FR2504921A1

FR2504921A1 - Medicament nouveau constitue par un complexe aprotinine-plasmine et procede de preparation de ce nouveau complexe

Info

Publication number: FR2504921A1
Application number: FR8108681A
Authority: FR
Inventors: Edmond Vairel
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1981-04-30
Filing date: 1981-04-30
Publication date: 1982-11-05
Also published as: FR2504921B1; JPS58500610A; WO1982003772A1; EP0077796A1

Abstract

MEDICAMENT NOUVEAU CONSTITUE PAR UN COMPLEXE APROTININE-PLASMINE. PROCEDE DE PREPARATION DE CE COMPLEXE, QUI CONSISTE A METTRE EN CONTACT DE LA PLASMINE OU SON PRECURSEUR, A SAVOIR LE PLASMINOGENE ASSOCIE A UN ACTIVATEUR, AVEC DE L'APROTININE, EN QUANTITES APPROPRIEES, DANS UN SOLVANT APPROPRIE, ET A PURIFIER LE COMPLEXE APROTININE-PLASMINE OBTENU PAR PASSAGE SUR UNE COLONNE SEPHAROSE-LYSINE. APPLICATION EN TANT QUE MEDICAMENT POUR LES TRAITEMENTS FIBRINOLYTIQUES.

Description

La présente invention est relative à un produit nouveau constitué par un complexe aprotinine-plasmine et Dlus particul iornt aprotinine-lys plasalne humaine et à l'utilisation de ce complexe mti- veau en tant que mvicament, notamment en tant que tbrobbolytique.

L'aprotinine est un inhibiteur naturel compétitif d'un certain nombre d'endopeptidases, extrait d'organes de Dovins tels que poumons, pancréas, parotides,dans lesquels il est présent dans les microsomes cellulaires. Son activité d'inhibition, en particulier vis-à-vis de la trypsine, de la kallikréine et de la plasmine, a permis son utilisation en therapeutique, notamment dans les fibrinolyses cataclysmiques en raison de, son activité antiplasmine.

L'Inventeur (cf. VAIREL E.G., ANTOINE G., Ann.

Anesth. Franç., 1963, IV, n special, 23) a pu démontrer que tout syndrome fibrinolytique est déclenché par une coagulation intravasculaire ; or, comme on le sait, une telle fibrinolyse est sous la dépendance de la plasmine, enzyme protéolytique formée à partir d'un précurseur plasmatique, le plasminogène, laquelle dégrade la fibrine qui constitue le caillot, en petits fragments solubles. Ainsi, la plasmine présente dans le sang circulant provoque la fibrinolyse du caillot. Or, l'aprotinine est un antifibrinolytique qui exerce une action d'inhibition de la fibrinolyse, en sorte que l'on aurait pu s'attendre à ce que son administration bien connue en thérapeutique, entraine des phénomènes de coagulation intravasculaire.Or, ce n'est pas le cas : l'aprotinine est très largement utilisée dans le traitement des pancréatites,sans provoquer le développement de syndromes de coagulation intravasculaire, bien que l'on observe dans tous les cas une hypercoagulation accompagnée d'une hyperfibrinolyse.De même, l'Inventeur a montré /VAIREL E.G., HUREAU J., Ann. Pharm.Franç., 1973, 31 (6), 4097 que l'accélération de la coagulation par injection,chez le chien,de kaolin ou de de trypsine, n'est pas modifiée par l'administration d'aprotinine et que l'on n'observe généralement pas de phénomène de coagulation
intravasculaire Par contre, l'administration d'acide
epsilon-amino-caprolque, qui est un inhibiteur synthétique
de la fibrinolyse, à la place de l'aprotinine, provoque la
mort rapide des animaux d'expérience, par infarcissement
cardiovasculaire massif, ce qui tendrait à démontrer que
cet inhibiteur synthétique s'opposerait à la fibrinolyse
aussi bien qu'à la fibrinogénolyse, alors que l'aprotinine
ne serait, in vivo, inhibiteur que de la fibrinogénolyse
(le fibrinogène étant, comme on le sait, le précurseur de
la fibrine, et étant transformé en cette dernière sous
l'action de la thrombine), son action antifibrinolytique
s'expliquant par son action d'inhibition de la plasmine
avec laquelle elle forme in situ un complexe enzyme
inhibiteur, considéré dans la Littérature comme étant
dénué a'activité aussi bien vis-à-vis du fibrinogène que
de la fibrine.

Des complexes plasmine-aprotinine ont été prépa
rés dans l'Art antérieur [cf. "The Journal of Biological
Chemistry, vol. 250, n 10, 25 Mai 1975, p. 3988-3995,
L. SUMMARIA, L. ARZADON, P. BERNABE et K.C. ROBBINS
"The activation of Plasminogen to Plasmine by Urokinase
in the presence of the Plasmin inhibitor trasylol" et
"Thrombosis Research, 17, p. 143-152, B. WIMAN :: "on the
reaction of plasmin or plasmin-streptokinase complex with aprotinin or i2-antiplasmine"] toutefois, ces com
plexes ont essentiellement été préparés dans le but, pour
l'équipe de SUMMARIA et Alia, de démontrer qu'il ne se
produit pas de clivages importants des liaisons peptidiqees
dans la fraction qui comporte un -NH2 terminal, des Glu
plasminogènes humais ou de lapin et dans le Asp
plasminogène de chat ou dans le X-plasminogène de chien,
pendant l'activation par des guantités catalytiques d'Urokinase dans 25 % de glycérol, en présence de
"Trasylol" (dénomination commerciale de l'aprotinine Bayer).

Le but recherché par B. WIMAN a été, par exemple, d'étu
dier la cinétique de la réaction d'inactivation de la plasmine par l'aprotinine par la formation d'un complexe présent au cours d'une première étape de la réaction, sous une forme réversible et, au cours d'une deuxième étape, sous une forme modifiée, également réversible, à partir d'un mélange de plasmine avec un excès (60 %) d'aprotinine par rapport à la plasmine. SUMbURRIA et Alia ont confirmé, dans leur étude précitée, que les complexes plasmineaprotinine sont inactifs en tant qu'enzymes.Aucune de ces publications n'a envisagé la possibilité d'une utilisation de ces complexes en thérapeutique, le but clairement visé de leurs Auteurs étant de tenter d'expliciter des mécanismes biochimi- mes en utilisant la propriété de l'aprotinine d'inhiber la olasnine in situ ,G l'aide de modèles formés in vitro.

L'Inventeur a a présent mis en évidence que le complexe aprotinine-plasmine n'est pas inerte vis-à-vis de la fibrine,dans certaines conditions, et que, de ce fait, il peut être utilisé en tant que nouveau médicament fibrinolytique.

En effet, contrairement à ce que l'on croyait être le comportement du complexe qui se formerait in situ entre l'aprotinine et la plasmine et que l'on considérait comme tout à fait inerte tant vis-à-vis de la fibrine que du fibrinogène, l Inventeur a pu établir que le produit nouveau conforme à l'invention n'est inerte que vis-à-vis du fibrinogène et ne l'est pas vis-à-vis de la fibrine.

De plus, il est connu que les a2antiplasmines contenues dans le plasma sont capables d'inhiber les deuxtiers environ de la plasmine pouvant être générée dans le plasma, a l'égard de laquelle ils jouent le rible d'inhibiteurs naturels présents dans le sang circulant ; de ce fait, il faut,pour que la fibrinolyse puisse se produire, que l'on ait abaissé le taux d'a2antiplasmines jusqu'à un certain point, afin de permettre à la plasmine de jouer son rôle vis-à-vis de la fibrine, ce qui a pour effet une consommation très importante du plasminogène circulant, ce qui né- cessite de pourvoir à un apport externe de plasmine ou de plasminogène.Or, alors que la plasmine présente dans le sang circulant est inhibée par les a2 antiplasmines, l'inventeur a pu établir que lorsque la plasmine est complexée avec l'aprotinine conformément à l'invention, elle est inerte vis-à-vis des a2 antiplasmines, ce qui fait que l'apport de plasmine nécessaire à la fibrinolyse est considérablement réduit et que cette dernière est susceptible d'exercer immédiatement son action.

La présente invention a donc pour objet un médicament nouveau constitué par un complexe aprotinineplasmine.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le médicament nouveau est constitué par un complexe aprotinine-lys plasmine humaine.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe dans un rapport aprotinine/plasmine de 2/1.

La présente invention a également pour objet un nouveau procédé de préparation du complexe aprotinineplasmine, lequel consiste à mettre en contact de la plasmine ou son précurseur, le plasminogène associé à un activateur, avec de l'aprotinine, en quantités appropriées, dans un solvant convenable, le complexe aprotinine-plasmine formé étant purifié par passage sur une colonne de Sépharose-lysine, de manière à éliminer l'excès éventuel d'aprotinine et le cas échéant l'activateur si celui-ci a été précédemment ajoute et le complexe étant ensuite élué par l'acide c-amino-caproSque à une concentration molaire d'au moins 0,05.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, dans le, cas ot l'on met en oeuvre le précurseur de la plasmine, à savoir le plasminogène, celui-ci est un plasminogène partiellement pré-activé tel que celui qui a été décrit dans le Brevet CHOAY nO 73 45289 déposé le 18 Décembre 1973 et publié sous le nO 2 254 316.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, l'activateur associé au plasminogène est l'urokinase.

Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, le mélange d'aprotinine et de plasmine comprend au moins 3500 à 5000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, et avantageusement 3600 à 4000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, la complexation de l'aprotinine et de a plasmine est réalisée par incubation d'un mélange d'aprotinine et de plasmine, ou de plasminogène associé à un activateur, à une température comprise entre l'ambiante et 400C.

Selon une disposition particulière de ce mode de réalisation, dans le cas oh l'on utilise le plasminogène associé à un activateur, la durée de l'incubation est suffisante - de l'ordre d'une heure environ -, pour provoquer la transformation du plasminogène en plasma et la complexation de cette derniere avec l'aprotinine, ce temps pouvant être réduit à quelques minutes dans le cas où l'on met en oeuvre la plasmine.

Conformément à l'invention, le pH du mélange est de tordre de 7,4 + 0,4.

Les différents paramètres ci-dessus indiqués, c 'est-à-dire concentration des produits en présence, température, pH, durée d'incubation, sont ajustés les uns aux autres en vue d'obtenir le complexe désiré. Comme il est bien connu dans ce type de réaction, ces différents paramètres sont généralement en relation directe les uns avec les autres et il est clair que la modification de l'un de ces facteurs conduit à l'ajustement des autres en conséquence.

Egalement conformément à l'invention, le complexe formé conformément à l'invention, est lyophilisé.

La Demanderesse a pu mettre en évidence que le complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention se fixe sur la fibrine, une certaine quantité d'aprotinine se trouve alors libérée et entrainée dans le plasma.

Le complexe ainsi modifié par la fibrine possède alors des propriétés fibrinolytiques qui s'exercent directement sur le support fibrine en l'hydrolysant. Cette modification a été démontrée, conformément a l'invention, par le dosage de l'activité inhibitrice de l'aprotinine sur la trypsine, selon la methode de la Pharmacopée française, d'une part directement et, d'autre part, dans le surnageant trichloracétique 5 z dont la plasmine précipitée est éliminée.

On constate 10) l'absence d'une activité inhibitrice directe du com
plexe sur la trypsine t la totalité de l'inhibiteur
engagé dans le complexe peut être retrouvée dans le
surnageant trichloracétique de la solution du com
plexe ; 20) en présence de fibrine, le complexe acquiert une
activité inhibitrice directe sur la trypsine, ce
qui montre une libération partielle d'aprotinine.

De plus, le surnageant du précipité trichloracétique
de l'ensemble (fibrine, fibrinopeptides, complexe
et aprotinine libre), permet de retrouver dans le
surnageant la totalité de l'aprotinine engagée dans
le complexe.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore, d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.

L'invention vise plus particulièrement le médicament nouveau conforme à l'invention, ainsi que le procédé et les moyens mis en oeuvre pour sa préparation et son utilisation.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du com plément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation du complexe conforme à l'invention, de dosage de l'aprotinine libérée du complexe, ainsi qu'à un compte-rendu d'expérimentations relatives à l'activité pharmacologique du nouveau complexe conforme à l'invention.

Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples de préparation et de dosage et ce compte-rendu d'expérimentations sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dcnt ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1
On mélange - Lys-plasminogène 30 microkatals X - Aprotinine 300 000 UIP - Urokinase 6 000 UCTA dans 2 ml de solution tampon phosphaté 0,15 M, pH 7,4.

te plasminogène activé par la streptokinase ou l'urokinase est dose par son activité estérolytique sur l'ester méthylique de la N-a-acétyl glycyl-L-lysine (AGLME) : l'unité 1 microkatal est l'activité enzymatique qui hydrolyse une mole de substrat par seconde à 300C - pH 8,10.

On incube pendant une heure.

Sur une colonne de lysine-Sépharose (Pharmacia) de 9 mm de diamètre et 14 cm de long, équilibrée avec le tampon phosphate, on effectue une chromatographie d'affinité du mélange incubé.

L'excès d'aprotinine et l'urokinase, non retenus sur le support, sont présents dans un premier pic (1) représenté à la figure unique du dessin annexé, qui apparatt dès l'écoulement d'un volume égal à celui de la colonne.

Le complexe aprotinine-plasmine est élué par le tampon phosphate additionné de 0,05 M d'acide E-amino caproSque (cf. flèche 3). Il appariait dans un pic étroit (2), représentant dans cet essai, 6 ml d'éluat.

Cet éluat est débarrassé de l'acide c-amino- caproique par dialyse. Le dialysat est lyophilisé.

EXEMPLE 2
On mélange - Lys-plasmine 800 mg - Aprotinine 64 mg dans 5 ml d'eau distillée.

On fait incuber 5 mn a température ambiante.

On lyophilise et on obtient environ 850 mg du complexe aprotinine-plasmine, soit un rendement pratiquement quantitatif.

EXEMPLE 3
a) formation du complexe
On mélange
- Lys-plasmine (titrant 2 pKatals/mg) 100 g
- Aprotinine (titrant 50 000 uIP/mg) 8,8 g
On incube dans les mêmes conditions qu'à l'Exemple 2 et on lyophilise ; on obtient environ 100 g du complexe.

b) purification du complexe
On procède comme indiqué à l'Exemple 1, mais avec une colonne de taille adaptée.

CARACTERISATION DU PRODUIT
- Le nouveau complexe conforme à l'invention présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes . son poids moléculaire après filtration sur "ULTROGEL"
est de l'ordre de 90 000 ; sa constante d'association, calculée par FRITZ H.,
SCHULT H., MEISTER R., WERLE E. - Z. Physiol. Chem.,
1969, 350, 1531, est égale à 3 x 108.

- Le complexe peut être en partie dissocié en présence de fibrine, ainsi qu'il est décrit plus loin et acquiert, du fait de sa dissociation partielle, des propriétés fibrinolytiques.

- Les caractéristiques biologiques du complexe conforme à l'invention, sont les suivantes il est inactif vis-à-vis du fibrinogène, en milieu
plasmatique, il est inactif vis-à-vis d'un excédent de plasmine.

Dosage de l'aprotinine libérée du complexe
On dose l'aprotinine libérée du complexe, en procédant comme décrit ci-après, dans le but de déterminer la quantité d'aprotinine fixée par microkatal de plasmine, dans le complexe conforme à l'invention.

a) On forme le complexe aprotinine-plasmine conforme à
l'invention à partir
. de 25 microkatals de Lys-plasminogène humain
dont l'activité a été préalablement mesurée,
. d'urokinase,
. et d'un excès d'aprotinine (cf. Exemple 1 ci
dessus) ;
on incube pendant une heure à 37 C.

On filtre sur une colonne de lysine-Sépharose qui
retient le complexe, tandis que l'excès d'aprotinine
et l'urokinase, qui ne sont pas retenus sur le sup
port, s'écoulent de la colonne.

Le complexe aprotinine-lys plasmine humaine obtenu,
est élué par de l'acide c-amino-caprolque, puis dia
lysé pour éliminer ce dernier.

b) On dissout le complexe obtenu dans du sérum physiolo
gique c) on ajoute à cette solution, de l'acide trichloracéti
que concentré en quantité suffisante pour obtenir une
concentration finale d'acide trichloracétique de 5 t
dans la solution de complexe. Il se forme un précipité
contenant la plasmine décomplexée, lequel est éliminé
par centrifugation.

On recueille le surnageant, qui contient l'aprotinine ;
on ajuste le pH à 8, puis on dose l'aprotinine présente
dans le surnageant, par inhibition de l'action de la
trypsine sur BAEE, à 253 nm, suivant la méthode de la
Pharmacopée Française.

Le dosage montre que 100 000 UIP d'aprotinine ont été
libérées du complexe, soit environ 4000 uIP par micro
katal de plasmine.

COMPTE-RENDU D'EXPERIMENTATIONS DEMONTRANT L'ACTIVITE
PHARMACOLOGIQUE DU COMPLEXE CONFORME A L'INVENTION
1 ) Comportement du complexe aprotinine-plasmine au contact de la fibrine
500 mg de fibrinogène humain (Kabivitrum) sont dissous dans 80 ml de tampon Tris- ClH, pH 7,4, 0,05 M contenant 0,01 % de mercurothiolatê de sodium ; 20 ml de plasma humain citraté sont ajoutés à cette solution (apport de facteur XIII).

Sous agitation, sont ajoutés 100 NIH de thrombine (Roche) dissous dans lo ml de solution de Cl2Ca M/20.

Après 20 minutes d'incubation à 370C, la fibrine est recueillie par centrifugation, puis mise en suspension dans 500 ml du tampon Tris par dispersion mécanique (Ultraturax).

Après agitation de 15 minutes, la fibrine est recueillie par centrifugation à + 10 C et remise en suspension dans 500 ml de tampon et agitée de la même manière que précédemment. Ce lavage est éventuellement répété afin d'obtenir une fibrine insensible à l'urokinase Choay ou à la streptokinase Behring (à 1 ml de suspension de fibrine, 0,1 ml de solution de SK à 1000 UI/ml ou 0,1 ml d'UK à 1000 UCTA/ml est ajouté ; aucune dissolution ne doit être observée après incubation d'une heure à 370C).

La totalité de la fibrine est alors dispersée mécaniquement dans 50 ml de tampon. Cette suspension sert à constituer une colonne de 15 cm de long et de 0,9 cm de diamètre. Cette colonne est alimentée en continu par une pompe, l'effluent est analysé par un lecteur U.V.

avant d'être distribué par un collecteur de fractions (matériel LKB). L'équilibre de la colonne est obtenu par passage de la solution tampon Tris sous un débit de 10 ml/heure pendant 2 heures.

20) Comportement du complexe apro~~nine-lys~plasmine humaine vis-à-vis de la fibrine en milieutampon
2 ml de la solution du complexe inactif correspondant à 8 microkatals de plasmine et additionnés de 50 000 uIP d'aprotinine en excès, sont déposés au sommet de la colonne de fibrine, puis un débit de 10 ml/heure de tampon est appliqué.

Résultats
Un pic apparaît entre le poème et le 16ème ml d 'ef fluent ; il contient uniquement l'aprotinine ajoutée en excès en même temps que la dissolution du sommet de la colonne est observée, dissolution qui est complète après 90 minutes.

Ceci prouve que l'aprotinine n'est pas adsorbée sur la fibrine et qu'à partir du moment où seul le complexe se trouve en présence de fibrine, la dissolution de cette dernière est observée.

Si au début de l'observation de la lyse, le tampon est additionné de 0,05 M d'acide #-amino-caproïque, la dissolution de la fibrine ne se poursuit pas et le complexe, comme décrit plus loin, est élué de la fibrine iS apparait dans un pic assez large.

En remplaçant la fibrine comme support par le
Sépharose-lysine défini par DEUTSCH D. et MERTZ E.T
Science 1970, 170, 1095 pour la purification du plasminogène, on observe que le complexe aprotinine-plasmine est retenu sur la colonne de Sépharose-lysine, alors que l'aprotinine en excès est éliminée ; l'excès d'aprotinine est présent dans l'éluat frontal et le complexe est élué par l'acide c-amino-caproSque. Cette observation a été utilisée pour le développement du procédé de préparation du complexe conforme à l'invention tel que décrit à l'Exemple 1 ci-dessus.

Conclusions
Le complexe aprotinine-plasmine, dont la constante d'association est très forte, 3 x 108 (FRITZ H.,
SCHULT H., MEISTER R., WERLE E. - Z. Physiol. Chem., 1969, 350, 1531), est partiellement dissocié en présence de fibrine. Tout se passe comme si le complexe aprotinineplasmine transformé comme décrit plus loin, formait un complexe transitoire avec la fibrine.

30) CompQrtement~du~complexe~ap~otinine~plasm~ne en milieu Slasmatigue humain
A/ Mise en évidence de l'action lytique sur la fibrine
La colonne de fibrine étant réalisée comme précédemment, 20 ml de plasma humain citraté dilués au 1/2 avec le tampon Tris ont servi a équilibrer la colonne sous un débit de 12,5 ml/heure.

2 ml de la solution du complexe inactif correspondant a 8 microkatals de plasmine, sont additionnés de 50 000 uIP d'aprotinine en excès, puis mélangés a 100 ml de plasma humain citraté dilué au 1/2 avec la solution tampon. Ce mélange a été passé sur la colonne de fibrine avec un débit de 12,5 ml/heure, puis 300 ml de plasma dilué au 1/2 ont été passés.

Résultants
a) L'inhibiteur se libère beaucoup plus lentement que dans le premier cas considéré et il faut attendre le passage de 50 ml de plasma d'élution pour qu'il soit complètement élué.

b) la fibrinolyse débute après que 100 ml de plasma d'élution soient passés au travers de la colonne. Cette lyse se poursuit, mais se limite à la moitié de la colonne. Ceci peut être dû à l'intervention des a2 anti- plasmines présentes en large excès dans le plasma. Il peut être également supposé qu'après 48 heures, la plasmine soit dégradée.

Conclusions
L'expérience réalisée en milieu plasmatique démontre que le complexe aprotinine-lys-plasmine humaine est également dissocié en milieu plasmatique humain et qu'il exerce son action fibrinolytique, ce qui permet d'envisager son utilisation comme thérapeutique spécifique de choix des coagulations intravasculaires.

B/ Mise en évidence de la libération d'aprotinine en
milieu plasmatique
a) On fait transiter le complexe aprotinineplasmine conforme à l'invention comprenant 10 microkatals de plasmine et 40 000 uIP d'aprotinine (1 microkatal pour 4 000 uIP), en solution dans 50 ml de plasma dilué au 1/2, à travers une colonne remplie de fibrine. Le complexe se fixe sur le caillot de fibrine.

b) On fait alors transiter à travers la colonne du plasma humain citraté, dilué au 1/2 et ne contenant pas de complexe.

Ce plasma dilué au 1/2, ayant transité au travers de la colonne, additionné de 25 u de streptokinase par ml et coagulé par la thrombine, donne un caillot dont le temps de lyse est de l'ordre de 5 mn.

Ce même plasma ayant transité au travers -de la colonne de fibrine chargée de complexe, additionné de la même manière de 25 u de streptokinase/ml et coagulé par la thrombine, donne un caillot dont le temps de lyse est supérieur à 35 mn.

Ceci montre que le plasma, en transitant au travers de la colonne s'est chargé d'inhibiteur, augmentant ainsi le temps de lyse.

Cette expérirentation illustre clairement que le complexe aprotinine-plasmine ne devient actif en tant que fibrinolytique qu'en présence de fibrine et après libération d'une partie de l'aprotinine initialement complexée dans le milieu plasmatique, ce qui met en évidence les deux formes sous lesquelles le complexe se présente, à savoir : - une forme stable inactive dans laquelle l'aprotinine est présente dans une proportion de 2/1 par rapport à la plasmine et une forme active, dans laquelle le rapport aprotinine-plasmine s'est abaissé, une partie de l'aprotinine ayant été libérée dans le plasma, en présence de fibrine.

40) Etude de la durée de la presence du complexe aprotinine-plasmine dans le sang circulant après injection intraveineuse au lapin
A. Le potentiel fibrinolytique du sang est étudié en utilisant une des méthodes d'étude des fibrinolytiques; celle-ci est décrite page 274 et suivantes par E.G. VAIREL dans "Progress in Chemical fibrinolysis and thrombolysis", vol. 1, édité par J.F. Davidson, M.M. Samama et P.C.

Desnoyers - Raven Press - New York.

Le sang citraté (1/20 de citrate de sodium à 9%) est centrifugé pour obtenir un plasma pauvre en plaquettes.

Le plasma citraté est recalcifié et on introduit aussitôt 0,5 ml dans le tube central à fond poreux, alors qu'en même temps, on obtient le même niveau dans le tube externe, avec une solution tampon pH 7,4, 0,15 mg Les tubes sont maintenus à 370C. Après coagulation ferme, le lavage est obtenu par addition de tampon à 37 C dans le tube externe ; la différence de niveau obtenue fait que le tampon pénètre au travers du caillot de bas en haut, et réalise son lavage. Le liquide de lavage après avoir traversé le caillot, est éliminé par siphonnage. Ce lavage peut être arrêté après 3 heures. Les tubes sont maintenus à 37 C.

Après 24 heures, un caillot constitué à partir de sang normal n'a subi aucune modification ; un caillot constitué à partir de sang contenant du complexe aprotinineplasmine conforme à l'invention a subi une dissolution partielle ou totale.

L'observation de la lyse du caillot plasmatique d'un animal ayant reçu préalablement une injection de complexe aprotinine-plasmine signifie que du complexe aprotinine-plasmine est encore présent dans le sang au moment du prélèvement. Ceci montre que le complexe est susceptible de poursuivre son action pendant une durée prolongée, ce qui n'est pas observé avec les fibrinolytiques actuellement utilisés en clinique (streptokinase, urokinase ou plasmine).

L'Inventeur a pratiqué cet essai en prélevant le sang dans l'artère centrale de l'oreille avant l'administration du complexe aprotinine-plasmine, puis 1 mn après, 30 minutes après, 2 heures, 4 heures et 5 heures 30 après l'injection dans la veine marginale de l'oreille.

Les résultats observés après injection de 25 microkatals de lys-plasmine inhibée par 2mg d'aprotinine pure, sont consignés dans le Tableau cf-après.

Le signe "+" indique que le caillot a lysé.

Le signe "O" qu'il n'y a pas eu de lyse.

On constate que, chez 5 animaux sur 6, le complexe est encore présent à la 2ème heure et que chez 3 animaux sur 6, il est encore présent au cours de la 5ème heure.

T A B L E A U
L Y S E D U C A I L L O T L A V E

<SEP> Lapins <SEP> n <SEP> 85 <SEP> 87 <SEP> 89 <SEP> 90 <SEP> 25 <SEP> 26
<tb> Prélèvement <SEP> 1 <SEP> mn <SEP> après <SEP> I.V. <SEP> + <SEP> +
<tb> 30 <SEP> mn <SEP> après <SEP> I.V. <SEP> + <SEP> +
<tb> 45 <SEP> mn <SEP> après <SEP> I.V. <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 2 <SEP> heures <SEP> après <SEP> I.V. <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> +
<tb> 3 <SEP> h <SEP> 30 <SEP> mn <SEP> après <SEP> I.V. <SEP> 0 <SEP> + <SEP> + <SEP> Prélèvement
<tb> <SEP> impossible
<tb> 5 <SEP> h <SEP> 30 <SEP> mn <SEP> après <SEP> I.V. <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pré- <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> lèvement
<tb> Nota : Un essai de contrôle est effectué pour chaque animal, avec le sang prélevé avant
iniection du complexe. Dans tous les cas, aucune lyse n'est observée.

+ = lyse du caillot 0 = pas de lyse du caillot
5 ) Etude de l'activité fibrinolytique du com
plexe aprotinine-plasmine in vivo
Cette étude a été effectuée sur le lapin.

18 animaux ont été utilisés.

On dégage une fémorale de lapin, on fait une ligature d'amont amovible, et, après avoir chassé le sang de la partie fémorale dégagée, on fait une ligature d'aval, également amovible.

A l'aide d'une petite aiguille de 5/10è, on injecte dans la partie ainsi isolée, du sang prélevé dans l'artère centrale de l'oreille du lapin ( soit environ 0,05 à 0,10 mi).

L'aiguille étant maintenue en place, on injecte 0,01 ml de solution de thrombine concentrée.

Il se forme presque immédiatement un caillot à l'intérieur de la partie isolée. On déplace alors la ligature d'aval en direction de la ligature d'amont, de manière que la ligature d'aval se trouve en amont du trou de piqûre, puis on lève très légèrement la ligature d'amont pour faire pénétrer un peu de sang dans le sac formé par les deux ligatures.

Le sang introduit se coagule sous l'effet de la thrombine précédemment introduite dans le sac.

On laisse les deux ligatures en place pendant 1/4 d'heure au bout duquel on retire totalement la ligature d'amont.

La thrombine contenue dans le caillot diffuse alors et s'étend dans des zones non dénudées.

Une heure après le début de l'expérience, on lève la ligature d'aval.

Résultats
Animagu~temQins :
Des obseflations effectuées 24 heures et 48 heures plus tard, montrent que l'artère est complètement bouchée et que le caillot reste en place.

Animaux traités
12 lapins sont traités immédiatement après l'en lèvement de la ligature d'aval, par une injection massive de complexe comprenant 50 microkatals de plasmine et 200 000 uIP d'aprotinine dans la veine marginale de l'oreille.

On observe chez 50 % des animaux la libération totale de l'artère dans les 24 heures qui suivent l'injection.

Cette étude montre que, dans les conditions expérimentales, le complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention est capable de lyser un caillot in vivo chez le lapin.

60) Tests de toxicité
On a injecté à la souris une quantité de complexe comprenant 2 microkatals de plasmine et 8 000 uIP d'aprotinine dans 0,5 ml de sérum physiologique, par voie intraveineuse. On a utilisé pour réaliser ces tests de toxicité, dix animaux : aucune anomalie n'a été constatée : les dix animaux étaient vivants au bout de 21 jours.

70) Indications et posologie
Le nouveau complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention est particulièrement indiqué pour tous traitements fibrinolytiques et notamment pour le traitement des embolies, des thromboses, des microcaillots des capillaires, des coagulations intravasculaires disséminées (CIVD) fréquentes en néphrologie, etc...

La stabilité du complexe conforme à l'invention pourrait avantageusement être utilisée pour obtenir une fibrinolyse thérapeutique locale, notamment dans les thromboses artérielles, du fait que son activité se prolonge pendant plusieurs heures, au lieu de ne durer que quelques minutes comme c'est le cas pour les fibrinolytiques actuellement connus.

Le complexe est avantageusement dosé de manière à administrer de 50 à 300 microkatals de plasmine complexée avec l'aprotinine par 24 heures.

Le complexe conforme à l'invention est avantageusement administré en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable, tel que le soluté chloruré isotonique, par exemple, par voie parentérale, de préférence intraveineuse.

Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre et de réalisation adoptés, l'on obtient un médicament doué d'une activité fibrinolytique efficace et rapide, à des doses relativement réduites.

Ainsi que cela ressort de ce qui précede, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre et de réalisation qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1 - Médicament nouveau caractérise en ce qu'il est constitué par un complexe aprotinine-plasmine. 20- Médicament nouveau selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un complexe aprotinine-lys plasmine humaine. 3 - Complexe selon la Revendication 1 ou la Reven dication 2, caractérisé en ce que la plasmine est présente sous la forme de son précurseur, le plasminogène associé à un activateur. 40- Complexe selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe, dans un rapport aprotinine/plasmine de l'ordre de 2/1. 5 - Procédé de préparation du nouveau médicament selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact de la plasmine ou son précurseur, le plasminogène associé à un activateur, avec de l'aprotinine, en quantités appropriées, dans un solvant convenable, le complexe aprotinine-plasmine formé étant purifié par passage sur une colonne de Sépharose-lysine, de manière à éliminer l'excès éventuel d'aprotinine et le cas échéant l'acti- vateur, si celui-ci a été précédemment ajouté, le complexe étant ensuite élué par l'acide #-amino-caproïque à une concentration molaire d'au moins 0,05 M. 60- Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce que dans le cas où l'on met en oeuvre le précurseur de la plasmine, à savoir le plasminogène, celui-ci est de préférence du lys-plasminogène et notamment du lys-plasminogène humain. 70- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que l'activateur associé au plasminogène, est l'urokinase. 80- Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce que le mélange d'aprotinine et de plasmine comprend au moins 3 500 à 5 000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, et avantageusement 3 600 à 4 000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine. 9 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la complexation de l'aprotinine et de la plasmine est réalisée par incubation d'un mélange d'aprotinine et de plasmine, ou de plasminogène associé à un activateur, à une température comprise entre l'ambiante et 400C. 100- Procédé selon la Revendication 9, caractérisé en ce que dans le cas où l'on utilise le plasminogène associé à un activateur, la durée de l'incubation est suffisante - de l'ordre d'une heure environ - pour provoquer la transformation du plasminogène en plasmine et la complexation de cette dernière avec l'aprotinine, ce temps pouvant être réduit à quelques minutes dans le cas où l'on met en oeuvre la plasmide.

11 - Procédé selon l'une quelconque des Revendications 5 à 10, caractérisé en ce que le pH du mélange est de l'ordre de 7,4 + 0,4.

120- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 5 à 11, caractérisé en ce que le complexe formé est lyophilisé.