FR2552765A1 - Procede de conversion de corrinoides produits par des microorganismes en cyanocorrinoides - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET LA CONVERSION DES CORRINOIDES PRODUITS PAR DES MICROORGANISMES EN CYANOCORRINOIDES PAR REACTION AVEC DES CYANURES. ON MET EN CONTACT UN BOUILLON DE FERMENTATION OBTENU PAR RUPTURE DES CELLULES DES MICROORGANISMES, AVANTAGEUSEMENT PAR TRAITEMENT THERMIQUE EN PRESENCE OU NON D'IONS SULFITE, FACULTATIVEMENT APRES UNE PURIFICATION, AVEC UN ADSORBANT CONVENABLE OU UNE RESINE ECHANGEUSE D'IONS; ON TRAITE LES CORRINOIDES SUR LA SURFACE DE L'ADSORBANT OU DE LA RESINE AVEC UNE SOLUTION AQUEUSE CONTENANT DES IONS CYANURE OU UN COMPOSE FOURNISSANT CES IONS, EN UNE PROPORTION PERMETTANT D'OBTENIR LES IONS CYANURE EN UN EXCES MOLAIRE DE 1,1 A 2,0FOIS PAR RAPPORT AUX CORRINOIDES; ON LAVE LA RESINE AVEC DE L'EAU ET ON ELUE LES CYANOCORRINOIDES. ADDITIFS AU FOURRAGE ET AUTRES UTILISATIONS ANALOGUES.

Description

i La présente invention concerne un procédé nouveau pour la conversion des

corrinoldes produits par des

microorganismes en cyanocorrinoldes.

On sait que les corrinoldes sont exclusivement pro5 duits par des microorganismes Dans les cellules des microorganismes, les corrinoldes sont accumulés sous forme de coenzymes ou sont liés à des protéines Comme premier stade d'isolement des corrinoldes, il faut rompre les cellules et briser les liaisons entre le 10 groupe désoxyadénosyle du squelette de corrine de la coenzyme B 12 et les protéines (voir Ullmann: Encyklopedie der Chemischen Technology, 18, 214, 1967) Si les cellules sont rompues en présence d'ions cyanure, sulfite ou nitrite, les coenzymes sont converties en cyano-, 15 sulfito ou nitrito-corrinoldes correspondants, alors qu'en l'absence des ions précités, on obtient des hydroxycorrinoldes Il est bien connu que la stabilité des complexes corrinoldes est différente Les stabilités diminuent dans l'ordre suivant: cyano-, sulfito-, nitrito et hydroxy-corrinoldes Etant donné que les hydroxycorrinoldes sont extrêmement instables, dans les procédés connus Jusqu'à présent, on les convertissait en cyano ou sulfitocorrino Ides plus stables au cours du premier stade du traitement On préparait en général les cyanocorrinoldes stables en rompant les cellules des microorganismes

en présence d'ions cyanure.

Les procédés connus pour la rupture des cellules la libération des corrinoldes à partir de la forme liée 5 à des protéines et leur conversion en cyanocorrinoldes correspondants sont résumés, par exemple, dans les monographies suivantes: E I Smith: Vitamin B 12 Ed Methuen's, 15, 26-28 ( 1965); Pawelkiewicz: Vitamin B 12 und Intrinsic Factor, Enke Verlag Stuttgart, 10 280 ( 1962); W Friedrich: Vitamin B 12 und verwandte Corrinoide (R Ammon: Fermente, Hormone, Vitamine III/2)

-13, G Thieme Verlag, Stuttgart ( 1975).

Etant donné qu'on doit préparer des cyanocorrinoldes comme produit final, en raison des volumes importants impliqués et de la présence d'impuretés qui peuvent également réagir avec les ions cyanure, on doitipendant la préparation industrielle des cyanocorrinoldes utiliser les ions cyanure en un excès multiple par rapport aux hydroxycorrinoldes pour obtenir le produit final

désiré Ceci pose des problèmes de sécurité et d'environnement.

Selon le brevet hongrois 171339, pendant la rupture des cellules et la libération des corrinoldes à partir des liaisons avec les protéines, on utilise l'ion cyanure 25 en un excès molaire de 100 à 600 fois, de préférence, 200 A 400 fois par rapport à la teneur en vitamine B 12 du bouillon de fermentation On traite ce bouillon de fermentation avec les ions cyanure pendant 10 à 300, de

préférence,20 à 120 minutes.

Selon le brevet US 2 530 416, on traite le bouillon de fermentation obtenu par culture des microorganismes produisant la vitamine B 12 ou un concentré obtenu de celui-ci avec un composé capable de fournir des ions cyanure, par exemple, un sel cyanhydrique capable d'une

dissociation ionique.

Dans le procédé décrit dans le brevet français 2.809 842, on rompt les cellules de Propionibacterium en présence de 5 % de métabisulfite de sodium à une température de 60 à 70 O C On purifie d'abord les sulfitocorrinoldes obtenus par extraction avec un solvant et 15 ensuite on traite pour la teneur en vitamine B 12 à 600 C pendant 15 minutes pour obtenir ainsi les cyanocorrinoldes désirés Le produit obtenu après cristallisation dans

l'acétone contient 10 ppm d'ions cyanure libres.

Un inconvénient commun aux procédés connus est qu'ils 20 exigent une quantité extrêmement élevée d'ions cyanure quand on les emploie à l'échelle industrielle En conséquence, pour une réalisation industrielle, on doit résoudre des problèmes difficiles de sécurité et de protection de l'environnement Un autre inconvénient est que le produit 25 brut contient des ions cyanure libres Ce n'est pas un problème si l'on prépare des corrinoldes cristallins puisque cette impureté peut être éliminée des corrino Ides pendant les stades de purification Toutefois, si on doit utiliser le produit brut comme additif au fourrage, on doit maintenir la concentration en ions cyanure libres

au-dessous d'une certaine limite.

Par le procédé selon l'invention, on prépare les

cyanocorrinoldes stables sans les inconvénients cités.

Les principaux stades du procédé sont comme suit: On effectue la rupture des cellules des microorganismes et la libération des corrino Ides des liaisons avec des 10 protéines d'une façon connue, en présence ou en l'absence d'ions sulfite et/ou par traitement thermique, de sorte que les corrinoldes présents dans la solution sont adsorbes sur un adsorbant ou une résine échanqeuse de cations, facultativement après des stades connus de purification. 15 Par le stade d'adsorption, on stabilise les hydroxoou sulfito-corrinoldes On prépare ensuite des cyanocorrinoldes stables à partir des corrinoides adsorbés sur la surface de l'adsorbant ou la résine échangeuse d'ions en traitant l'adsorbant ou la résine avec un excès molaire de 1,1 à 2,0 d'ions cyanure ou de composés capables de fournir des ions cyanure (par exemple une cyanohydrine) Cette réaction est instantanée à la surface de l'adsorbant ou de la résine échangeuse de cations On peut éliminer l'excès qui n'a pas réagi des ions cyanure 25 par lavage de l'adsorbant ou de la résine échangeuse de cations, si bien que les cyanocorrinoldes éliminés de l'adsorbant ou de la résine échangeuse sont exempts d'ions

cyanure libres.

L'invention concerne un procédé nouveau de conversion de corrinoldes produits par des microorganismes en, ayanocorrinoldes, selon lequel on met en contact un bouillon de fermentation obtenu par rupture des cellules d'une façon connue, de préférence par traitement thermique: en présence ou en l'absence diaons sulfite (facultativement après des stades connus de purifiúcation) avec un adsorbant convenable ou une résine écha; gusea d'ions, puis on traite les corrinoldes adsorbés sur la su-rftace de l'adsorbant ou 10 de la résine avec une solution aqueuse contenant des ions cyanure ou un composé capable de fournir des ions cyanure en une quantité qui fournit les ions cyanure dans un excès molaire de 1,1 à 2,0 par rapport aux corrinoldes On lave ensuite l'adsorbant ou la résine échangeuse avec de

l'eau et on 6 lue les cyanocorrinoldes formes par une technique connue, de preférence avec-de 1 'éthanol aqueux.

On peut utiliser avantageusement:le procédé de l'invention également pour le traitement d"o bouillons de fermentation qu'on obtient par rupture des cellules par un traitement thermique en l'absenct dti Lons sulfite Dams ce cas, les corrinoldes présents da>s le bouillon de fermentation non filtré sont directement adsorbés sur une résine macro-réticulaire d'adsorption utilisant des teckniques -'à lit fluidisi ou par simple mélange Etant donné qu'on peut exécuter ce stade en un temps extrment bref, les hydroxycorrinoldes ne sont pratiquement pas décomposés pendant cette période On convertit alors les eorrinoldes liés à l'adsorbant en cyanocorrinoides à l'aide d'une solution aqueuse diluée contenant des ions cyanure dans un excès molaire de 1,1 à 2,0 par rapport aux corrinoides adsorbés, de sorte que les ions cyanure qui n'ont pas réagi sont lavés par l'eau et les cyanocorrinoides sont élués-de l'adsorbant d'une façon connue. La soluttion obtenue contient la quantité totale des corrinoldes sous une forme de cyanure stable et elle est

pratiquement exempte d'ions cyanure.

Les principaux avantages de ce nouveau procédé sont comme suit: 1) La quantité d'ions cyanure nécessaire pour la réaction est inférieure de deux ordres de grandeur à celle

exigée par les procédés connus.

2) Le procédé convient particulièrement pour des réalisations industrielles économiques, étant donné que: on peut effectuer l'adsorption et la purification de l'ingrédient actif et sa conversion en cyanocorrinoides ainsi que l'élution par une opération continue avec un bon 20 rendement; il est inutile d'employer des procédés et des équipements coûteux pour l'élimination des ions cyanure; l'ordre des stades technologiques est en conformité avec les exigences de sécurité puisque le risque d'un dé25 gagement de gaz cyanhydrique est exclu du fait qu'on prépare

les cyanocorrinoldes à un p H neutre.

3) Le produit élué de l'adsorbant est pratiquement exempt d'ions cyanure libres Ceci est particulièrement important si l'on doit employer le produit comme additif

au fourrage sans autre purification.

4) Dans l'eau de rebut obtenue pendant la réalisation du procédé, qu'on décharge dans les égouts ou dans les eaux "vivantes", la concentration en ions cyanure est au dessous de la limite autorisée et on satisfait donc

aux exigences de la protection de l'environnement.

Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portées: Exemple 1 On règle à p H 4,0 avec de l'acide sulfurique 1 m 3 du bouillon de fermentation obtenu par fermentation (brevet

hongrois 159 356) avec une micropopulation mélangée produisant du méthane et contenant Corynebacterium sp.

( 24 A 1), Corynebacterium sp ( 244 C 1), Lactobacillus sp.

( 244 B C 1) et Propionibacterium sp ( 239 A 1/6), déposés dans la Collection Hongroise Nationale des Microorganismes 20 (OKI) sous les numéros 76, 77, 78 et 79 respectivement,

ayant un p H de 6,3 et contenant 50 g de corrinoldes.

On chauffe ensuite ce bouillon de fermentation à 100 o C et

on maintient à cette température pendant 10 minutes.

Pendant ce stade, les cellules sont rompues et les cor25 rinoldes libérés des cellules sont dissous dans le milieu

de fermentation La solution contient 24 g d'hydroxycobalamine et 23,5 g de corrinoides apparentés.

On fait passer le bouillon de fermentation à travers une colonne remplie avec 20 litres de DIAION HP 20 (Mitsubishi) qui est une résine macroréticulaire d'adsorption dans le sens ascendant, par la technologie en lit fluidisé Au cours de ce stade, les corrinoides dans le bouillon de fermentation sont adsorbés sur la résine Les débris des cellules et les impuretés organiques et minérales sont ensuite éliminés par passage d'eau à travers la colonne dans le même sens que pendant l'adsorption Ensuite, on 10 introduit dans la colonne de bas en haut 20 litres d'une solution aqueuse contenant au total 3,0 g de cyanure de potassium ( 1,25 équivalent) Après 10 minutes au repos, on décharge du mélange l'eau contenant le cyanure de potassium et on lave la colonne avec 100 litres d'eau On combine 15 la solution ayant servi au traitement du cyanure et

élbinée de la colonne avec la liqueur aqueuse de lavage.

Les 120 litres de solution qu'on obtient ainsi contiennent

0,15 mg d'ions cyanure libres par litre.

On élue les cyanocorrinoïdes à partir de la résine 20 d'adsorption avec 100 litres de méthanol et on fait continuellement couler vers le bas A partir de l'éluat méthanolique, on évapore le méthanol sous vide à une température ne dépassant pas 50 C La solution aqueuse contient 20,5 g de cyanocobalamine et 20,0 g d'autres 25 cyanocorrinoides Selon l'analyse par chromatographie liquide à haute pression, la concentration en hydroxycobalamine dans le produit est inférieure à 0,5 % On ne détecte même aucune trace d'ions cyanure libres Après séchage, on peut utiliser le produit comme additifs au fourrage.

Exemple 2

Comme matière de départ,on utilise 100 litres d'un bouillon de fermentation obtenu comme dans l'exemple 1 (en utilisant les mêmes microorganismes) contenant 5,0 g de corrinoldes Pour la rupture des cellules on ajoute au bouillon de fermentation 0,86 kg d'hydrogénophosphate 10 disodique dihydraté, 1,1 kg d'acide citrique et 1, 0 kg de métabisulfite de sodium, puis on conserve le bouillon dans un autoclave à 120 e C pendant 10 minutes Le mélange obtenu contient 2,3 g de sulfito-cobalamine et 2,42 g de sulfitocorrinoldes apparentés Après refroidissement, on fait remonter le mélange dans une colonne remplie de 3 litres de Ambertlite XAD 2 (Rohm and Haas) à titre de résine d'adsorption macroréticulaire Les sulfitocorrinoldes sont adsorbés sur la résine d'adsorption On élimine les traces du bouillon de fermentation provenant de la colon20 ne de résine avec de l'eau qu'on fait passer de bas en haut à travers la colonne Ensuite, on fait passer de haut en bas à travers la colonne 15 litres d'une solution aqueuse contenant 0,5 g de cyanure de potassium ( 2 équivalents) à un débit de 2 volumes de lit/heure En résultat, la couleur caractéristique rouge jaun&tre des sulfitocorrinoldes vire

à un pourpre vif qui est caractéristique des cyanocorrinoldes.

Après passage de la solution aqueuse de cyanure de potassium, on fait passer 45 litres d'eau de haut en bas à travers la colonne pour éliminer les ions cyanure La liqueur

qui sort est combinée avec la liqueur aqueuse de lavage.

La teneur en ions cyanure libres dans la liqueur combinée est de 0,12 mg/l On élue les corrinoldes de la colonne de résine avec 10 litres d'une solution aqueuse de méthanol de 80 % en volume On évapore l'éluat méthanolique sous vide pour éliminer le méthanol La solution aqueuse obtenue contient 1,92 g de cyanocobalamine et 2,01 g de 10 cyanocorrinoldes apparentés Par chromatographie liquide à haute pression on ne détecte aucun sulfito ou hydroxycorrinolde Le produit est également exempt d'ions cyanure libres.

Exemple 3

A partir de 100 litres d'un bouillon de fermentation obtenu par fermentation aseptique avec Propionibacterium sp Al/6 déposé à la Collection Nationale Hongroise de

Microorganismes (OKI) sous le n 239, on sépare les cellules contenant des corrinoldes La teneur en corrinoldes 20 dans la crème cellulaire (biomasse) obtenue est de 7,5 g.

A la biomasse on ajoute 20 litres d'eau, on règle son p H à 4,0 avec H Cl et on conserve le mélange à 12000 C pendant 10 minutes dans un autoclave Apres refroidissement, on élimine les débris cellulaires par séparation La solution 25 limpide obtenue contient 5,1 g d'hydroxycobalamine et 2,4 g d'autres corrinoldes On fait passer la solution à travers litres d'une résine échangeuse de cations Anterlite IC 50, qui est dans un cycle d'hydrogène On adsorbe les corrinoldes présents dans la solution sur la colonne On lave ensuite la colonne de résine avec 5 litres d'eau, puis on fait passer 40 litres d'eau contenant 400 mg de cyanure de sodium à travers la colonne à raison de 20 litres à

l'heure On lave ensuite la colonne avec de l'eau jusqu'à ce que la liqueur sortante soit exempte d'ions cyanure.

On recueille la liqueur de lavage contenant les ions cyanure; la teneur en ions cyanure libres est de 0,19 mg 10 par litre A partir de la colonne échangeuse de cations, on élue les cyanocorrinoides d'une façon connue avec une solution aqueuse à 80 % en volume d'acétone On

évapore sous vide l'acétone de l'éluat La solution aqueuse obtenue contient 3,8 g de cyanocobalamine et 1,7 g d'autres 15 cyanocorrinoldes Par chromatographie liquide à haute pression on ne détecte aucune hydroxycobalamine dans lasolution.

A partir de la solution, on peut préparer de façon connue une cyanocobalamine cristalline, par exemple par extraction avec un mélange 1:6 de phénol et de chloroforme, la dis20 solution de l'ingrédient actif dans l'eau et le traitement

par l'acétone.

Exemple 4

On procède comme dans l'exemple 3 sauf que de lasolution obtenue après rupture et séparation des cellules, onadsorbe 25 les corrinoldes sur une montmorrillonite correspondant d 2 % en poids, après réglage du p H à 3,5 Une fois l'adsorption terminée, on élimine l'argile d'adsorption par filtration et on lave jusqu'à neutralité avec de l'eau On agite l'adsorbant avec 10 litres d'une solution aqueuse 40 mg/l 5 de cyanure de sodium pendant 30 minutes, on filtre et on lave l'adsorbant qui reste sur le filtre avec 20 litres d'eau On élue les corrinoldes de l'adsorbant avec une solution aqueuse à 60 % en volume d'éthanol On élimine l'éthano 1 de l'éluat par évaporation sous vide La solution 10 aqueuse obtenue contient 3,5 g de cyanocobalamine et 1,6 g

d'autres cyanocorrinoldes.

Claims (2)

REVENDICATIONS

1 Procédé de conversion de corrinoldes produits par des microorganismes en cyanocorrinoldes par une réaction avec des cyanures, caractérisé en ce qu'on met en contact un bouillon de fermentation obtenu par rupture 5 des cellules de microroganismes d'une façon connue, de préférence,par traitement thermique en présence ou en l'absence d'ions sulfite, facultativement après des stades connus de purification, avec un adsorbant convenable ou une résine échangeuse d'ions; on traite les corrinoldes ad10 sorbées à la surface de l'adsorbant ou de la résine avec une solution aqueuse contenant des ions cyanure ou un composé capable de fournir des ions cyanure, en une quantité procurant les ions cyanure avec un excès molaire de 1,1 à 2,0 par rapport aux corrinoldes; on lave l'asorbant ou la résine échangeuse avec de l'eau; et on élue les cyanocorrinoldes obtenus d'une façon connue, de

préférence avec de l'éthanol aqueux.

2 Procédé selon la revendication 1,pour le traitement des bouillons de fermentation obtenus par traitement thermique des cellules de microorganismes, caractérisé en ce qu'on traite le bouillon de fermentation non filtré obtenu après rupture par traitement thermique, avec une résine macroréticulaire d'adsorption, de préférence par technologie en lit fluidisé; on met en contact la résine 25 contenant les corrinoldes adsorbés avec une solution aqueuse renfermant des ions cyanure en un excès molaire

de 1,1 à 2,0 par rapport aux corrinoldes et on procède ensuite comme dans la revendication 1.