FR2589166A1

FR2589166A1 - Process for the determination of DNAse activity

Info

Publication number: FR2589166A1
Application number: FR8515882A
Authority: FR
Inventors: Marc Lans; Henryck Taper; Marcel Roberfoid
Original assignee: Sopar NV SA
Current assignee: Sopar NV SA
Priority date: 1985-10-25
Filing date: 1985-10-25
Publication date: 1987-04-30
Also published as: FR2589166B1; JPS62107799A

Abstract

The invention relates to the determination of DNase activity in biological fluids. The biological fluid to be examined is added to a reaction medium consisting of a buffer solution, a soluble magnesium salt, a soluble calcium salt and deoxyribonucleic acid; the mixture thus obtained is kept for 45 to 90 minutes at a temperature of 45 to 63 DEG C, it is then denatured, the insoluble substances are separated and the remaining fluid is subjected to a spectrophotometric measurement at 260 nm against a reference solution additionally containing a DNase inhibitor. The process can be applied especially to the diagnosis of cancer and to the evaluation of the efficacy of the therapies applied to its treatment.

Description

La présente invention concerne un procédé de détermination de l'activité du complexe d'enzymes désoxyribonucléique (DNAses) dans les liquides biologiques, cette détermination trouvant son application notamment au diagnostic du cancer et à l'évaluation de l'efficacité des thérapies appliquées à son traitement. The present invention relates to a method for determining the activity of the complex of deoxyribonucleic enzymes (DNAse) in biological fluids, this determination finding its application in particular to the diagnosis of cancer and the evaluation of the effectiveness of the therapies applied to its treatment.

I1 a été constaté que l'activité des DNAses dans les liquides biologiques est modifiée chez des sujets porteurs de tumeurs malignes (par rapport à cette activité des DNAses chez des sujéts sains). It has been found that the activity of DNAses in body fluids is modified in subjects with malignant tumors (compared to this activity of DNAses in healthy subjects).

I1 a également été constaté que le traitement thérapeutique des patients cancéreux provoque un changement de l'activité des DNAses dans leurs liquides biologiques, tout au moins lorsque la réaction au traitement est positive. It has also been found that the therapeutic treatment of cancer patients causes a change in the activity of the DNAses in their biological fluids, at least when the reaction to the treatment is positive.

C'est ainsi qu'on a pu observer que la moyenne d'activité sérique des DNAses chez les patients porteurs de tumeurs malignes est significativement (p( 0,01) plus basse que la moyenne observée chez les personnes saines. Thus it has been observed that the mean serum activity of DNAses in patients with malignant tumors is significantly (p (0.01) lower than the average observed in healthy persons.

Par ailleurs, lors du traitement thérapeutique de patients cancéreux, on n'observe pas de changement de l'activité sérique des DNAses, dans le cas de tumeurs résistant au traitement, tandis que lorsque la réaction au traitement est positive, on constate une nette diminution de l'activité sérique des DNAses durant les quelques jours qui suivent le début du traitement. Moreover, during the therapeutic treatment of cancer patients, there is no change in the serum activity of the DNAses, in the case of treatment-resistant tumors, whereas when the reaction to the treatment is positive, there is a marked decrease the serum activity of the DNAses during the few days following the start of the treatment.

L'invention sera décrite ci-après en se référant aux dessins annexés, dans lesquels
- Fig. 1 est la distribution des DNAses alcalines dans le sérum des sujets sains et des patients cancéreux non traités;
- Fig. 2 est le profil d'évolution de l'activité des DNAses alcalines chez un patient cancéreux traité par radiothérapie;
- Fig. 3 est une courbe analogue pour un patient cancéreux traité par chimiothérapie;
- Fig. 4 est une vue en coupe d'un appareil avantageusement utilisé pour l'exécution du procédé conforme à l'invention.The invention will be described hereinafter with reference to the accompanying drawings, in which
- Fig. 1 is the distribution of alkaline DNAses in the serum of healthy subjects and untreated cancer patients;
- Fig. 2 is the evolution profile of the activity of alkaline DNAses in a cancer patient treated with radiotherapy;
- Fig. 3 is a similar curve for a cancer patient treated with chemotherapy;
- Fig. 4 is a sectional view of an apparatus advantageously used for carrying out the method according to the invention.

Dans le cas d'une réponse immédiate favorable au traitement thérapeutique durant les semaines qui suivent la fin du traitement, l'activité sérique des
DNAses alcalines peut évoluer de trois manières : a) l'activité sérique des DNAses augmente au point de dépasser la valeur d'origine et atteint la moyenne observée chez les personnes saines. Cette évolution indique une rémission totale (Fig. 2 et Fig. 3); b) l'augmentation n'atteint pas la moyenne et la rémission observée est considérée comme partielle; c) l'activité des DNAses n'augmente pas dans les semaines qui suivent le traitement et une progression fatale de la tumeur est à craindre.In the case of an immediate response favorable to the therapeutic treatment during the weeks following the end of the treatment, the serum activity of the
Alkaline DNAses can evolve in three ways: a) The serum activity of DNAses increases to the point of exceeding the original value and reaches the average observed in healthy people. This evolution indicates total remission (Fig. 2 and Fig. 3); (b) the increase does not reach the mean and the observed remission is considered to be partial; c) the activity of the DNAses does not increase in the weeks following the treatment and a fatal progression of the tumor is to be feared.

Si on disposait donc d'une méthode fiable et sensible permettant de mesurer l'activité des DNAses, on pourrait dépister l'existence d'une tumeur maligne et vérifier si tel traitement thérapeutique est efficace ou non et, dans l'affirmative, suivre son déroulement et son degré de succès et établir ainsi de manière simple et rapide la thérapie optimale pour chaque patient individuellement. If a reliable and sensitive method was available to measure the activity of the DNAses, we could detect the existence of a malignant tumor and check whether a therapeutic treatment is effective or not and, if so, follow its progress and its degree of success and thus establish in a simple and fast way the optimal therapy for each patient individually.

Pour qu'une telle méthode de mesure de l'activité des DNAses puisse être efficace, il faudrait qu'elle soit 1) suffisamment sensible pour déterminer de manière probante le niveau d'activité des DNAses chez l'homme, 2) qu'elle soit parfaitement reproductible et 3) qu'elle soit simple au point de pouvoir être utilisée par le personnel habituel d'un laboratoire d'analyse médicale. For such a method of measuring the activity of the DNAses to be effective, it should be 1) sufficiently sensitive to conclusively determine the level of activity of the DNAses in humans, 2) it it is perfectly reproducible and 3) it is so simple that it can be used by the usual staff of a medical laboratory.

Les procédés connus pour la détermination de l'activité des DNAses ne remplissent pas l'ensemble de ces conditions. Deux procédés se distinguent par leur relative simplicité et sont basés sur la mesure de l'extinction spectrophotométrique à 260 nm des polynucléotides solubles en milieu acide libérés par l'hydrolyse du DNA, à savoir a) la méthode de Loiselle et Carrier (Rev. Can. Biol., 22, 341-346 (1963)). The known methods for the determination of the activity of the DNAses do not fulfill all these conditions. Two methods are distinguished by their relative simplicity and are based on the measurement of the spectrophotometric extinction at 260 nm of soluble polynucleotides in acidic medium released by the hydrolysis of DNA, namely a) the method of Loiselle and Carrier (Can Rev. Biol., 22, 341-346 (1963)).

On ajoute 0,5 ml d'un sérum à examiner à 0,3 ml d'une solution à 0,4% de DNA (de sperme de saumon) dans 2 ml d'une solution tampon de pH 7,6 (Tris-HCl, 0,05 M) et de 0,1 ml d'une solution de chlorure de magnésium (0,342 M) et de chlorure de calcium (0,0162 M), ensuite on dilue avec une solution de sucrose à 0,35 M pour obtenir 3,6 ml. Après une incubation de 3 heures, à 370C, on y ajoute 1,2 ml d'acide perchlorique à 25% (ce qui correspond à 4 M), et après 10 minutes, on centrifuge la solution à 2800 g. On mesure l'extinction de la solution à 260 nm. 0.5 ml of a serum to be examined is added to 0.3 ml of a 0.4% solution of DNA (salmon sperm) in 2 ml of a pH 7.6 buffer solution (Tris). HCl, 0.05 M) and 0.1 ml of a solution of magnesium chloride (0.342 M) and calcium chloride (0.0162 M), then diluted with a solution of sucrose at 0.35 M to obtain 3.6 ml. After incubation for 3 hours at 370 ° C., 1.2 ml of 25% perchloric acid (corresponding to 4 M) are added thereto, and after 10 minutes the solution is centrifuged at 2800 g. The extinction of the solution is measured at 260 nm.

b) la méthode de Spandidos et al. (Europ. J. Cancer, 16, 1615-1616 (1980)).b) the method of Spandidos et al. (J. Cancer, 16, 1615-1616 (1980)).

On dilue 100 pg de DNA (de thymus de veau) dans une solution tampon à pH 8 (Tris-HCl). On y ajoute 25 ss du sérum à examiner, et on maintient la solution pendant 15 minutes à 250C. Ensuite, on y ajoute 2 ml d'acide perchlorique (1,5 M) à 4"C et on centrifuge la solution à 3000 g. L'extinction de la solution est mesurée à 260 nm. 100 μg of DNA (calf thymus) are diluted in pH 8 buffer solution (Tris-HCl). 25 ss of the serum to be examined are added thereto, and the solution is kept at 250 ° C. for 15 minutes. Then 2 ml of perchloric acid (1.5 M) are added at 4 ° C. and the solution is centrifuged at 3000 g The extinction of the solution is measured at 260 nm.

Ces deux procédés ne sont malheureusement pas suffisamment sensibles. These two methods are unfortunately not sufficiently sensitive.

Ainsi, pour la méthode de Loiselle et Carrier, malgré un temps d'incubation de 3 heures, un volume important de sérum, une quantité importante de DNA il arrive souvent qu'on ne parvient pas à mettre en évidence l'activité enzymatique. Thus, for the Loiselle and Carrier method, despite an incubation time of 3 hours, a large volume of serum, a large amount of DNA it often happens that it is not possible to demonstrate the enzymatic activity.

D'autre part, la méthode de Spandidos utilise une quantité faible de DNA, un volume faible de sérum, pas d'ions ajoutés et l'incubation dure 15 minutes seulement à 25 C. Mais, cette méthode donne. On the other hand, the Spandidos method uses a small amount of DNA, a low volume of serum, no added ions and the incubation lasts only 15 minutes at 25 C. But, this method gives.

souvent des valeurs négatives (par rapport au test blanc) et non reproductibles, le même échantillon donnant des variations de densité optique.often negative values (compared to the white test) and non-reproducible, the same sample giving optical density variations.

Le fait que l'activité n'est pas décelée est probablement dû à l'absence d'ions dans le milieu d'incubation, ce qui diminue de manière substantielle l'activité enzymatique. En effet, il est connu que l'ion Mg++ active l'enzyme et que l'ion Ca++ potentialise cette action. The fact that the activity is not detected is probably due to the absence of ions in the incubation medium, which substantially decreases the enzyme activity. Indeed, it is known that the Mg ++ ion activates the enzyme and that the Ca ++ ion potentiates this action.

Le but de l'invention est d'offrir un procédé simple, reproductible, à sensibilité élevée et universellement applicable, pour déterminer l'activité des
DNAses dans des liquides biologiques.The object of the invention is to provide a simple, reproducible, high sensitivity and universally applicable method for determining the activity of
DNAses in biological fluids.

Le nouveau procédé selon l'invention est un procédé de détermination de l'activité des désoxyribonucléases dans des liquides biologiques, par la détermination spectrophotométrique à 260 nm des produits d'hydrolyse de l'acide désoxyribonucléique, après incubation pendant un temps déterminé. Selon l'invention on ajoute le liquide biologique à examiner à un milieu de réaction composé d'une solution tampon à pH 7-9, de préférence 8, d'un sel soluble de magnésium, d'un sel soluble de calcium et de l'acide désoxyribonucléique. On maintient le mélange de réaction ainsi obtenu pendant 45 à 90 minutes, de préférence 60 minutes, à une température de 45 à 63"C, de préférence à une température de 55 à 600C et on le dénature. The novel process according to the invention is a method for determining the activity of deoxyribonucleases in biological liquids by spectrophotometric determination at 260 nm of the hydrolysis products of deoxyribonucleic acid, after incubation for a determined time. According to the invention, the biological fluid to be examined is added to a reaction medium composed of a buffer solution at pH 7-9, preferably 8, a soluble salt of magnesium, a soluble salt of calcium and a solution of calcium. 'Deoxyribonucleic acid. The reaction mixture thus obtained is maintained for 45 to 90 minutes, preferably 60 minutes, at a temperature of 45 to 63 ° C, preferably at a temperature of 55 to 600 ° C and denaturated.

On sépare les substances insolubles du mélange de réaction soit par filtration à travers de micropores, soit par une ultracentrifugation, de préférence à plus de 40000 g.The insoluble substances are separated from the reaction mixture either by filtration through micropores or by ultracentrifugation, preferably over 40,000 g.

On peut utiliser comme filtre une ou plusieurs membranes de nitrocellulose ou de Téflon ou de PVC. Le diamètre des pores est avantageusement de 0,30 à 0,60)Lm. One or more membranes of nitrocellulose or Teflon or PVC can be used as the filter. The pore diameter is advantageously from 0.30 to 0.60 μm.

On soumet le liquide restant à une mesure spectrophotométrique à 260 nm par rapport à une solution de référence (blanc) préparée dans les mêmes conditions opératoires, mais auquel on ajoute un inhibiteur des DNAses tel que 1'EGTA (acide éthylène bis-(oxyéthylénenitrile)tétracétique) qui bloque l'activité enzymatique. The remaining liquid is subjected to a spectrophotometric measurement at 260 nm relative to a reference solution (white) prepared under the same operating conditions, but to which is added a DNAse inhibitor such as EGTA (ethylene bis (oxyethylenitrile) acid). tetracetic) which blocks the enzymatic activity.

Le nouveau procédé est particulièrement utile pour le diagnostic et le dépistage de tumeurs malignes, pour mettre en évidence la sensibilité des tumeurs a la thérapie appliquée et pour suivre le déroulement et le succès d'un traitement. The new method is particularly useful for the diagnosis and screening of malignant tumors, to highlight the sensitivity of tumors to the applied therapy and to monitor the course and success of a treatment.

Une différence technique essentielle par rapport aux procédés connus est l'incubation à une température de 45 à 630C, idéalement de 55 à 600C, pendant un temps de réaction de 45 à 90 minutes. An essential technical difference from known methods is incubation at a temperature of 45 to 630C, ideally 55 to 600C, for a reaction time of 45 to 90 minutes.

L'effet favorable de cette température relativement élevée parait à première vue facile à concevoir, car une augmentation de la température donne une augmentation de la vitesse de réaction et une meilleure utilisation de la réactivité des ingrédients.The favorable effect of this relatively high temperature appears at first sight easy to conceive, since an increase in temperature gives an increase in the reaction rate and a better use of the reactivity of the ingredients.

En fait, ceci est exact en ce qui concerne les réactions chimiques normales, mais ne peut pas être appliqué tel quel aux réactions biochimiques faisant intervenir les protéines telles que les enzymes. Les réactions impliquant des enzymes se déroulent d'habitude à la température ambiante ou physiologique, en quelques minutes et, en général, ne peuvent supporter les températures au-dessus de 40"C. Il en ressort que la température utilisée pour l'invention est supérieure à la température habituelle. En effet, les températures de réaction du procédé de l'invention se trouvent dans une zone où, normalement, les protéines comme les enzymes, les albumines ou les histones accompagnant le
DNA se dénaturent, de sorte qu'il n'y a plus de réaction biochimique.A cette température élevée, le spécialiste s'attend donc à n'avoir aucune amélioration, mais plutôt une diminution drastique de l'activité.In fact, this is true with respect to normal chemical reactions, but can not be applied as such to biochemical reactions involving proteins such as enzymes. Reactions involving enzymes usually take place at room or physiological temperature within a few minutes and, in general, can not withstand temperatures above 40 ° C. It is apparent that the temperature used for the invention is In fact, the reaction temperatures of the process of the invention are found in an area where, normally, proteins such as enzymes, albumins or histones accompanying the
DNA is denatured, so that there is more biochemical reaction. At this high temperature, the specialist expects to have no improvement, but rather a drastic decrease in activity.

Mais le Demandeur a découvert que l'activité des DNAses subit une légère augmentation avec l'augmentation de la température. Ensuite, à partir de 450C, l'augmentation de l'activité fait un bond qui ne s'explique plus par une activation normale due à une hausse de température, mais par le fait que l'enzyme est liée, au moins partiellement, à une substance complexante, et que ce complexe est scindé ou détruit à partir de 450C. I1 en résulte une forte augmentation de l'activité qui augmente la sensibilité du procédé d'un facteur pouvant aller jusqu'à 30, ce qui constitue un autre avantage incontestable du procédé. But the Applicant has discovered that the activity of DNAses undergoes a slight increase with increasing temperature. Then, starting from 450C, the increase of the activity makes a jump which is no longer explained by a normal activation due to a rise in temperature, but by the fact that the enzyme is linked, at least partially, to a complexing substance, and that this complex is split or destroyed from 450C. This results in a large increase in activity which increases the sensitivity of the process by a factor of up to 30, which is another undeniable advantage of the process.

Le Demandeur a constaté qu'il est avantageux de conduire cette incubation à une température voisine de 55bu. En effet, à partir de 60"C, on peut observer une dénaturation de l'enzyme, qui, à partir de 63"C, est si forte que la chute d'activité empêche toute détermination. The Applicant has found that it is advantageous to conduct this incubation at a temperature of 55bu. Indeed, from 60 ° C, one can observe a denaturation of the enzyme, which, from 63 "C, is so strong that the fall of activity prevents any determination.

Le procédé de détermination se déroule par une réaction du liquide biologique avec une quantité déterminée de DNA qui se trouve dans le milieu de réaction et par un maintien pendant un temps déterminé à une température constante. Ensuite, on arrête la réaction par l'addition d'une substance dénaturante, qui bloque l'activité enzymatique. The determination process is carried out by reacting the biological fluid with a determined amount of DNA which is in the reaction medium and maintaining for a predetermined time at a constant temperature. Then, the reaction is stopped by the addition of a denaturing substance, which blocks the enzymatic activity.

Après dénaturation, les substances non solu bles seront éliminées du mélange de réaction. Le
Demandeur a constaté qu'une centrifugation à 20003000 g ne suffit pas pour obtenir une séparation qui donne des valeurs d'extinction reproductibles. I1 reste encore beaucoup de substances dans la partie liquide qui influencent de façon non contrôlée l'extinction à 260 nm. Le Demandeur a alors trouvé qu'on peut obtenir une séparation totale de toutes les substances solides du mélange dénaturé et de là une très bonne reproductibilité, si on soumet le mélange dénaturé pendant + 5 minutes, à une ultracentrifugation à plus de 40000 g. Mais ceci ne permet pas une utilisation universelle du procédé.After denaturation, the non-soluble substances will be removed from the reaction mixture. The
Applicant has found that a centrifugation at 20003000 g is not enough to obtain a separation which gives reproducible extinction values. There are still many substances in the liquid part which uncontrollably influence the extinction at 260 nm. The Applicant then found that a complete separation of all the solids from the denatured mixture can be achieved and hence a very good reproducibility, if the denatured mixture is subjected for +5 minutes, to ultracentrifugation at more than 40,000 g. But this does not allow a universal use of the process.

Le Demandeur a encore trouvé qu'il est possible de séparer le mélange de réaction dénaturé par filtration, de sorte qu'il ne reste plus de substances solides qui dérangeraient la reproductibilité de la mesure d'extinction. Pour une bonne filtration, il est indiqué d'utiliser des filtres dont le diamètre des pores est de 0, 3-0, 6 iem. Des filtres à plus petits pores ralentissent trop la vitesse de filtration, et des filtres à plus grands pores ne donnent pas de séparation suffisante. The Applicant has further found that it is possible to separate the denatured reaction mixture by filtration, so that there are no more solid substances that would disturb the reproducibility of the extinguishing measure. For good filtration, it is advisable to use filters with a pore diameter of 0.3-0.6 μm. Smaller pore filters slow down the filtration rate too much, and larger pore filters do not provide sufficient separation.

Quoique, en principe, toute membrane inerte à pores de cette dimension puisse convenir comme filtre, le Demandeur a constaté que les filtres à membranes nitrocellulose ou Téflon sont préférables. On peut utiliser une ou plusieurs couches de filtres et combiner les deux sortes de filtres. Although, in principle, any inert pore membrane of this size may be suitable as a filter, the Applicant has found that nitrocellulose or Teflon membrane filters are preferable. One or more layers of filters can be used and the two types of filters can be combined.

Pour faciliter la filtration, il est utile de centrifuger le récipient d'abord brièvement pour que les grands coagulats se posent au fond. To facilitate the filtration, it is useful to centrifuge the container first briefly so that the large coagulates settle to the bottom.

On mesure de manière connue l'extinction à 260 nm de la solution filtrée et on la compare à une solution de référence. On prépare la solution de référence dans les mêmes conditions opératoires en ajoutant de 1'EGTA avant incubation. The extinction at 260 nm of the filtered solution is measured in a known manner and is compared with a reference solution. The reference solution is prepared under the same operating conditions by adding EGTA before incubation.

Le procédé de l'invention peut être effectué par le personnel habituel d'un laboratoire d'analyse médicale et il donne des résultats fiables et bien reproductibles. The method of the invention can be carried out by the usual staff of a medical analysis laboratory and gives reliable and reproducible results.

Pour comparer la technique de l'invention avec les procédés Loiselle et Spandidos connus, on a soumis un échantillon du sérum de cinq personnes saines et quatre patients atteints d'une tumeur aux trois méthodes de détermination de l'activité des DNAses, à savoir celle de Loiselle, celle de Spandidos et celle de l'invention. Les conditions opératoires de ce test comparatif sont données dans le tableau récapitulatif suivant. In order to compare the technique of the invention with the known Loiselle and Spandidos methods, a serum sample of five healthy persons and four tumor patients were subjected to three methods of determining the activity of the DNAses, namely of Loiselle, that of Spandidos and that of the invention. The operating conditions of this comparative test are given in the following summary table.

TABLEAU RECAPITULATIF
Méthode I II III
Loiselle Spandidos "Méthode
de l'in
vention"
Type de DNA utilisé sperme thymus thymus
de de de
saumon veau veau
Quantité de DNA/test 1200 g 100 g 500pLg
Tampon Tris-HCl 0,05 M 0,1 M 0,1 M pH 7,6 8 8 MgC12 342 mM - 5 mM
CaCl2 16,2 mM - 0,25 mM
Vol. de sérum 500 l 25 1 200 l
Sucrose 0,35 M 700 l - -
Vol. final d'incub. 3,6 ml 1 ml 1 ml
Température d'incub. 370C 250C 550C
Temps d'incubation 180 min 15 min 60 min
Acide perchlorique (PCA) 4 M 1,5 M 1,5 M
Volume de PCA 1,2 ml 2 ml 2 ml
Centrifugation 2800 g 3000 g 45000 g
Le tableau II montre les résultats des mesures spectrophotométriques faites à 260 nm pour les trois méthodes par rapport aux blancs respectifs.

SUMMARY TABLE
Method I II III
Loiselle Spandidos "Method
linen
vention "
Type of DNA used sperm thymus thymus
de de
salmon veal calf
Amount of DNA / test 1200 g 100 g 500pLg
Buffer Tris-HCl 0.05 M 0.1 M 0.1 M pH 7.6 8 8 MgC12 342 mM - 5 mM
CaCl2 16.2 mM - 0.25 mM
Flight. of serum 500 l 25 1,200 l
Sucrose 0.35 M 700 l - -
Flight. final incubation 3.6 ml 1 ml 1 ml
Incubation temperature 370C 250C 550C
Incubation time 180 min 15 min 60 min
Perchloric acid (PCA) 4 M 1.5 M 1.5 M
PCA volume 1.2 ml 2 ml 2 ml
Centrifugation 2800 g 3000 g 45000 g
Table II shows the results of the spectrophotometric measurements made at 260 nm for the three methods relative to the respective whites.

<tb> <SEP> LOISELLE <SEP> SPANDIDOS <SEP> METHODE <SEP> SELON
<tb> <SEP> L'INVENTION
<tb> <SEP> Echan- <SEP> 37"C <SEP> 25"C <SEP> 370C <SEP> * <SEP> 550C
<tb> <SEP> tillon
<tb> <SEP> Normal
<tb> <SEP> 1 <SEP> 115 <SEP> -63 <SEP> 260 <SEP> 1498
<tb> <SEP> 2 <SEP> 80 <SEP> -106 <SEP> 87 <SEP> 1211
<tb> <SEP> 3 <SEP> 92 <SEP> -57 <SEP> 112 <SEP> 1414
<tb> <SEP> 4 <SEP> 37 <SEP> -16 <SEP> 51 <SEP> 396
<tb> <SEP> 5 <SEP> 55 <SEP> -78 <SEP> 62 <SEP> 865
<tb> Pathologique
<tb> <SEP> 6 <SEP> 21 <SEP> -144 <SEP> 22 <SEP> 502
<tb> <SEP> 7 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 81 <SEP> 172
<tb> <SEP> 8 <SEP> 98 <SEP> -39 <SEP> 119 <SEP> 1486
<tb> <SEP> 9 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 1 <SEP> 39
<tb> <tb><SEP> LOISELLE <SEP> SPANDIDOS <SEP> METHOD <SEP> ACCORDING TO
<tb><SEP> THE INVENTION
<tb><SEP> Sample <SEP> 37 "C <SEP>25" C <SEP> 370C <SEP> * <SEP> 550C
<tb><SEP> tillon
<tb><SEP> Normal
<tb><SEP> 1 <SEP> 115 <SEP> -63 <SEP> 260 <SEQ> 1498
<tb><SEP> 2 <SEP> 80 <SEP> -106 <SEP> 87 <SEP> 1211
<tb><SEP> 3 <SEP> 92 <SEP> -57 <SEP> 112 <SEP> 1414
<tb><SEP> 4 <SEP> 37 <SEP> -16 <SEP> 51 <SEP> 396
<tb><SEP> 5 <SEP> 55 <SEP> -78 <SEP> 62 <SEP> 865
<tb> Pathological
<tb><SEP> 6 <SEP> 21 <SEP> -144 <SEP> 22 <SEP> 502
<tb><SEP> 7 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 81 <SEP> 172
<tb><SEP> 8 <SEP> 98 <SEP> -39 <SEP> 119 <SEP> 1486
<tb><SEP> 9 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 1 <SEP> 39
<Tb>

ILLIS = illisible. Les chiffres sont donnés en millièmes de densité optique.ILLIS = illegible. The numbers are given in thousandths of optical density.

* = à titre indicatif mais non conforme à l'invention.* = indicative but not according to the invention.

Ce tableau montre que la méthode Spandidos ne donne que des résultats négatifs non interprétables. This table shows that the Spandidos method gives only uninterpretable negative results.

D'autre part, la diminution de l'activité des DNAses due aux tumeurs chez le patient cancéreux peut être telle qu'elle n'est plus décelable par la méthode trop peu sensible de Loiselle. Quand la mesure d'extinction n'est que de quelques dizaines de millièmes de densité optique au départ et que l'on désire examiner si un traitement est positif par une diminution de la densité optique, cela n'est plus possible avec la méthode
Loiselle, trop peu sensible dès le départ. De plus, dans deux cas pathologiques sur quatre, la lecture était illisible probablement due à l'interférence des substances solides en suspension. Enfin les chiffres dans le tableau étant des moyennes de plusieurs expériences du même échantillon, on a pu constater une divergence de résultats pour les procédés connus et une reproductibilité fiable pour le procédé de l'invention.On the other hand, the decrease of the activity of the DNAses due to tumors in the cancer patient can be such that it is no longer detectable by Loiselle's too insensitive method. When the extinction measurement is only a few tens of thousandths of initial optical density and it is desired to examine whether a treatment is positive by a decrease in the optical density, this is no longer possible with the method.
Loiselle, too insensitive from the start. Moreover, in two out of four pathological cases, the reading was unreadable, probably due to the interference of suspended solids. Finally, since the figures in the table are averages of several experiments of the same sample, it was possible to observe a divergence of results for the known processes and a reliable reproducibility for the process of the invention.

On constate, en tout cas, que la méthode selon l'invention, à 55"C, est nettement plus sensible que celle de Loiselle, la sensibilité étant augmentée a d'un facteur qui peut dépasser 20. It is found, in any case, that the method according to the invention, at 55 ° C, is significantly more sensitive than that of Loiselle, the sensitivity being increased to a factor that can exceed 20.

Les liquides biologiques susceptibles d'être testés sont notamment le sang, les liquides céphalorachidiens, les ponctions pleurales, le liquide lymphatique, le suc pancréatique et le liquide biliaire, l'urine ou les parties solubles séparées des particules solides d'homogénats de tissu ou de glandes. Biological fluids that may be tested include blood, cerebrospinal fluid, pleural punctures, lymphatic fluid, pancreatic juice and bile liquid, urine or soluble portions separated from solid particles of tissue homogenates or of glands.

Pour la détermination, il faut de 100 à 500)lu, de préférence 200#l, de liquide biologique qui sera incubé dans le milieu de réaction préparé au préalable. Le milieu de réaction contient une certaine quantité de DNA dans une solution tampon, qui garde le pH à un degré optimal et à laquelle on ajoute une petite quantité de sel de magnésium et de calcium. La quantité de DNA nécessaire se situe entre 250 et 750 > zg, de préférence à 500pug. Cette quantité est si grande que les fluctuations mineures de quantité qui surviennent par une divergence de pesage ou par des matériaux additionnés (par exemple histone) n'occasionnent aucune influence notable ou erreur à la détermination de l'activité. For determination, from 100 to 500 μl, preferably 200 μl, of biological fluid is required which will be incubated in the prepared reaction medium. The reaction medium contains a certain amount of DNA in a buffer solution, which keeps the pH to an optimum degree and to which is added a small amount of magnesium salt and calcium. The amount of DNA needed is between 250 and 750 μg, preferably 500 μg. This quantity is so great that minor fluctuations in quantity which occur by a weighing divergence or by added materials (eg histone) do not cause any significant influence or error in the determination of the activity.

L'origine des DNA est d'une importance secondaire, même si les DNA de différentes provenances se distinguent d'après leur contenu en substances secondaires et d'après leur degré de polymérisation. La préférence est donnée au substrat DNA hautement polymérisé provenant des thymus de veau. The origin of DNAs is of secondary importance, although DNAs from different sources are distinguished by their content of secondary substances and by their degree of polymerization. Preference is given to the highly polymerized DNA substrate from calf thymuses.

On peut choisir comme solution tampon toute solution dont le pH se situe entre 7 et 9. On préférera une solution tampon qui se compose de 0,1 M TRIS(tris (hydroxyméthyl)-aminométhane)-HCl d'une quantité de 0,5 à 2 ml. On dilue dans cette solution tampon de petites quantités de chlorure de magnésium (de préférence de 3 à 8 mmoles) et de chlorure de calcium (de préférence de 0,1 à 1,5 mmole). Any solution with a pH between 7 and 9 can be chosen as a buffer solution. A buffer solution consisting of 0.1 M TRIS (tris (hydroxymethyl) aminomethane) -HCl in the amount of 0.5 is preferred. to 2 ml. Small amounts of magnesium chloride (preferably 3 to 8 mmol) and calcium chloride (preferably 0.1 to 1.5 mmol) are diluted in this buffer solution.

Le mélange de réaction contenant le liquide à incuber est maintenu pendant 45 à 90 minutes à une température de 45 à 63"C. Vu que l'activité des enzymes sera mesurée en fonction du temps, il est important de mettre fin à l'activité des enzymes immédiatement après le temps d'incubation. Cela se fait par addition d'une petite quantité (1-3 ml) de substance dénaturante usuelle. De préférence, on utilise une solution d'acide perchlorique de 1-3 M. The reaction mixture containing the liquid to be incubated is maintained for 45 to 90 minutes at a temperature of 45 to 63 ° C. Since the activity of the enzymes will be measured as a function of time, it is important to discontinue the activity. Immediately following the incubation time, this is done by adding a small amount (1-3 ml) of the usual denaturant substance, preferably using a 1-3 M perchloric acid solution.

Les volumes donnés sont recommandés pour des travaux microanalytiques. I1 va de soi que le même procédé de détermination est réalisable de façon macroanalytique avec de plus grandes quantités. The volumes given are recommended for microanalytical work. It goes without saying that the same method of determination is feasible in a macroanalytical manner with larger quantities.

Pour la réalisation du test, il est avantageux d'utiliser un appareil faisant partie d'un kit vendu par la S.A. Sopar sous le nom de "Sopacheck" R de sorte qu'il peut être utilisé universellement dans n'importe quel laboratoire d'analyse. For carrying out the test, it is advantageous to use a device that is part of a kit sold by SA Sopar under the name "Sopacheck" R so that it can be used universally in any laboratory. analysis.

Cet appareil (Fig. 3) est composé de deux parties. La partie inférieure consiste en un cylindre de réaction 1. La partie supérieure 2 consiste en un récipient 3 monté à l'extrémité d'un piston creux 4. A la partie inférieure de ce piston est fixé et maintenu un filtre 5 dont le diamètre des pores est de 0,30,6 m. Cette partie inférieure du piston creux qui est pourvue d'un joint d'étanchéité 6 est engagée dans le cylindre de réaction 1. This apparatus (Fig. 3) consists of two parts. The lower part consists of a reaction cylinder 1. The upper part 2 consists of a container 3 mounted at the end of a hollow piston 4. At the bottom of this piston is fixed and held a filter 5 whose diameter of pores is 0.30,6 m. This lower part of the hollow piston which is provided with a seal 6 is engaged in the reaction cylinder 1.

La réaction, l'incubation, la dénaturation et la centrifugation sont faites dans le cylindre de réaction 1. Par enfoncement de la partie supérieure 2 dans le cylindre 1, le mélange de réaction dénaturé est séparé à l'aide d'un filtre 5 monté dans le piston creux 4 et est transféré dans le récipient 3 de la partie supérieure 2. En procédant de la sorte, le mélange dénaturé ne contient plus de substances solides qui dérangeraient la reproductibilité de la mesure d'extinction. The reaction, incubation, denaturation and centrifugation are carried out in the reaction cylinder 1. By depressing the upper part 2 in the cylinder 1, the denatured reaction mixture is separated using a mounted filter 5 in the hollow piston 4 and is transferred into the container 3 of the upper part 2. In doing so, the denatured mixture no longer contains solids which would disturb the reproducibility of the extinguishing measure.

Le test effectué avec le liquide biologique des patients est répété plusieurs fois avant, pendant et après le traitement thérapeutique. La détermination de l'activité des DNAses avant, et pendant le traitement des tumeurs malignes rend possible le contrôle du déroulement et des résultats de la thérapie. The test carried out with the biological fluid of the patients is repeated several times before, during and after the therapeutic treatment. Determination of the activity of the DNAses before and during the treatment of malignant tumors makes it possible to control the course and results of the therapy.

EXEMPLE 1.
On ajoute 500/g de DNA (de thymus de veau) dans le cylindre de réaction d'un appareillage "Sopacheck" à 800/cl d'une solution tampon à pH 8 (0,1 M TRIS/HC1) contenant 5 mmoles de MgC12 et 0,25 mmole de CaC12. Dans le milieu de réaction, 200 > X1 de sérum de sang sera incubé pendant 60 minutes à 550C.EXAMPLE 1
500 μg of DNA (calf thymus) are added to the reaction cylinder of a "Sopacheck" apparatus at 800 μl of a buffer solution at pH 8 (0.1 M TRIS / HCl) containing 5 mmol of MgCl2 and 0.25 mmol CaCl2. In the reaction medium, 200 μl of blood serum will be incubated for 60 minutes at 550 ° C.

Ensuite, on ajoute 2 ml d'une solution d'acide perchlorique glacée (1,5 M) et après une courte agitation du cylindre de réaction on le laisse reposer dans la glace pendant 30 minutes, ensuite la solution sera centrifugée à 3000 g pendant + 10 minutes.Then 2 ml of a solution of ice-cold perchloric acid (1.5 M) is added and after a short stirring of the reaction cylinder it is left standing in ice for 30 minutes, then the solution is centrifuged at 3000 g + 10 minutes.

On introduit lentement le piston pourvu d'un filtre en nitrocellulose (diamètre des pores : 0,45ohm) dans le cylindre de réaction. Le mélange de réaction filtré et dénaturé par l'acide perchlorique pénètre dans la partie creuse du piston. La solution filtrée est introduite dans un spectrophotomètre W où la mesure se fait à 260 nm. L'extinction est comparée à une solution de référence préparée du même sérum de sang dans les mêmes conditions opératoires, mais avec de 1'EGTA. The piston provided with a nitrocellulose filter (pore diameter: 0.45 ohms) is slowly introduced into the reaction cylinder. The filtered and denatured perchloric acid reaction mixture enters the hollow portion of the piston. The filtered solution is introduced into a spectrophotometer W where the measurement is made at 260 nm. The extinction is compared to a reference solution prepared from the same blood serum under the same operating conditions, but with EGTA.

L'extinction trouvée est 1486.The extinction found is 1486.

EXEMPLE 2.
On ajoute 500 g de DNA (de thymus de veau) dans le cylindre de réaction d'un appareillage "Sopacheck" à 800+ 1 d'une solution tampon à pH 8 (0,1 TRIS/HC1) contenant 5 mmoles de MgC12 et 0,25 mmole de CaC12. Dans le milieu de réaction 200/1 de ponction pleurale seront incubés pendant 60 minutes à 55"C. Ensuite, on ajoute 2 ml d'une solution d'acide perchlorique glacée (1,5 M) et, après une courte agitation du cylindre de réaction, on le laisse reposer dans la glace pendant 30 minutes, ensuite la solution sera centrifugée à 3000 g pendant fi 10 minutes.EXAMPLE 2
500 g of DNA (calf thymus) are added to the reaction cylinder of a "Sopacheck" apparatus at 800 + 1 of a pH 8 buffer solution (0.1 TRIS / HCl) containing 5 mmol of MgCl 2 and 0.25 mmol of CaCl2. In the 200/1 pleural puncture reaction medium will be incubated for 60 minutes at 55 ° C. Then 2 ml of an ice-cold perchloric acid solution (1.5 M) are added and, after a short agitation of the cylinder The reaction mixture is allowed to stand in ice for 30 minutes, then the solution is centrifuged at 3000 g for 10 minutes.

On introduit lentement le piston pourvu d'un filtre en nitrocellulose (diamètre des pores : 0,45 > um) dans le cylindre de réaction. Le mélange de réaction filtré et dénaturé par l'acide perchlorique pénètre dans la partie creuse du piston. La solution filtrée est introduite dans un spectrophotomètre W où la mesure se fait à 260 nm. L'extinction est comparée à une solution de référence préparée des mêmes ponctions pleurales dans les mêmes conditions opératoires, mais avec de 1'EGTA. L'extinction trouvée est 1150. The piston with a nitrocellulose filter (pore diameter: 0.45 μm) is slowly introduced into the reaction cylinder. The filtered and denatured perchloric acid reaction mixture enters the hollow portion of the piston. The filtered solution is introduced into a spectrophotometer W where the measurement is made at 260 nm. The extinction is compared with a reference solution prepared from the same pleural punctures under the same operating conditions, but with EGTA. The extinction found is 1150.

L'extinction trouvée correspond à l'activité des DNAses chez le patient lors de la prise du liquide biologique. La détermination de l'activité sera répétée plusieurs fois après un traitement. Lors d'une réaction positive au traitement, on constate clairement une diminution de l'activité des DNAses. The extinction found corresponds to the activity of the DNAses in the patient during the taking of the biological fluid. The determination of the activity will be repeated several times after treatment. In a positive reaction to the treatment, there is clearly a decrease in the activity of the DNAses.

Claims

R E V E N D I C AT I 3 N S

1. A method for determining the activity of deoxyribonucleases in biological liquids, by spectrophotometric determination at 260 nm of deoxyribonucleic acid decomposition products, after incubation for a determined time, characterized in that the liquid is added Biological test to a reaction medium consisting of a pH 7-9 buffer solution, a soluble magnesium salt, a soluble calcium salt and deoxyribonucleic acid, to maintain the reaction mixture thus obtained for 45 to 90 minutes at a temperature of 45 to 630C, which is denatured, that the insoluble substances are separated from the reaction mixture by filtration through micropores or by ultracentrifugation and that the remaining liquid is subjected to a spectrophotometric measurement at 260 nm compared to a reference solution which additionally contains an inhibitor of

DNAse.

2. A process according to claim 1, characterized in that the reaction mixture is maintained for 50 to 70 minutes at a temperature of 55 to 600C.

3. A process according to claim 1 or 2, characterized in that the pore diameter of the filters is 0.30 to 0.60 m.

4. A process according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the filter used at least one nitrocellulose membrane.

5. A process according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the filter used at least one Teflon membrane.

6. A process according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it precedes the filtration centrifugation.

7. A process according to claim 1 or 2, characterized in that the separation of insoluble substances is carried out by ultracentrifugation at more than 40,000 g.

8. A process according to any one of claims 1 to 7, characterized in that a sample of 100 to 500 l of the biological fluid is used.

9. A process according to claim 8, characterized in that a sample of 200 l of the biological fluid is used.

10. A process according to any one of claims 1 to 9, characterized in that 250 to 750 / g of deoxyribonucleic acid is used.

11. A process according to claim 10, characterized in that 500 μL of deoxyribonucleic acid is used.

12. A process according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the buffer solution consists of an aqueous solution of tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride.

13. A process according to claim 12, characterized in that 0.5 to 2 ml of a 0.1 M aqueous solution of tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride.

14. A process according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the buffer solution has a pH 8.

15. A process according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the soluble salt of magnesium is magnesium chloride and that its concentration is from 0.1 to 50 mM.

16. A process according to claim 15, characterized in that the concentration of magnesium chloride is 3 to 8 mM.

17. A process according to any one of claims 1 to 16, characterized in that the soluble calcium salt is calcium chloride and that its concentration is 0.01 to 3 mM.

18. A process according to claim 17, characterized in that the concentration of calcium chloride is 0.1 to 0.5 mM.

19. A process according to any one of claims 1 to 18, characterized in that the denaturing product is a perchloric acid at a concentration of 1 to 3 M.

20. A process according to any one of claims 1 to 19, characterized in that the DNAses inhibitor is ethylene-bis (oxyethylenenitrile) -tetracetic acid.

21. A process according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the biological fluid is selected from blood, cerebrospinal fluids, pleural punctures, lymphatic fluid, pancreatic juice and bile liquid, the urine and soluble parts separated solid particles of tissue homogenates or glands.

22. The method of claim 21, characterized in that the biological fluid is blood serum.

23. Process according to any one of claims 1 to 22, characterized in that it is carried out with an apparatus comprising a lower part which consists of a reaction cylinder (1) and an upper part (2) which comprises a container (3) mounted at the end of a hollow piston (4) provided with a filter (5), said hollow piston (4) provided with a seal (6) being engaged in the reaction cylinder (1).

24. A process according to claim 23, characterized in that the filter of the lower part of the piston is nitrocellulose whose pores have a diameter of 0.45 m.

25. The use of the method according to any one of claims 1 to 24 for screening for malignant tumors.

26. The use of the method according to any one of claims 1 to 24 for controlling the diagnosis of a malignant tumor treatment and diagnosing it.