<EMI ID=1.1> <EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
<EMI ID=4.1>
atome de carbone, ou bien R est le reste d'un nucléoside ou d'un alcool de sucre, ou peut encore représenter un groupe inorganique, tel qu'un anion hydroxyle ou sulfite.
<EMI ID=5.1>
glucoside d'une base hétérocyclique, ce terme englobant à la fois les glucosides naturels (comme l'adénosine, la cytidine, l'inosine, la guanosine ou l'uridine et leurs dérivés désoxy) et les glucosides synthétiques formés au départ de sucres naturels ou synthétiques (par exemple les hexoses, les pentoses ou leurs dérivés désoxy) , ainsi que les bases hétérocycliques naturelles ou synthétiques. L'expression "reste d'un nucléoside" désigne un groupe nucléoside attaché à l'atome de cobalt par une liaison carbone-cobalt. Les bases hétérocycliques peuvent être des bases naturelles ou synthétiques, comme la pyridine, la quinoléine, l'isoquinoléine, le benzimidazole, l'azapurine, l'azapyrimidine, etc.
Les groupes réactifs des nucléosides, sauf pour ce qui concerne le groupe attaché à l'atome de carbone destiné à être lié à l'atome de cobalt de la molécule de cobamide, doivent être protégés durant la réaction. A cet effet, on peut utiliser des groupes protecteurs traditionnels, qui sont séparés après la réaction par des méthodes connues en soi.
Le reste d'un alcool de sucre peut être, par exemple, <EMI ID=6.1>
La plupart des composés répondant à la formule générale
(I) présentée par la suite sont connus pour des propriétés pharma.cologiques intéressantes, telles que les effets de la vitamine
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enzymatiques remarquables.
On connaît de nombreux procédés pour la préparation de
<EMI ID=8.1>
Suivant le procédé décrit dans le brevet britannique n[deg.] 963.373 et dans le brevet allemand 1.213.842, on prépare des
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ou arylsuifonyle, de manier qu'un cobamide comportant un anion, en particulier un groupe cyano, ou une molécule d'eau attachée à l'atome de cobalt soit réduit et que le dérivé résultant, dans lequel l'atome de cobalt originellement trivalent a été réduit à un cobalt monovalent, soit condensé avec un agent approprié d.'alkylation, d'acylation ou de sulfonylation. Lorsqu'on utilise de
<EMI ID=10.1>
'est d'abord purifiée en la faisant passer à travers une colonne échangeuse d'ions. Le cobamide non converti se reconvertit en hydroxycobalamine durant la réaction, cet bydroxycobalamine apparaissant comme impureté dans le produit. Lorsqu'on utilise de la cyanocobalamine comme substance de départ, une partie des groupes cyanure qui se séparent au cours de la phase de réduction quitte le système, tandis qu'une partie de ces groupes est liée <EMI ID=11.1>
acide, le cyanure tend à se libérer lentement et il reconvertit
<EMI ID=12.1>
lamine comme impuretés. Celles-ci sont difficiles à séparer car
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produit. La cyanocobalamine est difficile à séparer par une chromatographie sur colonne car elle traverse pratiquement toute la colonne avec le produit final. Au cours de la réaction, d'au-
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comme intermédiaires, que. l'on doit également séparer..
<EMI ID=15.1>
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cobamides obtenus par réduction de la cyanocobalamine. Suivant ce brevet, on applique à cet effet divers sels de métaux qui oc
<EMI ID=17.1>
la suite de l'utilisation de borohydrur� de sodium comme agent
<EMI ID=18.1>
cyanure libères en complexes. Ce procédé présente le désavantage que la réaction se développe lentement, de sorte que la quantité
<EMI ID=19.1>
<EMI ID=20.1>
ble avec l'hydrox ocobalamine, ce qui diminue ainsi le rendement. De plus, du cyanure peut se libérer lors de l'acidification de la solution alcaline, de sorte que le produit brut doit être purifié par chromatographie.
<EMI ID=21.1>
thylcobalamine, qui est une substance intéressante du point de vu <EMI ID=22.1>
Suivant le procédé décrit dans le brevet belge
n[deg.] 773.144, on procède de manière que l'hydroxocobalamine soit réduite avec du chlorure stanneux dans une atmosphère .d'azcte sous une forte illumination, le cobamide réduit étant ensuite soumis à
<EMI ID=23.1>
groupes de méthyle du squelette de corrine se séparent par un mécanisme radicalaire sous l'effet d'une forte lumière et que les produits de cette réaction secondaire souillent le produit final.
Suivant la demande de brevet japonais publiée
<EMI ID=24.1>
de semicarbazide et le produit résultant est soumis à chromatographie sur une série de colonnes échangeuses d'ions ayant des propriétés variables.
<EMI ID=25.1>
n[deg.] 2.255.203 et dans le brevet belge n[deg.] 817.937, de l'hydroxoco-
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1>
matographie. Ce procédé exige d'importantes colonnes échangeuses
<EMI ID=29.1>
Comme on l'a décrit dans la demande de brevet japonais publiée 72/34720, . on a obtenu des alkyl cobalamines avec des rendements nettement meilleurs en ajoutant un réactif de Grignard à
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le produit résultant par une chromatographie sur colonne.
Suivant le procédé décrit dans le brevet hongrois
<EMI ID=31.1> <EMI ID=32.1>
duit de cette méthylation sélective, réalisée en une seule étape, contient toutefois aussi certains produits de décomposition qui se
<EMI ID=33.1>
en présence de grandes quantités d'iode ou durant l'évaporation du mélange jusqu'à siccité. La nature du réactif appliqué dans le procédé limite le nombre des dérivés que l'on peut obtenir. De plus, les difficultés qui s'élèvent au cours de la préparation du réactif rendent difficile une production à grande échelle.
La présente invention concerne l'élaboration d'un nou-
<EMI ID=34.1>
cile à mettre en oeuvre même sous des conditions à grande échelle.
L' invention est basée sur le fait reconnu que, lorsqu'un
<EMI ID=35.1>
valentes durant la phase de réduction, les effets néfastes de l' anion peuvent être éliminés, et la p-substitution de l'atome de cobalt, c'est-à-dire la formation de la liaison carbone-cobalt, peut se développer sans difficultés quelconques.
Sur la base de ce qui précède l'invention se rapporte
<EMI ID=36.1>
<EMI ID=37.1>
dans laquelle:
R se trouve dans la position {3 et représente un groupe
<EMI ID=38.1>
carbalcoxy attaché à l'atome de cobalt du noyau de corrinotde par l'intermédiaire d'un atome de carbone, ou bien R est le reste d'un nucléoside ou d'un alcool de sucre, ou bien encore peut représenter un groupe inorganique, tel qu'un anion hydroxyle ou sulfite,
<EMI ID=39.1>
formule générale (I) mais comportant un groupe X au lieu du substituant R, X représentant un anion attaché à l'atome de cobalt et différent de R, tel qu'un ion cyanure, cyanate, halogénuxe, hydroxyle, bisulfite, rhodanate, sulfite, rhodanide, nitrite ou am-
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kylation, d'hydroxyalkylation, de carboxyalkylation, d'aralkyla-
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d'un nucléoside, avec un dérivé d'alcool de sucre ou avec un sel minéral. Le procédé de l'invention se caractérise en ce que la
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moins un composé capable de lier le groupe X avec une liaison covalente. Ce composé lie, par addition, le groupe X se libérant durant la réaction et les impuretés d'aminés primaires éventuellement présentes, en les séparant ainsi du mélange de réaction. En conséquence, les matières de départ n'ayant pas réagi ou reconverties n'apparaissent pas comme impuretés dans le produit final, et il n'y a pas non plus de possibilité de formation d'antimêtabolites.
Tous les composés organiques capables de former un compo- <EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1>
C'est ainsi que, lorsque le groupe X est un groupe de cyanure ou un anion ayant un comportement semblable à celui du cyanure, tel qu'un ion cyanate, rhodanide, ou rhodanate, il peut être attaché à un aldéhyde aliphatique ou aromatique, à une cétone aliphatique ou aromatique, à un aldose ou à un cétose. Ces composés fcrment des cyanhydrines avec les groupes X mentionnés ci-dessus. Comme aldéhydes aliphatiques, on peut utiliser par exemple
<EMI ID=46.1>
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benzaldênyde.
Parmi les cétones aromatiques, les substances applica-
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parmi les cétones aliphatiques, on peut mentionner l'acétone ou
<EMI ID=49.1>
,Comme aldoses, on peut utiliser par exemple le D-ribose l'arabinose, le glucose, le mannose, le galactose, etc, tandis que comme cétoses, on peut utiliser notamment le fructose ou le sorbose.
Lorsque X désigne un anion sulfite ou bisulfite, celui. ci peut également être attaché à un aldéhyde sous la forme de bisulfite d'aldéhyde.
Lorsque X désigne un anion nitrite, celui-ci peut être attaché au phénol ou à un dérivé de phénol, formant un composé de nitrophênol avec l'anion nitrite. Parmi les dérivés de phénol, on peut mentionner le crésol et le thymol.
Comme on l'a déjà mentionné précédemment, le principal <EMI ID=50.1>
produit final relativement pur. Il se forme une petite quantité seulement d'impuretés qui peuvent être séparées sans application de phases chromatcgraphiques ou sans l'utilisation de colonnes échangeuses d'ion ou de colonnes de diéthylaminoéthyl- ou carboxyméthylcellulose préalablement désactivées. L'invention est mise plus complètement encore en évidence grâce aux exemples non limitatifs suivants.
Exemple 1
On introduit 5.0 g de cyanocobalamine cristalline dans un ballon à fond rond, à quatre cols rodés, d'une contenance de
500 ml, puis on y ajoute 100 ml d'eau distillée et 2 ml d'une so-
<EMI ID=51.1>
viduels du ballon, on adapte un entonnoir à robinet, un petit ballon en caoutchouc, ainsi qu'un raccord court et un long raccord, tous équipés d'un robinet.
Le mélange est agité par voie magnétique, le système est dégazé par dépression et ensuite rempli d'argon par le long raccord. Cette opération est répétée deux fois de plus, puis le court raccord est attaché à un laveur de gaz rempli d'eau distillée.
On ajoute ensuite au mélange par l'entonnoir à robinet une solution de 2 g de borohydrure de sodium dans 10 ml d'eau distillée. Il se produit une rapide formation de mousse et une rapide effervescence, puis le mélange cristallin rouge vire d'abord
<EMI ID=52.1>
tes les opérations sont réalisées sous une faible lumière diffuse.
Après 1 heure d'agitation, on ajoute au mélange exempt <EMI ID=53.1> veille à ce qu'il n'y ait pas d'entrée d'air dans le système. Or. agite le mélange pendant 15 minutes supplémentaires, puis on in-
<EMI ID=54.1>
de l'introduction de ce réactif, la solution de couleur bleu verdatre vire brusquement au rouge. Après 20 minutes d'agitation,
<EMI ID=55.1>
de méthyle au mélange afin de terminer la réaction.
Le mélange est agité pendant 20 minutes, puis on ajoute
12-15 ml- d'une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique, et ce
<EMI ID=56.1>
Lorsque le dégagement d'hydrogène cesse, le pE du mélange est vérifié et le contenu du ballon est amené dans un entonnoir à décantation. Le ballon est lavé à l'eau distillée et le liquide de lavage est également ajouté au mélange précédent.
On dissout 10 g de phénol cristallin dans la solution résultante, d'un volume d'environ 200 ml, puis on secoue le mélange avec 75, 50 et 25 ml d'un mélange de phénol et de chloroforme
(rapport de 1/1 en volume/volume). Les phases organiques sont combinées, lavées avec un volume égal d'eau distillée, puis les phases sont séparées l'une de l'autre.
On ajoute à la phase organique 150 ml d'acétone, 60 ml d'eau distillée et 500 ml de chloroforme, la phase organique est séparée à nouveau, et on là lave avec 25 ml d'eau distillée.
Les phases aqueuses sort combinées, mélangées avec 10 ml d'acétone, puis on laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant la nuit pour la cristallisation.
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
<EMI ID=60.1>
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<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
ment activée, lavée jusqu'à ce qu'elle soit:neutre, et on agite le mélange pendant 15-20 minutes. Le mélange encore chaud (environ
<EMI ID=64.1>
un vide de pompe à injection. La cellulose restant sur le filtre
<EMI ID=65.1>
20% en volume d'éthanol, jusqu'à obtention d'un liquide de lavage incolore. On ajoute au filtrat de la carboxyméthylcellulose
<EMI ID=66.1>
mélange est traité de la. façon décrite précédemment et le filtrat
<EMI ID=67.1>
300 ml dans un évaporateur rotatif à une température ne dépassant
<EMI ID=68.1>
nuit pour réaliser la cristallisation. Les cristaux séparés sont enlevés par filtration à travers un filtre en verre fritte, puis
<EMI ID=69.1>
<EMI ID=70.1>
<EMI ID=71.1>
cristalline. Par évaporation de la liqueur-mère, 4,12 g supplémentaires du produit final cristallin sont obtenus. La teneur du produit final'on agent actif est de 99,4% (sur la hase d'une
<EMI ID=72.1> <EMI ID=73.1>
sont les suivantes: cyanocobalamine: 0%; impuretés acides: 0,3%;
<EMI ID=74.1>
un rendement de 98,6%.
Exemple 2
On introduit 5,0 g de cyanocobalamine cristalline dans un ballon à fond rond, à quatre cols rodés, d'une contenance de
<EMI ID=75.1>
distiLlêe (rapport de 1/1 en volume/volume) et 2 ml d'une solution aqueuse à 40% de formaldéhyde. La réduction est réalisée de la façon décrite dans l'Exemple 1, par introduction d'abord d'une so-
<EMI ID=76.1>
et ensuite d'une solution d'une quantité supplémentaire de 0,5 g de borohydrure dans 5 ml d'eau distillée.
<EMI ID=77.1>
de sodium, on agite le mélange pendant 15 minutes, puis on y ajoute un réactif préparé de la façon décrite ci-après.
<EMI ID=78.1>
chement préparée au départ de 2,5 g d'adénosine avec une teneur d'humidité inférieure à 0,1%, est évaporée dans un ballon à fond rond jusqu' à obtention d'une masse -résineuse. On ajoute à cette
<EMI ID=79.1>
chlorhydrique 0,3. N (mélange d'un rapport de 1/1 en volume/volume), puis on traite le mélange au reflux pendant 30 minutes. Le mélange est refroidi rapidement jusqu'à la température ambiante, neutralise à un pH de 7,2 à 8,2 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de so-
<EMI ID=80.1>
<EMI ID=81.1>
<EMI ID=82.1> vire brusquement au rouge lors de l'introduction du réactif. Ce mélange est agité pendant 15 minutessupplémentaires, puis acidifié jusqu'au pH de 6, 0 avec une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique,, et on évapore ensuite le méthanol sous vide à une
<EMI ID=83.1>
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
nisée, puis le produit.passe de nouveau en phase aqueuse. On ajoute de l'acétone de manière continue au mélange pour provoquer
<EMI ID=86.1>
dant la nuit. De cette manière, on obtient 5,4 g de la coenzyme
<EMI ID=87.1>
décrite dans l'Exemple 1 pour obtenir 5,10 g de la coenzyme cris-
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1> <EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
<EMI ID=95.1> <EMI ID=96.1>
<EMI ID=97.1>
volume) de méthanol et d'acide chlorhydrique aqueux 0,3 N soit
<EMI ID=98.1>
alcoolique étant ensuite réglé à 8,0 avec une solution aqueuse
<EMI ID=99.1>
<EMI ID=100.1>
sation, on obtient 5,06 g (86,8%) de la coenzyme facteur -111
<EMI ID=101.1>
Exemple 4
<EMI ID=102.1>
de la façon décrite dans, l'Exemple 1. Ensuite, on procède comme décrit dans cet Exécute 1 à la différence que l'on utilise 1 ml
de benzaldéhyde comme agent de liaison du cyanure et qu'on emploie,.
<EMI ID=103.1>
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
<EMI ID=108.1>
<EMI ID=109.1>
<EMI ID=110.1> solution de 1,5 g de nitrite de sodium dans 10 ml d'eau distillée.
Après 10 minutes d'agitation, le pH de la solution est ajusté à 5,5-6,0 avec une solution aqueuse à 20% d'acide acétique, puis on ajoute une solution de 4,5 g de chlorhydrate d'hydroxylamine et de 3,0 g de chlorure d'ammonium dans 30 ml d'eau distillée. Le mélange de réaction est agité occasionnellement. Après environ 2 heures, le mélange est extrait avec un mélange de phénol et de chloroforme pour séparer les sels, puis le produit est converti en hydroxocobalamine base et ensuite en formiate d'hydroxocobala-
<EMI ID=111.1>
4,8 g (94,0%) de formiate d'hydroxoccbalamine cristallin, exempt d'impuretés de cyanocobalamine et de nitritocobalamine.
Exemple 7
On ajoute 100 ml d'eau distillée et 6 ml de phénol liquéfié à 5,0 g de nitritocobalamine cristalline. Ensuite, on procède comme décrit dans l'Exemple 1 pour obtenir 4,7 g de méthylcobalamine cristalline. Le rendement s'élève à 96,1%.
Exemple 8
On procède comme décrit dans l'Exemple 1 à la différence
<EMI ID=112.1>
<EMI ID=113.1>
Exemple 9
On procède comme décrit dans l'Exemple 2 à la différence
<EMI ID=114.1>
<EMI ID=115.1>
<EMI ID=116.1>
E;::em�� 10
<EMI ID=117.1>
<EMI ID=118.1>
sodium en présence de 20 ml d'eau distillée et de 0,4 ml d'une solution aqueuse à 40% de. formaldéhyde pour obtenir de l'hydridocobalamine. La réaction se réalise de la façon décrite dans l'Exemple 1.
Ensuite, on ajoute au mélange de réaction, une solution
<EMI ID=119.1>
puis on ajuste le pH de ce mélange à 5,5-6,0 avec une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique. On soumet le mélange à une distillation sous vide sur une courte période de temps,, puis on le désalinise et on le concentre en utilisant un mélange de phénol et de chloroforme. Les traces des solvants organiques sont séparées de la solution aqueuse, et l'agent actif est lié sur une
<EMI ID=120.1>
duit est élue avec une solution à 2% de chlorure de sodium formée avec de l'eau distillée, le pH de l'agent d'élution étant ajusté à 8,0 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 2 N. L'effluent est acidifié au pH de 5,5 avec une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique, puis la solution est désalinisée et passée dans une colonne chargée de carboxyméthylcellulose. Cette colonne est lavée avec une solution d'acide acétique 0,05 molaire jusqu'à obtention d'un liquide de lavage incolore, puis le produit est élue avec une solution aqueuse d'acide acétique 0,8 molaire. L'éluat est concentré avec un mélange de phénol et de chloroforme, puis évaporé jusqu'à un volume final d'environ 20 ml. On ajoute 9-10 parties en volume d'acétone au concentré, et le mé- <EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
Exemple 11
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
didésoxy-D-mannitol de l'acide monocarboxylique de la vitamine Bï2'
Exemple 12
<EMI ID=126.1>
rence que l'on utilise, comme réactif, 0,5 g de p-chlorométhyl-
<EMI ID=127.1>
<EMI ID=128.1>
dérivé de p-chlorométhylbenzaldéhyde de l'acide monocarboxylique
<EMI ID=129.1>
Exemple 13
<EMI ID=130.1>
que l'on utilise comme substance de départ 50 ml d'une solution
<EMI ID=131.1>
lichrome). On obtient de la sorte 0,94 g de méthylcobalamine cristalline.
Exemple 14
On procède comme décrit dans l'Exemple 1, à la différen que l'on utilise comme substance de départ 50 ml d'une solution contenant 2,1 g de dicyanocobinamide, et qu'on utilise 0,5 g de g