FR2589166A1

FR2589166A1 - Procede de determination de l'activite des dnases

Info

Publication number: FR2589166A1
Application number: FR8515882A
Authority: FR
Inventors: Marc Lans; Henryck Taper; Marcel Roberfoid
Original assignee: Sopar NV SA
Current assignee: Sopar NV SA
Priority date: 1985-10-25
Filing date: 1985-10-25
Publication date: 1987-04-30
Also published as: FR2589166B1; JPS62107799A

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LA DETERMINATION DE L'ACTIVITE DES DNASES DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES. ON AJOUTE LE LIQUIDE BIOLOGIQUE A EXAMINER A UN MILIEU DE REACTION COMPOSE D'UNE SOLUTION TAMPON, D'UN SEL SOLUBLE DE MAGNESIUM, D'UN SEL SOLUBLE DE CALCIUM ET D'ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE; ON MAINTIENT LE MELANGE AINSI OBTENU PENDANT 45 A 90 MINUTES A UNE TEMPERATURE DE 45 A 63C, PUIS ON LE DENATURE, ON SEPARE LES SUBSTANCES INSOLUBLES ET ON SOUMET LE LIQUIDE RESTANT A UNE MESURE SPECTROPHOTOMETRIQUE A 260NM PAR RAPPORT A UNE SOLUTION DE REFERENCE QUI CONTIENT EN PLUS UN INHIBITEUR DES DNAASES. LE PROCEDE EST APPLICABLE NOTAMMENT AU DIAGNOSTIC DU CANCER ET A L'EVALUATION DE L'EFFICACITE DES THERAPEUTIQUES APPLIQUEES A SON TRAITEMENT.

Description

La présente invention concerne un procédé de détermination de l'activité du complexe d'enzymes désoxyribonucléique (DNAses) dans les liquides biologiques, cette détermination trouvant son application notamment au diagnostic du cancer et à l'évaluation de l'efficacité des thérapies appliquées à son traitement.

I1 a été constaté que l'activité des DNAses dans les liquides biologiques est modifiée chez des sujets porteurs de tumeurs malignes (par rapport à cette activité des DNAses chez des sujéts sains).

I1 a également été constaté que le traitement thérapeutique des patients cancéreux provoque un changement de l'activité des DNAses dans leurs liquides biologiques, tout au moins lorsque la réaction au traitement est positive.

C'est ainsi qu'on a pu observer que la moyenne d'activité sérique des DNAses chez les patients porteurs de tumeurs malignes est significativement (p( 0,01) plus basse que la moyenne observée chez les personnes saines.

Par ailleurs, lors du traitement thérapeutique de patients cancéreux, on n'observe pas de changement de l'activité sérique des DNAses, dans le cas de tumeurs résistant au traitement, tandis que lorsque la réaction au traitement est positive, on constate une nette diminution de l'activité sérique des DNAses durant les quelques jours qui suivent le début du traitement.

L'invention sera décrite ci-après en se référant aux dessins annexés, dans lesquels
- Fig. 1 est la distribution des DNAses alcalines dans le sérum des sujets sains et des patients cancéreux non traités;
- Fig. 2 est le profil d'évolution de l'activité des DNAses alcalines chez un patient cancéreux traité par radiothérapie;
- Fig. 3 est une courbe analogue pour un patient cancéreux traité par chimiothérapie;
- Fig. 4 est une vue en coupe d'un appareil avantageusement utilisé pour l'exécution du procédé conforme à l'invention.

Dans le cas d'une réponse immédiate favorable au traitement thérapeutique durant les semaines qui suivent la fin du traitement, l'activité sérique des
DNAses alcalines peut évoluer de trois manières : a) l'activité sérique des DNAses augmente au point de dépasser la valeur d'origine et atteint la moyenne observée chez les personnes saines. Cette évolution indique une rémission totale (Fig. 2 et Fig. 3); b) l'augmentation n'atteint pas la moyenne et la rémission observée est considérée comme partielle; c) l'activité des DNAses n'augmente pas dans les semaines qui suivent le traitement et une progression fatale de la tumeur est à craindre.

Si on disposait donc d'une méthode fiable et sensible permettant de mesurer l'activité des DNAses, on pourrait dépister l'existence d'une tumeur maligne et vérifier si tel traitement thérapeutique est efficace ou non et, dans l'affirmative, suivre son déroulement et son degré de succès et établir ainsi de manière simple et rapide la thérapie optimale pour chaque patient individuellement.

Pour qu'une telle méthode de mesure de l'activité des DNAses puisse être efficace, il faudrait qu'elle soit 1) suffisamment sensible pour déterminer de manière probante le niveau d'activité des DNAses chez l'homme, 2) qu'elle soit parfaitement reproductible et 3) qu'elle soit simple au point de pouvoir être utilisée par le personnel habituel d'un laboratoire d'analyse médicale.

Les procédés connus pour la détermination de l'activité des DNAses ne remplissent pas l'ensemble de ces conditions. Deux procédés se distinguent par leur relative simplicité et sont basés sur la mesure de l'extinction spectrophotométrique à 260 nm des polynucléotides solubles en milieu acide libérés par l'hydrolyse du DNA, à savoir a) la méthode de Loiselle et Carrier (Rev. Can. Biol., 22, 341-346 (1963)).

On ajoute 0,5 ml d'un sérum à examiner à 0,3 ml d'une solution à 0,4% de DNA (de sperme de saumon) dans 2 ml d'une solution tampon de pH 7,6 (Tris-HCl, 0,05 M) et de 0,1 ml d'une solution de chlorure de magnésium (0,342 M) et de chlorure de calcium (0,0162 M), ensuite on dilue avec une solution de sucrose à 0,35 M pour obtenir 3,6 ml. Après une incubation de 3 heures, à 370C, on y ajoute 1,2 ml d'acide perchlorique à 25% (ce qui correspond à 4 M), et après 10 minutes, on centrifuge la solution à 2800 g. On mesure l'extinction de la solution à 260 nm.

b) la méthode de Spandidos et al. (Europ. J. Cancer, 16, 1615-1616 (1980)).

On dilue 100 pg de DNA (de thymus de veau) dans une solution tampon à pH 8 (Tris-HCl). On y ajoute 25 ss du sérum à examiner, et on maintient la solution pendant 15 minutes à 250C. Ensuite, on y ajoute 2 ml d'acide perchlorique (1,5 M) à 4"C et on centrifuge la solution à 3000 g. L'extinction de la solution est mesurée à 260 nm.

Ces deux procédés ne sont malheureusement pas suffisamment sensibles.

Ainsi, pour la méthode de Loiselle et Carrier, malgré un temps d'incubation de 3 heures, un volume important de sérum, une quantité importante de DNA il arrive souvent qu'on ne parvient pas à mettre en évidence l'activité enzymatique.

D'autre part, la méthode de Spandidos utilise une quantité faible de DNA, un volume faible de sérum, pas d'ions ajoutés et l'incubation dure 15 minutes seulement à 25 C. Mais, cette méthode donne.

souvent des valeurs négatives (par rapport au test blanc) et non reproductibles, le même échantillon donnant des variations de densité optique.

Le fait que l'activité n'est pas décelée est probablement dû à l'absence d'ions dans le milieu d'incubation, ce qui diminue de manière substantielle l'activité enzymatique. En effet, il est connu que l'ion Mg++ active l'enzyme et que l'ion Ca++ potentialise cette action.

Le but de l'invention est d'offrir un procédé simple, reproductible, à sensibilité élevée et universellement applicable, pour déterminer l'activité des
DNAses dans des liquides biologiques.

Le nouveau procédé selon l'invention est un procédé de détermination de l'activité des désoxyribonucléases dans des liquides biologiques, par la détermination spectrophotométrique à 260 nm des produits d'hydrolyse de l'acide désoxyribonucléique, après incubation pendant un temps déterminé. Selon l'invention on ajoute le liquide biologique à examiner à un milieu de réaction composé d'une solution tampon à pH 7-9, de préférence 8, d'un sel soluble de magnésium, d'un sel soluble de calcium et de l'acide désoxyribonucléique. On maintient le mélange de réaction ainsi obtenu pendant 45 à 90 minutes, de préférence 60 minutes, à une température de 45 à 63"C, de préférence à une température de 55 à 600C et on le dénature.

On sépare les substances insolubles du mélange de réaction soit par filtration à travers de micropores, soit par une ultracentrifugation, de préférence à plus de 40000 g.

On peut utiliser comme filtre une ou plusieurs membranes de nitrocellulose ou de Téflon ou de PVC. Le diamètre des pores est avantageusement de 0,30 à 0,60)Lm.

On soumet le liquide restant à une mesure spectrophotométrique à 260 nm par rapport à une solution de référence (blanc) préparée dans les mêmes conditions opératoires, mais auquel on ajoute un inhibiteur des DNAses tel que 1'EGTA (acide éthylène bis-(oxyéthylénenitrile)tétracétique) qui bloque l'activité enzymatique.

Le nouveau procédé est particulièrement utile pour le diagnostic et le dépistage de tumeurs malignes, pour mettre en évidence la sensibilité des tumeurs a la thérapie appliquée et pour suivre le déroulement et le succès d'un traitement.

Une différence technique essentielle par rapport aux procédés connus est l'incubation à une température de 45 à 630C, idéalement de 55 à 600C, pendant un temps de réaction de 45 à 90 minutes.

L'effet favorable de cette température relativement élevée parait à première vue facile à concevoir, car une augmentation de la température donne une augmentation de la vitesse de réaction et une meilleure utilisation de la réactivité des ingrédients.

En fait, ceci est exact en ce qui concerne les réactions chimiques normales, mais ne peut pas être appliqué tel quel aux réactions biochimiques faisant intervenir les protéines telles que les enzymes. Les réactions impliquant des enzymes se déroulent d'habitude à la température ambiante ou physiologique, en quelques minutes et, en général, ne peuvent supporter les températures au-dessus de 40"C. Il en ressort que la température utilisée pour l'invention est supérieure à la température habituelle. En effet, les températures de réaction du procédé de l'invention se trouvent dans une zone où, normalement, les protéines comme les enzymes, les albumines ou les histones accompagnant le
DNA se dénaturent, de sorte qu'il n'y a plus de réaction biochimique.A cette température élevée, le spécialiste s'attend donc à n'avoir aucune amélioration, mais plutôt une diminution drastique de l'activité.

Mais le Demandeur a découvert que l'activité des DNAses subit une légère augmentation avec l'augmentation de la température. Ensuite, à partir de 450C, l'augmentation de l'activité fait un bond qui ne s'explique plus par une activation normale due à une hausse de température, mais par le fait que l'enzyme est liée, au moins partiellement, à une substance complexante, et que ce complexe est scindé ou détruit à partir de 450C. I1 en résulte une forte augmentation de l'activité qui augmente la sensibilité du procédé d'un facteur pouvant aller jusqu'à 30, ce qui constitue un autre avantage incontestable du procédé.

Le Demandeur a constaté qu'il est avantageux de conduire cette incubation à une température voisine de 55bu. En effet, à partir de 60"C, on peut observer une dénaturation de l'enzyme, qui, à partir de 63"C, est si forte que la chute d'activité empêche toute détermination.

Le procédé de détermination se déroule par une réaction du liquide biologique avec une quantité déterminée de DNA qui se trouve dans le milieu de réaction et par un maintien pendant un temps déterminé à une température constante. Ensuite, on arrête la réaction par l'addition d'une substance dénaturante, qui bloque l'activité enzymatique.

Après dénaturation, les substances non solu bles seront éliminées du mélange de réaction. Le
Demandeur a constaté qu'une centrifugation à 20003000 g ne suffit pas pour obtenir une séparation qui donne des valeurs d'extinction reproductibles. I1 reste encore beaucoup de substances dans la partie liquide qui influencent de façon non contrôlée l'extinction à 260 nm. Le Demandeur a alors trouvé qu'on peut obtenir une séparation totale de toutes les substances solides du mélange dénaturé et de là une très bonne reproductibilité, si on soumet le mélange dénaturé pendant + 5 minutes, à une ultracentrifugation à plus de 40000 g. Mais ceci ne permet pas une utilisation universelle du procédé.

Le Demandeur a encore trouvé qu'il est possible de séparer le mélange de réaction dénaturé par filtration, de sorte qu'il ne reste plus de substances solides qui dérangeraient la reproductibilité de la mesure d'extinction. Pour une bonne filtration, il est indiqué d'utiliser des filtres dont le diamètre des pores est de 0, 3-0, 6 iem. Des filtres à plus petits pores ralentissent trop la vitesse de filtration, et des filtres à plus grands pores ne donnent pas de séparation suffisante.

Quoique, en principe, toute membrane inerte à pores de cette dimension puisse convenir comme filtre, le Demandeur a constaté que les filtres à membranes nitrocellulose ou Téflon sont préférables. On peut utiliser une ou plusieurs couches de filtres et combiner les deux sortes de filtres.

Pour faciliter la filtration, il est utile de centrifuger le récipient d'abord brièvement pour que les grands coagulats se posent au fond.

On mesure de manière connue l'extinction à 260 nm de la solution filtrée et on la compare à une solution de référence. On prépare la solution de référence dans les mêmes conditions opératoires en ajoutant de 1'EGTA avant incubation.

Le procédé de l'invention peut être effectué par le personnel habituel d'un laboratoire d'analyse médicale et il donne des résultats fiables et bien reproductibles.

Pour comparer la technique de l'invention avec les procédés Loiselle et Spandidos connus, on a soumis un échantillon du sérum de cinq personnes saines et quatre patients atteints d'une tumeur aux trois méthodes de détermination de l'activité des DNAses, à savoir celle de Loiselle, celle de Spandidos et celle de l'invention. Les conditions opératoires de ce test comparatif sont données dans le tableau récapitulatif suivant.

TABLEAU RECAPITULATIF
Méthode I II III
Loiselle Spandidos "Méthode
de l'in
vention"
Type de DNA utilisé sperme thymus thymus
de de de
saumon veau veau
Quantité de DNA/test 1200 g 100 g 500pLg
Tampon Tris-HCl 0,05 M 0,1 M 0,1 M pH 7,6 8 8 MgC12 342 mM - 5 mM
CaCl2 16,2 mM - 0,25 mM
Vol. de sérum 500 l 25 1 200 l
Sucrose 0,35 M 700 l - -
Vol. final d'incub. 3,6 ml 1 ml 1 ml
Température d'incub. 370C 250C 550C
Temps d'incubation 180 min 15 min 60 min
Acide perchlorique (PCA) 4 M 1,5 M 1,5 M
Volume de PCA 1,2 ml 2 ml 2 ml
Centrifugation 2800 g 3000 g 45000 g
Le tableau II montre les résultats des mesures spectrophotométriques faites à 260 nm pour les trois méthodes par rapport aux blancs respectifs.

<tb> <SEP> LOISELLE <SEP> SPANDIDOS <SEP> METHODE <SEP> SELON
<tb> <SEP> L'INVENTION
<tb> <SEP> Echan- <SEP> 37"C <SEP> 25"C <SEP> 370C <SEP> * <SEP> 550C
<tb> <SEP> tillon
<tb> <SEP> Normal
<tb> <SEP> 1 <SEP> 115 <SEP> -63 <SEP> 260 <SEP> 1498
<tb> <SEP> 2 <SEP> 80 <SEP> -106 <SEP> 87 <SEP> 1211
<tb> <SEP> 3 <SEP> 92 <SEP> -57 <SEP> 112 <SEP> 1414
<tb> <SEP> 4 <SEP> 37 <SEP> -16 <SEP> 51 <SEP> 396
<tb> <SEP> 5 <SEP> 55 <SEP> -78 <SEP> 62 <SEP> 865
<tb> Pathologique
<tb> <SEP> 6 <SEP> 21 <SEP> -144 <SEP> 22 <SEP> 502
<tb> <SEP> 7 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 81 <SEP> 172
<tb> <SEP> 8 <SEP> 98 <SEP> -39 <SEP> 119 <SEP> 1486
<tb> <SEP> 9 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 1 <SEP> 39
<tb>

ILLIS = illisible. Les chiffres sont donnés en millièmes de densité optique.

* = à titre indicatif mais non conforme à l'invention.

Ce tableau montre que la méthode Spandidos ne donne que des résultats négatifs non interprétables.

D'autre part, la diminution de l'activité des DNAses due aux tumeurs chez le patient cancéreux peut être telle qu'elle n'est plus décelable par la méthode trop peu sensible de Loiselle. Quand la mesure d'extinction n'est que de quelques dizaines de millièmes de densité optique au départ et que l'on désire examiner si un traitement est positif par une diminution de la densité optique, cela n'est plus possible avec la méthode
Loiselle, trop peu sensible dès le départ. De plus, dans deux cas pathologiques sur quatre, la lecture était illisible probablement due à l'interférence des substances solides en suspension. Enfin les chiffres dans le tableau étant des moyennes de plusieurs expériences du même échantillon, on a pu constater une divergence de résultats pour les procédés connus et une reproductibilité fiable pour le procédé de l'invention.

On constate, en tout cas, que la méthode selon l'invention, à 55"C, est nettement plus sensible que celle de Loiselle, la sensibilité étant augmentée a d'un facteur qui peut dépasser 20.

Les liquides biologiques susceptibles d'être testés sont notamment le sang, les liquides céphalorachidiens, les ponctions pleurales, le liquide lymphatique, le suc pancréatique et le liquide biliaire, l'urine ou les parties solubles séparées des particules solides d'homogénats de tissu ou de glandes.

Pour la détermination, il faut de 100 à 500)lu, de préférence 200#l, de liquide biologique qui sera incubé dans le milieu de réaction préparé au préalable. Le milieu de réaction contient une certaine quantité de DNA dans une solution tampon, qui garde le pH à un degré optimal et à laquelle on ajoute une petite quantité de sel de magnésium et de calcium. La quantité de DNA nécessaire se situe entre 250 et 750 > zg, de préférence à 500pug. Cette quantité est si grande que les fluctuations mineures de quantité qui surviennent par une divergence de pesage ou par des matériaux additionnés (par exemple histone) n'occasionnent aucune influence notable ou erreur à la détermination de l'activité.

L'origine des DNA est d'une importance secondaire, même si les DNA de différentes provenances se distinguent d'après leur contenu en substances secondaires et d'après leur degré de polymérisation. La préférence est donnée au substrat DNA hautement polymérisé provenant des thymus de veau.

On peut choisir comme solution tampon toute solution dont le pH se situe entre 7 et 9. On préférera une solution tampon qui se compose de 0,1 M TRIS(tris (hydroxyméthyl)-aminométhane)-HCl d'une quantité de 0,5 à 2 ml. On dilue dans cette solution tampon de petites quantités de chlorure de magnésium (de préférence de 3 à 8 mmoles) et de chlorure de calcium (de préférence de 0,1 à 1,5 mmole).

Le mélange de réaction contenant le liquide à incuber est maintenu pendant 45 à 90 minutes à une température de 45 à 63"C. Vu que l'activité des enzymes sera mesurée en fonction du temps, il est important de mettre fin à l'activité des enzymes immédiatement après le temps d'incubation. Cela se fait par addition d'une petite quantité (1-3 ml) de substance dénaturante usuelle. De préférence, on utilise une solution d'acide perchlorique de 1-3 M.

Les volumes donnés sont recommandés pour des travaux microanalytiques. I1 va de soi que le même procédé de détermination est réalisable de façon macroanalytique avec de plus grandes quantités.

Pour la réalisation du test, il est avantageux d'utiliser un appareil faisant partie d'un kit vendu par la S.A. Sopar sous le nom de "Sopacheck" R de sorte qu'il peut être utilisé universellement dans n'importe quel laboratoire d'analyse.

Cet appareil (Fig. 3) est composé de deux parties. La partie inférieure consiste en un cylindre de réaction 1. La partie supérieure 2 consiste en un récipient 3 monté à l'extrémité d'un piston creux 4. A la partie inférieure de ce piston est fixé et maintenu un filtre 5 dont le diamètre des pores est de 0,30,6 m. Cette partie inférieure du piston creux qui est pourvue d'un joint d'étanchéité 6 est engagée dans le cylindre de réaction 1.

La réaction, l'incubation, la dénaturation et la centrifugation sont faites dans le cylindre de réaction 1. Par enfoncement de la partie supérieure 2 dans le cylindre 1, le mélange de réaction dénaturé est séparé à l'aide d'un filtre 5 monté dans le piston creux 4 et est transféré dans le récipient 3 de la partie supérieure 2. En procédant de la sorte, le mélange dénaturé ne contient plus de substances solides qui dérangeraient la reproductibilité de la mesure d'extinction.

Le test effectué avec le liquide biologique des patients est répété plusieurs fois avant, pendant et après le traitement thérapeutique. La détermination de l'activité des DNAses avant, et pendant le traitement des tumeurs malignes rend possible le contrôle du déroulement et des résultats de la thérapie.

EXEMPLE 1.
On ajoute 500/g de DNA (de thymus de veau) dans le cylindre de réaction d'un appareillage "Sopacheck" à 800/cl d'une solution tampon à pH 8 (0,1 M TRIS/HC1) contenant 5 mmoles de MgC12 et 0,25 mmole de CaC12. Dans le milieu de réaction, 200 > X1 de sérum de sang sera incubé pendant 60 minutes à 550C.

Ensuite, on ajoute 2 ml d'une solution d'acide perchlorique glacée (1,5 M) et après une courte agitation du cylindre de réaction on le laisse reposer dans la glace pendant 30 minutes, ensuite la solution sera centrifugée à 3000 g pendant + 10 minutes.

On introduit lentement le piston pourvu d'un filtre en nitrocellulose (diamètre des pores : 0,45ohm) dans le cylindre de réaction. Le mélange de réaction filtré et dénaturé par l'acide perchlorique pénètre dans la partie creuse du piston. La solution filtrée est introduite dans un spectrophotomètre W où la mesure se fait à 260 nm. L'extinction est comparée à une solution de référence préparée du même sérum de sang dans les mêmes conditions opératoires, mais avec de 1'EGTA.

L'extinction trouvée est 1486.

EXEMPLE 2.
On ajoute 500 g de DNA (de thymus de veau) dans le cylindre de réaction d'un appareillage "Sopacheck" à 800+ 1 d'une solution tampon à pH 8 (0,1 TRIS/HC1) contenant 5 mmoles de MgC12 et 0,25 mmole de CaC12. Dans le milieu de réaction 200/1 de ponction pleurale seront incubés pendant 60 minutes à 55"C. Ensuite, on ajoute 2 ml d'une solution d'acide perchlorique glacée (1,5 M) et, après une courte agitation du cylindre de réaction, on le laisse reposer dans la glace pendant 30 minutes, ensuite la solution sera centrifugée à 3000 g pendant fi 10 minutes.

On introduit lentement le piston pourvu d'un filtre en nitrocellulose (diamètre des pores : 0,45 > um) dans le cylindre de réaction. Le mélange de réaction filtré et dénaturé par l'acide perchlorique pénètre dans la partie creuse du piston. La solution filtrée est introduite dans un spectrophotomètre W où la mesure se fait à 260 nm. L'extinction est comparée à une solution de référence préparée des mêmes ponctions pleurales dans les mêmes conditions opératoires, mais avec de 1'EGTA. L'extinction trouvée est 1150.

L'extinction trouvée correspond à l'activité des DNAses chez le patient lors de la prise du liquide biologique. La détermination de l'activité sera répétée plusieurs fois après un traitement. Lors d'une réaction positive au traitement, on constate clairement une diminution de l'activité des DNAses.

Claims

R E V E N D I C A T I 3 N S

1.- Procédé de détermination de l'activité des désoxyribonucléases dans des liquides biologiques, par la détermination spectrophotométrique à 260 nm des produits de décomposition de l'acide désoxyribonucléique, après incubation pendant un temps déterminé, caractérisé en ce qu'on ajoute le liquide biologique à examiner à un milieu de réaction composé d'une solution tampon à pH 7-9, d'un sel soluble de magnésium, d'un sel soluble de calcium et de l'acide désoxyribonucléique, qu'on maintient le mélange de réaction ainsi obtenu pendant 45 à 90 minutes à une température de 45 à 630C, qu'on le dénature, qu'on sépare les substances insolubles du mélange de réaction par filtration à travers de micropores ou par ultracentrifugation et qu'on soumet le liquide restant à une mesure spectrophotométrique à 260 nm par rapport à une solution de référence qui contient en plus un inhibiteur des

DNAses.

2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange de réaction est maintenu pendant 50 à 70 minutes à une température de 55 à 600C.

3.- Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le diamètre des pores des filtres est de 0,30 à 0,60 m.

4.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise comme filtre au moins une membrane de nitrocellulose.

5.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise comme filtre au moins une membrane de Téflon.

6.- Procédé suivant l'une quelconque - des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on fait précéder la filtration d'une centrifugation.

7.- Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la séparation des substances insolubles est effectuée par une ultracentrifugation à plus de 40000 g.

8.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on utilise un échantillon de 100 à 500 l du liquide biologique.

9.- Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise un échantillon de 200 l du liquide biologique.

10.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on utilise 250 à 750/g d'acide désoxyribonucléique.

11.- Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'on utilise 500jLg d'acide désoxyribonucléique.

12.- Procédé suivant l'une quelconques des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la solution tampon consiste en une solution aqueuse de chlorhydrate de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane.

13.- Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce qu'on utilise 0,5 à 2 ml d'une solution aqueuse à 0,1 M de chlorhydrate de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane.

14.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la solution tampon a un pH 8.

15.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le sel soluble de magnésium est le chlorure de magnésium et que sa concentration est de 0,1 à 50 mM.

16.- Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que la concentration du chlorure de magnésium est de 3 à 8 mM.

17.- Procédé suivant l'une quelconque des revendication 1 à 16, caractérisé en ce que le sel soluble de calcium est le chlorure de calcium et que sa concentration est de 0,01 à 3 mM.

18.- Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que la concentration du chlorure de calcium est de 0,1 à 0,5 mM.

19.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le produit de dénaturation est un acide perchlorique à une concentration de 1 à 3 M.

20.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que l'inhibiteur des DNAses est l'acide éthylène-bis-(oxyéthylènenitrile)-tétracétique.

21.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que le liquide biologique est choisi parmi le sang, les liquides céphalorachidiens, les ponctions pleurales, le liquide lymphatique, le suc pancréatique et le liquide biliaire, l'urine et les parties solubles séparées des particules solides d'homogénats de tissu ou de glandes.

22.- Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce que le liquide biologique est du sérum sanguin.

23.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé en ce qu'il est effectué avec un appareil comportant une partie inférieure qui consiste en un cylindre de réaction (1) et une partie supérieure (2) qui comprend un récipient (3) monté à l'extrémité d'un piston creux (4) muni d'un filtre (5), ce piston creux (4) pourvu d'un joint d'étanchéité (6)étant engagé dans le cylindre de réaction (1).

24.- Procédé suivant la revendication 23, caractérisé en ce que le filtre de la partie inférieure du piston est en nitrocellulose dont les pores ont un diamètre de 0,45 m.

25.- Utilisation du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 24, pour le dépistage de tumeurs malignes.

26.- Utilisation du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 24, pour contrôler le diagnostic d'un traitement de tumeurs malignes et c-onflr-mer -le diagnostic.