FR2562089A1 - Procede de production d'un coenzyme - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PRODUCTION D'UN COENZYME SOUS LA FORME REDUITE. LE PROCEDE CONSISTE A FAIRE REAGIR DE L'ACIDE MALIQUE AVEC UN COENZYME CHOISI ENTRE LE NICOTINAMIDE ADENINE DINUCLEOTIDE ET LE NICOTINAMIDE ADENINE DINUCLEOTIDE PHOSPHATE EN PRESENCE DE MALATE DESHYDROGENASE POUR OBTENIR LE PRODUIT REDUIT CORRESPONDANT. LES FORMES REDUITES DU NICOTINAMIDE ADENINE DINUCLEOTIDE ET DU NICOTINAMIDE ADENINE DINUCLEOTIDE PHOSPHATE INTERVIENNENT NOTAMMENT COMME COENZYMES DANS L'ANALYSE ENZYMATIQUE DE DIVERSES SUBSTANCES TELLES QUE L'ACIDE PYRUVIQUE, L'ACIDE OXALO-ACETIQUE ET L'AMMONIAC DANS LE SERUM ET DANS L'URINE.
Description
La présente invention concerne un procédé de production du nicotinamide
adénine dinucléotide sous la forme réduite (appelé ci-après NADH) et du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate sous la forme réduite (appelé ci-après NADPH). La présente invention a plus particulièrement trait à un procédé de production de NADH et de NADPH par réduction enzymatique de nicotinamide
adénine dinucléotide (appelé ci-après NAD) et de nicotina-
mide adénine dinucléotide phosphate (appelé ci-après
NADP), respectivement.
Le NADH et le NADPH constituent une substance qui est bien connue en tant que substance importante comme coenzyme de la déshydrogénase, et ils sont également utilisés pour la détection de divers types de réactions
de déshydrogénase en raison de leur absorption ultravio-
lette caractéristique. En effet, tandis que les composés NADH et NADPH, qui sont sous la forme réduite, présentent une absorption remarquable à 340 nm, les composés NAD et NADP, qui sont sous une forme oxydée, ne présentent pas une telle absorption, et par conséquent lorsque NADH et NADPH sont utilisés comme coenzyme pour une réaction de déshydrogénase dans l'analyse enzymatique de divers types de substances dans l'organisme vivant, tels que l'acide pyruvique, l'acide oxalo-acétique et l'ammoniac dans le sérumi et l'urine, ils peuvent constituer
un indicateur distinct pour lesdites substances.
Les composés NADH et NADPH sont obtenus respectivement par réduction de NAD et de NADP. Pour la réduction de NAD et de NADP, il existe également un procédé chimique qui utilise un agent réducteur tel que le dithionite de sodium (Na2S204). Toutefois, dans
ce procédé, divers isomères exerçant une action inhibi-
trice sur la réaction enzymatique sont produits, si bien que le dithionite de sodium ne peut pas être utilisé
comme réactif biochimique.
En revanche, attendu qu'une réduction enzyma-
tique avec des déshydrogénases dont le coenzyme est NAD ou NADPne produit pas de tels isomères, on l'utilise actuellement d'une façon générale pour la production de NADH et de NADPH. Pour la réduction enzymatique de NAD, il existe un procédé utilisant une formiate déshydrogénase (demande de brevet japonais mise à l'Inspection Publique sous le n 101 491/1979). Mais l'utilisation de l'acide
formique dans la production industrielle est un inconvé-
nient, parce que l'acide est un liquide volatil ayant une odeur très irritante et des propriétés corrosives, et parce qu'il provoque des troubles au contact de la peau. Pour la réduction enzymatique du NADP, divers procédés ont été rapportés, comme indiqué ci-après: un procédé utilisant la glucose-6-phosphate déshydrogénase (Izumi et collaborateurs, Collection of Lectures on the Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan, 1983, page 358); un procédé utilisant la glucose déshydrogénase (Izumi et collaborateurs, Collection of Lectures on the Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan, 1984, page 595); un procédé utilisant des bactéries méthanogènes [Eguchi et collaborateurs, Agricultural and Biological Chemistry, volume 47, pages 2941-2943 (1984)] ; etc. Toutefois, dans ces procédés, une condition
alcaline de pH d'environ 9 est considérée comme essentiel-
le pour l'évolution effective de la réaction, et cette condition produit un effet désavantageux sur le NAD(P) et le NAD(P)H, ce qui est indésirable en ce qui concerne
le rendement du produit recherché.
A cause des problèmes exposés ci-dessus, la Demanderesse s'est efforcée d'établir un procédé de production qui satisfait aux conditions suivantes, avec pour but d'effectuer la production industrielle de NAD(P)H: (1) Un composé utilisé comme substrat doit être bon
marché et ne doit pas être dangereux à manipuler.
(2) La réduction doit être conduite dans une région neutre de pH. Cette condition est inévitable si l'on considère que NAD et NADP sont aisément décomposés du côté alcalin et que NADH et NADPH sont aisément décomposés
du côté acide. En conséquence, l'essentiel pour la réac-
tion (c'est-à-dire la réduction) est que l'équilibre tende vers la formation de NADH ou de NADPH dans un
intervalle de pH de 6 à 8.
En bref, la présente invention propose un procédé de production de NADH et de NADPH et elle est caractérisée en ce qu'on obtient du NADH ou du NADPH en faisant réagir du NAD ou du NADP avec l'acide malique
en présence de malate déshydrogénase.
La réaction de la malate déshydrogénase est exprimée par l'équation suivante: Acide L-malique + NAD(P) malate-.Acide pyruvique + C02+NAD(P)H+ H+ Acide L-malique + NAD(P) 2éhdogns déshydrogénase Cette réaction s'accomplit entièrement dans une région pratiquement neutre de pH d'environ 7,5, en sorte que de petites quantités de substrat et d' enzyme suffisent, et aussi que la décomposition de NAD(P) et de NAD(P)H au cours de la réaction est inhibée. En outre, lorsque cette réaction est conduite sous pression réduite, afin d'éliminer du système réactionnel l'anhydride carbonique gazeux formé par la réaction, cette dernière évolue plus facilement vers la formation de NAD(P)H et il en résulte que la production de NAD(P)H peut être effectuée
très aisément.
Dans la présente invention, on peut utiliser des enzymes de toute source, s'il s'agit de malate déshydrogénase correspondant au numéro d'enzyme EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.39 ou EC 1.1.1.40. Un enzyme appartenant à EC 1.1.1.38 peut être tiré par exemple d'Escherichia coli ou de Lactobacillus arabinosus par le procédé bien
connu (voir Enzyme Handbook, page 14, publié par Asakura-
shoten Go. en 1982). Un enzyme appartenant à EC 1.1.1.39 est tiré par exemple d'Achromobacter parvulus (voir la demande de brevet japonais N 197080/1984). Un enzyme appartenant à EC. 1.1,1.40 est tiré par exemple du foie
de pigeon (voir Methods in Enzymology, volume 1, 739-
753, 1955).
Comme source d'enzyme, la cellule proprement dite douée d'activité de malate déshydrogénase dont la perméabilité de membrane a été préalablement améliorée par congélation et décongélation, traitement avec un solvant organique ou avec un agent tensio-actif, ou
par d'autres traitements, peut être utilisée telle quelle.
Pour l'immobilisation de la malate déshydro-
génase, on peut utiliser les procédés bien connus d'immo-
bilisation tels que le procédé au polyacrylamide, le procédé utilisant du glutaraldéhyde et un agent réactif ou des polysaccharides, tels que la carraoghnine, etc. L'activité enzymatique peut être mesurée d'après une élévation de l'absorption à 340 nm du NAD(P)H produit par la réaction. Les composants contenus dans 1I ml de la solution réactionnelle comprennent 20 imoles d'acide L-malique, 10 pmoles de chlorure de magnésium, 0,35 Bmole de NAD ou 0,20 gmole de NADP et 50 imoles
de tampon HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-
2-éthanesulfonique)/KOH (pH 7,4). La solution d'enzyme
est ajoutée à cette solution réactionnelle pour la condui-
te de la réaction pendant 30 minutes. Une unité U d'acti-
vité enzymatique est définie par l'activité enzymatique nécessaire pour décomposer 1 gmole d'un substrat par minute. La réaction de la présente invention est conduite, de préférence, à un pH de 6 à 8 dans l'eau ou dans une solution tampon (par exemple HEPES, tampon au chlorhydrate de tris-, tampon au phosphate). Il est avantageux d'ajouter un ion Mg++ (par exemple MgCl2, MgSO4) à la solution réactionnelle. La quantité de NAD ou de NADP que l'on ajoute à la solution réactionnelle va avantageusement de 0,05 à 10% (en poids/volume) et
la quantité d'acide malique qui y est ajoutée va avanta-
geusement de 0,02 à 5% (poids/volume). De la malate déshydrogénase est ajoutée après l'addition de NAD ou de NADP et d'acide malique. L'acide malique peut être
l'un ou l'autre de l'acide L-malique et de l'acide DL-
malique. La réaction est généralement conduite à 20-
C pendant plusieurs heures à plusieurs dizaines d'heu-
res.
La préparation de la malate déshydrogénase est effectuée comme indiqué ciaprès en utilisant par exemple Achromobacter parvulus IFO-13182. Un milieu nutritif contenant 1 g/dl d'acide DL-malique, 0,03 g/dl de MgSO4. 7H20, 0,3 g/dl d'acide citrique, 1,5 g/dl de K2HPO4, 0,53 g/dl de Na(NH4) HP04, 0,6 g/dl de NaOH, 0,1 g/dl d'extrait de levure et 1 g/dl de peptone est introduit dans dix fioles d'Erlenmeyer de 2 litres en quantité de 500 ml par fiole et stérilisé à 120"C pendant 15 minutes. Chaque milieu est inoculé avec la souche ci-dessus, l'inoculation étant suivie de l'agitation
par secousses de la culture à 30 C pendant 24 heures.
Lorsque la culture est terminée, le bouillon de culture est centrifugé pour recueillir les cellules. Les cellules sont lavées, mises en suspension dans 1000 ml d'une solution tampon au phosphate 40 mM (pH 7,4) contenant mM de 2-mercaptoéthanol (appelé ci-après 2-ME) et
2 mM de sel disodique d'acide éthylènediamine tétra-
acétique (appelé ci-après EDTA-2Na) et elles sont désinté-
grées à une température égale ou inférieure à 5 C pendant minutes au moyen d'un désintégrateur à ultrasons
de 9KHz (produit de la firme Kubota Seisakusho Co.).
La solution après désintégration est centrifugée et
la solution surnageante obtenue est utilisée comme solu-
tion d'enzyme dans l'expérience suivante. La solution exposée à la désintégration par les ultrasons est contaminée par de la NADH oxydase qui réoxyde le NADH produit à partir de NAD, en sorte qu'il est nécessaire de désactiver l'oxydase par un
traitement à la chaleur à 50 C pendant une heure. L'acti-
vité de la malate déshydrogénase n'est nullement affectée
dans ces conditions.
La malate déshydrogénase peut être utilisée sous la forme d'extrait comme décrit ci-dessus, mais les cellules peuvent aussi être utilisées après avoir été rendues hautement perméables. La perméabilité des cellules est améliorée par congélation et conservation des cellules pendant la nuit en présence d'un agent tensio-actif non ionique, par exemple 0,1% de Triton X-100 (Rohm & Haas Co.). En conséquence, les cellules ainsi préparées peuvent être utilisées telles quelles
comme préparation enzymatique.
La présente invention est illustrée de façon
plus détaillée par les exemples expérimentaux suivants.
Exemple expérimental 1 Production de NADH à partir de NAD La réaction de production de NADH a été effectuée dans les conditions normalisées suivantes: 3 mg d'acide L-malique, 45 mg de MgCl2 et 10 mg de NAD ont été dissous dans 2,0 ml de solution tampon HEPES mM; le pH de la solution obtenue a été ajusté à 7,4; 1 ml de la solution d'enzyme a été ajouté, et la réaction a été conduite à 30 C. Lorsqu'on a utilisé 1,5 unité de malate déshydrogénase de Ach. Parvulus IF0-13182 dans ces conditions normalisées (l'activité a été mesurée avec NAD comme coenzyme), du NADH a été formé avec un taux de transformation d'environ 100%
en trois heures.
La réaction a été répétée avec différentes solutions tampons. Les résultats de la réaction sont reproduits sur le tableau I.
TABLEAU I
Effet de solutions tampons sur la réduction de NAD Solution tampon Durée de réaction (h) (50 mM; pH, 7,8) 0 1 2 3 4 5 Solution tampon 1,00(0)* 52t25(63,78) 71,40(87,62) 79,50(97/70) 82,60(101,56) 83,25(102,36) HEPES Solution tampon au 1,00(0) 38,25(46,36) 57,05(69,76) 64,75(79,34) 73t90(90,73) 81,60(100,31)
phosphate de potas-
sium Solution tampon au 1,00(0) 34,25(41,38) 52,40(63,97) 66,05(80,96) 70, 20(86,.12) 82,75(101l74) phosphate de sodium Solution tampon au chlorhydrate de 1;00(0) 36,30(43,93) 60,35(73,86) 74,55(91;54) 82,15(101, 00) 82,30(!101,18) tris- Eau 1t00(0) 16,85(19,79) 27,05(32,42) 39,50(47, 92) 51,50(62,85) 58,70(71,81)
* Absorption de la solution réactionnelle à 340 nm.
Une valeur numérique placée entre parenthèses indique un taux de ro transformation (%) de NAD en NADH. L C> Co / anG Comme le fait apparaître le tableau I, une solution tampon HEPES ou au phosphate de potassium convient
pour cette réaction.
On a ensuite examiné le taux de transformation de NAD en NADH avec différentes concentrations d'acide malique, Les résultats sont reproduits sur le tableau I.
TABLEAU II
Effet des concentrations en acide malique sur la réduction de NAD Concentration Durée de réaction (h) de l'acide malique O' 2 3 4 5 (M)
(M) 0 1 2 3 4 _ 5
0 l0oo(o)* 1,00(0) 1100(0) 1,00(0) 1,00(0) 1,00(0) 0,005 1lO0(0) 25,00(31, 87) 25,45(32,47) 22180(28,95) 19,25(25,56) 18p15(22,77)
0,01 1,00(0) 40;45(52,39) 48,55(64,47) 47,80(62,15) 45,00(58,43) 44,45(57, 70)
0,05 1,00(0) 56;00(73,04) 71,15(93t16) 71t65(93,82) 71,85(94,08) 73,15(95, 81) 0,10 1,00(0) 58,60(76,49) 73t25(95,94) 71,90(94,15) 72t80(95,35) 74, 35(97,40)
0,15 1100(0) 53,85(70,18) 71,00(92,96) 72,15(94,48) 70,85(92 76) 71,90(94, 15)
0,20 1,00(0) 50,50(65,73) 70,50(92,29) 71t90(94,15) 74,50(97,60) 74,40(97, 47)
0,40 1,00(0) 38,75(50,13) 58,00(75,69) 70,60(92,42) 74,60(97,74) 75,90(99, 46)
0,60 1,00(0) 31,10(39,97) 51,80(67,46) 64,30(84,06) 70,95(92,89) 74,55(97, 67)
0,80 1,t00(0) 25,45(32,47) 44t35(57157) 55,20(71,97) 60,95(79,61) 71, 45(93,55)
1,00 1,00(0) 17,25(21,84) 31,15(40,04) 36,50(47,14) 50,80(66,13) 55,15(71, 91)
* Absorption de la solution réactionnelle a 340 nm.
Une valeur numérique placée entre parenthèses indique un taux cX
de transformation (%) de NAD en NADH.
%C Comme le fait apparaître le tableau II, des concentrations de 0,05 à 0, 2M conviennent pour la réduction
dans les conditions réactionnelles décrites ci-dessus.
On a ensuite examiné le taux de transformation de NAD en NADH avec différentes concentrations de NAD.
Les résultats ressortent du tableau III.
TABLEAU III
Effet des concentrations de NAD sur la réduction de NAD Concentration Durée de réaction (h) _. _ de NAD (%) 0 i 2 3 4 5 0,05 0,10(0)* 4,17(101, 31) 4,11(99,81) 4,08(99,07) 4,30(104154) 3t98(96t57) 0,10 0,10(0) 7r44(90; 85) 7,57(92,97) 7,67(94,21) 8,:15(100,19) 7,95(97f70) Ot50(0) 28t80(70,44) 37t05(91,97) 39tlO(97,19) 40rO05(99p44) 40,65(99,94) 0,75 1t00(0) 31, 20(50,11) 50,00(81,31) 55,35(90,19) 59,35(96,83) 59,35(96,83) 1,00 1t00(0) 49,70(60,61) 76,00(93,34) 83,40(102,55) 83.60(102,80) 83,60(102t80) 2,50 1,00(0) 13,30( 6,12) 19,55( 9t23) 24,95(11,92) 25,15(12,02) 26r10(12150) t00 1;00(0) 5,80( 1,19) 6t10( 1,27) 6,50( 1,37) 7,00( 1,49) 7,30( 1,57)
* Absorption de la solution réactionnelle à 340 nm.
Une valeur numérique placée entre parenthèses indique un taux
de transformation (%) de NAD en NADH.
Ln Co o Comme le fait apparaître le tableau III, une
concentration optimale de NAD dans les conditions réac-
tionnelles décrites ci-dessus est de 1,0%, et on obtient un taux de transformation de 100% par réaction pendant 3 heures. On peut constater d'après ces résultats que les concentrations optimales en acide malique et en NAD sont respectivement de 0,3% et de 1,0% et qu'une plage de pH de 7,5 à 8,0 convient pour cette réaction
enzymatique.
On a ajouté de l'éthanol à 50% a la solution réactionnelle pour précipiter des impuretés telles qu'une protéine, et après avoir enlevé les impuretés, on a ajouté de l'éthanol à 90% à la solution pour précipiter le NADH. Ce dernier a été purifié par lavage à plusieurs
reprises avec de l'éthano] de la même concentration.
Il a été confirmé que la préparation purifiée consistait
en NADH d'après l'activité coenzymatique avec la glu-
tathion réductase (EC 1.6.4.2), et sa pureté aéduite
de cette activité a été de 95%.
Exemple expérimental 2 Production de NADPH à partir de NADP La réaction en vue de la production de NADPH a été effectuée dans les conditions normalisées suivantes: 10 mg d'acide L-malique, 45 mg de MgCl2 et 10 mg de NADP ont été dissous dans 2,0 ml d'une solution tampon HEPES mM; le pH de la solution a été ajusté à 7,4; lml de la solution enzymatique a été ajouté, et la réaction a été conduite à 30 C. Lorsqu'on a utilisé 1,5 unité de malate déshydrogénase de Ach. parvulus IFO-13182 dans ces conditions normalisées (l'activité a été mesurée avec le NADP comme coenzyme), du NADPH s'est formé
avec un taux de transformation d'environ 100% en 3 heures.
La réaction a été répétée avec différentes solutions tampons. Les résultats de la réaction sont
reproduits sur le tableauIV.
TABLEAU IV
Effet de solutions tampons sur la réduction de NADP Solution tampon Durée de réaction (h) (50 miM; pil, 7,8) 0 1 2 3 4 5 Solution tampon 1,0(0)* 33, 90(48,25) 57,55(82e94) 68,20(98,56) 67,95(98,20) 69;20(100103) HEPES Solution tampon au phosphate de potas- 1,0(0) 40t40(57r79) 54,25(78t10) 64,75(93,50) 71,80{103;40) 71,20(102,96) sium Colution tampon au posptee smodiu 1,0(0) 22,15(31r02) 40t85(58,45) 53;05(76t34) 71135(103,18) 71, 10(102;82) phosphate de sodium t Solution tampon au chlorhydrate de 1,0(0) 27t05(38,21) 44t75(64,17) 57,35(82t65) 70;50(101,94) 71,05(102,74) trisEau 1,0(0) 15,65(21f49) 29;55(41187) 38,95(55,66) 48,15(69,16) 56,80(81, 84)
* Absorption de la solution réactionnelle à 340 nm.
Une valeur numérique entre parenthèses indique un taux de transfor-
um
mation (%) de NADP en NADPH.
o "O Comme le fait apparaître le tableau IV, une solution tampon au HEPES ou au phosphate de potassium
convient pour cette réaction.
Ensuite, on a examiné le taux de transforma-
tion de NADP en NADPH avec différentes concentrations d'acide malique. Les résultats sont reproduits sur le
tableau V.
TABLEAU V
Effet des concentrations d'acide malique sur la réduction de NADP Concentration Durée de réaction (h) de l'acide malique 0 1 2 3 4 5 (M) 0 1,10(0)* 1,10(0) l,10(0) 1,00 (0) 1,10(0) 1,00(0) 01005 1,00(0) 21t70(32, 39) 24,70(37109) 24;70(37,09) 23,30(34,90) 23,15(34,66)
0,01 1,00(0) 32,45(49,22) 40>70(62,13) 41,00(62,60) 43,30(66,20) 43,40(66, 35)
0,05 1,00(0) 39,05(59,55) 55t25(84t90) 58,90(90,61) 58e55(90,06) 59>75(91; 94) 0J10 1,00(0) 39,80(60,72) 55,20(84,82) 57;15(87,87) 59,70(93r43) 60, 15(92,57) 0,15 1,00(0) 38t85(59,23) 57,20(87,95) 64,00(98,59) 64,50(99,38) 65,00(100,16) 0,20 1,00(0) 31,05(47,03) 50,10(76,84) 56,10(86,23) 66t25(102,11) 65;30(100,63) 0,40 lr00(0) 24r80(37,25) 40,35(61,58) 48, 20(73787) 52r05(79,89) 59,85(92,10) 0,60 1,00(0) 19,25(28,56) 31>95(48,44) 39,35(60,02) 42t95(65,65) 49r10(75t28) 0r80 1,00(0) 14,10(20,50) 23t55(35,29) 32;15(48,75) 35195(54,70) 40,65(62,05)
1,00 1,00(0) 1100(15,65) 16,85(24,80) 23,35(34,98) 25,40(38,19) 28;75(43, 43)
* Absorption de la solution réactionnelle à 340 nm. n Une valeur numérique entre parenthèses indique un taux de r transformation ( de NADP en NADPH. o o Comme le fait apparaître le tableau V, des concentrations de 0,05 à 0,2M conviennent pour la réduction
dans les conditions réactionnelles décrites ci-dessus.
Ensuite, on a examiné le taux de transforma-
tion de NADP en NADPH avec différentes concentrations de NADP. Les résultats sont reproduits sur le tableau VI.
TABLEAU VI
Effet des concentrations de NADP sur la réduction de NADP Concentration Durée de réaction (h)
de NADP ()..
0 1 2 3 4 5
0,05 0,10(0)* 3;19(90,64) 3,20(90,94) 3t30(93t87) 3,45(98,27) 3,25(92140)
0,10(0) 6,29(9079) 6,47(93;43) 6166(96722) 685(99;00) 6;66(96123)
0,50 0,50(0) 16,30(46,35) 25,15(72(31) 28r90(83131) 30115(86;98) 33, 33(96r30) 0,75 1,00(0) 21,65(40y38) 35,65(67,76) 43135(82,82) 47715(90P25) 48,00(91,91) 1,00 1,00(0) 30,40(43t12) 45;15(64,76) 50,45(72,53) 66, 50(96,07) 68,00(98,27) 2,50 1100(0) 8,10( 4t17) 10140( 5t51) 9,70( 5;10) 11r65( 6t25) 11,65( 6,25) ,00 1;00(0) 5,45( 1;31) 5,75( 1,39) 5,60( 1,35) 5t60( 1135) 6,35( 1;57)
* Absorption de la solution réactionnelle à 340 nm.
Une valeur numérique entre parenthèses indique un taux de transformation (%) de NADP en NADPH., u1 oD o %o Comme le fait apparaître le tableau VI, une
concentration optimale de NADP dans les conditions réac-
tionnelles décrites ci-dessus est de 1,0%, un taux de transformation de 100% étant obtenu par réaction pendant 4 heures.
Il ressort de ces résultats que des concentra-
tions optimales d'acide malique et de NADP sont respecti-
vement de 0,3% et de 1,0% et qu'une plage-de' pH de -7,5
à 8,0 convient pour cette réaction enzymatique.
De l'éthanol à 50% a été ajouté-à la solution réactionnelle pour précipiter des impuretés telles qu'une protéine et après élimination des impuretés, de l'éthanol à 90% a été ajouté à la solution pour précipiter le NADPH. Ce dernier a été purifié par lavage à plusieurs
reprises avec de l'éthanol à la même concentration.
Il a été confirmé que la préparation purifiée consistait en NADPH d'après l'activité coenzymatique avec la glutathion réductase (EC 1.6.4.2), et sa pureté tirée
de cette activité a été de 95%.
La présente invention est illustrée plus particulièrement par les exemples suivants, donnés à
titre non limitatif.
Exemple 1
Un milieu comprenant 1 g/dl d'acide DL-
malique, 0,03 g/dl de MgSO4.7H20, 0,3 g/dl d'acide citri-
que, 1,5 g/dl de K2HP04, 0,53 g/dl de Na(NH4)HP04, 0,6 g/dl de NaOH, 0,1 g/dl d'extrait de levure et 1 g/dl de peptone a été introduit dans 2 fioles de 2 litres en quantité de 500 ml par fiole et stérilisé à 120 C pendant 15 minutes. Chaque milieu a été inoculé avec Achromobacter parvulus IFO-13182, l'inoculation étant suivie d'une culture sous agitation par secousses à C pendant 24 heures. Lorsque la culture a été terminée, le bouillon de culture a été centrifugé pour recueillir les cellules. Les cellules ont été lavées, mises en suspension dans 200 ml d'une solution tampon au phosphate
mM (pH 7,4) contenant 10 mM de 2-ME et 2 mM de EDTA-
2Na et elles ont été désintégrées à 5 C pendant 10 minutes au moyen d'un désintégrateur à ultrasons de 9KHz. La solution après désintégration a été centrifugée pour obtenir une liqueur surnageante. La solution a ensuite été traitée à la chaleur à 50 C pendant 1 heure pour désactiver la NADH oxydase et utilisée comme solution
d'enzyme (EC 1.1.1.39).
Six grammes d'acide L-malique, 3 g de MgC12 et 20 g de NAD ont été dissous dans 1,8 litre d'une solution tampon au phosphate de potassium 55 mM et le pH de la solution résultante a été ajusté à 7,5. Ensuite, on a ajouté 200 ml de la solution d'enzyme et on a conduit
la réaction à 30 C.
Du NAD a été réduit presque complètement en NADH par conduite continue de la réaction pendant 6 heures. Au bout de 6 heures, la solution réactionnelle a été lyophilisée en donnant une poudre qui a ensuite
été redissoute dans 200 ml d'eau distillée. Après enlève-
ment des produits insolubles par centrifugation, la
même quantité d'éthanol a été ajoutée (50%) et les préci-
pités formés ont été enlevés par centrifugation.
De l'éthanol a été ajouté à la liqueur surnageante obtenue par centrifugation de manière que sa concentration soit égale à 90%, pour précipiter le NADH. Le NADH précipité a été lavé trois fois à l'éthanol
à 90%.
La pureté du NADH purifié ainsi obtenu a été d'environ 95% d'après l'activité coenzymatique
avec la lactate déshydrogénase et le spectre d'absorption.
Rendement 98 %.
Exemple 2
Une solution soumise à une désintégration aux ultrasons a été obtenue de la même manière que dans
l'exemple 1 et utilisée comme solution d'enzyme.
Six grammes d'acide L-malique, 3 g de MgCl2 et 20 g de NADP ont été dissous dans 1,8 litre d'une solution tampon au phosphate de potassium 55 mM et le pH de la solution résultante a été ajusté à 7,5. Ensuite, on a ajouté 200 ml de la solution d'enzyme et on a conduit
la réaction à 30 C.
Du NADP a été réduit en NADPH presque complê-
tement par poursuite de la réaction pendant 5 heures.
Au bout de 5 heures, la solution réactionnelle a été lyophilisée en donnant une poudre qui a ensuite
été redissoute dans 200 ml d'eau distillée. Après élimina-
tion par centrifugation des produits insolubles, la même quantité d'éthanol a été ajoutée (50%) et les précipités
formés ont été éliminés par centrifugation.
De l'éthanol a été ajouté à la solution surnageante obtenue par centrifugation de manière que
sa concentration soit de 90%, pour précipiter le NADPH.
Le NADPH précipité a été lavé trois fois avec de l'éthanol à 90%. La pureté du NADPH purifié ainsi obtenu était d'environ 96% d'après l'activité coenzymatique avec
la glutathion réductase et d'après le spectre d'absorption.
Rendement,. 99%.
Exemple 3
On a chargé dans un récipient de réaction 500 ml d'un tampon au phosphate 50 mM (pH 7,5) contenant mM de MgC12 et après addition de 5 g de NAD et de 1,5 g d'acide L-malique, on a ajusté le pH de la solution résultante à 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium 1N. Ensuite, on a ajouté 50 unités de malate déshydrogénase (EC 1.1.1.38) préparée à partir d'Escherichia coli par le procédé décrit
dans The Journal of the Biochemistry, volume 73, 169-
(1973) et la réaction a été conduite à 30 C pendant heures sous agitation modérée. Le pH à la fin de la
réaction était de 7,8.
Les quantités de NAD et de NADH dans la
solution réactionnelle ont été déterminées par chromato-
graphie en phase liquide à haute performance et on a trouvé d'après le calcul que 95% du NAD initialement présent avaient été réduits. On a ajouté à la solution réactionnelle obtenue 1000 ml d'alcool éthylique et
après repos pendant encore 30 minutes, on a séparé l'enzy-
me par centrifugation sur une centrifugeuse réfrigérée.
Ensuite, on a ajouté de l'alcool éthylique à la solution surnageante jusqu'à ce que sa concentration soit égale à 90%, et on a laissé reposer la solution pendant 2 heures. Le précipité de NADH formé a été recueilli par centrifugation, lavé avec deux portions d'alcool éthylique et deux portions d'éther éthylique et séché sous vide en donnant 4,5 g de NADH. La pureté du NADH a été trouvée
égale à 97% par analyse avec la lactate déshydrogénase.
Exemple 4
On a chargé dans un récipient de réaction 500 ml d'un tampon au phosphate 50 mM (pH 7,5) contenant 10 mM de MgCl2, et après addition de 5 g de NAD et de 1,5 g d'acide L-malique, on a ajusté le pH de la solution résultante à 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium 1N. On
a encore ajouté 50 unités de malate déshydrogénase prove-
nant d'Escherichia coli, obtenue de la manière indiquée dans l'exemple 3, et on a conduit la réaction à 30 C pendant 5 heures sous pression réduite (20 mm de Hg) en agitant modérément. Le pH à la fin de la réaction
était égal à 8,0.
Les quantités de NAD et de NADH dans la
solution réactionnelle ont été déterminées par chromato-
graphie en phase liquide à haute performance et on a trouvé d'après le calcul que 98% du NAD initialement présent avaient été réduits. On a ajouté à la solution réactionnelle obtenue 1000 ml d'alcool éthylique, et
on a séparé l'enzyme par centrifugation sur une centrifu- geuse réfrigérée. Ensuite, on a ajouté de l'alcool éthyli-
que à la solution surnageante jusqu'à ce que sa concentra-
tion soit égale à 90%, et on a laissé reposer la solution
pendant 2 heures. Le précipité de NADH formé a été re-
cueilli par centrifugation, lavé avec deux portions d'alcool éthylique et deux portions d'éther éthylique et séché sous vide en donnant 4,8 g de NADIH. La pureté du NADH a été trouvée égale à 98% par analyse avec la
lactate déshydrogénase.
Exemple 5
On a chargé dans un récipient de réaction 1000 ml d'eau contenant 10 mM de MgC12 et après addition de 10 g de NADP et de 3 g d'acide L-malique, on a ajusté le pH de la solution résultante à 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium 1N. On a ajouté ensuite 100 unités de malate déshydrogénase (EC 1. 1.1.40) extraite de foie de pigeon par le procédé décrit dans Method in Enzymology, volume 1, 739-753 publié par Academic Press Co. en 1955, et on a conduit la réaction à 30 C pendant 4 heures en agitant modérément. Le pH à la fin de la réaction était
égal à 8,0.
Les quantités de NADP et de NADPH dans la
solution réactionnelle ont été déterminées par chromato-
graphie en phase liquide à haute performance, et on a trouvé par le calcul que 98% du NADP initialement présent avaient été réduits. On a ajouté à la solution réactionnelle obtenue 2000 ml d'alcool éthylique, et on a séparé l'enzyme par centrifugation (15 000 x g, minutes) sur une centrifugeuse réfrigérée. Ensuite,
on a ajouté de l'alcool éthylique à la solution surnagean-
te jusqu'à ce que sa concentration soit égale à 90%
et on a laissé reposer la solution pendant 2 heures.
Le précipité de NADPH formé a été recueilli par centrifu-
gation, lavé avec 2 portions d'alcool éthylique et 2 portions d'éther éthylique et séché sous vide en donnant 9,3 g de NADPH. La pureté du NADPH a été trouvée égale
à 96% par analyse avec la glutathion réductase.
Claims (2)
1. Procédé de production d'un coenzyme sous la forme réduite, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir l'acide malique avec un représentant du groupe de coenzymes comprenant le nicotinamide adénine dinucléotide et le nicotinamide adénine dinucloétide phosphate en présence de malate déshydrogénase pour
obtenir le produit réduit correspondant.
2. Procédé suivant la revendication 1, carac-
térisé en ce que la réaction est conduite sous pression
réduite avec élimination du système réactionnel de l'anhy-
dride carbonique gazeux formé.
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| JP6010084A JPS60203198A (ja) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | 還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・フオスフエ−トの製法 |
| JP8998284A JPS60234592A (ja) | 1984-05-04 | 1984-05-04 | 還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドの製法 |
| JP19708184A JPS6174593A (ja) | 1984-09-20 | 1984-09-20 | 還元型補酵素の製造方法 |
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1985
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Patent Citations (1)
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| ENZYME NOMENCLATURE, 1972, pages 46-47, Elsevier Scientific Publishing Co., Amsterdam, NL * |
Also Published As
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|---|---|
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| DE3510963C2 (de) | 1986-10-30 |
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| ST | Notification of lapse |