FI77538C - Foerfarande foer bestaemning av laogdensitetslipoproteiner (ldl) i kroppsvaetskor och reagens foer utfoerande daerav. - Google Patents

Description

1 77538

Menetelmä pienen tiheyden omaavien lipoproteiinien (LDL) määräämiseksi ja sen suorittamisessa tarvittava reagenssi

Keksintö koskee menetelmää ja reagenssia pienen tiheyden omaavien lipoproteiinien (LDL) määräämistä varten.

LDL-fraktion (low density lipoproteine), jota kutsutaan myös β-lipoproteiinifraktioksi määrääminen on saavuttanut huomattavan merkityksen lipidiaineenvaihduntahäiriön erotus-diagnoosissa .

Hyperkolesterinemia ja hypertriglyseridemia edistävät ateros-kleroosin ja sydäninfarktin syntymistä. Kolesteriinin ja tri-glyseridien määrääminen seerumista kuuluvat sen vuoksi kaikkein useimmin suoritettuihin kokeisiin kliiniskemiallisessa rutiinilaboratoriossa.

Useat rasva-aineenvaihdunnan tutkimukset tulevat siihen lopputulokseen, että yksityisen henkilön koronaaririski saadaan paremmin selville, jos määrätään ei ainoastaan triglyseridi-ja kolesteriinipeilin muutos vaan saadaan selville niiden pohjalla olevat patologiset siirtymät lipoproteiinimallissa (Munch.med.Wschr. 121, (1979) 1639).

Tunnetut plasmalipoproteiinit sisältävät eri suuruisen määrän proteiinia (apolipoproteiinia), fosfolipidejä, kolesteriinia ja triglyseridejä. Ne voidaan jakaa erilaisen käyttäytymisensä perusteella (erilainen tiheys) analyyttisessä ultrasent-rifugissa ja erilaisen vaeltamisnopeutensa perusteella geeli-elektroforeesissa neljään eri luokkaan: kylomikronit pre-6-lipoproteiini= VLDL (very low density lipoproteiini) β-lipoproteiini = LDL (low density lipoproteiini) α-lipoproteiini = HDL (high density lipoproteiini) 2 77538

Lipoproteiinien vaikutustavan tutkimuksesta on käynyt ilmi, että LDL on lipoproteiineissa ratkaiseva aterogeeninen komponentti, jonka lisääntyessä veressä on olemassa suurempi riski koronaarisydäntaudin saamisesta. Tämän tilan varhainen tietäminen ja torjuminen on hyvin tärkeätä. Sen vuoksi on olemassa käyttökelpoisen menetelmän tarve, jolla voidaan suorittaa LDL-konsentraation kvantitatiivinen määritys seerumista ja plasmasta.

Tähän asti on LDL-kolesteriiniarvon määritykseen käytetty pääasiassa kolmea menetelmää, joissa on kuitenkin varjopuolia: 1. Ultrasentrifugoiminen Tämä menetelmä ei sovellu rutiinilaboratorioon, koska siihen tarvitaan erikoinen välineistö ja suoritus vaatii erittäin huolellista työskentelytekniikkaa ja hyvin paljon aikaa ultra-sentrifugin kanssa (työläs sentrifugoiminen) . Sen vuoksi tämä analyysimenetelmä on jäänyt tähän asti vain tutkivan lääketieteen laboratorioiden käyttöön.

2. Elektroforeettinen erottaminen ja siihen liittyvä lipo-proteiinijuovien näkyviin saaminen polyanionien saostamisen kautta ja samennusyksiköiden muuntaminen kolesteriiniarvoik-si.

Tämä menetelmä on kuitenkin aikaaviepä ja vaatii oman elektro-foreesilaitteen sekä densitometrin tulkitsemista varten (Lab.Med.l, (1977) 145).

3. LDL-kolesteriini-arvon määritys Friedewald-kaavan mukaan (Clin.Chem.lU5, (1972) 499).

LDL-kolesteriini-arvon laskemista varten Friedewald-kaavan mukaan on määrättävä kolme parametriä: näytteen kolesteriini-, HDL-kolesteriini- ja triglyseridiarvo. Menetelmä ei siis ole riittävän käyttökelpoinen. Sitä paitsi tämä ravintokaava pätee vain kylomikronivapaisiin näytteisiin ja näytteisiin, joiden triglyseridiarvot ovat alle 400 mg/dl.

77538 4. Saostusreaktiot

Menetelmä, jossa LDL saostetaan lektiinin avulla, on selostettu DE-OS 2 857 710:ssa. Tässä menetelmässä kuitenkin voidaan LDL-kolesteriinin arvo saada selville vasta sakan uudelleen liuottamisen jälkeen eli kolesteriiniarvojen erosta ennen ja jälkeen saostamisen. Tämä merkitsee huomattavaa haittaa.

Lipoproteiinien saostamismenetelmä, jossa LDL jää sakan päällä olevaan nesteeseen, on selostettu DE-OS 2 600 664:ssä. Menetelmä ei kuitenkaan ole rutiinimäärityksissä käytettäväksi riittävän käyttökelpoinen, koska lipoproteiinien saostami-seen tarvitaan kaksi työvaihetta (kahden eri aineen, poly-etyleeni-imiinin ja kationinvaihtajän lisääminen, johon liittyy välissä oleva inkubointivaihe).

Tämän vuoksi on olemassa yksinkertaisen menetelmän ja reagens-sin tarve, LDL-lipoproteiinien määritystä varten, joka olisi hyvin käyttökelpoinen ja erittäin varma.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti menetelmän avulla, jolla voidaan määrätä pienen tiheyden omaavat lipo-proteiinit (LDL) ruumiin nesteistä, ja menetelmä on tunnettu siitä, että tutkittavaan näytteeseen lisätään suuren tiheyden omaavien lipoproteiinien (HDL)-vasta-aineita, erotetaan muodostunut liukenematon sakka ja määrätään LDL tai jokin sen komponenteista sakan yläpuolella olevasta nesteestä.

Keksintö perustuu siihen yllättävään toteamiseen, että HDL vasta-aineiden avulla saostuvat kaikki LDL-määritystä häiritsevät lipoproteiinifraktiot, itse HDL:n ohella erikoisesti VLDL ja kylomikronit, mutta LDL:ä itseään ei saada saostamalla. Tämä on erikoisesti sen vuoksi yllättävää, koska sekä HDL että myös LDL, VLDL ja kylomikronit omaavat proteiiniosan, joka sisältää samat apolipoproteiinit, vaikkakin hyvin erilaisissa konsentraatioissa. Sen vuoksi ei voitu etukäteen tietää, että HDL:n vasta-aineet saostavat kvantitatiivisesti paitsi HDL:ää myös VLDL:n ja kylomikronit 4 77538 ilman että ne vaikuttaisivat tällöin LDL:ään.

VLDL:n ja kylomikronien saostumista voidaan jouduttaa lisäämällä vielä tunnettuja näiden aineiden saostusaineita.

Reagenssin yläpuolella olevaan nesteeseen jäävä LDL-fraktio voidaan sitten määrätä tavanmukaisten tässä yhteydessä käytettävien menetelmien avulla. Sen sisältämän sidotun kolesterii-nin määritys tapahtuu etupäässä tunnettuja menetelmiä käyttäen. Siten voidaan määritys suorittaa esimerkiksi saippuoimalla alkoholia sisältävän kalilipeän avulla ja kemiallinen määritys Liebermann-Buchard'in mukaan. Parhaana pidetty on kuitenkin entsymaattinen määritys käyttäen kolesteriini-oksidaasia ja kolesteriiniesteriä hajottavaa entsyymiä tai entsyymisysteemiä kuten erikoisesti kolesteriiniesteraasia. Jälkimmäistä menetelmää käytettäessä voidaan määrätä kulutettu happi, muodostunut kolestenoni tai mieluimmin muodostunut ^02 ammattimiehen tuntemien menetelmien mukaan. Koska ammattimiehelle on sidotun kolesteriinin määritys tuttua, ei tässä yhteydessä ole tarpeen puuttua siihen lähemmin. Huomattakoon kuitenkin, että keksinnön mukaisen menetelmän piirissä estetään samentumien esiintyminen poistamalla VLDL- ja kylomikronifraktiot, mitkä voisivat häiritä kolestenonin tai H202:n optista mittaamista värireaktioiden muodossa. Menetelmä soveltuu sen vuoksi erikoisesti kolorimetrisen kolesterii-nimääritysmenetelmän yhteydessä.

On kuitenkin mahdollista määrätä LDL-fraktion sisältämän kolesteriinin tai muiden LDL-komponenttien kuten apolipoproteii-nin B, fosfolipidien ja triglyseridien asemesta itse LDL-fraktio, jolloin voidaan samaten käyttää ennestään tunnettuja menetelmiä. Mainittakoon esimerkiksi nefelometrinen määritys tai DE-OS 3 007 764:ssä selostettu turbidimetrinen määritys.

HDL vasta-aineita käytetään keksinnön piirissä joko HDL-anti-seerumin muodossa, HDL-antiseerumin muodossa, josta on rasva poistettu, tai puhdistettujen HDL-vasta-ainefraktioiden muo- 5 77538 dossa. On myös mahdollista käyttää HDL vasta-ainefragment-teja, esimerkiksi Fab, Fab2 ja Fab'-fragmentteja. Samoin on mahdollista käyttää HDL:n apolipoproteiinien A, C ja/tai E vasta-aineita tai niiden fragmentteja. Lopuksi voidaan käyttää myös monoklonaaleja HDL-vasta-aineita.

Keksinnön mukaisesti käytettyjen vasta-aineiden valmistaminen tapahtuu käyttämällä puhdasta HDLräätai jotakin mainituista apolipoproteiineista immunogeeninä. Vasta-aineen valmistamista varten voidaan mainita tavanmukaisesta käytetyt eläinlajit. Parhaina pidetään lammasta ja kaniinia. Mutta paitsi jo mainittuja eläimiä tai verrattavia eliöitä voidaan vasta-aineen valmistuksessa käyttää myös soluviljelyjä.

HDL-vasta-aineita lisättäessä muodostuneet immuuniaggregaa-tit voidaan erottaa samaten tavanmukaisten menetelmien avulla. Kun käytetään liukoisia HDL-vasta-aineita, tapahtuu erottaminen tarkoituksen mukaisesti sentrifugoimalla. Kun käytetään immobilisoituja, kantajaan sidottuja HDL-vasta-aineita, voidaan immuuniaggregaatit erottaa yksinkertaisesti erottamalla nestefaasi kompaktista kiinteästä faasista, esimerkiksi vasta-aineilla päällystetystä kiinteästä aineesta. Jos käytetään apolipoproteiinia immunogeeninä käyttämällä saatua vasta-ainetta, on se etupäässä sellaista, jossa immunogeeninä käytetyssä apolipoproteiinissa on lipidipäällys. Tämä saadaan aikaan esimerkiksi siten, että sen jälkeen kun on apoli-poproteiinit tavanmukaisesti delipidoitu ja sen jälkeen fraktioitu, valittu apolipoproteiinin A-, C- tai/ja E-fraktio lipidoidaan uudelleen. Immunogeeninä käytetään kuitenkin mieluimmin puhdistettua täydellistä HDL-fraktiota. Puhdistus tapahtuu tarkoituksen mukaisesti ennestään tunnetulla tavalla eristämällä ultrasentrifugissa. Lisäksi voidaan suorittaa tarvittaessa vielä yksi puhdistus esimerkiksi immo-bilisoidun Concavalin A:n avulla affiniteettikromatografis-ten tai elektroforeesimenetelmien mukaan. Ammattimies tuntee nämä menetelmät, eikä niitä ole tarpeen tässä yhteydessä selostaa lähemmin.

6 77538

Keksinnön kohteena on vielä reagenssi, jonka avulla voidaan määrittää LDL-fraktio ruumiin nesteistä, tunnettu siitä, että se sisältää HDL-vasta-aineita. Parhaana pidetyssä toteutusmuodossa keksinnön mukainen reagenssi sisältää jo mainittujen HDL-vasta-aineiden tai edellä keksinnön selostuksen yhteydessä lähemmin kuvattujen fragmenttien tai vasta-aineiden tai HDL-komponenttien fragmenttien ohella vielä kolesteriinin määritykseen käytettävää reagenssia.

Parhaana pidetty, edellä mainitun laatuinen reagenssi sisältää kolesteriinioksidaasia, kolesteriiniesteriä hajottavaa entsyymiä tai entsyymisysteemiä, määritykseen tarkoi tettua systeemiä ja pinta-aktiivista ainetta.

Erään erikoisen hyvänä pidetyn suoritusmuodon mukaisesti sisältää edellä mainittu reagenssi pääasiallisesti HDL-vasta-aineita, kolesteriinioksidaasia, kolesteriiniesteraasia, peroksidaasia, 3,4-dikloorifenolia, fenolia, 4-aminofenatso-nia, ei-ionista pinta-aktiivista ainetta, magnesiumaspartaat-tia ja puskuriainetta pH-arvoa 7- 8,5 varten.

Keksinnön mukainen reagenssi sisältää vasta-aineita tarkoi- -7 -3 tuksenmukaisesti konsentraatioalueella 10 - 10 mol/litra

(tai kiloa kohti kiinteitä aineita) laskettuna määräysliuok-sesta. Vasta-aine voi olla kiinteässä muodossa, etupäässä lyofilisoituna, tai liuoksen muodossa. Liuottimina voidaap käyttää vettä, fysiologista keittosuolaliuosta, seerumiväli-ainetta, puskuriainetta kuten esimerkiksi 0,01 - 0,5 m tris-puskuria, pH 7-8,5 tai 0,005 - 0,1 m fosfaattipuskuria, pH

6,5 - 8,5, johon tarvittaessa voidaan lisätä esimerkiksi keittosuolaa fysiologisten keittosuolaliuosten suuruusluokkaa oleva määrä. Jos vasta-aine käytetään immobilisoidussa muodossa, ovat sopivia kantaja-aineita esimerkiksi polysakkaridit kuten selluloosa, dekstraani, tärkkelys ja sen johdannaiset, silikaatit, polyamidit, kollageeni, lateksi, alumiini-oksidi, naudanseerumialbumiini ja muut sen kaltaiset kantaja-aineet. Vasta-aine voi olla myös testiastioiden, kuten muovi-reagenssilasien pinnalle sitoutuneena.

7 77538

Reagenssi voi sisältää myös tunnettuja saostusaineita VLDLrää ja kolymikroneja varten.

Keksinnön mukaisen menetelmän eräs oleellinen etu on siinä, että yhden ainoan reagenssin lisäyksen jälkeen voidaan näytteestä poistaa lipoproteiinilajit -'paitsi LDL :ää - ja diag-nostisesti tärkeä LDL-pitoisuus tai LDL-fraktion kolesterii-nipitoisuus voidaan ilman näytteen lisäkäsittelyjä mitata suoraan. Edullista on myöskin se, että näytteestä poistetaan samennuksia aiheuttavat triglyseridirikkaat lipoproteiinilajit, niin että LDL-tai kolesteriinimääritystä varten on käytettävissä kirkas näyte.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä erään parhaana pidetyn toteutusmuodon perusteella.

Esimerkki 1 A) Puhdistetun HDL:n valmistaminen

Kun VLDL ja LDL on erotettu ultrasentrifugissa, eristetään tarkasti HDL-fraktio (d 1,080 - 1,210) ultrasentrifugissa, kuten on selostettu julkaisussa: V.P. Skipski: Lipid composition of lipoproteins in normal and diseased states in Blood Lipids and Lipoproteins; Quantitation, Composition and Metabolism. Julkaisija: Nelson, Wiley, New York 1972, 471-583. Fraktio sedimentoidaan tai vaahdotetaan tämän jälkeen vielä kahdesti tiheyksillä 1,080 ja 1,210.

HDL-fraktio puhdistetaan immobilisoidun Concanavalin A:n avulla (1974) Febs Lett. 9J_, 174-198) af f initeettikromatograa-fisesti tai Geon-Pevicon-Block-elektroforeesin avulla R.W. Mahley'n ja K.S.Holcombe'n mukaan (1977) J.Lipid.Res. 18, 314-324, elektroforeettisesti.

B) Antiseerumin valmistaminen

Eläinlajit: lammas tai kaniini Käytetään kohdassa A saatua immunogeeniä ja noudatetaan seuraavaa immunoimiskaavaa: 8 77538 Päivä Antotapa Immunogeenimäärä 0 intradermaalisesti 1 mg proteiinia (HDL) emulgoituna Freundin apuaineeseen 7 intramuskulaarisesti " 14 subkutaanisesti " 30 intramuskulaarisesti !' 60 subkutaanisesti " edelleen joka subkutaanisesti " 30. päivä

Ensimmäinen näyteveren otto tapahtuu 45 päivän jälkeen.

C) 50 ^ul seerumia sekoitetaan 150 yUl:n kanssa kohdassa B) valmistettua antiseerumia. Inkuboidaan 30 min huoneenlämmössä ja muodostunut sakka sentrifugoidaan pois (2 min 10.000 g).

50 ^,ul:aan kirkasta sakan päällä olevaa nestettä lisätään 2 ml reagenssia, joka sisältää 0,1 mol/1 tris-puskuria, pH = 7,7; 0,05 mol/1 magnesiumaspartaattia; 1 mmol/1 4-aminofe-natsonia, 6 mmol/1 fenolia, 4 mmol/1 3,4-dikloorifenolia, 0,3 % rasva-alkoholipolyglykolieetteriä, 400 U/l kolesterii-niesteraasia, 250 U/l kolesteriinioksidaasia ja 200 U/l peroksidaasia.

20 min inkubointiajän jälkeen huoneenlämmössä mitataan näytteen ekstinktio reagenssien tyhjäarvolla (regenssien tyhjä-arvo sisältää 50 ^,ul antiseerumia ja ottaa huomioon antiseerumin kolesteriinipitoisuuden).

Λ E: δΕ .. , -δΕ . , , ...

näyte reagenssien tyhjaarvo

LDL-kolesteriini (mg/dl) =1.385x/2kE

9 77538

Seerumi Ulkonäkö Kolesteriini Triglyseridit LDL-kolesteriinl NIH-mene- Iimnunolo-telmä * ginen saostus 1 samea 353 mg/dl 503 mg/dl 234 mg/dl 238 mg/dl 2 kirkas 638 mg/dl 591 mg/dl 510 mg/dl 495 mg/dl 3 kirkas 350 mg/dl 153 mg/dl 237 mg/dl 231 mg/dl 4 samea 195 mg/dl 575 mg/dl 102 mg/dl 95 mg/dl 5 sisältää kylcmikro- 231 mg/dl 379 mg/dl 149 mg/dl 130 mg/dl ne ja *Vertailumenetelmänä käytetään NIH-menetelmää (kun VLDL ja kylomikronit on erotettu ultrasentrifugissa, saostetaan LDL. Kolesteriiniarvojen erotuksesta ennen ja jälkeen saostuksen saadaan LDL-kolesteriinin arvo).

Manual of Laboratory Operations, Lipid Research Clinics Program, Lipid and Lipoprotein Analysis, DREW Publication N:o 65-628.

Esimerkki 2

Liuos, jossa on 50 ^ul kutakin seuraavista: VLDL, HDL, LDL tai kylomikroneja, sekoitettiin 150 ^,ul:n kanssa kaniinin antiseerumia, jota oli tuotettu HDL:n avulla immunogeeninä. Sentrifugoitiin ja kolesteriinipitoisuus määrättiin kuten esimerkissä 1 on selostettu päällä olevasta nesteestä.

Näyte Näytteen kolesteriinipitoisuus

Ennen saostamista Saostamisen jälkeen Kylomikroneja 61,4 mg/dl 2,6 mg/dl VLDL 23,2 mg/dl 2,8 mg/dl LDL 177,0 mg/dl 165,0 mg/dl HDL 50,9 mg/dl 0,0 mg/dl

Claims (10)

10 77538

1. Menetelmä, jonka avulla voidaan määrätä pienen tiheyden omaavat lipoproteiinit <LDL) ruumiin nesteistä, tunnettu siitä, että lisätään tutkittavaan näytteeseen suuren tiheyden omaavien lipoproteiinien (HDD-vasta-aineita, erotetaan muodostunut liukenematon osa ja määrätään yläpuolella olevasta nesteestä LDL tai jokin sen komponenteista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrätään LDL:n komponenteista kolesteroli.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään vasta-aineita HDL-antieeerumin, HDL-seerumin muodossa, josta on rasva poistettu tai puhdistettuna vasta-ainefraktiona.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään HDL-vasta-aineiden fragmentteja.

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään lampaasta tai kaniinista saatuja vasta-aineita.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä LDL-fraktion määrittämiseksi ruumiin nesteistä käytettävä rea-genssi, tunnettu siitä, että se sisältää HDL:n vasta-aineita .

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää reagenssia kolesterolin määritystä varten. Θ. Patenttivaatimuksen 7 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että kolesterolin määritykseen käytettävä reagenssi sisältää kolesteriinioksidaasia, koleeteriiniesteriä hajotta- il 77538 vaa entsyymiä tai enteyymisyeteemiä, systeemiä I^C^in määräämiseksi ja pinta-aktiivista ainetta.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se muodostuu pääasiallisesti HDL-vasta-aineesta, kolesteriiniokeidaasista, kolesteriinieeteraasista, peroksi-daasista, 3,4-dikloorifenolista, fenolista, 4-aminofenatso-nista, ei-ionisesta pinta-aktiivisesta aineesta, magnesium-aspartaatieta ja puskurista pH-arvoa 7-8,5 varten.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 7-9 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää HDL-vasta-aineet immobili-soidussa muodossa.