyl resin (10 to 20 mg) is washed successively with DCM, ethanol and 5% DIEA in DCM and then the fluorescamine is added. The reaction takes place in a basic medium (DIEA 5% for 10 minutes) After washing and drying, the resin is viewed under a lamp
UV at a wavelength of 366nm. The appearance of fluorescence means the presence of free NH2.
- Test au chloranyl (Christensen, 1979) : après le couplage d'un acide aminé quelconque sur une proline on ne peut utiliser les deux premiers tests à cause de leur faible sensibilité dans la détection des amines secondaires. On utilise le chloranyl (2,3,5,6. tétrachloro 1,4 benzoquinone). A une partie aliquote de peptidyl-résine (5 à îOmg) on ajoute 200 ul d'acétone et 50 ul d'une solution saturée de chloranyl dans le toluène; le tout est maintenu en agitation pendant 5 minutes. L'apparition d'une coloration verte signifie un couplage incomplet.Selon le résultat du test, s'il demeure positif après un second ou troisième couplage, on bloque par acétylation les fonctions a-NH2 qui n'ont pas réagi pour éviter la formation de peptide à délétion, ou bien, s'il est négatif un nouveau cycle de déprotection-couplage est entamé. Par ailleurs, on titre à intervalles réguliers (tous les deux ou trois résidus incorporés) la quantité d'amines présentes sur la résine. Cette quantité doit rester constante et égale à la quantité d'acide aminé fixée initialement sur la phase solide.- Chloranyl test (Christensen, 1979): after the coupling of any amino acid to a proline, the first two tests can not be used because of their low sensitivity in the detection of secondary amines. Chloranyl (2,3,5,6 1,4-tetrachlorobenzoquinone) is used. To an aliquot of peptidyl resin (5 to 10 mg) is added 200 μl of acetone and 50 μl of a saturated solution of chloranyl in toluene; the whole is stirred for 5 minutes. The appearance of a green color means incomplete coupling. According to the test result, if it remains positive after a second or third coupling, the a-NH 2 functions which have not reacted to avoid formation are blocked by acetylation. deletion peptide, or, if negative, a new deprotection-coupling cycle is started. On the other hand, the amount of amines present on the resin is titrated at regular intervals (every two or three incorporated residues). This amount must remain constant and equal to the amount of amino acid initially fixed on the solid phase.
Nous utilisons la méthode des sels d'acide picrique (Gisinr 1972) 10 à 20 mg de peptidyl-résine séchés sont pesés avec précision dans une seringue et traités de la façon suivante - 5 lavages au DCM - 3 . traitements de 3 minutes avec une solution d'acide picrique (0,01 M dans DCM) - 5 lavages au DCM pour éliminer l'excès d'acide picrique - 5 traitements de 5 minutes avec la DIEA (5% dans DCM) qui déplacent le picrate lié à la résine. On recueille les filtrats dans une fiole jaugée de 100 ml.We use the picric acid salt method (Gisinr 1972) 10 to 20 mg of dried peptidyl-resin are accurately weighed into a syringe and processed as follows - 5 DCM-3 washes. 3 minutes treatment with a solution of picric acid (0.01 M in DCM) - 5 washes with DCM to remove excess picric acid - 5 treatments of 5 minutes with the DIEA (5% in DCM) which move picrate bound to the resin. The filtrates are collected in a 100 ml volumetric flask.
- lavage de la résine avec de'l'éthanol puis on complète la fiole à 100 ml avec l'éthanol - mesure de la densité optique à 358 nm : sachant la valeur de l'tM (coefficient d'extinction molaire) 358 nm (13800) on calcule la concentration des a-NH2 libres qui ont pu réagir avec l'acide picrique pour former le sel correspondant.washing the resin with ethanol and then flushing the flask to 100 ml with ethanol - measurement of the optical density at 358 nm: knowing the value of tM (molar extinction coefficient) 358 nm ( 13800) the concentration of free α-NH 2 which could react with picric acid to form the corresponding salt is calculated.
6/ Acétylation du peptide sur la résine
Si le couplage d'un acide aminé demeure incomplet après plusieurs tentatives de réaction, ou si la synthèse du peptide est terminée et que l'on désire bloquer l'extrémité o NH2 du peptide par le groupement acétyl (l'acétylation de l'extrémité N-terminale est faite dans l'objectif d'avoir un peptide qui mime au point de vue de la charge, celle qui existe dans la protéine native), le peptide sur la résine est acétylé dans les conditions suivantes - neutralisation par 5% DIEA - lavages DCM - lavages DMF - acétylation par le mélange d'îml d'anhydride acétique (10 mmoles) et de 1,7 ml de DIEA (10 mmoles) dans la
DMF. La réaction dure 20 à 30 minutes et est considérée comme complète lorsque le test de couplage est négatif.6 / Acetylation of the peptide on the resin
If the coupling of an amino acid remains incomplete after several reaction attempts, or if the synthesis of the peptide is complete and it is desired to block the o NH 2 end of the peptide by the acetyl group (acetylation of the end N-terminal is made in order to have a peptide that mimics in terms of the charge, that which exists in the native protein), the peptide on the resin is acetylated under the following conditions - 5% DIEA neutralization - DCM washes - DMF washes - acetylation with a mixture of 1 ml of acetic anhydride (10 mmol) and 1.7 ml of DIEA (10 mmol) in the
DMF. The reaction lasts 20 to 30 minutes and is considered complete when the coupling test is negative.
7/ Couture de la liaison PeDtide-résine
La rupture de la liaison peptide-phase solide est faite par l'acide fluorhydrique anhydre (HF) à 0C. 7 / Sewing of the PeDtide-resin bond
The breakdown of the peptide-solid phase bond is made by anhydrous hydrofluoric acid (HF) at 0C.
(Lenard et Robinson, 1967 ; Sakakibara et coll. r 1967).(Lenard and Robinson 1967, Sakakibara et al 1967).
Elle s'accompagne, si on a choisi des protecteurs labiles dans l'HF, de la déprotection des chaines latérales.It is accompanied, if we chose protectors labile in the HF, the deprotection of the lateral chains.
La présence d'anisole (10% en volume) est nécessaire pour piéger les radicaux libres et éviter ainsi l'alkylation de certains résidus, comme la tyrosine, par les groupements protecteurs libérés. En utilisant une résine benzhydrylamine on obtient, à l'issue de la réaction, le peptide sous sa forme C-o amidée. Après évaporation de l'acide fluorhydrique, l'anisole est extraite par l'éther et le peptide est solubilisé par l'acide acétique. Le rendement de la réaction de coupure est calculé à partir des résultats d'analyses d'acides aminés donnant les quantités de peptide avant (peptide fixé à la résine) et après (peptide brut libre) la coupure par l'acide fluorhydrique. Cependant certains groupements protecteurs des chaines latérales de quelques acides aminés, comme le formyl tryptophane ne sont enlevés que par un traitement supplémentaire.The presence of anisole (10% by volume) is necessary to trap the free radicals and thus avoid the alkylation of certain residues, such as tyrosine, by the protective groups released. By using a benzhydrylamine resin, the peptide in its C-α amidated form is obtained at the end of the reaction. After evaporation of the hydrofluoric acid, the anisole is extracted with ether and the peptide is solubilized with acetic acid. The yield of the cleavage reaction is calculated from the results of amino acid analyzes giving the amounts of peptide before (peptide attached to the resin) and after (free crude peptide) cleavage by hydrofluoric acid. However some side chain protecting groups of some amino acids, such as formyl tryptophan are removed only by additional treatment.
8/ DéDrotection du trvDtoDhane
Sous la forme formyl tryptophane, l'acide aminé aromatique est convenablement protégé durant la synthèse contre les risques d'oxydation du groupement indole. Ce groupement indole peut être régénéré par action d'une base (1 M hydroxylamine, pH 9) pendant une heure en milieu aqueux (Ohno et coll., 1972).8 / TruDtoDhane Disruption
In formyl tryptophan form, the aromatic amino acid is suitably protected during synthesis against the risks of oxidation of the indole group. This indole group can be regenerated by the action of a base (1 M hydroxylamine, pH 9) for one hour in an aqueous medium (Ohno et al., 1972).
EXEMPLE 2
ETUDE SEROLOGIOUE AVEC DU PEPTIDE PF 16 DE LA PROTEINE
F. OBTENU PAR SYNTHESE COMPARATIVE
Le peptide a été préalablement synthétisé par la méthode décrite précédemment. Ce peptide couvre la séquence de 35 acides aminés de la partie C-terminale de la séquence d'acides aminés de la protéine F du rétrovirus HIV-1.EXAMPLE 2
SEROLOGY STUDY WITH PEPTIDE PF 16 PROTEIN
F. OBTAINED BY COMPARATIVE SYNTHESIS
The peptide was previously synthesized by the method described above. This peptide covers the 35 amino acid sequence of the C-terminal portion of the amino acid sequence of the retrovirus HIV-1 F protein.
Le peptide PF 16 a la séquence d'acides aminés suivante, dans laquelle l'acétamide (acm) représente un groupe hautement protecteur des fonctions SH des cystéines
GMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC(acm)
Le peptide PF 16 est encore caractérisé par une masse molaire de 4408g et de 6725g lorsque ses fonctions réactives sont protégées. Son coefficient théorique d'extinction molaire E à 280 nm est de 7550 cm 1 M 1, sa charge nette à pH neutre est nulle et son homologie de séquence avec la séquence correspondante de
HIV-2 est de 40%.PF 16 has the following amino acid sequence, wherein acetamide (acm) is a highly protective group of SH functions of cysteines
GMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC (acm)
The PF 16 peptide is further characterized by a molar mass of 4408 g and 6725 g when its reactive functions are protected. Its theoretical extinction coefficient E at 280 nm is 7550 cm 1 M 1, its net charge at neutral pH is zero and its sequence homology with the corresponding sequence of
HIV-2 is 40%.
Pour les besoins du test, le peptide PF 16 est dilué à une concentration de 2 mg/ml. For the purpose of the test, the peptide PF 16 is diluted to a concentration of 2 mg / ml.
Sur une bande de papier BIORAD pour transblot, on dépose différents spots îijl, 2vl, 5pl, 101. On a strip of BIORAD paper for transblot, we put different spots îijl, 2vl, 5pl, 101.
Après séchage on pratique un test Western Blot classique en utilisant comme anticorps des sérums de patients infectés par le virus HIV-1, positifs pour la protéine F, à des dilutions variant de 1/100 à 1/300. After drying, a conventional Western Blot test is performed using as sera antibodies of patients infected with the HIV-1 virus, positive for the protein F, at dilutions ranging from 1/100 to 1/300.
Le peptide PF 16 donne des résultats positifs avec trois sérums différents anti-F ++ (++ signifiant une réaction plus marquée), comme le montre le tableau 2 qui suit. The PF 16 peptide gives positive results with three different anti-F ++ sera (++ signifying a stronger reaction), as shown in Table 2 which follows.
Par ailleurs, les inventeurs ont constaté qu'un anticorps monoclonal anti-protéine F d'un rétrovirus HIV-1 produit chez la souris reconnait le peptide PF de l'invention dans un test ELISA. Moreover, the inventors have found that an anti-F protein monoclonal antibody of an HIV-1 retrovirus produced in the mouse recognizes the PF peptide of the invention in an ELISA test.
Ceci montre bien le caractère immunodominant des peptides selon l'invention.
<SEP> SERUMS <SEP> POSITIFS, <SEP> ANTI-PROTEINE <SEP> F <SEP> DE <SEP> HIV-1
<tb> <SEP> CHA <SEP> 1/300 <SEP> P.6. <SEP> 1/200 <SEP> 1545 <SEP> 1/200 <SEP> LOM <SEP> 1/100
<tb> PEPTIDE <SEP> 10 <SEP> l <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 2 <SEP> l <SEP> 1 <SEP> l <SEP> 10 <SEP> l <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 2 <SEP> l <SEP> 1 <SEP> l <SEP> 10 <SEP> l <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 2 <SEP> l <SEP> 1 <SEP> l <SEP> 10 <SEP> l <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 2 <SEP> l <SEP> 1 <SEP> l
<tb> PF <SEP> 16 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++ <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> SERUMS <SEP> POSITIVE, <SEQ> ANTI-PROTEIN <SEP> F <SEP> FROM <SEP> HIV-1
<tb><SEP> CHA <SEP> 1/300 <SEP> P.6. <SEP> 1/200 <SEP> 1545 <SEP> 1/200 <SEP> LOM <SEP> 1/100
<tb> PEPTIDE <SEP> 10 <SEP> l <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 2 <SEP> l <SEP> 1 <SEP> l <SEP> 10 <SEP> l <SEP> 5 <SEP >SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP><SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> PF <SEP> 16 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++ <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<Tb>
Tableau 2 Table 2
Claims (16)
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8804406A FR2629460B1 (en) | 1988-04-01 | 1988-04-01 | PF16 PEPTIDES OF A HIV RETROVIRUS - PROCESS FOR THE SYNTHESIS OF THESE PEPTIDES - THEIR USE FOR DIAGNOSIS |
| JP1504146A JPH03503639A (en) | 1988-04-01 | 1989-03-31 | Peptides PF10 to PF19 of retrovirus HIV, methods for the synthesis of said peptides, especially their use for diagnostic purposes |
| EP89400905A EP0349354A1 (en) | 1988-04-01 | 1989-03-31 | Peptides PF10 to PF19 from a retro virus HIV, method for the synthesis of these peptides and their use, particularly in diagnostics |
| PCT/FR1989/000151 WO1989009227A2 (en) | 1988-04-01 | 1989-03-31 | Pf10 to pf19 peptides of an hiv retrovirus, process for synthetizing said peptides and their use, in particular for diagnosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8804406A FR2629460B1 (en) | 1988-04-01 | 1988-04-01 | PF16 PEPTIDES OF A HIV RETROVIRUS - PROCESS FOR THE SYNTHESIS OF THESE PEPTIDES - THEIR USE FOR DIAGNOSIS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2629460A1 true FR2629460A1 (en) | 1989-10-06 |
| FR2629460B1 FR2629460B1 (en) | 1990-12-21 |
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ID=9364921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8804406A Expired - Lifetime FR2629460B1 (en) | 1988-04-01 | 1988-04-01 | PF16 PEPTIDES OF A HIV RETROVIRUS - PROCESS FOR THE SYNTHESIS OF THESE PEPTIDES - THEIR USE FOR DIAGNOSIS |
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| FR (1) | FR2629460B1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0226513A1 (en) * | 1985-12-06 | 1987-06-24 | Institut Pasteur | Peptides capable of inhibiting interactions between antigens and lymphocytes T4, products derived therefrom and their applications |
| EP0242216A1 (en) * | 1986-04-16 | 1987-10-21 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Non-cytopathic clone of Human T-Cell Lymphotropic Virus type III |
| WO1987007642A1 (en) * | 1986-06-16 | 1987-12-17 | Transgene S.A. | Vaccine containing the protein f of the aids virus |
| EP0187041B1 (en) * | 1984-12-24 | 1996-05-15 | Genentech, Inc. | Fusions of AIDS-related polypeptides |
-
1988
- 1988-04-01 FR FR8804406A patent/FR2629460B1/en not_active Expired - Lifetime
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| WO1987007642A1 (en) * | 1986-06-16 | 1987-12-17 | Transgene S.A. | Vaccine containing the protein f of the aids virus |
Non-Patent Citations (4)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2629460B1 (en) | 1990-12-21 |
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