FI58514C - Samtidig framstaellning av ergokornin ergokryptin och ergometrin med hoegt utbyte med tillhjaelp av ett fermentativt foerfarande - Google Patents

Description

rr-,^-η Γλ1 kuulutusjulkaisu cqm .

4§Γφ ™ i11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 5 85 1 4 ijgS C (45) ·'’·’-1.

^ τ ^ (51) Ky.ik.3/iw.a3 C 12 P 17/16. 13/04 // σ o? d 519/02 SUOMI—FINLAND (2.1) 770393 (22) HtkwnitpiJvi—Aiwefcnlngatfti 0^.02.77 (33) Alkvpllvi—GlMghttadag 0U.02.77 (41) Tullut (ulklMk·) — Bllvtt offtntllg g 5 qQ jq PMMtti. Ja rakistcrihallitu· ( NAMUpm. ]· ku^lWw, pvm.-

Patent· och r*f 1staratyralsan ' Aiweksn uttafd och utUkrtfMn public·™! 31.10.80

(32)(33)(31) ««uoIImu*—toglrt prlorltM

(71) VEB Arzneimittelverk Dresden, Postfach 89/90, 8122 Radebeul 1, Saksan Demokraattinen Tasavalta-Demokratiska Republiken Tyskland(DD) (72) Klaus-Dieter Volzke, Dresden, Eva Borowski, Radebeul, Klaus Braun,

Radebeul, Klaus Breuel, Dresden, Christoph Dauth, Radebeul, Dieter Erge, Halle (Saale), Werner Gravert, Radebeul, Detlef Gröger, Halle (Saale), Liselotte Höhne, Dresden, Edda Knothe, Radebeul, Monika Miiller, Radebeul, Gisela Nordmann, Dresden, Rudolf Schirutschke,

Radebeul, Saksan Demokraattinen Tasavalta-Demokratiska Republiken Tyskland(DD) (7^0 Oy Borenius & Co Ab (5I+) Ergokorniinin, ergokryptiinin ja ergometriinin valmistaminen samanaikaisesti käymismenetelmän avulla suurin tuotoksin - Samtidig fram-ställning av ergokornin, ergokryptin och ergometrin med högt utbyte med tillhjälp av ett fermentativt förfarande

Keksinnön kohteena on menetelmä ergokorniinin, ergokryptiinin ja ergometriinin samanaikaiseksi teolliseksi valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan viljellään synteettisissä väliaineissa upoksissa olevaa mikro-organismin Claviceps purpurea (Fr.) uutta kantaa, ja tällöin muodostuneet torajyvä-alkaloidit otetaan talteen käymis- liemestä. Nämä alkaloidit tunnetaan ennestään niiden suuren terapeuttisen arvon takia, minkä ansiosta niitä käytetään sisätautien, neurologisten tautien ja naistentautien hoidossa.

Torajyvä-alkaloidien teollisuusmittakaavainen valmistus tapahtuu, kuten tunnettua, vielä laajalti viljelemällä maanviljelyskaltaisesti alkalipitoisia sklerotioita rukiin loiseliönä kasvavaa mikro-organismia Claviceps purpurea käyttäen. Tähän valmistukseen liittyvien huomattavien haittojen välttämiseksi on jo kauan yritetty viljellä Claviceps-organismia myös saprofyyttisissä olosuhteissa alkaloidin muodostamiseksi.

Yleisten kokemusten mukaan soveltuvat kuitenkin vain hyvin harvat 2 5 8 51 4 varsinaisesti tähän tarkoitukseen viljellyt Claviceps-kannat viljeltäviksi synteettisissä väliaineissa.

Koska näiden kantojen alkaloidispektrin koostumus on vastaavasti vaihteleva, muodostaa vain osa niistä ergotoksiiniryhmään kuuluvia alkaloideja, jotka ovat erikoisen arvokkaita peptidirakenteisia torajyvä-alkaloideja.

Huolimatta siitä, että on olemassa eräitä vähemmän yksityiskohtaisesti kuvattuja kantoja (vrt. HU-patenttijulkaisua no 150.631, DD-patentti-julkaisua 41.967, GB-patenttijulkaisua 1.158.380, DE-patentti-julkaisuja no 1.806.984; 1.909.216 ja US-patenttijulkaisua 3.884.762), ei silti ole millään tavoin ratkaistu ongelmaa ergotoksUniryhmän alkaloidien talteenottamisesta saprofyyttisesti yksistään, tai yhdessä muiden torajyväalkaloidien kanssa teollisuusmittakaavassa.

Jatkuvan valmistuksen suuren tuotoksen eräänä edellytyksenä on, että kannan suurtuotantokykyistä lähtöainetta on jatkuvasti suurin määrin käytettävissä ymppäysaineena käymismenetelmää varten, sekä myös menetelmäteknisesti yksinkertaisella ja luotettavalla tavalla. Teknisessä mikrobiologiassa tällöin tavanomaisin ja edullisin menetelmä perustuu siihen, että käytetään organismin määrättyjä lisääntymis-yksiköitä (konidioita), joiden avulla saadaan kanta suurtuotantokykyiselle tasolle viljelyteknisin keinoin, kuten mutageenikäsittelyllä tai yksittäisten itiöiden valinnalla, saadaan kannan halutut ominaisuudet säilymään monta vuotta stabiileina lyofiloituja itiöitä säilyttämällä, siis turvautumatta DE-patenttijulkaisussa no 1.206.384 selitettyyn erittäin monimutkaiseen ja kalliiseen menetelmään ja ennen kaikkea itiöiden tilavuusyksikköä kohden suuren lukumäärän ansioista voidaan pienellä ymppäysviljelmämäärällä ympätä ravinneliuosmääriä teknisessä mittakaavassa ja näin välttyä sellaisilta käymisen alkuolosuhteilta, jotka ovat huonoja lisääntymisen kannalta ja mahdollistavat vieraiden mikrobien pääsyn viljelyliemeen, kuten on esitetty US-patenttijulkaisussa 3.884.762.

Tämän menetelmän soveltaminen edellyttää kuitenkin, että kannalla on määrätty geneettinen ominaisuus, se on kyky muodostaa suuri määrä itiöitä, joilla on suuri ja stabiili kyky biosyntetisoida haluttuja alkaloideja. Näin ravinneliuoksen ymppäys myös teollisessa mittakaavassa voi tapahtua konidioiden suspensiolla niin, että 3 5851 4 viljelmän avulla saavutetaan suuri ja toistuva alkaloidisaanto vieraista mikro-organismeista vapaassa käymisprosessissa. Nimenomaan tämä ominaisuus, nimittäin konidioiden muodostuminen ja vastaava alkaloidibiosynteesitaipumus, puuttuu kuitenkin, kuten selvästi nähdään HU-patenttijulkaisusta no 150.631 sekä julkaisusta Amici et ai. (Appi. Microbiology 1_8 , ( 1 969 ), ss. 484...468), kokonaan tai melkein kokonaan alkaloidien valmistamiseksi käytetyiltä Claviceps purpurea-ergotoksiiniryhmän saprofyyttisesti viljellyiltä kannoilta, sillä tähänastisten kokemusten mukaan konidioiden muodostumistaipumus estää taipumuksen muodostaa alkaloideja. Tällöin on välttämätöntä, kuten US-patenttijulkaisusta 3.884.762 ilmenee, viljellä paljon huovastoa kiinteillä ravinnealustoilla sekä homogenisoida näin saatu ymppäysmateriaali steriileissä olosuhteissa, mikä on erittäin epäedullista jatkuvan teollisuusmittakaavaisen käymisen kannalta. Tämän lisäksi voi, kuten US-patenttijulkaisussa on esitetty, käytettäessä huovastoa ymppäysmateriaalina ergokorniinin ja ergokryptiinin valmistuksessa tapahtua noin 50%:inen kannan tehohäviö siirryttäessä ravistuspullosta käymissammioon, jopa pienessä teknisessä mittakaavassa .

Mainitusta julkaisusta selviää myös, että näitä ergotoksiinia kehittäviä mikro-organismeja käytettäessä siirtyy käymisen aikana vain pieni osa soluissa kehittyvästä ergotoksiinista viljelysuodokseen.

Täten on muodostuneiden alkaloidien saamiseksi täydellisesti talteen sekä viljelysuodos että myös huovasto käsiteltävä erikseen. Se suuri pigmentti- ja hyödyttömien aineiden osuus, joka muodostuu torajyvä-alkaloidien biosynteesissä upoksissa olevaa viljelmää käyttäen, edellyttää erittäin monimutkaisia käsittelymenetelmiä, eikä saavutettu tuotos ole tyydyttävä. Niinpä on GB-patentin no 1.158.380 mukaan saatu viljelysuodos uutettava kloroformilla pH-arvossa 9, täten saatu uutos on uutettava viinihapon vesiliuoksella, täten saatu vesi-uutos on uudelleen uutettava kloroformilla pH-arvossa 9, ja tämä uutos on yhdistettävä vastaavalla monimutkaisella tavalla saatuun ja puhdistettuun huovastouutokseen, minkä jälkeen yhdistetyt uutokset on haihdutettava, ja alkaloidin raakaemäkset saostettava heksaanin avulla. Täten saadusta sakasta poistetaan jääetikan, metanolin ja rikkihapon avulla ergotamiinisulfaatti, jäännös haihdutetaan, sen vesiliuos , 58514 uutetaan pH-arvossa 9 uudelleen kloroformilla, konsentroitu kloroformi-uutos kromatografoidaan 100-kertaisella määrällä piihappogeeliä, ja lopuksi eristetään täten puhdistettu ergokryptiini emäksenä bentseenis-tä. Toisesta kromatograafisesta fraktiosta saadaan enemmän ergota-miinia haihduttamalla ja liuottamalla jäännös asetonin vesiliuokseen.

Jälkikäsittely GB-patenttijulkaisussa no 1.158.380 ja US-patentti-julkaisussa 3.485.722 selitetyn yleisen menetelmän mukaan torajyvä-peptidi-alkaloidien eristämiseksi ei onnistunut, kun viljeltiin seuraavassa lähemmin selitettyä uutta Claviceps purpurea-kantaa. Häiritsevästi vaikuttivat tällöin ennen kaikkea viljely-suodosten ja huovastouutosten voimakas taipumus emulsioiden muodostumiseen kloroformilla uutettaessa. Ei myöskään onnistuttu muuttamaan ergotoksiinia kiteiseksi emäkseksi eikä saavuttamaan edellä mainituissa patenttijulkaisuissa mainittuja tuotoksia käyttämällä ei-kiteisiä puhdas- tai raaka-alkaloidikonsentraatteja.

DD-patentin no 41 967 mukaan kromatografoidaan sinänsä tunnetulla tavalla sekä ergotoksiinia että ergometriiniä sisältävä uutos, joka on saatu pienen alkaloidikonsentraation sisältävästä viljelyliemestä käyttämällä yhä enemmän polaarisia eluointivälineitä ja kiteyttämällä erillisalkaloidit sinänsä tunnetulla tavalla. On kuitenkin yleisesti tunnettua, että eluointi metanolipitoisilla liuottimilla johtaa ergo-metriinin haitallisen suuriin pigmenttipitoisuuksiin.

Keksinnön tarkoituksena on parantaa ergokorniinin, ergokryptiinin ja varsinkin ergometriinin teollista valmistusta. Keksinnön tehtävänä on osoittaa tähän soveltuva menetelmä.

On todettu, että Claviceps purpurea (Fr.) (Tul)-kanta, joka epäorgaanisia typpiyhdisteitä, sokeria, orgaanisia happoja ja tavanomaisia epäorgaanisia suoloja sisältävissä synteettisissä ravinneväliaineissa muodostaa upoksissa viljeltäessä ergokorniinia ja ergokryptiiniä terapeuttisesti sopivassa suhteessa sekä ergometriiniä huomattavassa määrässä, jolloin tälle kannalle on ominaista sekä teollisuuskäyttöä varten tähän asti tuntemattoman korkea alkaloidisynteesin taso että myös kyky muodostaa nestemäisissä väliaineissa määrätyissä olosuhteissa käymisteknisiä tarpeita varten erittäin edullinen määrä itiöitä, joilla on suuri kyky johtaa alkaloidien synteettiseen muodostumiseen.

i 5 58514

Lisäksi sisältyy muodostunut ergotoksiini viljelyn kuudentena ja seitsemäntenä päivän, eli alkaloidimuodostumisen maksimin ajankohtana, jo suurimmalta osaltaan ja ergometriini käytännöllisesti katsoen täydellisesti huovastoa ympäröivään viljelyväliaineeseen.

Keksinnölle on näin ollen tunnusomaista, että viljellään uutta kantaa Claviceps purpurea (Fr.) Tul. IMET PA 130 saprofyyttisissä olosuhteissa konidioiden muodostamiseksi, käytetään näitä konidioita sakkaroosia, epäorgaanista typpeä ja muita sinänsä tunnettuja lisäaineita sisältävän ravintoliuoksen ymppäämiseen, viljely suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla ilmastettuna käymisprosessina, viljely-ajan päätyttyä uutetaan muodostuneet alkaloidit suoraan viljely-liemestä, huovastosta tai vedellä laimennetusta ja suodatetusta viljelyliemestä etyyliasetaatilla tai asetonilla, johon on lisätty hiilivetyseosta, varsinkin petrolieetteri-ksyleeniseosta, puhdistetaan uutos vaihtamalla faasia happamen vesifaasin ja orgaanisen faasin välillä, väkevöidään näin saatu tuote, eristetään ergometriini kloroformiadduktion muodossa, väkevöidään jäännös uudelleen ja puhdistetaan se adsorptiokromatografisesti, jonka jälkeen bentseenistä, tolueenista tai ksyleenistä kiteytetään erittäin puhdasta, epimeeri-vapaata ergokorniini-ergokryptiiniseosta aromaattisena adduktio-tuotteena. Kun viljelylientä laimennetaan ennen uuttamista, syntyy toisaalta eräitä haitallisia sivutuotteita tavallista vähemmän, ja toisaalta on yllätyksellisesti myös havaittavissa viljelmäsuodokseen sisältyvän ergotoksiinimäärän huomattava suureneminen.

Suodatuksen jälkeen saatu biomassa voidaan, riippuen alkaloidien jäännöspitoisuudesta, uuttaa asetonilla, puhdistaa suodattamalla saatu kirkas uutos sen jälkeen, kun sen pH on säädetty happojen, varsinkin fosforihapon vesiliuosten avulla arvoon 2...3, hiilivety-seoksilla, kuten petrolieetterillä tai petrolieetterin ja ksyleenin seoksella ja edelleen uuttaa erottunut vesifaasi sen jälkeen, kun sen pH on säädetty arvoon 8...9 ammoniakin vesiliuoksen avulla, alemmilla alkyylikarbonihappoestereillä, varsinkin etyyliasetaatilla, ja saatu uutos pestä vedellä.

Uusi viljelemällä saatu kanta, jolla on tähän asti tuntemattomat tunnusmerkit, teknisesti edullisen ja taloudellisesti kannattavan torajyväalkaloidien, varsinkin ergotoksiiniryhmän alkaloidien ja ergometriinin valmistamiseksi teollisuusmittakaavassa, on talletettu 5851 4 s laitokseen Zentralinstitut fUr Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena der Deutschen Akademie der Wissenschaft zu Berlin numerolla IMET PA 130.

Tämä kanta erotettiin selektiivisesti valitsemalla viljelmä, joka on peräisin koeviljelyalueen sklerotiosta, ja jota käsiteltiin mutageeni-sesti. Tämän kannan morfologiset ominaisuudet on yhteenvetona esitetty taulukossa 1, ja kannalla on verrattuna aikaisemmin tunnettuihin menetelmiin ergokorniinin, ergokryptiinin ja ergometriinin samanaikaiseen valmistukseen käymismenetelmän avulla seuraavat edut: 1. Ergokorniinin ja ergokryptiinin biosynteesi terapeuttisesti edullisessa suhteessa sekä valmistuksen kannalta helposti erotettavissa olevan ergometriinin biosynteesi tapahtuu toistuvissa käymisajoissa korkeintaan 7 päivässä teknisissä käymisolosuhteissa saantotasolla, joka on noin 1300 mg ergotoksiinia ja 550 mg ergometriiniä viljelyliemilitraa kohden.

2. Muodostunut ergotoksiini löytyy huomattavassa määrässä huovastoa ympäröivästä käymisväliaineesta niin, että alkaloidien erottaminen voi tapahtua aikaisemmin tunnettuihin menetelmiin verrattuna paremmissa lähtöolosuhteissa.

3. Kiinteillä tai nestemäisillä väliaineilla muodostuu määrätyissä olosuhteissa paljon itiöitä, joiden avulla voidaan syntetisoida alkaloideja myös teknisissä käymislaitteissa. Nämä uudet ominaisuudet mahdollistavat järjestelmällisesti yksinkertaisemmin ja varmemmin kuin aikaisemmat menetelmät itiöiden lyofilisoinnin pitkäaikaista säilyttämistä varten, sekä standardoidun ja vieraille mikro-organismeille vähemmän alttiin ravinneliuoksen ymppäyksen teknisessä mittakaavassa ja aikaansaavat täten kokonaismenetelmän paremman toistuvuuden.

1 58514

Taulukko 1

Mikro-organismin Claviceps purpurea, kannan IMET PA 130 morfologiset ominaisuudet erilaisilla agarväliaineilla sen jälkeen, kun tätä kantaa on viljelty 14 vuorokautta petrikulhoissa 24 °C:ssa Väliaine 1 3% sakkaroosia 0,001% FeSO^ · 7H20:a 0,3% NaNO^a 1% maissiuutetta 0,1% K2HP01+:a 3% agaria 0,05% MgSO^ · 7H20:a pH 6,8...6,9

Rykelmien muoto:

Hyvin kehittyneitä tiiviitä epäsäännöllisiä ja voimakkaasti rypistyneitä rykelmiä, nurja puoli sileä, ei ole noussut levyn pohjasta. Rykelmien läpimitta: 1.0. ..1.5 cm Rykelmien väri:

Yläpuoli vaalearuskea^-violetti, reuna valkoinen, nurja puoli ruskea, reuna vaaleanruskea.

Keski-itiömäärä: e 43,6 x 10 konidiota/rykelmä Väliaine 2 15% olutvierrettä 0,1% ammoniumsitraattia 0,5% hiivauutetta 3% agaria 0,5% (NHu)2P04 pH 6,0%

Rykelmien muoto:

Keskusta kohonnut, kraaterimainen syvennys; reuna säteittäisesti laskostunut, kasvanut agarin läpi, rykelmä noussut levyn pohjasta. Rykelmien halkaisija: 2.. .3 cm Rykelmien väri:

Ylä- ja alapuolet vaaleanharmaat.

Keski-itiömäärä:

C

34,1 x 10 konidiota/rykelmä β 58514 taul. 1 jatk.

Väliaine 3 2% glukoosia 50% perunan vesiuutetta 3% agaria pH 6,0

Rykelmien muoto:

Keskusta kohonnut, kraaterimainen syvennys; kasvanut agarin läpi, rykelmä noussut levyn pohjasta.

Rykelmien halkaisija: 1.5.. .2.0 cm Rykelmien väri: yläpuoli harmaanvioletti, nurja puoli harmaanruskea Keski-itiömäärä: g 3,3 x 10 konidiota/rykelmä.

Konidioiden ja sienirihmojen mikroskooppiset tunnusmerkit:

Konidioilla on kaikissa tapauksissa ellipsoidin muoto, jonka mitat ovat 6...10 pm (pitkä akseli), vast. 4...8 pm (lyhyt akseli).

Viljelyalustan sienirihmojen pituus on jopa 200 pm ja niiden halkaisija on 4...8 pm. Pullistuneiden hyyfien ollessa kysymyksessä on halkaisija 8.. .16 pm. Esiintyy ilmarihmoja, joiden pituus on yli 200 pm, ja joiden halkaisija on vain 2...4 pm.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavassa lähemmin eräiden suoritus-esimerkkien avulla.

Esimerkki 1

Konidioitiöiden viljelemiseksi valmistetaan kevytmaidossa lyofilisoi-duista kannan IMET PA 130 Claviceps purpurea-itiöistä suspensio, joka siirretään 3-prosenttiseen agar-viljelyväliaineeseen (pH = 6,0), joka sisältää 15% olutvierrettä, 0,5% hiivauutetta, 0,5% (NH^)2P04:a ja 0,1% ammoniumsitraattia, ja viljellään vinoagarviljelmänä 14 vuorokautta 19 °C:ssa. Upoksissa suoritettavan viljelmän ymppäysmateriaalina voidaan tämän menetelmän mukaan 100 ml:n Jena-tyyppisiin leveäkaulai-siin pulloihin sijoittaa 1x10 itiöitä/viljelyastia, jolla määräl lä tarpeen vaatiessa voidaan ympätä jopa 120 1 ravinneliuosta.

g 58514

Esimerkki 2

Ymppäysaineen valmistus tapahtuu käyttämällä esimerkin 1 mukaan viljeltyjen itiöiden suspensiota, joka siirretään 1 x 105 itiöitä/ml sisältävänä konsentraationa nesteväliaineeseen, jossa on 1 S % olut-vierrettä ja 2% hiivauutetta. Viljely tapahtuu 22 °C:ssa käyttämällä 500 ml:n pyöreitä pulloja, joissa on 120 ml nesteväliainetta, ja jotka on sijoitettu pyörivään ravistuskoneeseen. Viljelmä sisältää 14 vuoro- g kauden kuluttua 6x10 itiöitä/pullo, joita itiöitä käytetään ymppäys-aineena alkaloidin käymisviljelyä varten.

Esimerkki 3

Ymppäysitiöiden valmistus tapahtuu esimerkin 1 mukaisella tavalla.

Viljelyväliaineena käytetään 3-prosenttista agar-väliainetta (pH 6,8... 6,9), jossa on 3% sakkaroosia, 0,3% NaNO^ra, 0,1% l^HPO^ra, 0,05%

MgSO^ ’ 7H20 : a, 0,05% KCl:a, 0,001% FeSO^ *7H20 :a ja 1% maissin uutosvet-tä. Käyttämällä 500 ml:n teollisuuslasia olevia kapeakaulaisia pulloja saadaan vinoa agarviljelmää soveltaen 14 vuorokautisen, 24 °C:ssa g suoritetun viljelmän jälkeen 3x10 itiöitä/viljelyastia, joita itiöitä käytetään lähtömateriaalina upoksissa suoritettavaa viljelyä varten alkaloidien valmistamiseksi synteettisesti.

Esimerkki 4

Esimerkin 1 mukaan viljellyn ymppäysaineviljelmän itiöt suspendoidaan, ja osa niistä käytetään ymppäysaineena yhtä suurina määrinä pystyissä pyöreissä 500 ml:n pulloissa, joissa jokaisessa on 120 ml esiviljely-väliainetta (10% sakkaroosia, 1,5% ammoniumsitraattia, 0,1% CaiNO^)^ 0,025% KH2P04:a, 0,01% HCl:a, 0,03% MgSO^a, 0,001% FeS04:a, 0,0004% ZnSC>4:a, tislattua vettä, pH-arvo 5,5, sterilointi 30 minuuttia paineen ollessa noin 50 KPa. Pulloja ravistetaan 24 °C:ssa pyörivässä ravistus-koneessa, joka pyörii 175 kierr/min. 7 vuorokauden jälkeen pullojen sisältö ympätään suhteessa 1:10 300 ml:n Erlenmeyer-kolveihin, joissa jokaisessa on 120 ml pääviljelyväliainetta (20% sakkaroosia, 1% ammoniums itraatt ia, 0,1% CaiNOg^’.a, 0 ,025% KH2P0^:a, 0,01% KCl:a, 0,03% MgS0^:a, 0,001% FeS0^:a, 0,0004% ZnS04:a, tislattua vettä, pH-arvo = 5,5, sterilointi 30 minuuttia paineessa noin 50 MPa. Näitä kolveja ravistetaan samoissa olosuhteissa kuin edellä.

10 5851 4 14 vuorokauden kuluttua todetaan Van Urk-reaktion avulla 2470 mg alkaloidia/1 1 viljelynestettä, laskettu ergotoksiinimaleinaattina. Alkaloidit uutetaan metylecnikloridin avulla soveltaen menetelmää, jonka ovat osoittaneet Hohmann & Rocheimeyer (Arch. Pharmazie 297 (1964), s. 186/187), erotetaan formamidilla kyllästettyä piimaata käyttäen ohutkerroskromatograafisesti ja määritetään UV-spektipfoto-metrisesti. Saadaan 1280 mg ergotoksiinia ja 340 mg ergoraetriinia/ litra, lopun jakautuessa kahdelle tähän asti tuntemattomalle luonnolliselle peptidialkaloidille ja yksinkertaisille ergoliinijohdannaisille, joista esimerkkeinä mainittakoon agroklaviini, tsanoklaviini, jne.

Rinnan tämän kanssa suoritettu imusuodattamalla erotetun huovaston ja suodoksen määritys osoittaa, että suodokseen sisältyy ergometriini täydellisesti ja tämän lisäksi 90% kaikkiaan muodostuneesta ergotok-siinista.

Esimerkki 3

Kymmenen 2 litran lasiseen käymisastiaan ympätään esimerkin 2 mukaisella tavalla upoksissa valmistettua itiöviljelmää. Jokaisessa käymis-astiassa on 1,3 1 ravinneliuosta A, jossa on 10% sakkaroosia, 1,5% ammoniumsitraattia, 0,05% KHgPO^ja, 0,03% MgS0^:a, 0,001% PeS0^:a ja 0,0004% ZnSQ^ja vesijohtovedessä (pH-arvo 5,5, sterilointi 30 minuuttia paineessa noin 50 kPa nopeudella, käyminen tapahtuu 24 °C;ssa, jolloin sekoitetaan 400 kierr/min nopeudella ja ilmastetaan 0,3 1 ilmaa/min. 7 vuorokauden kuluttua siirretään yhden käymisastian sisältö 18 litran jaloteräksiseen käymisastiaan, jossa on 10 1 ravinne-liuosta B, joka sisältää 10% sakkaroosia, 1,4% sitruunahappoa, 1,0% aramoniumhydroksidia (25%), 0,05% Ga(N0^)2:a, 0,025% KH2P0^:a, 0,01% KCl:a, 0,03% MgS0^:a, 0,001% FeSO^ja ja 0,0004% ZnSO^ja vesijohtovedessä, pH 5,5. Viljellään 24 °C:ssa, sekoitetaan 360 kierr/min nopeudella ja ilmastetaan 2,5 1 ilmaa/min, minkä jälkeen viidentenä päivänä käytetään käymisastian sisällöstä puolet 63 litran jaloteräksisessä käymisastias-sa olevan 40 l:n suuruisen ravinneliuoksen C yrappäämiseen. Tässä ravinneliuoksessa C on 20% sakkaroosia, 1,75% sitruunahappoa, 0,075% KH2P04:a, 0,02% KClsa, 0,03% MgSO^ja, 0,003% FeSO^sa, 0,0012% ZnSO^-.a vesijohtovedessä. Lisätään ammoniumhydroksidia pH-arvoon 5,3, steriloidaan 60 min 110 °C:ssa. Viljelmää sekoitetaan 7 vuorokautta 24 °C: ssa 300 kierr/min nopeudella ja ilmastetaan 27 litralla ilmaa/min, jolloin tarpeen vaatiessa lisätään vaahtoamisen estoainetta. Viljely-jakson päättyessä viljelyliuos sisältää kaikkiaan 2640 mg alkaloideja ,, 5851 4 11 litraa kohden. Esimerkin 4 mukaisella tavalla suoritettu analyysi osoittaa, että tästä määrästä on 1300 mg ergotoksiinia ja 550 mg ergometriiniä.

Esimerkki 6

Esimerkin 3 mukaan viljellyn ymppäysaineviljelmän koko itiömäärä jaetaan ymppäysaineena tasaisesti kahteen 18 litran jaloteräksiseen käymisastiaan, jossa kummassakin on 10 1 esimerkin 5 mukaista ravinne-liuosta A. Käymisastioita sekoitetaan 7 vuorokautta 24 °C:ssa 360 kierr/min nopeudella ja ilmastetaan 2,5 litralla ilmaa/min. Tämän jälkeen näiden molempien käymisastioiden sisältö siirretään 250 litran jaloteräksiseen käymisastiaan, jossa on 180 1 esimerkin 5 mukaista ravinneliuosta B, ja viljellään 24 °C:ssa sekoittaen 160 kierr/min nopeudella ja ilmastaen 0,5 litralla ilmaa/min. 5 vuorokauden kuluttua viljelmä siirretään 2000 litran jaloteräksiseen käymisastiaan, jossa on 1400 1 esimerkin 5 mukaista ravinneliuosta C, jolloin tähän liuokseen vielä on lisätty 0,0005% NiS0^:a. Viljely suoritetaan 24 °C:ssa sekoittamalla 160 kierr/min nopeudella ja ilmastamalla 0,6 litralla ilmaa ravinneliuoksen litraa kohden minuutissa. Tarpeen vaatiessa lisätään kaikkiin käymisastioihin vaahtoamisen estoainetta. Seitsemäntenä vuorokautena sisältää viljelmä kaikkiaa 2430 mg alkaloideja/ litra ravinnelientä. Esimerkissä 4 selitetyn analyyttisen määrityksen mukaan saadaan tästä 1150 mg ergotoksiinia ja 490 mg ergometriiniä/ litra ravinneliuosta.

Esimerkki 7 200 1 viljelmäsuodosta, joka on saatu vastaavasta määrästä esimerkin 6 mukaan valmistettua viljelylientä, jota ennen huovaston erottamista on laimennettu lisäämällä sekoittaen vettä tilavuussuhteessa 1:1, tehdään emäksiseksi ammoniakin 25%:lla vesiliuoksella pH-arvoon 8,5, ja uutetaan ergotoksiini-alkaloidit ja ergometriini 50 litralla etyyliasetaattia käyttämällä kaksivaiheista vastavirta-uuttamislaitetta. Etyyliasetaattiuutos konsentroidaan alipaineessa korkeintaan 30 °C:ssa lähtötilavuuden 1:20-osaan, minkä jälkeen haihdutusjäännökseen lisätään 2 tilavuusosaa kloroformia, ja annetaan reaktioseoksen olla 15 tuntia 4 °C:ssa ergometriinin ja kloroformin adduktiotuotteen saattamiseksi kiteytymään, minkä jälkeen kiteet erotetaan imemällä, jolloin saadaan 35,4 g kellertävää ergometriinin ja kloroformin adduktiotuotet-ta 75-prosenttisena tuotoksena.

12 5 85 1 4

Liuotetaan lämmittäen 35,4 g ergometriinin ja kloroformin adduktio-tuotetta 3,1 litraan asetonia, jossa on aktiivihiiltä, lisätään suodokseen laskettu määrä maleiinihapon asetoniliuosta, erotetaan muodostunut kiteinen ergometriini-dimaleinaatti imemällä ja kuivataan tämä tuote 70 °C:ssa. Alkaloidisuola saadaan ohutkerroskromatogriisesti puhtaana,väriltään valkoisenkellertävänä kiteisenä jauheena 90% tuotoksin, jolloin puhtausaste on 98...100%. Ominaiskierto Cet)= +50 °C (c = 1 vedessä).

Saatu ergotoksiinipitoinen suodos konsentroidaan edelleen 0,297 litran tilavuuteen, minkä jälkeen a) kromatografoidaan käyttämällä pylväässä 20-kertaista määrää neutraalia aktiviteettiasteen I alumiinioksidia, laskettu alkaloidi-konsentraatin koko alkaloidimäärästä, ja etyyliasetaatit eluoidaan 3,8 litralla samaa liuotinta. Tämän jälkeen eluaatti haihdutetaan alipaineessa ja korkeintaan 30 °C:ssa kuiviin, jolloin saadaan 74,2 g haihdutusjäännöstä, joka liuotetaan 0,212 litraan bentseeniä ja annetaan liuoksen olla 15 tuntia 4 °C:ssa niin, että jäännös muuttuu ergo-toksiinin ja bentseenin adduktiotuotteeksi, minkä jälkeen muodostuneet kiteet erotetaan, pestään bentseenillä ja kuivataan alipaineisessa kuivauskaapissa. Täten saadaan 55,2 g ohutkerroskromatografisesti puhdasta, valkoista kiteistä ergotoksiinin ja bentseenin adduktiotuotetta, jonka puhtausaste on 95%. Ominaiskierto (a)^ = -183° (c = 1,8 CHCl^rssa), tai b) sekoitetaan 20-kertaiseen määrään neutraalia aktiviteettiasteen I alumiinioksidia, laskettu alkaloidikonsentraatin koko alkaloidimäärästä, kunnes seos on väriltään homogeeninen. Reaktioseoksen oltua 15 minuuttia se uutetaan kolmasti kulloinkin 3,82 litralla etyyliasetaattia, minkä jälkeen yhdistetyt uutokset haihdutetaan 30 °C:ssa kuiviin, ja jatketaan käsittelyä kohdan a) mukaisella tavalla, jolloin saadaan 5 2,5 g ohutkerroskromatografisesti puhdasta, valkoista kiteistä ergotoksiinin ja bentseenin adduktiotuotetta, jonka puhtausaste on 95%, ominais-kierto (a)£°= -183° (c = 1,8 CHCl3:ssa).

c) kromatografoidaan pylväässä käyttämällä viisinkertaista määrää neutraalia aktiviteettiasteen I alumiinioksidia, alkaloidikonsentraatin koko alkaloidimäärästä laskettuna, ja lisätään aktiivihiiltä (adsorptio-aineiden suhde : alumiinioksidi : aktiivihiili = 5:1) ja etyyliasetaattia, ja eluoidaan 4 litralla samaa liuotinta, minkä jälkeen jatkokäsittely suoritetaan kohdan a) mukaisella tavalla, jolloin saadaan '55 g 13 5851 4 ohutkerroskromatografisesti puhdasta, valkoista kiteistä ergotoksiinin ja bentseenin adduktiotuotetta, jonka puhtausaste on 96%. Ominaiskierto (ct)£0= -183° (c = 1,8 CHCl3:ssa).

d) sekoitetaan käyttämällä pylväässä viisinkertaista määrää neutraalia aktiviteettiasteen I alumiinioksidia, alkaloidikonsentraatin koko alkaloidimäärästä laskettuna, ja lisäämällä aktiivihiiltä (adsorptio-aineiden suhde: alumiinioksidiraktiivihiili = 5:1), sekä eluoidaan sekoitus-suodatuslaitteessa 3 litralla etyyliasetaattia, uutetaan vielä kahdesti kulloinkin 2,5 litralla etyyliasetaattia, haihdutetaan yhdistetyt uutokset 30 °C:ssa kuiviin, minkä jälkeen jatkokäsittely suoritetaan kohdan a) mukaisella tavalla, jolloin saadaan 55 g ohutkerroskrana-grafisesti puhdasta,valkoista kiteistä ergotoksiinin ja bentseenin adduktiotuotetta, jonka puhtausaste on 96%. Ominaiskierto (ot)p =-183° (c = 1,8 CHClg:ssa).

Sekoitetaan 55,2 g ergotoksiinin ja bentseenin adduktiotuotetta hiukan lämmittäen 830 ml:aan absoluuttista etanolia, lisätään laskettu määrä 0,5 moolista etanolisulfonihapon etanoliliuosta (abs) ja tämän jälkeen 4,2 1 vedetöntä eetteriä, erotetaan muodostuneet kiteet imemällä ja kuivataan 70 °C:ssa, jolloin saadaan 95% tuotoksena ohutkerroskromatcgra-fisesti'puhdasta ,valkoista kiteistä ergotoksiini-etaanisulfonaattia, jonka puhtausaste on 98...100%.

Esimerkki 8

Uutetaan 12,0 kg uuden kannan, IMET PA 130 Claviceps purpurea, esimerkin 6 mukaisesti valmistettua huovastoa, joka on saatu suodattamalla vastaava määrä viljelylientä, 3 tunnin kuluessa 20 °C:ssa 18 litralla asetonia, minkä jälkeen suodattamalla erotetun asetonipitoisen vesi-uutoksen pH säädetään fosforihapon avulla arvoon 2...3 ja poistetaan rasva ja puhdistetaan kahdesti uuttaen 17 litralla petroli-eetteriä ja 11 litralla petrolieetterin ja ksyleenin seosta (tilavuussuhde 1:1). Saatu alkaloidipitoinen raskas faasi uutetaan pH-arvoon 8...9 (pH säädetty ammoniakkivedellä) yhteensä 7 litralla etyyliasetaattia, minkä jälkeen tilavuussuhteessa 1:1 vedellä pesty yläpuolinen faasi haihdutetaan 30 °C:ssa 0,70 litran tilavuuteen, ja lisätään 1,40 1 kloroformia, minkä jälkeen reaktioseoksen annetaan seistä yli yön 4 °C:ssa, ja erotetaan laskeutunut lietemäinen sakka.

14 5851 4

Suodos konsentroidaan edellä mainituissa olosuhteissa 0,180 litran tilavuuteen, kromatografoidaan käyttämällä 1100 kg aktiviteettiasteen I alumiinioksidia ja eluoidaan 2 litralla etyyliasetaattia, haihdutetaan saatu eluaatti alipaineessa kuiviin ja liuotetaan jäännös 100 mitään tolueenia (tai bentseeniä tai ksyleeniä). Reaktioseoksen annetaan seistä yli yön H °C:ssa, minkä jälkeen laskeutunut aine erotetaan, kuivataan alipaineisessa kuivauskaapissa, jolloin saadaan 14,0 g valkoista kiteistä ergotoksiinin ja tolueenin adduktiotuotetta, jonka puhtausaste on 98...100%.

Esimerkki 9

Uutetaan 10,0 1 esimerkin 5 mukaan valmistettua viljelylientä sekoittaen ja lisäämällä 10 paino-% ammoniumsuifaattia pH-arvon ollessa 8...9 ja lämpötilan 20 °C, 25,0 1:11a etyyliasetaattia, heitetään raskas bio-faasi pois, uutetaan orgaaninen faasi kahdesti kulloinkin 5,0 litralla 25-prosenttista fosforihappoa, yhdistetään vesifaasit, säädetään niiden pH ammoniakkivedellä arvoon 8...9 ja uutetaan kahdesti kulloinkin 5,0 litralla etyyliasetaattia, minkä jälkeen nämä kootut orgaaniset faasit haihdutetaan 30 °C:ssa 200 ml:n tilavuuteen, lisätään haihdutus-jäännökseen 400 ml kloroformia, annetaan reaktioseoksen seistä yli yön 4 °C:ssa, erotetaan muodostuneet kiteet imemällä, kuivataan ne alipaineisessa kuivauskaapissa, jolloin saadaan 4,20 g eli 71,2% teoreettisesta määrästä ergometriinin ja kloroformin adduktiotuotetta, jonka puhtausaste on 90,7%. Edellä mainituissa olosuhteissa 120 ml:n tilavuuteen konsentroitu ergotoksiinipitoinen suodos kromatografoidaan käyttämällä 300 g aktiviteettiasteen I alumiinioksidia, eluoidaan etyyliasetaatilla, haihdutetaan eluaatti alipaineessa kuiviin, liuotetaan kuiva jäännös 30 mlraan bentseeniä, annetaan reaktioseoksen seistä yli yön korkeintaan 10 °C:ssa, erotetaan laskeutunut aine imemällä, kuivataan se alipaineisessa kuivauskaapissa, jolloin saadaan 7,95 g eli 73,6% teoreettisesta määrästä valkoista kiteistä ergotoksiinin ja bentseenin adduktiotuotetta, jonka puhtausaste on 91,6%.

Claims (4)

15 5851 4

1. Menetelmä ergokorniinin, ergokryptiinin ja ergometriinin samanaikaiseksi valmistamiseksi suurin tuotoksin käymisviljelyn avulla sekä tuotteiden eristämiseksi ja puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään uutta kantaa Claviceps purpurea (Fr.) Tul. IMET PA 130 saprofyyttisissä olosuhteissa konidioiden muodostamiseksi, käytetään näitä konidioita sakkaroosia, epäorgaanista typpeä ja muita sinänsä tunnettuja lisäaineita sisältävän ravintoliuoksen ymppäämiseen, viljely suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla ilmastettuna käymisprosessina, viljelyajan päätyttyä uutetaan muodostuneet alkaloidit suoraan viljely-liemestä, huovastosta tai vedellä laimennetusta ja suodatetusta viljely-liemestä etyyliasetaatilla tai asetonilla, johon on lisätty hiilivety-seosta, varsinkin petrolieetteri-ksyleeniseosta, puhdistetaan uutos vaihtamalla faasia happamen vesifaasin ja orgaanisen faasin välillä, väkevöidään näin saatu tuote, eristetään ergometriini kloroformi-adduktion muodossa, väkevöidään jäännös uudelleen ja puhdistetaan se adsorptiokromatografisesti, jonka jälkeen bentseenistä, tolueenista tai ksyleenistä kiteytetään erittäin puhdasta epimeerivapaata ergokorniini-ergokryptiiniseosta aromaattisena adduktiotuotteena.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konidioiden käyttö ymppinä tapahtuu kiinteissä tai nestemäisissä väliaineissa ja 15...25 °C:ssa, sopivasti 18...24 °C:ssa.

1. Förfarande för samtidig framställning av ergokornin, ergokryptin och ergometrin med högt utbyte med tillhjälp av en fermentativ odling samt för isolering och rengöring av produkterna, känneteck-n a t därav, att man odlar den nya stammen Claviceps purpurea (Fr.) Tul. IMET PA 130 under saprofytiska förhällanden, för att bilda koni-dier, använder dessa konidier för ympning av en näringslösning inne-hällande sackaros, oorganiskt kväve och andra i och för sig kända till-satsmedel, utför odlingen pä i och för sig känt sätt som en luftad fermentationsprocess, extraherar de bildade alkaloiderna vid odlings-tidens slut direkt ur odlingslösningen, ur mycelet eller under med vatten utspädda och tillrenade odlingslösningen med etylacetat eller