FI111015B - Menetelmä salmonellan määrittämiseksi - Google Patents

Description

111015

Menetelmä salmonellan määrittämiseksi Förfarande för bestämning av salmonella 5

Keksinnön ala

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat menetelmät Salmonellan rikastamiseksi ja 10 määrittämiseksi näytteestä kuten raa’asta tai jalostetusta elintarvikkeesta tai rehutuot-teesta otetusta näytteestä.

Yleinen tausta 15 Raakojen ja jalostettujen elintarvikkeiden kontaminoituminen Salmonella-snknm kuuluvilla bakteerilajeilla, joihin viitataan seuraavassa käsitteellä Salmonella, on huomattava ongelma elintarvike- ja rehuteollisuudessa. Koska Salmonella-bakteereja on läsnä kaikkialla, niin kontaminoitumislähteitä on lukemattomia ja tartuntatavat ovat hyvin monimutkaisia.

20

Kaikki Salmonella-bakteerit voivat olla patogeenisiä ihmisissä, eläimissä tai molemmissa. Useimmissa serotyypeissä todetaan vain vähäistä isäntä-spesifisyyttä ja ne • ' voivat aiheuttaa ihmisissä ravinnon nauttimisen jälkeen salmonelloosia, joka on ruu ansulatuskanavan sairaus.

25

Vaikka Salmonella-infektiot ovatkin tavallisesti lieviä ja itse itseään rajoittavia, niistä toipumisen kestäessä muutaman vuorokauden, niin kuitenkin tällaiset infektiot voivat • « aiheuttaa vakavia komplikaatioita pienissä lapsissa, vanhuksissa sekä piileviä sairauksia potevissa henkilöissä Salmonella-infektion levitessä ruuansulatuskanavasta ► 30 elimistön muihin järjestelmiin, ja se voi johtaa vakavaan sairastumiseen tai jopa kuolemaan.

111015 2

Toisena yleisenä ongelmana ovat näistä bakteereista peräisin olevien endotoksiinien tuottamat immuunivasteet, jotka saattavat aiheuttaa yliherkkyysreaktioita, jotka voivat olla välitöntä tyyppiä (tyyppi 1) sekä viivästynyttä tyyppiä (tyyppi IV, soluvälitteinen tyyppi) olevaa yliherkkyyttä.

5

Alalla esiintyy suurta tarvetta saada käyttöön nopea ja luotettava keino Salmonellan ilmaisemiseksi raaoista ja jalostetuista elintarvikkeista sekä rehuista, jotta teollisuudessa kyettäisiin hallitsemaan elintarvikkeiden kontaminoituminen. Tavanomaiset menetelmät Salmonellan analysoimiseksi näistä elintarvikkeista käsittävät vaiheet, 10 joissa toteutetaan epäselektiivinen rikastus esim. puskuroidussa peptonivedessä, mitä seuraa selektiivinen (eli valikoiva) rikastus elatusalustoissa, jotka helpottavat Salmonellan kasvua ja estävät muiden bakteereiden kasvua, minkä jälkeen seuraa maljaaminen Salmonellan suhteen valikoivalle ja/tai sen osoittavalle agar-alustalle. Tällainen menettelytapa on hankala ja aikaavievä, ja siihen tarvitaan tavallisesti 3-5 15 vuorokautta suuntaa-antavan tuloksen tuottamiseksi.

Vuosien kuluessa alalla on ehdotettu lukuisia menetelmiä Salmonellan nopeammaksi ilmaisemiseksi elintarvikkeista. Esimerkkeinä niistä voidaan mainita entsymaattinen immuunimääritys (EIA) (Beumer et ai., 1991; Notermans ja Wernars, 1991; Emswi-20 ler-Rose et ai., 1991; D’Aoust ja Sewell, 1988b), immuunidiffuusio (D’Aoust ja Sewell, 1988a; Bailey et ai., 1991), lateksiagglutinaatiomääritys (D’Aoust et ai., 1987), hydrofobisen hilamembraanin läpi tapahtuvaan suodatukseen perustuva menetelmä (Entis, 1986), valikoiva, liikkuvuuteen perustuva rikastustekniikka (Holbrook et ai, 1986) sekä johtokykytekniikat (Smith et ai., 1989). Huolimatta 25 siitä, että näillä uusilla tekniikoilla saadaan tuloksia nopeammin (42—48 tunnissa) kuin tavanomaisilla menettelytavoilla, ne on hyväksytty huonosti elintarviketeollisuu-** dessa. Lisäksi Salmonellan määritysmenetelmiä on kuvattu seuraavissa julkaisuissa: FSTA An: 1987 (02): C0025, Journal of Food Protection, voi. 49, 1986, s. 510-514, De Smedt, J.M. et ai., "Rapid Salmonella detection in foods by motility 30 enrichment on a modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium", 3 111015 FSTA An: 1979 (03) : C0148, Journal of Food Science, vol. 43, 1978, s. 1444-1447, Swaminathan, B. et al., "Rapid detection of Salmonellae in foods by membrane filter-disc immunoimmobilization technique", US 4563418 A, EP 214340 B, WO 5 9217607 A ja WO 8804326 A.

Tästä voidaan päätellä, että teollisuudessa tarvitaan menetelmiä, jotka nopeuttavat ja yksinkertaistavat Salmonellan ilmaisemista elintarvikkeista ja rehuista.

Niinpä alalla esiintyy selvää tarvetta saada käyttöön menettelytapa Salmonellan 10 nopeaksi ilmaisemiseksi. Tällaisen menettelytavan tulisi olla herkkä, spesifinen ja luotettava. Toivottava olisi esimerkiksi menettely, jolla voidaan ilmaista jopa vain 1 Salmonella 25 grammassa näytettä 24 tunnissa, väärien positiivisten prosentuaalisen osuuden ollessa alle 10 % ja todellisten positiivisten prosentuaalisen osuuden ollesa vähintään 80 %, tavanomaiseen viljelymenetelmään verrattuna.

15

Keksinnön yhteenveto

Keksijät ovat nyt todenneet yllättäen, että raa’asta elintarvikkeesta otetun näytteen alustava rikastaminen puskuroidussa, Salmonellan suhteen valikoivassa alustassa, 20 37—43 °C:ssa, niinkin lyhyen kuin 19 tunnin ajan on tehokas tapa alkuperäisessä näytteessä läsnäolevan Salmonellan rikastamiseksi siten, että rikastetuilla näytteillä > toteutettu ELISA-määritys on erittäin spesifinen ja vähintään yhtä herkkä kuin tavanomaiset viljelymenetelmät Salmonellan ilmaisemiseksi raaoista tuotteista otetuista näytteistä.

25

Edelleen ollaan todettu, että jalostetuista elintarviketuotteista otetun näytteen alustava . ·* rikastaminen (jopa ei-valikoivassa alustassa), ja sitten, erään ajanjakson kuluttua, lämpötilan nostaminen noin arvosta 37 °C alueelle 40—43 °C, on tehokas tapa • alkuperäisessä näytteessä läsnä olevan Salmonellan rikastamiseksi siten, että rikaste- 30 tuilla näytteillä 19 tunnin kuluttua toteutettu ELISA-määritys on erittäin spesifinen ja vähintään yhtä herkkä kuin tavanomaiset viljelymenetelmät Salmonellan ilmaisemiseksi jalostetuista tuotteista otetuista näytteistä.

111015 4

Rikastuksen jälkeen toteutettavaa määritystä voi edeltää valikoiva jälkirikastus elintarvikkeen sellaisten komponenttien laimentamiseksi, jotka komponentit voivat mahdollisesti häiritä epäspesifisellä tavalla myöhemmin toteutettavia analyysejä. Salmonellan laimenemisen komponsoimiseksi tämä jälkirikastus toteutetaan normaa-5 listi noin 2—6 tunnin pituisen ajanjakson ajan, noin alueella 40—43 °C olevassa lämpötilassa. Erityisemmin, tämän jälkirikastuksen kesto on edullisesti noin alueella 2,0-4,5 tuntia, edullisesti alueella 2,5-3,5 tuntia, jälkirikastuksen keston ollessa kaikkein edullisimmin noin 3 tuntia. Tällaisen valikoivan jälkirikastuksen tarpeellisuus riippuu pääasiassa määritysvaiheessa käytetyn menetelmän tunnusomaisista 10 piirteistä: siinä tapauksessa, että määritys on olennaisesti epäherkkä määritettävässä näytteessä läsnä oleville, muuten häiritseville tai jopa ristireagoiville aineille, tällainen jälkirikastus ei ole tarpeellinen.

Tämä keksintö perustuu edellä mainittuihin ja muihin havaintoihin ja siinä käytetään 15 hyväksi strategiaa, jossa Salmonella rikastetaan valikoivasti heti, kun solut ovat valmiit siihen. Tämän strategian taustalla olevana pääfilosofiana on estää kilpailevan mikroflooran kasvu siten, ettei tämän mikroflooran kasvu pääse peittämään Salmonellaa, ajatellen myös mahdollisuutta ilmaista kilpaileva mikrofloora tässä määrityksessä. Vaikka sen seurauksena, että Salmonellan peittyminen muulla 20 kasvulla estetään esillä olevan keksinnön mukaisella strategialla, Salmonellaan kohdistuukin jossain määrin valikointipainetta, niin kuitenkin keksinnön mukaisesti käytetty tasapainotettu selektiivisyys suosii selvästi Salmonellaa siten, että päästään näytteessä läsnä olevan Salmonellan onnistuneeseen ilmaisemiseen, kuten seuraavasta kuvauksesta ja tarkasteluista ilmenee.

25

Toisella tavalla ilmaistuna, esillä oleva keksintö perustuu pääasiassa siihen, että ·* rikastustoimenpide sovitetaan määritystoimenpiteeseen, eikä siihen, että määritystoi- menpide sovitettaisiin perinteiseen rikastustoimenpiteeseen, viimeksi esitetyn tapauksen ollessa tavanomainen lähestymistapa. Keksinnön erityiset piirteet perustuvat 30 niihin havaintoihin, että 5 111015 kun valikoiva aine, tetrationaatti, yhdistetään korotettuun inkubointilämpöti-laan, niin tällöin päästään erityisen suureen herkkyyteen ja spesifisyyteen ilmaistaessa Salmonellaa, erityisesti raaoista tuotteista, ja 5 kun antibioottinen aine, novobiosiini, yhdistetään korotettuun inkubointiläm- pötilaan, niin tällöin saadaan vastaavia erinomaisia tuloksia erityisesti jaloste-tujen tuotteiden tapauksessa.

Yhteenvetona, keksinnössä on saatu aikaan uudet menetelmät, joiden avulla 10 Salmonella voidaan ilmaista 24 tunnin kuluessa siten, että herkkyys ja spesifisyys ovat hyvin suuret.

Keksinnön mukaisen menetelmän tunnusomaiset piirteet on esitetty patenttivaatimuksissa.

15

Keksinnön yksityiskohtainen yhteenveto

Seuraavassa on esitetty ohessa käytettyjen käsitteiden lukuisia määritelmiä: 20 Erään piirteensä mukaisesti keksinnön kohteena on menetelmä Salmonella-sukuun kuuluvien bakteereiden määrittämiseksi näytteestä, erityisesti raa’asta näytteestä, tämän menetelmän käsittäessä yhden niistä kolmesta rikastustoimenpiteestä 1)—3), jotka on selitetty jäljempänä, sekä määrityksen solujen lisääntymisen jälkeen rikas-tusalustassa läsnä olevan Salmonellan tunnistamiseksi ja/tai määrän selvittämiseksi, 25 tämän määrityksen käsittäessä analyysivaiheen, joka perustuu kohdemolekyylin tai molekyylien välisen vuorovaikutuksen, johon kohdemolekyyli osallistuu, tunnistami-,' * ’ seen ja/tai määrän selvittämiseen, ja tämän määrityksen ollessa erilainen kuin ohessa määritellyt perinteiset agarmaljaustekniikat. Esimerkkeinä tällaisista analyyseista, • jotka perustuvat kohdemolekyylin tai molekyylien välisen vuorovaikutuksen, johon 30 kohdemolekyyli osallistuu, tunnistamiseen ja/tai määrän selvittämiseen, voidaan mainita: määritykset, jotka käsittävät immunologisen reaktio, kuten immuunimääri-tys, esim. radioimmuunimääritys (Radio Immune Assay; Rl A), entsymaattinen 6 111015 immuunimääritys (Enzyme Immune Assay; EI A), entsyymiin kytkettyyn im-muunisorbenttiin perustuva määritys (Enzyme Linked Immune Sorbent Assay; ELISA), fluoresenssi-vasta-aine-tekniikka(Fluorecence Antibody; FA), immuunimääritys, jonka määritysvaiheessa käytetään liposomeja, misellejä tai liposomien kaltaisia 5 hiukkasia, määritys, joka käsittää immuuni-immobilisoinnin, määritys, joka käsittää immuuniagglutinoinnin kuten lateksiagglutinoinnin; analyysit, joissa määritysvaihe käsittää DNA/DNA-hybridisaatiokokeen, RNA/RNA-hybridisaatiokokeen tai DNA/RNA-hybridisaatiokokeen; analyysit, joissa määritysvaihe käsittää polymeraasiketjureaktion (PCR) tai nukleiinihapon vastaavanlaisia in vitro monistamisvaihei-10 ta; sekä analyysit, joiden määritysvaiheessa käytetään peptidimikleiinihappoja (PNA; katso Nielsen P.E. et ai., 1991).

Keksinnön mukaisesti on edullista rajoittaa analyysivaiheen pituutta. Normaalisti tämän analyysin pituuden tulisi olla korkeintaan 7 tuntia, mutta lyhyemmät kestot 15 ovat edullisia, kuten korkeintaan 6, 5, 4, 3, 2 tai 1 tunnin pituiset kestot.

Muita mielenkiintoisia määritysvaiheita, jotka voivat olla keksinnön mukaisen menetelmän osa, on lueteltu seuraavassa: 20 määritysvaiheet, joissa käytetään lektiinejä, tai samankaltaiset analyysit, jotka käsittävät reseptoriin sitoutumista; määritysvaiheet, joissa käytetään bakteriofaageja (joista erityisen mielenkiintoinen mahdollisuus on bakteriofaagi Felix 01); 25 määritysvaiheet, joissa jokin aine saadaan muuttumaan Salmonellan metabolian seurauksena siten, että tuloksena on Salmonellaa sisältävän alustan sähkövastuksen tai impedanssin muuttuminen, ja joissa Salmonella ilmaistaan mittaamalla tämä muutos; 30 7 111015 määritysvaiheet, joissa selvitetään Salmonellan kyky liikkua agarmatriisin päällä tai sen läpi; määritysvaiheet, joiden käsittämä analyysi sisältää suodatusvaiheen, jossa bakteerit 5 erotetaan alustasta ja ne pidättyvät suodattimelle [tähän liittyen, erityisen mielenkiintoinen on analyysi, joka perustuu hydrofobista hilamembraanisuodatinta käyttävään menetelmään (HGMF)]; määritysvaiheet, joiden käsittämässä analyysissä käytetään radiometristä menetelmää; 10 sekä määritysvaiheet, joiden käsittämässä analyysissä käytetään kromatografista erotusta.

Näiden määritysten erityisiä suoritusmuotoja on kuvattu laajasti kirjallisuusviitteissä, 15 jotka on lueteltu tämän kuvauksen sivulla 2.

Alalla tunnetaan suuri joukko tällaisia määrityksiä. Esimerkkiosassa on kuvattu ELISA-määrityksen käyttö, mutta on selvää, että tämän valinnan merkitys on vähäinen keksinnön toteuttamiselle. Esimerkiksi sellaiset määritykset, jotka käsittävät 20 nukleiinihappojen välisen hybridisaation, ovat myös mielenkiintoisia vaihtoehtoja, koska tällaisia määrityksiä voidaan muokata siten, että lajispesifisyys sekä kantas-pesifisyys saadaan hyvin suuriksi. Edelleen, tällaiset määritykset voivat olla epäher-kempiä muista bakteereista tai aineista johtuville häiriöille, jolloin valikoivan jälkirikastuksen tarve pienenee ja jolloin keksinnön mukainen menetelmä muuttuu 25 yksinkertaisemmaksi.

« «

On selvää, että edellä mainitut analyysit ja määritykset ovat "määritysvaiheen" osa, jolla määritysvaiheella tarkoitetaan ohessa menetelmän sitä vaihetta, jossa Salmonella määritetään.

Käsitteillä "määrittää" ja "määrittäminen" tarkoitetaan Salmonellan läsnäolon kvantitatiivista tai kvalitatiivista osoittamista näytteestä. Keksinnön mukaisen 30 111015 s menetelmän tavoitteena on tavallisesti kvalitatiivinen osoittaminen, koska tärkeätä on usein saada pelkästään selville Salmonellan läsnäolo tai sen puuttuminen. Kuitenkin tilanteissa, joissa joko tietynsuuruinen rajallinen kontaminoituminen voidaan hyväksyä tai kvantitatiivinen määritys on sinänsä mielenkiintoinen (esim. analysoitaessa 5 Salmonellan määrää eläimestä tai ihmisestä saadussa näytteessä), tämä määrittäminen voi olla kvantitatiivista. Viimeksimainitussa tapauksessa on tavallisesti välttämätöntä verrata ulkoiseen standardiin, joka sisältää tietyn määrän Salmonellan, ja jota standardia on käsitelty rinnakkain näytteen kanssa.

10 Käytetty analyysimenetelmä voi olla mikä tahansa tarkoituksenmukainen analyysimenetelmä Salmonellan läsnäolon määrittämiseksi. Tämä analyysimenetelmä ei ole kuitenkaan "perinteinen agarmaljaustekniikka", jollaista käytetään monissa standardimenetelmissä Salmonellan ilmaisemiseksi, ja jollainen maljaustekniikka on kuvattu esimerkiksi standardissa ISO 6579.

15

Analyysissä saattaa esiintyä häiriöitä, jotka johtuvat alkuperäisen näytteen sisältämien aineiden ja analyysimenetelmän komponenttien välisistä epäspesifisistä vuorovaikutuksista. Tällaiset häiriöt voivat johtaa sekä vääriin positiivisiin tuloksiin että vääriin negatiivisiin tuloksiin.

20

On selvää, että näiden häiritsevien aineiden aiheuttamat ongelmat johtuvat siitä, että muun kuin mikrobiologisen materiaalin alkuperäinen pitoisuus ensimmäisessä rikastusalustassa on suuri ja pysyy myös suurena koko ensimmäisen rikastuksen ajan, kun taas mikro-organismien (sekä Salmonellan että muiden) lähtöpitoisuus on 25 normaalisti melko pieni. Näin ollen keksinnön mukaisella rikastustoimenpiteellä ei ole mitään vaikutusta jo läsnäolevien aineiden aiheuttamaan häiriöön, kun taas .1 « t keksinnön mukainen rikastustoimenpide poistaa ristireagoivista mikro-organismeista johtuvat höiriöt tai vähentää niitä huomattavasti.

30 Ohessa käytetyllä käsitteellä "ristireaktiivisuus” viitataan muiden kuin Salmonella-bakteerien tai muista kuin Salmonella-bakteereista peräisin olevien molekyylien t tunnusomaiseen kykyyn tuottaa väärä positiivinen tulos tai signaali. Näin ollen "ris- 9 111015 tireaktiivisella mikro-organismilla" on ristireaktiivisimtta tai se "ristireagoi". On selvää, että ristireaktiivisuus johtuu siitä yhteisestä piirteestä, joka esiintyy sekä ristireagoivassa aineessa/mikro-organismissa sekä Salmonellassa, joka on tarkoitus määrittää. Näin ollen ristireaktiivisuus tulisi pitää erillään epäspesifisistä ilmiöistä 5 kuten analyysimenetelmässä läsnäolevien aineiden ja komponenttien välisistä epäspesifisistä vuorovaikutuksista.

Tämän analyysimenetelmän ohella määritysvaihe voi näin ollen käsittää "jälkirikas-tuksen", jolla käsitteellä tarkoitetaan valikoivaa rikastamista siirtämällä materiaalia 10 ensimmäisestä rikastuksesta erääseen tilavuuteen valikoivaa rikastusalustaa, laimentaen tällä tavalla ensimmäiseen rikastukseen käytetyssä alustassa läsnä olevia aineita, jotka saattaisivat muuten häiritä määritystä. Kuten edellä on mainittu, jälkirikas-tuksen tarve riippuu huomattavasti käytetyn analyysimenetelmän tyypistä, ja jälkiri-kastus osoittautuu arvokkaaksi pääasiassa silloin, kun käytetyssä analyysimenetelmäs-15 sä esiintyy edellä mainittuja epäspesifisiä vuorovaikutuksia.

Tässä yhteydessä käsitteellä "signaali" tarkoitetaan analyysimenetelmässä, jolla määritetään Salmonellan valitun ominaisuuden läsnäolo, saatua mitattavaa havaintoa. Tämä ominaisuus voi olla mikä tahansa biologinen tai kemiallinen piirre, joka erottaa 20 Salmonellan niistä muista mikro-organismeista, joita on läsnä näytteessä, josta halutaan määrittää Salmonellan läsnäolo, ja esimerkkeinä näistä piirteistä voidaan mainita DNA-kappaleet, RNA-kappaleet, antigeeniset determinantit, entsyymit, reseptorit sekä muut makromolekyylit.

25 Esillä olevassa kuvauksessa käsitteellä "raja-arvo" tarkoitetaan sitä analyysimenetelmästä saatua vähimmäissignaalia, jota pidetään vielä positiivisena signaalina. Niissä j« · kokeissa, joissa käytetään ELISA-2-tekniikkaa, tämä raja-arvo määritetään kaksi kertaa suuremmaksi kuin se signaali, joka saadaan määritettäessä olennaisesti Salmonellaa sisältämätön, huuhtelunesteestä koostuva näyte, kun taas niissä kokeissa, 30 joissa käytetään ELISA-l-tekniikkaa, tämä raja-arvo määritetään prosentuaaliseksi osuudeksi Salmonellaa sisältävästä, hyvin määritellystä standardinäytteestä (yksityiskohtien suhteen viitataan esimerkkiosaan).

111015 10 Näin ollen, tässä yhteydessä käsitteellä "positiivinen signaali", eli lopullinen tai suuntaa-antava tulos, joka osoittaa näytteen sisältävän Salmonellaa, tarkoittaa valitun raja-arvon yläpuolella olevaa signaalia, ja käsitteellä "negatiivinen signaali", eli lopullinen tai suuntaa-antava tulos, joka osoittaa, ettei näyte sisällä Salmonellaa, 5 tarkoittaa valitun raja-arvon alapuolella olevaa signaalia.

"Oikea positiivinen" signaali tai tulos määritellään ohessa positiiviseksi signaaliksi tai tulokseksi, joka voidaan varmistaa viljelemällä ensimmäisessä rikastuksessa käytettyä, positiivisen signaalin tuottanutta alustaa. Viljely voidaan toteuttaa ohessa 10 esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Vastaavasti, "väärä negatiivinen" signaali tai tulos määritellään sellaiseksi negatiiviseksi signaaliksi tai tulokseksi, jota ei voida valmistaa negatiiviseksi viljelemällä ensimmäisessä rikastuksessa käytettyä, määrityksessä negatiivisen signaalin tuottanutta alustaa.

15 Ohessa käytetyllä käsitteellä "näyte" tarkoitetaan mitä tahansa otosta mistä tahansa sellaisesta lähteestä, joka saattaa sisältää Salmonellaa.. Niinpä keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyt näytteet voivat olla peräisin sellaisista lähteistä kuten raa’asta ja jalostetuista tuotteista (jotka määritellään jäljempänä), mutta myöskin sellaisista lähteistä kuin uloste, mahaneste, virtsa, vesi, imuneste ja aivo-selkäydinneste, ja 20 muita näytteitä ovat elävästä kudoksesta otetut näytteet sekä muut eläimistä, ihminen mukaan lukien, saadut näytteet. Toinen tärkeä näyteryhmä koostuu ympäristöstä peräisin olevista näytteistä, joista voidaan mainita pöly, kerääntymät, nöyhtä ja muut vastaavat.

25 Käsitteellä "tuote" tarkoitetaan kaikkia sellaisia näytteitä, joista halutaan selvittää Salmonellan läsnäolo, kun taas "jalostettu tuote" määritellään tuotteeksi, esimerkiksi »· elintarvikkeeksi tai rehuksi, jota on jalostettu millä tahansa sellaisella tavalla (pakastamista lukuunottamatta), joka saattaa johtaa Salmonellan lähes tappavaan vahingoittumiseen (esim. kuumentamalla, kuivaamalla, kypsentämällä, happamoittamalla), 30 tämän jalostetun tuotteen sisältäessä tyypillisesti alle 5 paino- % jäljempänä määriteltävää raaka-ainetta. Käsitteellä "raaka tuote" tai raaka-aine tarkoitetaan näin ollen tuotetta, jota ei ole jalostettu edellä kuvatulla tavalla. Raakatuote sisältää tyypillisesti 11 111015 — vähintään 5 paino-% raakaa lihaa ja/tai kalaa, ja/tai — vähintään 5 paino-% raakaa munaa, ja/tai — vähintään 5 paino-% raakamaitoa, ja/tai — vähintään 5 paino-% raakoja vihanneksia ja/tai hedelmiä, ja/tai 5 — vähintään 5 paino-% ympäristönäytettä, joka on peräisin esimerkiksi viemä ristä, sekä ulostetta.

Ensin tarkastellaan rikastustoimenpidettä 1). Tässä rikastustoimenpiteessä näyte siirretään Salmonellaa varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on 10 puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, ja johon kasvualustaan lisätään tet-rationaattia ja/tai muuta valikoivaa ainetta tai sitä tuotetaan tässä alustassa joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän siirtämisen kanssa tai sen jälkeen, ja tuloksena olevaa seosta pidetään korkeintaan 38 °C:n lämpötilassa erään ajanjakson ajan näytteen siirtämisen jälkeen (esirikastusjakso), minkä jälkeen seoksen lämpötila 15 nostetaan alueella 39—43 °C ja seosta pidetään tässä alueella 39—43 °C olevassa korotetussa lämpötilassa erään ajanjakson ajan lämpötilan korottamisen jälkeen (rikastusjakso). Rikastustoimenpiteen 1) tunnusomaisena piirteenä on valikoivan aineen, erityisesti tetrationaatin käyttö.

20 Edellä kuvatussa rikastustoimenpiteessä ja muissa esillä olevan keksinnön mukaisissa rikastustoimenpiteissä käytetty kasvualusta on alusta, joka sisältää assimiloituvien perusravinteiden lähteet, mikroravinteitä sekä olennaisia kasvutekijöitä. Alustan osmoottisen paineen tulisi sopia Salmonellan viljelyyn ja alusta tulisi olla puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon. Edullista on, ettei alusta sisällä sokereita tai 25 että se on olennaisesti sokeritonta, tai mikäli alusta sisältää sokereita, niin niiden pitoisuus on sopeutettu alustan puskurikapasiteettiin siten, ettei alustan pH joudu pois . « · edellä mainitulta alueelta näiden sokereiden käymisen seurauksena syntyvien happojen muodostumisesta johtuen, ei ainakaan ensimmäisten 10—12 tunnin aikana. Erinomainen, nämä kriteerit täyttävä alusta on puskuroitu peptonivesi (BPW).

Ohessa käsitteellä "rikastus" tarkoitetaan yksinkertaisesti viljelemistä Salmonellalle sopivassa vesipitoisessa kasvualustassa, joka helpottaa Salmonellan lisäätymistä, kun 30 12 111015 taas "esirikastuksella" tarkoitetaan edeltävää viljelyä sellaisessa lämpötilassa, joka on alempi kuin esirikastuksen jälkeen toteutettavan rikastuksen aikana vallitsevat lämpötilat. "Alustava rikastus" on olennaisesti ensimmäinen viljely Salmonellalle sopivassa vesipitoisessa kasvualustassa, joka alustava rikastus tapahtuu ensimmäisten 5 15—30 tunnin aikana.

Rikastustoimenpiteen 1) pääasiallisena strategiana on käyttää valikoivaa ainetta toimenpiteen varhaisessa vaiheessa muiden kuin Salmonella-bnkteereiden alistamiseksi inhiboiviin olosuhteisiin mahdollisimman nopeasti, säätäen samalla valikoivan 10 aineen pitoisuus ja muut olosuhteet, lämpötila mukaan lukien, sellaisiksi, että Salmonella inhiboituu vain vähän, ja sitten, kun Salmonella on sopeutunut näihin olosuhteisiin, näitä valikoivia olosuhteita kiristetään nostamalla lämpötilaa, jolloin Salmonellan kasvunopeus todetaan hyväksi verrattuna moniin muihin kuin Salmonella-bakteeieMn, ja lisäksi nämä muut kuin Salmonellat pyrkivät tuottamaan 15 vähemmän vääriä positiivisia tuloksia, mikä johtuu esimerkiksi flagellojen heikommasta kehittymisestä, jotka flagellat saattavat häiritä esimerkiksi myöhemmässä ELISA-määrityksessä. Vaikka tämän esirikastusjakson pituus voikin vaihdella 10 minuutista 8 tuniin, niin se on normaalisti kuitenkin 0,5 tunnista 7 tuntiin, ja usein 1 tunnista 6,5 tuntiin, esimerkiksi alueella 2—6 tuntia, erityisesti 3—5 tuntia. 20 Tämän esirikastusjakson edullinen pituus on noin 4 tuntia.

* *v Tässä edellä kuvatussa rikastustoimenpiteessä (sekä muissa, ohessa kuvatuissa rikastustoimenpiteissä) valikoiva aine voidaan tuottaa kasvualustassa tietyllä hetkellä rikastamisen aloituksen jälkeen. Keksinnön mukaisesti tämän valikoivan aineen 25 tuottaminen on edullisella tavalla olennaisesti välitöntä, mutta se voi olla myös vähitellen etenevä prosessi, jossa valikoivan aineen pitoisuus kasvaa hitaasti. Kun valikoiva aine on tetrationaatti, niin tällöin tetrationaattia tuotetaan pitämällä alustassa tiosulfaattia ja lisäämällä myöhemmin jodia, jolloin alustaan saadaan tetrationaattia.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "valikoivat keinot" tarkoitetaan tapaa helpottaa Salmonellan kasvua suhteessa useimpien muiden mikro-organismien (muiden kuin 30 i 111015 13

Salmonella-bakteereiden) kasvuun vesipitoisessa kasvualustassa, eli tämä valikoiva keino voi olla aine (valikoiva aine), joka riittävän suurena määränä Salmonellan kasvualustaan lisättynä estää Salmonellan kasvua olennaisesti vähemmän kuin useimpien muiden mikro-organismien kasvua, tai valikoiva keino voi olla fysikaali-5 sen parametrin, esim. lämpötilan säätäminen arvoon, joka estää Salmonellan kasvua olennaisesti vähemmän useimpien muiden mikro-organismien kasvuun verrattuna. Valikoivalla keinolla tarkoitetaan lisäksi sellaista menettelytapaa, joka takaa sen, ettei alkuperäisen näytteen tai muiden ristireaktiivisten mikro-organismien tai molekyylien läsnäolo häiritse valittua, rikastuksen, jossa käytetään jotakin valikoivaa keinoa, jäl-10 keen toteutettavaa määritysmenetelmää Salmonellan läsnäolon ilmaisemiseksi.

Näin ollen "valikoiva rikastus" tarkoittaa rikastustoimenpidettä, jossa käytetään valikoivaa keinoa, ja vastaavasti "ei-valikoiva rikastus" on rikastustoimenpide, jossa ei käytetä valikoivia keinoja.

15

Huomattakoon, että myös muita mikro-organismeja voi hyvinkin olla läsnä määritetyssä näytteessä ja niiden pitoisuus voi olla suurempi kuin määrityksen kohteena olevan Salmonellan pitoisuus, mutta nämä mikro-organismit eivät häiritse valittua määritysmenetelmää, koska niiden ristireaktiivisuus on tukahtunut rikastustoimenpi-20 teen seurauksena.

"Alustavalla valikoivalla rikastuksella" tarkoitetaan alustavaa rikastusta, joka muunnetaan valikoivaksi rikastukseksi tämän alustavan rikastuksen ensimmäisten 8 tunnin aikana.

25

Yhtäpitävästi edellä olevan selityksen kanssa käsitteillä "rikastusalusta", "rikastusvä- G » < liaine", "alustavan rikastuksen alusta", "alustavan rikastuksen väliaine", "valikoivan rikastuksen alusta", "valikoivan rikastuksen väliaine", "alustavan, valikoivan rikastuksen alusta" ja "alustavan, valikoivan rikastuksen väliaine", tarkoitetaan elatusalus-30 toja tai väliaineita, joita käytetään vastaavissa rikastuksissa.

111015 14

On selvää, että alustavan valikoivan rikastuksen pääasiallisena tavoitteena on tuottaa riittäviä määriä Salmonellaa siten, että Salmonellan läsnäolo voidaan määrittää, tämän läsnäolon tuottaessa positiivisen signaalin määritysmenetelmässä, jolla selvitetään, onko alkuperäisessä näytteessä mahdollisesti läsnä Salmonellaa. Rikastustoi-5 menpide tulisi näin ollen arvioida sen perusteella, voidaanko sen avulla alkuperäinen pieni Salmonella-pitoisuus rikastaa lopulliseksi Salmonella-pitoisuudeksi, joka on riittävän suuri määrityksen onnistunutta suorittamista ajatellen. Näin ollen rikastustoi-menpiteen ja Salmonella-määrityksen käsittävän yhdistelmämenetelmän herkkyys riippuu rikastuksen tehokkuudesta sekä käytetyn määritysmenetelmän herkkyydestä.

10

Ohessa käytetty käsite "herkkyys" määritellään menetelmän kyvyksi ilmaista Salmonella, mikäli sitä on läsnä, alkuperäisestä näytteestä. Kun todetaan, että menetelmän herkkyys on parempi kuin tavanomaisella menettelytavalla, niin tällä tarkoitetaan sitä, että menetelmällä saadaan tilastollisesti enemmän oikeita positiivisia 15 tuloksia kuin tavanomaisella menettelytavalla analysoitaessa suuria määriä satunnais-näytteitä.

Rikastusjakson kesto on normaalisti sellainen, että esirikastusjakson pituuden ja rikastusjakson pituuden summa on alueella 10—48 tuntia, edullisesti 15—30 tuntia, 20 erityisesti 17—24 tuntia, minä aikana näytteessä mahdollisesti läsnäoleva Salmonella lisääntyy normaalisti hyväksyttävälle tasolle, rikastustoimenpiteen kokonaiskeston ollessa samalla kuitenkin tyydyttävän lyhyt. On selvää, että aina kun ohessa tarkastellaan esirikastus- ja rikastusjaksoja, niin mainitut jaksot ovat kokonaisaikoja kyseisissä olosuhteissa; esirikastus- tai rikastusjakso voidaan keskeyttää, esimerkiksi 25 lisättäessä tai tuotettaessa valikoivaa ainetta, tai muista syistä, mikä ei ole kuitenkaan . normaalisti edullista.

• · Näin ollen tetrationaatin sopivan pitoisuuden ja alueella 39—43 °C olevan lämpötilan yhdistelmällä voidaan päästä toisaalta Salmonellan erinomaiseen kasvuun ja toisaalta 30 muista kuin Salmonella-bakteereista johtuvien ristireaktioiden, jotka aiheuttaisivat vääriä positiivisia tuloksia, hyvin olennaiseen tukahtumiseen. Vaikka periaatteessa tetrationaatin pitoisuus tässä seoksessa voikin olla noin alueella 5—40 mM tai jopa 111015 15 tämän alueen ulkopuolella, niin kuitenkin normaalisti tetrationaatin pitoisuus on noin alueella 7—35 mM, tavallisesti noin alueella 9—30 mM ja edullisesti noin alueella 11—28 mM, esimerkiksi noin alueella 13—26 mM, kuten noin 14—25 mM, edullisesti noin alueella 15—23 mM ja monissa tapauksissa noin alueella 16—22 mM, 5 erityisesti noin alueella 17—21 mM, kuten esimerkiksi noin 18—20 mM. Tetrationaatin kaikkein edullisin pitoisuus on noin 19 mM. Kuten edellä on mainittu, kyseisessä tilanteessa valittava erityinen pitoisuus riippuu erityisesti lämpötilasta sekä muiden valikoivien aineiden mahdollisesta läsnäolosta. Tetrationaatin mielenkiintoinen täydentäjä on novobiosiini, jota voidaan lisätä Proteus-lajin ja monien Gram-10 positiivisten bakteereiden tukahduttamiseksi. Novobiosiinin optimaalinen määrä on noin 2,5 ^g/ml. Suuntaa-antavasti voidaan todeta, että edullinen, alueella 39—43 °C oleva lämpötila on 40—42 °C rikastusjakson vähintään olennaisen osan aikana, erityisesti alueella 40,5—41,5 °C, kaikkein edullisimmin 41 °C.

15 Vaikka alusta puskuroidaankin alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon rikastustoimen-piteen alussa, niin kuitenkaan ohessa ei voida poissulkea sitä mahdollisuutta, että erikoistapauksissa, esim. käsiteltäessä näytteitä, joiden pH voi olla hapan, kuten raakamaitotuotteita, pH ei pysy tällä alueella koko rikastustoimenpiteen aikana, vaikka yleisesti edullista onkin se, että läsnä on riittävästi puskurikapasiteettia pH:n 20 pitämiseksi tällä alueella. Mainitun alueen puitteissa pH pidetään edullisesti osa-alueella 6,7-7,3, erityisesti juuri noin arvossa 7,0.

t

Tetrationaattia tai muuta valikoivaa ainetta kuten novobiosiinia on edullisesti läsnä alustassa ennen näytteen lisäämistä alustaan. Tetrationaatin tapauksessa huomatta-25 koon, että tämä aine tuotetaan normaalisti in situ lisäämällä alustaan jodia, jolloin jodi reagoi alustaan edeltäkäsin lisätyn tiosulfaatin kanssa. Kuitenkin on selvää, että « c tetrationaattia ja/tai muuta valikoivaa ainetta voidaan lisätä alustaan tai tuottaa siinä sen jälkeen, kun näyte on lisätty alustaan, mikä ei ole kuitenkaan normaalisti edullista. Tässä tapauksessa valikoivan aineen lisääminen tai tuottaminen tapahtuu 30 normaalisti korkeintaan neljän tunnin kuluessa siirtämisen jälkeen, sopivasti korkeintaan 2 tunnin kuluessa siirtämisen jälkeen, edullisesti korkeintaan 1 tunnin kuluttua 111015 16 siirtämisen jälkeen tai kaikkein edullisimmin korkeintaan 10 minuutin kuluttua siirtämisen jälkeen.

Vaikka seleniitti, kuten natriumvetyseleniitti (jota kutsutaan seuraavassa seleniitiksi) 5 onkin normaalisti Salmonellan rikastuksessa käytetty valikoiva aine, mukaan lukien standardimenettelytapa, esim. AOCA, niin seleniitti ei ole kuitenkaan edullinen aine oheisessa yhteydessä, erityisesti koska siihen liittyvät ongelmana väärät positiiviset tulokset. Tästä syystä on edullista, ettei rikastusalustassa ole läsnä seleniittiä, tai että seleniitin mahdollinen läsnäolo rajoitetaan sellaiseen pitoisuuteen, joka vastaa 10 korkeintaan 0,5 % p/t natriumvetyseleniittiä sisältävässä liuoksessa olevaa seleniitti-pitoisuutta.

Alustavasta valikoivasta rikastuksesta ja sitä seuraavasta, Salmonellan läsnäolon määrityksestä muodostuvan yhdistelmän tärkeä piirre on sen spesifisyys; on selvää, 15 että tällaisesta yhdistelmämenetelmästä voidaan saada myös sellaisia positiivisia tuloksia, jotka eivät johdu Salmonellan läsnäolosta. Tästä syystä keksinnön mukaisten menetelmien kaltainen menetelmä tulisi arvioida myös sen suhteen, kyetäänkö siinä välttämään vääriä negatiivisia tuloksia. Niinpä rikastustoimenpiteen olosuhteet sovitetaan määritykseen siten, että päästään hyvälaatuiseen määritykseen.

20

Ohessa käytetyllä käsitteellä "spesifisyys" viitataan menetelmän kykyyn olla tuottamatta vääriä positiivisia tuloksia tai signaaleja. On selvää, että sellainen menetelmä, joka tuottaa vain vähän vääriä positiivisia tuloksia tai signaaleja, on erittäin spesifinen menetelmä.

25 Tämän sovittamisen helpottamiseksi on kehitetty joukko yksinkertaisia ja toistettavia * « kokeita. Kahdessa tällaisessa kokeessa käytetään helposti saatavia standardipuhdasvil-jelmiä, joita on saatavana kansallisista kokoelmista, kuten kantakokoelmasta ATCC: 30 Koe 1) on koe, jolla selvitetään menetelmän kyky ilmaista Salmonella ja se toteutetaan toteuttamalla edellä kuvatut rikastus- ja määritystoimenpiteet siten, että valikoivaan rikastusalustaan siirrostetaan Salmonella-kantaa noin 15 solua/ml olevaksi 111015 17 lähtöpitoisuudeksi ja tähän rikastusalustaan lisätään rikastusjakson alussa 10 % satunnaisesti valittua raakaa jauhelihaa, ja tätä tuloksena saatua seosta pidetään rikas-tusjaksolle sopivassa lämpötilassa tai lämpötiloissa, ja menetelmän katsotaan läpäisevän tämän kokeen, mikäli se tuottaa määrityksessä positiivisen tuloksen vähin-5 tään 90 %:ssa kaikista tapauksista, testattaessa joukkoa satunnaisesti valittuja Sia/mon^/a-serotyyppejä.

Koe 2) on koe, jolla selvitetään menetelmän kyky olla tuottamatta vääriä positiivisia tuloksia, ja se toteutetaan toteuttamalla edellä kuvattu rikastustoimenpide ja määritys 10 siten, että valikoivaan rikastusalustaan siirrostetaan rikastusjakson alussa yhtä seuraavista ei-Salmonella-lajm kannoista

Citrobacter freundii,

Escherichia coli ja 15 Enterobacter cloacae, noin 100 solua/ml olevaksi lähtöpitoisuudeksi, jolloin valikoiva rikastusalusta ei sisällä olennaisesti muita mikro-organismeja kuin näitä siirrostettuja d-Salmonella-kantoja, minkä jälkeen tätä tuloksena saatua seosta pidetään rikastusjaksolle sopivassa 20 lämpötilassa tai lämpötiloissa, ja menetelmän katsotaan läpäisevän tämän kokeen, mikäli määrityksessä väärien positiivisten prosentuaalinen osuus on korkeintaan t 15 % kunkin lajin tapauksessa, kun kokeessa määritetään näiden ti-Salmonella-\z)\tn joukosta satunnaisesti valitun 20 kannan joukkoa.

25 On selvää, että mikäli erityinen koejärjestely ei läpäise jompaa kumpaa tai kumpaakaan koetta, niin alan asiantuntija kykenee hienosäätämään rikastuksen olosuhteet t · t määrityksen olosuhteisiin sopiviksi, esimerkiksi rikastuslämpötilan ja/tai valikoivan aineen pitoisuuden suurentaminen ja/tai esirikastusajan lyhentäminen kokeen (2) tapauksessa tuottaa liikaa vääriä positiivisia tuloksia, ja esimerkiksi vähentämällä 30 valikoivien keinojen tiukkuutta väärien negatiivisten tulosten välttämiseksi kokeessa (Ϊ).

111015 18

Vaikka kokeessa 1 oikeiden positiivisten tulosten osuus on vähintään 90 %, niin kuitenkin on edullista, että tämä osuus on suurempi, esimerkiksi 92 % tai 95 % tai paremmin 97 % tai jopa 99,5 % tai paremmin 99,9 % kokeessa 1.

5 Lisäksi kokeessa 2 väärien positiivisten tulosten osuus ei saa olla enemmän kuin 15 %, edullisesti 12 % tai 10 % tai edullisemmin 7 % tai 5 %, tämän osuuden ollessa niinkin pieni kuin 1 % tai 0,5 %.

Lopullisempi koe käsittää menetelmän ja järjestelyn kalibroinnin standarditoimenpi-10 teeseen NMKL nro 71 nähden (Nordic Committe on Food Analysis, menetelmä nro 71, 1991, neljäs laitos), paitsi että ohessa määriteltyä RVS:ää käytetään ohessa määritellyn RV:n sijasta, ja RVS:ää inkuboidaan 42 °C:ssa, ja että ohessa määriteltyä XLD:tä käytetään myös maljausalustana siten, että määrityksessä saadaan vähintään 80 % oikeita positiivisia tuloksia, kuten ohessa on määritelty, standarditoi-15 menpiteeseen verrattuna, ja siinä saadaan korkeintaan 10 % vääriä positiivisia tuloksia, kuten ohessa on määritelty, kun testataan 100 jauhelihanäytettä (koe 3), näissä kummassakin kokeessa testattavan näyteosan painon ollessa 25 g, jotka 100 näytettä on saatu 10 eri vähittäismyyjältä, joilta kultakin saatiin 10 eri näytettä, ja 20 saatuun näytteeseen oli siirrostettu noin 15 Salmonella typhimurium -solua näytettä 20 kohden ja 20 saatuun näytteeseen oli siirrostettu noin 15 Salmonella enterititis -solua näytettä kohden.

t Tällaisessa kalibroinnissa vähimmäisvaatimuksena saattaa olla, että keksinnön mukaisessa menetelmässä oikeiden positiivisten tulosten osuus on 80 % standarditoi-25 menpiteeseen verrattuna, mutta tavoite on usein suurempi kuten 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % tai jopa 100 % tai jopa enemmän oikeita positiivisia e » c ··· tuloksia.

Keksinnön mukaisen menetelmän eräs etu on se, että se vähintään ilmaisuun tarvitta-30 vaa kokonaisaikaa standarditoimenpiteeseen verrattuna. Niinpä rikastustoimenpiteen ja määritysvaiheen summa on normaalisti korkeintaan 56 tuntia (esimerkiksi korkein 111015 19 taan 48 tuntia, 40 tuntia, 34 tuntia, 32 tuntia, 28 tuntia), mutta realistisemmilla suoritusmuodoilla saadaan normaalisti tuloksia 24 tunnissa tai jopa 22 tai 20 tunnissa.

Edellä kuvattua menetelmää käytetään edullisesti määritettäessä Salmonellan läsnäolo 5 näytteistä, jotka poikkeavat jalostetuista tuotteista, eli jotka ovat edellä esitetyn määritelmän mukaisia raakoja tuotteita.

Seuraavassa kuvataan rikastustoimenpide 2). Tässä toimenpiteessä näyte siirretään Salmonellan varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu 10 alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, näytteen sisältävää kasvualustaa pidetään alueella 39—42,5 °C olevassa lämpötilassa ja siilien lisätään tetrationaattia ja/tai muuta valikoivaa ainetta tai sitä tuotetaan tähän alustaan joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän siirtämisen kanssa tai korkeintaan 8 tuntia siirtämisen jälkeen, ja tuloksena olevaa seosta pidetään alueella 39—42,5 °C olevassa 15 lämpötilassa erään ajanjakson ajan näytteen siirtämisestä lähtien (esirikastusjakso).

Tämän rikastustoimenpiteen strategiana on käyttää lämpötilaa pääasiallisena valikoivana parametrinä heti rikastustoimenpiteen alusta lähtien, ja tetrationaattia ja/tai muuta valikoivaa ainetta lisätään sovitettuina määrinä edullisesti niin pian kuin 20 käytännössä on mahdollista. Tämän strategian yksityiskohtien, sen määritykseen sovittamisen sekä kokeiden 1)—3) suhteen viitataan edellä rikastustoimenpiteen - · - 1) yhteydessä esitettyyn tarkasteluun sekä patenttivaatimuksiin. Rikastustoimenpiteen 2) tärkeä muunnos on kuitenkin se, jossa novobiosiinia lisätään alustaan ainoaksi valikoivaksi aineeksi ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti siirtämisen kanssa 25 tai siirtämisen jälkeen, novobiosiinin määrän ollessa tässä tapauksessa noin alueella 1—100 /ig/ml, erityisesti 1—20 /ig/ml, erityisesti 2—13 ^g/ml. Tässä tapauksessa • * < -- rikastuslämpötila on edullisesti 40—42 °C.

Lopuksi rikastustoimenpiteessä 3) näyte siirretään Salmonellan varten tarkoitettuun 30 vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, tähän alustaan lisätään tetrationaattia tai sitä tuotetaan tässä alustassa joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän siirtämisen kanssa tai korkeintaan 8 tuntia 111015 20 siirtämisen jälkeen, ja tuloksena olevaa seosta pidetään noin alueella 36,0—39,0 °C olevassa lämpötilassa erään ajanjakson ajan näytteen siirtämisen jälkeen (esirikastus-jakso). Samoin tämän toimenpiteen yhteydessä viitataan soveltuvin osin edellä toimenpiteen 1) yhteydessä esitettyyn tarkasteluun, tämän toimenpiteeseen 3) 5 liittyvien tärkeiden poikkeusten ollessa, että toimenpiteellä 3) saadaan parhaat tulokset pitämällä lämpötila alueella 36—39 °C, ja että tetrationaattia pitäisi lisätä tai tuottaa noin 1 tunnin, edullisesti 5 minuutin kuluessa näytteen lisäämisestä.

Kaikki edellä kuvatut muunnokset ovat pääasiassa käyttökelpoisia raakojen näytteiden 10 yhteydessä, joten keksinnön toisen pääpiirteen kohteena on menetelmä Salmonellan rikastamiseksi ja määrittämiseksi erityisesti jalostetuista tuotteista. Tämä piirre, jota tarkastellaan seuraavassa, käsittää rikastustoimenpiteen toteuttamisen, jossa rikastus-toimenpiteessä joko 15 a) näyte siirretään Salmonellan varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, ja joka alusta ei sisällä olennaisesti lainkaan bakteereiden kasvua estävää ainetta, tuloksena olevaa seosta pidetään korkeintaan 39,0 °C:n lämpötilassa vähintään 1 minuutin pituisen ajanjakson ajan (esirikastusjakso), ja sitten 20 seoksen lämpötila nostetaan alueella 39,5—43 °C ja siihen lisätään valinnaisesti novobiosiinia ja/tai muuta valikoivaa ainetta, ja seosta pidetään tässä korotetussa, alueella 39,5—43 °C olevassa lämpötilas-25 sa erään ajanjakson ajan lämpötilan korottamisen jälkeen (valikoiva rikastus- jakso), tai • « b) näyte siirretään Salmonellan varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, tähän alustaan 30 lisätään novobiosiinia ja/tai toista valikoivaa ainetta joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän siirtämisen kanssa tai siirtämisen jälkeen, ja tuloksena saatua seosta pidetään tässä korkeintaan 39,0 °C olevassa 111015 21 lämpötilassa erään ajanjakson ajan siirtämisestä tai novobiosiinin tai muun valikoivan aineen lisäyksestä alkaen, riippuen siitä, kumpi niistä tapahtui myöhemmin (esirikastusjakso), ja sitten 5 seoksen lämpötila nostetaan alueella 39,5—43 °C ja siihen lisätään valinnai sesti novobiosiinia ja/tai muuta valikoivaa ainetta, ja seosta pidetään tässä korotetussa, alueella 39,5—43 °C olevassa lämpötilassa erään ajanjakson ajan lämpötilan korottamisen jälkeen (valikoiva rikastus-10 jakso), tai c) näyte siirretään Salmonellaa varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, tähän alustaan lisätään novobiosiinia joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän 15 siirtämisen kanssa tai siirtämisen jälkeen, ja tuloksena saatua seosta pidetään korkeintaan 39,0 °C olevassa lämpötilassa erään ajanjakson ajan siirtämisestä tai novobiosiinin tai muun valikoivan aineen lisäyksestä alkaen, riippuen siitä, kumpi niistä tapahtui myöhemmin (esirikastusjakso), ja sitten 20 toteutetaan määritys rikastamisen jälkeen alustassa läsnäolevan Salmonellan tunnistamiseksi ja/tai määrän selvittämiseksi.

Keksinnön tämän piirteen taustalla oleva strategia on periaatteessa sama kuin ensiksi mainitun piirteen taustalla oleva strategia, toisin sanoen, että näytettä tulisi käsitellä 25 valikoivilla keinoilla heti, kun Salmonella on valmis siihen, mutta esillä olevassa piirteessä kiinnitetään erityistä huomiota siihen, että jalostetun näytteen sisältämä • ·

Salmonella on vahingoittunut lähes tappavasti ja se pitää elvyttää sopivalla tavalla, ennen kuin sitä voidaan käsitellä selvästi valikoivilla keinoilla.

30 Keksinnön tämän piirteen mukaiset rikastustoimenpiteet oletetaan ainutlaatuisiksi ja edullisiksi, ei yksinomaan sen määritysmenetelmän (määritelty edellä) yhteydessä, « johon menetelmään niitä sovelletaaan, vaan yleisesti yksinomaan rikastusmenetel- 111015 22 minä, joita voidaan käyttää tavanomaisten valikoivien rikastusalustojen (kuten jäljempänä määriteltyjen RV- ja TTB-alustojen) sekä tavanomaisen agarmaljauksen yhteydessä. Kuitenkin, useimmissa tapauksissa määritys käsittää edullisesti analyysi-vaiheen, joka perustuu kohdemolekyylin tai molekyylien välisen vuorovaikutuksen, 5 johon kohdemolekyyli osallistuu, tunnistamiseen ja/tai määrän selvittämiseen, tämän analyysivaiheen ollessa erilainen kuin ohessa määritellyt agarmaljaustekniikat, erityisesti raakoihin tuotteisiin liittyvän piirteen yhteydessä esitettyyn tarkasteluun viitaten.

10 Kunkin rikastustoimenpiteen olosuhteet on sovitettu edullisesti määritykseen siten, että — koe (koe 4) käsittää rikastustoimenpiteen ja määrityksen, ja siinä vesipitoiseen kasvualustaan on siirrostettu Salmonella-kaman lämpökäsiteltyjä soluja noin 15 1000 lämpökäsiteltyä solua/ml olevaksi pitoisuudeksi, ja alustaan on lisätty 5 % rasvatonta kuivamaitoa rikastustoimenpiteen alussa, jolloin määrityksestä saadaan positiivinen tulos 90 %:ssa kaikista tapauksista, joissa testattiin joukkoa satunnaisesti valittuja Salmonella-serotyyppejä, ja 20 — koe 5 käsittää rikastustoimenpiteen ja määrityksen, ja siinä vesipitoiseen kasvualustaan on siirrostettu rikastusjakson alussa yhtä seuraavista ei-Salmonella-lajin kannoista

Citrobacter freundii, 25 Escherichia coli ja

Enterobacter cloacae,

• * I

noin 100 solua/ml olevaksi lähtöpitoisuudeksi, jolloin määrityksessä väärien positiivisten tulosten prosentuaalinen osuus on korkeintaan 25 % kunkin lajin 30 tapauksessa, kun kokeessa määritetään näiden ei-Salmonella-h.]ien joukosta satunnaisesti valitun 20 kannan joukkoa.

111015 23

Edellä mainittu solujen lämpökäsittely tulisi toteuttaa 10 minuutin ajan vedessä, jonka lämpötila on 51 °C, ja joka sisältää 0,85 % NaCl:ia.

Myös tähän piirteeseen liittyen, kalibrointi standardin mukaiseen viljelytoimenpitee-5 seen NMKL nro 71 nähden (Nordic Committe on Food Analysis, menetelmä nro 71, 1991, neljäs laitos), toteutetaan siten, että määrityksessä saadaan vähintään 80 % oikeita positiivisia tuloksia standarditoimenpiteeseen verrattuna, ja että siinä saadaan korkeintaan 10 % vääriä positiivisia tuloksia, kuten ohessa on määritelty, testattaessa (koe 6) yhteensä sellaista 50 näytettä, jotka koostuvat 50 g:sta maitojauhetta, jotka 10 on valittu satunnaisesti erän ja tyypin suhteen, ja joista näytteistä kukin on jaettu kahdeksi 25 gramman osaksi, joista osista kulloinkin yhtä käytetään näytteenä keksinnön mukaisessa, erityisesti jalostetuille tuotteille tarkoitetussa menetelmässä Salmonellan rikastamiseksi, ja kulloinkin toista käytetään näytteenä standardin mukaisessa viljelytoimenpiteessä, kontaminoiden 25 näistä yhteensä 50:stä 15 25 gramman osasta muodostuvasta parista seuraavalla tavalla: — parin yhtä 25 gramman osaa, jota käsiteltiin standardin mukaisella viljelytoi-menpiteellä, täydennetään lisäämällä menettelyyn kuuluvan rikastustoimenpi-teen alussa toimenpiteessä käytettyyn vesipitoiseen kasvualustaan 0,1—1 g 20 rasvatonta kuivamaitoa, joka sisältää noin 5 CFU Salmonella panama- tai

Salmonella typhimurium -bakteeria, ( — parin toista 25 gramman osaa, jota käsiteltiin keksinnön mukaisella menetelmällä Salmonellan rikastamiseksi ja määrittämiseksi erityisesti jalostetuista 25 tuotteista, täydennetään lisäämällä menettelyyn kuuluvan rikastustoimenpiteen alussa toimenpiteessä käytettyyn vesipitoiseen kasvualustaan 0,1—1 g ras- # · ·· vatonta kuivamaitoa, joka sisältää noin 5 CFU Salmonella panama- tai

Salmonella typhimurium -bakteeria.

30 "CFU" (colony forming units; pesäkkeitä muodostavat yksiköt) määritetään käyttämällä tavanomaista laimennus- ja maljaustekniikkaa.

111015 24

Kokeissa 4)-6) tavoitteena olevien tulosten suhteen viitataan siihen edellä erityisesti raakojen tuotteiden yhteydessä esitettyyn tarkasteluun, kuitenkin niin, että koe 5 on yleisesti jonkin verran vähemmän tiukka kuin vastaava edellä tarkasteltu koe 2), mikä todetaan asiaanliittyvistä patenttivaatimuksista.

5

Muunnoksessa a) tai muunnoksessa b), esirikastusjakso on normaalisti vähintään 0,5 tuntia, kuten 1—10 tuntia, edullisesti 1—8 tuntia, erityisesti 2—6 tuntia, kuten 3-5 tuntia ja kaikkein edullisimmin 3,5-4,5 tuntia. Esirikastusjakso kestää erityisen edullisesti noin 3 tuntia.

10

Koko rikastusjakson, määritysvaiheen pituuden ja määritysmenetelmien luonteen suhteen viitataan edellä esitettyyn tarkasteluun.

Kaikissa edellä kuvatuissa piirteissä, näyte preparoidaan kulloinkin kysymyksessä 15 olevassa maassa voimassaolevien, siihen erityiseen tuotealueeseen, josta näyte on peräisin, kohdistuvien säännösten mukaisesti. Niinpä näytteen käsittelyyn voi liittyä jauhamista, hienonnusta, homogenisointia ja muita vastaavia hyvin tunnettujen standardimenetelmien mukaisesti.

20 ESIMERKIT

Materiaalit ja menetelmät

Koska Salmonella on määritettävä niinkin pienistä pitoisuuksista kuin yksi bakteeri 25 25 grammassa ruokaa, niin näyte on rikastettava ennen ELISA-analyysiä.

• « • · Esimerkeissä käytetty rikastustoimenpide koostuu valikoivasta alustavasta rikastukses- ta (15—30 tuntia) edellä kuvattujen periaatteiden mukaisesti sekä eräissä esimerkeissä määritysvaiheen osan muodostavasta jälkirikastuksesta muokatussa M-elatusalustassa 30 myöhempiä analyyseja mahdollisesti häiritsevien elintarvikekomponenttien laimentamiseksi. Salmonellan laimenemisen kompensoimiseksi tämä jälkirikastus kestää normaalisti noin 2—6 tunnin pituisen ajanjakson ajan ja se toteutetaan alueella 40- 111015 25 43 °C olevassa lämpötilassa. M-elatusalustan muokkaus käsittää joko tetrationaatin tai novobiosiinin lisäyksen.

Niinpä koko rikastustoimenpide voidaan toteuttaa yhteensä noin 15—36 tunnissa.

5 Jäljempänä esitetyissä esimerkeissä kuvatuissa kokeissa käytettiin seuraavia alustoja: API-20E-järjestelmä: Bio Merieux 20100.

10 BGA: Brilliantgreen agar (Merck 7273/Oxoid CM 329).

BPW: Puskuroitu peptonivesi (Gibco 152-03812/Oxoid CM501).

15 Konjugaatti 1: Salmonellan monoklonaalinen vasta-aine, joka on konjugoitu B-galaktosidaasi-entsyymiin (2 jtg/ml).

Konjugaatti 2: Salmonellan polyklonaalinen vasta-aine, joka on konjugoitu biotiiniin.

20 AV-GAL: β-galaktosidaasiin konjugoitu streptavidiini (Zymed), laimen- * nettuna 2000-kertaisesti 1 % naudan seerumin albumiinilla.

H-seerumi: Moniarvoinen H-seerumi (Difco 2406).

25 * LIA: Lysiini-rauta-agar (Difco 0849).

• · · • »· MB: M-elatusalusta (Difco 0940).

30 MBN: M-elatusalusta, jota on täydennetty novobiosiinilla (Sigma N

1628, 10 /ig/ml).

111015 26 O-seenimi: Moniarvoinen O-seerumi (Difco 2264).

ONPG-alusta: O-nitrofenyyli-fi-D-galaktopyranosidi (Sigma N 1127), valmis tettu Cowan:in, 1974, kuvaamalla tavalla.

5

Hiukkasliuos 2: Immunospheres [Dynabead® (yhtiön Dynal, Norja, omistama tavaramerkki), 2,0 mg/ml], jotka on pinnoitettu Salmonellan tavallista flagella-antigeenia vastaan vaikuttavilla monoklonaa-lisilla vasta-aineilla.

10

Hiukkasliuos 1: Immunospheres [Dynabead® (yhtiön Dynal, Norja, omistama tavaramerkki), 0,6 mg/ml], jotka on pinnoitettu Salmonellan tavallista flagella-antigeenia vastaan vaikuttavilla monoklonaa-lisilla vasta-aineilla.

15 RV-alusta: Rappaport-Vassiliadis-alusta (Merck 7700).

RVS-alusta: Rappaport-Vassiliadis-alusta (Oxoid CM 866).

20 RM: Raaka alusta: BPW, jota on täydennetty 17 grammalla/1

NaS2C>3 (Merck 6516), josta osa muunnetaan tetrationaatiksi lisäämällä 19 ml/1 jodiliuosta.

Jodiliuos: 6 g jodia (Merck 4761) + 5 g KI (Merck 5043) + 20 ml 25 H20.

♦ « < ·· STOP: Glysiinipuskuri, 0,1 M, pH 10,5.

SUB: 4-metyyliumbelliferyyli-h-galaktosidi, 100 μΜ, 1 mM MgCl2 30 0,7 % dimetyyliformamidissa.

TSI: Kolmois-sokeri-rauta (Difco 0265).

111015 27 TTB: Tetrationaattialusta (Difco 0104).

WASH: PBS (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos) + 0,1 % Triton-XIOO, pH 7,4.

5 XLD: Ksyloosi-lysiini-desoksikolaatti-agar (Gibco 152-05600/0xoid CM 469).

Lysiinialusta: 2 g L-lysiiniä (Merck 5700) liuotettuna 10 ml:aan ^Oita ja 10 lisättynä 200 ml:aan Decarboxylase Base Moeller-alustaa (Difco 0890).

Rautasulfiitti: Agaralusta, valmistettu tavalla, jonka tuntematon on kuvannut 1980.

15 MX4: MB-alusta: BPW, jota on täydennetty 17 grammalla/1 NaS203 (Merck 6516), josta osa muunnetaan tetrationaatiksi lisäämällä 20 ftg/ml jodiliuosta.

20 Kaikki rikastetut näytteet määritettiin käyttämällä ELISA-tekniikkaa (entsyymiin kytkettyyn immuunisorbenttiin perustuva määritys) ja automaattista analysaattoria. Esimerkit 3—8 toteutettiin käyttämällä EiaFoss^^-analysaattoria, joka on yhtiön Foss Electric kehittämä instrumentti automaattisia ELISA-analyyseja varten, kun taas esimerkkien 1 ja 2 kokeet toteutettiin käyttäen tämän saman instrumentin kehitysmal-25 lia.

• «« ELISA-1: Tämä ELISA-analyysi perustuu "sandwich"-tekniikkaan, ja siinä käytetään kahta 30 erilaista, Salmonella-antigeenejä vastaan kohdistuvaa monoklonaalista vasta-ainetta. Nämä vasta-aineet reagoivat vähän natiivin flagellan kanssa, ja voimakkaasti lämpökäsitellyn Salmonella-mtteen kanssa. Tästä syystä rikastettuja näytteitä lämpökäsitel- 111015 28 lään 100 °C:ssa 15 minuuttia esimerkissä 1 yksityiskohtaisesti kuvatulla tavalla ennen ELISA:n toteuttamista. Tämä lämpökäsittely tappaa/inaktivoi Salmonellan ja muut patogeeniset bakteerit. ELISA:11a voidaan ilmaista 10~* solua/ml. Rikastus toteutetaan siten, että Salmonellan lukumääräksi voidaan taata vähintään 10~7ml 5 rikastuksen päättyessä.

Automaattinen ELISA-analyysi EiaFoss™ -analysaattorilla kestää suunnilleen 75 minuuttia, mutta se voidaan toteuttaa myös käsin, jolloin se voidaan kuvata seuraavasti: 10 — Yksi koeputki, joka sisältää WASH-liuosta (negatiivinen vertailu), ja yksi koeputki, joka sisältää 500 μ\ kalibroijaa (.Salmonella typhimurium\\n lämpökäsitelty suspensio, joka on laimennettu noin 10^ solua/ml olevaan pitoisuuteen), laitetaan näytekiekkoon yhdessä 500 μ\ lämpökäsiteltyjä näytteitä 15 sisältävien koeputkien kanssa.

— Näytteet lämmitetään 35 °C:n lämpötilaan ja analyysi aloitetaan.

— 90 μΐ hiukkasliuosta 1 lisätään kuhunkin näytteeseen ja inkuboidaan 12,5 minuuttia. Näytteessä läsnäolevat Salmonella-antigeenit reagoivat vasta- 20 aineen kanssa muodostaen immuunikomplekseja immuunipallosten ("immunospheres") pinnalle. Näiden mikropallosten kokonaispinta-ala on > hyvin suuri, mikä tekee mahdolliseksi vasta-aineiden ja antigeenien välisen nopean ja tehokkaan sitoutumisen.

25 — Sitoutumaton materiaali huuhdotaan pois WASH-liuoksella, pitäen im- muunipalloset koeputken sivulla magneettivoiman avulla.

• 4 b — Sitten lisätään 130 μ\ konjugaattia 1 ja putkia inkuboidaan 12,5 minuuttia. Konjugoitunut vasta-aine sitoutuu tähän immuunipallosten ja antigeenien 30 väliseen kompleksiin. Tällä tavalla saadaan "sandwich", jossa täytteenä on

Salmonella-antigeenejä.

111015 29 — Sitoutumaton merkkivasta-aine huuhdotaan pois WASH-liuoksella.

— 200 μ\ SUB-liuosta lisätään ja inkuboidaan 12,5 minuuttia. Hiukkasiin sitoutunut entsyymi pilkkoo substraatin mm. 4-metyyliumbelliferyyliksi, joka 5 on fluoresoiva yhdiste, joka mitataan fluoresenssi-ilmaisimella (viritys 365 nm, emissio 450 nm).

— Entsyymireaktio pysäytetään lisäämällä 200 μ\ STOP-liuosta, Nyt 4-metyy-liumbelliferyylin pitoisuus mitataan ilmaisimella ja tämä pitoisuus on verran- 10 nollinen näytteessä läsnäolevan Salmonella-antigeenin määrään. Yksittäisellä näytteellä saatua fluoresenssisignaalia verrataan raja-arvoon, joka määritellään 25 %:ksi kalibroijan signaalista. Positiivisina pidetään niitä näytteitä, joiden signaali on suurempi tai yhtä suuri kuin tämä raja-arvo. Negatiivisina pidetään niitä näytteitä, joiden signaali on pienempi kuin raja-arvo.

15 ELISA-2:

Myös tämä ELISA-analyysi perustuu "sandwich"-tekniikkaan, ja siinä käytetään kahta erilaista, SaZmone//a-antigeeneja vastaan kohdistuvaa vasta-ainetta. Myös nämä 20 vasta-aineet reagoivat vähän natiivin flagellan kanssa, ja voimakkaasti lämpökäsitellyn Salmonella-uutteen kanssa. Tästä syystä rikastettuja näytteitä lämpökäsitellään ' ‘ 100 °C:ssa 15 minuuttia esimerkissä 1 yksityiskohtaisesti kuvatulla tavalla ennen ELISA:n toteuttamista. Tämä lämpökäsittely tappaa/inaktivoi Salmonellan ja muut patogeeniset bakteerit. ELISA:11a voidaan ilmaista 10^ solua/ml.

25 Tämä ELISA-analyysi voidaan kuvata seuraavasti: •« — Yksi koeputki, joka sisältää WASH-liuosta (negatiivinen vertailu), ja yksi koeputki, joka sisältää 500 μ\ positiivista vertailua {Salmonella typhimurium 30 -flagelliinin puhdistettu liuos, joka on laimennettu sellaiseen pitoisuuteen, joka vastaa flagelliinien pitoisuutta noin 10^ solua/ml käsittävässä solususpen- 111015 30 siossa), laitetaan näytekiekkoon yhdessä 500 μΐ lämpökäsiteltyjä näytteitä sisältävien koeputkien kanssa.

— 60 μ\ hiukkasliuosta 2, joka sisältää myös 63 μξ/ηύ konjugaattia 2, lisätään 5 kuhunkin näytteeseen ja inkuboidaan 25 minuuttia. Näytteessä läsnäolevat

Salmonella-äntigeemt reagoivat vasta-aineen kanssa muodostaen immuuni-komplekseja immuunipallosten pinnalle. Biotiiniin konjugoitu vasta-aine sitoutuu samanaikaisesti tähän immuunipallosen ja antigeenin väliseen kompleksiin. Tällä tavalla saadaan "sandwich", jossa täytteenä on Salmonella-anti- 10 geenejä. Näiden mikropallosten kokonaispinta-ala on hyvin suuri, mikä tekee mahdolliseksi vasta-aineiden ja antigeenien välisen nopean ja tehokkaan sitoutumisen.

— Sitoutumaton materiaali huuhdotaan pois WASH-liuoksella, pitäen im- 15 muunipalloset koeputken sivulla magneettivoiman avulla.

— Sitten lisätään 100 μ\ AV-GAL:ia ja putkia inkuboidaan 20 minuuttia. AV-GAL sitoutuu tähän immuunipallosten, antigeenin ja vasta-aineen väliseen kompleksiin.

20 — Sitoutumaton AV-GAL huuhdotaan pois WASH-liuoksella.

• ♦ — 200 μΐ SUB-liuosta lisätään ja inkuboidaan 8 minuuttia. Hiukkasiin sitoutunut entsyymi pilkkoo substraatin mm. 4-metyyliumbelliferyyliksi, joka on 25 fluoresoiva yhdiste, joka mitataan fluoresenssi-ilmaisimella (viritys 365 nm, emissio 450 nm).

• · * · - — Entsyymireaktio pysäytetään lisäämällä 230 μΐ STOP-liuosta. Nyt 4-metyy-liumbelliferyylin pitoisuus mitataan ilmaisimella ja tämä pitoisuus on verran- 30 nollinen näytteessä läsnäolevan Salmonella-antigeenin määrään. Yksittäisellä näytteellä saatua fluoresenssisignaalia verrataan raja-arvoon, joka saadaan kertomalla negatiivisen vertailun signali kahdella. Positiivisina pidetään niitä 111015 31 näytteitä, joiden signaali on suurempi tai yhtä suuri kuin tämä raja-arvo. Negatiivisina pidetään niitä näytteitä, joiden signaali on pienempi kuin raja-arvo.

5 Edellä kuvatuissa ELISA-määrityksissä käytetyt vasta-aineet voidaan saada alan asiantuntijalle tutuilla menetelmillä.

Esimerkiksi Salmonellaa vastaan vaikuttava polyklonaalinen vasta-aine voidaan tuottaa immunoimalla kaneja puhdistetuilla flagelloilla tavanomaisen immunointi-10 menettelyn mukaisesti. Kanien veri otetaan talteen ja seerumi eristetään ja puhdistetaan samoin standarditekniikoilla. Vasta-aineet puhdistetaan edelleen polyklonaalisia vasta-aineita käsittävän antiseerumin absorptiolla, käyttäen ristireagoivasta Citrobacter freundii -bakteerista saatuja puhdistettuja flagelloita.

15 Monoklonaalinen vasta-aine voidaan tuottaa monoklonaalisten vasta-aineiden tavanomaisilla tuotantotekniikoilla käyttäen immunogeenina Salmonellan flagelliinia (monoklonaalisiin vasta-aineisiin liittyvän informaation suhteen viitataan mm. julkaisuun Köhler & Millstein, 1975).

20 Esimerkki 1 « *

Salmonellan alustava valikoiva rikastaminen ja määrittäminen kontaminoiduista jauhelihanäytteistä 25 Kaksi Salmonellan sisältämättömästä jauhelihasta saatua 1 gramman suuruista näytettä siirrettiin kahteen koeputkeen, joista kumpikin sisälsi 10 ml RM-alustaa.

, ** Salmonellan viljeltiin yön yli (37 °C:ssa) ja tämä viljelmä laimennettiin 10^-kertai- sesti 0,85 % NaCl-liuoksella, jolloin Salmonellan lopulliseksi pitoisuudeksi saatiin ‘ noin 3x10 solua/ml. 50 μΐ tätä solususpensiota lisättiin yhteen edellä mainittuun 30 koeputkeen, jolloin solujen keskimääräiseksi lähtölukumääräksi saatiin 15 solua/ml. Kumpaakin koeputkea inhiboitiin 24 tuntia 41 °C:ssa.

111015 32

Rikastuksen jälkeen koeputkia kuumennettiin kiehuvassa vedessä 15 minuutia. Jäähtymisen jälkeen tämä lämpökäsitelty suspensio määritettiin ELISA-2-analyysillä.

Taulukko 1 5 Käytetty Salmonella

Serotyyppi Kontaminoitujen näytteiden lkm.

Salmonella thomson 5 10 Salmonella typhimunum* 5

Salmonella greenside 2

Salmonella dakar 2

Salmonella typhimunum 3

Salmonella wirchow 2 15 Salmonella kentucky 3

Salmonella heidelberg 2

Taulukko 1 Käytetty Salmonella 20 Serotyyppi Kontaminoitujen näytteiden lkm.

Salmonella typhimurium 3

Salmonella weslaco 2

Salmonella berta 3 25 Salmonella Worthington 2 ’** 1 Eristetty kananpojasta * · 4 ^ Eristetty kananpojasta 30 Yhteensä 34 jauhelihanäytettä testattiin edellä kuvatulla tavalla (kontaminoimistapa on esitetty taulukossa 1). Kaikilla 34 kontaminoidulla näytteellä saatiin positiivinen 111015 33 reaktio ELISA-2-analyysissä, eikä ainoatakaan kontaminoimatonta lihanäytettä todettu positiiviseksi.

Esimerkki 2 5

Esimerkissä 1 kuvatun menetelmän lämpötilariippuvuus 25 jauhelihanäytettä testattiin samalla tavalla kuin esimerkin 1 mukaisessa kokeessa, paitsi että alustava valikoiva rikastus toteutettiin myös 37 °C:ssa ja 43 °C:ssa. 10 Lihanäytteiden kontaminointitapa on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2 Käytetty Salmonella 15 Serotyyppi Kontaminoitujen näytteiden lkm.

Salmonella thomson 2

Salmonella typhimurium* 3

O

Salmonella typhimurium^ 3 20 Salmonella wirchow 2

Salmonella kentucky 3 » : , Salmonella heidelberg 2

Salmonella typhimurium 3

Salmonella weslaco 2 25 Salmonella berta 3

Salmonella Worthington 2 • « • · — - --- * Eristetty kananpojasta n . Eristetty kananpojasta 30

Tulokset on lueteltu taulukossa 3: 111015 34

Taulukko 3 Lämpötilan vaikutus alustavaan valikoivaan rikastukseen Lämpötila 5

37 °C 41 °C 43 °C

Kontaminoimattomat näytteet positiivisten lkm. 1/25* 0/25 0/25 10 Kontaminoidut näytteet positiivisten lkm. 24/25 25/25 21/25 * Katsottiin vääräksi positiiviseksi ELISA-tulokseksi.

15 Kuten edellä olevista tuloksista voidaan selvästi nähdä, lämpötilaoptimi näyttää olevan noin 41 °C.

Jotta voitaisiin edelleen selvittää menetelmän riippuvuutta lämpötilasta, 9 jauheli-hanäytettä testattiin edellä kuvatulla tavalla lämpötiloissa 39, °C, 40 °C, 41 °C ja 20 42 °C. Kontaminointi toteutettiin taulukon 4 mukaisesti:

Taulukko 4 Käytetty Salmonella i • « 25 Serotyyppi Kontaminoitujen näytteiden lkm.

Salmonella thomson 3

Salmonella typhimurium* 2

Salmonella greenside 2 30 Salmonella spp. 2 1 Eristetty kananpojasta Näiden kokeiden tulokset on lueteltu taulukossa 5: 111015 35

Taulukko 5 Lämpötilan vaikutus alustavaan valikoivaan rikastukseen Lämpötila 5 _

39 °C 40 °C 41 °C 42 °C

Kontaminoimattomat näytteet positiivisten lkm. 0/9 0/9 0/9 0/9 10 Kontaminoidut näytteet positiivisten lkm. 9/9 9/9 9/9 9/9 15 Kuten selvästi voidaan nähdä, esimerkin 1 mukainen menetelmä on hyvin herkkä ja hyvin spesifinen koko lämpötila-alueella 39—42 °C.

Esimerkki 3 20 Alustavan valikoivan rikastuksen selektiivisyys Salmonellan suhteen raakojen ja jalostettujen tuotteiden tapauksessa 25 erilaista Salmonella-kantaa, ja 11 erilaista, Salmonellasta, poikkeavaa kantaa rikastettiin ei-valikoivissa olosuhteissa MB-alustassa (37 °C, 18 tuntia), niitä 25 lämpökäsiteltiin 15 minuuttia 100 °C:ssa ja sitten niistä tehtiin laimennossarja 10-kertaisesta laimennoksesta 10 000-kertaiseen laimennokseen. Nämä 11 Salmonellasta poikkeavaa kantaa valittiin 100:sta Salmonellaa läheisesti muistuttavasta kannasta ja ... niillä kaikilla todettiin (aikaisemmassa kokeessa) heikon ja vahvan välillä vaihtelevaa ristireaktiivisuutta ELISA-l-määrityksessä, kun taas muilla 89 kannalla ei tällaista 30 ristireaktiivisuutta todettu. Näillä laimennetuilla suspensioilla toteutettiin ELISA-1- määritys. Tulokset on esitetty taulukossa 6: *

Taulukko 6

Positiivisten ELISA-1-tulosten prosentuaalinen osuus 111015 36 5 Laimennokset

Bakteerit 10~4 10'3 KT2 KT1 10°*

Salmonella 64 % 84 % 96 % 100 % 100 % 10

Ei-Salmonella 0 % 37 % 45 % 82 % 100 % * 10^-laimennos vastaa noin 2x10^ solua/ml olevaa solujen lukumäärää.

15 Näitä samoja Salmonella-kantoja ja Salmonellasta eroavia kantoja käytettiin myös siinä ELISA-1-määrityksessä, joka toteutettiin erityisen hyvin raakojen tuotteiden rikastamiseen sopivan alustavan valikoivan rikastuksen jälkeen: 20 10 ml RM-alustaa, jota oli täydennetty 1,5 /zg/ml olevalla määrällä novobiosiinia ja johon oli lisätty 1 g lämpökäsiteltyä (100 °C:ssa 15 minuuttia) jauhelihaa, sisältävään koeputkeen lisättiin noin 103 solua/ml. Sitten koeputkea inkuboitiin 41 °C:ssa 19 tuntia. Sitten 0,5 ml rikastettua suspensiota lisättiin 10 ml:aan MBN-alustaa, jota inkuboitiin sitten 3 tuntia 42 °C:ssa. MBN lämpökäsiteltiin, laimennettiin ja se 25 määritettiin ELISA-1-määrityksellä edellä tässä esimerkissä kuvatulla tavalla.

> · ·

Taulukko 7

Positiivisten ELISA-l-tulosten prosentuaalinen osuus 111015 37

Laimennokset 5 _;___

Bakteerit 10"4 KT3 KT2 KT1 10°*

Salmonella 0 % 44 % 96 % 96 % 96 %

Ei-Salmonella 0 % 0% 9 % 9 % 9 % 10 _ * 10^-laimennos vastaa noin 5x10** solua/ml olevaa solujen lukumäärää.

Taulukoiden 6 ja 7 perusteella on ilmeistä, että keksinnön mukaisella rikastuksella voidaan poistaa mahdollinen ristireaktiivisuus 10/11 muusta kuin Salmonella-kamas-15 ta, jotka olivat ristireaktiivisia, kun ne rikastettiin ei-valikoivasti. Samoin, kuten voidaan nähdä, valikoiva alustava valikoiva rikastus vaikutti paljon vähemmän Salmonellaan.

Näitä samoja Salmonella-kantoja ja Salmonellasta eroavia kantoja käytettiin myös 20 siinä ELISA-1 -määrityksessä, joka toteutettiin erityisen hyvin jalostettujen tuotteiden rikastamiseen sopivan alustavan valikoivan rikastuksen jälkeen: Näin 30 solua/ml lisättiin koeputkeen, joka sisälsi 10 ml BPW-alustaa, jota oli täydennetty 2,5 /ig/ml olevalla määrällä novobiosiinia. Sitten tätä koeputkea inkuboi-25 tiin 37 °C:ssa 4 tuntia. Välittömästi tämän jälkeen koeputkea inkuboitiin edelleen 41 °C:ssa 15 tuntia. Sitten 0,5 ml rikastettua suspensiota siirrettiin 10 mhaan MBN-alustaa, jota inkuboitiin sitten 3 tuntia 42 °C:ssa. MBN lämpökäsiteltiin, se laimennettiin ja määritettiin ELISA-l-määrityksellä edellä tässä esimerkissä kuvatulla tavalla.

30

Taulukko 8

Positiivisten ELISA-1-tulosten prosentuaalinen osuus 111015 38

Laimennokset 5 _______

Bakteerit 10'4 1(T3 KT2 10'1 10°*

Salmonella 0 % 80 % 88 % 96 % 96 % 10 Έϊ-Salmonella 0% 0% 9 % 9% 18% Π 8 * 10-laimennos vastaa noin 5x10 solua/ml olevaa solujen lukumäärää.

Taulukoita 6 ja 8 vertaamalla on ilmeistä, että keksinnön mukaisella rikastuksella 15 voidaan poistaa mahdollinen ristireaktiivisuus 9/11 muusta kuin Salmonella-kannasta, jotka olivat ristireaktiivisia, kun ne rikastettiin ei-valikoivasti. Samoin, kuten voidaan nähdä, valikoiva alustava valikoiva rikastus vaikutti kuitenkin paljon vähemmän

Salmonellaan.

20 Esimerkki 4

Standardin mukaisen viljelytoimenpiteen ja alustavan valikoivan rikastuksen « vertaaminen ja Salmonellan määrittäminen raaoista tuotteista.

25 Yhteensä 54 raa’asta näytteestä (esim. broilerista, jauhelihasta, munanvalkuaisesta ja munankeltuaisesta) määritettiin Salmonellan läsnäolo käyttäen standardin mukaista viljelymenetelmää, jossa käytettiin komitean Nordic Committee on Food Analysis (NMKL nro 71) ehdottamia rikastustoimenpiteitä, pääasiallisen poikkeuksen ollessa se, että RV-alustaa inkuboitiin 42,5 °C:ssa eikä 41,5 °C:ssa.

25 gramman näyte sekoitettiin 225 ml:aan BPW-alustaa steriileissä mahapusseissa ja seosta homogenoitiin käsin 15—20 sekuntia. Pusseja inkuboitiin 37 + 1 °C:n 30 111015 39 lämpötilassa 18-24 tuntia. 0,1 ml:n suuruinen osa siirrettiin 10 ml:aan RV-alustaa ja inkuboitiin vesihauteessa 42,5 ± 0,2 °C:ssa 20—24 tuntia. Tästä rikastetusta RV-alustasta levitettiin silmukallinen BGA-agarille. Agarmaljoja inkuboitiin 37 ± 1 °C:ssa ja ne tarkastettiin 18—24 tunnin kuluttua ja ne tarkastettiin uudestaan 48 5 tunnin kuluttua. Jokaiselta maljalta siirrettiin 4—6 epäilyttävää pesäkettä, mikäli läsnä, TSI-alustalle, rautasulfiittiagarille, lysiinialustalle, ONPG-alustalle ja määritettiin lopuksi serologisesti agglutinaation avulla moniarvoista O-seerumia ja H-seeru-mia käyttäen. Edelleen epäilyttäviä eristeitä tunnistettiin edelleen API-20E-järjestel-män avulla.

10 Nämä 54 näytettä testattiin rinnakkain keksinnön mukaisella menetelmällä: 25 gramman näyte sekoitettiin ja homogenoitiin edellä standardin mukaisen viljelymenetelmän yhteydessä kuvatulla tavalla. Raakatuotteet sekoitettiin 225 ml:aan RM-15 alustaa, jota oli täydennetty 1,5 /ig/ml olevalla määrällä novobiosiinia. Raakanäyt-teitä sisältävää RM-alustaa inkuboitiin vesihauteessa 41,5 ± 0,2 °C:ssa 19—24 tuntia. Näytteitä jälkirikastettiin 3 tuntia MBN-alustassa, ja määritys tapahtui edellä esimerkissä 3 kuvatulla ELISA-l-tekniikalla. Positiiviset näytteet varmistettiin siirtämällä RM-alustalta 0,1 ml 10 ml:aan RV-alustaa, jota inkuboitiin vesihauteessa 20 42,5 ± 0,2 °C:ssa 20—24 tuntia. Tältä RV-alustasta levitettiin silmukallinen BGA- agarille, jota inkuboitiin 37 ± 1 °C:ssa 18—24 tuntia. Epäilyttäviä pesäkkeitä (1—3 kultakin maljalta) siirrettiin TSI-alustalle ja LIA-alustalle ja määritettiin serologisesti moniarvoisella O-seerumilla ja H-seerumilla. Yhä epäilyttäviä eristeitä tunnistettiin edelleen API-20E-järjestelmän avulla. Kun ELISA-1-positiivista näytettä ei kyetty 25 toteamaan edellä kuvatulla menettelytavalla, niin tällöin Salmonella yritettiin myös eristää käyttämällä valikoivana rikastusalustana TTB-alustaa. RM-alustasta siirrettiin 1 ml 10 inhaan TTB-alustaa ja inkuboitiin 42,5 °C:ssa 18—24 tuntia, mitä seurasi aliviljely BGA:lla ja XLD.llä. Epäilyttävät pesäkkeet tutkittiin edellä kuvatulla tavalla.

30

Tulokset on esitetty taulukossa 9: • ·

Taulukko 9

Positiivisten Salmonella-tulosten lukumäärä 111015 40 Näytteiden Positiiviset Todettu positiivisiksi 5 kokonaislukumäärä standardin mukaisessa keksinnön mukaisella viljelymenetelmässä menetelmällä 54 18 21 10 Näin ollen keksinnön mukainen yhdistelmämenetelmä on vähintään yhtä herkkä Salmonellan ilmaisemista ajatellen kuin standardin mukainen viljelymenetelmä. Vääriä positiivisia ei todettu keksinnön mukaisella menetelmällä, mikä osoittaa, että alustava valikoiva rikastusmenetelmä on hyvin spesifinen.

15

Esimerkki 5

Salmonellan alustava valikoiva rikastaminen ja määrittäminen luonnollisesti 20 kontaminoituneissa liha- j a luuj auhenäytteissä sekä kuivatussa veren albumiinissa, käyttäen menetelmää Ml

Yhteensä 60 näytteestä, jotka käsittivät 45 liha- ja luujauhenäytettä sekä 15 kuivattua verialbumiininäytettä, määritettiin Salmonellan läsnäolo seuraavalla tavalla: 25

Ml: *«

Kustakin näytteestä siirrettiin 10 g:n osa 160 ml:aan BPW-alustaa. Tätä näytteen sisältävää BPW-alustaa inkuboitiin 37 °C:ssa 4 tuntia. Sitten lämpötila nostettiin 30 arvoon 41 °C ja inkubointia jatkettiin 15 tuntia. Kustakin rikastusalustasta siirrettiin 0,5 ml:n osa 10 ml:aan MBN-alustaa ja inkuboitiin 42 °C:ssa 3 tuntia. Sitten MBN-alustaa kuumennettiin kiehuvassa vedessä 15 minuuttia ja se jäähdytettiin johtoveden alla ennen ELISA-1-määrityksen toteuttamista. ELISA-määrityksessä positiiviset 111015 41 näytteet varmistettiin siirtämällä 0,1 ml alustavaa rikastusalustaa (BPW) 10 ml:aan RV-alustaa ja 1,0 ml 10 ml:aan TTB-alustaa. RV:tä ja TTB:tä sisältäviä putkia inkuboitiin 43 °C:ssa 20—24 tuntia. RV:stä ja TTB:stä levitettiin silmukallinen BGA:lle ja XDL:lle ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 18—24 tuntia. Epäilyttävät pesäk-5 keet siirrettiin TSI-alustalle ja LIA-alustalle ja määritettiin serologisesti moniarvoisel la O-seerumilla ja H-seerumilla. Yhä epäilyttäviä eristeitä tunnistettiin edelleen API-20E-järjestelmän avulla.

Näytteitä tutkittiin edelleen standardin mukaisella viljelymenetelmällä: 10

Standardimenetelmä: 10 g kutakin näytettä siirrettin 160 ml:aan BPW:tä ja inkuboitiin 37 °C:ssa 18—24 tuntia. Sitten 0,1 ml:n ja 1,0 ml:n suuruiset annokset tästä rikastusalustasta 15 siirrettiin 10 ml:aan RV-alustaa ja 1,0 ml:n annos TTB-alustaan, vastaavasti. RV:tä ja TTB:tä sisältäviä putkia inkuboitiin 43 °C:ssa 20—24 tuntia. RV:stä ja TTB:stä levitettiin silmukallinen BGA:lle ja XDL:lle ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 18—24 tuntia. Epäilyttävät pesäkkeet siirrettiin TSI-alustalle ja LIA-alustalle ja määritettiin serologisesti moniarvoisella O-seerumilla ja H-seerumilla. Yhä epäi-20 lyttävät eristeet tunnistettiin edelleen API-20E-järjestelmän avulla.

Tulokset on esitetty taulukossa 10:

Taulukko 10 25 Positiivisten Salmonella-tulosten lukumäärä Näytteiden Todettu ELISA-1- Positiiviset standradin kokonaislukumäärä positiivisiksi Ml- mukaisessa viljelymenetelmällä menetelmässä 30 ___ 60 31 26 111015 42

Edellä esitetyn taulukon perusteella on ilmeistä, että Ml-menetelmä on tehokkaampi ajatellen Salmonellan toteamista tutkituista, jalostetuista tuotteista saaduista näytteistä standardin mukaiseen viljelymenetelmään verrattuna. Huomattavaa on, ettei Ml-menetelmän yhteydessä todettu vääriä positiivisia tuloksia.

5 Täten selektiivisyys, johon päästään lämpötilaa korottamalla, parantaa Salmonellan ilmaisemista ELISA-tekniikkaa käytettäessä sekä käytettäessä perinteistä maljaustek-nilkkaa (eli vahvistavaa viljelytoimenpidettä).

10 Esimerkki 6

Esimerkissä 5 kuvatun Ml-menetelmän lämpötilariippuvuus 63 jalostetuista elintarvikkeista ja rehuista saatua näytettä testattiin samankaltaisella 15 tavalla kuin esimerkin 5 menetelmässä Ml, paitsi että alustava selektiivinen rikastaminen toteutettiin myös 40 °C:ssa ja 42 °C:ssa, RVS-alustaa käytettiin RV-alustan sijasta ja sitä inkuboitiin 42 °C:ssa ja myös TTB:tä inkuboitiin 42 °C:ssa.

18 näistä testatuista näytteistä oli rehuja, joista oli eristetty aikaisemmin Salmonellaa. 20 Jäljellä olevia 45 näytettä, jotka käsittivät 9 nopeasti keitetyistä vihanneksista otettuja näytteitä, 7 kaakaonäytettä, 5 lemmikkieläinten ruuasta otettua näytettä, 4 äyriäis-näytettä, 9 valmisruokanäytettä, 9 keittonäytettä sekä 2 kuivatusta kookospähkinästä otettua näytettä, ei oltu tutkittu aikaisemmin. Tulokset on esitetty taulukosssa 11: 25 I * « )«4 111015 43

Taulukko 11

Varmistettu ELISA-1 -positiivisiksi Ml-menetelmää käyttäen Lämpötila 5 Näytteiden __

kokonaislkm. 40 °C 41 °C 42 °C

63 10 12 11 10 Näin ollen Ml-rikastusmenetelmä on yhdenmukaisesti tehokas ajatellen Salmonellan toteamista jalostetuista tuotteista koko lämpötila-alueella 40-42 °C. Kuten esimerkissä 5, vääriä positiivisia ei todettu.

15 Esimerkki 7

Salmonellan alustava valikoiva rikastaminen ja määrittäminen luonnollisesti kontaminoituneissa liha-ja luujauhenäytteissä sekä kuivatussa veren albumiinissa, käyttäen menetelmiä M2 ja M3.

20

Yhteensä 89 rehunäytteestä, joista muutama oli kontaminoitunut Salmonellalla toimittajan ilmoituksen mukaan, määritettiin Salmonellan läsnäolo seuraavalla tavalla: M2: 25

Kustakin näytteestä siirrettiin 10 g:n osa 160 ml:aan BPW-alustaa, jota oli täydennet-“ ty 2,5 fig/ml olevalla määrällä novobiosiinia, ja alustaa inkuboitiin 37 °C:ssa 4

Uintia. Sitten lämpötila nostettiin arvoon 41 °C ja inkubointia jatkettiin 15 tuntia. Kustakin rikastusalustasta siirrettiin 0,5 ml:n osa 10 ml:aan MX4-alustaa ja jälkiri-30 kastus toteutettiin 41 °C:ssa 4 tunnin ajan. Sitten MX4-alustaa kuumennettiin kiehuvassa vedessä 15 minuuttia ja se jäähdytettiin johtoveden alla ennen ELISA-1-määrityksen toteuttamista. ELISA-määrityksessä positiiviset näytteet varmistettiin 111015 44 siirtämällä 0,1 ml alustavaa rikastusalustaa (BPW) 10 ml:aan RVS-alustaa ja 1,0 ml 10 ml:aan TTB-alustaa. RVS:tä ja TTB:tä sisältäviä putkia inkuboitiin 42 °C:ssa ja 43 °C:ssa kulloinkin 20—24 tuntia. RVS:stä ja TTB:stä levitettiin silmukallinen BGA:lle ja XDL:lle ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 18—24 tuntia. Epäilyttävät pesäk-5 keet siirrettiin TSI-alustalle ja LIA-alustalle j a määritettiin serologisesti moniarvoisella O-seerumilla ja H-seerumilla. Yhä epäilyttävät eristeet tunnistettiin edelleen API-20E-järjestelmän avulla.

M3: 10 Tässä menetellään samankaltaisella tavalla kuin M2:ssa käyttäen samojen näytteiden toista erää, paitsi että inkubointilämpötila nostettiin arvoon 43 °C eikä arvoon 41 °C.

15 Näytteitä tutkittiin edelleen standardin mukaisella viljelymenetelmällä: 10 g kutakin näytettä siirrettin 160 ml:aan BPW:tä ja inkuboitiin 37 °C:ssa 18—24 tuntia. Sitten 0,1 ml:n ja 1,0 ml:n suuruiset annokset tästä rikastusalustasta siirrettiin 10 ml:aan RVS-alustaa ja 1,0 ml:n annos TTB-alustaan, vastaavasti. 20 RVS:tä ja TTB:tä sisältäviä putkia inkuboitiin 42 °C:ssa ja 43 °C:ssa kulloinkin 20—24 tuntia. RVS:stä ja TTB:stä levitettiin silmukallinen BGA:lle ja XDL:lle ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 18-24 tuntia. Epäilyttävät pesäkkeet siirrettiin TSI-alustalle ja LIA-alustalle ja määritettiin serologisesti moniarvoisella O-seerumilla ja H-seerumilla. Yhä epäilyttävät eristeet tunnistettiin edelleen API-20E-järjestelmän 25 avulla.

• « .

··· Tulokset on esitetty taulukossa 12:

Taulukko 12

Positiivisten Salmonella-tulosten lukumäärä 111015 45 Näytteiden Todettu ELISA-1- Todettu ELISA-1- Positiiviset 5 kokonaislukumäärä positiivisiksi positiivisiksi standradin M2-menetelmällä M3-menetelmällä mukaisessa viljelymene telmässä 10 89 6 4 4

Menetelmällä M2 kyetään ilmaisemaan Salmonella 50 % useammin näytteistä kuin standardimenettelytavalla. Kun lämpötilataso nostetaan arvoon 43 °C (M3) arvon 15 41 °C (M2) sijasta, niin positiivisten näytteiden lukumäärä pienenee tasolle, joka on samankaltainen kuin standardimenettelytavan tapauksessa. Kuitenkin M2:ta käytettäessä todetaan 2 väärää positiivista näytettä, kun taas M3-menetelmällä saadaan vain yksi väärä positiivinen tulos. Niinpä, inkubointilämpötilan nostaminen johtaa parempaan selektiivisyyteen mutta huonompaan herkkyyteen.

20

Esimerkki 8

Salmonellan alustava valikoiva rikastaminen j a määrittäminen kontaminoiduissa ( < maustenäytteissä 25

Yhteensä 8 maustenäytettä (pippuri, curry, paprika, sinappijauhe, tandoori) tutkittiin seuraavalla tavalla: • · ) « « .

' Kustakin maustenäytteestä otetut kaksi 6,25 gramman annosta siirrettiin kahteen 30 pulloon, joissa kummassakin oli 200 ml BPW-alustaa, jota oli täydennetty 2,5 ^g/ml olevalla määrällä novobiosiinia. Yhteen pulloon lisättiin kapseli, jonka sisältämä maitojauhe oli kontaminoitu noin 5 CFU (pesäkkeitä muodostavalla yksiköllä) Salmonella panama -kantaa (nämä kapselit saatiin laitoksesta National Institute of Public Health and Environmental Protection, Bildhoven, Alankomaat). Kaikkia 111015 46 pulloja inkuboitiin 37 °C:ssa 4 tuntia, minkä jälkeen inkubointia jatkettiin 15 tuntia 41 °C:ssa. Sitten Imi siirrettiin 10 ml:aan MBN-alustaa ja inkuboitiin 3 tuntia 42 °C:ssa ja lämpökäsiteltiin tämän jälkeen kiehuvassa vedessä 50 minuuttia. Jäähdyttämisen jälkeen näytteet määritettiin ELISA-1-määrityksellä. Kaikki näytteet 5 (sekä ELISA-positiiviset että -negatiiviset) varmistettiin siirtämällä 0,1 ml tästä alustavan rikastuksen alustasta (BPW) 10 ml:aan RVS-alustaa. Putkia inkuboitiin 42 °C:ssa 20—24 tuntia. Silmukallinen levitettiin BGA:lle ja XDL:lle ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 18—24 tuntia. Epäilyttävät pesäkkeet siirrettiin TSI-alustalle ja LIA-alustalle ja määritettiin serologisesti moniarvoisella O-seerumilla ja H-see-10 rumilla. Yhä epäilyttävät eristeet tunnistettiin edelleen API-20E-järjestelmän avulla.

Tulokset on esitetty taulukossa 13:

Taulukko 13 15 Positiivisten Salmonella-tulosten lukumäärä Näytteiden Kontaminoidut näytteet, jotka Kontaminoimattomat kokonaislukumäärä todettiin ELISA-positiivisiksi näytteet, jotka todet tiin ELISA-positii- 20 siksi 8 7 0 25 Yhteenvetona voidaan todeta, että menetelmä tunnista Salmonella panama:n 7:stä 8 kontaminoidun maustenäytteenjoukosta. Jäljellejääneessä kontaminoidussanäytteessä Salmonellaa ei kyetty ilmaisemaan ELISA :11a eikä varmistustoimenpiteellä.

' Mahdotonta ei kuitenkaan ole, että kapseli ei sisältänyt lainkaan Salmonellaa. Yksi kontaminoimaton näyte (12,5 %) tuotti ELISA-määrityksessä väärän positiivisen 30 tuloksen.

111015 47 KIRJALLISUUS:

Anonymous, 1980, Determinationa of the number of sulphite-reducing Clostridia in foods. Nordic committee on food analysis, Helsinki. Method nro 56.

5

Beumer, R R, Brinkman E, Rombouts F M, 1991, Int. J. Food Microbiol. 12, pp. 363-374.

Cowan S T, 1974, Cowan and Steel’s Manual for the identification of medical 10 bacteria. Cambridge University Press, Cambridge, Second ed. p. 153.

D’Aoust J-Y, Sewell A M, 1988a, J. Food Protect. 51, pp. 853—856.

D’Aoust J-Y, Sewell A M, 1988b, J. Food Protect. 51, pp. 538—541.

15 D’Aoust J-Y, Sewell A M, Greco P, 1991, J. Food Protect. 54, pp. 725—730.

Emswiler-Rose B, Gehle W D, Johnston R W, Okrend A. Moran A, Bennett B., 1991, J. Food Sci. 49, pp. 1018-1020.

20

Entis P, 1986, Membrane filtration systems. In: Pierson M D and Stern N J (Eds.), Foodborne Microorganisms and their toxins: Developing methodology. Marcel Dekker, New York, NY, and Basel, pp. 91—106.

25 Hadfield S Q, Lane A, Mcillmurray M B, 1987, J. Immun. Met. 97, pp. 153—158.

Holbrook R, Anderson J M, Baird-Parker A C, Dodds L M, Sawhney D, Stuchbury S H, Swaine D, 1989, Lett: Appi. Microbiol. 8, pp. 139—142.

30 Kohler & Millstein, Nature 256, 1975, p. 495.

Nielsen P E et al., 1991, Science 254, pp. 1497—1500.

111015 48

Notermans S, Werrmars K, 1991, In. J. Food Microbiol. 12, pp. 91—102.

Smith P J, Boradman A, Shutt P C, 1989, J. Appi. Bacteriol. 67, pp. 575—588. 5 Vassiliadis P, 1983, J. Appi. Bacterial. 54, pp. 69—76.

Wolcott M J, 1991, J. Food Protect. 54, pp. 387—401.

10 » » I V · «.

Claims (53)

111015 49

1. Menetelmä Salmonella-sukuun kuuluvien bakteereiden määrittämiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää rikastustoimenpiteen, jossa joko 5 1. näyte siirretään Salmonellaa varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, ja johon kasvualustaan lisätään tai tuotetaan tetrationaattia ja/tai muuta valikoivaa ainetta, joka ei ole seleniittiä, joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän 10 siirtämisen kanssa tai sen jälkeen, ja tuloksena olevaa seosta pidetään kor keintaan 38 °C:n lämpötilassa ajanjakso, jonka pituus on 10 minuutista 8 tuntiin, näytteen siirtämisen jälkeen (esirikastusjakso), minkä jälkeen seoksen lämpötila nostetaan alueella 39—43 °C ja seosta pidetään tässä alueella 39—43 °C olevassa korotetussa lämpötilassa erään ajanjakson ajan 15 lämpötilan korottamisen jälkeen (rikastusjakso), esirikastusjakson ja rikastus- jakson pituuksien summan ollessa 10—48 tuntia, tai 2. näyte siirretään Salmonellaa varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, näytteen sisältävää 20 kasvualustaa pidetään alueella 39—42,5 °C olevassa lämpötilassa ja siihen lisätään tai tuotetaan tetrationaattia ja/tai muuta valikoivaa ainetta, joka ei ole seleniittiä, joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän siirtämisen kanssa tai korkeintaan 8 tuntia siirtämisen jälkeen, ja tuloksena olevaa seosta pidetään alueella 39—42,5 °C olevassa lämpötilassa 10—48 tunnin pituisen 25 ajanjakson ajan näytteen siirtämisestä lähtien (esirikastusjakso), . · - minkä jälkeen toteutetaan määrittäminen lisääntymisen jälkeen rikastuksen väliainees sa läsnäolevan Salmonellan tunnistamiseksi ja/tai määrän määrittämiseksi, tämän määrityksen käsittäessä analyysivaiheen, joka perustuu kohdemolekyylin tai molekyy-30 lien välisen vuorovaikutuksen, johon kohdemolekyyli osallistuu, tunnistamiseen ja/tai määrän selvittämiseen, ja joka vaihe eroaa tavanomaisista agarmaljaustekniikoista, 111015 50 sovittaen rikastustoimenpiteen olosuhteet määritykseen siten, että koe (koe 1) joka käsittää rikastustoimenpiteen ja määrityksen, ja jossa valikoivaan rikas-tusalustaan siirrostetaan Salmonella-kantaa noin 15 solua/ml olevaksi lähtöpi-5 toisuudeksi ja tähän rikastusalustaan lisätään rikastusjakson alussa 10 % satunnaisesti valittua raakaa jauhelihaa, ja tätä tuloksena saatua seosta pidetään rikastusjaksolle sopivassa lämpötilassa tai lämpötiloissa, tuottaa määrityksessä positiivisen tuloksen vähintään 90 %:ssa kaikista tapauksista, 10 testattaessa joukkoa satunnaisesti valittuja Sfl/mone/Za-serotyyppejä, ja että kokeen (koe 2) joka käsittää rikastustoimenpiteen ja määrityksen, ja jossa valikoivaan rikastusalustaan siirrostetaan rikastusjakson alussa yhtä seuraavista ύ-Salmonella-15 lajin kannoista Citrobacter freundii, Escherichia coli ja Enterobacter cloacae, 20 noin 100 solua/ml olevaksi lähtöpitoisuudeksi, jolloin valikoiva rikastusalusta * ei sisällä olennaisesti muita mikro-organismeja kuin näitä siirrostettuja ei- Salmonella-kantoja, minkä jälkeen tätä tuloksena saatua seosta pidetään rikastusjaksolle sopivassa lämpötilassa tai lämpötiloissa, 25 määrityksessä väärien positiivisten prosentuaalinen osuus on korkeintaan 15 % • « kunkin lajin tapauksessa, kun kokeessa määritetään näiden ά-Salmonella-h}ien joukosta satunnaisesti valitun 20 kannan joukkoa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on alueella 40—42 °C, edullisesti alueella 40,5—41,5 °C, rikastusjakson vähintään olennaisen osan ajan. Tl 1015 51

3. Jomman kumman patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alustaan lisätään tai tuotetaan tetrationaattia ja/tai muuta valikoivaa ainetta, joka ei ole seleniittiä, korkeintaan 4 tuntia siirtämisen jälkeen, esimerkiksi korkeintaan 2 tuntia, korkeintaan 1 tuntia ja korkeintaan 10 minuuttia siirtämisen jälkeen. 5

4. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainoa valikoiva aine, jota lisätään tai tuotetaan alustaan ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän siirtämisen kanssa tai siirtämisen jälkeen, on novobiosiini. 10

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että novobiosii-nin pitoisuus tuloksena olevassa seoksessa on noin alueella 1—100 /-ig/ml, esimerkiksi noin alueella 1—20 ja 2—13 jug/ml.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1—3 mukainen menetelmä, muunnos 1), tunnet- t u siitä, että esirikastusjakson pituus on alueella 0,5—7 tuntia, esimerkiksi alueella 1—6,5 tuntia, 2—6 tuntia ja 3—5 tuntia, tämän pituuden ollessa edullisesti noin 4 tuntia.

7. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rikastustoimenpiteen ja määritysvaiheen ajallisten pituuksien summa on korkeintan 56 tuntia, esimerkiksi korkeintaan 48 tuntia, 40 tuntia, 34 tuntia, 32 tuntia, 28 tuntia, 24 tuntia, 22 tuntia ja 20 tuntia.

8. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rikastusjakson pituus, tai muunnoksessa 1), esirikastusjakson ja rikastusjak- »· ♦ son pituuksien summa on 15—30 tuntia, esimerkiksi 17—24 tuntia.

9. Menetelmä Salmonella-sukmn kuuluvien bakteereiden määrittämiseksi näytteestä, 30 tunnettu siitä, että menetelmä käsittää 111015 52 rikastustoimenpiteen, jossa näyte siirretään Salmonellaa varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, ja johon kasvualustaan lisätään tai tuotetaan tetrationaattia joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän siirtämisen kanssa tai korkeintaan 3 tuntia siirtämisen 5 jälkeen, ja tuloksena olevaa seosta pidetään noin 36—39 °C:n lämpötilassa ajanjakso, jonka pituus on 15—30 tuntia, näytteen siirtämisen jälkeen (rikastusjakso), minkä jälkeen toteutetaan määrittäminen lisääntymisen jälkeen rikastuksen väliaineessa läsnäolevan Salmonellan tunnistamiseksi ja/tai määrän määrittämiseksi, tämän 10 määrityksen käsittäessä analyysivaiheen, joka kestää korkeintaan 7 tuntia ja joka perustuu kohdemolekyylin tai molekyylien välisen vuorovaikutuksen, johon kohdemole-kyyli osallistuu, tunnistamiseen ja/tai määrän selvittämiseen, ja joka vaihe eroaa tavanomaisista agarmaljaustekniikoista, 15 rikastustoimenpiteen ja määrityksen yhteiden pituuden ollessa korkeintaan 40 tuntia, ja sovittaen rikastustoimenpiteen olosuhteet määritykseen siten, että patenttivaatimuksessa 1 määritelty koe 1 tuottaa määrityksessä positiivisen tuloksen vähintään 90 %:ssa kaikista tapauksista, testattaessa joukkoa satunnaisesti valittuja Salmonella-serotyyppejä, ja että patenttivaatimuksessa 1 määriteltyyn kokeeseen 2 kuuluvassa 20 määrityksessä väärien positiivisten prosentuaalinen osuus on korkeintaan 15 % kunkin lajin tapauksessa, kun kokeessa määritetään näiden Qi-Salmonella-h.)ien joukosta satunnaisesti valitun 20 kannan joukkoa.

10 DN A/DN A-hybr idisaatiomäär ity s, RNA/RNA-hybridisaatiomääritys ja DNA/RNA-hybridisaatiomääritys. 15

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rikastus-25 toimenpiteen ja määritysvaiheen ajallisten pituuksien summa on korkeintan 34 tuntia, esimerkiksi korkeintaan 32 tuntia, 28 tuntia, 24 tuntia, 22 tuntia ja 20 tuntia. fr fr 1 i« (

11. Jomman kumman patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rikastusjakson pituus on 17—24 tuntia. 30

12. Jonkin patenttivaatimuksen 9—11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on alueella 36-39 °C rikastusjakson vähintään olennaisen osan ajan. 111015 53

13. Jonkin patenttivaatimuksen 9—12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tetrationaattia lisätään tai tuotetaan alustaan korkeintaan 1 tunnin kuluessa siirtämisen jälkeen, esimerkiksi korkeintaan 5 minuutin kuluessa.

14. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se on kalibroitu standarditoimenpiteeseen NMKL nro 71 nähden (Nordic Committe on Food Analysis, menetelmä nro 71, 1991, neljäs laitos, 17. painos), paitsi että Oxoid CM 866 Rappaport-Vassiliadis-alustaa (RVS) käytetään Merck 7700 Rappaport-Vassiliadis-alustan (RV) sijasta, ja RVS-alustaa inkuboidaan 10 42 °C:ssa, ja että Gibco 152-05600/0xoid CM 469 ksyloosi-lysiini-desoksikolaatti- agaria (XLD) käytetään myös maljausalustana siten, että määrityksessä saadaan vähintään 80 % oikeita positiivisia tuloksia standarditoimenpiteeseen verrattuna, ja siinä saadaan korkeintaan 10 % vääriä positiivisia tuloksia, kun testataan 100 jauhelihanäytettä (koe 3), näillä kummallakin kahdella menetelmällä testattavan 15 näyteosan painon ollessa 25 g, jotka 100 näytettä on saatu 10 eri vähittäismyyjältä, joilta kultakin saatiin 10 eri näytettä, ja 20 saatuun näytteeseen oli siirrostettu noin 15 Salmonella typhimurium -solua näytettä kohden ja 20 saatuun näytteeseen oli siirrostettu noin 15 Salmonella enterititis -solua näytettä kohden.

15. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, t u n n e 11 u siitä, että näyte eroaa jalostetusta tuotteesta.

16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityksestä saadaan vähintään 85 % oikeita positiivisia tuloksia verrattuna standar- 25 ditoimenpiteeseen kokeessa 3, esimerkiksi vähintään 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ja 100 % oikeita positiivisia tuloksia. ♦<

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityksestä saadaan vähintään 101 % oikeita positiivisia tuloksia verrattuna standarditoi- 30 menpiteeseen kokeessa 3. 111015 54

18. Jonkin patenttivaatimuksen 14—17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityksestä saadaan korkeintaan 8 % vääriä positiivisia tuloksia kokeessa 3, esimerkiksi korkeintaan 5%,3%,2% ja 1% vääriä positiivisia tuloksia.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määri tyksestä saadaan 0 väärää positiivista tulosta kokeessa 3.

20. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityksestä saadaan vähintään 92 % oikeita positiivisia tuloksia kaikissa 10 kokeen 1 tapauksissa, esimerkiksi vähintään 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ja 99,9 % oikeita positiivisia tuloksia.

21. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityksestä saadaan korkeintaan 12 % vääriä positiivisia tuloksia 15 kokeessa 2, esimerkiksi korkeintaan 10%,7%,5%, 3%,2%, 1 % ja 0,5 % vääriä positiivisia tuloksia.

22. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tetrationaatin pitoisuus tuloksena olevassa seoksessa on noin alueella 5- 20 40 mM, esimerkiksi noin alueella 7—35 mM, 9—30 mM, 11—28 mM, 13—26 mM, 14—25 mM, 15—23 mM, 16—22 mM, 17—21 mM ja 18—20 mM.

23. Menetelmä Salmonella-sukuun kuuluvien bakteereiden määrittämiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että menetelmässä toteutetaan rikastustoimenpide, jossa joko 25 a) näyte siirretään Salmonellaa varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, * ·« joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, ja joka alusta ei sisällä olennaisesti lainkaan bakteereiden kasvua estävää ainetta, tuloksena olevaa seosta pidetään korkeintaan 39,0 °C:n lämpötilassa vähintään 30 1 minuutin pituisen ajanjakson ajan (esirikastusjakso), ja sitten 111015 55 seoksen lämpötila nostetaan alueella 39,5—43 °C ja siihen lisätään valinnaisesti novobiosiinia ja/tai muuta valikoivaa ainetta, joka ei ole seleniittiä, ja seosta pidetään tässä korotetussa, alueella 39,5—43 °C olevassa lämpötilas-5 sa erään ajanjakson ajan lämpötilan korottamisen jälkeen (valikoiva rikastus- jakso), tai b) näyte siirretään Salmonellaa varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, tähän alustaan 10 lisätään novobiosiinia ja/tai toista valikoivaa ainetta, joka ei ole seleniittiä, joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän siirtämisen kanssa tai siirtämisen jälkeen, ja tuloksena saatua seosta pidetään tässä korkeintaan 39,0 °C olevassa lämpötilassa vähintään 0,5 tunnin pituisen ajanjakson ajan siirtämisestä tai novobiosiinin tai muun valikoivan aineen, joka ei ole seleniit-15 ti, lisäyksestä alkaen, riippuen siitä, kumpi niistä tapahtui myöhemmin (esi- rikastusjakso), ja sitten seoksen lämpötila nostetaan alueella 39,5—43 °C ja siihen lisätään valinnaisesti novobiosiinia ja/tai muuta valikoivaa ainetta, joka ei ole seleniittiä, 20 ja seosta pidetään tässä korotetussa, alueella 39,5—43 °C olevassa lämpötilassa erään ajanjakson ajan lämpötilan korottamisen jälkeen (valikoiva rikastus-jakso), 25 minkä jälkeen toteutetaan määrittäminen lisääntymisen jälkeen rikastuksen väliaineessa läsnäolevan Salmonellan tunnistamiseksi ja/tai määrän määrittämiseksi, esirikas- 4 4 - tusjakson ja valikoivan rikastusjakson ajallisten pituuksien summan ollessa 10—48 tuntia.

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esirikas- tusjakso kestää vähintään 0,5 tuntia, esimerkiksi 1—10 tuntia, 1—8 tuntia, 2—6 tuntia, 3—5 tuntia ja 3,5-4,5 tuntia, sen kestäessä edullisesti noin 4 tuntia. 111015 56

25. Patenttivaatimuksen 23 tai 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rikastustoimenpiteen ja määritysvaiheen ajallisten pituuksien summa on korkeintaan 56 tuntia, tämän ajallisten pituuksien summan ollessa korkeintaan 48 tuntia, 40 tuntia, 32 tuntia, 28 tuntia, 24 Uintia, 22 tuntia ja 20 tuntia. 5

26. Jonkin patenttivaatimuksen 23—25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esirikastusjakson ja valikoivan rikastusjakson ajallisten pituuksien summa on 15—30 tuntia, esimerkiksi 17—24 tuntia.

27. Menetelmä Salmonetta-sukaxm kuuluvien bakteereiden määrittämiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että menetelmässä toteutetaan rikastustoimenpide, jossa näyte siirretään Salmonellaa varten tarkoitettuun vesipitoiseen kasvualustaan, joka on puskuroitu alueella 5,6-9,3 olevaan pH-arvoon, tähän alustaan 15 lisätään novobiosiinia joko ennen näytteen siirtämistä, samanaikaisesti tämän siirtämisen kanssa tai siirtämisen jälkeen, ja tuloksena saatua seosta pidetään korkeintaan 39,0 °C olevassa lämpötilassa 15—30 tunnin pituisen ajanjakson ajan siirtämisestä tai novobiosiinin tai muun valikoivan aineen, joka ei ole seleniitti, lisäyksestä alkaen, riippuen siitä, kumpi niistä tapahtui myöhemmin 20 (esirikastusjakso), ja sitten toteutetaan korkeintaan 7 tunnin pituinen määritys lisääntymisen jälkeen rikastuksen väliaineessa läsnäolevan Salmonellan tunnistamiseksi ja/tai määrän selvittämiseksi, 25 rikastustoimenpiteen ja määrityksen ajallisten pituuksien summan ollessa korkeintaan • «i *· 40 tuntia.

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rikastus-30 toimenpiteen ja määritysvaiheen ajallisten pituuksien summa on korkeintaan 32 tuntia, tämän ajallisten pituuksien summan ollessa korkeintaan 28 tuntia, 24 tuntia, 22 tuntia ja 20 tuntia. 111015 57

29. Patenttivaatimuksen 27 tai 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rikastusjakson pituus on 17—24 tuntia.

30. Jonkin patenttivaatimuksen 27—29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 5 että määritys käsittää analyysivaiheen, joka perustuu kohdemolekyylin tai molekyylien välisen vuorovaikutuksen, johon kohdemolekyyli osallistuu, tunnistamiseen ja/tai määrän selvittämiseen, ja joka vaihe eroaa tavanomaisesta agarmaljauksesta.

31. Jonkin patenttivaatimuksen 27—30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 10 että rikastustoimenpiteen olosuhteet on sovitettu määritykseen siten, että — kokeeseen (koe 4), joka käsittää rikastustoimenpiteen ja määrityksen, ja jossa vesipitoiseen kasvualustaan on siirrostettu Salmonella-kannan lämpökäsiteltyjä soluja noin 1000 lämpökäsiteltyä solua/ml olevaksi pitoisuudeksi, ja alustaan 15 on lisätty 5 % rasvatonta kuivamaitoa rikastustoimenpiteen alussa, kuuluvasta määrityksestä saadaan positiivinen tulos 90 %:ssa kaikista tapauksista, joissa testataan joukkoa satunnaisesti valittuja Salmonella-serotyyppejä, ja — kokeeseen (koe 5), joka käsittää rikastustoimenpiteen ja määrityksen, ja jossa 20 vesipitoiseen kasvualustaan on siirrostettu rikastusjakson alussa yhtä seuraa- vista ei-Salmonella-hjm kannoista c Citrobacter freundii, Escherichia coli ja 25 Enterobacter cloacae, ' » I noin 100 solua/ml olevaksi lähtöpitoisuudeksi, kuuluvassa määrityksessä väärien positiivisten tulosten prosentuaalinen osuus on korkeintaan 25 % kunkin lajin tapauksessa, kun kokeessa määritetään näiden ci-Salmonella-hjien 30 joukosta satunnaisesti valitun 20 kannan joukkoa. 111015 58

32. Jonkin patenttivaatimuksen 27—31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se on kalibroitu standardin mukaiseen viljelytoimenpiteeseen NMKL nro 71 nähden (Nordic Committe on Food Analysis, menetelmä nro 71, 1991, neljäs laitos, 17. painos) siten, että määrityksessä saadaan vähintään 80 % oikeita positiivisia 5 tuloksia standarditoimenpiteeseen verrattuna, ja että siinä saadaan korkeintaan 10 % vääriä positiivisia tuloksia testattaessa (koe 6) yhteensä sellaista 50 näytettä, jotka koostuvat kulloinkin 50 g:sta maitojauhetta, ja jotka on valittu satunnaisesti erän ja tyypin suhteen, ja joista näytteistä kukin on jaettu kahdeksi 25 gramman osaksi, joista osista kulloinkin yhtä käytetään näytteenä jonkin patenttivaatimuksen 21—25 10 mukaisessa menetelmässä, ja kulloinkin toista käytetään näytteenä standardin mukaisessa viljelytoimenpiteessä, kontaminoiden 25 näistä yhteensä 50:stä 25 gramman osasta muodostuvasta parista seuraavalla tavalla: — parin yhtä 25 gramman osaa, jota käsiteltiin standardin mukaisella viljelytoi-15 menpiteellä, täydennetään lisäämällä menettelyyn kuuluvan rikastustoimenpi- teen alussa toimenpiteessä käytettyyn vesipitoiseen kasvualustaan 0,1—1 g rasvatonta kuivamaitoa, joka sisältää noin 5 CFU Salmonella panama- tai Salmonella typhimunum -bakteeria, 20. parin toista 25 gramman osaa, jota käsiteltiin jonkin patenttivaatimuksen 21—25 mukaisella menetelmällä, täydennetään lisäämällä menettelyyn kuu-' ' luvan rikastustoimenpiteen alussa vesipitoiseen kasvualustaan 0,1—1 g ras vatonta kuivamaitoa, joka sisältää noin 5 CFU Salmonella panama-tai Salmonella typhimurium -bakteeria. 25

33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määri- • · tyksestä saadaan vähintään 85 % oikeita positiivisia tuloksia verrattuna kokeessa 6 käytettyyn standarditoimenpiteeseen, esimerkiksi vähintään 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ja 100 % oikeita positiivisia tuloksia. 30 111016 59

34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityksestä saadaan vähintään 101 % oikeita positiivisia tuloksia verrattuna kokeessa 6 käytettyyn standarditoimenpiteeseen.

35. Jonkin patenttivaatimuksen 32—34 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityksestä saadaan korkeintaan 8 % vääriä positiivisia tuloksia kokeessa 6, esimerkiksi korkeintaan 5%,3%,2% ja 1 % vääriä positiivisia tuloksia.

36. Patenttivaatimuksen 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määri-10 tyksestä saadaan 0 positiivista tulosta kokeessa 6.

37. Jonkin patenttivaatimuksen 27—36 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityksestä saadaan vähintään 92 % oikeita positiivisia tuloksia kaikissa kokeen 4 tapauksissa, esimerkiksi vähintään 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ja 15 99,9 % oikeita positiivisia tuloksia.

38. Jonkin patenttivaatimuksen 27—37 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määrityksestä saadaan korkeintaan 20 % vääriä positiivisia tuloksia kokeessa 5, esimerkiksi korkeintaan 15 %, 10 %,6 %, 3 %, 2 % ja 1 % vääriä positiivisia 20 tuloksia.

- * - 39. Jonkin patenttivaatimuksen 27—38 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyte on jalostettu tuote.

40. Tonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaihe käsittää immunologisen reaktion. • »

41. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys-vaiheessa määrittäminen tapahtuu menetelmällä, joka on valittu seuraavista: 30 immuunimääritys, esim. radioimmuunimääritys (Radio Immune Assay; RIA), entsy-maattinen immuunimääritys (Enzyme Immune Assay; EI A), entsyymiin kytkettyyn 111015 60 immuunisorbenttiin perustuva määritys (Enzyme Linked Immune Sorbent Assay; ELISA), fluoresenssi-vasta-aine-tekniikka (Fluorecence Antibody; FA) ja im-muunimääritys, jossa ilmaisemiseen käytetään liposomeja, misellejä tai liposomien kaltaisia hiukkasia, 5 määritys, joka käsittää immuuni-immobilisoinnin, määritys, joka käsittää immuuniagglutinoinnin kuten lateksiagglutinoiimin;

42. Jonkin patenttivaatimuksen 1—39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaihe käsittää polymeraasiketjureaktion (PCR).

43. Jonkin patenttivaatimuksen 1—39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 20 että määritysvaiheessa käytetään peptidinukleiinihappoja (PNA).

44. Jonkin patenttivaatimuksen 1—39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaiheessa käytetään lektiinejä.

45. Jonkin patenttivaatimuksen 1—39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaiheessa käytetään bakteriofaageja kuten bakteriofaagia Felix 01. « «

46. Jonkin patenttivaatimuksen 1—39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaiheessa jokin aine muuttuu Salmonellan metabolian seurauksena siten, 30 että Salmonellaa sisältävän alustan sähkövastus tai impedanssi muuttuu, jolloin Salmonella ilmaistaan mittaamalla tämä muutos. 111015 61

47. Jonkin patenttivaatimuksen 1—39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaiheessa määritetään Salmonellan kyky liikkua agarmatriisin pinnalla tai sen läpi.

48. Jonkin patenttivaatimuksen 1—39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaiheessa käytettyyn menetelmään kuuluu suodatusvaihe, jossa bakteerit erotetaan alustasta ja ne pidättyvät suodattimelle, esimerkiksi hydrofobisen hilamem-braanisuodattimen käyttöön perustuva menetelmä (HGMF).

49. Jonkin patenttivaatimuksen 1—39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaiheessa käytetty menetelmä käsittää radiometrisen määrityksen.

50. Jonkin patenttivaatimuksen 1—39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaiheessa käytetty menetelmä käsittää kromatografisen erotuksen. 15

51. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaihe käsittää valikoivan jälkirikastuksen.

52. Patenttivaatimuksen 51 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tämä 20 jälkirikastus kestää 2—6 tuntia, sen pituuden ollessa esimerkiksi 2,0-4,5 tuntia, 2,5-3,5 tuntia ja edullisesti noin 3 tuntia. t

53. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Salmonellaa, varten tarkoitetussa vesipitoisessa alustassa seleniitin pitoisuus 25 on sellainen, että se vastaa korkeintaan seleniittipitoisuutta 0,5 % p/t natrium-vetyseleniittiä sisältävässä liuoksessa, edullisesti 0 % p/t olevaa seleniittipitoisuutta. « « 111015 62