DK159840B - Reagens til bestemmelse af low density lipoproteiner (ldl) - Google Patents

Description

i

DK 159840 B

Opfindelsen angår et reagens til bestemmelse af Low Density lipoproteiner (LDL).

Bestemmelsen af LDL-fraktionen (Low Density lipoproteiner), der også betegnes som 3-lipoproteinfraktion, har fået væsent-5 lig betydning for den differentierede diagnose af en lipid-stofskifteforstyrrelse.

Hyperkolesterolæmi og hypertriglyceridæmi begunstiger fremkomsten af atherosclerose og hjerteinfarkt. Bestemmelsen af cholesterol og triglycerider i serum hører derfor til de 10 hyppigst gennemførte prøver i det klinisk-kemiske rutine-laboratorium·

Talrige undersøgelser af fedtstofskiftet fører til den konklusion, at den individuelle coronarrisiko bedre kan konstateres, når ikke blot forandringen i triglycerid- og 15 cholesterolspejlet bestemmes, men de grundlæggende patologiske forskydninger i lipoproteinmønstret konstateres (Munch, med. Wschr. 121, (1979) 1639).

De kendte plasmalipoproteiner indeholder en forskelligt høj mængde protein (dpolipoproteiner), phospholipider, 20 cholesterol og triglycerider. De kan på grund af deres opførsel (forskellige massefylde) i den analytiske ultra-centrifuge og på grund af deres forskellige vandringshastighed ved gel-elektroforesen opdeles i fire forskellige klasser: Chylomikroner, præ-β-lipoprotein = VLDL (Very 25 Low Density Lipoprotein), β-lipoprotein = LDL (Low Density

Lipoprotein), α-lipoprotein = HDL (High Density Lipoprotein).

Undersøgelsen af lipoproteinernes funktion førte til, at LDL er den afgørende atherogene komponent inden for lipo-proteinerne, ved hvis forøgelse i blodet der foreligger en 30 forøget risiko for en coronar hjertesygdom. Den tidlige 2

DK 159840 B

erkendelse og bekæmpelse af denne tilstand er af stor betydning. Der foreligger derfor et behov for en praktikabel fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af LDL-koncen-trationen i serum og plasma.

5 Hidtil blev der til bestemmelse af LDL-cholesterolmængden i det væsentlige benyttet tre metoder, der imidlertid er behæftet med ulemper: 1. Ultracentrifugering.

Denne fremgangsmåde er ikke egnet til et rutinelaboratorium, 10 da man hertil behøver en speciel apparatudrustning, og da gennemførelsen kræver en yderst omhyggelig arbejdsteknik og et meget stort tidsforbrug (flere dages centrifugering) i en ultracentrifuge. Således var denne analysemetode hidtil kun forbeholdt for forskningsmedicinens laboratorium.

15 2. Elektroforetisk separation med påfølgende visualisering af lipoproteinbåndene ved hjælp af polyanionfældning og omregning af uklarhedsenhederne til kolesterolmængder.

Denne fremgangsmåde er imidlertid tidsrøvende og kræver et selvstændigt elektroforeseapparatur samt et densitometer 20 til vurderingen (Lab. Med. 1, (1977) 145).

3. Bestemmelse af LDL-cholesterolmængden ved hjælp af F.riedewald-formlen (Clin. Chem. 18, (1972) 499) .

Til beregning af LDL-cholesterolmængden ifølge Friedewald-formlen er bestemmelse af 3 parametre nødvendig: Prøvens 25 cholesterol-, HDL-cholesterol- og triglyceridmængde. Metoden er derfor ikke tilstrækkelig praktikabel. Endvidere gælder denne næringsformel kun for chylomikronfri prøver og prøver med triglyceridmængder under 400 mg/dl.

3

DK 159840 B

4. Fældningsreaktioner.

En fremgangsmåde, ved hvilken LDL udfældes ved hjælp af en lectin, er beskrevet i tysk offentliggørelsesskrift nr.

5 28 57 710. Ved hjælp af denne metode kan imidlertid mængden af LDL-cholesterol først konstateres efter genopløsning af præcipitatet eller kun ved forskelsdannelse mellem chole-sterolmængderne før og efter udfældning. Dette frembyder en betydelig ulempe.

10

En udfældningsmetode for lipoproteiner, ved hvilken LDL forbliver i den ovenstående væske ved fældningen, beskrives 1 tysk patentskrift nr. 26 00 664. Denne metode er imidlertid ikke tilstrækkelig praktikabel til anvendelse som rutine- 15 bestemmelse, da der til udfældning af lipoproteinerne kræves 2 arbejdstrin (tilsætning af to forskellige reagenser -polyethylenimin og en kationbytter - i forbindelse med en mellemliggende inkubationsfase).

20 Fra fransk offentliggørelsesskriftet nr. 2.455.743 kendes en ELISA-metode til bestemmelse af serumapoproteinerne, ved hvilken en bestemt mængde af et mobiliseret specifikt anti-apopro-tein-anti stof omsættes med prøven og et 1ipoprotein-enzym-kon-jugat, og den bærerf ikserede enzymaktivitet måles efter fase-25 separation. Ved anvendelse af LDL-anti stoffer skal dermed også LDL kunne bestemmes. Denne metode er omstændelig, da den kræver bærerfiksering af antistofferne samt fremstilling af et enzymkonjugat og omfatter en faseseparation.

30 Der foreligger derfor et behov for et reagens med høj prakti-kabi1 itet og stor træfsikkerhed til bestemmelse af LDL-lipo-protein.

Reagenset ifølge opfindelsen til bestemmelse af LDL-fraktionen 35 i legemsvæsker er ejendommeligt ved et indhold af HDL-anti-stoffer, der er opnået med renset fuldstændig HDL-fraktion som immunogen, og et reagens til bestemmelse af cholesterol.

A

DK 159840 B

Et foretrukket reagens til bestemmelse af cholesterol indeholder cholesteroloxidase, et cholesterolesterspaltende enzym eller enzymsystem, et system til bestemmelse af H202 og et overfladeaktivt middel.

5

Ifølge en særlig foretrukken udførelsesform for det ovenfor nævnte reagens består dette i det væsentlige af HDL-anti-stoffer, cholesteroloxidase, cholesterolesterase, peroxidase, 3,4-dichlorphenol, phenol, 4-aminophenazon, en ikke-ionisk 10 detergent, magnesiumaspartat samt puffer, pH 7 til 8,5.

Reagenset ifølge opfindelsen indeholder hensigtsmæssigt -7 -3 antistofferne i koncentrationsområdet fra 10 til 10 mol/1 (eller kg fast stof), regnet i forhold til bestem-15 melsesopløsningen. Antistofferne kan foreligge i fast form, fortrinsvis lyofiliseret, eller i form af en opløsning.

Som opløsningsmidler kan eksempelvis anvendes vand, fysiologisk kogsaltopløsning, serummiljø, puffer, såsom eksempelvis 0,01 til 0,5 M trispuffer, pH 7 til 8,5, eller 0,005 2 0 til 0,1 M phosphatpuffer, pH 6,5 til 8,5, eventuelt med kogsalttilsætning af størrelsesordenen af fysiologiske kogsaltopløsninger. Hvis antistofferne anvendes i immobi- 1iseret form, er eksempler på egnede bærematerialer poly= saccharider, såsom cellulose, dextran, stivelse og derivater 25 deraf, silikater, polyamider, kollagen, latex, aluminiumoxid, kvægserumalbumin og lignende bærematerialer. Antistofferne kan også foreligge bundet til overfladen af prøvebeholdere, såsom kunststofreagensglas.

30

Reagenset kan endvidere indeholde kendte fældningsmidler for VLDL og chylomikroner.

Ved fremgangsmåden til bestemmelse af Low Density lipoprotei-ner (LDL) i legemsvæsker sætter man High-Density-1ipoprotein 35 (HDL)-antistoffer, der er opnået med renset fuldstændig HDL- fraktion som immunogen, til den til undersøgelse bestemte prøve, fraskiller dannet uopløseligt materiale og bestemmer LDL eller én af dets komponenter i den ovenstående væske 5

DK 159840 B

Opfindelsen beror på den overraskende konstatering, at med HDL-antistoffer udfældes samtlige 1ipoproteinfraktioner, der forstyrrer LDL-be’stemme 1 sen, foruden HOL selv især VLDL og chylomikronerne, medens LDL selv imidlertid ikke bliver omfat-5 tet af fældningen. Dette er navnlig overraskende, fordi såvel HDL som LDL, VLDL og chylomikroner har en proteinmængde, der indeholder de samme apolipoproteiner, omend i meget forskellige koncentrationer. Det kunne derfor ikke forudses, at antistoffer mod HDL ikke blot udfælder HDL kvantitativt, men også 10 VLDL og chylomikroner, uden derved at påvirke LDL.

Fældningen af VLDL og chylomikroner kan fremmes ved, at man yderligere anvender kendte fældningsmidler for disse stoffer.

15

Den i reagensets ovenstående væske forblivende LDL-fraktion kan derpå bestemmes i overensstemmelse med de herfor sædvanlige metoder. Fortrinsvis foregår bestemmelsen af den deri indeholdte bundne choleste.rol under anvendelse af de 20 hertil kendte metoder. Således kan bestemmelsen eksempelvis gennemføres ved hjælp af forsæbning med alkoholisk kalilud og kemisk bestemmelse ifølge Liebermann-Burchard. Fortrinsvis foretages imidlertid en enzymatisk bestemmelse under anvendelse af cholesteroloxidase og et cholesterolester-2 5 spaltende enzym eller enzymsystem, såsom navnlig cholesterol- esterase. Ved anvendelse af sidstnænvte metode kan forbrugt oxygen, dannet cholestenon eller mest foretrukket dannet H-2°2 kestenirnes i overensstemmelse med de af fagmanden hertil kendte metoder. Da bestemmelsen af den bundne chole-30 sterol kendes af fagmanden, er det ikke nødvendigt i den foreliggende sammenhæng at gå nærmere ind herpå. Det skal dog bemærkes, at ved fremgangsmåden, der gør brug af reagenset ifølge opfindelsen, forhindres forekomsten af uklarheder ved hjælp af fjernelse af VLDL- og .chylomikronfraktionerne, der 35 kunne genere en optisk måling af cholestenon eller H202 inden for farvereakt ionens rammer. Fremgangsmåden egner sig derfor i særlig grad i forbindelse med en kolorimetrisk cholesterol bestemmelsesmetode .

6

DK 159840 B

Det er imidlertid også muligt i stedet for den i LDL-frak-tionen indeholdte cholesterol eller andre LDL-komponenter, såsom apolipoprotein B,.phospholipider og triglycerider, at bestemme LDL-fraktionen selv, hvorved der ligeledes 5 kan anvendes i og for sig kendte metoder. Nævnes skal eksempelvis den nephelometriske bestemmelse eller den i tysk offentliggørelsesskrift nr. 30 07 764 beskrevne tur-bidimetriske bestemmelse.

10 HDL-antistofferne anvendes inden for opfindelsens rammer enten i form af et HDL-antiserum, som affedtet HDL-anti-serum eller i form af rensede HDL-antistoffrektioner. Det er også muligt at anvende HDL-antistoffragmenter, eksempelvis Fab, Fab 2 og Fab'-fragmenter.

15

Fremstillingen af de ifølge opfindelsen benyttede antistoffer sker med anvendelse af rent HDL som immunogen. Til antistofud-vindelsen kan fremhæves de sædvanligvis benyttede dyrearter.

Får og kaniner foretrækkes. Til antistofudvindelsen kan der i -20 midlertid ud over de allerede nævnte dyr eller tilsvarnede levende væsener også anvendes cellekulturer.

Fraskillelsen af de ved tilsætningen af HDL-antistofferne dannede immunaggregater kan ligeledes foregå ifølge sæd-25 vanlige metoder. Anvendes opløselige HDL-antistoffer, så foregår fraskillelsen hensigtsmæssigt ved hjælp af centrifugering. Anvendes immobiliserede, bærerbundne HDL-antistof fer, så kan immunaggregaterne separeres ved hjælp af simpel adskillelse af den flydende fase fra den kompakte 30 faste fase, eksempelvis et med antistoffer belagt fast legeme. Ifølge opfindelsen anvender man som immunogenrensede fuldstændige HDL-fraktioner. Rensningen sker hensigtsmæssigt på i og for sig kendt måde ved isolering i ultracentrifugen. Yderligere kan der eventuelt foretages en yderligere rensning 35' ved hjælp af eksempelvis immobi1 i seret Concavalin A ifølge affinitetskromatografiens eller elektroforesens metoder. Disse metoder kendes af fagmanden og behøver her ikke at blive beskrevet nærmere.

7

DK 159840 B

En væsentlig fordel ved anvendelse af reagenset ifølge opfindelsen består i, at 1 ipoproteinklassen - med undtagelse af LDL - efter tilsætning af· et enkelt reagens kan fjernes fra prøven, og at det diagnostisk betydningsfulde LDL-indhold eller 5 LDL-frektionens cholesterolindhold derefter uden yderligere prøveforbehandling kan gøres til genstand for en direkte måling. Fordelagtigt er det endvidere, at de triglycerid-rige lipoproteinklasser, der forårsager uklarheder i prøven, fjernes, så at en klar prøve står til rådighed for påfølgende 10 LDL- eller cholesterolbestemmelse.

De efterfølgende eksempler belyser opfindelsen i en fore-trukken udførelsesform.

15 Eksempel 1.

A) Fremstilling af renset HDL·

Efter fraskillelse af VLDL og LDL i ultracentrifugen iso-20 leres en snævert afgrænset HDL-fraktion (d 1,080 til 1,210) i ultracentrifugen, således som beskrevet af V.P. Skipski:

Lipid composition of lipoproteins in normal and diseased states, in: Blood Lipids and Lipoproteins: Quantitation, Composition and Metabolism. Hrsg.: Nelson, Wiley, New York 25 1972, 471-583. Fraktionen bliver derpå yderligere sedimen teret eller floteret to gange ved massefylderne 1,080 og 1,210.

HDL-fraktionen renses affinitetskromatografisk ved hjælp 30 af immobiliseret Concanavalin A ((1974) Febs Lett. 91, 174-198) eller elektroforetisk ved hjælp af Geon-Pevicon-Block-elektroforese ifølge R.W. Mahley, K.S. Holcombe (1977), J. Lipid. Res. 18, 314-324.

35 b) Fremstilling af antiserummet.

Dyrearter: Får eller kaniner.

DK 159840 B

8

Under anvendelse af det ifølge A opnåede immunogen anvendes følgende immuniseringsskema: 5

Dag Administration Immunogenmængde 0 intradermalt 1 mg protein (HDL) emulgeret i Freund’s adjuvans 10 7 intramuskulært " 14 subkutant " 30 intramuskulært 1 mg protein (HDL) emulgeret i Freund's adjuvans 15 60 subkutant " alle yderligere 30 dage subkutant "

Den første prøveblødning foretages efter 45 dage.

20 C) 50 μΐ serum blandes med 150 μΐ af et ifølge B fremstillet antiserum. Efter 30 minutters inkubation ved stuetemperatur fracentrifugeres det dannede bundfald (2 minut-25 ter ved 10.000 g).

50 μΐ af den klare væske over præcipitatet tilsættes 2 ml af et reagens, der indeholder 0,1 mol/1 tris-puffer, pH = l,lm, 0,05 mol/1 magnesiumaspartat; 1 mmol/1 4-aminophenazon, 30 6 mmol/1 phenol, 4 mmol/1 3,4-dichlorphenol, 0,3% fedtalko-holpolyglycolether, 400 U/l cftolesterolesterase, 250 U/l cholesteroloxidase og 200 U/l peroxidase.

Efter 20 minutters inkubationstid ved stuetemperatur måles 35 prøvens ekstinktion i forhold til reagensbiindværdien (rea-gensblindværdien indeholder 50 μΐ af antiserummet og tager hensyn til antiserummets cholesterolindhold).

DK 159840 B

9 ΔΕ = ΔΕ prøve - ΔΕ reagensbiindværdi.

LDL-cholesterol (mg/dl) = 1.385 x ΔΕ.

5 Serum Udseende cholesterol triglyce- LDL-cholesterol rider NIH- iimtunolo- metode gisk ud- _______x_fældning 1 Uklar 353 mg/dl 503 mg/dl 234 mg/dl 238 mg/dl 10 2 klar 638 mg/dl 591 mg/dl 510 mg/dl 495 mg/dl 3 klar 350 mg/dl 153 mg/dl 237 mg/dl 231 mg/dl 4 liklar 195 mg/dl 575 mg/dl 102 mg/dl 95 mg/dl 5 indeholder 231 mg/dl 379 mg/dl 149 mg/dl 130 mg/dl chylcmikroner 15 _ x Som referencemetode benyttes NIH-metoden (efter fraskillelse af VLDL og chylcmikroner i ultracentrifugen udfældes LDL. Ud fra forskellen mellem cholesterolværdier før og efter fældning opnår man værdien for LDL-20 cholesterol).

Manual of Laboratory Operations, Lipid Research Clinics Program, Lipid and Lipoprotein Analysis, DHEW Publication No. 65-628.

25

Eksempel 2.

En 50 μΐ opløsning af VLDL, HDL, LDL og chylomikroner blev blandet med 150 yl af et kaninantiserum, der blev fremstil-let med HDL som immunogen. Efter centrifugering blev chole-sterolindholdet bestemt i den ovenstående væske som beskrevet i eksempel 1.

35

Claims (4)

5 VLDL 23,2 mg/dl 2,8 mg/dl LDL 177,0 mg/dl 165,0 mg/dl HDL 50,9 mg/dl 0,0 mg/dl Patent krav.

1. Reagens til bestemmelse af LDL-fraktionen (Low Density 15 Lipoprotein-fraktionen) i legemsvæsker, kendetegnet ved, at den indeholder HDL-antistoffer (High Density Lipopro-tein-antistoffer), der er opnået med renset fuldstændig HDL-fraktion som immunogen, og et reagens til bestemmelse af cho-1esterol. 20

2. Reagens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at reagenset til bestemmelse af cholesterol indeholder choleste-roloxidase, et cholesterolesterspal tende enzym eller enzymsystem, et system til bestemmelse af H2O2 og et overfladeak- 25 tivt middel.

3. Reagens ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det i det væsentlige består af HDL-anti stoffer, cholesteroloxida-se, cholesterase, peroxidase, 3,4-dichlorphenol, phenol, 30 4-aminophenazon, en ikke-ionisk detergent, magnesiumaspartat og puffer, pH 7 til 8,5.

4. Reagens ifølge ethvert af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at det indeholder HDL-anti stofferne i immo- 35 biliseret form.